KR20050026037A

KR20050026037A - 코리네포름 세균을 사용한 ｌ-라이신의 생산 방법

Info

Publication number: KR20050026037A
Application number: KR1020057001589A
Authority: KR
Inventors: 바테브리짓테; 레이넨카롤리네; 페페를레발터
Original assignee: 데구사 아게
Priority date: 2002-07-31
Filing date: 2003-07-10
Publication date: 2005-03-14
Also published as: CN1671853A; EP1525322A2; WO2004013340A2; AU2003250933A1; PL374942A1; DE10235029A1; WO2004013340A3; AU2003250933A8; MXPA05001106A

Abstract

본 발명은

a) 디아미노피멜산 유사체, 특히 4-하이드록시디아미노피멜산에 대해 적어도 민감성인, L-라이신을 생산하는 코리네포름 세균을 발효시키는 단계;

b) 배지 또는 세균 세포속에 L-라이신을 풍부하게 하는 단계; 및

임의로 c) 발효 브로쓰로부터 L-라이신 또는 L-라이신을 함유하는 사료 첨가물을 분리함으로써, 발효 브로쓰 및/또는 생물량으로부터의 성분이 0% 이상 내지 100% 이하로 존재하도록 하는 단계를 수행하고,

임의로 L-라이신의 생합성 경로의 추가의 유전자가 또한 증진된 세균, 또는 L-라이신의 형성을 감소시키는 대사 경로가 적어도 부분적으로 스위칭 오프(switching off)된 세균을 사용함을 특징으로 하는, L-라이신의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

코리네포름 세균을 사용한 Ｌ-라이신의 생산 방법{Process for the production of L-lysine using Coryneform bacteria}

본 발명은 디아미노피멜산 유사체, 특히 4-하이드록시-디아미노피멜산에 대해 민감성인 코리네포름 세균을 사용하여 L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.

L-아미노산, 특히 L-라이신은 사람 의약 및 약제 산업, 사료 산업, 및 가장 특히 동물 영양에서 사용된다.

코리네포름 세균, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 균주를 발효시켜 아미노산을 생산하는 것은 알려져 있다. 이들의 큰 중요성으로 인하여, 생산 방법을 개선시키려는 노력이 지속적으로 이루어지고 있다. 방법 개선은 예를 들면, 교반 및 산소의 공급과 같은 발효 기술 수단, 또는 예를 들면, 발효동안 당 농도와 같은 영양 배지의 조성, 또는 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 제품 형태로의 후처리, 또는 미생물 자체의 고유 수행능에 관한 것일 수 있다.

이러한 미생물들의 수행성을 개선시키기 위해, 돌연변이유발, 선별 및 돌연변이체 선택을 포함하는 방법이 사용되고 있다. 이러한 방법에서, 예를 들면, 라이신 유사체인, S-(2-아미노에틸)-시스테인과 같은 항대사산물에 대해 민감성인 균주 또는 조절적으로 중요한 대사산물에 대한 영양요구성인 균주, 및 L-아미노산을 생성하는 균주가 수득된다.

수년동안 재조합 DNA 기술 방법을 또한 사용하여 개개의 아미노산 생합성 유전자를 증폭시키고 L-아미노산 생산에 있어서의 효과를 시험함으로써 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰의 균주들을 개선시켜 왔다.

발명의 목적

본 발명자들은 코르네포름 세균을 사용한 L-라이신의 발효적 생산의 개선된 방법에 대한 새로운 원리를 연구하는데 참여하여 왔다.

이후에 L-라이신 또는 라이신이 언급되는 경우, 이는 염기뿐 아니라 예를 들면, 라이신 모노하이드로클로라이드 또는 라이신 설페이트와 같은 염을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 디아미노피멜산 유사체, 특히 4-하이드록시디아미노피멜산에 대해 민감성인 코리네포름 세균을 사용한 L-라이신의 발효적 생산 방법을 제공한다. 당해 유사체는 일반적으로 ≥ (초과/이상) 3 내지 ≤(미만/이하) 30 g/l의 농도로 사용된다.

본 발명은 또한 이미 L-라이신을 생산하며 디아미노피멜산 유사체, 특히 4-하이드록시-디아미노피멜산에 대해 민감성인 코리네포름 세균을 사용한 L-라이신의 발효적 생산 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 L-라이신의 생산 방법을 제공하며, 당해 방법은 하기 단계들에 의해 수행된다:

a) 디아미노피멜산 유사체, 특히 4-하이드록시디아미노피멜산에 대해 적어도 민감성인 L-라이신을 생산하는 코리네포름 세균을 발효시키는 단계;

b) 배지 또는 세균 세포내에 L-라이신을 농축시키는 단계; 및 임의로

c) 발효 브로쓰로부터 L-라이신 또는 L-라이신을 함유하는 사료 첨가물을 분리함으로써 발효 브로쓰 및/또는 생물량으로부터의 성분이 0 이상 내지 100%로 존재하도록 하는 단계.

본 발명은 유사하게는 디아미노피멜산 유사체, 특히 4-하이드록시-디아미노피멜산에 대해 민감성인 코리네포름 세균의 생산 방법을 제공한다.

사용된 균주는 바람직하게는 4-하이드록시디아미노피멜산에 대해 민감성이기 이전에 L-라이신을 생산한다.

본 발명에 따른 발현 디아미노피멜산 유사체는 4-플루오로디아미노피멜산, 4-하이드록시디아미노피멜산, 4-옥소디아미노피멜산 또는 2,4,6-트리아미노피멜산과 같은 화합물을 포함한다.

본 발명은 또한 4-플루오로디아미노피멜산, 4-하이드록시디아미노피멜산, 4-옥소디아미노피멜산 또는 2,4,6-트리아미노피멜산을 포함하는 그룹으로부터 선택된 디아미노피멜산 유사체중 하나 이상에 대해 민감성인, L-라이신을 생산하는 돌연변이체 코리네포름 세균을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따라 생산된 L-라이신을 함유하고 L-라이신을 생산하는 미생물의 발효동안 형성된 발효 브로쓰로부터의 생물량 및/또는 성분을 함유하지 않거나 단지 미량만을 함유하는 발효 브로쓰를 기초로 하는 사료 첨가물을 제공한다.

용어 "미량"은 0% 초과 내지 5%의 양을 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명은 또한

a) 본 발명에 따라 생산된 L-라이신을 함유하고;

b) L-라이신-생산 미생물의 발효동안 형성된 발효 브로쓰로부터의 생물량 및/또는 성분을 90% 내지 100%의 양으로 함유함을 특징으로 하는, 발효 브로쓰를 기초로 하는 사료 첨가물을 제공한다.

본 발명에 의해 제공된 미생물은 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분 및 셀룰로즈로부터, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 아미노산을 생산할 수 있다. 이들 미생물은 코리네포름 세균, 특히 코리네박테리움 속이 대표적일 수 있다. 코리네박테리움 속 중에서, 특히, L-아미노산을 생산하는 자체의 능력이 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 종이 언급될 수 있다.

코리네박테리움, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적합한 균주는 특히 다음의 공지된 야생형 균주,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032,

코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC15806,

코리네박테리움 아세토악시도필룸 ATCC13870,

코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965,

코리네박테리움 써모아미노게네스 FERM BP-1539,

브레비박테리움 플라붐 ATCC14067,

브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13869 및

브레비박테리움 디바리카툼 ATCC14020과,

이러한 야생형 균주로부터 생산된 L-아미노산-생산 돌연변이체 및/또는 균주, 예를 들면, L-라이신을 생산하는 균주,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709,

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708,

브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM-P 1712,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21513,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21544,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21543,

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 4697 및

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5715이다.

디아미노피멜산 유사체, 특히 4-하이드록시디아미노피멜산에 대해 민감성인 코리네포름 세균이 L-라이신을 개선된 방식으로 생산함이 밝혀졌다.

4-하이드록시디아미노피멜산에 대해 민감성인, 본 발명에 따른 코리네포름 세균을 생산하기 위해서는, 선행 분야에 기술된 돌연변이유발법이 사용된다.

돌연변이유발을 위해서는, 예를 들면, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 또는 자외선과 같은 돌연변이유발 물질을 사용한 생체내 돌연변이유발 공정이 통상적으로 사용될 수 있다(참조: Miller, J. H. : A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992).

4-하이드록시-디아미노피멜산에 대해 민감성인 코리네포름 세균은, 4-하이드록시디아미노피멜산을 함유하는 영양 배지 플레이트상에 평판배양함으로써 동정할 수 있다. 영양 배지속에 4-하이드록시디아미노-피멜산의 최종 농도가 약 5 내지 15g/l, 예를 들면, 10g/l인 것이 당해 목적에 특히 적합하다. 당해 농도에서 4-하이드록시다아미노피멜산에 대해 민감성인 돌연변이체는 지연된 성장에 의해 변이되지 않은 모 균주와 구별될 수 있다. 선별 후 4-하이드록시다아미노피멜산에 대해 민감성인 돌연변이체는 개선된 L-라이신 생산을 나타낸다.

또한, L-라이신의 생산을 위해, 4-하이드록시-디아미노피멜산에 대한 민감성외에, 각각의 생합성 경로, 해당작용, 육아발생(anaplerosis), 시트르산 주기, 펜토즈 포스페이트 주기 및 아미노산 배출중의 하나 이상의 효소 및 임의로 조절 단백질을 증진, 특히 과발현시키는 것이 유리할 수 있다. 내인성 유전자의 사용이 일반적으로 바람직하다.

표현 "내인성 유전자" 또는 "내인성 뉴클레오타이드 서열"은 종의 집단내에 존재하는 유전자 또는 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로 이해된다.

표현 "증진" 및 "증진시키다"는 이와 관련하여, 예를 들면 유전자 또는 유전자들의 카피수를 증가시키고, 강력한 프로모터 또는 활성이 높은 상응하는 효소 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 사용하고, 임의로 이들 수단들을 조합시킴에 의해, 상응하는 DNA에 의해 암호화된 하나 이상의 효소 또는 단백질의 세포내 활성을 미생물내에서 증가시키는 것을 말한다.

이러한 증진, 특히 과발현 수단에 의해, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도는 일반적으로 야생형 단백질의 활성 또는 농도 및/또는 출발 미생물에서의 단백질의 활성 또는 농도에 비하여 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500% 이상 내지 1000% 또는 2000% 이하로 상승된다.

따라서, L-라이신의 생산을 위해서, 디아미노피멜산 유사체, 특히 4-하이드록시디아미노피멜산에 대한 민감성외에, 하기 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 증진, 특히 과발현시킬 수 있다.

·피이드백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자(수탁 번호 제P26512호; EP-B-0387527; EP-A-0699759); WO 00/63388),

·디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자(참조: EP-B 0 197 335),

·글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[참조: Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174:6076-6086],

·동시에, 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자(참조: DE-A-198 31 609, EP-A-1108790),

·글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 zwf 유전자(참조: JP-A-09224661, EP-A-1108790),

·동시에, 라이신 배출 단백질을 암호화하는 lysE 유전자(참조: DE-A-195 48 222),

·Zwa1 단백질을 암호화하는 zwa1 유전자(참조: DE: 19959328.0, DSM 13115),

·디아미노피멜산 데카복실라제를 암호화하는 lysA 유전자(수탁 번호 제 X07563호),

·시그마 인자 C를 암호화하는 sigC 유전자(참조: DE 10043332.4, DSM14375),

·트리오스 포스페이트 이소머라제를 암호화하는 tpi 유전자[참조: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086] 및

·3-포스포글리세레이트 키나제를 암호화하는 pgk 유전자[참조: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086].

또한, L-라이신을 생산하기 위해, 4-하이드록시디아미노피멜산에 대한 민감성외에, 하기 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 동시에 약화, 특히, 감소시키는 것이 유리할 수 있다:

·포스포에놀 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자(참조: DE 199 50 409.1, DSM 13047),

·글루코즈-6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자(참조: US 09/396,478, DSM 12969),

·피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자(참조: DE: 1995 1975.7, DSM 13114),

·DNA 헬리카제를 암호화하는 deaD 유전자(참조: DE 10047865.4, DSM14464),

·시트레이트 라이세이즈를 암호화하는 citE 유전자(참조: PCT/EP01/00797, DSM13981),

·O-석시닐벤조산 CoA-리가제를 암호화하는 menE 유전자(참조: DE: 10046624.9, DSM 14080),

·전사 조절 MikE17을 암호화하는 mikE17 유전자(참조: DE 10047867.0, DSM14143) 및

·Zwa2 단백질을 암호화하는 zwa2 유전자(참조: DE 19959327.2, DSM13113).

이와 관련하여, 용어 "약화"는 예를 들면 약한 프로모터 또는 활성이 낮은 상응하는 효소를 암호화하는 유전자 또는 대립형질 유전자를 사용하거나, 또는 상응하는 유전자 또는 효소(단백질)을 불활성화시키고, 임의로 이들 방법을 조합함으로써, 상응하는 DNA에 의해 암호화된 하나 이상의 효소(단백질)의 세포내 활성을 미생물내에서 감소시키거나 스위칭 오프(switching off)시킴을 말한다.

이러한 약화 수단에 의해, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도는 일반적으로 야생형 당백질의 활성 또는 농도, 및/또는 초기 미생물내 단백질의 활성 또는 농도의 0 내지 75%, 0 내지 50%, 0 내지 25%, 0 내지 10% 또는 0 내지 5%로 감소된다.

최종적으로, L-라이신을 생산하기 위해서는, 4-하이드록시-디아미노피멜산에 대한 민감성외에, 또한 바람직하지 않은 제 2 반응을 스위칭 오프시키는 것이 유리할 수 있다[참조: Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

본 발명에 따라 생산된 미생물은 또한 본 발명에 의해 전환되고 L-라이신의 생산 목적을 위해 뱃취 공정(뱃취 배양)에서, 공급-뱃취 공정(공급 공정)에서, 또는 반복된 공급-뱃취 공정(반복된 공급 공정)에서 연속적으로 또는 불연속적으로 배양시킬 수 있다. 공지된 배양 방법의 요약은 문헌[참조: 크미엘(Chmiel)의 교과서, (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) 또는 슈토르하스(Storhas)의 교과서, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)]에 기술되어 있다.

사용될 배양 배지는 각각의 균주의 요구사항을 적합한 방식으로 만족시켜야 한다. 각종 미생물에 대한 배양 배지의 기술은 문헌[참조: the handbook "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에 포함되어 있다.

탄소원으로서, 예를 들면 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분 및 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 예를 들면, 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛유와 같은 오일 및 지방, 예를 들면, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀산과 같은 지방산, 예를 들면, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알콜, 및 예를 들면, 아세트산과 같은 유기산을 사용할 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

질소원으로서, 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수대 액, 대두 분말 및 우레아와 같은 유기 질소 함유 화합물, 또는 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 화합물을 사용할 수 있다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

인원으로서, 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 사용할 수 있다. 배양 배지는 또한 예를 들면, 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속 염을 함유하여야 한다. 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 촉진제를 위에서 언급한 물질외에 사용할 수 있다. 이들과 달리, 적합한 전구체를 배양 배지에 가할 수 있다. 위에서 언급한 출발 물질을 단일 뱃취의 형태로 배양물에 가하거나 배양 동안 적절한 방식으로 공급할 수 있다.

배양물의 pH를 조절하기 위하여 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수와 같은 염기성 화합물, 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물을 경우에 따라 사용한다. 거품 형성을 조절하기 위하여 예를 들면, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 포지제를 가할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지시키기 위하여, 적합하게 선택적으로 작용하는 물질, 예를 들면, 항생제를 배지에 가할 수 있다. 통기 조건을 유지시키기 위하여, 산소 또는 예를 들면, 공기와 같은 산소 함유 기체 혼합물을 배지에 공급한다. 배양 온도는 일반적으로 20℃ 내지 45℃, 및 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 최대량의 목적 생성물이 형성될 때까지 배양을 지속한다. 당해 목표는 일반적으로 10시간 내지 160 시간내에 달성된다.

L-라이신을 측정하는 방법은 선행 분야에 공지되어 있다. 당해 분석은 스팍만(Spackman) 등의 문헌[참조: Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190]에 기술된 바와 같이 이온 교환 크로마토그래피에 이은 닌하이드린 유도체화에 의해, 또는 린드로쓰(Lindroth) 등의 문헌[참조: Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174]에 기술된 바와 같은 역상 HPLC에 의해 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 L-라이신의 발효적 생산에 사용할 수 있다.

L-라이신의 농도는 L-라이신의 첨가에 의해 바람직한 수치로 임의 조절할 수 있다.

기술된 공정들에 의해 디아미노피멜산 유사체, 특히 4-하이드록시-디아미노피멜산에 대해 민감성인 코리네포름 세균을 분리하고 기술된 발효 공정에 따라 개선된 방식으로 L-라이신을 생산하는 것이 가능하다.

실시예 1

4-하이드록시디아미노피멜산에 대해 민감성인 돌연변이체에 대한 스크리닝(screening)

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM13994를 씨. 글루타미쿰 ATCC13032로부터 다중의 표적화된 돌연변이유발, 선별 및 돌연변이체 선별에 의해 생산한다. 균주 DSM13994는 라이신 유사체인 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대해 민감성이며, 라이신 [또는 라이신 유사체인 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인, 100mM] 및 트레오닌 (10mM)의 혼합물에 의한 억제에 대해 민감성이지 않은 피이드백-내성 아스파르테이트 키나제를 지니는 반면, 이와는 대조적으로 야생형에서 아스파르테이트 키나제의 활성은 잔류 활성의 10%까지 억제된다.

당해 균주의 순수한 배양물은 2001년 1월 16일자로 독일 미생물 및 세포 배양물 기탁기관[도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(DSM), 독일 브라운쉬바이크 소재]에 부타페스트 조약에 따라 수탁 번호 DSM13994로서 기탁되었다.

4-하이드록시-디아미노피멜산에 대해 민감성인 콜로니를 스크리닝하기 위해, UV 돌연변이유발[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Edition, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 후, 균주 DSM13994를 4-하이드록시디아미노피멜산을 함유하는 LB 아가 플레이트위에 평판배양하였다. 아가 플레이트에 10g/l의 4-하이드록시디아미노피멜산을 보충한다. 콜로니의 성장을 48시간에 걸쳐 관측한다. 이 농도에서 4-하이드록시디아미노피멜산에 대해 민감성인 돌연변이체는 지연된 성장에 의해 변형되지 않은 모 균주로부터 구별될 수 있다. 이러한 방식으로 DSM13994와 비교하여 실질적으로 지연된 성장을 나타내는 클론을 동정한다. 당해 균주는 DSM13994_Hdap_s로 동정된다.

실시예 2

라이신의 생산

실시예 1에서 수득한 씨. 글루타미쿰 균주 DSM13994_Hdap_s를 라이신의 생산에 적합한 영양 배지속에서 배양하고 배양 상층액속의 라이신 함량을 측정한다.

이러한 목적을 위해, 균주를 우선 한천 플레이트상에서 24시간 동안 33℃에서 배양한다. 당해 한천 플레이트 배양물을 사용하여 예비배양물(100ml의 원뿔형 플라스크내 10ml의 배지)에 접종한다. 배지 MM을 예비배양용 배지로 사용한다. 예비배양물을 24시간 동안 33℃에서 240rpm으로 바이브레이터(vibrator)위에서 배양한다. 이러한 예비배양물을 사용하여 주 배양물에 접종함으로써 주 배양물의 초기 광학 밀도(OD - 660nm)가 0.1 OD가 되도록 한다. MM 배지를 또한 주 배양을 위해 사용한다.

MM 배지

CSL	5g/l
MOPS	20g/l
글루코즈(별도로 오토클레이브함)	50g/l
염:
(NH₄)₂SO₄	25g/l
KH₂PO₄	0.1g/l
MgSO₄·7H₂O	1.0g/l
CaCl₂·2H₂O	10mg/l
FeSO₄·7H₂O	10mg/l
MnSO₄·H₂O	5.0mg/l
바이오틴(멸균 여과됨)	0.3mg/l
트리아민·HCl(멸균 여과됨)	0.2mg/l
CaCO₃	25g/l

CSL(옥수수대 액), MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 및 염 용액을 암모니아수를 사용하여 pH 7로 조절하고 오토클레이브한다. 이어서, 멸균 물질과 비타민 용액 및 무수 오토클레이브한 CaCO₃를 가한다.

배플(baffle)이 장착된 100ml들이 원뿔형 플라스크내에서 10ml의 용량으로 배양을 수행한다. 33℃ 및 80% 대기 습도에서 배양을 수행한다.

72시간 후 660nm의 측정 파장에서의 OD를 바이오멕(Biomek) 1000[제조원: Beckmann Instruments GmbH, 무니히 소재]을 사용하여 측정한다. 형성된 라이신의 양을 에펜도르프-바이오트로닉사(Eppendorf-BioTronik, 독일 함부르크 소재)로부터의 아미노산 분석기를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피 및 후-컬럼 유도체화와 닌하이드린 검출에 의해 측정한다.

표 1은 실험 결과를 나타낸다.

균주	OD (660nm)	라이신·HCl g/l
DSM13994	9.7	18.9
DSM13994_Hdap_s	7.5	19.6

Claims

a) 디아미노피멜산 유사체, 특히 4-하이드록시디아미노피멜산에 대해 적어도 민감성인, L-라이신을 생산하는 코리네포름 세균을 발효시키는 단계;

b) 배지 또는 세균 세포속에 L-라이신을 풍부하게 하는 단계; 및 임의로

c) 발효 브로쓰로부터 L-라이신 또는 L-라이신을 함유하는 사료 첨가물을 분리함으로써, 발효 브로쓰 및/또는 생물량으로부터의 성분이 0% 이상 내지 100% 이하로 존재하도록 하는 단계를 수행함을 특징으로 하는, L-라이신의 생산 방법.
제1항에 있어서, L-라이신의 생합성 경로의 추가 유전자가 또한 증진된 세균을 사용함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, L-라이신의 발효를 감소시키는 대사 경로가 적어도 부분적으로 스위칭 오프(switching off)된 세균을 사용함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 동시에 하기 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 유전자들을 증진, 특히 과발현시킨 코리네포름 미생물을 발효시킴을 특징으로 하는, L-라이신의 생산 방법:

4.1 피이드백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자,

4.2 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자,

4.3 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자,

4.4 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자,

4.5 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 zwf 유전자,

4.6 동시에, 라이신 배출 단백질을 암호화하는 lysE 유전자,

4.7 Zwa1 단백질을 암호화하는 zwa1 유전자,

4.8 디아미노피멜산 데카복실라제를 암호화하는 lysA 유전자,

4.9 시그마 인자 C를 암호화하는 sigC 유전자,

4.10 트리오스 포스페이트 이소머라제를 암호화하는 tpi 유전자, 또는

4.11 3-포스포글리세레이트 키나제를 암호화하는 pgk 유전자.
제1항에 있어서, 동시에 하기 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 유전자들을 약화시킨 코리네포름 미생물을 발효시킴을 특징으로 하는, L-라이신의 생산 방법:

5.1 포스포에놀 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자,

5.2 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자,

5.3 DNA 헬리카제를 암호화하는 deaD 유전자,

5.4 시트레이트 라이세이즈를 암호화하는 citE 유전자,

5.5 O-석시닐벤조산 CoA-리가제를 암호화하는 menE 유전자,

5.6 전사 조절 MikE17을 암호화하는 mikE17 유전자,

5.7 피루베이트 옥사다제를 암호화하는 poxB 유전자 및

5.8 Zwa2 단백질을 암호화하는 zwa2 유전자.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 종의 미생물이 사용됨을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 4-하이드록시디아미노피멜산에 대해 민감성인 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 미생물이 사용됨을 특징으로 하는 방법.
L-라이신을 생산하고, 4-플루오로디아미노-피멜산, 4-하이드록시디아미노피멜산, 4-옥소-디아미노피멜산 또는 2,4,6-트리아미노피멜산을 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 디아미노피멜산 유사체 하나 이상에 대해 민감성인 코리네포름 세균의 돌연변이체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, L-라이신을 생산하고, 4-플루오로디아미노피멜산, 4-하이드록시디아미노피멜산, 4-옥소-디아미노피멜산 또는 2,4,6-트리아미노피멜산을 포함하는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 디아미노피멜산 유사체에 대해 민감성인 코리네포름 세균의 돌연변이체가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
a) 제1항 내지 제7항 및 제9항중의 어느 한 항에 따른 방법으로 생산된 L-라이신을 함유하고,

b) L-라이신을 생산하는 미생물의 발효 동안 형성된 발효 브로쓰로부터의 생물량 및/또는 성분을 0% 내지 5%의 양으로 함유함을 특징으로 하는, 발효 브로쓰를 기초로 하는 사료 첨가물.
a) 제1항 내지 제7항 및 제9항중의 어느 한 항에 따른 방법으로 생산된 L-라이신을 함유하고,

b) L-라이신을 생산하는 미생물의 발효 동안 형성된 발효 브로쓰로부터의 생물량 및/또는 성분을 90% 내지 10%의 양으로 함유함을 특징으로 하는, 발효 브로쓰를 기초로 하는 사료 첨가물.