La présente invention concerne un procédé de production d'acide
L-aspartique à partir d'acide fumarique et d'ammoniac au moyen d'un microorganisme qui appartient au genre Rhodococcus et qui a une activité d'aspartase.

L'acide L-aspartique est utilisé notamment comme produit pharmaceutique et comme additif alimentaire. Récemment, il a également attiré l'attention comme matière première pour tensioactifs et pour agents chélatants biodégradables.

L'acide L-aspartique est produit principalement à partir d'acide fumarique et d'ammoniac par des procédés enzymatiques utilisant une aspartase.

Par exemple, on connaît un procédé utilisant la bactérie Escherichia coli (demande de brevet japonais publiée avant examen n" 60-133883), un procédé utilisant une bactérie appartenant au genre Serratia (demande de brevet japonais publiée avant examen n" 59-113887) et un procédé utilisant une bactérie appartenant au genre Brevibacterium (demande de brevet japonais publiée avant examen nO 56-26196).

La présente invention a pour but d'identifier d'autres micro-organismes ayant une activité d'aspartase et de produire de l'acide L-aspartique avec efficacité au moyen de ces micro-organismes.

A la suite de recherches approfondies pour atteindre ce but, le demandeur a identifié certains micro-organismes appartenant au genre
Rhodococcus qui ont une activité d'aspartase et qui peuvent produire de l'acide
L-aspartique efficacement. Jusqu'à présent, L'activité d'aspartase des bactéries du genre Rhodococcus n'était ni décrite ni connue.

Ainsi, la présente invention concerne un procédé de production d'acide
L-aspartique à partir d'acide flimarique et d'ammoniac par action d'un microorganisme ayant une activité d'aspartase qui appartient au genre Rhodococcus. Le micro-organisme à activité d'aspartase appartenant au genre Rhodococcus peut être notamment Rhodococcus sp. EA4 (FERM BP-6231), Rhodococcus rhodochrous ATCC 17041, Rhodococcus rhodochrous ATCC 17895,
Rhodococcus rhodochrous ATCC 19140 ou Rhodococcus rhodochrous ATCC 33258.

Parmi ces micro-organismes, la souche EA4 a été déposée sous le numéro d'accès mentionné ci-dessus auprès du National Institute ofBioscience and
Human-Technology, Agency of Indu striaI Science and Technology, Japon. Les propriétés bactériologiques de cette souche sont décrites dans la demande de brevet japonais publiée avant examen n" 4-304892. Les souches ATCC 17041,
ATCC 17895, ATCC 19140 et ATCC 33258 sont disponibles auprès de la
American Type Culture Collection (ATCC).

Un micro-organisme destiné à être utilisé dans le cadre de la présente invention est cultivé dans un milieu conventionnel contenant des sources de carbone assimilable (comme le glycérol, le glucose, le saccharose, le lactose, le fructose), des sources d'azote (comme un extrait de viande, un extrait de levure, un extrait de malt, un liquide de trempage, la polypeptone) et des sels inorganiques essentiels pour la croissance de chaque micro-organisme (comme le chlorure de magnésium, le sulfate de sodium, le chlorure de calcium, le sulfate de manganèse, le chlorure de fer, le sulfate de zinc). Dans le milieu décrit ci-dessus, L'acide
L-aspartique peut être utilisé comme source de carbone et d'azote, et l'acide fùmarique peut être utilisé comme source de carbone. Ces substances peuvent être ajoutées en des quantités respectives de 0,1 à 5 %.

Le pH de la solution de culture est compris entre 4 et 10. La culture est réalisée à une température de 5 à 50"C pendant 1 à 7 jours dans des conditions aérobies et elle est prolongée jusqu'à ce que l'activité d'aspartase atteigne son maximum.

On conduit la réaction de la manière suivante : tout d'abord, on met en suspension dans un milieu aqueux comme l'eau ou un tampon les cellules séparées de la solution de culture d'un micro-organisme cultivé comme décrit ci-dessus ou un produit obtenu en traitant de telles cellules (par exemple cellules séchées, cellules lysées, enzyme brute ou purifiée séparée, cellules immobilisées ou enzyme immobilisée). Puis, on met cette suspension en contact avec un substrat constitué par l'acide fumarique et l'ammoniac que l'on peut introduire dans le système réactionnel sous différentes formes. Par exemple, on peut utiliser le fumarate d'ammonium ou une combinaison d'acide flimarique ou d'un sel d'acide fumarique et d'un sel d'ammonium inorganique. Le fùmarate de sodium et le fumarate de potassium sont des flimarates appropriés. Comme sel d'ammonium inorganique, on peut utiliser le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le phosphate d'ammonium ou un mélange de ces sels.

De préférence, le rapport molaire de l'acide flimarique ou d'un sel d'acide fùmarique à un sel d'ammonium inorganique est compris entre 1:1,5 et 1:2.

La température de réaction est comprise entre 0 et 600C, de préférence entre 20 et 500C. On conduit la réaction pendant 0,1 à 100 h.

Pendant la réaction, on ajuste le pH entre 6 et 10, de préférence entre 8 et 10.

Habituellement, on ajoute à la solution réactionnelle des ions de métal divalent tels que le calcium ou le magnésium à raison de 0,1 à 100 mM, de préfé rencedel à 10 mM.

La présente invention sera mieux comprise à la lecture de l'exemple non limitatif suivant.

Exemple
On a inoculé séparément Rhodococcus sp. EA4, Rhodococcus rhodochrous ATCC 17041, Rhodococcus rhodochrous ATCC 17895,
Rhodococcus rhodochrous ATCC 19140 et Rhodococcus rhodochrous ATCC 33258 à 10 ml de milieu MYK (0,5 % de polypeptone, 0,3 % d'extrait de bactolevure, 0,3 % d'extrait de bacto-malt, 0,2 % de K2HPO4, 0,2 % de KH2PO4) et on a cultivé à 30"C pendant 3 jours. Puis, on a inoculé 0,5 ml de la solution de culture à 50 ml de milieu ASP (1 % d'acide L-aspartique, 1 % de polyptone, 1 % d'extrait de bacto-levure, 0,5 % de K2HPO4, pH 7,0) et on a cultivé à 30"C pendant 96 h.

Ensuite, on a récolté les cellules par centrifugation, on les a lavées avec du tampon phosphate 100 mM (pH 8,0) et, enfin, on les a mises en suspension dans une petite quantité de ce tampon. On a lysé la suspension de cellules résultante par sonication en refroidissant dans la glace, puis on a centrifugé pour obtenir une solution d'enzyme brute. On a soumis cette solution d'enzyme à une détermination de l'activité d'aspartase.

On a réalisé la détermination de l'activité d'aspartase en mettant en contact la solution d'enzyme brute avec du fumarate d'ammonium I M (pH 8,8, contenant du chlorure de magnésium 1 mM) et en déterminant quantitativement la production d'acide L-aspartique à 300C pendant 20 h par CLHP au moyen d'une colonne ODS. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous.

TABLEAU
Souche Acide L-aspartique (mM)
Rhodococcus sp. EA4 210
Rhodococcus rhodochrous ATCC 17041 140
Rhodococcus rhodochrous ATCC 17895 50
Rhodococcus rhodochrous ATCC 19140 170
Rhodococcus rhodochrous ATCC 33258 100