DE10235029A1

DE10235029A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Verwendung coryneformer Bakterien

Info

Publication number: DE10235029A1
Application number: DE10235029A
Authority: DE
Inventors: Brigitte Dr. Bathe; Caroline Reynen; Walter Dr. Pfefferle
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2002-07-31
Filing date: 2002-07-31
Publication date: 2004-02-19
Also published as: CN1671853A; KR20050026037A; EP1525322A2; WO2004013340A2; PL374942A1; AU2003250933A8; WO2004013340A3; MXPA05001106A; AU2003250933A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, bei dem man folgende Schritte durchführt: DOLLAR A a) Fermentation der L-Lysin produzierenden coryneformen Bakterien, die zumindest sensitiv gegen Diaminopimelinsäure-Analoga, insbesondere 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure, sind; DOLLAR A b) Anreicherung des L-Lysin im Medium oder in den Zellen der Bakterien und DOLLAR A c) Isolierung des L-Lysin oder L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditivs aus der Fermentationsbrühe, gegebenenfalls DOLLAR A d) mit Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse (> 0 bis 100%); DOLLAR A und gegebenenfalls Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges des L-Lysin verstärkt, oder Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung des L-Lysin verringern.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, unter Verwendung coryneformer Bakterien, die sensitiv gegen Diaminopimelinsäure-Analoga, insbesondere 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure, sind.

L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.

Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie zum Beispiel das Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren produzieren.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L- Aminosäure produzierender Stämme von Corynebacterium glutamicum eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die L-Aminosäure-Produktion untersucht.

Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Grundlagen für verbesserte Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin, mit coryneformen Bakterien bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Wenn im Folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern sind auch die Salze wie z.B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die sensitiv gegen Diaminopimelinsäure-Analoga, insbesondere 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure, sind.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin, unter Verwendung von bereits L-Lysin produzierenden coryneformen Bakterien, die sensitiv gegen Diaminopimelinsäure-Analoga, insbesondere 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure, sind.

Gegenstand dieser Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin in dem folgende Schritte durchführt werden:

a) Fermentation der L-Lysin produzierenden coryneformen Bakterien, die zumindest sensitiv gegen Diaminopimelinsäure-Analoga, insbesondere 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure, sind;
b) Anreicherung des L-Lysin im Medium oder in den Zellen der Bakterien; und
c) Isolierung des L-Lysin oder L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditivs aus der Fermentationsbrühe, gegebenenfalls
d) mit Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse (> 0 bis 100 %).

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung coryneformen Bakterien, die sensitiv gegen Diaminopimelinsäure-Analoga, insbesondere 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure, sind.

Die eingesetzten Stämme produzieren bevorzugt bereits vor der Sensitivität gegen 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure L-Lysin.

Unter dem Begriff Diaminopimelinsäure-Analoga werden nach der vorliegenden Erfindung Verbindungen wie

– 4-Fluoro-Diaminopimelinsäure,
– 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure,
– 4-Oxo-Diaminopimelinsäure oder
– 2,4,6-Triaminopimelinsäure

zusammengefasst.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.

Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme
wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
Corynebacterium glutamicum ATCC 21513
Corynebacterium glutamicum ATCC 21544
Corynebacterium glutamicum ATCC 21543
Corynebacterium glutamicum DSM 4697 und
Corynebacterium glutamicum DSM 5715.

Es wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien, die sensitiv gegen Diaminopimelinsäure-Analoga, insbesondere 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure, sind in verbesserter Weise L-Lysin produzieren.

Zur Erzeugung der erfindungsgemäßen gegen 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure sensitiven coryneformen Bakterien, werden im Stand der Technik beschriebene Mutagenesemethoden verwendet.

Für die Mutagenese können klassische in-vivo Mutageneseverfahren unter Verwendung mutagener Stoffe wie beispielsweise N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin oder ultraviolettes Licht (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992) verwendet werden.

Die coryneformen Bakterien, die sensitiv gegenüber 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure sind, können durch Ausplatieren auf 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure haltigen Nährmediumsplatten identifiziert werden. Hierzu eignen sich in besonderem Maße Endkonzentrationen von 10g/l 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure im Nährmedium. Bei dieser Konzentration können 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure sensitive Mutanten von. den unveränderten Elternstämmen durch ein verlangsamtes Wachstum unterschieden werden. Nach erfolgter Selektion zeigen die 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure sensitive Mutanten eine verbesserte L-Lysinproduktion.

Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Sensitivität gegen 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren. Die Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt.

Unter „endogenen Genen" oder „endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen.

Der Begriff „Verstärkung" bzw. „Verstärken" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp-Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.

So kann für die Herstellung von L-Lysin zusätzlich zur Sensitivität gegen 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe

– das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No.P26512, EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388),
– das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
– das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174:6076-6086),
– gleichzeitig das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A-198 31 609, EP-A-1108790),
– das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661, EP-A-1108790),
– gleichzeitig das für den Lysin-Export-Protein kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),
– das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE: 19959328.0, DSM 13115),
– das für die Diaminopimelinsäure Decarboxylase kodierende Gen lysA (Accession Nr. X07563),
– das für den Sigma-Faktor C kodierende Gen sigC (DE: 10043332.4, DSM14375),
– das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086) und
– das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Lysin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Sensitivität gegen 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

– das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck ( DE 199 50 409.1 , DSM 13047),
– das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi ( US 09/396,478 , DSM 12969),
– das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE:1995 1975.7, DSM 13114),
– das für die DNA-Helikase kodierende Gen deaD (DE: 10047865.4, DSM14464),
– das für die Citrat Lysase kodierende Gen citE (PCT/EP01/00797, DSM13981),
– das für die O-Succinylbenzoesäure-CoA-Ligase kodierende Gen menE (DE: 10046624.9, DSM14080),
– das für den Transkriptionsregultaor MikE17 kodierende Gen mikE17 (DE: 10047867.0, DSM14143) und
– das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE: 19959327.2, DSM 13113)

abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.

Der Begriff „Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.

Schließlich kann es für die Produktion von L-Lysin, vorteilhaft sein, neben der Sensitivität gegen 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch – Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Lysin kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology„ der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten.

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z.B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z.B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z.B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z.B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.

Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z.B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z.B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Methoden zur Bestimmung von L-Lysin sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed Phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Lysin.

Die Konzentration von L-Lysin kann gegebenenfalls durch den Zusatz von L-Lysin auf den gewünschten Wert eingestellt werden.

Durch die beschriebenen Verfahren gelingt es coryneforme Bakterien zu isolieren, die sensitiv gegen Diaminopimelinsäure-Analoga, insbesondere 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure, sind, und nach den beschriebenen Fermentationsverfahren in verbesserter Weise L-Lysin produzieren.

Claims

Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt, a) Fermentation der L-Lysin produzierenden coryneformen Bakterien, die zumindest sensitiv gegen Diaminopimelinsäure-Analoga, insbesondere 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure, sind; b) Anreicherung des L-Lysin im Medium oder in den Zellen der Bakterien; und c) Isolierung des L-Lysin oder L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditivs aus der Fermentationsbrühe, gegebenenfalls d) mit Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse (> 0 bis 100 %).
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges des L-Lysin verstärkt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung des L-Lysin verringern.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man für die Herstellung von L-Lysin coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe 4.1 das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC, 4.2 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA, 4.3 das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap, 4.4 das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc, 4.5 das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf, 4.6 gleichzeitig das für den Lysin-Export-Proteins kodierende Gen lysE, 4.7 das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1, 4.8 das für die Diaminopimelinsäure Decarboxylase kodierende Gen lysA, 4.9 das für den Sigma-Faktor C kodierende Gen sigC, 4.10 das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi, oder 4.11 das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk, verstärkt, insbesondere überexprimiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung von L-Lysin coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe 5.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen, 5.2 das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende pgi-Gen, 5.3 das für die DNA-Helikase kodierende Gen deaD, 5.4 das für die Citrat Lysase kodierende Gen citE, 5.5 das für die O-Succinylbenzoesäure-CoA-Ligase kodierende Gen meine, 5.6 das für den Transkriptionsregultaor MikE17 kodierende Gen mikE17, 5.7 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB, oder 5.8 das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2, abschwächt.
verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt.
Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt, die sensitiv gegen 4-Hydroxy-Diaminopimelinsäure sind.