KR910004368B1 - 발효법에 의한 l-라이신의 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

발효법에 의한 L-라이신의 제조방법

본 발명은 발효법에 의한 L-라이신의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 구체적으로는 호모세린(또는 L-메티오닌 및 L-스레오닌) 및 라이신 요구성과 라이신, 스레오닌 및 이소라이신 아나로그, 알지닌 아나로그들 및 기타 아나로그 [β-(2-티아졸릴)-DL-알라닌, 카나바닌, 카다버린, 스퍼민, 스퍼미딘, 퓨트리신, 5-하이드록시-우리딘, 알지닌 하이드록사메이트, 6-아자우라실]에 대하여 내성을 갖는 L-라이신 생산 변이주인 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) CS-755(KFCC-10672)를 배양시, L-라이신 고갈후 10시간 이내에 L-라이신을 0.1-0.3g/ℓ의 농도로 첨가횟수를 제한하여 첨가하고 배양하여 배양액으로부터 L-라이신을 분리회수함을 특징으로 하는 L-라이신의 제조방법에 관한 것이다.

L-라이신은 필수아미노산의 일종으로 가축의 사료, 식품첨가제, 의약원료 및 영양제등으로 사용되며, 가축의 사료에 첨가할 경우 체내 단백질의 흡수율을 증가시킬 수 있다.

그러나, 최근에 L-라이신의 수요가 급증하여 고역가 균주등에 관한 연구가 계속되고 있으며 유전자 조작 기술 및 세포융합 기술의 발달로 고역가 균주육종이 가능하게 되었다.

한편, L-라이신의 제조방법으로는 효소법과 발효법이 있으나 후자의 방법, 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)의 아미노산 요구성 균주를 배양하여 L-라이신을 제조하는 방법(국내특허공고 제79-1710호, 제79-1782호, 제81-1746호, 제85-1231호등)이 주를 이루고 있다.

L-라이신 생산균주에 L-라이신 영양요구성을 부여시켜 L-라이신을 생산하는 방법은 공지된 것으로 이 방법이 가능한 것은 L-라이신 생합성 경로에 관련된 디하이드로디피코리네이트 신세타제(Dihy-drodipicolinate synthetase)의 유전자 발현을 L-라이신이 억제하기 때문인 것으로 알려져 있다.(Agric. Biol. Chem., 42(8), 1501-1506, 1978).

따라서, 본 발명자등은 코리네박테리움 글루타미컴 CS-755 (KFCC-10672)을 배양하여 L-라이신을 생산하는 방법에 있어서, 미생물의 성장기 이후인 정상기(Stationary phase)중 일정기간 내에 L-라이신을 적당량 첨가하면 고농도의 L-라이신을 얻을 수 있을 뿐만 아니라. 발효시간도 단축시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명을 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

코리네박테리움 글루타미컴 YJ-150(FKCC-10014)을 자외선 및 NTG 처리하여 얻은 코리네박테리움 글루타미컴 CS-755(KFCC-10672)을 배양하면서 L-라이신 비생산 속도(Specifie production rate)를 측정한 결과, L-라이신이 고갈된 후에 높은 비생산 속도를 나타내어 약 10시간 동안 활성이 유지됨을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에서는 L-라이신이 고갈된 후에 소량의 L-라이신을 첨가한 결과 첨가 직후에는 L-라이신 비생산속도가 급격히 저하되지만 L-라이신 고갈후 다시 높은 활성이 수시간 지속됨을 확인하였을 뿐만 아니라, L-라이신의 농도를 0.1-0.3g/ℓ로 첨가함으로서 L-라이신 비생산속도의 저해를 억제하는 동시에 L-라이신 생산수율을 극대화시킬 수 있었다.

본 발명에 있어서, 균체성장의 정도는 배양액을 562nm에서 흡광도(Optical density)를 측정하여 건조균체량으로 표시하였으며 당분석은 공지의 버트린트법으로 시행하였고, L-라이신의 정량은 공지의 산성 닌히드린법(acid-ninhydrin법) 또는 고속 액체 크로마토그래피법(HPLC)에 의해 분석하였으며, L-라이신의 정량은 L-라이신 영양요구성을 갖는 페티오코커스 아시디락티시(Pediococcus acidilactici) ATCC-8042를 이용한 생물학적 분석법(Bioassay)이나 고속 액체 크로마토그래피법(HPLC)을 사용하여 분석했다.

다음의 실시예는 본 발명을 좀더 구체적으로 설명하는 것이다.

[실시예 1]

코리네박테리움 글루타미컴 YJ-150(KFCC-10014)에 자외선 및 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)을 처리하여 얻은 코리네박테리움 글루타미컴 CS-755(KFCC-10672)를 7ℓ 발효조에서 다음과 같은 조성을 갖는 발효배지를 사용하여 pH 6.9, 온도 32℃, 교반속도 600RPM, 통기속도 1VVM의 조건으로 배양하면서 L-라이신 첨가농도에 따라 생성되는 균체량을 측정하여 그 결과를 표 1에 기재하였다.

발효배지 조성 : 글루코오즈 75g, NaCl 2.5g, (NH₄)₂SO₄20g, KH₂PO₄1.5g, MgSO₄·7H₂O 0.6g, 이스트추출물 3g, L-스레오닌 1g, DL-메티오닌 0.7g, MnSO₄·4-6H₂O 12㎎, FeSO₄·7H₂O 12㎎, L-라이신 0.1-0.9g, 비오틴 300㎍, 티아민염산염 500㎍, 판토텐산 1.5㎎, 나아신아미드 1.5㎎, 소포제(5%) 3ml, 증류수 1ℓ, pH 6.9.

[표 1] L-라이신 첨가농도에 따른 균체량

표 1의 기재로부터 알 수 있는 바와 같이, 균체량은 L-라이신의 첨가량에 비례하여 증가하였다.

[실시예 2]

실시예 1의 균을 0.6g/ℓ의 L-라이신을 함유하는 실시예 1의 배지에서 배양하면서 균체량, L-라이신의 잔류양, L-라이신의 양, 당농도를 분석하여 결과를 표 2에 기재하였다.

[표 2] 배양시간에 따른 L-라이신의 비생산속도

* 추가당 첨가시간 : 균 접종후 19시간

표 2의 기재로부터, 균의 성장기에는 L-라이신 비생산속도가 낮았으며 정상기(Stationary phase)에서 최대의 비생산속도에 도달하여 일정기간 유지되었으나 그후에 점차로 비생산속도가 저하됨을 알 수 있다.

[실시예 3]

L-라이신이 고갈된 상태인 배양 22.5시간 후에 0.2g/ℓ의 L-라이신을 첨가한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 코리네박테리움 글루타미컴 CS-755(KFCC-10672)를 배양하면서 균체 성장정도와 L-라이신 비생산속도를 측정하여 그 결과를 표 3에 기재하였다.

[표 3] 배당액중 L-라이신 고갈에 따른 L-라이신 비생산속도의 변화

* L-라이신 추가시간 : 접종후 22.5시간

추가당 첨가시간 : 접종후 18시간

표 3의 기재로부터 알 수 있는 바와 같이, L-라이신 첨가 직후에는 균체성장이 계속되고 L-라이신 비생산속도가 급격히 저하되지만, 배양액중의 L-라이신이 고갈되면서 점차로 L-라이신 비생산속도가 회복되었다.

[실시예 4]

다음과 같은 조성을 갖는 배지에서 pH 6.9, 배양온도 32℃, 교반속도 600RPM , 통기량 1.0VVM의 조건으로 당, 메티오닌, 스레오닌, (NH₄)₂SO_4,L-라이신을 수회에 걸쳐 추가로 첨가하면서 코리네박테리움 글루타미컴 CS-755(KFCC-10672)를 배양하고 L-라이신 첨가시기와 첨가횟수에 따른 L-라이신 비생산 속도를 측정하여 그 결과를 표 4에 기재하였다.

배지조성 : 당밀(환원당 함량 53%) 150g, (NH₄)₂SO₄11g(추가량), NaCl 2.7g, KH₂PO₄1.1g, MgSO₄·7H₂O 1.0g, MnSO₄·4-6H₂O 13㎎, FeSO₄·7H₂O 13㎎, L-스레오닌 150g(추가량), L-메티오닌 50㎎(추가량), 티아민염산염 540㎍, 비오틴 325㎍, 니아신아미드 1650㎍, 판토텐산 1650㎍, 소포제(5%) 3ml, L-라이신 0.92g, 증류수 1ℓ, pH 6.9.

[표 4] L-라이신 추가농도 및 추가횟수에 따른 L-라이신생산

표 4의 기재로부터 알 수 있는 바와 같이, L-라이신을 4회에 나누어 첨가한 경우에, 배지중 L-라이신이 고갈된 후 10시간 이내에 L-라이신이 첨가됨에 따라 균체의 L-라이신 비생산속도를 높게 유지시키면서 발효를 진행시킬 수 있기 때문에 고농도의 L-라이신을 제조하는데 효과적이었다.

[실시예 5]

표 5에 기재된 바와 같이 추가 L-라이신양을 변화시키고 L-라이신 및 당을 1회만 추가하여 첨가한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 배양하면서 L-라이신 농도에 따른 L-라이신 생산량을 측정하고 그 결과를 표 5에 기재하였다.

[표 5] L-라이신 추가농도에 따른 L-라이신 생산량

* L-라이신 및 당 추가첨가시간 : 접종후 12시간

표 5의 기재로부터 알 수 있는 바와 같이, L-라이신의 농도가 0.1g/ℓ이하일 경우에는 발효시간이 지연될 뿐만 아니라 L-라이신 생산이 저조하였으며, 0.4g/ℓ이상일 경우에는 발효시간은 단축되었지만 L-라이신 합성저해로 인하여 L-라이신 생산이 역시 저조하였다. 즉, L-라이신 첨가농도가 0.1-0.3g/ℓ일 경우에 발효시간이 단축되고 L-라이신 생산량이 우수하였다.

Claims (2)

1. 호모세린 및 라이신에 대한 영양요구성과 라이신, 스레오닌, 이소라이신아나로그, 알지닌아나로그 또는 기타 아나로그에 내성을 갖는 L-라이신 생산변이주 CS-755(KFCC-10672)를 배양함에 있어서, L-라이신이 고갈된 후에 첨가농도 0.1-0.3g/ℓ로 L-라이신을 첨가횟수를 제한하여 첨가함을 특징으로 하는 발효법에 의한 L-라이신의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, L-라이신의 첨가는 초기의 L-라이신의 고갈된 이후 10시간 이내에 행함을 특징으로 하는 제조방법.