CN1310233A - 突变体ilvH基因和制备L－缬氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

一种制备L－缬氨酸的方法,它包括以下步骤:培养携带了编码乙酰羟酸合成酶同功酶Ⅲ的DNA的细菌,其中该酶来源于大肠杆菌,不受L－缬氨酸的抑制,并且具有催化从丙酮酸产生α－乙酰乳酸和从α－丁酮酸及丙酮酸产生α－乙酰－α羟基丁酸这两种反应的活性;在培养基中生产和积累L－缬氨酸;并从培养基回收L－缬氨酸。

Description

突变体ilvH基因和制备L-缬氨酸的方法
                 技术领域
本发明涉及通过发酵制备L-缬氨酸的方法，具体地说，本发明涉及一种不受L-缬氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶同功酶Ⅲ的DNA、携带该DNA的微生物、以及使用这种微生物制备L-缬氨酸的方法。
                 发明背景
过去，L-缬氨酸通过发酵方法来生产，主要使用属于短杆菌属、棒杆菌属或沙雷氏菌属并且能够生产L-缬氨酸或L-亮氨酸的微生物或其突变体(《氨基酸发酵》，日本科学协会出版，397-422页，1986)。尽管传统的方法已经在很大程度上提高了这些氨基酸的生产，但仍需要发展一种更有效、廉价的技术，来满足将来L-缬氨酸和L-亮氨酸不断增长的需要。
至于除上述细菌以外的用于L-缬氨酸生产的细菌，其例子为，属于埃希氏菌属、生长需要硫辛酸和/或H+-ATP酶活性缺陷的L-缬氨酸生产菌，以及属于埃希氏菌属、具有上述特征、被导入了一种能表达ilvG、ilvM、ilvE和ilvD基因的ilvGMEDA操纵子并且不表达苏氨酸脱氨酶的细菌(WO96/06926)。
L-缬氨酸生物合成的最后步骤由一组ilvGMEDA操纵子编码的酶催化。ilvGMEDA操纵子包括ilvG、ilvM、ilvE、ilvD和ilvA基因各一个，分别编码乙酰羟酸合成酶同功酶Ⅱ的大亚基和小亚基、转氨酶、二羟酸脱氢酶和苏氨酸脱氨酶。在这些酶中，乙酰羟酸合成酶、转氨酶和二羟酸脱氢酶催化丙酮酸至L-缬氨酸和2-丁酮酸至L-异亮氨酸的合成途径，而苏氨酸脱氨酶催化L-苏氨酸至2-丁酮酸的脱氨反应，后者是L-异亮氨酸生物合成的限速步骤。顺便提一句，ilvGMEDA操纵子的表达受L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸的控制(减弱)。
就涉及L-缬氨酸生物合成的乙酰羟酸合成酶而言，除了同功酶Ⅱ(这里也称为AHASⅡ)，还知道有同功酶Ⅲ(这里也称为AHASⅢ)。AHASⅢ由ilvIH操纵子编码，该操纵子由编码大亚基(催化亚基)的ilvI和编码小亚基(控制亚基)的ilvH组成。AHASⅢ受L-缬氨酸的反馈抑制。
顺便提一句，已经有报道，从抗L-缬氨酸的突变体大肠杆菌中克隆的ilvH基因具有一个14gly至asp的氨基酸取代(Vyazmensky,M.等，《生物化学》35:10339-10346(1996))。而且，已知ilvH612是AHASⅢ突变(De Felice等，《细菌学杂志》120:1058-1067(1974))。大肠杆菌MI262(Guardiola等，《细菌学杂志》120:536-538(1974)；De Felice等，《细菌学杂志》120:1068-1077(1974))的ilvIH操纵子中的ilvH基因含有ilvH612双重突变，分别是29Asn被Lys取代和92Gln被一个终止密码子(TAG)取代。
如上所述，编码AHASⅡ的DNA已被用于培育L-缬氨酸的生产菌株，但对于AHASⅢ，就没有这方面的报道。
                 发明公开
鉴于上面所指出的，本发明的目的是提供一种不受L-缬氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶同功酶Ⅲ的DNA、携带该DNA的微生物、以及使用这种细菌制备L-缬氨酸的方法。
作为为完成上述目的而进行的努力研究的结果，本发明的发明者们发现，在将从一种L-缬氨酸抗性突变体分离的、编码缬氨酸抗性AHASⅢ的DNA导入大肠杆菌时，缬氨酸的产量增加。因此完成了本发明。
即，本发明的各方面如下：
(1)一种编码乙酰羟酸合成酶同功酶Ⅲ的小亚基的DNA，它来源于大肠杆菌，它具有一个突变，即对应于SEQ ID NO:2中17号氨基酸的丝氨酸残基的氨基酸残基被另一种残基取代；或者它具有两个突变，即对应于SEQ ID NO:2中17号氨基酸的丝氨酸残基和对应于14号氨基酸的甘氨酸残基的氨基酸残基被另一种残基取代；
(2)(1)的DNA，其中对应于17号氨基酸的丝氨酸残基的氨基酸残基的突变是丝氨酸残基被苯丙氨酸残基取代，对应于14号氨基酸的甘氨酸残基的氨基酸残基的突变是甘氨酸残基被天冬氨酸残基取代；
(3)一种编码来源于大肠杆菌的乙酰羟酸合成酶同功酶Ⅲ的DNA，该酶不受L-缬氨酸的抑制，并且具有催化从丙酮酸产生α-乙酰乳酸和从α-丁酮酸及丙酮酸产生α-乙酰-α羟基丁酸这两种反应的活性；
(4)(3)的DNA，其中DNA编码乙酰羟酸合成酶同功酶Ⅲ的大亚基和小亚基，小亚基带有一个突变，即SEQ ID NO:2中对应于17号氨基酸的丝氨酸残基的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代，或者对应于29号氨基酸的天冬酰胺残基的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代，或者自91号氨基酸下游的一个C末端片段缺失，或者选自上述突变和对应于SEQ ID NO:2中14号氨基酸的甘氨酸残基的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代的突变的2种或多种突变的组合；
(5)(4)的DNA，其中对应于17号氨基酸的丝氨酸残基的氨基酸残基的突变是丝氨酸残基被苯丙氨酸残基取代，对应于29号氨基酸的天冬氨酸残基的氨基酸残基的突变是天冬氨酸残基被赖氨酸或酪氨酸残基取代，对应于14号氨基酸的甘氨酸残基的氨基酸残基的突变是甘氨酸残基被天冬氨酸残基取代；
(6)在其染色体DNA或质粒上携带(1)或(3)的DNA并具有产生L-缬氨酸能力的细菌；
(7)(6)的细菌，其中DNA的表达被增强；
(8)(7)的细菌，其中表达通过将DNA置于强启动子的控制之下或增加DNA的拷贝数来增强；
(9)一种制备L-缬氨酸的方法，包括以下步骤：在一种培养基中培养(6)的细菌，在培养基中生产和积累L-缬氨酸，并从培养基回收L-缬氨酸。
下面将对本发明进行详细解释。
本发明的第1个DNA是编码AHASⅢ的小亚基的DNA，该亚基与大亚基一起显示不受L-缬氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶活性。乙酰羟酸合成酶活性在这里指催化从丙酮酸产生α-乙酰乳酸和从α-丁酮酸及丙酮酸产生α-乙酰-α羟基丁酸这两种反应的活性。大肠杆菌的AHASⅢ小亚基具有序列表中SEQ ID NO:2描述的氨基酸序列。
上述突变选自如下的一个突变，即对应于SEQ ID NO:2中17号氨基酸的丝氨酸残基的氨基酸残基被另一种残基取代；或者两个突变，即对应于SEQ ID NO:2中17号氨基酸的丝氨酸残基和对应于14号氨基酸的甘氨酸残基的氨基酸残基被另一种残基取代。就对应于17号氨基酸的丝氨酸残基的氨基酸残基的突变而言，优选的例子是用苯丙氨酸残基取代丝氨酸残基，而就对应于14号氨基酸的甘氨酸残基的氨基酸残基的突变来说，优选的例子是用天冬氨酸残基取代甘氨酸残基。
本发明的第2个DNA是编码AHASⅢ的DNA，其中所说的AHASⅢ不受L-缬氨酸的抑制，并且具有催化从丙酮酸产生α-乙酰乳酸和从α-丁酮酸及丙酮酸产生α-乙酰-α羟基丁酸这两种反应的活性。该DNA同时编码AHASⅢ的大亚基和小亚基。
小亚基带有一个突变，即SEQ ID NO:2中对应于17号氨基酸的丝氨酸残基的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代，或者对应于29号氨基酸的天冬酰胺残基的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代，或者自91号氨基酸下游的一个C末端片段缺失，或者选自上述突变和对应于SEQ ID NO:2中14号氨基酸的甘氨酸残基的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代的突变的2种或多种突变的组合。带有这些突变的AHASⅢ小亚基在这里也被称为AHASⅢ的小亚基突变体。就对应于17号氨基酸的丝氨酸残基的氨基酸残基突变而言，优选的例子是丝氨酸残基被苯丙氨酸残基取代，就对应于29号氨基酸的天冬氨酸残基的氨基酸残基而言，例子是天冬氨酸残基被赖氨酸或酪氨酸残基取代，而就对应于14号氨基酸的甘氨酸残基的氨基酸残基的突变而言，优选的例子是甘氨酸残基被天冬氨酸残基取代。
本发明的DNA获自大肠杆菌的L-缬氨酸抗性突变体，但它也可通过定点诱变将上述突变导入编码野生型AHASⅢ的DNA来获得。AHASⅢH由ilvIH操纵子编码。ilvIH操纵子可通过诸如PCR扩增ilvH基因的启动子区域至3’末端的DNA片段来获得，PCR使用具有示于SEQ ID NO:3和4的序列的引物，并使用大肠杆菌的基因组DNA作为模板。ilvIH操纵子的核苷酸序列已经知道(Genbank/EMBL/DDBJaccession X55034)。ilvH的编码区的核苷酸序列在SEQ ID NO:1中描述。
本发明的DNA编码的AHASⅢ的突变体小亚基可以具有一种含有一个或几个氨基酸取代、缺失、插入、添加或倒位以及上述突变的氨基酸序列，只要突变体小亚基能够与大亚基一起显示不受L-缬氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶活性。
编码与上面介绍的突变体小亚基基本上相同的蛋白的DNA，可通过诸如修饰核苷酸序列，例如通过定点诱变的方法使特殊位点的一个或多个氨基酸残基被取代、缺失、插入、添加或倒位，来获得。按上面的介绍修饰的DNA可以通过传统已知的突变处理来获得。突变处理包括例如用羟胺在体外处理编码小亚基的DNA的方法；以及用紫外线辐射或一种突变试剂如通常用于突变处理的N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸处理一种属于埃希氏菌属并携带编码小亚基的DNA的细菌的方法。
编码与AHASⅢ突变体小亚基基本上相同的蛋白的DNA通过如下方法来获得：在一种合适的细胞中以多拷贝的方式表达含有上述突变的DNA，研究对L-缬氨酸的抗性，并选择抗性提高的DNA。而且通常知道，一种蛋白质的氨基酸序列以及编码它的核苷酸序列在菌株、突变体或变异体之间有少量的差别，因此，编码基本上相同的蛋白的DNA可从属于埃希氏菌属的L-缬氨酸抗性的种、菌株、突变体和变异体中获得。
具体地说，编码与突变体小亚基基本上相同的蛋白的DNA可通过如下方法来获得：从经过突变处理的、属于埃希氏菌属的细菌或一种属于埃希氏菌属的细菌的自发突变体或变异体中，分离一种DNA，该DNA能够与具有诸如示于序列表的SEQ ID NO:1的核苷酸序列在严紧条件下杂交，并且编码具有乙酰羟酸合成酶活性的蛋白。术语“严紧条件”在这里指这样一种条件，在该条件下，特异性杂交体形成而非特异性杂交体不能形成。使用任何数值都很难清楚地表述这种条件。但是，例如，严紧条件包括这样一种条件，在该条件下，具有高度同源性的DNAs例如彼此的同源性不低于70％的DNAs能够杂交，并且彼此的同源性低于上面的介绍的DNAs不能杂交。
本发明的细菌携带有本发明的第1种DNA或第2种DNA，并具有产生L-缬氨酸的活性。这种细菌没有特别的限制，只要它具有一种涉及乙酰羟酸合成酶的L-缬氨酸生物合成途径。其例子是属于埃希氏菌属、棒状细菌和沙雷氏菌属的细菌，优选是埃希氏菌属的细菌。属于埃希氏菌属的细菌的具体的例子是大肠杆菌。
将本发明的DNA导入一种细菌的方法的例子包括，诸如细菌用含有本发明的DNA的质粒转化的方法；本发明的DNA通过同源重组整合进细菌的染色体DNA的方法等等。
本发明的DNA的表达优选被增强。表达的增强通过将本发明的DNA置于强启动子的控制之下或扩增DNA的拷贝数来完成。例如，已知lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体的PR启动子、PL启动子、tet启动子、amyE启动子和spac启动子是强启动子。而且，可以在多拷贝载体上维持DNA或将多拷贝的DNA导入染色体DNA来增加本发明的DNA的拷贝数。多拷贝载体的例子是pBR322、pTWV228、pMW119和pUC19等。
为将含有本发明的DNA的载体导入宿主细菌，可以使用任何已知的转化方法。例如，可以使用的方法有：用氯化钙处理受体细胞来增加DNA的通透性的方法，这种方法已被报道用于大肠杆菌K-12(见Mandel,M.和Higa,A.《分子生物学杂志》53卷，159页(1970))；和从处于生长期的细胞制备感受态细胞，接着将DNA导入其中的方法，这种方法已被用于枯草芽孢杆菌(见Duncan,C.H.,Wilson,G.A.和Young,F.E.《基因》1:153(1977))。除了这些，还可使用的方法是将DNA受体细胞制备成容易摄取重组DNA的原生质体或球质体，接着将重组DNA导入细胞，这种方法已知被用于枯草芽孢杆菌、放线菌和酵母(见Chang,S.和Choen,S.N.，《普通分子遗传学》168:111(1979)；Bibb,M.J.,Ward,J.M.和Hopwood,O.A.,《自然》274:398(1978)；Hinnen,A.,Hicks,J.B.和Fink,G.R.，《美国科学院院刊》75:1929(1978))，或者用于本发明的实施方案中的转化方法是电脉冲方法(参见日本专利公开No.2-207791)。
可以使用的、将本发明的DNA导入细菌染色体DNA的方法包括，使用线性化DNA的方法和使用含有温度敏感的复制起始区域的质粒的方法。此外，本发明的DNA可通过转导从在染色体上携带本发明的DNA的细菌导入一种细菌。
为将多拷贝的本发明的DNA导入一种细菌的染色体DNA，使用一种序列作为靶进行同源重组，其中该序列的多拷贝存在于染色体DNA中。就多拷贝存在于染色体DNA中的序列而言，可以使用存在于转座因子的末端的重复DNA、反向重复DNA。而且，如同在日本专利公开No.2-109985中的公开，可以将本发明的DNA整合进转座子，使其能够通过转座将多拷贝的DNA导入染色体DNA。
导入本发明的DNA的细菌可以是一种通过导入本发明的DNA而获得L-缬氨酸产生能力的细菌以及本身具有L-缬氨酸产生能力的细菌。
具有L-缬氨酸产生能力的细菌的例子包括诸如大肠杆菌VL1970(美国专利5 658 766)。此外，优选使用WO96/06926中介绍的诸如属于埃希氏菌属、生长需要硫辛酸和/或H+-ATP酶活性缺陷的L-缬氨酸生产菌，或者属于埃希氏菌属并被导入了一种能表达ilvG、ilvM、ilvE和ilvD基因的ilvGMEDA操纵子的细菌。因为ilvGMEDA操纵子的表达受L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸的控制(减弱)，优选将对减弱作用重要的区域缺失或突变，来使表达抑制对产生的L-缬氨酸脱敏。另一种途径提出引入突变(ileS或valS)来影响氨酰-tRNA合成酶，使之对相应的氨基酸具有降低的亲合性(Km增加)。而且，优选使用不表达活性苏氨酸脱氨酶的操纵子。
含有ileS17突变并且减弱作用如上所述脱敏的大肠杆菌VL1970已经在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM),GNIIgenetika,(1,Dorozhny Proezd.,,113545,Moseow,Russia)进行了保藏，保藏号为VKPM B-4411。
所用的方法，例如杂交、PCR、质粒DNA制备、DNA的消化和连接以及转化，由Sambrook,J.,Fritsche,E.F.,Maniatis,T.在《分子克隆》Cold Spring Harbor Laboratory Press,1.21(1989)中介绍。
L-缬氨酸的制备按下面的方法进行，在一种培养基中培养具有L-缬氨酸生产能力的细菌，制备缬氨酸并在培养基中积累，从培养基中回收L-缬氨酸。
在本发明中，培养、从培养基中回收和纯化L-缬氨酸等可以与传统的使用微生物生产氨基酸的发酵方法相似的方式进行。用于培养的培养基可以是一种合成培养基或一种天然培养基，只要该培养基含有碳源和氮源和矿物质，并且在需要时含有适当数量的微生物生长所需要的营养物质。碳源可包括各种碳水化合物如葡萄糖和蔗糖以及各种有机酸。根据所用微生物的同化模式，可以使用醇类包括乙醇和甘油。就氮源而言，可以使用各种铵盐如氨和硫酸铵、其他含氮化合物如胺、天然氮源如蛋白胨、大豆水解物和消化的发酵微生物。就矿物质而言，可以使用单磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、碳酸钙等。
培养优选在有氧条件下例如振荡培养、通气和搅拌培养在20至40℃的温度下优选30至38℃下进行。培养的pH通常在5至9之间，优选在6.5至7.2之间。培养物的pH可用氨、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲液进行调节。在通常情况下，1至3天的培养将导致靶L-缬氨酸在液体培养基中积累。
培养之后，固体如细胞可通过离心和膜过滤从液体培养基中除去，接着靶L-缬氨酸可通过离子交换、浓缩和结晶方法收集和纯化。
                附图简述
图1显示用于获得只含有一个突变“14Gly至Asp”的突变体ilvH基因的PCR引物；
图2显示用于获得只含有一个突变“17Ser至Phe”的突变体ilvH基因的PCR引物。
              实施本发明的最佳方式
以下参照实施例来介绍本发明。(1)大肠杆菌W3350的L-缬氨酸抗性菌株
在含有0.1mg/ml的L-缬氨酸的基础培养基上从大肠杆菌野生型菌株W3350中选择了一个L-缬氨酸抗性突变体。这样获得的突变体W3350 Val0.1 R对浓度不超过1mg/ml的L-缬氨酸具有抗性。
接着将插入了转座子Tn10(Leu::Tn10)的亮氨酸操纵子(leuABCD)通过P1转导导入W3350 Val0.1 R。从W3350 Val0.1 R Leu::Tn10转导子中，诱导了一株双突变体菌株，该菌株能够在含有20mg/ml的缬氨酸和0.05mg/ml的L-亮氨酸的基础培养基中生长。(2)L-缬氨酸生产菌株VLl991的培育
大肠杆菌VL1970(VKPM B-4411，美国专利5 658 766)被导入了一种参与抵抗高浓度的苏氨酸(＞40mg/ml)或高丝氨酸(＞5mg/ml)的基因，该基因分离自带有一个参与抗性的突变(rhtA23)的菌株B3996(美国专利5 705 371)。这样就获得了菌株VL1971。
然后通过使用P1噬菌体的转导将来自大肠杆菌VL478的蔗糖利用基因导入VL1971，获得VL1972。然后自VL1972诱导一种自发突变体VL1991，该菌株比亲本菌株长得快。(3)将L-缬氨酸抗性导入VL1991
通过P1转导将上面提到的双重突变体中含有的突变导入VL1991。从转导子中选择一种Leu+的自发突变体。该突变体被命名为VL1997。接着将插入了转座子Tn10(ilvD::Tn10)的ilvD基因通过P1转导导入VL1997，获得VL1997 ilvD::Tn10。然后用来自大肠杆菌菌株B的ilvGMEDA操纵子转导VL1997 ilvD::Tn10。从这样获得的VL1998中选择了一种自发突变体VL1999，该菌株比亲本菌株长得快。(4)L-缬氨酸生产菌株VL1999/pVL715
菌株VL1999用质粒pVL715转化，获得重组缬氨酸生产菌株VL1999/pVL715。质粒pVL715按如下方法构建。从含有ilv基因(ilvGMEDAYC)的质粒pVR12(Gavrilova等，《生物技术》(俄文)，4,No5,600-608(1988)切下含有该基因的BamHⅠ-XmalⅠDNA片段，并接着插入一种RSF1010衍生物(Chistoserdov和Tsygankov 《质粒》1986,16卷，161-167页)--pAYC32，取代pAYC32的BamHⅠ-XmalⅠDNA片段，产生质粒pVS712。然后从pVS712衍生质粒pVL715，后者按如下介绍抑制影响缬氨酰-tRNA合成酶的valS91突变(美国专利5 658 766)。将pVS712导入valS91突变体。所产生的菌株ValS91/pVS712如受体菌一样保留了缬氨酸自养性。然后选择能够在不含缬氨酸的基础培养基上生长的“回复子”。在一些回复子中，这种特性是由pVS712质粒中含有的ilvGMEDAYC基因中的一个突变引起的。从一个“回复子”中，分离了质粒pVL715。在含有pVL715的大肠杆菌菌株中，至少AHAS活性与含有pVS712的菌株相比被提高。(5)提供L-缬氨酸抗性的突变的鉴定
从W3350 Val0.1 R和VL1997中，对ilvIH基因进行了克隆和测序。ilvIH基因通过使用具有示于SEQ ID NO:3和4的序列的引物、用PCR扩增ilvIH基因的启动子区域至3’末端的DNA片段来克隆，PCR在下列条件下进行：94℃ 60秒、48℃ 30秒、72℃ 90秒、30个循环。扩增的ilvIH基因用Klenow片段处理，并克隆进pUC19载体的HincⅡ位点，产生pILVIH1和pILVIH2。用同样的方式，将野生型ilvIH操纵子从菌株W3350克隆进pUC19，获得pILVIH。
序列比较分析显示，W3350 Val0.1 R的突变体ilvIH操纵子在SEQ IDNO:1的50位核苷酸处含有一个取代：“C”至“T”，而VL1997的突变体ilvIH操纵子含有两个取代：在SEQ ID NO:1的50位核苷酸处的“C”至“T”和41位核苷酸处的“G”至“A”。这些突变导致17Ser至Phe和14Gly至Asp的氨基酸取代。17Ser至Phe和14Gly至Asp的突变分别可以被称为ilvHI1突变和ilvHI2突变。含有一个或两个这些突变的ilvH基因分别被命名为ilvH1、ilvH2和ilvH1,2。(6)从ilvH1,2突变基因分离ilvHI1突变和ilvHI2突变
为阐明ilvH1,2的每个突变的影响，使用PCR通过定点诱变分离这些突变。
为获得仅含一个突变：14Gly至Asp的突变体ilvH基因，利用如下事实，即此突变产生了一个单一的Mlu位点(图1)。因此，合成了两条具有示于SEQ ID NO:5和6的序列的引物。
使用上述引物，用PCR对质粒pILVIH1,2进行扩增，该质粒中克隆了ilvH1,2基因。这样，就制备了两翼为Mlu位点的约5kb的线性DNA片段。将此PCR片段用Mlu切割，并接着连接，产生环形的质粒pILVIH2，该质粒仅含靶突变。这也被序列分析证明。
为获得仅含一个突变：17Ser至Phe的突变体ilvH基因，设计了两条具有示于SEQ ID NO:7和8的序列的引物。
使用这些引物，用PCR对含有野生型ilvIH操纵子的质粒pILVIH进行扩增。所产生的PCR片段两翼为StuⅠ位点，该位点由用ATA(编码Ile)取代适当密码子ATT来产生。片段用StuⅠ切割并连接，产生环形质粒pILVIH1’，该质粒含有新导入的突变点17Ser至Phe。这通过对质粒的ilvH1基因进行测序来证明。(7)提供L-缬氨酸抗性的其他突变的鉴定
在以上面介绍的同样方式获得的大肠杆菌W3350的两个L-缬氨酸抗性突变体中，对ilvH基因进行了克隆和测序。结果显示，在一个突变体中，产生了位于SEQ ID NO:1的85位核苷酸的“T”取代“A”，在另一个突变体中产生了位于SEQ ID NO:1的87位核苷酸的“A”取代“C”，通过这些突变，29Asn分别被Tyr或Lys取代。29Asn至Tyr和29Asn至Lys的突变分别可以被称为ilvH3和ilvH4。从这些突变体将ilvIH操纵子克隆进pUC19，分别获得pILVIH3和pILVIH4。
用同样的方式，将ilvIH操纵子克隆进来自大肠杆菌MI262(IlvI-,IlvB-,IlvG-)的pUC19，获得pILVIH262，其中该菌株获自大肠杆菌遗传保藏中心，其AHASⅢ具有一个已知的突变ilvH612(Guardiolae等，《细菌学杂志》120:536-538(1974)；De Felice等，《细菌学杂志》120:1068-1077(1974))。pILVIH262的操纵子中的ilvH基因具有下列突变(ilvH612):SEQ ID NO:1的87位核苷酸处的“C”至“A”和SEQ ID NO:1的274位核苷酸处的“C”至“T”。通过这些突变29Asn被Lys取代，92Gln被一个终止密码子(TAG)取代。顺便提一句，MI262中的ilvIH操纵子的ilvI基因具有一个突变(ilvI614)，这样ilvI基因的表达产物不显示酶活性。用含有野生型ilvI基因的pILVIHA的BamHⅠ片段取代含有突变的ilvI基因的pILVIH262的BamHⅠ片段，获得pILVIH612。(8)将ilvH1基因导入大肠杆菌的野生型菌株
使用以前介绍的方法(Parker和Marinus,1988，《基因》73卷，531-535页)将突变体ilvH1基因导入大肠杆菌菌株W3350的染色体。这样就获得菌株W3350 ilvH1。已经证明，该菌株能抵抗高达1mg/ml的L-缬氨酸，也就是说，它显示与菌株W3350 Val0.1 R相同的抗性水平。
这样，通过对ilvH1基因以及通过定点诱变从ilvH1,2突变体的ilvH2突变分离的ilvH1突变的序列分析，我们证明了突变点：17Ser至Phe能够赋予细胞对L-缬氨酸低水平的抗性。(9)各种ilvH突变对AHASⅢ抵抗L-缬氨酸抑制的影响
突变IlvH1(17Ser至Phe)、ilvH2(14Gly至Asp)、ilvH3(29Asn至Lys)、ilvH4(29Asn至Tyr)和ilvH612(29Asn至Lys和92Gln至一个终止密码子TAG)按如下方式赋予酶AHASⅢ对L-缬氨酸抑制的抗性。也就是说，缺乏AHAS活性的大肠杆菌菌株MI262，在导入带有各种ilvIH基因的质粒之后，该菌株显示对L-缬氨酸具有不同抗性水平的酶活性(表1)。还可以发现，来自含有pILVIH2或pILVIH612质粒的菌株的AHAS显示对L-缬氨酸具有最高抗性水平。
表1各种ilvH突变对AHASⅢ抵抗L-缬氨酸抑制的影响
质粒     缬氨酸对AHAS的抑制％
    1mM     10mM
 pILVIH     70     ＞99.9
 pILVIH1     50     70
 pILVIH2     0     10
 pILVIH3     10     20
 pILVIH4     8     12
 pILVIH612     0     0
(10)各种ilvH突变对L-缬氨酸产生的影响
检测了各种ilvH突变对L-缬氨酸产生的影响。将突变导入菌株VL1970和VL1999/pVL715的染色体。顺便提一句，菌株VL1970和VL1999的亲本菌株(W3350)不表达活性的乙酰羟酸合成酶Ⅱ(AHASⅡ)，因为该亲本菌株在ilvG基因中有一个移码突变。在另一方面，菌株VL1970和VL1999表达一种活性的AHASⅡ。
在将各种ilvH突变导入菌株VL1970之后，获得了新菌株VL1970ilvH1、VL1970 ilvH2、VL1970 ilvH3、VL1970 ilvH4、VL1970 ilvH612。另外，在将各种ilvH突变导入菌株VL1999/pVL715之后，获得了新菌株VL1999 ilvH1,2/pVL715、VL1999 ilvH3/pVL715、VL1999ilvH612/pVL715。将这些菌株和相应的亲本菌株各自在37℃在一种营养肉汤中培养18小时，在含有下列组分的20×200mm试管中的3ml发酵培养基中接种0.3ml所获得的培养物，在37℃在摇床上(250r.p.m.)培养72小时。培养之后，用已知方法测定培养基中缬氨酸的积累数量和培养基在560nm处的吸收值。
结果示于表2和表3。在这些表中，ilvH+表示野生型ilvH基因。
发酵培养基组成(g/L)：葡萄糖                     80(NH4)2SO4              22K2HPO4                  2NaCl                       0.8MgSO4 *7H2O              0.8FeSO4 *5H2O              0.02MnSO4 *5H2O              0.02盐酸硫胺素                 0.2酵母抽提物                 1.0CaCO3                    30(CaCO3单独灭菌)
表2菌株VL1970中各种ilvH突变对L-缬氨酸产生的影响
菌株     OD560     L-缬氨酸(g/L)
VL1970     19.4     10.2
VL1970ilvH1     20.1     11.4
VL1970ilvH1,2     19.5     12.6
VL1970ilvH3     18.2     12.62
VL1970ilvH4     17.2     11.7
VL1970ilvH612     18.4     12.8
表3在ilvH基因中含有不同突变的菌株VL1999/pVL715的L-缬氨酸产生
菌株     OD560     L-缬氨酸(g/L)
VL1999 ilVH+/pVL715     17.6     18.7
VL1999 ilVH1,2/pVL715     18.9     23.4
VL1999 ilVH3/pVL715     19.4     20.6
VL1999 ilVH612/pVL715     17.7     20.2
由表2和表3可以看出，导入上面介绍的ilvH突变提高了各缬氨酸产生菌株的缬氨酸产量。而且，ilvH1和ilvH2突变的组合可产生最好的结果。
将含有各种突变体ilvH基因的ilvIH操纵子的pUC19衍生物导入菌株W3350。顺便提一句，菌株W3350不表达活性的乙酰羟酸合成酶Ⅱ(AHASⅡ)，因为该亲本菌株在ilvG基因中有一个移码突变。从表4可以看出，所获得的转化子产生L-缬氨酸，并且含有质粒pILVIH1,2的菌株产量最高。
表4携带含不同突变体ilvH基因的质粒的菌株W3350的L-缬氨酸产量
菌株     OD560     L-缬氨酸(g/L)
W3350     21.4     0
W3350/pILVIH1     13.8     2.3
W3350/pILVIH1,2     10.5     8.2
W3350/pILVIH3.     11.7     5.9
W3350/pILVIH4     16.4     5.5
以前本发明的发明者们观察到，在L-缬氨酸发酵过程中，生产细胞中的AHAS活性(主要由AHASⅡ提供)逐渐降低。已经显示，AHASⅢ在45℃的半衰期是144分钟，而AHASⅡ的半衰期是44分钟。(Alexander-Caudle等，《细菌学杂志》172卷，3060-3065(1990))。这可能提示，AHASⅢ的较高的热稳定性反应了该酶普遍增加的稳定性。因此，我们认为L-缬氨酸抗性的AHASⅢ对L-缬氨酸的产量具有正向的影响，因为它与AHASⅡ相比具有较高的稳定性。
                    序列表<110>Ajinomoto,Co.,Inc.<120>突变体ilvH基因和制备L-缬氨酸的方法<130>0P969<141>2000--<150>RU-2000101678<151>2000-01-26<160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>492<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(489)<400>1atg cgc cgg ata tta tca gtc tta ctc gaa aat gaa tca ggc gcg tta  48Met Arg Arg Ile Leu Ser Val Leu Leu Glu Asn Glu Ser Gly Ala Leu1               5                  10                  15tcc cgc gtg att ggc ctt ttt tcc cag cgt ggc tac aac att gaa agc  96Ser Arg Val Ile Gly Leu Phe Ser Gln Arg Gly Tyr Asn Ile Glu Ser
        20                   25                 30ctg acc gtt gcg cca acc gac gat ccg aca tta tcg cgt atg acc atc  144Leu Thr Val Ala Pro Thr Asp Asp Pro Thr Leu Ser Arg Met Thr Ile
    35              40                      45cag acc gtg ggc gat gaa aaa gta ctt gag cag atc gaa aag caa tta  192Gln Thr Val Gly Asp Glu Lys Val Leu Glu Gln Ile Glu Lys Gln Leu
50                  55                   60cac aaa ctg gtc gat gtc ttg cgc gtg agt gag ttg ggg cag ggc gcg  240His Lys Leu Val Asp Val Leu Arg Val Ser Glu Leu Gly Gln Gly Ala65                 70                   75                   80cat gtt gag cgg gaa atc atg ctg gtg aaa att cag gcc agc ggt tac  288His Val Glu Arg Glu Ile Met Leu Val Lys Ile Gln Ala Set Gly Tyr
            85                  90                   95ggg cgt gac gaa gtg aaa cgt aat acg gaa ata ttc cgt ggg caa att  336Gly Arg Asp Glu Val Lys Arg Asn Thr Glu Ile Phe Arg Gly Gln Ile
        100                 105                 110atc gat gtc aca ccc tcg ctt tat acc gtt caa tta gca ggc acc agc  384Ile Asp Val Thr Pro Ser Leu Tyr Thr Val Gln Leu Ala Gly Thr Ser
    115                 120                 125ggt aag ctt agt gca ttt tta gca tcg att cgc gat gtg gcg aaa att  432Gly Lys Leu Ser Ala Phe Leu Ala Ser Ile Arg Asp Val Ala Lys Ile130                  135                 140gtg gag gtt gct cgc tct ggt gtg gtc gga ctt tcg cgc ggc gat aaa  480Val Glu Val Ala Arg Ser Gly Val Val Gly Leu Ser Arg Gly Asp Lys145                 150                 155                 160ata atg cgt tga                                                  492Ile Met Arg<210>2<211>163<212>PRT<213>大肠杆菌<400>2Met Arg Arg Ile Leu Ser Val Leu Leu Glu Asn Glu Ser Gly Ala Leu1               5                    10                  15Ser Arg Val Ile Gly Leu Phe Ser Gln Arg Gly Tyr Asn Ile Glu Ser
        20                   25                  30Leu Thr Val Ala Pro Thr Asp Asp Pro Thr Leu Ser Arg Met Thr Ile
    35                  40                   45Gln Thr Val Gly Asp Glu Lys Val Leu Glu Gln Ile Glu Lys Gln Leu
50                   55                  60His Lys Leu Val Asp Val Leu Arg Val Ser Glu Leu Gly Gln Gly Ala65                  70                   75                 80His Val Glu Arg Glu Ile Met Leu Val Lys Ile Gln Ala Ser Gly Tyr
             85                  90                  95Gly Arg Asp Glu Val Lys Arg Asn Thr Glu Ile Phe Arg Gly Gln Ile
        100                 105                 110Ile Asp Val Thr Pro Ser Leu Tyr Thr Val Gln Leu Ala Gly Thr Ser
    115                 120                 125Gly Lys Leu Ser Ala Phe Leu Ala Ser Ile Arg Asp Val Ala Lys Ile
130                 135                 140Val Glu Val Ala Arg Ser Gly Val Val Gly Leu Ser Arg Gly Asp Lys145                 150                 155                 160Ile Met Arg<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>3gacatgaatg tctggttt                                    18<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>4tcaacgcatt attttatcg                                   19<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>5taaacgcgtt atcccgcgtg attg                             24<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>6gccacgcgtc tgattcattt tcga                             24<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>7ctcgaggcct tttttcccag cgtgg                        25<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>8ctcgaggcct atcacgcgga aataacg                      27

Claims (9)

1．一种编码乙酰羟酸合成酶同功酶Ⅲ的小亚基的DNA，它来源于大肠杆菌，它具有一个突变，即对应于SEQ ID NO:2中17号氨基酸的丝氨酸残基的氨基酸残基被另一种残基取代；或者它具有两个突变，即对应于SEQ ID NO:2中17号氨基酸的丝氨酸残基和对应于14号氨基酸的甘氨酸残基的氨基酸残基被另一种残基取代。
2．权利要求1的DNA，其中对应于17号氨基酸的丝氨酸残基的氨基酸残基的突变是丝氨酸残基被苯丙氨酸残基取代，对应于14号氨基酸的甘氨酸残基的氨基酸残基的突变是甘氨酸残基被天冬氨酸残基取代。
3．一种编码来源于大肠杆菌的乙酰羟酸合成酶同功酶Ⅲ的DNA，该酶不受L-缬氨酸的抑制，并且具有催化从丙酮酸产生α-乙酰乳酸和从α-丁酮酸及丙酮酸产生α-乙酰-α羟基丁酸这两种反应的活性。
4．权利要求3的DNA，其中DNA编码乙酰羟酸合成酶同功酶Ⅲ的大亚基和小亚基，小亚基带有一个突变，即SEQ ID NO:2中对应于17号氨基酸的丝氨酸残基的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代，或者对应于29号氨基酸的天冬酰胺残基的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代，或者自91号氨基酸下游的一个C末端片段缺失，或者选自上述突变和对应于SEQ ID NO:2中14号氨基酸的甘氨酸残基的氨基酸残基被另一种氨基酸残基取代的突变的2种或多种突变的组合。
5．权利要求4的DNA，其中对应于17号氨基酸的丝氨酸残基的氨基酸残基的突变是丝氨酸残基被苯丙氨酸残基取代，对应于29号氨基酸的天冬氨酸残基的氨基酸残基的突变是天冬氨酸残基被赖氨酸或酪氨酸残基取代，对应于14号氨基酸的甘氨酸残基的氨基酸残基的突变是甘氨酸残基被天冬氨酸残基取代。
6．在其染色体DNA或质粒上携带权利要求1或3的DNA并具有产生L-缬氨酸能力的细菌。
7．权利要求6的细菌，其中所说DNA的表达被增强。
8．权利要求7的细菌，其中表达通过将所说DNA置于强启动子的控制之下或增加所说DNA的拷贝数来增强；
9．一种制备L-缬氨酸的方法，包括以下步骤：在一种培养基中培养权利要求6的细菌，在培养基中生产和积累L-缬氨酸，并从培养基回收L-缬氨酸。
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