KR19990044609A

KR19990044609A - 디-판토산 및 디-판토텐산 또는 그의 염의 생성방법

Info

Publication number: KR19990044609A
Application number: KR1019980701859A
Authority: KR
Inventors: 다께오 모리야; 유이찌 히끼찌; 유미꼬 모리야; 다까마사 야마구찌
Original assignee: 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
Priority date: 1995-09-13
Filing date: 1996-09-11
Publication date: 1999-06-25
Also published as: EP0859848B1; KR100421088B1; DK0859848T3; US5932457A; CN1201491A; DE69632199T2; AU6943696A; EP0859848A1; DE69632199D1; SK30598A3; WO1997010340A1; ATE264392T1; CN1142997C

Abstract

D-판토산 또는 D-판토텐산 합성능을 가진 미생물을 이용하여 D-판토산 또는 D-판토텐산의 생성 방법이 개시된다. 상기 방법에 따르면, (a) D-판토산은 글루코스와 같은 각종 탄소원으로 부터 생합성되어 배양 배지내에 축적되고, 또는 (b) 예를 들어, β-알라닌을 배양 배지에 첨가하므로써 β-알라닌을 미생물과 접촉시키므로써 생합성된 D-판토산과 β-알라닌의 축합을 유도하여 배지내에 D-판토텐산이 축적된다.

Description

디-판토산 및 디-판토텐산 또는 그의 염의 생성방법

D-판토텐산은 비타민으로서 유용하다. 선행의 D-판토텐산 생성방법들로는, (1) DL-판토락톤을 광학 분해시키고, 메탄올중 생성된 D-판토락톤을 β-알라닌 또는 그의 염과 화학적 축합시키는 것을 이루어지는 방법, (2) D-판토텐산 에스테르를 미생물 또는 효소로 가수분해시켜 D-판토텐산을 수득하거나, 또는 DL-판토텐산 에스테르의 D-이성질체만을 선택적 가수분해시켜 D-판토텐산을 수득하는 것으로 이루어진 방법 (JP-A 1-228487, JP-A 1-228488), (3) D-판토산칼륨, β-알라닌 및 ATP 를 트리스 완충액중 미생물의 휴지세포 또는 그의 효소와 접촉시키는 것으로 이루어지는 방법 [Journal of Biological Chemistry, Vol. 198, p.23 (1952), Abstract of Papers 176th American Chemical Society National Meeting, Division of Microbial and Biochemical Technology, Vol. 48 (1978), etc.], (4) DL-판토산 및 β-알라닌의 존재하에 특정 미생물을 배양시키고 D-판토산을 β-알라닌과 특이적으로 축합시키므로써 D-판토텐산을 수득하는 것으로 이루어지는 방법 (JP-A 5-23191), 및 (5) β-알라닌의 존재하에서 특정 미생물을 배양시켜 D-판토텐산을 수득하는 것으로 이루어지는 방법 (JP-A 6-261772) 가 포함된다.

D-판토산 및/또는 D-판토텐산을 생성하는 방법으로는, (6) 화학적으로 합성된 DL-판토락톤을 퀴닌 및 브루신과 같은 분해제로 광학 분해시키는 것으로 이루어진 방법, (7) DL-판토락톤중 L-판토락톤만을 특정 미생물로 분해시켜 D-판토락톤을 수득하는 것으로 이루어지는 방법, (8) DL-판토락톤중 L-판토락톤만을 특정 미생물로 산화시켜 케토판토락톤을 수득하고, 이어서 D-판토락톤으로 비대칭 환원시키는 것으로 이루어지는 방법 (JP-A 47-19745), (9) 화학적으로 합성된 케노판토락톤을 특정 미생물로 비대칭 환원시켜 D-판토락톤을 수득하는 것으로 이루어지는 방법 (JP-B 61-14797), (10) DL-판토락톤중 L-판토락톤을 특정 미생물로 선택적으로 및 비대칭 가수분해시키므로써 D-판토락톤을 수득하는 것으로 이루어지는 방법 (JP-A 57-152895 및 JP-A 62-294092), (11) DL-판토락톤중 D-판토락톤을 특정 미생물로 선택적으로 및 비대칭 가수분해시키므로써 D-판토산을 수득하는 것으로 이루어지는 방법 (JP-B 3-65198), 및 (12) 특정 미생물을 배양하여 글루코스로 부터 D-판토산을 생합성하는 것으로 이루어지는 방법 (JP-A 6-261772) 이 포함된다.

D-판토텐산 (이후, 그의 염을 포함) 의 산업적 생산에 있어서, 상기 방법 (1) 은 주요 원료인 DL-판토락톤을 합성하는 복잡한 단계를 필요로 할 뿐 아니라, 복잡하고 어려운 광학 분해 단계들을 포함한다. 상기 방법 (2) 는 불이익하게 DL-판토락톤으로 부터 D-판토텐산 에스테르 또는 DL-판토텐산 에스테르의 생성 단계를 필요로 한다. 상기 방법 (3) 은 불이익하게 값비싼 ATP 및 트리스 완충액을 이용하고, 이는 값비싼 출발물질 D-판토산으로 부터 극소량의 판토텐산만이 생성되기 때문에 비실용적인 방법이다. 상기 방법 (4) 는 다른 방법들 보다는 더 단순하지만, DL-판토산을 생성 및 라세미화하는 단계들을 필요로 한다. 상기 방법 (5) 는 방법 (4) 보다는 더 단순하다. 그러나, 판토텐산 생합성 경로의 윗쪽에 위치하는 발린 생합성 경로의 활성이 배양의 후기 단계에서 사라지고, 판토텐산 생성은 발린의 고갈로 중단된다. 그러므로, 생성이 제한된다.

D-판토산 및/또는 D-판토락톤의 생성 방법 대부분은 복잡한 단계들을 통해 합성되어야 하는 출발 물질 DL-판토락톤을 사용하는 불리함이 있다. 또한, 상기 방법 (6) 은 값비싼 분해제를 불리하게 사용하고 D-판토락톤을 회수하는데 있어서 어려움이 있다. 상기 방법 (7) 은 DL-판토락톤의 절반이 손실되기 때문에 불리하다. 상기 방법 (8), (9), (10) 및 (11) 은 사용되는 미생물의 특성 및 판토락톤 또는 판토산의 특성 때문에 배양 용액중에서 100 % 광학적 수율로 D-이성질체만을 생성하는데 큰 어려움이 있다. 더구나, 상기 방법 (6), (10) 및 (11) 은 남아있는 L-이성질체를 회수 및 재활용하기 위한 부가적인 복잡한 단계들을 요구한다. 상기 방법 (12) 에서 D-판토산 생성은 상기 판토텐산 생성 방법 (5) 에서와 같이 발린 생합성의 활성에 의존한다.

발명의 요약

본 발명자들은 D-판토텐산의 생성을 위한 산업적으로 유리하고 효율적인 방법을 얻기위해 집중적으로 연구하여 왔다. 그 결과로써, β-알라닌을 함유하는 배양 배지중에서 미생물을 배양시켜 D-판토텐산을 생성하는 것으로 이루어지는 방법으로, 측쇄 아미노산 생합성을 위한 유전자를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 박테리아 균주가 배양 배지에서 D-판토텐산 또는 D-판토산 (및/또는 D-판토락톤) 을 고농도로 생성할 수 있는 것이 밝혀졌다. 플라스미드의 도입은 배양 초기 단계에서 발린 생합성 활성을 향상시키고 중기 및 말기 단계중에 향상된 활성을 유지시킨다. 상기 판토텐산 생성은 더 오래도록 지속되고, 생성물의 최종 축적이 증가된다.

본 발명은 판토텐산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분 및 측쇄 아미노산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 미생물을 배양하여 배지중에 D-판토산 또는 그의 염을 생성 축적시키고, D-판토산 또는 그의 염을 수합하는 것으로 이루어진 D-판토산 또는 그의 염의 생성 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 판토텐산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분 및 측쇄 아미노산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 미생물을 β-알라닌의 존재하에서 배양시켜 D-판토텐산 또는 그의 염을 배지중에서 생성 축적시키고, D-판토텐산 또는 그의 염을 수합하는 것으로 이루어진 D-판토텐산 또는 그의 염의 생성 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 판토텐산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드 및 측쇄 아미노산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 미생물을 배양하여 배지중에 D-판토산 또는 그의 염을 생성 축전시키고, D-판토산 또는 그의 염을 수합하는 것으로 이루어진 D-판토산 또는 그의 염의 생성 방법을 제공한다.

본 발명은 판토텐산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드 및 측쇄 아미노산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 미생물을 β-알라닌의 존재하에 배양하여 D-판토텐산 또는 그의 염을 배지중에 생성 축적시키고, D-판토텐산 또는 그의 염을 수합하는 것으로 이루어진 D-판토텐산 또는 그의 염의 생성 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 판토텐산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분 및 측쇄 아미노산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드, 또는 (b) 판토텐산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드 및 측쇄 아미노산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 미생물을 제공하는데, 이는 β-알라닌의 존재하에서 판토산을 생성하거나 또는 판토텐산을 생성할 수 있다.

바람직하게는, 미생물은 에쉐리키아 콜리 (Escherichia coli) FV 5069/pFV202 (FERM BP-5227) 이다.

더욱이, 본 발명은 판토텐산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분 및 측쇄 아미노산 생합성 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드를 제공한다.

바람직하게는, 플라스미드는 pFV202 이다.

본 발명에 있어서, 측쇄 아미노산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분은 바람직하게는 ilvGM 유전자이다.

본 발명은 상기 방법 (5) 및 (12) 에서 문제시되고 있는 발린 생성을 증가시켜 더 높은 농도의 판토텐산을 축적할 수 있다.

본 발명은 D-판토산 및/또는 D-판토텐산, 또는 그의 염의 신규한 제조방법에 관한 것이다. 판토텐산은 비타민으로서 유용하고, D-판토산은 판토텐산 또는 CoA 생성을 위한 중요한 중간체로서 유용하다.

도 1 은 pFV202 가 삽입된 4.7 kb DNA 단편의 개열 지도이다.

본 발명에 있어서, D-판토산, D-판토텐산 및 β-알라닌은 그의 염의 형태일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "D-판토산", "D-판토텐산" 및 "β-알라닌" 은 그의 염 뿐아니라 그의 유리 형태를 포함한다. D-판토산, D-판토텐산 및 β-알라닌의 염의 예로는 알칼리 금속 및 알칼리 토금속 염이 포함된다. 각 경우에 있어서, 칼슘염, 나트륨염 또는 칼륨염이 바람직하다.

본 발명자들은 에쉐리키아 속 등에 속하는 미생물로의 직접 발효에 의해서 다당류와 같은 탄소원으로 부터 D-판토산을 생성하는 효율적이고 경제적인 방법을 개발하기 위해 연구하여왔다. 그 결과로써, 다량의 D-판토산을 생성할 수 있는 박테리아 균주가 DNA 재조합 방법으로 처리된 미생물에 속하며, 그의 판토텐산 생합성 경로 뿐 아니라 상류에 위치하는 그들의 발린 생합성 경로를 향상시키는 것이 밝혀졌다. 다량의 D-판토텐산이 탄소원을 함유하는 배양 배지중 상기 미생물과 β-알라닌을 접촉시키므로써 생성될 수 있다는 것이 또한 밝혀졌다. 즉, 본 발명의 D-판토산 또는 D-판토텐산을 생성하는 방법은 미생물의 D-판토산 또는 D-판토텐산 합성능을 이용한다. 그에 의해, (a) D-판토산은 글루코스와 같은 각종 탄소원으로 부터 생합성되어 배양 배지중에 축적되거나, 또는 (b) 예를 들어, β-알라닌을 배양 배지에 첨가하므로써 β-알라닌을 미생물과 접촉시켜 생합성된 D-판토산과 β-알라닌을 축합시키므로써 배지중 D-판토텐산이 축적된다. 그러므로, 본 발명의 방법은 판토텐산 생합성 경로 뿐 아니라 그의 상류에 위치하는 발린 생합성 경로의 활성을 DNA 재조합 방법에 의해 향상시키므로써 더욱 더 높은 농도의 D-판토산 및 D-판토텐산을 생성할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 미생물은 β-알라닌의 존재하에 D-판토텐산을 생성할 수 있는 미생물, 및 D-판토산을 생성할 수 있는 미생물을 포함한다. 실제 사용을 위해서, 미생물은, 시트로박터 (Citrobacter), 쉬젤라 (Shigella), 클레브시엘라 (Klebsiella), 엔테로박터 (Enterobacter), 살모넬라 (Salmonella) 및 에쉐리키아 (Escherichia) 속에 속하는 미생물과 같은, 엔테로박테리아시에 (Enterobacteriaceae) 과에 속하는 미생물이 바람직하다. 미생물의 가장 바람직한 예로는, 문헌 [List of Cultures, 8th ed., 1988 (Institute for Fermentation, Osaka, Japan)] 에 기재된 에쉐리키아 콜리의 공지된 균주 (예를 들어, 에쉐리키아 콜리 IFO 3547) 와 같은, 에쉐리키아 속에 속하는 박테리아 균주 및 그로부터 유래된 균주가 포함된다. 유래된 균주의 예로는, 에쉐리키아 콜리 IFO 3547 에 살리실산 내성, α-케토이소발레산 내성, α-케노부티르산 내성, β-히드록시아스파르트산 내성 및 o-메틸트레오닌 내성을 부여하므로써 수득된 에쉐리키아 콜리 균주 FV 5069, 에쉐리키아 콜리 균주 FV 5069 를 판토텐산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부 및 측쇄 아미노산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부를 함유하는 플라스미드 pFV 202 로 형질전환시키므로써 수득된 에쉐리키아 콜리 균주 FV 5069/pFV 202 (FERM BP-5227) 이 포함된다.

측쇄 아미노산 생합성 유전자를 함유하는 유전자 단편은, 예를 들어, 문헌 [H. Saito 및 K. Miura, Biochem. Biophys. Acta] 에 기재된 공지된 방법 또는 그의 변현된 방법에 의해서 제조될 수 있다. 예를 들어, 크로모좀 DNA 를 공여 세포로 부터 추출한 다음, 제한효소 HindIII 로 개열한다. 이어서, 상기 수득된 크로모좀 DNA 단편을 벡터 DNA 에 삽입시킨다. 본 발명에 사용되는 벡터 DNA 는 숙주 세포내에서 성장할 수 있는 벡터 DNA 들로 부터 적절하게 선택된다. 숙주 세포내에서 성장할 수 있는 벡터 DNA 로는, 예를 들어, pSC101 (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 70, 3240 (1973)), 및 pUC18 (Gene, 33, 103 (1985)) 이 포함된다. 상기 벡터 DNA 들은 특정하게 국한되지 않으며, 새로이 단리 또는 합성된 것들이 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [T. Maniatis et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Todai Shuppankai (1982)] 에 기재된 방법 등 또는 그의 변형된 방법들에 의해서 유잔자 단편을 상기 플라스미드 벡터에 삽입시킬 수 있다. 유전자 단편이 삽입된 플라스미드는 문헌 [J. Mol. Biol., 53, 159 (1972)] 에 기재된 공지의 형질전환 방법 등 또는 그의 변형된 방법에 의해서 숙주 세포로 도입될 수 있다. 숙주 세포의 예로는 에쉐리키아 콜리 균주 JM109 (J. Mol. Biol., 166 (1983)) 와 같은 공지된 박테리아 균주가 포함된다.

측쇄 아미노산 생합성 유전자를 함유하는 플라스미드가 도입된 균주는, 예를 들어, 탐침으로써 에쉐리키아 콜리 균주 K-12 의 아세토히드록시산 합성효소 유전자 서열의 일부분을 사용하는, 콜로니 혼성화 방법 등에 의해서 형질전환된 균주로 부터 선택될 수 있다. 상기 수득된 측쇄 아미노산 생합성 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA 는 그의 숙주 균주로 부터 추출되어 다른 숙주 세포로 도입될 수 있다. 이와는 달리, 측쇄 아미노산 생합성 유전자를 함유하는 DNA 단편은 추출된 플라스미드 DNA 로 부터 제조된 다음 다른 벡터에 결찰될 수 있다.

상기 수득된 형질전환된 균주의 예로는 에쉐리키아 콜리 균주 FV 5069/pFV 202 (FERM BP-5227, IFO 15857) 가 포함된다. pFV 202 는 에쉐리키아 콜리 균주 FV 525 로 부터 유래된 판토텐산 생합성 유전자 및 에쉐리키아 콜리 균주 FV 5069 로 부터 유래된 측쇄 아미노산 생합성 유전자 (아세토히드록시산 합성효소 이소자임 II 유전자) 를 함유하는 플라스미드이다. 에쉐리키아 콜리 균주 FV 5069/pFV 202 (FERM BP-5227) 은 pFV 202 를 에쉐리키아 콜리 균주 FV 5069 로 도입하므로써 수득된 균주이다. 사용된 IFO 번호는 기관 [Institute for Fermentation, Osaka (IFO) (17-5 Juso-hanmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japan)] 에 대한 기탁번호이고, 사용된 FERM BP 번호는 부다페스트 조약하에 국제기탁기관 [National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (NIBH) (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan)] 에 대한 기탁번호이다. 특히 에쉐리키아 콜리 FV 5069/pFV 202 는 1995 년 9 월 7 일 부터 부다페스트 조약하에 기탁번호 FERM BP-5227 로 NIBH 에 기탁되어 있다.

상기 수득된 박테리아 균주는 진탕 배양법 (예를 들어, 회전식 진탕기상에서 진탕 배양), 정지 배양법 및 통기 진탕 배양법과 같은 통상적인 방법들에 의해 지속적으로 또는 간헐적으로 배양될 수 있다. 사용되는 배양 배지는 사용되는 미생물이 성장할 수 있는 통상적인 제형을 가질 수 있다. 탄소원은 탄수화물, 오일 및 지방, 지방산, 유기산 및 알콜과 같은 동화성 탄소원으로 부터 적절하게 선택될 수 있으며, 단독으로 또는 혼합물로서 사용된다. 질소원으로는, 예를 들어, 펩톤, 콩가루, 솜가루, 콘 스팁 리큐어, 효모 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물 및 요소와 같은 유기 질소원, 및 암모늄 술페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 니트레이트 및 암모늄 포스페이트와 같은 무기 질소원이 포함된다. 질소원은 단독으로 또는 그의 혼합물로서 사용될 수 있다. 포타슘 디히드로포스페이트 또는 디포타슘 히드로겐포스페이트가 인의 원으로서 사용되는 것이 유리하다. 배지는 성장에 필요한 금속염 (예를 들어, 황산마그네슘), 필수적인 성장 인자 또는 탄소원, 질소원 및 인의 원과 더불어 아미노산 및 비타민과 같은 성장-촉진 물질을 함유할 수 있다. 배양중 pH 를 조절하기 위해서, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아, 탄산칼슘 등과 같은 염기성 물질을 적절하게 첨가할 수 있다. 발포 방지제의 첨가는 또한 발포를 조절하는데 효과적이다. 상기 물질은 배양중 적절하게 첨가될 수 있다. 통기 조건을 유지시키기 위해서, 산소가 풍부한 통기를 수행하는 것이 효과적이다. 배양 온도는 통상적으로 15 ℃ ∼ 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ ∼ 40 ℃ 이다. 배양을 판토텐산 및/또는 판토산의 최대 축적량에 도달할 때 까지 지속한다. 통상적으로, 6 시간 내지 120 시간의 배양 시간이 본 목적을 달성할 수 있다. 본 발명에 따른 D-판토텐산의 생성에 있어서, 박테리아 균주의 배양전에 또는 배양중 적합한 단계에서 원료 물질을 첨가하거나, 또는 원료물질을 가공된 박테리아 세포에 첨가하므로써 원료 물질 β-알라닌을 박테리아 세포와 접촉시킬 수 있다. 가공된 박테리아 세포는 박테리아를 배양시켜 수득된 배양액의 린스된 박테리아 세포, 아세톤-건조된 박테리아 세포, 폴리아크릴아미드 겔 또는 k-카라게난으로 고정화된 박테리아 세포 등을 의미한다. 원료 물질은 물과 같은 적합한 용매중의 용액 또는 현탁액으로써 또는 분말로써 한번에 또는 적합한 시간에 걸쳐 지속적으로 또는 간헐적으로 첨가될 수 있다.

배지에 첨가되는 β-알라닌의 농도는 미생물의 생산성에 따라 다양하다. 경제적인 관점으로 부터, β-알라닌의 농도는 바람직하게는 0.1 ∼ 6 w/v%, 보다 바람직하게는 0.5 ∼ 4 w/v% 이다.

D-판토텐산 또는 그의 염은 통상적인 방법에 의해서 상기 배양액 또는 반응 혼합물로 부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 배양액으로 부터 박테리아 세포를 제거한 후, 잔류물에 대해 이온-교환 크로마토그래피, 활성탄, 합성 흡착제 등으로의 흡착법, 농축법 및 결정화와 같은 공지된 단리 방법을 수행하여 D-판토텐산 또는 그의 염을 단리시킨다. 상기 방법들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. JP-B 40-2330 에 따른 결정화는, 용이하게 여과 가능한 결정을 고수율로 생성할 수 있기 때문에 산업적으로 유리하다. 상기 결정화 방법에 따르면, 판토텐산 칼슘의 몰 당 4 몰의 메탄올 및 1 몰의 물을 함유하는 용매화된 수화물 (판토텐산 칼슘·4 MeOH·1H₂O) 이 침전된 결정으로서 수득된다. 생성된 결정을 건조시켜 결정중 메탄올 및 물을 제거하므로써 판토텐산 칼슘을 수득한다 (M. Inagaki et al., Chem. Pharm. Bull., 24, 3097-3102 (1976)).

예를 들어, D-판토텐산 칼슘은 하기와 같이 배양액으로 부터 단리될 수 있다. 박테리아 세포가 제거된 배양액을 양이온-교환 수지로 패킹한 컬럼 (예를 들어, Diaion PK-216 (H-형), PK-228 (H-형); Mitsubishi Chemical Corporation 사제) 을 통과시켜 양이온을 제거한 다음, 음이온-교환 수지가 패킹된 컬럼 (예를 들어, PA-412 (OH-형), WA-30 (OH-형); Mitsubishi Chemical Corporation 사제) 을 통과시켜 무기성 음이온 및 판토텐산 보다 더 강한 산성을 갖는 유기산을 제거한다. 수산화칼슘을 유리 판토텐산을 함유하는 용리액 (pH: 약 2.6) 에 첨가하여 pH 를 약 5.0 으로 조절한 다음, 혼합물을 판토텐산 농도 약 25 w/v% 로 농축시킨다. 이어서, 수산화칼슘을 농축물에 첨가하여 pH 를 약 7.0 으로 조절하고, 활성탄 (예를 들어, Shirasagi A, Takeda Chemical Industries, Ltd. 사제) 을 첨가하여 탈색시킨다. 활성탄을 여과시켜 제거한 후, 여액을 약 45 % ∼ 55 % (w/w) 의 판토텐산 칼슘의 농도로 농축시킨다. 이어서, 적정량의 메탄올을 첨가하여 용액중 물함량을 5 % ∼ 15 % 로 조절한다. 이어서, 용액을 약 2 ℃ 로 냉각시키고, 종자 결정을 첨가하여 판토텐산 칼슘의 용매화 수화물의 결정을 침전시킨다. 결정을 수합하여 건조시켜 고순도의 D-판토텐산을 고수율로 수득한다.

하기 실시예는 더욱이 본 발명을 상세하게 설명하지만 그에 국한되는 것으로 추정되지는 않는다.

D-판토텐산은 고성능 액체 크로마토그래피 (컬럼: Shimadzu SCR101H (7.9 mm I.D. × 30 cm); 이동상: 0.008N 황산; 유속: 0.8 ml/분; 확인: 시차 굴절계) 및/또는 미생물 정량법 (시험 박테리아: 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) IFO 3070; 배지: 시판되는 판토텐산 정량용 배지 (DIFCO 사제)) 에 의해 측정된다. 배양액중 발린을 고성능 액체 크로마토그래피 (컬럼: Mitsubishi Chemical Corporation MCI GEL CRS 10W (4.6 mm I.D. × 5 cm); 이동상: 1mM-CuSO₄/CH₃CN = 7/1; 유속: 0.7 ml/분; 확인: UV 측광기) 로 측정한다.

실시예 1

(1) 크로모좀 DNA 의 제조

에쉐리키아 콜리 FV5069 를 L 배지 (1 리터) (박토트립톤 10 %, 효모 추출물 0.5 %, 염화나트륨 0.5 %) 에 접종하여 37 ℃ 에서 하룻밤동안 배양시킨다. 생성된 박테리아 세포로 부터, 크로모좀 DNA (최종 수율: 3.3 mg) 가 페놀을 사용하는 사이또 (Saito et al.) 방법 [Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)] 으로 수득된다.

(2) 벡터 플라스미드 pUC18 로 크로모좀 DNA 의 삽입

상기 (1) 에서 수득된 크로모좀 DNA (10 μg) 및 pUC18 (Nippon Gene 사제) 각각을 제한효소 HindIII (Nippon Gene 사제) 로 개열시키고, 생성된 DNA 단편들을 혼합시킨 다음 T4 파아지로 부터 유래된 DNA 리가제 (Nippon Gene 사제) 로 결찰시킨다.

(3) 크로모좀 DNA 단편이 삽입된 플라스미드 DNA 의 선별

에쉐리키아 콜리 균주 JM109 에 상기 (2) 에서 수득된 각종 플라스미드의 혼합물을 감응세포 방법에 의해 형질전환시킨다. 이어서, 상기 형질전환체를 함유하는 현탁액을 앰피실린 나트륨염 (50 μg/ml), IPTG (0.5 mM) 및 X-gal (100 μg/ml) 을 함유하는 L 아가 플레이트 배지상에 스프레드하여 37 ℃ 에서 하룻밤동안 배양시킨다. 생성된 콜로니중, 크로모좀 DNA 단편을 함유하는 플라스미드 DNA 를 갖는 형질전환체로써 백색 콜로니를 선택한다.

(4) 탐침의 제조

로더 (Rother et al.) 에 의해 확인된 약 600 bp 서열의E. coli균주 K-12 ilvG 유전자 (아세토히드록시산 합성효소 이소자임 II 큰 서브유니트 유전자, Nucleic Acids Research, 2137, 15 (1987)) 를 PCR 방법으로 증폭시킨다. 증폭된 유전자를 랜덤 프라임 방법에 의해³²P 로 표지하여, 탐침으로 사용한다.

(5) 아세토히드록시산 합성효소 이소자임 II 유전자의 클로닝

상기 (3) 에서 수득된 백색 콜로니가 획선되어 있는, 앰피실린 나트륨 (50 μg/ml) 을 함유하는 L 아가 플레이트 배지상에 나일론 막을 위치시키고, 37 ℃ 에서 하룻밤동안 배양시킨다. 막을 알칼리로 처리하여 중성화시키고, 80 ℃ 에서 2 시간 동안 구워 막위에 세포내 DNA 를 고정시킨다. 상기 (4) 의 탐침을 이용하여, 막을 혼성화시켜 다른 것 보다 뚜렷하게 더 강한 시그날을 방출하는 콜로니의 한 균주를 수득한다.

(6) 써던 혼성화법에 의한 확인

플라스미드 (10 μg) 를 상기 콜로니로 부터 추출하여, HindIII 로 개열시킨 다음 전기영동시킨다. 삽입된 단편을 써던 혼성화법으로 분석한다. 결과는, 상기 단편이 4.7 kb 길이이고 (K-12 의 아세토히드록시산 합성효소 이소자임 II 유전자를 함유하는 HindIII 단편이 또한 4.7 kb 길이이다), 상기 (4) 에서 수득된 탐침으로 강하게 혼성화된다는 것을 보여준다.

(7) 발편 플라스미드의 구축

상기 4.7 kb 삽입 단편을 플라스미드 벡터 pMW 118 의 HindIII 위치에 삽입시킨 후, 2.5 kb 인 에쉐리키아 콜리 FV525 의 판토텐산 생합성 유전자를 EcoRI 위치에 삽입시킨다. 생성된 플라스미드를 pFV202 로 명명한다. 판토텐산-생성 균주 FV5069 를 상기 플라스미드로 형질전환시키고, 생성된 형질전환체를 FV5069/pFV202 로 명명한다. 상기 형질전환체의 아세토히드록시산 합성효소 이소자임 II 활성을 판토텐산 생합성 유전자만이 삽입된 pFV31 로 형질전환된 FV5069/pFV31 의 활성, 및 형질전환되지 않은 모 (숙주) 균주 FV5069 의 활성과 비교한다.

(8) 형질전환체의 아세토히드록시산 합성효소 활성의 측정

시험 박테리아를 생성 배지 (A) 에서 약 48 시간 동안 배양시키고, 초음파에 의해 박테리아로 부터 용해질을 제조한다. 용해질을 20,000 rpm 으로 1 시간 동안 원심분리하여 상층액을 수득한다. 잭슨 (Jackson et al.) 방법 [Methods Enzymol. 1988] 에 따라, 생성된 아세토락트산을 조 효소용액으로써 상층액을 사용하여 아세토인으로 전환시킨다. 생성된 아세토인을 2-나프톨로 발색시켜 530 nm 의 파장으로 정량한다.

결과를 표 1 에 나타낸다.

표 1 에 나타낸 바와 같이, pFV202 로 삽입된 4.7 kb HindIII 단편은 아세토히드록시산 합성효소 이소자임 II 를 코드하는 ilvGM 유전자를 함유한다.

박테리아 균주	고유 활성 (μmol/분.mil)
FV5069	38.2
FV5069/pFV31	35.7
FV5069/pFV202	108.9

(9) ilvGM 을 함유하는 4.7 kb 단편의 개열지도

pFV202 로 삽입된 4.7 kb DNA 단편은 하나의 PstI 부위, 하나의 SalI 부위 및 하나의 PvuII 부위를 포함한다. 도 1 은 상기 단편의 개열지도를 나타낸다.

실시예 2

표 2 에 나타낸 조성을 갖는 액체 배지를 오토클레이브내에서 121 ℃ 로 15 분간 가열하여 멸균시키고, 200 ml 에를렌메이어 플라스크로 20 ml 분량으로 분주한다. 상기 실시예 1 의 (7) 의 사면 배지로 부터 수득된 에쉐리키아 콜리 균주 FV5069/pFV202 (FERM BP-5227) 및 균주 FV5069/pFV31 (FERM BP-4395) 각각의 백금 루우프 하나 분량을 배지에 접종하고, 220 rpm 인 회전식 진탕기상에서 30 ℃ 에서 20 시간 동안 배양시킨다. 종자 배양액 (1 ml) 을 표 2 에 나타낸 조성을 갖는 배지 (20 ml) 로 옮겨, 200 ml 주름잡힌 에를렌메이어 플라스크내에서 38 ℃ 로 72 시간 동안 배양시킨다. 배양중에, 표 3 에 나타낸 각종 물질을 첨가한다. 표 4 는 배양 말기에 생성된 판토텐산 (PaA) 의 양 및 발린 (Val) 의 양을 나타낸다.

배지 조성 :

종자 배지 :CSL 0.5 %(NH₄)₂SO₄0.5 %MgSO₄·7H₂O 0.001 %KH₂PO₄0.01 %K₂HPO₄0.01 %티아민 히드로클로라이드 2 μg/ml글루코스 5 %CaCO₃2 %pH 7.0

주요 배지 :CSL 2 %(NH₄)₂SO₄1.25 %MgSO₄·7H₂O 0.002 %KH₂PO₄0.01 %β-알라닌 1 %티아민 히드로클로라이드 0.5 μg/ml글루코스 9 %CaCO₃4 %pH 7.0

각종 물질의 첨가

배양 시간	글루코스	티아민 히드로클로라이드	(NH₄)₂SO₄	β-알라닌
17 시간	6 %	0.5 μg/ml	0.75 %	1 %
24 시간	6 %	0.5 μg/ml		0.5 %
41 시간	4 %	0.5 μg/ml		0.5 %
50 시간	5 %	0.5 μg/ml

배양의 결과

배양 시간	FV5069/pFV31	FV5069/pFV202
배양 시간	PaA	Val	PaA	Val
24 시간	38.7 g/L	2.1 g/L	29.9 g/L	5.2 g/L
48 시간	52.2 g/L	1.1 g/L	60.1 g/L	2.7 g/L
72 시간	51.8 g/L	0.9 g/L	66.0 g/L	1/3 g/L

상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 판토산 및 판토텐산의 생합성 경로의 상류에 위치하는 발린 생합성 경로의 활성을 향상시켜 발린 생산성을 증가시킬 수 있고, 더 높은 농도의 판토산 및 판토텐산을 생성할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 산업적으로 유리하며 효율적인 방법이다.

Claims

판토텐산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분 및 측쇄 아미노산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 미생물을 배양하여 배지내에 D-판토산 또는 그의 염을 생성 축적시키고, D-판토산 또는 그의 염을 수합하는 것으로 이루어지는, D-판토산 또는 그의 염의 생성 방법.
판토텐산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분 및 측쇄 아미노산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 미생물을 β-알라닌의 존재하에서 배양하여 배지내에 D-판토텐산 또는 그의 염을 생성 축적시키고, D-판토텐산 또는 그의 염을 수합하는 것으로 이루어지는, D-판토텐산 또는 그의 염의 생성 방법.
판토텐산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드 및 측쇄 아미노산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 미생물을 배양하여 배지내에 D-판토산 또는 그의 염을 생성 축적시키고, D-판토산 또는 그의 염을 수합하는 것으로 이루어지는, D-판토산 또는 그의 염의 생성 방법.
판토텐산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드 및 측쇄 아미노산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 미생물을 β-알라닌의 존재하에서 배양하여 배지내에 D-판토텐산 또는 그의 염을 생성 축적시키고, D-판토텐산 또는 그의 염을 수합하는 것으로 이루어지는, D-판토텐산 또는 그의 염의 생성 방법.
판토텐산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분 및 측쇄 아미노산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드 (a) 및 판토텐산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드 및 측쇄 아미노산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드 (b) 로 형질전환되고, β-알라닌의 존재하에서 판토산을 생성하거나 또는 판토텐산을 생성할 수 있는 미생물.
제 5 항에 있어서, 측쇄 아미노산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을이 ilvGM 유전자인 미생물.
제 5 항에 있어서, 에쉐리키아 콜리 FV 5069/pFV202 (FERM-BP 5227) 인 미생물.
판토텐산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분 및 측쇄 아미노산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을 갖는 DNA 를 함유하는 플라스미드.
제 8 항에 있어서, 측쇄 아미노산 생합성 유전자 영역 또는 그의 일부분을이 ilvGM 유전자인 플라스미드.
제 8 항에 있어서, pFV202 인 플라스미드.