CN1671853A - 使用棒杆菌生产l－赖氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及L－赖氨酸的生产方法，该方法实行了下列步骤：a)产生L－赖氨酸的棒杆菌的发醇，其至少对于二氨基庚二酸类似物敏感，特别是对于4－羟基二氨基庚二酸；b)在培养基或者细菌细胞内富集L－赖氨酸；和可选地c)从发酵培养基中分离L－赖氨酸或者含有L－赖氨酸的营养添加剂，使得存在≥0至100％的来自发酵培养基和/或生物质的成分，并且可选地使用L－赖氨酸生物合成途径中其它基因另外得到增强的细菌，或者选用降低L－赖氨酸形成的代谢途径至少是部分被关闭的细菌。

Description

使用棒杆菌生产L-赖氨酸的方法
本发明提供了一种使用棒杆菌生产L-赖氨酸的方法，该棒杆菌对于二氨基庚二酸类似物敏感，特别是对于4-羟基二氨基庚二酸。
背景技术
L-氨基酸，特别是L-赖氨酸，用于人类药物和制药工业，食品工业和最特别用于动物营养。
人们已经知道通过棒杆菌的菌株发酵来生产氨基酸，特别是使用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium bacteria)。由于它们巨大的重要性，因此不断地努力以改进生产方法。方法的改进可以涉及到发酵的技术方法，例如搅拌和提供氧气，或者营养培养基的组成，例如发酵过程的糖浓度，或者通过例如离子交换色谱加工成产品形式，或者微生物本身的内在功效属性。
为了改进这些微生物的功效属性而使用的方法包括突变、筛选和突变株的选择。以这种方法得到的菌株是对抗代谢物例如对于赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-半胱氨酸敏感的，或者针对具有调节性的重要代谢物是营养缺陷型的，并且产生L-氨基酸。
数年来重组DNA技术方法也被用于改进产生L-氨基酸的谷氨酸棒杆菌菌株，这种方法是通过扩增单个氨基酸生物合成基因并研究其对于L-氨基酸的产量的影响来实现的。
发明内容
发明人致力于设计新的规程来改进使用棒杆菌发酵生产L-赖氨酸的方法。
发明描述
此后提到的L-赖氨酸或者赖氨酸，不仅是碱，也是指盐，例如单盐酸赖氨酸或者硫酸赖氨酸。
本发明提供了一种使用棒杆菌发酵生产L-赖氨酸的方法，所述棒杆菌是对于二氨基庚二酸类似物敏感的，特别是对于4-羟基二氨基庚二酸。类似物通常的使用浓度是≥3(大于等于)至≤(小于等于)30g/l。
本发明还提供了一种使用棒杆菌发酵生产L-赖氨酸的方法，该棒杆菌已经产生L-赖氨酸，并且对于二氨基庚二酸类似物敏感，特别是对于4-羟基二氨基庚二酸。
本发明进一步提供了一种生产L-赖氨酸的方法，该方法需要施行下列步骤：
a)将产生L-赖氨酸的棒杆菌发酵，其至少是对于二氨基庚二酸类似物敏感的，特别是对于4-羟基二氨基庚二酸。
b)在培养基或者在细菌细胞内富集L-赖氨酸；并且可选择地
c)从发酵培养基中分离L-赖氨酸或者含有L-赖氨酸的营养添加物，使得存在≥0至100％的来自发酵培养基和/或生物质的成分。
本发明类似地提供了一种生产棒杆菌的方法，所述棒杆菌是对于二氨基庚二酸类似物敏感，特别是对于4-羟基二氨基庚二酸。
所使用的菌株优选在对于4-羟基二氨基庚二酸产生敏感性之前已经生产了L-赖氨酸。
根据本发明，二氨基庚二酸类似物的表述包括化合物诸如：
·4-氟二氨基庚二酸
·4-羟基二氨基庚二酸
·4-氧代二氨基庚二酸，或者
·2，4，6-三氨基庚二酸
本发明还提供生产L-赖氨酸的棒杆菌的突变株，所述突变株对于一种或多种选自包含4-氟二氨基庚二酸、4-羟基二氨基庚二酸、4-氧二氨基庚二酸或者2，4，6-三氨基庚二酸的二氨基庚二酸类似物敏感。
此外本发明还提供了基于发酵培养基的营养添加物，其包含根据本发明生产的L-赖氨酸，和不含有或只含有痕量的在产生L-赖氨酸的微生物的发酵过程中形成的来自发酵培养基的生物质和/或成分。
术语“痕量”的意思是＞0％至5％的量。
本发明另外提供了基于发酵培养基的营养添加物，其特征在于：
a)  它们包含根据本发明生产的L-赖氨酸产物，和
b)  它们包含来源于发酵培养基的，数量为90％到100％的生物质和/或成分，所述生物质和/或成分是在产生L-赖氨酸的微生物的发酵过程中形成的。
本发明提供的微生物能够利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或者甘油和酒精生产氨基酸。这些微生物可以是棒杆菌的代表性菌株，特别是棒杆菌属的代表性菌株。在棒杆菌属中应当特别提到谷氨酸棒杆菌种，其因其生产L-赖氨酸的能力而被本领域技术人员所知。
在棒杆菌属中，尤其是在谷氨酸棒杆菌种中，合适的菌株特别是下列已知的野生型菌株
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)
醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806)
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilumATCC13870)
Corynebacterium melassecola ATCC17965
产氨嗜热棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes FERMBP-1539)
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum ATCC14067)
乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum ATCC13869)和
叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum ATCC14020)
以及由此获得的产生L-氨基酸的突变体和/或菌株，
例如产生L-赖氨酸的菌株
谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709
黄色短杆菌FERM-P 1708
乳糖发酵短杆菌FERM-P 1712
谷氨酸棒杆菌FERM-P 6463
谷氨酸棒杆菌FERM-P 6464
谷氨酸棒杆菌ATCC 21513
谷氨酸棒杆菌ATCC 21544
谷氨酸棒杆菌ATCC 21543
谷氨酸棒杆菌DSM 4697和
谷氨酸棒杆菌DSM 5715。
已经发现棒杆菌能以改进的方法生产L-赖氨酸，所述棒杆菌是对于二氨基庚二酸类似物敏感的，特别是对于4-羟基二氨基庚二酸。
为了生产依照本发明对于4-羟基二氨基庚二酸敏感的棒杆菌，使用在现有技术中描述的诱变方法。
对于诱变可以会采用传统的体外诱变方法，使用诱变物质例如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍或者紫外线(Miller，J.H.：A Short Coursein Bacterial Genetics.A Laboratory Manual and Handbook forEscherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，1992)。
对于4-羟基二氨基庚二酸敏感的棒杆菌可以通过在含有4-羟基二氨基庚二酸的营养培养基平板上的涂板来鉴定。该化合物的终浓度约为5-15g/l，例如含有10g/l的4-羟基二氨基庚二酸的营养培养基特别适合于该目的。在该浓度下对于4-羟基二氨基庚二酸敏感的突变株会因为生长延缓而与那些未曾改变的亲本菌株区别开来。选择后，对于4-羟基二氨基庚二酸敏感的突变株表现出更好的L-赖氨酸的生产。
另外，这可能对于L-赖氨酸的生产有益，即除了对于4-羟基二氨基庚二酸敏感性以外，增强特别是过量表达，一种或者多种各生物合成途径的酶，糖酵解、糖回补、柠檬酸循环、戊糖磷酸循环、氨基酸运出和任选的调节蛋白。内源基因的使用通常是优选的。
“内源基因”或者“内源核苷酸序列”的表述是指在一个种的群体内存在的基因或者核苷酸序列。
“增强”的表述在此描述了在微生物中由相关DNA编码的一种或者多种酶或者蛋白的细胞内活性的增强，例如通过增加该基因或者该组基因的拷贝数，应用强启动子或者编码高活性的酶或者蛋白的基因，以及任选地联合这些方法。
通过这些增强，特别是过量表达的方法，相关蛋白的活性或者浓度通常提高最少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或者500％，最高可以达到1000％或者2000％，参照野生型蛋白的浓度或者活性和/或者初始微生物的蛋白浓度和活性。
因而，对于L-赖氨酸的生产而言，除了对于二氨基庚二酸类似物，特别是对于4-羟基二氨基庚二酸敏感，一个或者多个选自下组的基因可以被增强，特别是过量表达：
·编码反馈耐受的天冬氨酸激酶的基因lysC(编号P26512，EP-B-0387527；EP-A-0699759；WO 00/63388)，
·编码二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase)的基因dapA(EP-B 0 197 335)，
·编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因gap(Eikmanns(1992).Journal of Bacteriology 174：6076-6086)，
·同时地编码丙酮酸羧化酶的基因pyc(DE-A-198 31 609，EP-A-1108790)，
·编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的基因zwf(JP-A-09224661，EP-A-1108790)，
·同时地编码赖氨酸输出蛋白的基因lysE(DE-A-195 48 222)，
·编码Zwa1蛋白的基因zwa1(DE：19959328.0，DSM13115)，
·编码二氨基庚二酸脱羧酶的基因lysA(编号：X07563)，
·编码σ因子C的基因sigC(DE：10043332.4，DSM14375)，
·编码磷酸丙糖异构酶的基因tpi(Eikmanns(1992).Journal ofBacteriology 174：6076-6086)，和
·编码3-磷酸甘油酸激酶的基因pgk(Eikmanns(1992).Journalof Bacteriology 174：6076-6086)，
此外，这可能对赖氨酸的生产有利，即除了对于4-羟基二氨基庚二酸的敏感性之外，同时减弱，特别是降低一个或者多个选自下组的基因的表达：
·编码磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶的基因pck(DE 199 50 409.1，DSM13047)，
·编码葡糖-6-磷酸异构酶的基因pgi(US 09/396，478，DSM12969)，
·编码丙酮酸氧化酶的基因poxB(DE：1995 1975.7，DSM13114)，
·编码DNA螺旋酶的基因dead(DE：10047865.4，DSM14464)，
·编码柠檬酸裂合酶(lysase)的基因citE(PCT/EP01/00797，DSM13981)，
·编码O-琥珀酰苯甲酸辅酶A连接酶的基因menE(DE：10046624.9，DSM14080)，
·编码转录调控子MikE17的基因mikE17(DE：10047867.0，DSM14143)和
·编码Zwa2蛋白的基因zwa2(DE：19959327.2，DSM13113)。
在此术语“减弱”描述在微生物中降低或者关闭一种或者多种由相应DNA编码的酶(蛋白)的细胞内活性，例如通过使用弱启动子或者编码弱活性的相应酶的基因或者等位基因，或者使相应的基因或酶(蛋白)失活，和可选地联合这些方法。
依靠这些减弱的方法，相关蛋白的活性或者浓度通常会减少到0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或者0-5％，相对于野生型蛋白的活性或者浓度，和/或初始微生物的蛋白活性或者浓度。
最后，这可能对赖氨酸的生产有利，即除了对于4-羟基二氨基庚二酸的敏感性之外，同样也可以关闭不期望的副反应(Nakayama：“Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms”，in：Overproduction of Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，Academic Press，London，UK，1982)。
依照本发明产生的微生物也包括于本发明内，并且可以连续培养或者用不连续地以批次方法批次培养或者以馈料批次方法(饲养方法)或者重复馈料批次方法(重复饲养方法)达到生产赖氨酸的目的。已知培养方法的总结在Chmiel的教科书中有说明(Bioprozesstechnik 1.Einfüihrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)或者在Storhas的教科书中有说明(Bioreaktorenund periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))。
所使用的培养基必须以一种合适的方式满足各种菌株的需求。用于不同微生物的培养基的说明包含在美国细菌学会(Washington D.C.，USA，1981)的“Manual of Methods for General Bacteriology”手册中。
作为碳源可以使用糖和碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素、油和脂肪(例如大豆油、葵花子油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇例如甘油和乙醇以及有机酸例如乙酸。这些物质可以单独使用或者混和使用。
氮源可以使用有机含氮化合物例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆(corn steep liquor)、大豆粉和尿素，或者无机化合物例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可以单独使用或者混和使用。
磷源可以使用磷酸、磷酸二氢钾或者磷酸氢二钾或者相关的含钠的盐。培养基此外必须包含金属盐类，例如硫酸镁或者硫酸铁，这些是生长必需的。最后，可以使用除了上述物质之外的必需的生长促进剂例如氨基酸和维生素。除此以外，合适的前体可以加入培养基中。上述初始物质可以以单批次的形式一次加入或者可以在培养过程中以合适的方法给料。
为了调节培养基的pH值，可以适当地使用碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或者氨水，或者酸性化合物例如磷酸、硫酸。为了控制泡沫的形成，可以使用防沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了保持质粒的稳定性，合适的选择性作用物质，例如抗生素，可以加入培养基中。为了保持需氧环境，氧气或者含氧气的气体混和物例如空气被通入培养基中。培养基的温度通常是20℃-45℃，优选25℃-40℃。持续培养直到形成最大量的所需产物。这个目标通常在10个小时至160个小时内达到。
测定L-赖氨酸的方法从现有技术中已知。该分析可以按照Spackman等人(Analytical Chemistry，30，(1958)，1190)描述的那样通过阴离子交换色谱法和随后的茚三酮衍生化来施行，或者按照Lindroth等人(Analytical Chemistry(1979)51：1167-1174)描述的那样通过反相HPLC来施行。
根据本发明的方法用于L-赖氨酸的发酵生产。
L-赖氨酸的浓度可以任选地通过添加L-赖氨酸调节到所希望的值。
根据描述的方法，分离对于二氨基庚二酸类似物敏感、特别是对于4-羟基二氨基庚二酸敏感的棒杆菌是可能的，并且根据描述的发酵过程以改进的方式生产L-赖氨酸。
实施例1
筛选对于4-羟基二氨基庚二酸敏感的突变株
谷氨酸棒杆菌的菌株DSM13994是通过多重、非定向诱变、选择和突变株选择而从谷氨酸棒杆菌的菌株ATCC13032产生的。菌株DSM13994对于赖氨酸的类似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸敏感并且具有反馈耐受的天冬氨酸激酶，该天冬氨酸激酶对于赖氨酸(或者赖氨酸的类似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸，100mM)和苏氨酸(10mM)的混合物的抑制不敏感，与之相反的是野生型的天冬氨酸激酶被抑制得至多剩余10％的活性。
该菌株的纯培养物根据布达佩斯协定于2001年1月16日作为DSM13994保存在德国微生物和细胞培养物保藏所中(DSM Brunswick)。
为了筛选对于4-羟基二氨基庚二酸敏感的菌落，在紫外诱变(Sambrook等人，分子克隆：实验室手册。第二版，Cold Spring Harbor，纽约，1989)后将菌株DSM 13994在含有4-羟基二氨基庚二酸的LB琼脂平板上涂板。琼脂平板中添加了10g/l的4-羟基二氨基庚二酸。在经过48小时后观察到菌落的生长。在该浓度，对于4-羟基二氨基庚二酸敏感的突变株会因为生长延缓而与未曾改变的亲本菌株区别开来。以这种方法鉴定出相对于DSM13994表现出明显的生长延缓的克隆。该菌株被鉴定为DSM13394_Hdap_s。
实施例2
赖氨酸的生产
将实施例1中得到的谷氨酸棒杆菌菌株DSM13994_Hdap_s在一个合适生产赖氨酸的营养培养基中培养，并且对培养上清液中赖氨酸的含量进行测定。
为了该目的，所述菌株首先于33℃在琼脂平板上培养24小时。使用该琼脂平板培养物接种预培养物(10ml的培养基在100ml的锥形瓶中)。MM培养基用作为预培养物的培养基。预培养物于33℃240rpm在振荡器上培养24小时。用该预培养物为主培养物接种，从而主培养物的起始光密度(OD-660nm)是0.1 OD。MM培养基也用于主培养物。
MM培养基
CSL                              5g/l
MOPS                             20g/l
葡萄糖(分别压热灭菌)             50g/l
盐：
(NH4)2SO4                    25g/l
KH2PO4                        0.1g/l
MgSO4×7H2O                   1.0g/l
CaCl2×2H2O                   10mg/l
FeSO4×7H2O                   10mg/l
MnSO4×H2O                    5.0mg/l
生物素(过滤灭菌)                 0.3mg/l
盐酸硫胺素(过滤灭菌)             0.2mg/l
CaCO3                           25g/l
CSL(玉米浆)，MOPS(4-吗啉代丙磺酸)和盐溶液都用氨水调节至pH 7，随后压热灭菌。随后加入无菌的底物和维生素溶液以及干压热灭菌的碳酸钙。
培养是在100ml的带挡板的锥形瓶中以10ml的体积进行的。培养是于33℃和80％的空气湿度下进行的。
72个小时后，使用Biomek 1000仪器(Beckmann Instruments有限公司，慕尼黑)于波长660nm 测量OD值。形成的赖氨酸数量是用离子交换色谱法和使用茚三酮检测的柱后衍生法测定的，测定使用Eppendorf-BioTronik(汉堡，德国)的氨基酸分析仪。
试验的结果显示在表1中
表1
    菌株     OD值(660nm)     盐酸赖氨酸g/l
  DSM13994     9.7     18.9
  DSM13994_Hdap_s     7.5     19.6
            用于专利程序的布达佩斯条约微生物保藏的国际认可
                         INTERNATIONAL FORM
Degussa-HüLs AG
Kantstr.2
33790 Halle/Künsebeck
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Claims (11)

1.生产L-赖氨酸的方法，其特征在于施行下列步骤：
a)将产生L-赖氨酸的棒杆菌发酵，其至少对于二氨基庚二酸类似物敏感，特别是对于4-羟基二氨基庚二酸；
b)在培养基或者细菌细胞内富集L-赖氨酸；和可选地
c)从发酵培养基中分离L-赖氨酸或者含有L-赖氨酸的营养添加剂，使得存在≥0至100％的来自发酵培养基和/或生物质的成分。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用其中L-赖氨酸生物合成途径中的其它基因得到增强的细菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用其中减少L-赖氨酸形成的代谢途径至少部分被关闭的细菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，为了产生L-赖氨酸，对其中同时有一个或者多个选自下列的基因被增强、特别是过量表达的棒状微生物进行发酵：
4.1编码反馈耐受的天冬氨酸激酶的基因lysC，
4.2编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因dapA，
4.3编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因gap，
4.4编码丙酮酸羧化酶的基因pyc，
4.5编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的基因zwf，
4.6同时地编码赖氨酸输出蛋白的基因lysE，
4.7编码Zwa1蛋白的基因zwa1，
4.8编码二氨基庚二酸脱羧酶的基因lysA，
4.9编码σ因子C的基因sigC，
4.10编码磷酸丙糖异构酶的基因tpi，或
4.11编码3-磷酸甘油酸激酶的基因pgk。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，为了产生L-赖氨酸，对其中同时有一个或者多个选自下列的基因被减弱的棒状微生物进行发酵：
5.1编码磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶的基因pck，
5.2编码葡糖-6-磷酸异构酶的基因pgi，
5.3编码DNA螺旋酶的基因deaD，
5.4编码柠檬酸裂合酶的基因citE，
5.5编码O-琥珀酰苯甲酸辅酶A连接酶的基因menE，
5.6编码转录调控子MikE17的基因mikE17，
5.7编码丙酮酸氧化酶的基因poxB，或
5.8编码Zwa2蛋白的基因zwa2。
6.根据前述权利要求中的一项或者多项的方法，其特征在于，使用谷氨酸棒杆菌种的微生物。
7.根据前述权利要求中的一项或者多项的方法，其特征在于，使用对于4-羟基二氨基庚二酸敏感的谷氨酸棒杆菌种的微生物。
8.棒杆菌的突变株，其产生L-赖氨酸，并对选自包含4-氟二氨基庚二酸、4-羟基二氨基庚二酸、4-氧二氨基庚二酸或者2，4，6-三氨基庚二酸的组中的一个或者多个二氨基庚二酸类似物敏感。
9.根据权利要求1-7所述的方法，其特征在于，使用棒杆菌的突变株，其生产L-赖氨酸，并对选自包含4-氟二氨基庚二酸、4-羟基二氨基庚二酸、4-氧二氨基庚二酸或者2，4，6-三氨基庚二酸的组中的一个或者多个二氨基庚二酸类似物敏感。
10.基于发酵培养基的营养成分添加剂，其特征在于：
a)它们含有根据权利要求1-7或9生产的L-赖氨酸，和
b)它们包含产生L-赖氨酸的微生物在发酵过程中形成的发酵培养基中的生物质和/或成分，其量为0％-5％。
11.基于发酵培养基的营养成分添加剂，其特征在于：
a)它们含有根据权利要求1-7或9生产的L-赖氨酸，和
b)它们包含产生L-赖氨酸的微生物在发酵过程中形成的发酵培养基中的生物质和/或成分，其量为90％-100％。
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