JP2000325024A - 動物飼料添加剤ならびにその製造方法 - Google Patents
動物飼料添加剤ならびにその製造方法Info
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- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/20—Inorganic substances, e.g. oligoelements
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- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/174—Vitamins
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 飼料添加剤として適当な新規の調製形のＤ−
パントテン酸およびその塩を提供する。 【解決手段】 ａ）Ｄ−パントテン酸および／またはそ
の塩、 ｂ）Ｄ−パントテン酸を産生する微生物の発酵中に形成
されるバイオマス０〜１００％、 ｃ）少なくとも発酵ブロスの他の成分の大部分を含有
し、かつ ｄ）固体、微細または粒状の、易流動性の形で存在する
動物飼料添加剤を提供する。
パントテン酸およびその塩を提供する。 【解決手段】 ａ）Ｄ−パントテン酸および／またはそ
の塩、 ｂ）Ｄ−パントテン酸を産生する微生物の発酵中に形成
されるバイオマス０〜１００％、 ｃ）少なくとも発酵ブロスの他の成分の大部分を含有
し、かつ ｄ）固体、微細または粒状の、易流動性の形で存在する
動物飼料添加剤を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｄ−パントテン酸
および／またはその塩の１つを含有する、発酵ブロスを
ベースとする動物飼料添加剤ならびに該添加剤の製造方
法に関する。
および／またはその塩の１つを含有する、発酵ブロスを
ベースとする動物飼料添加剤ならびに該添加剤の製造方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】パントテン酸は世界中で１年間に数千ト
ンの規模で製造されている。製造される大部分のパント
テン酸は、経済的に有用な動物、例えば家禽および豚に
給餌するために使用される。需要は増大している。
ンの規模で製造されている。製造される大部分のパント
テン酸は、経済的に有用な動物、例えば家禽および豚に
給餌するために使用される。需要は増大している。
【０００３】パントテン酸は、化学合成によるか、また
は生物工学的には適当な栄養溶液中での適当な微生物の
発酵によって製造することができる。化学合成の場合に
おいては、ＤＬ−パントラクトンは重要な前駆物質であ
る。これはホルムアルデヒド、イソブチルアルデヒドお
よびシアニドから多段階法で製造される。更なる方法工
程において、ラセミ混合物を分離し、Ｄ−パントラクト
ンをβ−アラニンと縮合させ、このようにＤ−パントテ
ン酸を製造する。
は生物工学的には適当な栄養溶液中での適当な微生物の
発酵によって製造することができる。化学合成の場合に
おいては、ＤＬ−パントラクトンは重要な前駆物質であ
る。これはホルムアルデヒド、イソブチルアルデヒドお
よびシアニドから多段階法で製造される。更なる方法工
程において、ラセミ混合物を分離し、Ｄ−パントラクト
ンをβ−アラニンと縮合させ、このようにＤ−パントテ
ン酸を製造する。
【０００４】典型的な市販形はＤ−パントテン酸のカル
シウム塩である。Ｄ，Ｌ−パントテン酸のラセミ混合物
のカルシウム塩も使用することができる。
シウム塩である。Ｄ，Ｌ−パントテン酸のラセミ混合物
のカルシウム塩も使用することができる。
【０００５】微生物を使用する発酵的製造の利点は、Ｌ
−パントテン酸を含有しない所望の立体異性形（Ｄ−
形）の直接的な形成である。
−パントテン酸を含有しない所望の立体異性形（Ｄ−
形）の直接的な形成である。
【０００６】種々のタイプの細菌、例えばＥＰ−Ａ−０
４９３０６０号、ＥＰ−Ａ−０５９０８５７号およびＷ
Ｏ９７／１０３４０号に示されるようなエシェリキア
コリ（Escherichia coli）、アルスロバクター ウレア
ファシエンス（Arthrobacterureafaciens）、コリネバ
クテリウム エリスロゲネス（Corynebacterium erythro
genes）、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brev
ibacterium ammoniagenes）および酵母、例えばデバロ
マイセス カステリイ（Debaromyces castelii）は発酵
の適当な条件下でＤ−パントテン酸を産生する。特に適
当な微生物はその点で記載されるエシェリキア コリＩ
ＦＯ３５４７の派生物（derivative）、例えばＦＶ５０
６９／ｐＦＶ３１株またはＦＶ５０６９／ｐＦＶ２０２
株である。
４９３０６０号、ＥＰ−Ａ−０５９０８５７号およびＷ
Ｏ９７／１０３４０号に示されるようなエシェリキア
コリ（Escherichia coli）、アルスロバクター ウレア
ファシエンス（Arthrobacterureafaciens）、コリネバ
クテリウム エリスロゲネス（Corynebacterium erythro
genes）、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brev
ibacterium ammoniagenes）および酵母、例えばデバロ
マイセス カステリイ（Debaromyces castelii）は発酵
の適当な条件下でＤ−パントテン酸を産生する。特に適
当な微生物はその点で記載されるエシェリキア コリＩ
ＦＯ３５４７の派生物（derivative）、例えばＦＶ５０
６９／ｐＦＶ３１株またはＦＶ５０６９／ｐＦＶ２０２
株である。
【０００７】ＥＰ−Ａ−０４９３０６０号、ＥＰ−Ａ−
０５９０８５７号およびＷＯ９７／１０３４０号に記載
されるようにＤ−パントテン酸を発酵的に製造する間
に、Ｄ−パントテン酸を製造できる微生物は適当な栄養
下で培養され、次いで製造されたＤ−パントテン酸は高
価な方法で単離され、精製され、かつカルシウム塩とし
て製造される。
０５９０８５７号およびＷＯ９７／１０３４０号に記載
されるようにＤ−パントテン酸を発酵的に製造する間
に、Ｄ−パントテン酸を製造できる微生物は適当な栄養
下で培養され、次いで製造されたＤ−パントテン酸は高
価な方法で単離され、精製され、かつカルシウム塩とし
て製造される。
【０００８】適当な栄養培地は炭素源、例えばグルコー
スまたはデンプン加水分解物またはスクロースもしくは
糖蜜、前駆体、例えばβ−アラニン、Ｄ，Ｌ−パントイ
ン酸またはＤ，Ｌ−パントラクトン、窒素源、例えば硫
酸アンモニウム、リン源、例えばリン酸カリウムおよび
他の塩、微量元素およびビタミンおよび、場合により天
然培地添加物、例えば酵母エキスを含有している。微生
物は前記培地中で適当なｐＨにおいて、適当な通気およ
び撹拌下にインキュベートされ、その中にＤ−パントテ
ン酸が放出される。
スまたはデンプン加水分解物またはスクロースもしくは
糖蜜、前駆体、例えばβ−アラニン、Ｄ，Ｌ−パントイ
ン酸またはＤ，Ｌ−パントラクトン、窒素源、例えば硫
酸アンモニウム、リン源、例えばリン酸カリウムおよび
他の塩、微量元素およびビタミンおよび、場合により天
然培地添加物、例えば酵母エキスを含有している。微生
物は前記培地中で適当なｐＨにおいて、適当な通気およ
び撹拌下にインキュベートされ、その中にＤ−パントテ
ン酸が放出される。
【０００９】ＷＯ９６／３３２８３号およびＥＰ−Ａ−
０５９０８５７号によって表される現行の先行技術によ
れば、Ｄ−パントテン酸のカルシウム塩は発酵ブロスを
含有するパントテン酸から高価な単離および精製によっ
て得られる。濾過または遠心分離によるバイオマスの最
初の単離後に、濾液の更なるプロセシングを活性炭によ
る精製またはカラムクロマトグラフィーによって実施す
る。前記のようにして得られる溶液と水酸化カルシウム
との反応後に、所望のＣａ塩が晶出する。
０５９０８５７号によって表される現行の先行技術によ
れば、Ｄ−パントテン酸のカルシウム塩は発酵ブロスを
含有するパントテン酸から高価な単離および精製によっ
て得られる。濾過または遠心分離によるバイオマスの最
初の単離後に、濾液の更なるプロセシングを活性炭によ
る精製またはカラムクロマトグラフィーによって実施す
る。前記のようにして得られる溶液と水酸化カルシウム
との反応後に、所望のＣａ塩が晶出する。
【００１０】ＷＯ９６／３３２８３号によれば、濾液を
第１のカラムにおいて活性炭によって脱色する。ｐＨは
濃塩酸を使用して３．０に調整し、次いで該液体を、活
性炭を充填した２個の更なるカラムを通して連続的に精
製する。Ｄ−パントテン酸の溶出はメチルアルコールの
使用により達成される。Ｃａ（ＯＨ）2粉末を使用する
引き続きの中和工程後に、溶液が得られ、そこから５℃
での晶出によってＤ−パントテン酸カルシウムが回収さ
れる。
第１のカラムにおいて活性炭によって脱色する。ｐＨは
濃塩酸を使用して３．０に調整し、次いで該液体を、活
性炭を充填した２個の更なるカラムを通して連続的に精
製する。Ｄ−パントテン酸の溶出はメチルアルコールの
使用により達成される。Ｃａ（ＯＨ）2粉末を使用する
引き続きの中和工程後に、溶液が得られ、そこから５℃
での晶出によってＤ−パントテン酸カルシウムが回収さ
れる。
【００１１】ＥＰ−Ａ−０５９０８５７号に記載の方法
において、濾液はまずはカチオンおよびアニオン交換体
カラムを使用して精製される。溶出は塩酸を使用して実
施される。次いで溶出した分画はＣａ（ＯＨ）2を使用
して中和され、そこに活性炭を添加し、混合物を濾過す
る。次いで得られた濾液を低分子量アルコール（メタノ
ール、エタノール、イソプロパノール）中で抽出し、晶
出によってＤ−パントテン酸カルシウムを得ている。
において、濾液はまずはカチオンおよびアニオン交換体
カラムを使用して精製される。溶出は塩酸を使用して実
施される。次いで溶出した分画はＣａ（ＯＨ）2を使用
して中和され、そこに活性炭を添加し、混合物を濾過す
る。次いで得られた濾液を低分子量アルコール（メタノ
ール、エタノール、イソプロパノール）中で抽出し、晶
出によってＤ−パントテン酸カルシウムを得ている。
【００１２】前記のように製造されるＤ−パントテン酸
カルシウムは動物の栄養のために飼料添加剤として使用
される。
カルシウムは動物の栄養のために飼料添加剤として使用
される。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】従来の技術によてば、
Ｄ−パントテン酸およびＤ，Ｌ−パントテン酸の塩は、
化学合成または発酵によって製造される酸と所望の塩溶
液との反応によって製造される。
Ｄ−パントテン酸およびＤ，Ｌ−パントテン酸の塩は、
化学合成または発酵によって製造される酸と所望の塩溶
液との反応によって製造される。
【００１４】本発明の課題は、飼料添加剤として適当な
新規の調製形のＤ−パントテン酸およびその塩を提供す
ることである。
新規の調製形のＤ−パントテン酸およびその塩を提供す
ることである。
【００１５】更に、本発明の課題は、現在知られている
方法よりも経済的かつ効率的な製造方法を提供すること
である。
方法よりも経済的かつ効率的な製造方法を提供すること
である。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明は、発酵ブロスを
ベースとし、かつ ａ）Ｄ−パントテン酸および／またはその塩、特にアル
カリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、 ｂ）発酵中に０〜１００％の量で形成されるバイオマ
ス、および ｃ）少なくとも発酵ブロスの他の溶解された成分の大部
分を含有し、かつ ｄ）固体形、特に微細形または粒状形および易流動形で
存在することを特徴とする動物飼料添加剤を提供してい
る。
ベースとし、かつ ａ）Ｄ−パントテン酸および／またはその塩、特にアル
カリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、 ｂ）発酵中に０〜１００％の量で形成されるバイオマ
ス、および ｃ）少なくとも発酵ブロスの他の溶解された成分の大部
分を含有し、かつ ｄ）固体形、特に微細形または粒状形および易流動形で
存在することを特徴とする動物飼料添加剤を提供してい
る。
【００１７】必要に応じて、該添加剤は一般に噴霧乾燥
または凍結乾燥された、微細な易流動性粉末として、あ
るいは粒状形において提供され、これらは種々の割合の
バイオマスを含有していてよい。かさ密度は特に約５０
０ｋｇ／ｍ3である。該添加剤は貯蔵安定である。
または凍結乾燥された、微細な易流動性粉末として、あ
るいは粒状形において提供され、これらは種々の割合の
バイオマスを含有していてよい。かさ密度は特に約５０
０ｋｇ／ｍ3である。該添加剤は貯蔵安定である。
【００１８】バイオマスを単離する際に、当然のよう
に、例えば他の無機固体も分離される。更に、本発明に
よる添加剤は、製造された他の物質または発酵ブロス中
に溶解されて存在するが適当な方法で分離されていない
添加された物質の大部分を少なくとも含有する。
に、例えば他の無機固体も分離される。更に、本発明に
よる添加剤は、製造された他の物質または発酵ブロス中
に溶解されて存在するが適当な方法で分離されていない
添加された物質の大部分を少なくとも含有する。
【００１９】これらの物質は、発酵の間に微生物によっ
て製造および分泌される、Ｄ−パントテン酸以外の有機
二次生成物を含んでよい。これらはＬ−メチオニン、Ｌ
−リジン、Ｌ−バリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アラニン
またはＬ−トリプトファンの群から選択されるＬ−アミ
ノ酸、特にＬ−バリンを含む。更に、３個以下のカルボ
キシル基を有する有機酸、例えば酢酸、乳酸、クエン
酸、リンゴ酸またはフマル酸をも包含している。最後
に、転換に乏しい糖、例えばトレハロースも包含してい
る。場合により、前記の化合物は、これらが添加剤の価
値をもたらすのであれば望ましい。
て製造および分泌される、Ｄ−パントテン酸以外の有機
二次生成物を含んでよい。これらはＬ−メチオニン、Ｌ
−リジン、Ｌ−バリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アラニン
またはＬ−トリプトファンの群から選択されるＬ−アミ
ノ酸、特にＬ−バリンを含む。更に、３個以下のカルボ
キシル基を有する有機酸、例えば酢酸、乳酸、クエン
酸、リンゴ酸またはフマル酸をも包含している。最後
に、転換に乏しい糖、例えばトレハロースも包含してい
る。場合により、前記の化合物は、これらが添加剤の価
値をもたらすのであれば望ましい。
【００２０】更に、前記物質は、使用される転換可能な
糖、例えばグルコースまたはサッカロースからの群も包
含してよい。
糖、例えばグルコースまたはサッカロースからの群も包
含してよい。
【００２１】また本発明は、 ａ）一般にナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム
塩、マグネシウム塩またはカルシウム塩を含有するＤ−
パントテン酸含有ブロスを発酵によって製造し、 ｂ）該ブロスからバイオマスを場合により、完全または
部分的に分離し、 ｃ）前記のように得られた溶液またはブロスにアルカリ
土類金属またはアルカリ金属の水酸化物もしくは酸化物
を、有利にはＤ−パントテン酸に関する化学量論的量で
添加し、 ｄ）前記のように得られた混合物を乾燥、噴霧乾燥、噴
霧造粒または造粒することを特徴とする、Ｄ−パントテ
ン酸および／またはその塩を含有する飼料添加剤を製造
するための方法を提供している。
塩、マグネシウム塩またはカルシウム塩を含有するＤ−
パントテン酸含有ブロスを発酵によって製造し、 ｂ）該ブロスからバイオマスを場合により、完全または
部分的に分離し、 ｃ）前記のように得られた溶液またはブロスにアルカリ
土類金属またはアルカリ金属の水酸化物もしくは酸化物
を、有利にはＤ−パントテン酸に関する化学量論的量で
添加し、 ｄ）前記のように得られた混合物を乾燥、噴霧乾燥、噴
霧造粒または造粒することを特徴とする、Ｄ−パントテ
ン酸および／またはその塩を含有する飼料添加剤を製造
するための方法を提供している。
【００２２】また本発明は、Ｄ−パントテン酸および／
またはそのナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム
塩、マグネシウム塩またはカルシウム塩を２０〜８０質
量％（乾燥質量）の範囲内で含有している飼料添加剤
を、発酵ブロスから製造するにあたり、 ａ）有利には発酵ブロスから水を除去し（濃縮工程）、 ｂ）場合により、発酵中に形成したバイオマス０〜１０
０％を除去し、 ｃ）ａ）およびｂ）に従って得られた発酵ブロスに、前
記の１種以上の化合物を添加し、その際、化合物の質量
を動物飼料添加剤中のその濃度が約２０〜８０質量％、
特に５０〜８０質量％であるように添加する、 ｄ）ｃ）によって得られた発酵ブロスを乾燥させて、所
望の粉末形または粒状形で動物飼料添加剤を得る、こと
を特徴とする方法を提供している。
またはそのナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム
塩、マグネシウム塩またはカルシウム塩を２０〜８０質
量％（乾燥質量）の範囲内で含有している飼料添加剤
を、発酵ブロスから製造するにあたり、 ａ）有利には発酵ブロスから水を除去し（濃縮工程）、 ｂ）場合により、発酵中に形成したバイオマス０〜１０
０％を除去し、 ｃ）ａ）およびｂ）に従って得られた発酵ブロスに、前
記の１種以上の化合物を添加し、その際、化合物の質量
を動物飼料添加剤中のその濃度が約２０〜８０質量％、
特に５０〜８０質量％であるように添加する、 ｄ）ｃ）によって得られた発酵ブロスを乾燥させて、所
望の粉末形または粒状形で動物飼料添加剤を得る、こと
を特徴とする方法を提供している。
【００２３】Ｄ−パントテン酸の製造のために適当な微
生物を使用して得られ、かつＤ−パントテン酸および／
またはその塩を含有する発酵ブロスは本発明による方法
のために適当である。
生物を使用して得られ、かつＤ−パントテン酸および／
またはその塩を含有する発酵ブロスは本発明による方法
のために適当である。
【００２４】微生物は、真菌類または酵母、例えばデバ
ロマイセス カステリイまたは、例えばコリネバクテリ
ウム属からのグラム陽性細菌または、例えば腸内細菌科
からのグラム陰性細菌であってよい。エシェリキア コ
リ種を包含するエシェリキア属は、特に腸内細菌科から
挙げられる。エシェリキア コリ種内で、いわゆるＫ−
２株、例えばＭＧ１６５５株またはＷ３１１０株（Neid
hard et al.: Escherichia coli and Salmonella. Cell
ular and Molecular Biology(ASM Press, Washington
D.C.））またはエシェリキア コリ野生株ＩＦＯ３５４
７（Institut fuer Fermentation, Osaka, Japan）およ
びこれらから得られた変異体を挙げることができる。更
に、ＩＦＯ３５４７から調製される株内で、いわゆるＦ
Ｖ５０６９／ｐＦＶ３１（ＥＰ−Ａ−０５９０８５７
号）およびＦＶ５０６９／ｐＦＶ２０２（ＷＯ９７／１
０３４０号）は一際優れている。コリネバクテリウム
グルタミクム種は特にコリネバクテリウム属から挙げら
れる。
ロマイセス カステリイまたは、例えばコリネバクテリ
ウム属からのグラム陽性細菌または、例えば腸内細菌科
からのグラム陰性細菌であってよい。エシェリキア コ
リ種を包含するエシェリキア属は、特に腸内細菌科から
挙げられる。エシェリキア コリ種内で、いわゆるＫ−
２株、例えばＭＧ１６５５株またはＷ３１１０株（Neid
hard et al.: Escherichia coli and Salmonella. Cell
ular and Molecular Biology(ASM Press, Washington
D.C.））またはエシェリキア コリ野生株ＩＦＯ３５４
７（Institut fuer Fermentation, Osaka, Japan）およ
びこれらから得られた変異体を挙げることができる。更
に、ＩＦＯ３５４７から調製される株内で、いわゆるＦ
Ｖ５０６９／ｐＦＶ３１（ＥＰ−Ａ−０５９０８５７
号）およびＦＶ５０６９／ｐＦＶ２０２（ＷＯ９７／１
０３４０号）は一際優れている。コリネバクテリウム
グルタミクム種は特にコリネバクテリウム属から挙げら
れる。
【００２５】前記の微生物は、Ｄ−パントテン酸の製造
の目的のために、バッチ法または流加法または反復流加
法（repeated fed-batch process）において連続的また
はバッチ式に培養することができる。培養の公知法の概
要はクミール（Chmiel）によるテキストブック（Biopro
zesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstec
hnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991））ま
たはシュトーハス（Storhas）によるテキストブック（B
ioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Ver
lag, Braunschweig/ Wiesbaden, 1994））に挙げられて
いる。
の目的のために、バッチ法または流加法または反復流加
法（repeated fed-batch process）において連続的また
はバッチ式に培養することができる。培養の公知法の概
要はクミール（Chmiel）によるテキストブック（Biopro
zesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstec
hnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991））ま
たはシュトーハス（Storhas）によるテキストブック（B
ioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Ver
lag, Braunschweig/ Wiesbaden, 1994））に挙げられて
いる。
【００２６】使用される培養培地は適当なように特定の
微生物の必要条件を満たさねばならない。種々の微生物
のための培養培地の記載は、米国微生物協会（the Amer
icanSociety for Bacteriology）（ワシントンD.C.、Ｕ
ＳＡ、１９８１）によって出版された“一般微生物学の
ための方法のマニュアル（Manual of Methods forGener
al Bacteriology）”に挙げられている。糖および炭化
水素、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、
フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセル
ロース、油および脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落
花生油およびココナツ脂、脂肪酸、例えばパルミチン
酸、ステアリン酸およびリノール酸、アルコール、例え
ばグリセロールおよびエタノールならびに有機酸、例え
ば酢酸を炭素源として使用してよい。前記の物質を別々
に、または混合物として使用してよい。窒素含有有機化
合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エ
キス、コーンスティープリカー、大豆ミールおよび尿素
または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよ
び硝酸アンモニウムを窒素源として使用してよい。該窒
素源は、別々にまたは混合物として使用してよい。リン
酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相
応のナトリウム含有塩をリン源として使用してよい。ま
た培養培地は成長に必要な金属塩、例えば硫酸マグネシ
ウムまたは硫酸鉄を含有しなければならない。最後に、
必須の増殖促進物質、例えばアミノ酸およびビタミンも
前記の物質に加えて使用される。更に、Ｄ−パントテン
酸の前駆体、例えばアスパルテート、β−アラニン、ケ
トイソバレレート、ケトパントイン酸またはパントイン
酸および、場合によりその塩を該培養培地に添加しても
よい。前記の供給原料を１回限りのバッチの形で培養に
添加するか、または培養中に適当な方法で培養に供給し
てもよい。
微生物の必要条件を満たさねばならない。種々の微生物
のための培養培地の記載は、米国微生物協会（the Amer
icanSociety for Bacteriology）（ワシントンD.C.、Ｕ
ＳＡ、１９８１）によって出版された“一般微生物学の
ための方法のマニュアル（Manual of Methods forGener
al Bacteriology）”に挙げられている。糖および炭化
水素、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、
フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセル
ロース、油および脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落
花生油およびココナツ脂、脂肪酸、例えばパルミチン
酸、ステアリン酸およびリノール酸、アルコール、例え
ばグリセロールおよびエタノールならびに有機酸、例え
ば酢酸を炭素源として使用してよい。前記の物質を別々
に、または混合物として使用してよい。窒素含有有機化
合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エ
キス、コーンスティープリカー、大豆ミールおよび尿素
または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよ
び硝酸アンモニウムを窒素源として使用してよい。該窒
素源は、別々にまたは混合物として使用してよい。リン
酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相
応のナトリウム含有塩をリン源として使用してよい。ま
た培養培地は成長に必要な金属塩、例えば硫酸マグネシ
ウムまたは硫酸鉄を含有しなければならない。最後に、
必須の増殖促進物質、例えばアミノ酸およびビタミンも
前記の物質に加えて使用される。更に、Ｄ−パントテン
酸の前駆体、例えばアスパルテート、β−アラニン、ケ
トイソバレレート、ケトパントイン酸またはパントイン
酸および、場合によりその塩を該培養培地に添加しても
よい。前記の供給原料を１回限りのバッチの形で培養に
添加するか、または培養中に適当な方法で培養に供給し
てもよい。
【００２７】有利にはアンモニアまたはアンモニア水は
ｐＨの調整のために使用される。他の塩基性化合物、例
えば水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムは場合によ
り適当である。酸化合物が必要であれば、リン酸または
硫酸を適当な方法で使用する。フォームの形成の制御の
ためには、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステ
ルが使用される。適当な選択的に作用する物質、例えば
抗生物質は場合により培地に添加され、プラスミドの安
定性を維持する。好気条件を得るために、酸素または酸
素含有気体混合物、例えば空気を培養中に導通させる。
培養の温度は通常、２０℃〜４５℃であり、有利には２
５℃〜４０℃である。培養手順は最多のＤ−パントテン
酸が製造されるまで継続させる。前記の目標には一般に
１０時間〜１６０時間内に達成される。
ｐＨの調整のために使用される。他の塩基性化合物、例
えば水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムは場合によ
り適当である。酸化合物が必要であれば、リン酸または
硫酸を適当な方法で使用する。フォームの形成の制御の
ためには、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステ
ルが使用される。適当な選択的に作用する物質、例えば
抗生物質は場合により培地に添加され、プラスミドの安
定性を維持する。好気条件を得るために、酸素または酸
素含有気体混合物、例えば空気を培養中に導通させる。
培養の温度は通常、２０℃〜４５℃であり、有利には２
５℃〜４０℃である。培養手順は最多のＤ−パントテン
酸が製造されるまで継続させる。前記の目標には一般に
１０時間〜１６０時間内に達成される。
【００２８】前記のように得られる発酵ブロスは一般に
乾燥質量７．５〜２５質量％を有しており、かつＤ−パ
ントテン酸を＞０〜２０質量％の濃度で含有している。
発酵の完了後にＤ−パントテン酸が乾燥質量の２〜２０
質量％である発酵プロセスが特に有利である。また、発
酵プロセスを、少なくとも発酵時間の最後に、有利には
発酵時間の少なくとも３０％にわたり糖を制限して実施
する。すなわち発酵培地中の転化可能な糖の濃度を、≧
０〜３ｇ／ｌに維持するか、または前記の時間の間にそ
の値に低下させる。
乾燥質量７．５〜２５質量％を有しており、かつＤ−パ
ントテン酸を＞０〜２０質量％の濃度で含有している。
発酵の完了後にＤ−パントテン酸が乾燥質量の２〜２０
質量％である発酵プロセスが特に有利である。また、発
酵プロセスを、少なくとも発酵時間の最後に、有利には
発酵時間の少なくとも３０％にわたり糖を制限して実施
する。すなわち発酵培地中の転化可能な糖の濃度を、≧
０〜３ｇ／ｌに維持するか、または前記の時間の間にそ
の値に低下させる。
【００２９】本発明による添加剤の製造のためのアンモ
ニウムイオンを含有する変法において、場合によりバイ
オマスは最初に、完全または部分的にＤ−パントテン酸
を含有する発酵ブロスから公知の分離方法、例えば遠心
分離、濾過、傾瀉またはその組合せによって分離するこ
とができる。しかしながら、本発明によれば、発酵ブロ
ス中に全バイオマスを残留させることも可能である。最
後に、Ｄ−パントテン酸に対してアルカリ金属またはア
ルカリ土類金属の酸化物または水酸化物、特にＮａＯ
Ｈ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）2またはＭｇＯの０．８〜
１．２、有利には０．９５〜１．１当量が一般に前記ブ
ロスに添加される。Ｄ−パントテン酸濃度が低い場合に
おいては、より大量の酸化物または水酸化物を、例えば
１．２〜４当量の範囲で使用するのが有利である。前記
のように得られる懸濁液は一般に乾燥前に最高の６０質
量％に濃縮される。また発酵ブロスをまず濃縮し、次い
で酸化物または水酸化物を添加することもできる。次い
で得られた濃縮物を、注入可能な、易流動性の、微細な
粉末または粒体へと慣用の乾燥器中で、または流下薄膜
型蒸発器または薄層蒸発器または噴霧乾燥器または噴霧
造粒機または凍結乾燥装置を使用して変換される。また
造粒は乾燥後に、例えばビルドアップ造粒（build-up g
ranulation）の形で実施することができる。
ニウムイオンを含有する変法において、場合によりバイ
オマスは最初に、完全または部分的にＤ−パントテン酸
を含有する発酵ブロスから公知の分離方法、例えば遠心
分離、濾過、傾瀉またはその組合せによって分離するこ
とができる。しかしながら、本発明によれば、発酵ブロ
ス中に全バイオマスを残留させることも可能である。最
後に、Ｄ−パントテン酸に対してアルカリ金属またはア
ルカリ土類金属の酸化物または水酸化物、特にＮａＯ
Ｈ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）2またはＭｇＯの０．８〜
１．２、有利には０．９５〜１．１当量が一般に前記ブ
ロスに添加される。Ｄ−パントテン酸濃度が低い場合に
おいては、より大量の酸化物または水酸化物を、例えば
１．２〜４当量の範囲で使用するのが有利である。前記
のように得られる懸濁液は一般に乾燥前に最高の６０質
量％に濃縮される。また発酵ブロスをまず濃縮し、次い
で酸化物または水酸化物を添加することもできる。次い
で得られた濃縮物を、注入可能な、易流動性の、微細な
粉末または粒体へと慣用の乾燥器中で、または流下薄膜
型蒸発器または薄層蒸発器または噴霧乾燥器または噴霧
造粒機または凍結乾燥装置を使用して変換される。また
造粒は乾燥後に、例えばビルドアップ造粒（build-up g
ranulation）の形で実施することができる。
【００３０】更に、本発明はＤ−パントテン酸のアンモ
ニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩
またはカルシウム塩を含有する粉末またはこれらを含有
するプレゼンテーションの形を迅速かつ費用効率よく製
造する新規の方法を見いだしている。そのために、Ｄ−
パントテン酸を含有する発酵ブロスを相応のヒドロキシ
ル化合物を使用して製造し、場合によりまずバイオマス
を完全または部分的に、公知の分離方法、例えば遠心分
離、濾過、傾瀉またはその組合せによって分離する。し
かしながら、本発明によれば、発酵ブロス中に全バイオ
マスを残留させることも可能である。次いで場合により
前処理したブロスを、公知法を使用して、例えば回転蒸
発器または薄層蒸発器または流下薄層型蒸発器を使用し
て濃縮または乾燥させる。場合により前処理したブロス
を次いで加工して、注入可能な、易流動性の、微細な粉
末、または粒体が、噴霧乾燥、噴霧造粒または凍結乾燥
または幾つかの他の方法を使用して得られる。
ニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩
またはカルシウム塩を含有する粉末またはこれらを含有
するプレゼンテーションの形を迅速かつ費用効率よく製
造する新規の方法を見いだしている。そのために、Ｄ−
パントテン酸を含有する発酵ブロスを相応のヒドロキシ
ル化合物を使用して製造し、場合によりまずバイオマス
を完全または部分的に、公知の分離方法、例えば遠心分
離、濾過、傾瀉またはその組合せによって分離する。し
かしながら、本発明によれば、発酵ブロス中に全バイオ
マスを残留させることも可能である。次いで場合により
前処理したブロスを、公知法を使用して、例えば回転蒸
発器または薄層蒸発器または流下薄層型蒸発器を使用し
て濃縮または乾燥させる。場合により前処理したブロス
を次いで加工して、注入可能な、易流動性の、微細な粉
末、または粒体が、噴霧乾燥、噴霧造粒または凍結乾燥
または幾つかの他の方法を使用して得られる。
【００３１】一般に本発明による新規の動物飼料添加剤
は全質量に対して、Ｄ−パントテン酸および／またはそ
の塩２０〜８０質量％、有利には３０〜７５質量％含有
する。一般にまた、これらは無機成分を２．５〜２５質
量％、かつ場合により有機第二生成物を＞０〜３０質量
％の量で含有する。乾燥バイオマスの割合は、０〜３５
質量％である。有利には水含有率は、≦５質量％であ
る。Ｄ−パントテン酸および／または１種以上の前記の
塩の所望の濃度は、場合により相応の化合物を発酵的に
製造された生成物に添加することによって製造すること
ができる。有利には該混合物中に所望の化合物を溶液ま
たは乾燥物質の形で添加し、かつ該混合物と乾燥または
噴霧乾燥前に、特に混合物の濃縮後に混合する。前記の
ように得られた生成物は飼料添加剤として使用される。
は全質量に対して、Ｄ−パントテン酸および／またはそ
の塩２０〜８０質量％、有利には３０〜７５質量％含有
する。一般にまた、これらは無機成分を２．５〜２５質
量％、かつ場合により有機第二生成物を＞０〜３０質量
％の量で含有する。乾燥バイオマスの割合は、０〜３５
質量％である。有利には水含有率は、≦５質量％であ
る。Ｄ−パントテン酸および／または１種以上の前記の
塩の所望の濃度は、場合により相応の化合物を発酵的に
製造された生成物に添加することによって製造すること
ができる。有利には該混合物中に所望の化合物を溶液ま
たは乾燥物質の形で添加し、かつ該混合物と乾燥または
噴霧乾燥前に、特に混合物の濃縮後に混合する。前記の
ように得られた生成物は飼料添加剤として使用される。
【００３２】Ｄ−パントテン酸の濃度は公知の方法（Ve
lisek; Chromatographic Science 60, 515-560(1992)）
を使用して決定することができる。
lisek; Chromatographic Science 60, 515-560(1992)）
を使用して決定することができる。
【００３３】
【実施例】本発明を以下の実施例において詳細に説明す
る。この目的のために、ブタペスト条約に従って茨城県
つくば市ひがし１−１−３（日本）の微工研、工業科学
技術局（Fermentation Research Institute, Agency of
Industrial Science andTechnology）にＦＥＲＭ−Ｂ
Ｐ４３９５として寄託されているＤ−パントテン酸を製
造するエシェリキア コリ５０６９／ｐＦＶ３１株を使
用して実施した。
る。この目的のために、ブタペスト条約に従って茨城県
つくば市ひがし１−１−３（日本）の微工研、工業科学
技術局（Fermentation Research Institute, Agency of
Industrial Science andTechnology）にＦＥＲＭ−Ｂ
Ｐ４３９５として寄託されているＤ−パントテン酸を製
造するエシェリキア コリ５０６９／ｐＦＶ３１株を使
用して実施した。
【００３４】例１ Ｄ−パントテン酸を含有する発酵ブロスの製造 １．接種材料の製造 エシェリキア コリＦＶ５０６９／ｐＦＶ３１の試料
を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを補ったＬＢＧアガー
上に塗布した。このアガープレート培養を３７℃で１７
時間インキュベートし、次いで＋４℃の冷蔵庫中で保存
した。選択された個々のコロニーを更にＬＢＧブロス中
で増殖させた。ＬＢＧブロスは以下の組成を有してい
る：ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣ
ｌ５ｇ／ｌおよびグルコース１ｇ／ｌ。またＬＢＧアガ
ーは寒天１２ｇ／ｌを含有している。事前に調製された
調製物をＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ（ペーズリー、スコットラ
ンド、グレートブリテン）からＬＢブロスベース（LB b
roth base）またはＬＢアガーとして購入してもよい。
グルコース１ｇ／ｌを添加した後に、前記の培地が得ら
れる。１００ｍｌコニカルフラスコ中に入っている培養
１０ｍｌをキューナー社（Kuehner AG）（Birsfelden、
スイス）のＥＳＲインキュベーター中で３７℃および１
８０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。次いで、細
胞懸濁液をベックマン社（ハノーバー、ドイツ）のＪ−
６Ｂ遠心分離器中で４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離
した。細胞ペレットを、２０％グリセロールを補ったＬ
ＢＧ培地１０ｍｌ中に再懸濁し、各１ｍｌの１０アリコ
ートで滅菌条件下に瓶詰めし、−７０℃で凍結させた。
これらの培養をマスター細胞バンクとして使用した。
を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを補ったＬＢＧアガー
上に塗布した。このアガープレート培養を３７℃で１７
時間インキュベートし、次いで＋４℃の冷蔵庫中で保存
した。選択された個々のコロニーを更にＬＢＧブロス中
で増殖させた。ＬＢＧブロスは以下の組成を有してい
る：ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣ
ｌ５ｇ／ｌおよびグルコース１ｇ／ｌ。またＬＢＧアガ
ーは寒天１２ｇ／ｌを含有している。事前に調製された
調製物をＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ（ペーズリー、スコットラ
ンド、グレートブリテン）からＬＢブロスベース（LB b
roth base）またはＬＢアガーとして購入してもよい。
グルコース１ｇ／ｌを添加した後に、前記の培地が得ら
れる。１００ｍｌコニカルフラスコ中に入っている培養
１０ｍｌをキューナー社（Kuehner AG）（Birsfelden、
スイス）のＥＳＲインキュベーター中で３７℃および１
８０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。次いで、細
胞懸濁液をベックマン社（ハノーバー、ドイツ）のＪ−
６Ｂ遠心分離器中で４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離
した。細胞ペレットを、２０％グリセロールを補ったＬ
ＢＧ培地１０ｍｌ中に再懸濁し、各１ｍｌの１０アリコ
ートで滅菌条件下に瓶詰めし、−７０℃で凍結させた。
これらの培養をマスター細胞バンクとして使用した。
【００３５】作業細胞バンクを製造するために、アンピ
シリン５０μｇ／ｍｌを補ったＬＢＧ培地を１００ｍｌ
のコニカルフラスコ間で１０ｍｌ部に分配し、次いで前
記のマスター細胞バンク１００μｌを接種した。混合物
をキューナー社（Kuehner AG）（Birsfelden、スイス）
のＥＳＲインキュベーター中で３７℃および１８０ｒｐ
ｍで１６時間インキュベートした。インキュベーション
後に、培養懸濁液の光学密度（ＯＤ）をＤｒ．ランゲ社
（Dr. lange Co）（ベルリン、ドイツ）のＦＰ２Ｗフォ
トメーターを使用して測定波長６６０ｎｍで決定した。
それは３．５であった。次いで細胞懸濁液を、グライナ
ー社（Greiner Co）（フリッケンハウゼン、ドイツ）の
滅菌の３０ｍｌポリエチレンチューブ中に滅菌下で入
れ、ベックマン社（ハノーバー、ドイツ）のＪ−６Ｂ遠
心分離器を使用して２５００ｒｐｍで１５分間遠心分離
した。分離したバイオマスを２０％のグリセロールを補
ったＬＢＧ培地１０ｍｌ中で再懸濁した。次いで細胞懸
濁液を５００μｌ部でナルジーン社（Nalgene Co）（ニ
ューヨーク、ＵＳＡ）の１ｍｌ滅菌中に滅菌条件下で入
れ、−７０℃で凍結させた。前記のように製造した保存
される部を作業細胞バンクとして使用した。
シリン５０μｇ／ｍｌを補ったＬＢＧ培地を１００ｍｌ
のコニカルフラスコ間で１０ｍｌ部に分配し、次いで前
記のマスター細胞バンク１００μｌを接種した。混合物
をキューナー社（Kuehner AG）（Birsfelden、スイス）
のＥＳＲインキュベーター中で３７℃および１８０ｒｐ
ｍで１６時間インキュベートした。インキュベーション
後に、培養懸濁液の光学密度（ＯＤ）をＤｒ．ランゲ社
（Dr. lange Co）（ベルリン、ドイツ）のＦＰ２Ｗフォ
トメーターを使用して測定波長６６０ｎｍで決定した。
それは３．５であった。次いで細胞懸濁液を、グライナ
ー社（Greiner Co）（フリッケンハウゼン、ドイツ）の
滅菌の３０ｍｌポリエチレンチューブ中に滅菌下で入
れ、ベックマン社（ハノーバー、ドイツ）のＪ−６Ｂ遠
心分離器を使用して２５００ｒｐｍで１５分間遠心分離
した。分離したバイオマスを２０％のグリセロールを補
ったＬＢＧ培地１０ｍｌ中で再懸濁した。次いで細胞懸
濁液を５００μｌ部でナルジーン社（Nalgene Co）（ニ
ューヨーク、ＵＳＡ）の１ｍｌ滅菌中に滅菌条件下で入
れ、−７０℃で凍結させた。前記のように製造した保存
される部を作業細胞バンクとして使用した。
【００３６】２．Ｄ−パントテン酸を含有する発酵ブロ
スの製造 パントテン酸を含有する発酵ブロスを製造するために、
まず作業細胞バンクを振盪フラスコ培養で増殖させ、こ
れを使用して前発酵槽（prefermenter）に接種した。前
発酵槽からの培養を使用して、製造発酵槽（production
fermenter）に接種した。
スの製造 パントテン酸を含有する発酵ブロスを製造するために、
まず作業細胞バンクを振盪フラスコ培養で増殖させ、こ
れを使用して前発酵槽（prefermenter）に接種した。前
発酵槽からの培養を使用して、製造発酵槽（production
fermenter）に接種した。
【００３７】ＳＫＡ培地を振盪フラスコ培養のために使
用した。ＳＫＡ培地は以下に記載のように製造した：事
前に２５％濃度のアンモニア溶液を使用してｐＨを６．
８に調整した７．０ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．５ｇの
ＫＨ2ＰＯ4、１．０ｇのＫ2ＨＰＯ4、０．５ｇのＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ、０．０１ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．０
１ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００５ｇのＦｅ2（Ｓ
Ｏ4）3ならびに２０ｇのコーンスティープリカーを１ｌ
ガラスビーカーに秤量し、次いでそこに蒸留水８７５ｍ
ｌを添加した。前記のコーンスティープリカーを含有す
る塩溶液をオートクレーブ中で１２１℃で２０分間滅菌
した。更に、１２５ｇの蒸留水、２８．７ｇのグルコー
スおよび０．００２ｇのチアミン・ＨＣｌを含有する溶
液を濾過滅菌した。１０ｇのＣａＣＯ3を１００ｍｌフ
ラスコ中に秤量し、オートクレーブ中で１２３℃で２０
分間滅菌した。ＳＫＡ培地は、前記の２成分とコーンス
ティープリカーを含有する塩溶液とを混合することによ
って得られた。
用した。ＳＫＡ培地は以下に記載のように製造した：事
前に２５％濃度のアンモニア溶液を使用してｐＨを６．
８に調整した７．０ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．５ｇの
ＫＨ2ＰＯ4、１．０ｇのＫ2ＨＰＯ4、０．５ｇのＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ、０．０１ｇのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．０
１ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００５ｇのＦｅ2（Ｓ
Ｏ4）3ならびに２０ｇのコーンスティープリカーを１ｌ
ガラスビーカーに秤量し、次いでそこに蒸留水８７５ｍ
ｌを添加した。前記のコーンスティープリカーを含有す
る塩溶液をオートクレーブ中で１２１℃で２０分間滅菌
した。更に、１２５ｇの蒸留水、２８．７ｇのグルコー
スおよび０．００２ｇのチアミン・ＨＣｌを含有する溶
液を濾過滅菌した。１０ｇのＣａＣＯ3を１００ｍｌフ
ラスコ中に秤量し、オートクレーブ中で１２３℃で２０
分間滅菌した。ＳＫＡ培地は、前記の２成分とコーンス
ティープリカーを含有する塩溶液とを混合することによ
って得られた。
【００３８】前記のＳＫＡ培地を１００ｍｌコニカルフ
ラスコ中に１２．５ｍｌ部で分配し、次いで細胞懸濁液
０．５ｍｌを接種した。滅菌生理食塩水で１：１００に
希釈した作業細胞培養の保存された部を細胞懸濁液とし
て使用した。インキュベーションを、インフォルス社
（Infors AG）（Bottmingen、スイス）のＲＣ−１−Ｔ
Ｋインキュベーター中で３２℃および１５０ｒｐｍで２
０時間実施した。前記の手順の後に測定した測定波長６
６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ６６０）は１２．５であっ
た。
ラスコ中に１２．５ｍｌ部で分配し、次いで細胞懸濁液
０．５ｍｌを接種した。滅菌生理食塩水で１：１００に
希釈した作業細胞培養の保存された部を細胞懸濁液とし
て使用した。インキュベーションを、インフォルス社
（Infors AG）（Bottmingen、スイス）のＲＣ−１−Ｔ
Ｋインキュベーター中で３２℃および１５０ｒｐｍで２
０時間実施した。前記の手順の後に測定した測定波長６
６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ６６０）は１２．５であっ
た。
【００３９】前記の振盪フラスコ培養０．５ｍｌを生理
的食塩水４．５ｍｌで希釈し、そのうち０．７ｍｌを使
用して、予めブラウンディーセルビオテック社（Braun
Diessel Biotech GmbH）（メルズンゲン、ドイツ）の２
ｌの研究室用の発酵槽モデルＢｉｏｓｔａｔ(R)ＭＤに
入れてある培養培地１３００ｍｌに接種した。
的食塩水４．５ｍｌで希釈し、そのうち０．７ｍｌを使
用して、予めブラウンディーセルビオテック社（Braun
Diessel Biotech GmbH）（メルズンゲン、ドイツ）の２
ｌの研究室用の発酵槽モデルＢｉｏｓｔａｔ(R)ＭＤに
入れてある培養培地１３００ｍｌに接種した。
【００４０】該培養培地は以下のように製造した。水道
水１３００ｍｌ中の９．８１ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、
０．７ｇのＫＨ2ＰＯ4、１．４０２ｇのＫ2ＨＰＯ4、
０．７０ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０１４ｇのＭｎ
ＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．０１４ｇのＦｅ2（ＳＯ4）3ならび
に２８．０４ｇのコーンスティープリカーを含有する溶
液を２５％濃度のアンモニア溶液を使用してｐＨ６．５
に調整し、オートクレーブ中で１２１℃で２０分間滅菌
した。前記のコーンスティープリカーを含有する塩溶液
に、１００ｇの蒸留水中の４０．６２ｇのグルコースお
よび０．００４２ｇのチアミン・ＨＣｌを含有する別々
の濾過滅菌した溶液を滅菌条件下で添加した。
水１３００ｍｌ中の９．８１ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、
０．７ｇのＫＨ2ＰＯ4、１．４０２ｇのＫ2ＨＰＯ4、
０．７０ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０１４ｇのＭｎ
ＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．０１４ｇのＦｅ2（ＳＯ4）3ならび
に２８．０４ｇのコーンスティープリカーを含有する溶
液を２５％濃度のアンモニア溶液を使用してｐＨ６．５
に調整し、オートクレーブ中で１２１℃で２０分間滅菌
した。前記のコーンスティープリカーを含有する塩溶液
に、１００ｇの蒸留水中の４０．６２ｇのグルコースお
よび０．００４２ｇのチアミン・ＨＣｌを含有する別々
の濾過滅菌した溶液を滅菌条件下で添加した。
【００４１】発酵を３７℃および通気速度１ｖｖｍで１
６時間実施した。溶解させた酸素を２０％に維持し、ｐ
Ｈを６．５に維持した。２５％濃度のアンモニア溶液を
ｐＨ調整剤として使用した。光学密度は１３．１であっ
た。該培養９０ｍｌを使用して、本発酵手順のために２
ｌ研究所発酵槽Ｂｉｏｓｔａｔ(R)ＭＤモデル中で増殖
培地１１４４ｍｌに接種した。
６時間実施した。溶解させた酸素を２０％に維持し、ｐ
Ｈを６．５に維持した。２５％濃度のアンモニア溶液を
ｐＨ調整剤として使用した。光学密度は１３．１であっ
た。該培養９０ｍｌを使用して、本発酵手順のために２
ｌ研究所発酵槽Ｂｉｏｓｔａｔ(R)ＭＤモデル中で増殖
培地１１４４ｍｌに接種した。
【００４２】該増殖培地は以下のように製造した。水道
水１１４４ｍｌ中の４．１４ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、
０．７４４ｇのＫＨ2ＰＯ4、１．０ｇのＫ2ＨＰＯ4、
０．８３ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０１２４ｇのＭ
ｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、１８．８７ｇのβ−アラニン、０．７
４ｇのストルクトール（Struktol）Ｊ６４７ならびに４
９．７２ｇのコーンスティープリカーを含有する溶液を
２５％濃度のアンモニア溶液を使用してｐＨ６．５に調
整し、オートクレーブ中で１２１℃で２０分間滅菌し
た。前記のコーンスティープリカーを含有する塩溶液
に、１００ｍｌの蒸留水中の３５．９２ｇのグルコース
および０．００２ｇのチアミン・ＨＣｌを含有する別々
の濾過滅菌した溶液を滅菌条件下で添加した。
水１１４４ｍｌ中の４．１４ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、
０．７４４ｇのＫＨ2ＰＯ4、１．０ｇのＫ2ＨＰＯ4、
０．８３ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０１２４ｇのＭ
ｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、１８．８７ｇのβ−アラニン、０．７
４ｇのストルクトール（Struktol）Ｊ６４７ならびに４
９．７２ｇのコーンスティープリカーを含有する溶液を
２５％濃度のアンモニア溶液を使用してｐＨ６．５に調
整し、オートクレーブ中で１２１℃で２０分間滅菌し
た。前記のコーンスティープリカーを含有する塩溶液
に、１００ｍｌの蒸留水中の３５．９２ｇのグルコース
および０．００２ｇのチアミン・ＨＣｌを含有する別々
の濾過滅菌した溶液を滅菌条件下で添加した。
【００４３】発酵を３７℃で４０時間実施した。増殖相
において、ｐＨは６．５であり、通気速度は１ｖｖｍで
あった。製造相においては、ｐＨは６．０であり、通気
速度は１．５ｖｖｍであった。両者の相において、溶解
させた酸素は２％未満に維持した。２５％濃度のアンモ
ニア溶液をｐＨ調整剤として使用した。発酵の間に、製
造培地１および製造培地２を段階的に供給した。コーン
スティープリカーは培養中に１回で添加した。製造培地
は５８４ｍｌの水道水中に４６５．２９ｇのグルコース
および０．０２６１ｇのチアミン・ＨＣｌを含有し、か
つ濾過滅菌した。製造培地２は、オートクレーブ中で１
２１℃で２０分間滅菌された１４０ｍｌの水道水中に３
７．５ｇのβ−アラニンを含有している。７．５時間の
発酵時間および培養工程の終わりまでの発酵時間の後
に、製造培地１を段階的に供給した。１０．５時間の培
養後に、水道水１００ｍｌ中に溶解させ、かつオートク
レーブ中で１２１℃で２０分間滅菌したコーンスティー
プリカー４９．５ｇを滅菌条件下で添加した。１２．５
時間の発酵時間および培養工程の終わりまでの発酵時間
の後に、製造培地２を添加速度３．５ｇ／ｈで供給し
た。４１時間の培養後に、パントテン酸濃度６．１質量
％が発酵ブロス中に見いだされた。
において、ｐＨは６．５であり、通気速度は１ｖｖｍで
あった。製造相においては、ｐＨは６．０であり、通気
速度は１．５ｖｖｍであった。両者の相において、溶解
させた酸素は２％未満に維持した。２５％濃度のアンモ
ニア溶液をｐＨ調整剤として使用した。発酵の間に、製
造培地１および製造培地２を段階的に供給した。コーン
スティープリカーは培養中に１回で添加した。製造培地
は５８４ｍｌの水道水中に４６５．２９ｇのグルコース
および０．０２６１ｇのチアミン・ＨＣｌを含有し、か
つ濾過滅菌した。製造培地２は、オートクレーブ中で１
２１℃で２０分間滅菌された１４０ｍｌの水道水中に３
７．５ｇのβ−アラニンを含有している。７．５時間の
発酵時間および培養工程の終わりまでの発酵時間の後
に、製造培地１を段階的に供給した。１０．５時間の培
養後に、水道水１００ｍｌ中に溶解させ、かつオートク
レーブ中で１２１℃で２０分間滅菌したコーンスティー
プリカー４９．５ｇを滅菌条件下で添加した。１２．５
時間の発酵時間および培養工程の終わりまでの発酵時間
の後に、製造培地２を添加速度３．５ｇ／ｈで供給し
た。４１時間の培養後に、パントテン酸濃度６．１質量
％が発酵ブロス中に見いだされた。
【００４４】Ｄ−パントテン酸濃度を、クナウアー社
（Knauer）（ベルリン、ドイツ）のＨＰＬＣ（高性能液
体クロマトグラフィー）ユニットモデルＭ３２１を使用
して、５μｍ粒度を有するＨｙｐｅｒｓｉｌ ＡＰＳ２
アミノ相を使用するＲＩ（屈折率）検出によって決定し
た。
（Knauer）（ベルリン、ドイツ）のＨＰＬＣ（高性能液
体クロマトグラフィー）ユニットモデルＭ３２１を使用
して、５μｍ粒度を有するＨｙｐｅｒｓｉｌ ＡＰＳ２
アミノ相を使用するＲＩ（屈折率）検出によって決定し
た。
【００４５】例２ 例１に記載したのと同一の条件下で実施した発酵試験に
おいて、パントテン酸濃度５．４質量％が、４３時間の
培養時間後に発酵ブロス中で検出された。Ｌ−バリンの
濃度は８ｇ／ｌであった。
おいて、パントテン酸濃度５．４質量％が、４３時間の
培養時間後に発酵ブロス中で検出された。Ｌ−バリンの
濃度は８ｇ／ｌであった。
【００４６】例３ Ｄ−パントテン酸カルシウムの製造 バイオマスを、例１および例２に記載された方法を使用
して製造され、かつ約６．１質量％のＤ−パントテン酸
を含有しているパントテン酸含有発酵ブロスから分離し
た。このために、前記の発酵ブロス１ｌを研究室用遠心
分離器であるヘラオイス社（Heraeus）（デュッセルド
ルフ、ドイツ）のＢｉｏｆｕｇｅＳｔｒａｔｏｓモデル
を使用して、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上
清の遠心分離液を更に、ＩＣＴ社（ICT GmbH）（Bad Ha
nburg、ドイツ）のＵＦ装置（UFunit）中で３０ｋＤの
ＭＲＣポリマー膜を使用してクロスフロー限外濾過によ
って精製した。
して製造され、かつ約６．１質量％のＤ−パントテン酸
を含有しているパントテン酸含有発酵ブロスから分離し
た。このために、前記の発酵ブロス１ｌを研究室用遠心
分離器であるヘラオイス社（Heraeus）（デュッセルド
ルフ、ドイツ）のＢｉｏｆｕｇｅＳｔｒａｔｏｓモデル
を使用して、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上
清の遠心分離液を更に、ＩＣＴ社（ICT GmbH）（Bad Ha
nburg、ドイツ）のＵＦ装置（UFunit）中で３０ｋＤの
ＭＲＣポリマー膜を使用してクロスフロー限外濾過によ
って精製した。
【００４７】次いで固体のＣａ（ＯＨ）2（９６％；メ
ルク、ダルムシュタット、ドイツ）１０．１ｇを、撹拌
しながらバッチ式に添加した。ｐＨは約１０．３であっ
た。次いで前記のように処理したブロスを回転蒸発器の
ビューチ−ラボルテヒニック社（Buechi-Labortechnik
GmbH）（コンスタンツ、ドイツ）のＲｏｔａｖａｐｏｒ
ＲＥ−１２０中で約５０％の乾燥質量の液体含有率に
６０℃で真空下に濃縮した。次いで前記のように得られ
た濃縮ブロスを噴霧乾燥し、Ｄ−パントテン酸のカルシ
ウム塩を製造した。このために、研究室用の噴霧乾燥器
のビューチ−ラボルテヒニック社（コンスタンツ、ドイ
ツ）のビューチ−１９０（Buechi-190）を、入口温度１
０７℃、出口温度８５℃、圧力差−４０ミリバールおよ
び空気の流速６００ＮＬ／ｈで使用した。
ルク、ダルムシュタット、ドイツ）１０．１ｇを、撹拌
しながらバッチ式に添加した。ｐＨは約１０．３であっ
た。次いで前記のように処理したブロスを回転蒸発器の
ビューチ−ラボルテヒニック社（Buechi-Labortechnik
GmbH）（コンスタンツ、ドイツ）のＲｏｔａｖａｐｏｒ
ＲＥ−１２０中で約５０％の乾燥質量の液体含有率に
６０℃で真空下に濃縮した。次いで前記のように得られ
た濃縮ブロスを噴霧乾燥し、Ｄ−パントテン酸のカルシ
ウム塩を製造した。このために、研究室用の噴霧乾燥器
のビューチ−ラボルテヒニック社（コンスタンツ、ドイ
ツ）のビューチ−１９０（Buechi-190）を、入口温度１
０７℃、出口温度８５℃、圧力差−４０ミリバールおよ
び空気の流速６００ＮＬ／ｈで使用した。
【００４８】前記のように製造したＤ−パントテン酸カ
ルシウムを含有する生成物はパントテン酸濃度６８．５
質量％を有しており、易流動性であり、かつかさ密度４
６０ｍｇ／ｍｌを有していた。５ヶ月間保存した後に、
Ｄ−パントテン酸濃度は６７．６質量％であった。
ルシウムを含有する生成物はパントテン酸濃度６８．５
質量％を有しており、易流動性であり、かつかさ密度４
６０ｍｇ／ｍｌを有していた。５ヶ月間保存した後に、
Ｄ−パントテン酸濃度は６７．６質量％であった。
【００４９】例４ Ｄ−パントテン酸ナトリウムの製造 バイオマスを、例１および例２に記載されるような方法
を使用して製造され、かつ約６．１質量％のＤ−パント
テン酸を含有するパントテン酸含有発酵ブロスから分離
した。このために、前記の発酵ブロス１ｌを例３に記載
したのと同様に遠心分離および限外濾過した。
を使用して製造され、かつ約６．１質量％のＤ−パント
テン酸を含有するパントテン酸含有発酵ブロスから分離
した。このために、前記の発酵ブロス１ｌを例３に記載
したのと同様に遠心分離および限外濾過した。
【００５０】次いでＮａＯＨ（９９％；メルク）１０．
６ｇを撹拌しながらバッチ式に添加した。ｐＨは約１０
であった。次いで前記のように処理したブロスを、回転
蒸発器のビューチ−ラボルテヒニック社のＲｏｔａｖａ
ｐｏｒ ＲＥ−１２０中で５０〜６０℃で真空下に、約
５０％の乾燥重量の液体含有率に濃縮した。次いで前記
のように濃縮したブロスを凍結乾燥器のレイボルト社
（Leybold）（Cologne、ドイツ）のＬＹＯＶＡＣ ＧＴ
２中で凍結乾燥し、Ｄ−パントテン酸のナトリウム塩を
製造した。
６ｇを撹拌しながらバッチ式に添加した。ｐＨは約１０
であった。次いで前記のように処理したブロスを、回転
蒸発器のビューチ−ラボルテヒニック社のＲｏｔａｖａ
ｐｏｒ ＲＥ−１２０中で５０〜６０℃で真空下に、約
５０％の乾燥重量の液体含有率に濃縮した。次いで前記
のように濃縮したブロスを凍結乾燥器のレイボルト社
（Leybold）（Cologne、ドイツ）のＬＹＯＶＡＣ ＧＴ
２中で凍結乾燥し、Ｄ−パントテン酸のナトリウム塩を
製造した。
【００５１】前記のように製造したＤ−パントテン酸ナ
トリウムを含有する生成物はＤ−パントテン酸濃度６
３．８質量％を有しており、易流動性であった。５ヶ月
間の保存後に、Ｄ−パントテン酸濃度は６３．０質量％
であった。
トリウムを含有する生成物はＤ−パントテン酸濃度６
３．８質量％を有しており、易流動性であった。５ヶ月
間の保存後に、Ｄ−パントテン酸濃度は６３．０質量％
であった。
【００５２】例５ Ｄ−パントテン酸マグネシウムの製造 バイオマスを、例１および例２に記載されるような方法
を使用して製造され、かつ約６．１質量％のＤ−パント
テン酸を含有するパントテン酸含有発酵ブロスから分離
した。このために、前記の発酵ブロス１ｌを例２に記載
したのと同様に遠心分離および限外濾過した。
を使用して製造され、かつ約６．１質量％のＤ−パント
テン酸を含有するパントテン酸含有発酵ブロスから分離
した。このために、前記の発酵ブロス１ｌを例２に記載
したのと同様に遠心分離および限外濾過した。
【００５３】次いで、ＭｇＯ（９７％；メルク）５．４
ｇを撹拌しながらバッチ式に添加した。ｐＨは約９〜１
０であった。次いで前記のように処理したブロスを、回
転蒸発器のビューチ−ラボルテヒニック社のＲｏｔａｖ
ａｐｏｒ ＲＥ−１２０中で５０〜６０℃で真空下に、
約５０％の乾燥重量の液体含有率に濃縮した。次いで前
記のように濃縮したブロスを凍結乾燥器のレイボルト社
のＬＹＯＶＡＣ ＧＴ２中で凍結乾燥し、Ｄ−パントテ
ン酸のマグネシウム塩を製造した。
ｇを撹拌しながらバッチ式に添加した。ｐＨは約９〜１
０であった。次いで前記のように処理したブロスを、回
転蒸発器のビューチ−ラボルテヒニック社のＲｏｔａｖ
ａｐｏｒ ＲＥ−１２０中で５０〜６０℃で真空下に、
約５０％の乾燥重量の液体含有率に濃縮した。次いで前
記のように濃縮したブロスを凍結乾燥器のレイボルト社
のＬＹＯＶＡＣ ＧＴ２中で凍結乾燥し、Ｄ−パントテ
ン酸のマグネシウム塩を製造した。
【００５４】前記のように製造したＤ−パントテン酸マ
グネシウムを含有する生成物はＤ−パントテン酸濃度６
４．７質量％を有しており、易流動性であった。５ヶ月
間の保存後に、Ｄ−パントテン酸濃度は６４．４質量％
であった。
グネシウムを含有する生成物はＤ−パントテン酸濃度６
４．７質量％を有しており、易流動性であった。５ヶ月
間の保存後に、Ｄ−パントテン酸濃度は６４．４質量％
であった。
【００５５】例６ Ｄ−パントテン酸カリウムの製造 バイオマスを、例１および例２に記載されるような方法
を使用して製造され、かつ約６．１質量％のＤ−パント
テン酸を含有するパントテン酸含有発酵ブロスから分離
した。このために、前記の発酵ブロス１ｌを例２に記載
したのと同様に遠心分離および限外濾過した。
を使用して製造され、かつ約６．１質量％のＤ−パント
テン酸を含有するパントテン酸含有発酵ブロスから分離
した。このために、前記の発酵ブロス１ｌを例２に記載
したのと同様に遠心分離および限外濾過した。
【００５６】次いでＫＯＨ（８５％；メルク）１７．４
ｇを撹拌しながらバッチ式に添加した。ｐＨは約１０〜
１１であった。次いで前記のように処理したブロスを、
回転蒸発器のビューチ−ラボルテヒニック社のＲｏｔａ
ｖａｐｏｒ ＲＥ−１２０中で６０℃で真空下に、約５
０％の乾燥重量の液体含有率に濃縮した。次いで前記の
ように濃縮したブロスを凍結乾燥器のレイボルト社のＬ
ＹＯＶＡＣ ＧＴ２中で凍結乾燥し、Ｄ−パントテン酸
のカリウム塩を製造した。
ｇを撹拌しながらバッチ式に添加した。ｐＨは約１０〜
１１であった。次いで前記のように処理したブロスを、
回転蒸発器のビューチ−ラボルテヒニック社のＲｏｔａ
ｖａｐｏｒ ＲＥ−１２０中で６０℃で真空下に、約５
０％の乾燥重量の液体含有率に濃縮した。次いで前記の
ように濃縮したブロスを凍結乾燥器のレイボルト社のＬ
ＹＯＶＡＣ ＧＴ２中で凍結乾燥し、Ｄ−パントテン酸
のカリウム塩を製造した。
【００５７】前記のように製造したＤ−パントテン酸カ
リウムを含有する生成物はＤ−パントテン酸濃度６３．
５質量％を有しており、易流動性であった。５ヶ月間の
保存後に、Ｄ−パントテン酸濃度は６２．９質量％であ
った。
リウムを含有する生成物はＤ−パントテン酸濃度６３．
５質量％を有しており、易流動性であった。５ヶ月間の
保存後に、Ｄ−パントテン酸濃度は６２．９質量％であ
った。
【００５８】例７ Ｄ−パントテン酸アンモニウムの製造 バイオマスを、例１および例２に記載されるような方法
を使用して製造され、かつ約６．１質量％のＤ−パント
テン酸を含有するパントテン酸含有発酵ブロスから分離
した。このために、前記の発酵ブロス１ｌを例２に記載
したのと同様に遠心分離および限外濾過した。
を使用して製造され、かつ約６．１質量％のＤ−パント
テン酸を含有するパントテン酸含有発酵ブロスから分離
した。このために、前記の発酵ブロス１ｌを例２に記載
したのと同様に遠心分離および限外濾過した。
【００５９】次いで前記のように処理したブロスを、回
転蒸発器のビューチ−ラボルテヒニック社のＲｏｔａｖ
ａｐｏｒ ＲＥ−１２０中で６０℃で真空下に、約５０
％の乾燥重量の液体含有率に濃縮した。次いで前記のよ
うに濃縮したブロスを凍結乾燥器のレイボルト社のＬＹ
ＯＶＡＣ ＧＴ２中で凍結乾燥し、Ｄ−パントテン酸の
アンモニウム塩を製造した。
転蒸発器のビューチ−ラボルテヒニック社のＲｏｔａｖ
ａｐｏｒ ＲＥ−１２０中で６０℃で真空下に、約５０
％の乾燥重量の液体含有率に濃縮した。次いで前記のよ
うに濃縮したブロスを凍結乾燥器のレイボルト社のＬＹ
ＯＶＡＣ ＧＴ２中で凍結乾燥し、Ｄ−パントテン酸の
アンモニウム塩を製造した。
【００６０】前記のように製造したＤ−パントテン酸ア
ンモニウムを含有する生成物はＤ−パントテン酸濃度６
６．８質量％を有しており、易流動性であった。
ンモニウムを含有する生成物はＤ−パントテン酸濃度６
６．８質量％を有しており、易流動性であった。
【００６１】例８ バイオマスを含有する発酵ブロスからのＤ−パントテン
酸カルシウムの製造 例１および例２に記載された方法を使用して製造され、
かつ約６．１質量％のＤ−パントテン酸を含有するパン
トテン酸含有発酵ブロスを回転蒸発器のビューチ−ラボ
ルテヒニック社（コンスタンツ、ドイツ）のＲｏｔａｖ
ａｐｏｒ ＲＥ−１２０中で６０℃で真空下に、１．０
ｌの容量を約３０質量％の乾燥質量の液体濃度に濃縮し
た。固体のＣａ（ＯＨ）2（９６％；メルク、ダルムシ
ュタット、ドイツ）１０．１ｇを撹拌しながらバッチ式
に添加した。ｐＨは約１０であった。前記のように処理
かつ濃縮されたバイオマス含有ブロスを噴霧乾燥して、
Ｄ−パントテン酸のカルシウム塩を製造した。このため
に、研究室用の噴霧乾燥器のビューチ−ラボルテヒニッ
ク社（コンスタンツ、ドイツ）のビューチ−１９０を、
入口温度１０７℃、出口温度８５℃、圧力差−４０ミリ
バールならびに空気の流速６００ＮＬ／ｈで使用した。
酸カルシウムの製造 例１および例２に記載された方法を使用して製造され、
かつ約６．１質量％のＤ−パントテン酸を含有するパン
トテン酸含有発酵ブロスを回転蒸発器のビューチ−ラボ
ルテヒニック社（コンスタンツ、ドイツ）のＲｏｔａｖ
ａｐｏｒ ＲＥ−１２０中で６０℃で真空下に、１．０
ｌの容量を約３０質量％の乾燥質量の液体濃度に濃縮し
た。固体のＣａ（ＯＨ）2（９６％；メルク、ダルムシ
ュタット、ドイツ）１０．１ｇを撹拌しながらバッチ式
に添加した。ｐＨは約１０であった。前記のように処理
かつ濃縮されたバイオマス含有ブロスを噴霧乾燥して、
Ｄ−パントテン酸のカルシウム塩を製造した。このため
に、研究室用の噴霧乾燥器のビューチ−ラボルテヒニッ
ク社（コンスタンツ、ドイツ）のビューチ−１９０を、
入口温度１０７℃、出口温度８５℃、圧力差−４０ミリ
バールならびに空気の流速６００ＮＬ／ｈで使用した。
【００６２】前記のように製造したＤ−パントテン酸カ
ルシウムを含有する生成物はＤ−パントテン酸濃度４
９．８質量％を有しており、易流動性であり、かつかさ
密度４８０ｍｇ／ｍｌであった。バイオマス含有率は約
３０質量％であった。
ルシウムを含有する生成物はＤ−パントテン酸濃度４
９．８質量％を有しており、易流動性であり、かつかさ
密度４８０ｍｇ／ｍｌであった。バイオマス含有率は約
３０質量％であった。
【００６３】例９ コリネバクテリウム グルタミクムからのＤ−パントテ
ン酸カルシウムおよびバイオマスを含有する生成物の製
造 １．コリネバクテリウム グルタミクムのパントテン酸
産生株の製造 特許ＵＳ−Ａ−５１８８９４８号はＬ−バリン産生株ブ
レビバクテリウム ラクトフェルメンツムＦＥＲＭ ＢＰ
−１７６３を記載している。ＤＥ１９８５５３１３．７
号は、コリネバクテリウム グルタミクムからの遺伝子
ｐａｎＢ、ｐａｎＣおよびｐａｎＤを有するプラスミド
ｐＮＤ−ＤＢＣ２（図２）を開示している。該プラスミ
ドは微生物および細胞培養のためのドイツ微生物保存機
関（German collection of microorganisms and cell c
ultures）（ブラウンシュバイク、ドイツ）でＤＳＭ１
２４３７として、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−ＤＢＣ
２株の形で寄託されている。パントテン酸産生株ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１７６３／ｐＮＤ−ＤＢＣ２はＦＥＲＭ ＢＰ
−１７６３株をプラスミドｐＮＤ−ＤＢＣ２で形質転換
することによって得ることができる。
ン酸カルシウムおよびバイオマスを含有する生成物の製
造 １．コリネバクテリウム グルタミクムのパントテン酸
産生株の製造 特許ＵＳ−Ａ−５１８８９４８号はＬ−バリン産生株ブ
レビバクテリウム ラクトフェルメンツムＦＥＲＭ ＢＰ
−１７６３を記載している。ＤＥ１９８５５３１３．７
号は、コリネバクテリウム グルタミクムからの遺伝子
ｐａｎＢ、ｐａｎＣおよびｐａｎＤを有するプラスミド
ｐＮＤ−ＤＢＣ２（図２）を開示している。該プラスミ
ドは微生物および細胞培養のためのドイツ微生物保存機
関（German collection of microorganisms and cell c
ultures）（ブラウンシュバイク、ドイツ）でＤＳＭ１
２４３７として、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−ＤＢＣ
２株の形で寄託されている。パントテン酸産生株ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１７６３／ｐＮＤ−ＤＢＣ２はＦＥＲＭ ＢＰ
−１７６３株をプラスミドｐＮＤ−ＤＢＣ２で形質転換
することによって得ることができる。
【００６４】２．パントテン酸を含有する発酵ブロスの
製造 ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツムＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１７６３／ｐＮＤ−ＤＢＣ２の試料をＨＨＫアガー
上に塗布した。
製造 ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツムＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１７６３／ｐＮＤ−ＤＢＣ２の試料をＨＨＫアガー
上に塗布した。
【００６５】ＨＨＫアガーは、メルクＫｇａＡ（ダルム
シュタット、ドイツ）で市販されている脳／心臓アガー
（brain/heart agar）を含有し、かつカナマイシンを補
っている。ＨＨＫアガーの組成は第８ａ表に記載した。
シュタット、ドイツ）で市販されている脳／心臓アガー
（brain/heart agar）を含有し、かつカナマイシンを補
っている。ＨＨＫアガーの組成は第８ａ表に記載した。
【００６６】前記のアガープレート培養を３７℃で１７
時間インキュベートし、次いで＋４℃の冷蔵庫中で保存
した。個々の選択されたコロニーを、同一の培地で更に
増殖させた。次いでクローンからの細胞材料をＨＨＫア
ガーから採取し、白金耳を使用して、全容量１０００ｍ
ｌの振盪フラスコ中に入れてあるＨＨＫブロス１００ｍ
ｌに移した。
時間インキュベートし、次いで＋４℃の冷蔵庫中で保存
した。個々の選択されたコロニーを、同一の培地で更に
増殖させた。次いでクローンからの細胞材料をＨＨＫア
ガーから採取し、白金耳を使用して、全容量１０００ｍ
ｌの振盪フラスコ中に入れてあるＨＨＫブロス１００ｍ
ｌに移した。
【００６７】ＨＨＫブロスは、メルクＫｇａＡ（ダルム
シュタット、ドイツ）で市販されている脳／心臓培地
（brain/heart medium）を含有し、かつカナマイシンを
補っている。ＨＨＫブロスの組成は第８ｂ表に記載し
た。
シュタット、ドイツ）で市販されている脳／心臓培地
（brain/heart medium）を含有し、かつカナマイシンを
補っている。ＨＨＫブロスの組成は第８ｂ表に記載し
た。
【００６８】第８ａ表：ＨＨＫアガー
【００６９】
【表１】
【００７０】第８ｂ表：ＨＨＫブロス
【００７１】
【表２】
【００７２】混合物を３０℃および１５０ｒｐｍで２２
時間インキュベートした。培養プロセスの完了後に、
６．１の光学密度が波長６６０ｎｍ（ＯＤ６６０）でフ
ォトメーターにおいて測定された。ＦＥＲＭ ＢＰ−１
７６３／ｐＮＤ−ＤＢＣ２株の培養を使用して、製造発
酵槽に接種した。
時間インキュベートした。培養プロセスの完了後に、
６．１の光学密度が波長６６０ｎｍ（ＯＤ６６０）でフ
ォトメーターにおいて測定された。ＦＥＲＭ ＢＰ−１
７６３／ｐＮＤ−ＤＢＣ２株の培養を使用して、製造発
酵槽に接種した。
【００７３】第８ｃ表に挙げたＳＫ−７１培地を発酵の
ために使用した。ＳＫ−７１培地中の全ての成分を作業
濃度に従って発酵槽中に直接導入し、その場で滅菌し
た。
ために使用した。ＳＫ−７１培地中の全ての成分を作業
濃度に従って発酵槽中に直接導入し、その場で滅菌し
た。
【００７４】第８ｃ表：ＳＫ−７１培地
【００７５】
【表３】
【００７６】Ｂ．ブラウン社（B. Braun Co）の１０ｌ
撹拌反応器（ＢＢＩ、ドイツ、メルズンゲン、モデルＢ
ｉｏｓｔａｔ Ｅ／ＥＤ）を発酵槽として使用した。
撹拌反応器（ＢＢＩ、ドイツ、メルズンゲン、モデルＢ
ｉｏｓｔａｔ Ｅ／ＥＤ）を発酵槽として使用した。
【００７７】前記のＨＨＫブロス中の撹拌フラスコ前培
養１００ｍｌを使用して、ＳＫ−７１発酵培地１９５０
ｇに接種した。
養１００ｍｌを使用して、ＳＫ−７１発酵培地１９５０
ｇに接種した。
【００７８】混合物を、全発酵時間にわたり温度３０
℃、容量固有の通気速度（volume-specific rate of ae
ration）０．７５ｖｖｍ、撹拌速度８００〜１７００ｒ
ｐｍで培養するが、これらは酸素の消費および７．０の
ｐＨおよび空気飽和２０％の酸素分圧に依存する。該培
養を、ＯＤ６６０が２６．２に達するまで前記の条件下
で全体で４９時間培養した。
℃、容量固有の通気速度（volume-specific rate of ae
ration）０．７５ｖｖｍ、撹拌速度８００〜１７００ｒ
ｐｍで培養するが、これらは酸素の消費および７．０の
ｐＨおよび空気飽和２０％の酸素分圧に依存する。該培
養を、ＯＤ６６０が２６．２に達するまで前記の条件下
で全体で４９時間培養した。
【００７９】アンモニア水溶液（２５％ｗ／ｖ）を補正
媒体（correction medium）として使用してｐＨを調整
した。
媒体（correction medium）として使用してｐＨを調整
した。
【００８０】次いで光学密度（ＯＤ）をＤｒ．ブルーノ
ランゲ社（Dr. Bruno Lange GmbHCo）（ベルリン、ド
イツ）のＬＰ１Ｗ型のデジタルフォトメーターを使用し
て、測定波長６６０ｎｍで測定し、かつＤ−パントテン
酸の濃度はＨＰＬＣ（Hypersil APS2 ５μｍ、２５０×
５ｍｍ、ＲＩ検出）を使用して測定した。
ランゲ社（Dr. Bruno Lange GmbHCo）（ベルリン、ド
イツ）のＬＰ１Ｗ型のデジタルフォトメーターを使用し
て、測定波長６６０ｎｍで測定し、かつＤ−パントテン
酸の濃度はＨＰＬＣ（Hypersil APS2 ５μｍ、２５０×
５ｍｍ、ＲＩ検出）を使用して測定した。
【００８１】約０．２ｇ／ｌのパントテン酸濃度は４９
時間後の最終発酵試料中で測定された。
時間後の最終発酵試料中で測定された。
【００８２】３．パントテン酸含有生成物の製造 約０．０２質量％の濃度を有するＤ−パントテン酸含有
発酵ブロスを、例９．２の方法を使用して製造した。該
発酵ブロスの容量１．４ｌをまず、約１５％の乾燥固体
含有率を有するブロスに、回転蒸発器のビューチ−ラボ
ルテヒニック社（コンスタンツ、ドイツ）のＲｏｔａｖ
ａｐｏｒ ＲＥ−１２０中で６０℃で真空下に蒸発させ
た。次いで２７．１ｇの固体のＣａ（ＯＨ）2（９６
％；メルク、ダルムシュタット、ドイツ）を撹拌しなが
ら１回で添加した。ｐＨは約１０．０であった。Ｄ−パ
ントテン酸カルシウム３７．７ｇ（＞９８％、Euro OTC
Pharma GmbH, Kamen, Germany）を、前記のように処理
かつ濃縮されたバイオマス含有ブロスに添加した。研究
室用の噴霧乾燥器のビューチ−ラボルテヒニック社（コ
ンスタンツ、ドイツ）のビューチ−１９０を、インプッ
ト温度１０７℃、流出物温度８５℃、圧力差−４０ミリ
バールならびに空気の流速６００Ｎｌ／ｈで最終噴霧乾
燥手順のために使用した。
発酵ブロスを、例９．２の方法を使用して製造した。該
発酵ブロスの容量１．４ｌをまず、約１５％の乾燥固体
含有率を有するブロスに、回転蒸発器のビューチ−ラボ
ルテヒニック社（コンスタンツ、ドイツ）のＲｏｔａｖ
ａｐｏｒ ＲＥ−１２０中で６０℃で真空下に蒸発させ
た。次いで２７．１ｇの固体のＣａ（ＯＨ）2（９６
％；メルク、ダルムシュタット、ドイツ）を撹拌しなが
ら１回で添加した。ｐＨは約１０．０であった。Ｄ−パ
ントテン酸カルシウム３７．７ｇ（＞９８％、Euro OTC
Pharma GmbH, Kamen, Germany）を、前記のように処理
かつ濃縮されたバイオマス含有ブロスに添加した。研究
室用の噴霧乾燥器のビューチ−ラボルテヒニック社（コ
ンスタンツ、ドイツ）のビューチ−１９０を、インプッ
ト温度１０７℃、流出物温度８５℃、圧力差−４０ミリ
バールならびに空気の流速６００Ｎｌ／ｈで最終噴霧乾
燥手順のために使用した。
【００８３】前記のように製造したＤ−パントテン酸カ
ルシウム含有生成物は約３５％のＤ−パントテン酸濃度
を有しており、注入可能であり、かつかさ密度６００ｍ
ｇ／ｍｌを有していた。Ｃ．グルタミクム−バイオマス
の比率は約３．５質量％であった。
ルシウム含有生成物は約３５％のＤ−パントテン酸濃度
を有しており、注入可能であり、かつかさ密度６００ｍ
ｇ／ｍｌを有していた。Ｃ．グルタミクム−バイオマス
の比率は約３．５質量％であった。
【００８４】例１０ サッカロマイセス セレビシエからのＤ−パントテン酸
カルシウムおよびバイオマスを含有する生成物の製造 １．サッカロマイセス セレビシエのパントテン酸産生
株の製造 読み枠ＹＨＲ０６３ｃの増幅：サッカロマイセス セレ
ビシエの読み枠ＹＨＲ０６３ｃ（国立生物工学センター
（the National Center for Biotechnology）、ベテス
ダ、ＭＤ、ＵＳＡにおける受け入れ番号Ｕ０００６１）
のためのヌクレオチド配列から出発して、以下のＰＣＲ
プライマーを合成した（MWG-Biotech, Ebersberg, Germ
any）。読み枠の開始および終止はピリオド（．）で表
した。
カルシウムおよびバイオマスを含有する生成物の製造 １．サッカロマイセス セレビシエのパントテン酸産生
株の製造 読み枠ＹＨＲ０６３ｃの増幅：サッカロマイセス セレ
ビシエの読み枠ＹＨＲ０６３ｃ（国立生物工学センター
（the National Center for Biotechnology）、ベテス
ダ、ＭＤ、ＵＳＡにおける受け入れ番号Ｕ０００６１）
のためのヌクレオチド配列から出発して、以下のＰＣＲ
プライマーを合成した（MWG-Biotech, Ebersberg, Germ
any）。読み枠の開始および終止はピリオド（．）で表
した。
【００８５】・ｏＪＤ５３９（５’ＥｃｏＲＩ−Ｎｏｔ
Ｉ開始）： ５’−ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣ
ＧＣＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴ．ＡＴＧＡ
ＣＴＧＣＡＣＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧ−３’ ・ｏＪＤ５４０（３’ＳｐｅＩ−ＰｓｔＩ終止）： ５’−ＣＧＣＧＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＡＧ．ＴＣＡＧＴ
ＣＣＴＴＴＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣ−３’ Ｃ．グスリーおよびＧ．Ｒ．フィンク（C. Guthrie and
G. R. Fink）の方法（酵母遺伝学および分子生物学へ
の誘い（Guide to yeast genetics and molecular biol
ogy）、酵素学における方法、Ｖｏｌ．１９４，アカデ
ミックプレス、サンディエゴ、ＣＡ、１９９１）を使用
して単離されたＳ．セレビシエＪＤ２４２株からのゲノ
ムＤＮＡを鋳型として使用した。前記の株は、ゲノムが
配列決定されている（ゴフォ他（Goffeau et al）., Sc
ience 274, pp. 546, (1996)）二倍体株ＳＣ２８８Ｃ
（ウィンストン他（Winston et al）., Yeast 11, 53f
f. (1995)）の一倍体の分離体（segregant）である。四
分子分析を、Ｃ．グスリーおよびＧ．Ｒ．フィンクの方
法（酵母遺伝学および分子生物学への誘い、酵素学にお
ける方法、Ｖｏｌ．１９４，アカデミックプレス、サン
ディエゴ、ＣＡ、１９９１）によって実施した。株ＪＤ
２４２はロイシンに関して栄養要求（ｌｅｕ２Δ１対立
遺伝子）およびウラシルに関して栄養要求（ｕｒａ３−
５２対立遺伝子）である。約１．２ｋＢのサイズのＤＮ
Ａ断片を、ロッヒェ社（Roche Co）（マンハイム）の
“High Fidelity Expand Polymerase”キットを使用し
て、製造者が示す条件下で２８ＰＣＲサイクルで増幅さ
せた。サイズを０．８％濃度のアガロースゲル中での塩
基泳動による分離で決定した。
Ｉ開始）： ５’−ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣ
ＧＣＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴ．ＡＴＧＡ
ＣＴＧＣＡＣＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧ−３’ ・ｏＪＤ５４０（３’ＳｐｅＩ−ＰｓｔＩ終止）： ５’−ＣＧＣＧＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＡＧ．ＴＣＡＧＴ
ＣＣＴＴＴＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣ−３’ Ｃ．グスリーおよびＧ．Ｒ．フィンク（C. Guthrie and
G. R. Fink）の方法（酵母遺伝学および分子生物学へ
の誘い（Guide to yeast genetics and molecular biol
ogy）、酵素学における方法、Ｖｏｌ．１９４，アカデ
ミックプレス、サンディエゴ、ＣＡ、１９９１）を使用
して単離されたＳ．セレビシエＪＤ２４２株からのゲノ
ムＤＮＡを鋳型として使用した。前記の株は、ゲノムが
配列決定されている（ゴフォ他（Goffeau et al）., Sc
ience 274, pp. 546, (1996)）二倍体株ＳＣ２８８Ｃ
（ウィンストン他（Winston et al）., Yeast 11, 53f
f. (1995)）の一倍体の分離体（segregant）である。四
分子分析を、Ｃ．グスリーおよびＧ．Ｒ．フィンクの方
法（酵母遺伝学および分子生物学への誘い、酵素学にお
ける方法、Ｖｏｌ．１９４，アカデミックプレス、サン
ディエゴ、ＣＡ、１９９１）によって実施した。株ＪＤ
２４２はロイシンに関して栄養要求（ｌｅｕ２Δ１対立
遺伝子）およびウラシルに関して栄養要求（ｕｒａ３−
５２対立遺伝子）である。約１．２ｋＢのサイズのＤＮ
Ａ断片を、ロッヒェ社（Roche Co）（マンハイム）の
“High Fidelity Expand Polymerase”キットを使用し
て、製造者が示す条件下で２８ＰＣＲサイクルで増幅さ
せた。サイズを０．８％濃度のアガロースゲル中での塩
基泳動による分離で決定した。
【００８６】ｐＪＤ−ＹＨＲ０６３ｃの構造：Ｓ．セレ
ビシエ中でＹＨＲ０６３ｃ読み枠を発現させるために、
ＰＣＲ増幅物をＥ．コリ−Ｓ．セレビシエのシャトルベ
クターｐＪＤＣＥＸ２（図２およびドーメン他（Dohmen
et al）., 1995, Journal of Biological Chemistry 2
70, 18099-18109）中に組み込んだ。
ビシエ中でＹＨＲ０６３ｃ読み枠を発現させるために、
ＰＣＲ増幅物をＥ．コリ−Ｓ．セレビシエのシャトルベ
クターｐＪＤＣＥＸ２（図２およびドーメン他（Dohmen
et al）., 1995, Journal of Biological Chemistry 2
70, 18099-18109）中に組み込んだ。
【００８７】まずＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＳｐｅ
Ｉ（ＡＧＳ、ハイデルベルク、ドイツ）によって制限消
化した。次いでこれを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ（Ａ
ＧＳ、ハイデルベルク、ドイツ）で処理したｐＪＤＣＥ
Ｘ２−ＤＮＡと混合し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（ロッヒ
ェ、マンハイム、ドイツ）を使用してライゲーションし
た。ライゲーション混合物を、Ｅ．コリＸＬ１−Ｂｌｕ
ｅ株（ブロック他（Bullock et al）., 1987. Biotechn
iques 5, 376）に形質転換した。形質転換体を、アンピ
シリン（シグマ、ダイゼンホフェン、ドイツ）１５０μ
ｇ／ｍｌを含有するＬＢアガー上での選択によって得
た。アンピシリン耐性クローンからのプラスミドＤＮＡ
をアルカリ性細胞溶解（サンブローク他（Sambrook et
al）.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Col
d Spring Harbor Laboratory Press, 1989）によって調
製した。次いで単離したプラスミドＤＮＡをＮｏｔＩお
よびＰｓｔＩを使用する制限消化によって試験し、引き
続き０．８％濃度のアガロースゲル中で分離した。所望
の構造を有するプラスミドをｐＪＤ−ＹＨＲ０６３ｃ
（図３）と名付けた。
Ｉ（ＡＧＳ、ハイデルベルク、ドイツ）によって制限消
化した。次いでこれを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ（Ａ
ＧＳ、ハイデルベルク、ドイツ）で処理したｐＪＤＣＥ
Ｘ２−ＤＮＡと混合し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（ロッヒ
ェ、マンハイム、ドイツ）を使用してライゲーションし
た。ライゲーション混合物を、Ｅ．コリＸＬ１−Ｂｌｕ
ｅ株（ブロック他（Bullock et al）., 1987. Biotechn
iques 5, 376）に形質転換した。形質転換体を、アンピ
シリン（シグマ、ダイゼンホフェン、ドイツ）１５０μ
ｇ／ｍｌを含有するＬＢアガー上での選択によって得
た。アンピシリン耐性クローンからのプラスミドＤＮＡ
をアルカリ性細胞溶解（サンブローク他（Sambrook et
al）.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Col
d Spring Harbor Laboratory Press, 1989）によって調
製した。次いで単離したプラスミドＤＮＡをＮｏｔＩお
よびＰｓｔＩを使用する制限消化によって試験し、引き
続き０．８％濃度のアガロースゲル中で分離した。所望
の構造を有するプラスミドをｐＪＤ−ＹＨＲ０６３ｃ
（図３）と名付けた。
【００８８】株ＪＤ２４２／ｐＪＤ−ＹＨＲ０６３ｃの
製造：Ｓ．セレビシエＪＤ２４２株をドーメン他の方法
（Dohmen et al., Yeast 7,691(1991)）を使用してプラ
スミドｐＪＤ−ＹＨＲ０６３ｃで形質転換した。形質転
換体の選択を、１．８％のアガーを使用するロイシン不
含の最少培地ＳＤ上で実施した（第９ａ表および第９ｂ
表参照）。
製造：Ｓ．セレビシエＪＤ２４２株をドーメン他の方法
（Dohmen et al., Yeast 7,691(1991)）を使用してプラ
スミドｐＪＤ−ＹＨＲ０６３ｃで形質転換した。形質転
換体の選択を、１．８％のアガーを使用するロイシン不
含の最少培地ＳＤ上で実施した（第９ａ表および第９ｂ
表参照）。
【００８９】第９ａ表：最少培地ＳＤ
【００９０】
【表４】
【００９１】第９ｂ表：最少培地ＳＤ
【００９２】
【表５】
【００９３】２．パントテン酸を含有する発酵ブロスの
製造 Ｄ−パントテン酸を含有する発酵ブロスを製造するため
に、Ｓ．セレビシエＪＤ２４２／ｐＪＤ−ＹＨＲ０６３
ｃ株の個々のコロニーをまず最少培地ＳＤを有するアガ
ープレート上に塗布し、３０℃で３日間インキュベート
した。振盪フラスコ中で前記の第１の前培養を製造する
ために、細胞を最少培地ＳＤ５ｍｌで浮遊させた。次い
で最少培地ＳＤ（第９ａ表および第９ｂ表）５０ｍｌを
含有する各振盪フラスコ（全容量５００ｍｌ）に前記の
細胞懸濁液２．５ｍｌを接種し、インフォルス社（Bott
mingen, スイス）のＲＣ−１−ＴＫインキュベーター上
で３０℃および１３０ｒｐｍで、波長６６０ｎｍでの光
学密度（ＯＤ６６０）１．９が測定できるまで６時間培
養した。第２の前培養を、１０００ｍｌのバッフルフラ
スコ（baffle-flask）において最少培地ＳＤ１５０ｍｌ
（第９ａ表および第９ｂ表）中で製造し、かつそれぞれ
に５０ｍｌの前記の前培養１を接種した。インキュベー
ションを、波長６６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ６６０）
約３．８が達成されるまで３０℃および８０ｒｐｍで２
０時間実施した。パントテン酸を製造するための本発酵
を全容量６０００ｍｌを有する丸底フラスコ中で最少培
地ＳＤ（第９ａ表および第９ｂ表）１５００ｍｌにおい
て実施した。この目的のために、丸底フラスコにそれぞ
れ、９０ｍｌの前培養２を接種し、かつ３０℃および６
０ｒｐｍで３０時間インキュベートした。
製造 Ｄ−パントテン酸を含有する発酵ブロスを製造するため
に、Ｓ．セレビシエＪＤ２４２／ｐＪＤ−ＹＨＲ０６３
ｃ株の個々のコロニーをまず最少培地ＳＤを有するアガ
ープレート上に塗布し、３０℃で３日間インキュベート
した。振盪フラスコ中で前記の第１の前培養を製造する
ために、細胞を最少培地ＳＤ５ｍｌで浮遊させた。次い
で最少培地ＳＤ（第９ａ表および第９ｂ表）５０ｍｌを
含有する各振盪フラスコ（全容量５００ｍｌ）に前記の
細胞懸濁液２．５ｍｌを接種し、インフォルス社（Bott
mingen, スイス）のＲＣ−１−ＴＫインキュベーター上
で３０℃および１３０ｒｐｍで、波長６６０ｎｍでの光
学密度（ＯＤ６６０）１．９が測定できるまで６時間培
養した。第２の前培養を、１０００ｍｌのバッフルフラ
スコ（baffle-flask）において最少培地ＳＤ１５０ｍｌ
（第９ａ表および第９ｂ表）中で製造し、かつそれぞれ
に５０ｍｌの前記の前培養１を接種した。インキュベー
ションを、波長６６０ｎｍでの光学密度（ＯＤ６６０）
約３．８が達成されるまで３０℃および８０ｒｐｍで２
０時間実施した。パントテン酸を製造するための本発酵
を全容量６０００ｍｌを有する丸底フラスコ中で最少培
地ＳＤ（第９ａ表および第９ｂ表）１５００ｍｌにおい
て実施した。この目的のために、丸底フラスコにそれぞ
れ、９０ｍｌの前培養２を接種し、かつ３０℃および６
０ｒｐｍで３０時間インキュベートした。
【００９４】光学密度（ＯＤ）をＤｒ．ブルーノランゲ
社（ベルリン、ドイツ）のＬＰ１Ｗ型のデジタルフォト
メーターを使用して測定波長６６０ｎｍで測定した。得
られたパントテン酸濃度は、ＤＩＦＣＯ（ミシガン、Ｕ
ＳＡ；１０版、１１００−１１０２（１９８４））から
のマニュアル“ＤＩＦＣＯ ＭＡＮＵＡＬ”におけるデ
ータに従って、ラクトバシラス プランタルムＡＴＣＣ
(R)８０１４株（strainLactobacillus plantarum ATCC
(R) 8014）を使用して測定した。
社（ベルリン、ドイツ）のＬＰ１Ｗ型のデジタルフォト
メーターを使用して測定波長６６０ｎｍで測定した。得
られたパントテン酸濃度は、ＤＩＦＣＯ（ミシガン、Ｕ
ＳＡ；１０版、１１００−１１０２（１９８４））から
のマニュアル“ＤＩＦＣＯ ＭＡＮＵＡＬ”におけるデ
ータに従って、ラクトバシラス プランタルムＡＴＣＣ
(R)８０１４株（strainLactobacillus plantarum ATCC
(R) 8014）を使用して測定した。
【００９５】光学密度（ＯＤ６６０）は約４であり、Ｄ
−パントテン酸の濃度は約１ｍｇ／ｌであった。
−パントテン酸の濃度は約１ｍｇ／ｌであった。
【００９６】３．パントテン酸を含有する生成物の製造 Ｄ−パントテン酸濃度約１ｍｇ／ｌを有するパントテン
酸を含有する発酵ブロスを、例１０．２の方法を使用し
て製造した。まず容量６．０ｌを、１６％の乾燥固体含
有率を有するブロスが得られるように、ビューチ−ラボ
ルテヒニック社（コンスタンツ、ドイツ）のＲｏｔａｖ
ａｐｏｒ ＲＥ−１５１の回転蒸発器中で６０℃で真空
下に蒸発させた。次いで固体のＣａ（ＯＨ）2（９６
％；メルク、ダルムシュタット、ドイツ）１５．９ｇを
撹拌しながら１回で添加した。ｐＨは約９．２であっ
た。次いでＤ−パントテン酸カルシウム（＞９８％、Eu
ro OTCPharma GmbH, Kamen, Germany）２８．４ｇを、
前記のように処理かつ蒸発させたバイオマスを含有する
ブロスに添加した。次いで該ブロスをレイボルト社（Co
logne, ドイツ）のＬＹＯＶＡＣ ＧＴ２型の凍結乾燥器
中で凍結乾燥させた。
酸を含有する発酵ブロスを、例１０．２の方法を使用し
て製造した。まず容量６．０ｌを、１６％の乾燥固体含
有率を有するブロスが得られるように、ビューチ−ラボ
ルテヒニック社（コンスタンツ、ドイツ）のＲｏｔａｖ
ａｐｏｒ ＲＥ−１５１の回転蒸発器中で６０℃で真空
下に蒸発させた。次いで固体のＣａ（ＯＨ）2（９６
％；メルク、ダルムシュタット、ドイツ）１５．９ｇを
撹拌しながら１回で添加した。ｐＨは約９．２であっ
た。次いでＤ−パントテン酸カルシウム（＞９８％、Eu
ro OTCPharma GmbH, Kamen, Germany）２８．４ｇを、
前記のように処理かつ蒸発させたバイオマスを含有する
ブロスに添加した。次いで該ブロスをレイボルト社（Co
logne, ドイツ）のＬＹＯＶＡＣ ＧＴ２型の凍結乾燥器
中で凍結乾燥させた。
【００９７】前記のように製造されたＤ−パントテン酸
カルシウムを含有する生成物はＤ−パントテン酸濃度２
６．５質量％を有しており、注入可能であり、かつかさ
密度４５０ｍｇ／ｍｌを有していた。Ｓ．セレビシエの
バイオマスの比率は約６．８質量％であった。
カルシウムを含有する生成物はＤ−パントテン酸濃度２
６．５質量％を有しており、注入可能であり、かつかさ
密度４５０ｍｇ／ｍｌを有していた。Ｓ．セレビシエの
バイオマスの比率は約６．８質量％であった。
【図１】プラスミドｐＮＤ−ＤＢＣ２の図である。
【図２】プラスミドｐＪＤＣＥＸ２の図である。
【図３】プラスミドｐＪＤ−ＹＨＲ０６３ｃの図であ
る。
る。
ｒｒｎＢＴ１Ｔ２ ｒｒｎＢ遺伝子の転写ターミネータ
ー、 Ｐｔａｃ ｔａｃプロモーター、 ｐａｎＢ ｐ
ａｎＢ遺伝子のコード領域、 ｐａｎＣ ｐａｎＣ遺伝
子のコード領域、 ｐａｎＤ ｐａｎＤ遺伝子のコード
領域、 ｒｅｐ−Ｃ．ｇ． Ｃ．グルタミクム中の複製
のためのＤＮＡ領域、 ｏｒｉＶ−Ｅ．ｃ． Ｅ．コリ
における増殖継代（vegetative transfer）の起点、
ｋａｎカナマイシンのための耐性遺伝子、 ＢｇｌＩＩ
制限酵素ＢｇｌＩＩの開裂部位、 ＣｌａＩ 制限酵
素ＣｌａＩの開裂部位、 ＮｃｏＩ 制限酵素ＮｃｏＩ
の開裂部位、 ＮｒｕＩ 制限酵素ＮｒｕＩの開裂部
位、 ＰｖｕＩ 制限酵素ＰｖｕＩの開裂部位、 Ｓａ
ｃＩ 制限酵素ＳａｃＩの開裂部位、 ＳａｌＩ制限酵
素ＳａｌＩの開裂部位、 ＳｃａＩ 制限酵素ＳｃａＩ
の開裂部位、 ＳｐｈＩ 制限酵素ＳｐｈＩの開裂部
位、 ＸｈｏＩ 制限酵素ＸｈｏＩの開裂部位、 ＬＥ
Ｕ２ サッカロマイセス セレビシエのβ−イソプロピ
ルマレートデヒドロゲナーゼ遺伝子、 ２μ サッカロ
マイセス セレビシエの内因性の２μプラスミドの配
列、 ＡｐR β−ラクタマーゼ遺伝子、 Ｐ−ＣＵＰ
１ サッカロマイセス セレビシエのＣＵＰ１遺伝子
（メタロチオネイン）のプロモーター、 Ｔ−ＣＹＣ１
サッカロマイセス セレビシエのＣＹＣ１遺伝子（チ
トクロームＣ）のターミネーター、 ＳＤ シャインダ
ルガーノ配列、 ＥｃｏＲＩ制限酵素ＥｃｏＲＩの開裂
部位、 ＮｏｔＩ 制限酵素ＮｏｔＩの開裂部位、Ｓｐ
ｅＩ 制限酵素ＳｐｅＩの開裂部位、 ＸｂａＩ 制限
酵素ＸｂａＩの開裂部位
ー、 Ｐｔａｃ ｔａｃプロモーター、 ｐａｎＢ ｐ
ａｎＢ遺伝子のコード領域、 ｐａｎＣ ｐａｎＣ遺伝
子のコード領域、 ｐａｎＤ ｐａｎＤ遺伝子のコード
領域、 ｒｅｐ−Ｃ．ｇ． Ｃ．グルタミクム中の複製
のためのＤＮＡ領域、 ｏｒｉＶ−Ｅ．ｃ． Ｅ．コリ
における増殖継代（vegetative transfer）の起点、
ｋａｎカナマイシンのための耐性遺伝子、 ＢｇｌＩＩ
制限酵素ＢｇｌＩＩの開裂部位、 ＣｌａＩ 制限酵
素ＣｌａＩの開裂部位、 ＮｃｏＩ 制限酵素ＮｃｏＩ
の開裂部位、 ＮｒｕＩ 制限酵素ＮｒｕＩの開裂部
位、 ＰｖｕＩ 制限酵素ＰｖｕＩの開裂部位、 Ｓａ
ｃＩ 制限酵素ＳａｃＩの開裂部位、 ＳａｌＩ制限酵
素ＳａｌＩの開裂部位、 ＳｃａＩ 制限酵素ＳｃａＩ
の開裂部位、 ＳｐｈＩ 制限酵素ＳｐｈＩの開裂部
位、 ＸｈｏＩ 制限酵素ＸｈｏＩの開裂部位、 ＬＥ
Ｕ２ サッカロマイセス セレビシエのβ−イソプロピ
ルマレートデヒドロゲナーゼ遺伝子、 ２μ サッカロ
マイセス セレビシエの内因性の２μプラスミドの配
列、 ＡｐR β−ラクタマーゼ遺伝子、 Ｐ−ＣＵＰ
１ サッカロマイセス セレビシエのＣＵＰ１遺伝子
（メタロチオネイン）のプロモーター、 Ｔ−ＣＹＣ１
サッカロマイセス セレビシエのＣＹＣ１遺伝子（チ
トクロームＣ）のターミネーター、 ＳＤ シャインダ
ルガーノ配列、 ＥｃｏＲＩ制限酵素ＥｃｏＲＩの開裂
部位、 ＮｏｔＩ 制限酵素ＮｏｔＩの開裂部位、Ｓｐ
ｅＩ 制限酵素ＳｐｅＩの開裂部位、 ＸｂａＩ 制限
酵素ＸｂａＩの開裂部位
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クラウス−エーリッヒ ウッフマン ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト ラッ ポルトシュトラーセ 73 (72)発明者 イロナ ヴァルガー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト バル ラッハシュトラーセ ７ (72)発明者 ウルリヒ ベッカー スロバキア国 セルツェ プリーコッド 318 (72)発明者 ヴァルター フェッファーレ ドイツ連邦共和国 ハレ ヤーンシュトラ ーセ 33 (72)発明者 ハインツ フリードリヒ ドイツ連邦共和国 ハーナウ グリューナ ウシュトラーセ ４
Claims (14)
- 【請求項１】 Ｄ−パントテン酸および／またはその塩
を含有し、かつ発酵ブロスをベースとする動物飼料添加
剤において、 ａ）Ｄ−パントテン酸および／またはその塩、 ｂ）Ｄ−パントテン酸を産生する微生物の発酵中に形成
されるバイオマス０〜１００％、 ｃ）少なくとも発酵ブロスの他の成分の大部分を含有
し、かつ ｄ）固体、微細または粒状の、易流動性の形で存在する
ことを特徴とする動物飼料添加剤。 - 【請求項２】 Ｄ−パントテン酸のナトリウム塩、カリ
ウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩またはカルシ
ウム塩の群から選択する１種以上の塩を含有する、請求
項１記載の動物飼料添加剤。 - 【請求項３】 Ｄ−パントテン酸および／またはその塩
の１種を＞０質量％（乾燥重量）の量で含有する、請求
項１または２記載の動物飼料添加剤。 - 【請求項４】 噴霧乾燥された形または噴霧造粒された
形で存在する、請求項１記載の動物飼料添加剤。 - 【請求項５】 またＬ−メチオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−
バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−トレオニンまたはＬ−トリ
プトファンの群から選択したＬ−アミノ酸の１種以上を
含有する、請求項１から４までのいずれか１項記載の動
物飼料添加剤。 - 【請求項６】 請求項１から５までのいずれか１項記載
のＤ−パントテン酸および／またはその塩を含有する飼
料添加剤を発酵ブロスから製造する方法において、 ａ）バイオマスおよび／または他の幾つかの成分を完全
または部分的に、Ｄ−パントテン酸および／またはその
塩を含有する発酵ブロスから分離してよく、 ｂ）アルカリ土類金属またはアルカリ金属の水酸化物ま
たは酸化物を前記のように得られた溶液またはブロスに
添加し、かつ ｃ）前記のように得られた混合物を乾燥または噴霧乾
燥、噴霧造粒または造粒する、動物飼料添加剤の製造方
法。 - 【請求項７】 ナトリウム、カリウム、アンモニウム、
マグネシウムまたはカルシウム化合物の群から選択した
酸化物または水酸化物をＤ−パントテン酸に対して化学
量論比０．８〜１．２で添加する、請求項６記載の方
法。 - 【請求項８】 Ｄ−パントテン酸および／またはそのナ
トリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウ
ム塩またはカルシウム塩を含有する、請求項１から５ま
でのいずれか１項記載の飼料添加剤を製造するための方
法において、 ａ）バイオマスおよび／または幾つかの成分を完全また
は部分的に、所望のヒドロキシル化合物を使用して得ら
れたＤ−パントテン酸塩を含有する発酵ブロスから分離
してよく、 ｂ）前記のように得られた混合物を濃縮し、かつ ｃ）相応のパントテン酸塩を含有する飼料添加剤を、乾
燥、噴霧乾燥または噴霧造粒によって固体形で得る、動
物飼料添加剤の製造方法。 - 【請求項９】 Ｄ−パントテン酸および／またはそのナ
トリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウ
ム塩またはカルシウム塩の濃度を約２０〜８０質量％
（乾燥重量）の範囲で有する動物飼料添加剤を発酵ブロ
スから製造するための方法において、 ａ）有利には発酵ブロスから水を除去し（濃縮工程）、 ｂ）発酵の間に形成したバイオマス０〜１００％を除去
してよく、 ｃ）前記の化合物の１種以上をａ）およびｂ）に従って
得られた発酵ブロスに添加し、その際、添加された化合
物の質量を、動物飼料添加剤におけるその全濃度が約２
０〜８０質量％の範囲であるようにし、 ｄ）ｃ）に従って得られた発酵ブロスを乾燥させて、所
望の粉末形または粒状形で得る、動物飼料添加剤の製造
方法。 - 【請求項１０】 前記のアルカリ金属またはアルカリ土
類金属の酸化物または水酸化物を、濃縮工程の前または
後に発酵ブロスに添加する、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 発酵工程において真菌または酵母を使
用する、請求項６から９までのいずれか１記載の方法。 - 【請求項１２】 Ｌ−リジン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニ
ン、Ｌ−トレオニンまたはＬ−トリプトファンの群から
選択した１種以上のＬ−アミノ酸を、濃縮されていてよ
い発酵ブロスに添加する、請求項９記載の方法。 - 【請求項１３】 コリネバクテリウム属からの細菌を発
酵工程で使用する、請求項６から１１までのいずれか１
項記載の方法。 - 【請求項１４】 腸内細菌科からの細菌を発酵工程で使
用する、請求項６から１１までのいずれか１項記載の方
法。
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