KR20010029688A

KR20010029688A - Ｄ-판토텐산 및/또는 이의 염을 함유하는 가축사료 첨가물및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20010029688A
Application number: KR1020000023984A
Authority: KR
Inventors: 빈터미하엘; 우프만클라우스-에리히; 발거일로나; 벡커울리히; 페페를레발터; 프리드리히하인츠
Original assignee: 데구사-휠스 악티엔게젤샤프트
Priority date: 1999-05-05
Filing date: 2000-05-04
Publication date: 2001-04-06
Also published as: SK283900B6; CN1276981A; MXPA00004310A; IL135956A; JP2000325024A; EP1050219B1; BR0002297A; PT1050219E; RU2245628C2; HUP0001772A2; HUP0001772A3; DK1050219T3; EP1050219A1; HU0001772D0; ATE227938T1; SK6452000A3; ES2188442T3; IL135956A0; ID25885A

Abstract

본 발명은 D-판토텐산 생산 미생물을 발효시켜 수득되고, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘 또는 칼슘염의 그룹으로부터 선택되는 D-판토텐산의 염 하나 이상을 함유하고, 임의로 상기 화합물들 중 하나 이상을 부가하여 수득된 발효 브로스에 기초한 가축사료 첨가물을 제공한다.

Description

Ｄ-판토텐산 및/또는 이의 염을 함유하는 가축사료 첨가물 및 이의 제조 방법 {A feedstuff additive which contains D-pantothenic acid and/or its salts and a process for the preparation thereof}

본 발명은 D-판토텐산 및/또는 이의 염 중 하나를 함유하는, 발효 브로스에 기초한 동물 가축사료 첨가물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

판토텐산은 연간 수천톤의 규모로 전세계에서 생산되고 있다. 생산된 판토텐산의 대부분은 가금 및 돼지 같은 경제적으로 유용한 동물을 사육하는데 사용된다. 수요는 증가하고 있다.

판토텐산은 화학적으로 합성하거나 적합한 영양액 중에서 적합한 미생물을 발효시켜 생명공학적으로 제조할 수 있다. 화학적 합성의 경우, DL-판토락톤이 중요한 전구체이다. 이는 포름알데하이드, 이소부틸알데하이드 및 시아나이드로부터 다단계 방법에서 제조된다. 추가의 방법 단계들에서, 라세미체 혼합물을 분리하고 D-판토락톤을 β-알라닌과 함께 축합시켜 D-판토텐산을 생산한다.

전형적인 시판 형태는 D-판토텐산의 칼슘염이다. D,L-판토텐산의 라세미체 혼합물의 칼슘염이 또한 사용될 수 있다.

미생물을 사용한 발효 제조의 장점은 바람직한 입체이성체 형태, 즉 D 형태를 직접적으로 형성시킨다는 것이며, 이는 어떠한 L-판토텐산도 함유하지 않는다.

문헌[EP-A 제0 493 060호, EP-A 제0 590 857호 및 WO 제97/10340호]에 나타낸 바와 같이, 다양한 유형의 세균, 예를 들면 에스케리치아 콜라이, 아트로박터 우레아패시언스, 코리네박테리움 에리트로게네스, 브레비박테리움 암모니아게네스 및 또한 효모(예를 들면, 데바로마이세스 카스텔리)가 적합한 발효 조건하에서 D-판토텐산을 생산할 수 있다. 특히 적합한 미생물은 예를 들면, 균주 FV5069/pFV31 또는 FV5069/pFV202 같은, 문헌에 기술된 에스케리치아 콜라이 IFO3547의 유도체이다.

D-판토텐산의 발효적 제조 동안, 문헌[EP-A 제0 493 060호, EP-A 제0 590 857호 및 WO 제97/10340호]에 기술된 바와 같이, D-판토텐산을 생산할 수 있는 미생물을 적합한 영양분에서 배양하고 이후에, 생산된 D-판토텐산은 고비용으로 분리하고, 정제하여 칼슘염으로서 제조한다.

적합한 영양 배지는 탄소원[예를 들면, 글루코오스, 전분 가수분해물, 슈크로오스, 당밀, 전구체(예를 들면, β-알라닌, D,L-판토산 또는 D,L-판토락톤)], 질소원(예를 들면, 암모늄 설페이트), 인 공급원(예를 들면, 인산칼륨 및 기타 염들), 미량 원소 및 비타민을 함유하며, 임의로 예를 들면, 효모 추출물 같은 복합 배지 첨가물을 함유한다. 이후, 미생물을 적합한 pH에서 적당한 통기 및 교반과 함께 상기 배지에서 배양하면, 상기 미생물은 D-판토텐산을 분비한다.

문헌[WO 제96/33283호 및 EP-A 제0 590 857호]에 의해 대표되는 최근 선행 기술에 따르면, D-판토텐산의 칼슘염은 D-판토텐산 함유 발효 브로스로부터 고비용의 분리 및 정제에 의해 수득된다. 바이오매스를 여과 및 농축으로 최초 분리한 후, 활성탄 또는 컬럼 크로마토그래피를 사용한 정제로 여과물에 대한 추가의 가공을 수행한다. 상기 방법으로 수득한 용액을 수산화칼슘과 반응시킨 후, 바람직한 Ca 염이 결정화된다.

문헌[WO 제96/33283호]에 따라서, 상기 여과물을 제1 컬럼에서 활성탄으로 탈색시킨다. pH를 농축 염산을 사용하여 3.0으로 조정한 후 상기 액체를 연속적으로 활성탄으로 채워진 두 개의 추가의 컬럼으로 정제한다. D-판토텐산의 용출은 메틸 알콜을 사용하여 달성한다. Ca(OH)₂분말을 사용하는 후속적인 중화 단계 후, 용액을 수득하고, 이로부터 D-판토텐산 칼슘을 5℃에서 결정화에 의해 회수한다.

문헌[EP-A 제0 590 857호]에 기술된 방법에서, 여과물을 우선 탄소 및 음이온 교환 컬럼을 사용하여 정제한다. 염산을 사용하여 용출을 수행한다. 이후, 용출된 분획을 Ca(OH)₂를 사용하여 중화시키고, 활성탄을 부가하고 혼합물을 여과시킨다. 수득된 여과물을 저분자량 알콜(메탄올, 에탄올, 이소프로판올)을 사용하여 추출하고 D-판토텐산 칼슘을 결정화로 수득한다.

상기된 방법으로 제조된 D-판토텐산 칼슘을 동물 사육을 위한 가축사료 중 첨가물로서 사용한다.

선행 기술에 따라서, 화학적 합성 또는 발효로 제조된 판토텐산을 바람직한 염 용액과 반응시켜 D-판토텐산의 염과 D,L-판토텐산의 염을 제조한다.

본 발명의 목적은 가축사료 첨가물로 적합한 D-판토텐산 및 이의 염의 신규한 제조 형태를 제공하는 것이다.

추가로, 본 발명의 목적은 현재 공지된 방법에 비해 보다 경제적이고 효율적인 제조 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 플라스미드 pND-DBC2의 차트이다.

도 2는 플라스미드 pJDCEX2의 차트이다.

도 3은 플라스미드 pJD-YHR063c의 차트이다.

본 발명은, 발효 브로스가 a) D-판토텐산 및/또는 이의 염, 특히 알칼리 금속 또는 알칼리 토 금속염, b) 발효 동안 0 내지 100%의 양으로 형성되는 바이오매스, 및 c) 발효 브로스 중 과반수 이상의 기타 용해된 성분을 함유하며, d) 고체 형태, 특히 미분된 형태 또는 과립 및 자유 유동 형태로 존재함을 특징으로 하는, 발효 브로스에 기초하는 동물 가축사료 첨가물을 제공한다.

필요 조건에 따라서, 첨가물은 일반적으로 분무 건조되거나 동결 건조되고, 미분된 자유 유동성 분말, 또는 그밖에 과립 형태로 제공되며, 이는 상이한 비율의 바이오매스를 함유할 수 있다. 벌크 밀도는 특히 약 500kg/㎥이다. 첨가물은 저장 안정성이 있다.

바이오매스를 분리하는 경우, 천연의 기타 (예를 들면, 무기성) 고체들이 또한 제거된다. 부가적으로, 본 발명에 따른 첨가물은, 적합한 방법으로 분리되지 않는 한 발효 브로스내에 용해되어 존재하는 과반수 이상의 생산되거나 임의로 부가된 물질들을 함유한다.

상기 물질들은 D-판토텐산 이외에, 발효 동안 사용된 미생물에 의해 생산되어 분비된 유기 2차 생성물을 포함할 수 있다. 이는 그룹, L-메티오닌, L-리신, L-발린, L-트레오닌, L-알라닌 또는 L-트립토판, 특히 L-발린으로부터 선택된 L-아미노산을 포함한다. 추가로, 예를 들면, 아세트산, 락트산, 시트르산, 말산 또는 푸마르산 같은 세 개 이하의 카복실 그룹을 함유하는 유기산이 또한 포함된다. 최종적으로, 거의 전환될 수 없는 당, 예를 들면, 트레할로오스 같은 당도 또한 포함된다. 이러한 화합물은 첨가물의 효용성에 기여하는 경우, 임의로 바람직하다.

추가로, 이러한 물질들은 예를 들면, 글루코오스 또는 사카로오스 같은 사용된 전환될 수 있는 당으로부터의 배합물을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 D-판토텐산 및/또는 이의 염을 함유하는 가축사료 첨가물을 제조하는 방법을 제공하며, 이는 a) 일반적으로 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘 또는 칼슘염을 함유하는 D-판토텐산 함유 브로스를 발효에 의해 제조하고, b) 이로부터 바이오매스를 임의로 완전하게 또는 부분적으로 분리하고, c) 알칼리 토금속 또는 알칼리 금속의 수산화물 또는 산화물을 상기 방법으로 수득한 용액 또는 브로스에, 바람직하게는 D-판토텐산에 대해 화학량론적 양으로 부가하며, d) 상기 방법으로 수득한 혼합물을 건조, 분무 건조, 분무 과립화 또는 과립화시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, D-판토텐산 및/또는 이의 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘 또는 칼슘염을 발효 브로스로부터 20 내지 80 중량%(건조 중량)의 범위에서 함유하는 가축사료 첨가물의 제조 방법을 제공하며, 이는 a) 바람직하게는, 발효 브로스로부터 물의 제거(농축 단계), b) 임의로, 발효 동안 형성된 바이오매스의 0 내지 100%의 제거, c) a) 및 b)에 따라서 수득된 발효 브로스에 언급된 화합물 하나 이상의 부가(이때, 부가된 화합물의 중량은 동물 사료 첨가물내 이들의 전체 농도가 약 20 내지 80 중량%, 특히 50 내지 80 중량%의 범위가 되는 중량이다), 및 d) c)에 따라서 수득된 발효 브로스를 건조시켜 바람직한 분말 형태 또는 과립 형태의 동물 가축사료 첨가물을 수득하는 것을 특징으로 한다.

D-판토텐산 생산에 적합한 미생물을 사용하여 수득된, D-판토텐산 및/또는 이의 염을 함유하는 발효 브로스가 본 발명에 따른 방법에 적합하다.

미생물은 진균 또는 효모(예를 들면, 데바로마이세스 카스텔리), 그람-양성 세균(예를 들면, 코리네박테리움 속) 또는 그람-음성 세균(예를 들면, 엔테로박테리아세애 과)일 수 있다. 에스케리치아 콜라이 종을 포함하는 에스케리치아 속이 엔테로박테리아세애 과에서 특히 언급된다. 에스케리치아 콜라이 종에서, 소위 K-12 균주(예를 들면, 균주 MG1655 또는 W3110[Neidhard et al., Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington D.C.)]) 또는 에스케리치아 콜라이 야생형 균주 IFO3547(Institut fur Fermentation, Osaka, Japan) 또는 이로부터 유도된 돌연변이체들을 언급할 수 있다. 또한, IFO3547로부터 제조된 균주들 중에서, 명칭이 FV5069/pFV31[EP-A 제0 590 857호] 및 FV5069/pFV202[WO 제97/10340호]인 것들이 특히 언급된다. 코리네박테리움 글루타미쿰 종이 특히 코리네박테리움 속에서 언급된다.

상기 언급된 미생물들은 D-판토텐산 생산을 위한 배치 방법, 페드-배치 방법 또는 반복 페드-배치 방법에서 연속적으로 또는 배치형식으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법의 요약은 문헌[Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991] 또는 문헌[Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994]에서 제시된다.

사용하는 배양 배지는 적합한 방식으로 특정 미생물의 필요조건을 만족시켜야만 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지에 대한 기술은 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" produced by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 제시된다. 당 및 탄수화물(예를 들면, 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 당밀, 전분 및 셀룰로오스), 오일 및 지방(예를 들면, 간장유, 해바라기 기름, 낙화생유 및 코코넛 지방), 지방산(예를 들면, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예를 들면, 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예를 들면, 아세트산)을 탄소원으로 사용할 수 있다. 이들 물질들은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 유기 질소 함유 화합물(예를 들면, 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두 가루 및 우레아) 또는 무기 화합물(예를 들면, 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카보네이트 및 암모늄 니트레이트)을 질소원으로서 사용할 수 있다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 인 공급원으로서 사용할 수 있다. 배양 배지는 또한 금속염, 예를 들면, 마그네슘 설페이트 또는 철 설페이트를 함유해야 하며, 이는 성장에 필요하다. 최종적으로, 아미노산 및 비타민 같은 필수 성장-촉진 물질을 상기 언급된 물질에 부가하여 또한 사용한다. 부가적으로, 아스파르테이트, β-알라닌, 케토이소발레레이트, 케토판토산 또는 판토산 같은 D-판토텐산의 전구체 및 임의로 이의 염을 또한 배양 배지에 부가할 수 있다. 언급된 공급 성분들을 1회 배치의 형태로 배양물에 부가하거나 배양 동안 적합한 방식으로 배양물에 공급할 수 있다.

암모니아 또는 암모니아수는 pH를 조절하는데 바람직하게 사용한다. 수산화나트륨 또는 수산화칼륨 같은 기타 염기성 화합물이 임의로 적합할 수 있다. 산성 화합물이 필요한 경우, 인산 또는 황산이 적합한 방식으로 사용된다. 발포체의 생성을 조절하기 위해서, 소포제, 예를 들면 지방산 폴리글리콜 에스테르가 사용된다. 선택적으로 작용하는 적합한 물질, 예를 들면 항생제를 배지에 임의로 부가하여 플라스미드의 안정성을 유지시킨다. 통기 조건을 유지하기 위해서, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물(예를 들면, 공기)을 배양물내로 통과시킨다. 배양 온도는 정상적으로는 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양 공정은 최대량의 D-판토텐산이 생산될 때까지 계속한다. 이러한 목표는 일반적으로 10시간 내지 160시간내에 달성된다.

상기 방법으로 수득된 발효 브로스는 일반적으로 7.5 내지 25 중량%의 건조 중량을 가지며 0 초과 내지 20 중량%의 농도로 D-판토텐산을 함유한다. 발효를 완결한 후 D-판토텐산이 2 내지 20 중량%의 건조 중량으로 축적되는 발효 방법이 특히 유리하다. 발효 공정이 최소한 말기에는, 그러나 유리하게는 발효 시간의 30% 이상 동안 당-제한된 방식으로 수행되는 것이 또한 유리하다. 즉, 발효 배지내에서 전환될 수 있는 당의 농도는 0 이상 내지 3g/ℓ로 유지되거나, 상기 시간 동안은 이범위까지 낮아진다.

본 발명에 따른 첨가물을 제조하는데 있어서 암모늄 이온을 함유하는 다른 방법에서, 바이오매스는 예를 들면, 원심분리, 여과, 따르기 또는 이의 혼합 방법 같은 공지된 분리 방법으로 D-판토텐산 함유 발효 브로스로부터 임의로 처음에 완전히 또는 부분적으로 제거시킨다. 그러나, 본 발명에 따라서, 발효 브로스내에 전체 바이오매스를 방치하는 것이 또한 가능하다. 최종적으로, D-판토텐산에 대해, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 산화물 또는 수산화물, 특히, NaOH, KOH, Ca(OH)₂또는 MgO 0.8 내지 1.2, 바람직하게는 0.95 내지 1.1 당량을 일반적으로 상기 브로스에 부가한다. D-판토텐산 농도가 낮은 경우, 보다 많은 양, 예를 들면, 1.2 내지 4 당량의 산화물 또는 수산화물을 사용하는 것이 또한 유리할 수 있다. 상기 방법으로 수득한 현탁액을 일반적으로 건조시키기 전에 최대 60 중량%의 건조 중량으로 농축시킨다. 우선 발효 브로스를 농축시키고 산화물 또는 수산화물을 부가하는 것이 또한 가능하다. 이후, 수득된 농축물을, 통상적인 건조기에서, 또는 예를 들면 낙하 막 증발기 또는 박막 증발기를 사용하거나, 분무 건조기, 분무 과립화기 또는 동결-건조 단위를 사용하여, 부을 수 있고 자유 유동하는, 미분된 분말 또는 과립으로 전환시킬 수 있다. 과립화는 건조 이후, 예를 들면 축적(build-up) 과립화의 형태로 발생한다.

추가로, 본 발명자들은 신속하고 비용-효과적인 방식으로 D-판토텐산 암모늄, 칼륨, 나트륨, 마그네슘 또는 칼슘 함유 분말 또는 이들을 함유하는 대표적인 형태들을 제조하는 신규한 방법을 확인하였다. 이를 위해서, D-판토텐산 함유 발효 브로스를 상응하는 하이드록실 화합물을 사용하여 제조하고, 예를 들면, 원심분리, 여과, 따르기 또는 이의 혼합 방법 같은 공지된 분리 방법으로 바이오매스를 임의로 우선 완전히 또는 부분적으로 제거한다. 그러나, 본 발명에 따라서, 발효 브로스내에 전체 바이오매스를 방치하는 것도 또한 가능하다. 이후, 임의로 예비-처리한 브로스를 농축하거나 예를 들면, 회전 증발기, 박막 증발기 또는 낙하 막 증발기를 사용하는 것과 같은 공지된 방법을 사용하여 건조시킨다. 이후에, 임의로 예비-처리한 브로스를 분무-건조, 분무 과립화 또는 동결-건조 또는 몇몇 기타 방법을 사용하여 가공하여 부을 수 있고, 자유 유동하는 미분된 분말 또는 과립을 수득한다.

본 발명에 따른 신규한 동물 가축사료 첨가물은 일반적으로 전체 중량에 대해 D-판토텐산 및/또는 이의 염을 20 내지 80 중량%, 바람직하게는 30 내지 75 중량%를 함유한다. 이들은 또한 일반적으로 2.5 내지 25 중량%의 무기 성분 및 임의로 0 초과 내지 30 중량%의 유기 2차 생성물을 함유한다. 건조 바이오매스의 비율은 0 내지 35 중량%이다. 수분 함량은 바람직하게는 5 중량% 이하이다. D-판토텐산 및/또는 언급된 염 중 하나 이상의 바람직한 농도는 상응하는 화합물을 발효적으로 생산된 생성물에 부가함으로써 임의로 생성된다. 바람직한 화합물은 바람직하게는 용액 형태 또는 건조 물질의 형태로 건조 또는 분무 건조 전에, 특히 혼합물을 농축한 후에, 혼합물에 부가되어 이와 함께 혼합된다. 상기 방법으로 수득되는 생성물을 가축사료 첨가물로서 사용한다.

D-판토텐산의 농도는 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다[Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)].

실시예

본 발명은 하기 실시예를 수단으로 하기에서 보다 상세히 설명된다. 이러한 목적을 위해서, 부다페스트 조약에 따라서, 국제기탁기관[Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology in 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki (Japan)]에 기탁번호 FERM-BP 제4395호로 기탁된 D-판토텐산 생산 균주 에스케리치아 콜라이 5069/pFV31을 사용하여 실험을 수행한다.

실시예 1

D-판토텐산 함유 발효 브로스의 제조

1. 접종물 제조

에스케리치아 콜라이 FV5069/pFV31의 샘플을 암피실린 50㎍/㎖을 보충한 LBG 아가상에 도말한다. 상기 아가 플레이트 배양물을 37℃에서 17시간 동안 배양한 후 +4℃에서 냉장고에 저장한다. 이후에, 선택된 개별적인 콜로니를 LBG 브로스에서 추가로 증식시킨다. LBG 브로스는 하기 조성을 갖는다: 펩톤 10g/ℓ, 효모 추출물 5g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, 및 글루코오스 1g/ℓ. LBG 아가는 또한 아가 12g/ℓ를 포함한다. 이미 제조된 조제품을 LB 브로스 기초 또는 LB 아가로서 제조원 (Gibco/BRL, Paisley, Scotland, Great Britain)으로부터 구입할 수 있다. 글루코오스 1g/ℓ를 부가한 후, 상기 언급된 배지를 수득한다. 100㎖ 코니칼 플라스크에 위치시킨 배양물 10㎖를 37℃에서 ESR 배양기(제조원: Kuhner AG, Birsfelden, Switzerland)에서 180rpm으로 16시간 동안 배양한다. 이후, 세포 현탁액을 4000rpm에서 15분 동안 J-6B 원심분리기(제조원: Beckmann, Hannover, Germany)에서 원심분리시킨다. 세포 펠렛을 글리세롤 20%로 보충한 LBG 배지 10㎖에 재현탁시키고, 각각 1㎖씩 10개의 분취물을 멸균 조건하에서 용기에 저장하고 -70℃로 동결시킨다. 이러한 배양물을 주 세포 은행으로서 사용한다.

발효용 세포 은행을 제조하기 위해서, 암피실린 50㎍/㎖를 보충한 LBG 배지를 10㎖ 분획으로 100㎖ 코니칼 플라스크내에 분배한 후 상기된 주 세포 은행 100㎕로 접종한다. 혼합물을 37℃에서 ESR 배양기(제조원: Kuhner AG, Birsfelden, Switzerland)에서 16시간 동안 배양한다. 배양 후, 배양 현탁액의 흡광도(OD)를 660㎚에서 LP2W 광도계(제조원: Dr. Lange Co., Berlin, Germany)를 사용하여 측정한다. 결과는 3.5이다. 이후, 세포 현탁액을 멸균 조건하에서 멸균된 30㎖ 폴리에틸렌 뷰브(제조원: Greiner Co., Frickenhausen, Germany)에 위치시키고 J-6B 원심분리기(제조원: Beckman, Hannover, Germany)를 사용하여 2500rpm에서 15분 동안 원심분리시킨다. 분리된 바이오매스를 글리세롤 20%로 보충한 LBG 배지 10㎖에 재현탁시킨다. 이후, 세포 현탁액을 멸균 조건하에서 1㎖ 멸균된 (원문 그대로)(제조원: Nalgene Co., New York, U.S.A.)에서 500㎕씩 분획시키고, -70℃에서 동결시킨다. 상기 방법으로 제조된 보존된 분획들을 발효용 세포 은행으로서 사용한다.

2. D-판토텐산 함유 발효 브로스의 제조

판토텐산 함유 발효 브로스의 제조에서, 발효용 세포 은행을 우선 진탕 플라스크 배양에서 증식시키고 이를 사용하여 예비 발효기를 접종시킨다. 예비 발효기로부터의 배양물을 사용하여 생산 발효기를 접종시킨다

SKA 배지를 진탕 플라스크 배양에서 사용한다. SKA 배지는 하기에 기술된 바와 같이 제조한다. 25% 암모니아 용액을 사용하여 미리 pH를 6.8로 조절한 (NH₄)₂SO₄7.0g, KH₂PO₄0.5g, K₂HPO₄1.0g, MgSO₄*7H₂O 0.5g, MnSO₄*H₂O 0.01g, ZnSO₄*7H₂O 0.01g, Fe₂(SO₄)₃0.005g, 및 옥수수 침지액 20g을 1ℓ 유리 비이커내로계량해 넣고 증류수 875㎖를 이에 부가한다. 상기 옥수수 침지액 함유 염 용액을 오토클래이브에서 121℃에서 20분 동안 멸균시킨다. 추가로, 증류수 125g, 글루코오스 28.7g 및 티아민*HCl 0.002g으로 이루어진 용액을 여과시켜 멸균시킨다. CaCO₃10g을 100㎖ 플라스크내로 계량해 넣고 오토클래이브에서 123℃에서 20분 동안 멸균시킨다. SKA 배지를 상기 언급한 두 성분과 옥수수 침지액 함유 염 용액과 혼합하여 수득한다.

상기 SKA 배지를 100㎖ 코니칼 플라스크에 12.5㎖ 분획으로 분배한 후 세포 현탁액 0.5㎖를 접종한다. 발효용 세포 배양물의 보존된 일부분을 멸균 생리적 식염수로 1:100으로 희석하여 세포 현탁액으로서 사용한다. 배양은 32℃에서 RC-1-TK 배양기(제조원: Infors AG, Bottmingen, Switzerland)에서 150rpm에서 수행한다. 상기 공정 후 660㎚의 측정 파장(OD 660)에서의 흡광도는 12.5이다.

상기 진탕 플라스크 배양물 0.5㎖를 생리적 염수 4.5㎖로 희석하고 이중에서 0.7㎖를 2ℓ 연구실용 발효기 모델 BiostatMD(제조원: Braun Diessel Biotech GmbH, Melsungen, Germany)에서 처음에 넣어 둔 배양 배지 1300㎖를 접종하는데 사용한다.

배양 배지를 하기와 같이 제조한다. 수돗물 1300㎖ 중 (NH₄)₂SO₄9.81g, KH₂PO₄0.7g, K₂HPO₄1.402g, MgSO₄*7H₂O 0.70g, MnSO₄*H₂O 0.014g, Fe₂(SO₄)₃0.014g, 및 옥수수 침지액 28.04g으로 이루어지는 용액을 25% 암모니아 용액을 사용하여 pH를 6.5로 조절하고 오토클래이브에서 121℃에서 20분 동안 멸균시킨다. 상기 옥수수 침지액 함유 염 용액에 멸균 조건하에서 증류수 100g 중 글루코오스 40.62g 및 티아민*HCl 0.0042g을 함유하는 개별적인 멸균-여과된 용액을 부가한다.

발효는 37℃에서 1vvm의 통기율로 16시간 동안 수행한다. 용해된 산소는 20%로 유지시키고 pH는 6.5로 유지시킨다. 25% 암모니아 용액을 pH 조절제로서 사용한다. 흡광도는 13.1이다. 상기 배양물 90㎖를 사용하여 2ℓ 실험실용 발효기, BiostatMD 모델에서 주 발효 공정을 위하여 성장 배지 1144㎖를 접종한다.

성장 배지를 하기와 같이 제조한다. 수돗물 1144㎖ 중 (NH₄)₂SO₄4.14g, KH₂PO₄0.744g, K₂HPO₄1.0g, MgSO₄*7H₂O 0.83g, MnSO₄*H₂O 0.0124g, β-알라닌 18.87g, Struktol J647 0.74g, 및 옥수수 침지액 49.72g으로 이루어지는 용액을 25% 암모니아 용액을 사용하여 pH를 6.5로 조절하고 121℃에서 20분 동안 오토클래이브에서 멸균시킨다. 상기 옥수수 침지액 함유 염 용액에 증류수 100㎖ 중 글루코오스 35.92g 및 티아민*HCl 0.002g을 함유하는 개별적인 멸균-여과된 용액을 멸균 조건하에서 부가한다.

발효는 37℃에서 40시간 동안 수행한다. 성장기에서, pH는 6.5이며 통기율은 1vvm이다. 생산기에서 pH는 6.0이며 통기율은 1.5vvm이다. 용해된 산소는 두 단계에서 2% 미만으로 유지된다. 25% 암모니아 용액을 pH 조절제로서 사용한다. 발효 동안, 생산 배지 1 및 생산 배지 2가 단계적으로 공급된다. 옥수수 침지액을 배양 동안 한번에 부가한다. 생산 배지 1은 수돗물 584㎖ 중 글루코오스 465.29g 및 티아민*HCl 0.0261g을 함유하며 멸균-여과된다. 생산 배지 2는 121℃에서 20분 동안 오토클래이브에서 멸균한 수돗물 140㎖ 중 β-알라닌 37.5g을 함유한다. 7.5시간의 발효시간 후 및 배양 단계의 말기까지, 생산 배지 1을 단계적으로 공급한다. 배양 10.5시간 후, 수돗물 100㎖에 용해시키고 121℃에서 20분 동안 오토클래이브에서 멸균시킨 옥수수 침지액 49.5g을 멸균 조건하에서 부가한다. 12.5시간의 발효 시간 후 및 배양 단계 말기까지, 생산 배지 2를 3.5g/h의 부가 속도로 공급한다. 배양 41시간 후, 발효 브로스에서 6.1 중량%의 판토텐산 농도가 확인된다.

D-판토텐산의 농도는 5㎛ 입자 크기를 갖는 Hypersil APS2 아미노 상을 사용하는 RI(refracrive index, 굴절 지수) 검출을 수단으로 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 유니트 모델 M321(제조원: Knauer, Berlin, Germany)을 사용하여 결정한다.

실시예 2

실시예 1에 기술된 바와 같은 동일한 조건하에서 수행되는 발효 실험에서, 5.4 중량%의 판토텐산 농도가 43시간의 배양 시간 후 발효 브로스에서 검출된다. L-발린의 농도는 8g/ℓ이다.

실시예 3

D-판토텐산 칼슘의 제조

우선, 실시예 1 및 2에 기술된 방법을 사용하여 제조되고 D-판토텐산 6.1 중량%를 함유하는 판토텐산 함유 발효 브로스로부터 바이오매스를 분리시킨다. 이를 위해서, 상기 언급된 발효 브로스 1ℓ를 실험실용 원심분리기, Biofuge-Stratos 모델(제조원: Heraeus, Dusseldorf, Germany)을 사용하여 4000rpm에서 20분 동안 원심분리시키고, 원심분리 상등액을 UF 유니트 중 30kD의 MRC 폴리머 멤브레인(제조원: ICT GmbH, Bad Homburg, Germany)을 사용하여 직교류 한외여과로 추가로 정제한다.

이후, 고체 Ca(OH)₂10.1g(96%, 제조원: Merck, Darmstadt, Germany)를 배치방식으로 부가하면서 교반시킨다. pH는 약 10.3이다. 이후, 상기 방법으로 처리한 브로스를 회전 증발기 Rotavapor RE-120(제조원: Buchi-Labortechnik GmbH, Konstanz, Germany)에서 60℃에서 진공하에서 약 50% 건조 중량의 액체 함량까지 농축시킨다. 이후, 상기 방법으로 수득한 농축된 브로스를 분무 건조시켜 D-판토텐산의 칼슘염을 제조한다. 상기 목적을 위해서, 실험실용 분무 건조기, Buchi-190(제조원: Buchi-Labortechnik GmbH, Konstanz, Germany)를 입구 온도 107℃, 출구 온도 85℃, 압력차 -40 mbar 및 공기 유속 600NL/h에서 사용한다.

상기 방법으로 제조된 D-판토텐산 칼슘 함유 생성물은 68.5 중량%의 농도의 판토텐산을 가지고 자유 유동하며 460㎎/㎖의 벌크 밀도를 갖는다. 5개월 동안 저장한 후, D-판토텐산의 농도는 67.6 중량%이다.

실시예 4

D-판토텐산 나트륨의 제조

우선, 실시예 1 및 2에 기술된 방법을 사용하여 제조되고 D-판토텐산 6.1 중량%를 함유하는 판토텐산 함유 발효 브로스로부터 바이오매스를 분리시킨다. 이를 위해서, 상기 언급된 발효 브로스 1ℓ를 실시예 3에서 기술한 바와 동일한 방법으로 원심분리하고 한외여과한다.

이후, NaOH 10.6g(99%, 제조원: Merck)를 배치방식으로 부가하면서 교반시킨다. pH는 약 10이다. 상기 방법으로 처리한 브로스를 회전 증발기 Rotavapor RE-120(제조원: Buchi-Labortechnik GmbH)에서 50 내지 60℃에서 진공하에서 약 50% 건조 중량의 액체 함량까지 농축시킨다. 이후, 상기 방법으로 수득한 농축된 브로스를 동결-건조기, LYOVAC GT 2(제조원: Leybold, Cologne, Germany)에서 동결 건조시켜 D-판토텐산의 나트륨염을 제조한다.

상기 방법으로 제조된 D-판토텐산 나트륨 함유 생성물은 63.8 중량%의 농도를 가지며 자유 유동한다. 5개월 동안 저장한 후, D-판토텐산의 농도는 63.0 중량%이다.

실시예 5

D-판토텐산 마그네슘의 제조

우선, 실시예 1 및 2에서 기술된 방법을 사용하여 제조되고 D-판토텐산 약 6.1 중량%를 함유하는 판토텐산 함유 발효 브로스로부터 바이오매스를 분리한다. 이를 위해서, 상기 언급된 발효 브로스 1ℓ를 실시예 2에서 기술된 바와 동일한 방법으로 원심분리시키고 한외여과한다.

이후, 고체 MgO 5.4g(97%, 제조원: Merck)를 배치형식으로 부가하면서 교반한다. pH는 약 9 내지 10이다. 이후, 상기 방식으로 처리한 브로스를 회전 증발기, Rotavapor RE-120(제조원: Buchi-Labortechnik GmbH)에서 50 내지 60℃에서 진공하에서 약 50% 건조 중량의 액체 농도까지 농축시킨다. 이후, 상기 방식으로 농축한 브로스를 동결 건조기, LYOVAC GT 2(제조원: Leybold)에서 동결 건조시켜 D-판토텐산의 마그네슘염을 제조한다.

상기 방식으로 제조한 D-판토텐산 마그네슘 함유 생성물은 64.7 중량%의 D-판토텐산 농도를 가지며 자유 유동한다. 5개월 동안 저장한 후, D-판토텐산의 농도는 64.4 중량%이다.

실시예 6

D-판토텐산 칼륨의 제조

우선, 실시예 1 및 2에서 기술된 방법을 사용하여 제조하고 D-판토텐산 약 6.1 중량%를 함유하는 판토텐산 함유 발효 브로스로부터 바이오매스를 분리한다. 이를 위해서, 상기 언급된 발효 브로스 1ℓ를 실시예 2에서 기술된 동일한 방법으로 원심분리하고 한외여과시킨다.

이후, KOH 17.4g(85%; 제조원: Merck)을 배치형식으로 부가하면서 교반시킨다. pH는 약 10 내지 11이다. 이후, 상기 방법으로 처리한 브로스를 회전 증발기, Rotavapor RE-120(제조원: Buchi-Labortechnik GmbH)에서 진공하에서 60℃에서약 50% 건조 중량의 액체 농도까지 농축시킨다. 이후, 상기 방법으로 농축한 브로스를 동결 건조기, LYOVAC GT 2(제조원: Leybold)에서 동결 건조시켜 D-판토텐산의 칼륨염을 제조한다.

상기 방법으로 제조한 D-판토텐산 칼륨 함유 생성물은 63.5 중량%의 D-판토텐산 농도를 가지며 자유 유동한다. 5개월 동안 저장한 후, D-판토텐산의 농도는 62.9 중량%이다.

실시예 7

D-판토텐산 암모늄의 제조

우선, 실시예 1 및 2에서 기술된 방법을 사용하여 제조하고 D-판토텐산 약 6.1 중량%를 함유하는 판토텐산 함유 발효 브로스로부터 바이오매스를 분리한다. 이를 위해서, 상기 언급한 발효 브로스 1ℓ를 실시예 2에서 기술된 바와 동일한 방법으로 원심분리하고 한외여과시킨다.

이후, 상기 방법으로 처리한 브로스를 회전 증발기, Rotavapor RE-120(제조원: Buchi-Labortechnik GmbH)에서 진공하에 60℃에서 약 50% 건조 중량의 액체 농도까지 농축한다. 이후, 상기 방법으로 농축된 브로스를 동결 건조기, LYOVAC GT 2(제조원: Leybold)에서 동결 건조하여 D-판토텐산의 암모늄염을 수득한다.

상기 방법으로 제조한 D-판토텐산 암모늄은 66.8 중량%의 D-판토텐산 농도를 가지며 자유 유동한다.

실시예 8

바이오매스 함유 발효 브로스로부터 D-판토텐산 칼슘의 제조

우선, 실시예 1 및 2에서 기술된 방법으로 제조하고 약 6.1 중량%의 D-판토텐산을 함유하는 판토텐산 함유 발효 브로스를 회전 증발기, Rotavopor RE-120(제조원: Buchi-Labortechnik GmbH, Konstanz, Germany)에서 진공하에 60℃에서 1.0ℓ의 용적을 약 30% 건조 중량의 액체 농도까지 농축한다. 이후, 고체 Ca(OH)₂10.1g(96%; 제조원: Merck, Darmstadt, Germany)을 배치형식으로 부가하면서 교반시킨다. pH는 약 10이다. 이후, 상기 방법으로 처리하고 농축한 바이오매스 함유 브로스를 분무 건조시켜 D-판토텐산의 칼슘염을 제조한다. 이를 위해서, 입구 온도 107℃, 출구 온도 85℃, 압력차 -40 mbar 및 공기의 유속 600NL/h에서 실험실용 분무 건조기, Buchi-190(제조원: Buchi-Labortechnik GmbH, Konstanz, Germany)을 사용한다.

상기 방법으로 제조한 D-판토텐산 칼슘 함유 생성물은 49.8 중량%의 D-판토텐산 농도를 가지고, 자유 유동하며 480㎎/㎖의 벌크 밀도를 갖는다. 바이오매스 함량은 약 30 중량%이다.

실시예 9

코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 D-판토텐산 칼슘 및 바이오매스를 함유하는 생성물의 제조

1. 코리네박테리움 글루타미쿰의 판토텐산 생성 균주의 제조

특허 문헌[US-A 제5,188,948호]는 L-발린 생성 균주 브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM 제BP-1763호를 기술하고 있다. 특허 문헌[DE 제19855313.7호]는 플라스미드 pND-DBC2(도 1)를 기술하고 있으며, 이는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 유전자 panB, panC 및 panD를 함유한다. 상기 플라스미드는 국제기탁기관[The Deutschen Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen(German collection of microorganisms and cell cultures), Braunschweig, Germany]에 균주 ATCC13032/pND-DBC2의 형태로 DSM 제12437호로서 기탁되었다. 판토텐산 생성 균주 FERM BP-1763/pND-DBC2는 균주 FERM BP-1763를 플라스미드 pND-DBC2로 형질전환시켜 수득한다.

2. 판토텐산 함유 발효 브로스의 제조

브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM BP-1763/pND-DBC2의 샘플을 HHK 아가상에 도말한다.

HHK 아가는 뇌/심장 아가로 이루어지며, 이는 제조원(Merck kgaA, Darmstadt, Germany)이 시판한 것이며, 카나마이신으로 보충된다. HHK 아가의 조성은 표 1에 나타낸다.

상기 아가 플레이트 배양은 37℃에서 17시간 동안 배양한 후 +4℃에서 냉장고에 저장한다. 이후에, 개별적인 선택된 콜로니를 추가로 동일한 배지상에서 증식시킨다. 이후, HHK 아가로부터 클론으로부터의 세포 물질을 취하여 접종환을 사용하여 전체 용적 1000㎖인 진탕 플라스크내에 위치한 HHK 브로스 100㎖내로 접종한다.

HHK 브로스는 제조원(Merck kgaA, Darmstadt, Germany)이 시판하는 뇌/심장 배지로 이루어지며, 글루코오스 및 카나마이신을 보충한다. HHK 브로스의 조성은 표 2에 나타낸다.

HHK 아가

물질	리터 당 양
뇌/심장 아가	52.0g
카나마이신	25㎎

HHK 브로스

물질	리터 당 양
뇌/심장 배지	37.0g
카나마이신	25㎎
글루코오스	20.0g

혼합물을 30℃ 및 150rpm에서 22시간 동안 배양한다. 배양 공정을 완결한 후, 6.1의 흡광도가 660㎚의 파장에서 광도계에 의해 측정된다(OD 660). 균주 FERM BP-1763/pND-DBC2의 상기 배양물을 사용하여 생산 발효기를 접종시킨다.

표 3에 나타낸 배지 SK-71은 발효에 사용된다. SK-71 배지내의 모든 성분은 발효 농도에 따라서 처음에 직접적으로 발효기내로 도입되어 동일계내에서 멸균된다.

배지 SK-71

화합물	리터 당 양
글루코오스 수화물	110.0000g
옥수수 침지액(CSL)	5.0000g
β-알라닌	5.0000g
니코틴산	0.0050g
1-이소루이신	0.1500g
호모세린	0.1500g
암모늄 설페이트	25.0000g
인산이수소칼륨	0.1000g
황산마그네슘 7H₂0	1.0000g
황산철 7H₂O	0.0100g
황산망간 H₂O	0.0050g
CaCl₂*2H₂O	0.0100g
티아민 HCl	0.0002g
D(+)바이오틴	0.0003g
Struktol	0.60g

제조원(the B. Braun Co., BBI, Germany, Melsungen, 모델 Biostat E/ED)으로부터의 10ℓ 교반시킨 반응기를 발효기로 사용한다.

상기된 HHK 브로스 중 진탕 플라스크 예비 배양물 100㎖를 사용하여 발효 배지 SK-71 1950g을 접종하는데 사용한다.

상기 혼합물을 온도 30℃, 용적 특이적인 통기율 0.75vvm, 교반 속도 800 내지 1700rpm(이는 산소 소비에 의존한다), pH 7.0 및 공기 포화도의 20%의 산소 부분압에서 전체 발효 시간 동안 배양한다. 상기 배양물을 26.2의 OD660이 달성될 때까지 상기 주어진 조건하에서 전체 49시간 동안 배양한다.

암모니아 수용액(25%v/v)을 pH를 조절하기 위한 보정 매질로서 사용한다.

이후, 흡광도(OD)를 660㎚의 측정 파장에서 LP1W 유형의 디지탈 광도계(제조원: Dr. Bruno Lange GmbH Co., Berlin, Germany)를 사용하여 측정하며, D-판토텐산의 농도는 HPLC(Hypersil APS 25㎛, 250 x 5㎜, RI 검출)로 측정한다.

약 0.2g/ℓ의 D-판토텐산 농도가 49시간 후 최종 발효 샘플에서 측정된다.

3. 판토텐산 함유 생성물의 제조

D-판토텐산 약 0.02 중량%의 농도를 갖는 D-판토텐산 함유 발효 브로스를 실시예 9.2의 방법을 사용하여 제조한다. 우선, 상기 발효 브로스의 1.4ℓ 용적을 진공하에서 60℃에서 회전 증발기, Rotavapor RE-120 유형(제조원: Buchi-Labortechnik GmbH, Konstanz, Germany)에서 약 15%의 건조 고체 함량을 갖는 브로스로 증발시킨다. 이후, 고체 Ca(OH)₂27.1g(96%; 제조원: Merck, Darmstadt, Germany)를 조금씩 부가하면서 교반시킨다. pH는 약 10.0이다. 이후, D-판토텐산 칼슘(＞98%, 제조원: Euro OTC Pharma GmbH, Kamen, Germany)을 상기 방법으로 처리하고 농축한 바이오매스 함유 브로스에 부가한다. Buchi-190 유형의 실험실용 분무 건조기(제조원: Buchi-Labortechnik GmbH, Konstanz, Germany)를 입구 온도 107℃, 출구 온도 85℃, 압력차 -40 mbar 및 공기의 유속 600NL/h에서 최종 분무 건조 공정에서 사용한다.

상기 방법으로 제조한 D-판토텐산 칼슘 함유 생성물은 약 35%의 D-판토텐산 농도를 가지고, 부을 수 있으며 600㎎/㎖의 벌크 밀도를 갖는다. 씨. 글루타미쿰 - 바이오매스의 비율은 약 3.5 중량%이다.

실시예 10

사카로마이세스 세레비지애로부터의 D-판토텐산 칼슘 및 바이오매스를 함유하는 생성물의 제조

1.사카로마이세스 세레비지애의 판토텐산 생산 균주의 제조

판독 프레임 YHR063c의 증폭:

사카로마이세스 세레비지애 판독 프레임 YHR063c(생명공학 국립 센터의 승인 번호 제U00061호, Bethesda, MD, USA)에 대한 뉴클레오타이드 서열을 사용하여, 하기 PCR 프라이머를 합성한다(MWG-Biotech, Ebersberg, Germany). 판독 프레임의 출발 및 종결은 마침표(.)로 나타낸다.

oJD539(5' EcoRI-NotI START)

5'-GCG CGA ATT CAG ATC CGC GGC CGC AAA GAG GAG AAA TTA ACT.ATG ACT GCA CCA CAC AGA AG-3'

oJD540(3' SpeI-PstI STOP)

5'-CGC GAC TAG TCT GCA G.TC AGT CCT TTC TCC AGT CAC-3'

문헌[C. Guthrie and G.R. Fink method, Guide to yeast genetics and molecular biology, Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, San Diego, CA, 1991]의 방법을 사용하여 분리된 에스. 세레비지애 균주 JD242로부터의 게놈성 DNA를 주형으로 사용한다. 상기 균주는 배수체 균주 SC288C[Winston et al., Yeast 11, 53ff, (1995)]의 반수체 분리체이며, 상기 배수체의 게놈은 서열 분석되었다[Goffeau et al., Science 274, pp. 546, (1996)]. 테트라드 분석법을 문헌[C. Guthrie and G.R. Fink method, Guide to yeast genetics and molecular biology, Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, San Diego, CA, 1991]의 방법에 의해 수행한다. 균주 JD242는 루신(leu2△1 대립형질) 및 우라실(ura3-52 대립형질)에 대한 영양요구성이다. 대략 1.2kb 크기의 DNA 단편을 제조원(Roche Co., Manheim)에 의해 인용된 조건하에서 "High Fidelity Expand Polymerase" 키트를 사용하여 PCR 28 주기로 증폭시킨다. 크기는 0.8% 아가로오스 겔에서 전기영동 분리에 의해 측정한다.

pJD-YHR063c의 구조

에스. 세레비지애에서 YHR063c 판독 프레임을 발현시키기 위해서, 상기 PCR 증폭물을 이 콜라이-에스. 세레비지애 셔틀 벡터 pJDCEX2[도 2 및 문헌 참조: Dohmen et al., 1995, Journal of Biological Chemistry 270, 18099-18109]내에 도입시킨다.

PCR 생성물을 우선 EcoRI 및 SpeI(제조원: AGS, Heidelberg, Germany)을 사용하여 재연결시킨다. 이후, 이를 pJDCEX2-DNA(이는 EcoRI 및 XbaI(제조원: AGS, Heidelberg, Germany)으로 처리한다)와 혼합하여, T4-DNA 리가제(제조원: Roche, Mannheim, Germany)로 연결시킨다. 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 XL1-블루[Bullock et al., 1987, Biothechniques 5, 376]에 형질전환시킨다. 형질전환체는 암피실린(제조원: Sigma, Deisenhofen, Germany) 150㎍/㎖를 함유하는 LB 아가상에서 선택에 의해 수득한다. 암피실린-내성 클론으로부터의 플라스미드 DNA를 알칼리 세포 용해[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]로 제조한다. 이후, 분리된 플라스미드 DNA를 NotI 및 PstI을 사용하여 제한 분석으로 시험하고, 후속적으로 0.8% 아가로오스 겔에서 분리시킨다. 바람직한 구조를 갖는 플라스미드를 pJD-YHR063c(도 3)로 명명한다.

JD242/pJD-YHR063c의 제조

에스. 세레비지애 균주 JD242를 문헌[Dohmen et al., Yeast 7, 691 (1991)]의 방법으로 플라스미드 pJD-YHR063c를 사용하여 형질전환시킨다. 형질전환체의 선택은 1.8% 아가를 사용하여 루이신-비함유 최소 배지 SD에서 수행한다(표 4 및 5 참조).

최소 배지 SD

화합물	리터 당 양
(NH₄)₂SO₂	5g
KH₂PO₄	1g
MgSO₄*7H₂0	0.5g
NaCl	0.1g
NaCl₂	0.1g
CaCl₂	0.1g
H₃BO₃	500㎍
CuSO₄	40㎍
KI	100㎍
FeCl₃*6H₂O	200㎍
MnSO₄*H₂O	400㎍
Na₂MoO₄*2H₂O	400㎍
ZnSO₄*7H₂O	200㎍
바이오틴	2㎍
폴산	2㎍
이노시톨	2㎎
니아신	400㎍
p-아미노벤조산	200㎍
피리독신 하이드로클로라이드	400㎍
리보플라빈	200㎍
티아민 하이드로클로라이드	400㎍

최소 배지 SD

부가된 물질	리터 당 양
글루코오스	20g
우라실	40㎎
CUSO₄	24㎎
-Leu DO 보충물	650㎎
케토판토에이트	100㎎
β-알라닌	100㎎

2. 판토텐산 함유 발효 브로스의 제조

D-판토텐산염 함유 발효 브로스를 제조하기 위해서, 에스. 세레비지애 균주 JD242/pJD-YHR063c의 개별적인 콜로니를 우선 최소 배지 SD와 함께 아가 플레이트 상에 도말하고 30℃에서 3시간 동안 배양한다. 진탕 플라스크에서 상기 제1 예비 배양물을 제조하기 위해서, 상기 세포를 최소 배지 SD 5㎖에 잠기게 한다. 최소 배지 SD(표 9a 및 9b) 50㎖를 함유하는 각각의 진탕 플라스크(전제 용적 500㎖)에 상기 세포 현탁액 2.5㎖를 접종하고, 660㎚의 파장(OD 660)에서 흡광도가 1.9로 측정될 때까지 30℃에서 130rpm에서 RC-1-TK 배양기(제조원: Infors AG, Bottmingen, Switzerland)에서 6시간 동안 배양한다. 제2 예비 배양은 1000㎖ 바플-플라스크 중 최소 배지 SD(표 9a 및 9b) 150㎖에서 제조하고, 이들 각각은 상기된 제1 예비 배양물 50㎖로 접종한다. 배양은 660㎚의 파장(OD660)에서 약 3.8의 흡광도가 달성될 때까지 30℃ 및 80rpm에서 20시간 동안 수행한다. 판토텐산을 생산하기 위한 주 발효는 전체 용적 6000㎖ 환저 플라스크에서 최소 배지 SD(표 9a 및 9b) 1500㎖를 사용하여 수행한다. 상기 목적을 위해서, 환저 플라스크를 제2 예비 배양물 90㎖로 접종하고 30℃ 및 60rpm에서 30시간 동안 배양한다.

흡광도(OD)를 660㎚의 측정 파장에서 LP1W 유형의 디지털 광도계(제조원: Dr. Bruno Lange GmbH, Berlin, Germany)로 측정한다. 수득된 D-판토텐산의 농도를 매뉴얼["DIFCO MANUAL", DIFCO, Michigan, USA;, 10^thEdition, 1100-1102 (1984)]의 데이터에 따라서 균주 락토바실러스 플랜타룸 ATCC8014를 사용하여 측정한다.

흡광도(OD660)은 약 4이며 D-판토텐산의 농도는 약 1㎎/ℓ이다.

3. 판토텐산 함유 생성물의 제조

D-판토텐산의 농도 약 1㎎/ℓ를 갖는 판토텐산 함유 발효 브로스를 실시예 10.2의 방법을 사용하여 제조한다. 6.0ℓ 용적을 우선 진공하에 60℃에서 Rotavapor RE-151(제조원: Buchi-Labortechnik GmbH, Konstanz, Germany) 유형의 회전 증발기에서 증발시켜 약 16% 건조 고체 함량을 갖는 브로스를 수득한다. 이후, 고체 Ca(OH)₂15.9g(96%, 제조원: Merck, Darmstadt, Germany)을 조금씩 교반과 함께 부가한다. pH는 약 9.2이다. D-판토텐산 칼슘(＞98%, 제조원: Euro OTC Pharma GmbH, Kamen, Germany) 28.4g을 상기 방법으로 처리하고 증발시킨 바이오매스-함유 브로스내로 부가한다. 이후, 상기 브로스를 LYOVAC GT 2(제조원: Leybold Co., Cologne, Germany) 유형의 동결 건조기에서 동결 건조시킨다.

상기 방법으로 제조한 D-판토텐산 칼슘 함유 생성물은 26.5 중량%의 D-판토텐산 농도를 가지며, 부을 수 있고 450㎎/㎖의 벌크 밀도를 갖는다. 에스. 세레비지애 바이오매스의 비율은 약 6.8 중량%이다.

도면에 사용되는 약어 일람표가 하기에 제시된다:

도 1 참조:

rrnBT1T2: rrnB 유전자의 전사-종결 인자Ptac: tac 프로모터panB: panB 유전자의 암호화 영역panC: panC 유전자의 암호화 영역panD: panD 유전자의 암호화 영역rep-C.g.: 씨. 글루타미쿰에서 복제를 위한 DNA 영역oriV-E.c.: 이. 콜라이에서 무성적인 전달의 오리진Kan: 카나마이신 내성 유전자BglII: 제한효소 BglII의 절단 부위ClaI: 제한효소 ClaI의 절단 부위NcoI: 제한효소 NcoI의 절단 부위NruI: 제한효소 NruI의 절단 부위PvuI: 제한효소 PvuI의 절단 부위SacI: 제한효소 SacI의 절단 부위SalI: 제한효소 SalI의 절단 부위ScaI: 제한효소 ScaI의 절단 부위SphI: 제한효소 SphI의 절단 부위XhoI: 제한효소 XhoI의 절단 부위

도 2 및 3 참조:

LEU2: 사카로마이세스 세레비지애의 베타-이소프로필말레이트데하이드로게나제 유전자2μ: 사카로마이세스 세레비지애의 내인성 2μ 플라스미드의 서열Ap^R: 베타-락타마제 유전자P-CUP1: 사카로마이세스 세레비지애 CUP1 유전자(메탈로티오네인)의 프로모터T-CYC1: 사카로마이세스 세레비지애의 CYC1 유전자(사이토그롬 C)의 종결 인자SD: 샤인 달가르노 서열EcoRI: 제한효소 EcoRI의 절단 부위NotI: 제한효소 NotI의 절단 부위SpeI: 제한효소 SpeI의 절단 부위XbaI: 제한효소 XbaI의 절단 부위

본 발명은 현재 공지된 방법에 비해 보다 경제적이고 효율적인 제조 방법을 사용하여 가축사료 첨가물로 적합한 D-판토텐산 및 이의 염의 신규한 제조 형태를 제공한다.

Claims

a) D-판토텐산 및/또는 이의 염, b) D-판토텐산을 생산하는 미생물의 발효 동안 형성된 바이오매스 0 내지 100% 및 c) 발효 브로스의 과반수 이상의 기타 성분을 함유하며, d) 고체, 미분되거나 과립화된, 자유 유동성 형태로 존재함을 특징으로 하는 발효 브로스에 기초한, D-판토텐산 및/또는 이의 염을 함유하는 동물 가축사료 첨가물.
제1항에 있어서, D-판토텐산의 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘 또는 칼슘염의 그룹으로부터 선택되는 염 하나 이상을 함유함을 특징으로 하는, 동물 가축사료 첨가물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 0 중량% 초과, 특히 20 내지 80 중량%(건조 중량)의 양으로 D-판토텐산 및/또는 이의 염 중 하나를 함유함을 특징으로 하는, 동물 가축사료 첨가물.
제1항에 있어서, 분무 건조된 또는 분무 과립화된 형태로 존재함을 특징으로 하는, 동물 가축사료 첨가물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, L-메티오닌, L-리신, L-발린, L-알라닌, L-트레오닌 또는 L-트립토판의 그룹으로부터 선택되는 L-아미노산 하나 이상을 또한 함유함을 특징으로 하는, 동물 가축사료 첨가물.
a) 바이오매스 및/또는 기타 성분 중 일부를 D-판토텐산 및/또는 이의 염을 함유하는 발효 브로스로부터 임의로 완전히 또는 부분적으로 제거하고, b) 알칼리 토금속 또는 알칼리 금속의 수산화물 또는 산화물을 상기 방법으로 수득된 용액 또는 브로스에 부가하며, c) 상기 방법으로 수득한 혼합물을 건조시키거나, 분무 건조시키거나, 분무 과립화하거나, 과립화시킴을 특징으로 하여, 발효 브로스로부터 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 D-판토텐산 및/또는 이의 염을 함유하는 가축사료 첨가물을 제조하는 방법.
제6항에 있어서, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘 또는 칼슘 화합물의 그룹으로부터 선택된 산화물 또는 수산화물을 D-판토텐산에 대하여, 0.8 내지 1.2, 바람직하게는 0.95 내지 1.1의 화학량론적 비율로 부가함을 특징으로 하는 방법.
a) 바이오매스 및/또는 성분의 일부를 바람직한 하이드록실 화합물을 사용하여 수득된 D-판토텐산염 함유 발효 브로스로부터 임의로 완전히 또는 부분적으로 제거하고, b) 상기 방식으로 수득된 혼합물을 바람직하게는 수분을 제거하여 농축시키며, c) 상응하는 판토텐산염을 함유하는 가축사료 첨가물을 건조, 분무 건조 또는 분무 과립화에 의해 고체 형태로 수득함을 특징으로 하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 D-판토텐산 및/또는 이의 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘 또는 칼슘염을 함유하는 가축사료 첨가물을 제조하는 방법.
a) 바람직하게는, 발효 브로스로부터 수분을 제거하는 단계(농축 단계), b) 임의로, 발효 동안 형성된 바이오매스 0 내지 100%를 제거하는 단계, c) a) 및 b)에 따라서 수득된 발효 브로스에 알칼리 토금속 또는 알칼리 금속의 수산화물 또는 산화물 하나 이상을 부가하는 단계(이때, 부가되는 화합물의 중량은 동물 가축사료 첨가물에서 이의 전체 농도가 약 20 내지 80 중량% 범위가 되게 하는 중량이다), 및 d) c)에 따라서 수득한 발효 브로스를 건조시켜 목적하는 분말 또는 과립화된 형태의 동물 가축사료 첨가물을 수득하는 단계를 특징으로 하는, 발효 브로스로부터 약 20 내지 80 중량%(건조 중량) 농도 범위의 D-판토텐산 및/또는 이의 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘 또는 칼슘염을 함유하는 동물 가축사료 첨가물의 제조 방법.
제9항에 있어서, 언급된 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 산화물 또는 수산화물을 바람직하게 수행된 농축 단계 전후에 발효 브로스에 부가함을 특징으로 하는 방법.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 진균 또는 효모가 발효 공정에서 사용됨을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, L-리신, L-발린, L-알라닌, L-트레오닌 또는 L-트립토판의 그룹으로부터 선택된 L-아미노산 하나 이상을 임의로 농축된 발효 브로스에 부가함을 특징으로 하는 방법.
제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움 속의 세균을 발효 공정에 사용함을 특징으로 하는 방법.
제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 엔테로박테리아세애 과의 세균을 발효 공정에 사용함을 특징으로 하는 방법.