DE112016001706T5

DE112016001706T5 - Verfahren zur Herstellung von Lactam

Info

Publication number: DE112016001706T5
Application number: DE112016001706.5T
Authority: DE
Inventors: Sang Yup Lee; Tong Un Chae; Chan Woo Song
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority date: 2015-04-13
Filing date: 2016-04-11
Publication date: 2018-01-04
Anticipated expiration: 2036-04-12
Also published as: KR101839595B1; DE112016001706B4; CN107438667A; US20180037896A1; US10683512B2; CN107438667B; JP2018510614A; JP6602872B2; KR20160122073A

Abstract

Die vorliegende Offenbarung bezieht sich auf einen rekombinanten Mikroorganismus, der Lactam aus einer Omega-Aminosäure produzieren kann, wobei ein Gen, das eine beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase codiert, in einen Mikroorganismus eingeführt ist, der inhärent einen Omega-Aminosäure-Biosynthese-Stoffwechselweg aufweist oder in den ein Omega-Aminosäure-Biosynthese-Stoffwechselweg eingeführt ist, und auf ein Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Lactamen und Omega-Aminoacyl-CoAs unter Verwendung desselben. Der rekombinante Mikroorganismus und das Verfahren zur Herstellung des Lactams gemäß der vorliegenden Offenbarung eignen sich für die Herstellung einer Vielzahl von Lactamen, wie Propiolactam, 2-Pyrrolidon, Valerolactam, Caprolactam und Heptanolactam, aus einer Vielzahl von Omega-Aminosäuren.

Description

Hintergrund
Gebiet
Die vorliegende Offenbarung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Lactams unter Verwendung eines Enzyms und insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung eines Lactams unter Verwendung eines Enzyms, das eine Omega-Aminosäure in ein Omega-Aminoacyl-CoA umwandelt, oder auf einen rekombinanten Mikroorganismus, in den ein das Enzym codierendes Gen eingeführt wurde.
Beschreibung des Standes der Technik
In letzter Zeit richtete sich wegen des Problems des zunehmenden Verbrauchs der Ölreserven und wegen Umweltproblemen große Aufmerksamkeit auf die Herstellung verschiedener nachhaltiger chemischer Mehrwertprodukte unter Verwendung von Mikroorganismen. Viele Studien wurden durchgeführt, um unter den verschiedenen Mehrwertverbindungen verschiedene Lactame herzustellen, die Vorläufer von Nylon sind. Bisher gab es jedoch noch keine erfolgreichen Beispiele für die Herstellung verschiedener Lactame unter Verwendung rekombinanter Mikroorganismen.
Es gibt jedoch viele Berichte von rekombinanten Mikroorganismen, die Omega-Aminosäuren, bei denen es sich um Vorläufer von Lactamen handelt, mit Hilfe herkömmlicher Stoffwechseltechnikverfahren herstellen. Bekannte Beispiele waren die Herstellung von Omega-Aminosäuren wie gamma-Aminobuttersäure (GABA), 5-Aminovaleriansäure (5AVA) und 6-Aminocapronsäure (6ACA), bei denen es sich um Vorläufer von 2-Pyrrolidon, Valerolactam und Caprolactam als typische Beispiele für ein Lactam handelt.
Zuerst werden Produktionsstudien für GABA unter Verwendung rekombinanter Mikroorganismen auf der Basis von Corynebacterium (Shi et al., Biotechol. Lett. 33: 2469–2474, 2011; Shi et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 40: 1285–1296, 2013; Takahashi et al., Enzyme Microb. Tech. 51: 171–176, 2012) und Milchsäurebakterien (Li et al., Microb. Cell. Fact. 9: 85, 2010) durchgeführt. 5AVA wurde mit Hilfe von Escherichia coli hergestellt (Park et al., Metab. Eng. 16: 42–47, 2013; Adkins et al., Biotechnol. Bioeng. 110: 1726–1734, 2013). Schließlich wurde 6ACA erfolgreich für die 6ACA-Produktion ( US 2014/0134681 ) über 5-Formylvaleriansäure ( US 2012/0028320 A1 ) auf der Basis des Stoffwechselwegs der methanogenen Bakterien patentiert.
Eine direkte Lactamherstellung unter Verwendung rekombinanter Mikroorganismen wurde nicht berichtet, aber es gibt ein Patent, das einen Stoffwechselzyklus entwirft, der in Mikroorganismen Caprolactam erzeugen kann, bei dem es sich um eines der anspruchsvollsten Lactame handelt ( US 2013/0303723 A1 ). In diesem Patent gibt es jedoch keine tatsächlichen Daten über die Caprolactamproduktion und das Enzym, das tatsächlich bewirken könnte, dass ein solcher Stoffwechselweg stattfindet.
Dementsprechend haben sich die Erfinder bemüht, ein Verfahren zur effizienten Herstellung verschiedener Lactame unter Verwendung von Mikroorganismen zu entwickeln. Als Ergebnis haben sie ein Enzym gefunden, das eine Omega-Aminosäure als Substrat nimmt und sie in Omega-Aminoacyl-CoA umwandelt. Es wurde bestätigt, dass ein Lactam unter Verwendung des Enzyms selbst oder eines rekombinanten Mikroorganismus, in den das Gen eingeführt wurde, hergestellt werden kann, wodurch die vorliegende Offenbarung fertiggestellt wurde.
Kurzbeschreibung
Ein Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, einen rekombinanten Mikroorganismus bereitzustellen, in den ein Gen, das ein Enzym codiert, eingeführt ist, wobei das Enzym eine Omega-Aminosäure in ein Omega-Aminoacyl-CoA umwandelt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung verschiedener Lactame aus Omega-Aminosäuren unter Verwendung des rekombinanten Mikroorganismus anzugeben.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung verschiedener Lactame aus Omega-Aminosäuren unter Verwendung eines Enzyms, das Omega-Aminosäuren in Omega-Aminoacyl-CoAs umwandelt, anzugeben.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung verschiedener Omega-Aminoacyl-CoAs aus Omega-Aminosäuren unter Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus anzugeben, in den ein Gen, das ein Enzym codiert, eingeführt ist, wobei das Enzym Omega-Aminosäuren in Omega-Aminoacyl-CoAs umwandelt.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung verschiedener Omega-Aminoacyl-CoAs aus Omega-Aminosäuren unter Verwendung eines Enzyms, das Omega-Aminosäuren in Omega-Aminoacyl-CoAs umwandelt, anzugeben.
Um das obige Ziel zu erreichen, stellt die vorliegende Offenbarung einen rekombinanten Mikroorganismus bereit, der Lactam aus einer Omega-Aminosäure produzieren kann, wobei ein Gen, das eine beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase codiert, in einen Mikroorganismus eingeführt ist, der inhärent einen Omega-Aminosäure-Biosynthese-Stoffwechselweg aufweist oder in den ein Omega-Aminosäure-Biosynthese-Stoffwechselweg eingeführt ist.
Die vorliegende Offenbarung gibt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Lactams aus einer Omega-Aminosäure unter Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus an, in den ein beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase-Gen eingeführt ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Kultivieren des rekombinanten Mikroorganismus, so dass er das Lactam produziert; und (b) Gewinnen des produzierten Lactams.
Die vorliegende Offenbarung gibt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Lactams aus einer Omega-Aminosäure unter Verwendung von beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase an, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Mischen der beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase mit einer Reaktionslösung, die die Omega-Aminosäure enthält, und dann Umsetzen zur Herstellung eines Omega-Aminoacyl-CoA; und (b) Herstellen eines Lactams durch Bilden einer Ringstruktur aus der hergestellten Omega-Aminoacyl-CoA.
Die vorliegende Offenbarung gibt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Omega-Aminoacyl-CoA aus einer Omega-Aminosäure unter Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus an, in den ein beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase-Gen eingeführt ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Kultivieren des rekombinanten Mikroorganismus, so dass er das Omega-Aminoacyl-CoA produziert; und (b) Gewinnen des produzierten Omega-Aminoacyl-CoA.
Die vorliegende Offenbarung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung eines Omega-Aminoacyl-CoA aus einer Omega-Aminosäure unter Verwendung einer beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase, wobei das Verfahren einen Schritt des Mischens einer beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase in einer Reaktionslösung, die die Omega-Aminosäure enthält, und dann Umsetzen zur Herstellung des Omega-Aminoacyl-CoA umfasst.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt Wege zur Herstellung verschiedener Lactame aus Omega-Aminosäuren über Omega-Aminoacyl-Coenzym-A-Transferasen.
2 zeigt ein Plasmid, das pET30α-his-act, in das ein his-markiertes act-Gen eingefügt ist, zur Reinigung einer beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase überexprimiert.
3 ist ein SDS-PAGE-Foto einer gereinigten beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase.
4 zeigt die Ergebnisse einer Analyse von GABA-CoA, das unter in-vitro-Bedingungen unter Verwendung eines Enzyms, und zwar einer beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase, hergestellt wurde.
5 zeigt die Ergebnisse einer Analyse von 6ACA-CoA, das unter in-vitro-Bedingungen unter Verwendung eines Enzyms, und zwar einer beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase, hergestellt wurde.
6 zeigt die Ergebnisse einer Analyse von 2-Pyrrolidon, das unter in-vitro-Bedingungen unter Verwendung eines Enzyms, und zwar einer beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase, hergestellt wurde.
7 zeigt die Ergebnisse einer Analyse von Caprolactam, das unter in-vitro-Bedingungen unter Verwendung eines Enzyms, und zwar einer beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase, hergestellt wurde.
8 zeigt ein pTac15k_act-Plasmid, das für die Expression einer beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase in einem Mikroorganismus hergestellt wurde und in das ein act-Gen eingefügt ist.
9 zeigt die Ergebnisse einer Analyse von 2-Pyrrolidon, das durch Kultivieren des rekombinanten Mikroorganismus, in den der Vektor eingeführt ist, hergestellt wurde.
10 zeigt die Ergebnisse einer Analyse von 7-AHA-CoA, das unter in-vitro-Bedingungen unter Verwendung eines Enzyms, und zwar einer beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase, hergestellt wurde.
11 zeigt die Ergebnisse einer Analyse von Valerolactam, das unter in-vitro-Bedingungen unter Verwendung eines Enzyms, und zwar einer beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase, hergestellt wurde.
12 zeigt einen Stoffwechselweg zur Herstellung von Valerolactam aus Lysin, der in einer beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung durchgeführt wird.
13 zeigt ein pEKEx1_act-Plasmid, das für die Expression einer beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase in einem Mikroorganismus hergestellt wurde und in das ein act-Gen eingefügt ist.
14 zeigt ein pEKEx1_gadB-Plasmid, das für die Expression einer Glutaminsäure-Decarboxylase in einem Mikroorganismus hergestellt wurde und in das ein gadB-Gen eingefügt ist.
15 zeigt ein pEKEx1_act_gadB-Plasmid, das für die Expression einer beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase und einer Glutaminsäure-Decarboxylase in einem Mikroorganismus hergestellt wurde und in das ein act- und ein gadB-Gen eingefügt sind.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Soweit sie nicht anders definiert sind, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke dieselbe Bedeutung, wie es der Fachmann auf dem Gebiet, zu dem die vorliegende Offenbarung gehört, üblicherweise versteht.
Im Allgemeinen ist die hier verwendete Nomenklatur wohlbekannt und wird in der Technik häufig verwendet.
In der vorliegenden Offenbarung wird bestätigt, dass ein Enzym, beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase, neben beta-Alanin, das ein natürliches Omega-Aminosäure-Substrat ist, verschiedene Omega-Aminosäuren als Substrat nimmt, um ein entsprechendes Omega-Aminoacyl-Coenzym-A zu bilden, dieses Omega-Aminoacyl-Coenzym-A ohne die Hilfe von Enzymen in ein entsprechendes Lactam umgewandelt wird und es somit möglich ist, ein System zu etablieren, das verschiedene Lactame unter Verwendung von Enzymen aus Omega-Aminosäuren herstellen kann (1).
In der vorliegenden Offenbarung wurde ein Experiment durchgeführt, um die Möglichkeit der Produktion eines Lactams mit Hilfe eines Mikroorganismus zu untersuchen, in den ein Gen eingeführt wurde, das eine beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase codiert, bei dem es sich um eines der Enzyme handelt, die eine Omega-Aminosäure in ein Omega-Aminoacyl-CoA umwandeln. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass ein Lactam erzeugt wurde, wenn ein Mikroorganismus, in den das Enzym-codierende Gen eingeführt wurde, verwendet wurde.
Das heißt, in einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung wurde, um zu bestätigen, ob 2-Pyrrolidon über GABA-Coenzym A durch GABA, bei dem es sich um eine repräsentative Omega-Aminosäure in Mikroorganismen handelt, produziert wird, ein pTac15k_act-Vektor, in den act, ein Gen, das eine beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase codiert, kloniert worden war, hergestellt (siehe 8) und dann in wildes Escherichia coli eingeführt. Weiterhin wurde eine Glutaminsäure, ein Vorläufer von GABA, mit Glucose als Kohlenstoffquelle zugeführt, um GABA in Mikroorganismen bereitzustellen. Als Ergebnis des Kultivierens des rekombinanten Mikroorganismus unter den obigen Kulturbedingungen konnte bestätigt werden, dass 2-Pyrrolidon, eine Art von Lactam, in der Kulturlösung des Mikroorganismus erzeugt wurde (siehe 9).
Daher bezieht sich die vorliegende Offenbarung in einem ihrer Aspekte auf einen rekombinanten Mikroorganismus, der aus einer Omega-Aminosäure Lactam erzeugen kann, wobei ein Gen, das eine beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase codiert, in einen Mikroorganismus eingeführt wird, der inhärent einen Omega-Aminosäure-Biosynthese-Stoffwechselweg aufweist oder in den ein Omega-Aminosäure-Biosynthese-Stoffwechselweg eingeführt ist.
Der Ausdruck ”inhärent” in der vorliegenden Offenbarung bezeichnet den eigenen Stoffwechselweg eines Mikroorganismus, den er aufweist, ohne dass er durch genetische Rekombination zu einem Mikroorganismus hinzugefügt wurde. Zum Beispiel ist der Stoffwechselweg von Escherichia coli, der GABA aus Glutaminsäure erzeugt und der in einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung durchgeführt wird, ein Weg der Biosynthese von Glutaminsäure aus Glucose durch Glycolyse und dann durch Erzeugen von GABA durch intrinsische Glutaminsäure-Decarboxylase (GadA oder GadB).
In der vorliegenden Offenbarung kann der Omega-Aminosäure-Biosyntheseweg dadurch eingeführt werden, dass man ein entsprechendes Gen einführt. Zum Beispiel kann er dadurch gekennzeichnet sein, dass man einen Stoffwechselweg für die Biosynthese von 5-Aminovaleriansäure (5AVA) aus Lysin in Escherichia coli einführt.
In der vorliegenden Offenbarung kann der 5-Aminovaleriansäure-Biosyntheseweg aus dem Lysin, ohne darauf beschränkt zu sein, dadurch gekennzeichnet sein, dass ein Gen, das delta-Aminovaleramidase codiert, eingeführt wird und es sich bei dem Gen, das delta-Aminovaleramidase codiert, um ein von Pseudomonas putida abgeleitetes davA-Gen und bei dem Gen, das Lysin-2-Monooxygenase codiert, um ein von Pseudomonas putida abgeleitetes davB-Gen handelt.
In der vorliegenden Offenbarung kann das Gen, das die beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase codiert, ohne darauf beschränkt zu sein, dadurch gekennzeichnet sein, dass es sich um ein von Clostridium propionicum abgeleitetes act handelt.
In der vorliegenden Offenbarung kann das von Clostridium propionicum abgeleitete act-Gen, ohne darauf beschränkt zu sein, dadurch gekennzeichnet sein, dass es durch SEQ ID Nr. 1 beschrieben wird.
In der vorliegenden Offenbarung kann die beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase, ohne darauf beschränkt zu sein, dadurch gekennzeichnet sein, dass sie durch SEQ ID Nr. 2 beschrieben wird.
In der vorliegenden Offenbarung kann das Enzym dadurch gekennzeichnet sein, dass die Homologie, d. h. die Sequenzähnlichkeit, 50% oder mehr, vorzugsweise 60% oder mehr und besonders bevorzugt 70% oder mehr beträgt.
In der vorliegenden Offenbarung kann das Lactam jede chemische Substanz sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine heterocyclische Ringstruktur aufweist und eine Amidbindung im Ring aufweist, kann aber vorzugsweise dadurch gekennzeichnet sein, dass sie aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Propiolactam, 2-Pyrrolidon, Valerolactam, Caprolactam, Heptanolactam, Octanolactam, Nonanolactam, Decanolactam, Undecanolactam und Dodecanolactam besteht.
In der vorliegenden Offenbarung kann die Omega-Aminosäure jede chemische Substanz sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine funktionelle Amin- und Carbonsäuregruppe gleichzeitig aufweist, kann aber vorzugsweise dadurch gekennzeichnet sein, dass sie aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus beta-Alanin, gamma-Aminobuttersäure (GABA), 5-Aminovaleriansäure (5AVA), 6-Aminocapronsäure (6ACA), 7-Aminoheptansäure (7AHA), 8-Aminooctansäure, 9-Aminononansäure, 10-Aminodecansäure, 11-Aminoundecansäure und 12-Aminododecansäure besteht.
In der vorliegenden Offenbarung kann das beta-Alanin, ohne darauf beschränkt zu sein, dadurch gekennzeichnet sein, dass es einen Weg der Biosynthese durch L-Aspartat-α-decarboxylase aus Asparaginsäure aufweist, das GABA kann, ohne darauf beschränkt zu sein, dadurch gekennzeichnet sein, dass es einen Weg der Biosynthese durch Glutaminsäure-Carboxylase (GadA oder GadB) aus Glutaminsäure aufweist, das 5AVA kann dadurch gekennzeichnet sein, dass es einen Weg der Biosynthese durch delta-Aminovaleramidase (DavA) und Lysin-2-monooxygenase (DavB) aus Lysin aufweist, 6ACA und 7AHA können dadurch gekennzeichnet sein, dass sie einen Weg der Biosynthese durch Homocitrat-Synthase, 3-Isopropylmalat-Dehydratase, Isopropylmalat/Isohomocitrat-Dehydrogenase, verzweigtkettige α-Ketosäure-Decarboxylase und Pyruvat-Transaminase aus alpha-keto-Glutaminsäure aufweisen.
In der vorliegenden Offenbarung können die Omega-Aminosäuren, ohne darauf beschränkt zu sein, dadurch gekennzeichnet sein, dass sie aus einer Kohlenstoffquelle biosynthetisiert werden, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Monosacchariden, Disacchariden und Polysacchariden einschließlich Glucose, Saccharose, Galactose, Maltose, Xylose, Glycerin, Fructose und Zuckerrohr besteht.
In der vorliegenden Offenbarung kann der rekombinante Mikroorganismus jeder Mikroorganismus sein, der eine Omega-Aminosäure, die ein Vorläufer davon ist, produzieren oder als Kohlenstoffquelle nutzen kann, und kann vorzugsweise dadurch gekennzeichnet sein, dass er aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bakterien, Hefe und Pilzen besteht.
In der vorliegenden Offenbarung können die Bakterien, ohne darauf beschränkt zu sein, dadurch gekennzeichnet sein, dass sie aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus der Gattung Corynebacterium und aus Escherichia coli besteht.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Offenbarung bezieht sie sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Lactams aus einer Omega-Aminosäure, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Kultivieren des rekombinanten Mikroorganismus gemäß der obigen Beschreibung, so dass er ein Lactam produziert; (b) Gewinnen des produzierten Lactams.
In der vorliegenden Offenbarung kann das Verfahren zum Kultivieren des rekombinanten Mikroorganismus durchgeführt werden, indem man ein herkömmlicherweise bekanntes Kulturverfahren verwendet. Es kann auch ein anderes Medium als eine gesüßte Flüssigkeit, wie Molke und Maisquellwasser (CSL), verwendet werden, und verschiedene Verfahren, wie eine Fed-Batch-Kultur und eine kontinuierliche Kultur, können neben dem spezifischen Kulturmedium und dem speziellen Kulturverfahren, die in den Beispielen der vorliegenden Offenbarung verwendet werden, verwendet werden (Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26: 63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58: 663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25: 111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54: 23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72: 41, 2001).
Indessen wurde vorhergesagt, dass dann, wenn das Enzym unter in-vitro-Bedingungen verwendet würde, verschiedene Lactame aus Omega-Aminosäuren hergestellt werden könnten.
In einer anderen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung wurde ein Enzymassay durchgeführt, um zu bestätigen, dass die beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase auf die Omega-Aminosäuren, wie GABA, 6ACA und 7AHA, sowie auf beta-Alanin, ein natürliches Substrat, wirkt. Um ein gereinigtes Enzym zu erhalten, wurde zuerst ein pET30α_his_act-Vektor hergestellt, indem man ein his-act-Gen, das eine beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase codiert und an das ein his-Tag gebunden wurde, klonierte (2), und die beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase mit dem his-Tag wurde gereinigt (3). Das gereinigte Protein, das Acetyl-Coenzym-A und GABA, 6ACA oder 7AHA wurden hinzugefügt, um den Enzymassay durchzuführen. Danach wurde die Produktion von GABA-Coenzym A, 6ACA-Coenzym A und 7AHA-Coenzym A, Formen von Omega-Aminoacyl-Coenzym-A, bei den jeweiligen Omega-Aminosäuren mit Hilfe von HPLC-MS/MS oder HPLC-MS bestätigt (4, 5 und 10).
In noch einer anderen beispielhaften Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung wurden Experimente durchgeführt, um zu bestätigen, dass GABA-Coenzym-A, 5AVA-Coenzym-A und 6ACA-Coenzym-A, die zu den repräsentativen Omega-Aminoacyl-CoA gehören, ohne die Hilfe von Enzymen in das entsprechende Lactam umgewandelt werden. Ein Enzymassay zeigte, dass GABA-Coenzym-A, 5AVA-Coenzym-A und 6ACA-Coenzym-A ohne Zugabe jeglichen Enzyms produziert wurden, was zur Bildung von 2-Pyrrolidon, Valerolactam bzw. Caprolactam führte (6, 7 und 11).
Dementsprechend gibt die vorliegende Offenbarung in einem anderen ihrer Aspekte ein Verfahren zur Herstellung eines Lactams aus einer Omega-Aminosäure an, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Mischen der beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase mit einer Reaktionslösung, die die Omega-Aminosäure enthält, und dann Umsetzen zur Herstellung eines Omega-Aminoacyl-CoA; und (b) Herstellen des Lactams durch Bilden einer Ringstruktur aus der hergestellten Omega-Aminoacyl-CoA.
In der vorliegenden Offenbarung kann das Gen, das die beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase codiert, ohne darauf beschränkt zu sein, dadurch gekennzeichnet sein, dass es sich um ein von Clostridium propionicum abgeleitetes act handelt.
In der vorliegenden Offenbarung kann das Lactam jede chemische Substanz sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine heterocyclische Ringstruktur aufweist und eine Amidbindung im Ring aufweist, kann aber vorzugsweise dadurch gekennzeichnet sein, dass sie aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Propiolactam, 2-Pyrrolidon, Valerolactam, Caprolactam, Heptanolactam, Octanolactam, Nonanolactam, Decanolactam, Undecanolactam und Dodecanolactam besteht.
In noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Offenbarung bezieht sie sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Omega-Aminoacyl-CoA aus einer Omega-Aminosäure unter Verwendung des rekombinanten Mikroorganismus, in den ein beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase-Gen eingeführt ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Kultivieren des rekombinanten Mikroorganismus, so dass er das Omega-Aminoacyl-CoA produziert; (b) Gewinnen des produzierten Omega-Aminoacyl-CoA.
In der vorliegenden Offenbarung kann der Schritt des Gewinnens des produzierten Omega-Aminoacyl-CoA, ohne darauf beschränkt zu sein, dadurch gekennzeichnet sein, dass er die Schritte des Aufschließens von Zellen unter Erhalt eines Gemischs, das Omega-Aminoacyl-CoA enthält, und des Gewinnens des Omega-Aminoacyl-CoA durch ein Reinigungsverfahren umfasst.
Der Zellaufschluss der vorliegenden Offenbarung kann durch verschiedene Methoden erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind, und ist vorzugsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, dadurch gekennzeichnet, dass er mit Hilfe eines Schallwellenverfahrens durchgeführt wird. Das Reinigungsverfahren kann, ohne darauf beschränkt zu sein, dadurch gekennzeichnet sein, dass es unter Verwendung eines Chromatogramms durchgeführt wird.
In der vorliegenden Offenbarung ist der Schritt des Gewinnens des produzierten Omega-Aminoacyl-CoA dadurch gekennzeichnet, dass er weiterhin einen Schritt des Immobilisierens der Zellen vor dem Aufschluss der Zellen oder einen Schritt des Behandelns der Verbindungen, um die Bildung eines Rings des Omega-Aminoacyl-CoA zu verhindern, umfasst.
In noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Offenbarung bezieht sie sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Omega-Aminoacyl-CoA aus einer Omega-Aminosäure, wobei das Verfahren den Schritt des Mischens einer beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase in einer Reaktionslösung, die die Omega-Aminosäure enthält, und dann Umsetzen zur Herstellung des Omega-Aminoacyl-CoA umfasst.
In der vorliegenden Offenbarung kann das Gen, das die beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase codiert, ohne darauf beschränkt zu sein, dadurch gekennzeichnet sein, dass es sich um ein von Clostridium propionicum abgeleitetes act handelt.
In der vorliegenden Offenbarung kann die Omega-Aminosäure jede chemische Substanz sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine funktionelle Amin- und Carbonsäuregruppe gleichzeitig aufweist, kann aber vorzugsweise dadurch gekennzeichnet sein, dass sie aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus beta-Alanin, gamma-Aminobuttersäure (GABA), 5-Aminovaleriansäure (5AVA), 6-Aminocapronsäure (6ACA), 7-Aminoheptansäure (7AHA), 8-Aminooctansäure, 9-Aminononansäure, 10-Aminodecansäure, 11-Aminoundecansäure und 12-Aminododecansäure besteht.
In der vorliegenden Offenbarung bedeutet der Ausdruck ”Vektor” ein DNA-Produkt, das eine DNA-Sequenz enthält, die funktionell mit einer geeigneten regulatorischen Sequenz verknüpft ist, und innerhalb eines geeigneten Wirts DNA exprimieren kann. Der Vektor kann ein Plasmid, ein Phagenpartikel oder einfach eine potentielle Genominsertion sein. Sobald er durch Transformation in den geeigneten Wirt gelangt ist, kann der Vektor sich unabhängig vom Wirtsgenom replizieren und funktionieren oder in einigen Fällen in das Genom selbst integrieren. Da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form des derzeitigen Vektors ist, werden die Ausdrücke ”Plasmid” und ”Vektor” im Zusammenhang der vorliegenden Offenbarung zuweilen synonym verwendet. Die vorliegende Offenbarung umfasst jedoch auch andere Formen von Vektoren, die Funktionen aufweisen, die zu den bekannten oder in der Technik bekannten äquivalent sind. Typische Expressionsvektoren für die Expression in einer Säugerzellkultur beruhen zum Beispiel auf pRK5 ( EP 307 247 ), pSV16B ( WO 91/08291 ) und pVL1392 (Pharmingen).
Der Ausdruck ”expressionsregulatorische Sequenz” bedeutet eine DNA-Sequenz, die für die Expression einer codierenden Sequenz, welche funktionell mit einem bestimmten Wirtsorganismus verknüpft ist, wesentlich ist. Eine solche regulatorische Sequenz umfasst einen Promotor zur Durchführung der Transkription, irgendwelche Operatorsequenzen zur Steuerung dieser Transkription, eine Sequenz, die eine geeignete mRNA-Ribosomenbindungsstelle codiert, und eine Sequenz, die die Termination der Transkription und der Translation steuert. Zum Beispiel umfasst eine regulatorische Sequenz, die für eine prokaryontische Zelle geeignet ist, einen Promotor, irgendwelche Operatorsequenzen und eine Ribosomenbindungsstelle. Die eukaryontische Zelle umfasst einen Promotor, ein Polyadenylierungssignal und einen Enhancer. Der Faktor mit dem größten Einfluss auf das Expressionsniveau des Gens in dem Plasmid ist ein Promotor. Als Promotor für eine hohe Expression werden vorzugsweise ein SRα-Promotor, ein vom Cytomegalovirus abgeleiteter Promotor usw. verwendet.
Um die DNA-Sequenz der vorliegenden Offenbarung zu exprimieren, kann eine Vielzahl von expressionsregulatorischen Sequenzen in dem Vektor verwendet werden. Beispiele für geeignete expressionsregulatorische Sequenzen sind zum Beispiel frühe und späte Promotoren von SV40 oder Adenovirus, das lac-System, das trp-System, das TAC- oder TRC-System, der T3- oder T7-Promotor, die Hauptoperator- und -promotorbereiche des Lambdaphagen, ein Kontrollbereich des das FD-Protein codierenden Bereichs, ein Promotor für 3-Phosphoglycerat-Kinase oder andere glycolytische Enzyme, ein Promotor der Phosphatase, wie Pho5, ein Promotor des alpha-Paarungssystems der Hefe und eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle oder Konstitution, die bekanntermaßen die Expression der Gene dieser Viren und anderer Induktionssequenzen steuert, und Kombinationen davon. Der T7-RNA-Polymerase-Promotor Φ10 kann geeignet sein, um das Protein NSP in Escherichia coli zu exprimieren.
Eine Nucleinsäure ist ”funktionell verknüpft”, wenn sie in eine funktionelle Beziehung zu einer anderen Nucleinsäuresequenz gesetzt ist. Dabei kann es sich um das Gen sowie eine oder mehrere regulatorische Sequenzen handeln, die so miteinander verknüpft sind, das eine Genexpression möglich ist, wenn ein geeignetes Molekül (z. B. ein Transkriptionsaktivatorprotein) mit der oder den regulatorischen Sequenzen kombiniert wird. Zum Beispiel ist die DNA für eine Pre-Sequenz oder sekretorische Leadersequenz funktionell mit DNA für ein Polypeptid verknüpft, wenn sie als Pre-Protein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; der Promotor oder Enhancer ist funktionell mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn er die Transcription der Sequenz beeinflusst; die Ribosomenbindungsstelle ist funktionell mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn sie die Transcription der Sequenz beeinflusst; oder die Ribosomenbindungsstelle ist funktionell mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn sie in einer leichten Translation positioniert ist. Im Allgemeinen bedeutet ”funktionell verknüpft”, dass die verknüpfte DNA-Sequenz in Kontakt ist, und im Falle einer sekretorischen Leadersequenz, dass sie in Kontakt und im Leseraster vorhanden ist. Der Enhancer braucht jedoch nicht in Kontakt zu sein. Die Verknüpfung dieser Sequenzen wird durch Ligierung (Verbindung) an einer zweckmäßigen Restriktionsenzymstelle durchgeführt. Wenn es keine solchen Stellen gibt, wird ein synthetischer Oligonucleotidadapter oder -linker gemäß herkömmlichen Verfahren verwendet.
Der hier verwendete Ausdruck ”Expressionsvektor” bezeichnet gewöhnlich einen rekombinanten Träger, in den ein Fragment von Hetero-DNA eingefügt ist, und bezieht sich im Allgemeinen auf ein Fragment von doppelsträngiger DNA. Dabei bedeutet ”Hetero-DNA” eine Hetero-DNA, die natürlicherweise nicht in der Wirtszelle vorkommt. Sobald sich der Expressionsvektor in einer Wirtszelle befindet, kann er sich unabhängig von der chromosomalen DNA des Wirts replizieren, und es können mehrere Kopien des Vektors und seiner eingefügten (Hetero)-DNA erzeugt werden.
Wie in der Technik wohlbekannt ist, muss das entsprechende Gen, um das Expressionsniveau eines Gens in einer damit transfizierten Wirtszelle zu erhöhen, funktionell mit Transkriptions- und Translations-expressionsregulatorischen Sequenzen verknüpft sein, die in einem ausgewählten Expressionswirt funktionsfähig sind. Vorzugsweise sind die expressionsregulatorische Sequenz und das entsprechende Gen innerhalb eines Expressionsvektors enthalten, der einen bakteriellen Selektionsmarker und einen Replikationsstartpunkt enthält. Wenn der Expressionswirt eine eukaryontische Zelle ist, sollte der Expressionsvektor weiterhin einen in dem eukaryontischen Expressionswirt geeigneten Expressionsmarker umfassen.
Eine Wirtszelle, die mit dem oben beschriebenen Expressionsvektor transformiert oder transfiziert ist, bildet einen weiteren Aspekt der vorliegenden Offenbarung. Der hier verwendete Ausdruck ”Transformation” bedeutet die Einführung von DNA in einen Wirt in einer solchen Weise, dass die DNA als extrachromosomaler Faktor oder durch chromosomale Integration replizierbar ist. Der hier verwendete Ausdruck ”Transfektion” bedeutet, dass ein Expressionsvektor von einer Wirtszelle angenommen wird, ob nun irgendeine codierende Sequenz tatsächlich exprimiert wird oder nicht.
Die Wirtszelle der vorliegenden Offenbarung kann eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein. Außerdem wird gewöhnlich ein Wirt verwendet, der eine hohe Effizienz der Einführung von DNA und eine hohe Effizienz der Expression der eingeführten DNA aufweist. Bekannte eukaryontische und prokaryontische Wirte wie Escherichia coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Pilze und Hefe, Insektenzellen, wie Spodoptera frugiperda (SF9), Tierzellen, wie CHO- und Mauszellen, Zellen der Äthiopischen Grünmeerkatze, wie COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 und BMT 10, sowie in Gewebekultur gezüchtete humane Zellen sind Beispiele für Wirtszellen, die verwendet werden können. Wenn die cDNA, die das NSP-Protein der vorliegenden Offenbarung codiert, kloniert wird, wird vorzugsweise eine Tierzelle als Wirt verwendet. Im Falle der Verwendung von COS-Zellen ist, da in COS-Zellen das große T-Antigen von SV40 exprimiert wird, das Plasmid, das einen SV40-Replikationsstartpunkt aufweist, in Form von mehrfachen Kopien von Episomen in den Zellen vorhanden, und es ist eine höhere Expression zu erwarten als gewöhnlich. Die eingeführte DNA-Sequenz kann von derselben Spezies wie die Wirtszelle erhalten werden, oder sie kann von einer anderen Spezies als die Wirtszelle erhalten werden, oder es kann sich um eine Hybrid-DNA-Sequenz handeln, die irgendeine heterologe oder homologe DNA umfasst.
Weiterhin sollte man sich darüber im Klaren sein, dass nicht alle Vektoren und expressionsregulatorischen Sequenzen bezüglich der Expression der DNA-Sequenzen der vorliegenden Offenbarung gleich gut funktionieren. Ebenso funktionieren auch nicht alle Wirte bei demselben Expressionssystem in identischer Weise. Der Fachmann wird jedoch in der Lage sein, ohne unzumutbare Experimente eine geeignete Auswahl unter einer Vielzahl von Vektoren, expressionsregulatorischen Sequenzen und Wirten vorzunehmen, ohne vom Umfang der vorliegenden Offenbarung abzuweichen. Zum Beispiel sollte bei der Auswahl eines Vektors der Wirt in Betracht gezogen werden, da der Vektor in diesem repliziert werden muss. Die Anzahl von Kopien des Vektors, die Fähigkeit, die Anzahl der Kopien zu steuern, und die Expression anderer Proteine, die von dem entsprechenden Vektor codiert werden, wie Antibiotika-Marker, muss ebenfalls in Betracht gezogen werden. Bei der Auswahl der expressionsregulatorischen Sequenzen müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden. Zum Beispiel sollte die relative Stärke der Sequenz, ihre Steuerbarkeit und Verträglichkeit mit den DNA-Sequenzen der vorliegenden Offenbarung, insbesondere bezüglich möglicher Sekundärstrukturen, berücksichtigt werden. Der einzellige Wirt sollte ausgewählt werden, indem man Faktoren wie den ausgewählten Vektor, die Toxizität des Produkts, das von der DNA-Sequenz der vorliegenden Offenbarung codiert wird, die Sekretionsmerkmale, die Fähigkeit, das Protein korrekt zu falten, die Kultur- und Fermentierungsanforderungen, die Leichtigkeit der Reinigung des Produkts, das von der DNA-Sequenz der vorliegenden Offenbarung codiert wird, aus dem Wirt berücksichtigt. Im Rahmen dieser Variablen kann der Fachmann verschiedene Kombinationen von Vektor/expressionsregulatorischen Sequenzen/Wirt auswählen, die die DNA-Sequenzen der vorliegenden Offenbarung bei der Fermentierung oder in großen Tierkulturen exprimieren können. Als Screening-Verfahren zur Klonierung der cDNA des NSP-Proteins durch Expressionsklonierung kann ein Bindungsverfahren, ein Panning-Verfahren, ein Filmemulsionsverfahren oder dergleichen angewendet werden.
Als Definition der vorliegenden Offenbarung bedeutet ”im Wesentlichen rein”, dass das Polypeptid und die DNA-Sequenz, die das Polypeptid gemäß der vorliegenden Offenbarung codiert, im Wesentlichen keine anderen Proteine, die von Bakterien abgeleitet sind, umfassen.
Als Wirtszellen zum Exprimieren von rekombinanten Proteinen werden verbreitet prokaryontische Zellen, wie Escherichia coli und Bacillus subtilis, verwendet, die in kurzer Zeit Zellen in hoher Dichte kultivieren können, deren Gene sich leicht manipulieren lassen und deren genetische und physiologische Merkmale gut charakterisiert sind. Um jedoch die Probleme der posttranslationalen Modifikation, des Sekretionsvorgangs, der aktiven dreidimensionalen Struktur und des aktiven Zustands von Proteinen zu lösen, und da in letzter Zeit Zellen im Bereich von einzelnen eukaryontischen Zellen bis zu höheren Organismen, wie die Hefereihe (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha usw.), Fadenpilze, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen, als Wirtszelle für die Produktion von rekombinanten Proteinen verwendet werden, ist die Verwendung anderer Wirtszellen sowie Escherichia coli, das in den Beispielen als Beispiel genannt wird, auf den Fachmann anwendbar.
Im Folgenden wird die vorliegende Offenbarung ausführlicher unter Bezugnahme auf Beispiele beschrieben. Der Fachmann wird sich darüber im Klaren sein, dass diese Beispiele nur dazu dienen, die vorliegende Offenbarung zu veranschaulichen, und dass der Umfang der vorliegenden Offenbarung nicht als durch diese Beispiele eingeschränkt gelten soll.
Beispiel 1. Bestätigung der in-vitro-Aktivität von beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase
1-1: Herstellung des pET30α_his_act-Vektors
Die Aminosäuresequenz der von einem Clostridium-propionicum-Stamm abgeleiteten beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase und die diese codierende Nucleotidsequenz des act-Gens sind in SEQ ID Nr. 2 bzw. 1 gezeigt.
Eine PCR wurde durchgeführt, wobei die chromosomale DNA eines Clostridium-propionicum-Stammes als Matrize und die Primer der SEQ ID Nr. 3 und 4 verwendet wurden, um ein his_act-Genfragment herzustellen, das ein beta-Alanin-Coenzym-A mit einem his-Tag am N-Terminus codiert. [SEQ ID Nr. 3] ckphisact (NdeI, F):
[SEQ ID Nr. 4] ckpact (SalI, R):
Dann wurden das his_act-Fragment und das pET30α-Plasmid mit Restriktionsenzymen (NdeI und SalI) behandelt, dann mit T4-DNA-Ligase behandelt, so dass das mit Restriktionsenzymen verdaute his_act-Fragment und das pET30α-Plasmid miteinander kombiniert wurden, um ein rekombinantes Plasmid pET30α_his_act herzustellen (siehe 2).
1-2: Reinigung von beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase
Zur Reinigung der beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase wurde das in Beispiel 1-1 erhaltene Plasmid pETa_his_act in E. coli BL21 (DE3) (F-ompT hsdSB(rB- mB-)gal dem (DE3), einen Prophagen, der das T7-RNA-Polymerase-Gen trägt) (New England Biolabs, USA) eingeführt.
Nach der frühen Inkubation, bei der die transformierten Stämme in 10 ml flüssiges LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt und 10 g/l NaCl), das 25 mg/l Kanamycin enthielt, eingeimpft und bei 37°C mit 200 U/min kontinuierlich geschüttelt wurden, wurden die Zellen zu 1% in 200 ml des oben beschriebenen Mediums eingeimpft und bei 37°C unter ständigem Schütteln mit 200 U/min inkubiert. Dann wurde 1 mM IPTG hinzugefügt, um die Expression von his_act zu induzieren, wenn die bei einer Wellenlänge von 600 nm in einem Spektrophotometer gemessene optische Dichte (CD) 0,4 betrug.
Nach 4 Stunden Induktion der Expression wurde die Kultur 10 Minuten lang in einer Zentrifuge (Hanil Science Industrial, Korea) bei 4°C mit 3000 U/min behandelt, um Mikroorganismen zu isolieren und einen Überstand zu entfernen. Die isolierten Mikroorganismen wurden in 40 ml eines Äquilibrierungspuffers (50 mM Na₃PO₄, 300 mM NaCl, pH 7,0) gegeben, dann über 2 Stunden hinweg mittels Pulsen durch 5 Sekunden mit 30% Intensität und 5 Sekunden Stehenlassen unter Verwendung eines Zellsonikators (Sonics & Materials, Inc., USA) aufgelöst und dann 10 Minuten lang bei 4°C mit 13 200 U/min zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen und dann ein Zelllysat zu erhalten.
Das Zelllysat wurde mit einem 0,45-μm-Filter gereinigt, und die his-markierte beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase wurde mit Hilfe eines Talon-Harzes (Clontech Laboratories, Inc., USA) isoliert. Die Isolierung der an das Talon-Harz gebundenen beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase erfolgte unter Verwendung von Äquilibrierungspuffern, die 7,5, 15, 30, 45, 60, 90, 120 bzw. 150 mM Imidazol enthielten. Danach wurden die Proben, die das Vollzelllysat enthielten, die durch die Talon-Harze passierte Proteinlösung und die mit jeder Konzentration von Imidazol erhaltene Proteinlösung mit 5 × Laemmli-Probenpufferlösung (LPS Solution, Korea) gemischt, mit Hilfe von 12% SDS-PAGE aufgetrennt und mit einer Lösung von Coomassie-Brillantblau R250 (Bio-Rad, USA) angefärbt (siehe 3). Als Ergebnis wurde die bis zur höchsten Reinheit von 120 mM gereinigte beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase verwendet.
1-3: Enzymassay der beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase
Ein Enzymassay wurde in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) durchgeführt. Substrate und Enzyme, die für den Enzymassay erforderlich waren, wurden wie folgt hinzugefügt. 10 mM GABA, 6ACA oder 7AHA, 1 mM Acetyl-CoA und 2,5 μg gereinigte beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase wurden hinzugefügt und 2 Stunden lang bei 30°C umgesetzt. Um die einzigen Coenzym-A-Derivate aus dem Enzymassaygemisch zu isolieren, wurden die folgenden Vorschriften mit einer OASIS-HLB-SPE-Kartusche (Waters, USA) verwendet.
In die erste Kartusche wurden 1 ml Methanol und dann 2 ml 0,15%-ige TCA-Lösung gegossen. Danach wurde ein Enzymassaygemisch durchfließen gelassen, und dann wurde wiederum 1 ml 0,15%-ige TCA-Lösung durchfließen gelassen. Schließlich wurde 1 ml einer Lösung von Methanol und NH₄OH in einem Volumenverhältnis von 99:1 durchfließen gelassen, um gereinigte Coenzym-A-Derivate zu erhalten. Das Lösungsmittel wurde mit Hilfe einer Vakuumzentrifuge verdampft, und die Probe wurde bei –24°C gelagert.
Die Proben wurden unmittelbar vor der Analyse unter Verwendung von HPLC-MS (Massenspektrometer: LC/MSD VL, Agilent, USA, HPLC: Agilent, USA) oder HPLC-MS/MS (Massenspektrometer: API3200QTRAP, SCIEX, USA, HPLC: Shimadzu, Japan) in destilliertem Wasser gelöst, und dann wurden die Coenzym-A-Derivate analysiert. Im Falle des Enzymassaygemischs, bei dem GABA und 6ACA als Substrat verwendet wurden, wurde im positiven Modus unter Verwendung von HPLC-MS/MS analysiert, und im Falle des Assaygemischs, bei dem 7AHA als Substrat verwendet wurde, wurde im negativen Modus unter Verwendung von HPLC-MS analysiert.
Als Ergebnis zeigte eine primäre MS-Analyse des Enzymassaygemischs unter Verwendung von GABA als Substrat einen Peak bei 852,2, der dem erwarteten m/z-Wert von 853 von GABA-Coenzym A ähnlich ist. Dieser Peak wurde mit sekundärem MS fragmentiert, und die Analyse wurde durchgeführt. Als Ergebnis wurden Peaks bei 243,1, 345,5 und 428,1 bestätigt, die ähnlich wie die erwarteten Peaks mit m/z = 244, 346 bzw. 428 sind (siehe 4). Weiterhin zeigte eine primäre MS-Analyse des Enzymassaygemischs unter Verwendung von 6ACA als Substrat einen Peak bei 881,3, der dem erwarteten m/z-Wert von 881 von GABA-Coenzym A ähnlich ist. Dieser Peak wurde mit sekundärem MS fragmentiert, und die Analyse wurde durchgeführt. Als Ergebnis wurden Peaks bei 272,2, 374,3 und 428,2 bestätigt, die ähnlich wie die erwarteten Peaks mit m/z = 272, 374 bzw. 428 sind (siehe 5). Weiterhin wurde im Falle des Enzymassaygemischs, das unter Verwendung von 7AHA als Substrat durchgeführt wurde, bestätigt, dass ein neuer CoA-Derivat-Peak bei t = 9,844 Minuten auftrat und denselben Wert aufwies wie der erwartete m/z-Wert von 893,2 von 7AHA-Coenzym-A (siehe 10).
Anhand dieser Ergebnisse wurde bestätigt, dass beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase GABA, 6ACA und 7AHA gemäß der vorliegenden Offenbarung erfolgreich in GABA-Coenzym-A, 6ACA-Coenzym-A bzw. 7AHA-Coenzym-A umwandelte.
Beispiel 1. Bestätigung der in-vitro-Produktion von 2-Pyrrolidon, Valerolactam und Caprolactam
GABA-Coenzym-A, 5AVA-Coenzym-A und 6ACA-Coenzym-A wurden hergestellt, indem man den Enzymassay mit Hilfe des in Beispiel 1–3 beschriebenen Verfahrens durchführte. Die resultierenden GABA-Coenzym-A, 5AVA-Coenzym-A und 6ACA-Coenzym-A wurden 48 Stunden lang ohne jede Behandlung bei 37°C stehen gelassen und dann mit Hilfe von HPLC-MS analysiert, um die Produktion von 2-Pyrrolidon, Valerolactam und Caprolactam zu bestätigen.
Als Ergebnis wurde ein Standard-2-Pyrrolidon-Reagens (Sigma-Aldrich, USA) durch HPLC-MS analysiert, um den Peak von 2-Pyrrolidon bei 6,352 Minuten nachzuweisen, und dieser Peak wurde durch MS-Analyse analysiert, um Peaks zu bestätigen, die bei m/z = 86,1 und 108,1 auftraten. Als Kontrolle wurde das Assaygemisch analysiert, das keine beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase enthielt, d. h. kein GAB-Coenzym-A erzeugte. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass in der 6-Minuten-Bande kein Peak auftrat.
In der Assaygemischprobe, bei der eine beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase hinzugefügt worden war, um GABA-Coenzym A herzustellen, wurde ein Peak bei 6,348 Minuten nachgewiesen, der dem des Standard-2-Pyrrolidon-Reagens ähnlich ist. Eine MS-Analyse des Peaks zeigte, dass Peaks bei m/z = 86,0 und 108,0 nachgewiesen wurden, die dem des Standard-2-Pyrrolidon-Reagens ähnlich sind (siehe 6). Weiterhin wurde als Analyseergebnis des Standard-Valerolactam-Reagens (Sigma-Aldrich, USA) durch HPLC-MS ein Peak von Valerolactam bei 8,098 Minuten nachgewiesen. Eine MS-Analyse des Peaks zeigte, dass ein Peak bei m/z = 100,1 auftrat.
In der Assaygemischprobe, bei der eine beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase hinzugefügt worden war, um 5AVA-Coenzym-A-Transferase herzustellen, wurde ein Peak bei 8,092 Minuten nachgewiesen, der dem des Standard-Valerolactam-Reagens ähnlich ist. Eine MS-Analyse des Peaks zeigte, dass ein Peak bei m/z = 100,1 nachgewiesen wurde, der dem des Standard-Valerolactam-Reagens ähnlich ist (siehe 11). Eine Analyse des Standard-Valerolactam-Reagens (Sigma-Aldrich, USA) durch HPLC-MS zeigte, dass ein Peak von Caprolactam bei 9,395 Minuten nachgewiesen wurde. Eine MS-Analyse des Peaks zeigte, dass Peaks bei m/z = 114,1 bzw. 136,0 auftraten.
Im Falle des Assaygemischs, bei dem kein 6ACA-Coenzym-A produziert wurde, weil keine beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase dabei war, wurde gemäß der obigen Logik in der 9-Minuten-Bande kein Peak nachgewiesen. Im Falle der Assaygemischprobe, bei der beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase hinzugefügt wurde, um 6ACA-Coenzym-A herzustellen, wurde ein Peak bei 9,469 Minuten nachgewiesen, ähnlich dem des Standard-Caprolactam-Reagens. Eine MS-Analyse dieses Peaks bestätigte, dass Peaks bei m/z = 114,1 und 136,0 nachgewiesen wurden, ähnlich dem des Standard-Caprolactam-Reagens (siehe 7).
Anhand dieser Ergebnisse wurde bestätigt, dass GABA-Coenzym-A, 5AVA-Coenzym-A und 6ACA-Coenzym-A, die unter Verwendung von beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase gemäß der vorliegenden Offenbarung hergestellt wurden, ohne die Hilfe von Enzymen in 2-Pyrrolidon, Valerolactam bzw. Caprolactam umgewandelt wurden.
Beispiel 3: Herstellung von Lactam aus Omega-Aminosäure mit Hilfe eines rekombinanten Mikroorganismus
3-1: Herstellung des pTac15k-act-Vektors
Ein act-Genfragment, das ein beta-Alanin-Coenzym-A codiert, wurde dadurch hergestellt, dass man eine PCR unter Verwendung der Primer von SEQ ID Nr. 5 und 6 durchführte und die chromosomale DNA eines Clostridium-propionicum-Stammes als Matrize nahm. [SEQ ID Nr. 5] ckpact (EcoRI, F):
[SEQ ID Nr. 6] ckpact (SacI, R):
Dann wurde das Plasmid pTac15k (Hiszczynska-Sawicka und Kur, 1997), das eine starke Genexpression des act-Fragments und des tac-Promotors fördert, mit Restriktionsenzymen (EcoRI und SacI) behandelt, dann mit T4-DNA-Ligase behandelt, so dass das mit Restriktionsenzym gespaltene act-Fragment und das pTac15k-Plasmid ligiert wurden, um ein rekombinantes Plasmid pTac15k_act herzustellen (siehe 8).
3-2: Herstellung des pEKEx1 act-Vektors
Das Plasmid pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene. 102, 93–98, 1991), das die starke Genexpression des in Beispiel 3-1 hergestellten act-Fragments und den tac-Promotor trägt, wurde mit Restriktionsenzymen (EcoRI und BamHI) behandelt, dann mit T4-DNA-Ligase behandelt, so dass das mit Restriktionsenzym gespaltene act-Fragment und das pEKEx1-Plasmid ligiert wurden, um ein rekombinantes Plasmid pEKEx_act herzustellen (siehe 13).
3-3: Herstellung des pEKEx1 gadB-Vektors
Unter Verwendung der chromosomalen DNA des Escherichia-coli-Stamms als Matrize wurde eine PCR mit den Primern von SEQ ID Nr. 8 und 9 durchgeführt, um ein gadB-Genfragment herzustellen, das Glutaminsäure-Decarboxylase codiert. [SEQ ID Nr. 7] ecjgadB (BamHI, RBS, F):
[SEQ ID Nr. 8] ecjgadB (SalI, R):
Dann wurde das Plasmid pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene. 102, 93–98, 1991), das die starke Genexpression des gadB-Fragments und den tac-Promotor trägt, mit Restriktionsenzymen (BamHI und SalI) behandelt, dann mit T4-DNA-Ligase behandelt, so dass das mit Restriktionsenzym gespaltene gadB-Fragment und das pEKEx1-Plasmid ligiert wurden, um ein rekombinantes Plasmid pEKEx_gadB herzustellen (siehe 14).
3-4: Herstellung des pEKEx1_act gadB-Vektors
Das in Beispiel 3-2 hergestellte pEKEx1-act-Plasmid und das in Beispiel 3-2 hergestellte gadB-Fragment wurden mit Restriktionsenzymen (BamHI und SalI) behandelt, dann mit T4-DNA-Ligase behandelt, so dass das mit Restriktionsenzym gespaltene gadB-Fragment und das pEKEx1_act-Plasmid ligiert wurden, um ein rekombinantes Plasmid pEKEx_act_gadB herzustellen (siehe 15).
3-5: Herstellung eines rekombinanten Mikroorganismus
Das in Beispiel 3-1 hergestellte pTac15k_act-Plasmid wurde in Escherichia coli WL3110 (Lee et al., Mol. Syst. Biol. 3: 149 2007) eingeführt, so dass das act-Gen, das das beta-Alanin-Coenzym-A-Gen codiert, in dem Mikroorganismus exprimiert wurde, wodurch ein rekombinanter Mikroorganismus (WL3110/pTac15k-act) hergestellt wurde, und Escherichia coli (WL3110/pTac15k), in das pTac15k, ein leerer Vektor, eingeführt wurde, wurde als Kontrollstamm verwendet.
Um die Möglichkeit der Produktion in verschiedenen Kohlenstoffquellen nachzuweisen, wurde weiterhin das in Beispiel 3-1 hergestellte pTac15k_act-Plasmid in Escherichia coli XQ56/pKE112-davAB (Park et al., Metab. Eng. 16: 42–47 2013) eingeführt, so dass das act-Gen, welches das beta-Alanin-Coenzym-A-Gen codiert, in dem Mikroorganismus exprimiert wurde, wodurch ein rekombinanter Mikroorganismus (XQ56/pKE112-davAB/pTac15k-act) hergestellt wurde, und Escherichia coli (XQ56/pKE112-davAB/pTac15k), in das pTac15k, ein leerer Vektor, eingeführt wurde, wurde als Kontrollstamm verwendet.
Um die Möglichkeit der Produktion in verschiedenen Kohlenstoffquellen nachzuweisen, wurde weiterhin das in Beispiel 3-4 hergestellte pEKEx1_act_gadB-Plasmid in den Wildtyp von Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) eingeführt, so dass das gadB-Gen, welches das Glutaminsäure-Decarboxylase-Gen für die Biosynthese von GABA codiert, und das act-Gen, welches das beta-Alanin-Coenzym-A-Gen codiert, in dem Mikroorganismus exprimiert wurden, wodurch ein rekombinanter Mikroorganismus (ATCC 13032/pEKEx1_act_gadB) hergestellt wurde. Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032/pEKEx1_gadB), in das das pEKEx1_gadB-Plasmid eingeführt wurde, wurde als Kontrollstamm verwendet. Das pEKEx1_gadB-Plasmid wurde in Beispiel 3-3 hergestellt und exprimierte nur das gadB-Gen.
3-6: Bestätigung der Produktion von 2-Pyrrolidon aus GABA unter Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus
Der in Beispiel 3-5 hergestellte rekombinante Mikroorganismus (WL3110/pTac15k-act) wurde in 10 ml LB-Medium eingeimpft, 8 Stunden lang bei 37°C vorkultiviert, und 1,5 ml des vorkultivierten Mediums wurden in einem 350-ml-Kolben in 50 ml modifiziertes MR-1-Medium eingeimpft und kultiviert.
Die Zusammensetzung des modifizierten MR-1-Mediums (pH 7,0) enthielt 10 g Glucose, 5 g GABA, 9 g (NH₄)₂SO₄, 6,67 g KH₂PO₄, 4,0 g (NH₄)₂HPO₄, 0,8 g Zitronensäure, 0,8 g MgSO₄·7H₂O, 0,01 g CaCl₂·2H₂O, 5 ml Spurenmetalllösung (10 g FeSO₄·7H₂O, 2,2 g ZnSO₄·4H₂O, 0,58 g MnSO₄·4H₂O, 1 g CuSO₄·5H₂O, 0,1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 0,02 g Na₂6₄O₇·10H₂O pro 1 Liter destilliertes Wasser) pro 1 Liter destilliertes Wasser. GABA wurde in der obigen Zusammensetzung als Kohlenstoffquelle zugeführt. Die Kultur wurde 48 Stunden lang in einem Schüttelinkubator (jSR, Korea) durchgeführt, der bei 37°C und mit 200 U/min betrieben wurde. Nachdem die Kultur beendet war, wurde die Kulturlösung 10 Minuten lang mit 13 200 U/min zentrifugiert, und nur der Überstand wurde gewonnen und einer HPLC-MS-Analyse unterzogen, um die Produktion von 2-Pyrrolidon zu bestätigen.
Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, wurde als Ergebnis bestätigt, dass der rekombinante Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Offenbarung 193,78 mg/l 2-Pyrrolidon produzierte, während das 2-Pyrrolidon in dem rekombinanten Mikroorganismus, der mit einem leeren Vektor transformiert wurde, überhaupt nicht produziert wurde.
Anhand dieser Ergebnisse wurde bestätigt, dass der rekombinante Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Offenbarung erfolgreich 2-Pyrrolidon produzierte, wobei er GABA als Kohlenstoffquelle nutzte. Tabelle 1 Produktionsmenge (mg/l) von 2-Pyrrolidon durch den rekombinanten Mikroorganismus

Stamm Produktionsmenge von 2-Pyrrolidon (mg/l)

WL3110/pTac15k 0

WL3110/pTac15k-act 193,78
3-7: Bestätigung der Produktion von Valerolactam aus 5AVA unter Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus
Der in Beispiel 3-5 hergestellte rekombinante Mikroorganismus (WL3110/pTac15k-act) wurde in 10 ml LB-Medium eingeimpft, 8 Stunden lang bei 37°C vorkultiviert, und 1,5 ml des vorkultivierten Mediums wurden in einem 350-ml-Kolben in 50 ml modifiziertes MR-2-Medium eingeimpft und kultiviert.
Die Zusammensetzung des modifizierten MR-2-Mediums (pH 7,0) enthielt 10 g Glucose, 5 g 5AVA, 9 g (NH₄)₂SO₄, 6,67 g KH₂PO₄, 4,0 g (NH₄)₂HPO₄, 0,8 g Zitronensäure, 0,8 g MgSO₄·7H₂O, 0,01 g CaCl₂·2H₂O, 5 ml Spurenmetalllösung (10 g FeSO₄·7H₂O, 2,2 g ZnSO₄·4H₂O, 0,58 g MnSO₄·4H₂O, 1 g CuSO₄·5H₂O, 0,1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 0,02 g Na₂B₄O₇·10H₂O pro 1 Liter destilliertes Wasser) pro 1 Liter destilliertes Wasser. 5AVA wurde in der obigen Zusammensetzung als Kohlenstoffquelle zugeführt. Die Kultur wurde 48 Stunden lang in einem Schüttelinkubator (jSR, Korea) durchgeführt, der bei 37°C und mit 200 U/min betrieben wurde. Nachdem die Kultur beendet war, wurde die Kulturlösung 10 Minuten lang mit 13 200 U/min zentrifugiert, und nur der Überstand wurde gewonnen und einer HPLC-MS-Analyse unterzogen, um die Produktion von Valerolactam zu bestätigen.
Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, wurde als Ergebnis bestätigt, dass der rekombinante Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Offenbarung 592,68 mg/l Valerolactam produzierte.
Anhand dieser Ergebnisse wurde bestätigt, dass der rekombinante Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Offenbarung erfolgreich Valerolactam produzierte, wobei er 5AVA als Kohlenstoffquelle nutzte. Tabelle 2 Produktionsmenge (mg/l) von Valerolactam durch den rekombinanten Mikroorganismus

Stamm Produktionsmenge von Valerolactam (mg/l)

WL3110/pTac15k-act 592,68
Beispiel 4: Herstellung von Lactam aus einer anderen Kohlenstoffquelle mit Hilfe eines rekombinanten Mikroorganismus
4-1: Bestätigung der Produktion von 2-Pyrrolidon aus Glutaminsäure unter Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus
Der in Beispiel 3-5 hergestellte rekombinante Mikroorganismus (WL3110/pTac15k-act) wurde in 10 ml LB-Medium eingeimpft, 8 Stunden lang bei 37°C vorkultiviert, und 1,5 ml des vorkultivierten Mediums wurden in einem 350-ml-Kolben in 50 ml modifiziertes M9-Medium eingeimpft und kultiviert.
Die Zusammensetzung des modifizierten M9-Mediums enthielt 10 g Glucose, 5 g Glutaminsäure, 6,78 g Na₂HPO₄, 3,0 g KH₂PO₄, 0,5 g NaCl, 1,0 g NH₄Cl, 1 mM MgSO₄, 0,1 mM CaCl₂, 10 mg Thiamin pro 1 Liter destilliertes Wasser. In der obigen Zusammensetzung wurde die Glutaminsäure als Kohlenstoffquelle zugeführt, um für GABA in dem Mikroorganismus zu sorgen. Die Kultur wurde 48 Stunden lang in einem Schüttelinkubator (jSR, Korea) durchgeführt, der bei 37°C und mit 200 U/min betrieben wurde. Nachdem die Kultur beendet war, wurde die Kulturlösung 10 Minuten lang mit 13 200 U/min zentrifugiert, und nur der Überstand wurde gewonnen und einer HPLC-MS-Analyse unterzogen, um die Produktion von 2-Pyrrolidon zu bestätigen.
Wie in 9 gezeigt ist, wurde als Ergebnis bestätigt, dass der rekombinante Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Offenbarung einen Peak bei 6,445 Minuten zeigte, der dem von 2-Pyrrolidon-Standardsubstanzen ähnlich ist, und eine Analyse des Peaks zeigte, dass Peaks bei m/z = 86,0 und 108,0 nachgewiesen wurden, die dieselben sind wie der des Standard-2-Pyrrolidons, während das 2-Pyrrolidon in dem rekombinanten Mikroorganismus, der mit einem leeren Vektor transformiert wurde, überhaupt nicht produziert wurde.
Anhand dieser Ergebnisse wurde bestätigt, dass der rekombinante Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Offenbarung erfolgreich 2-Pyrrolidon produzierte, wobei er Glutaminsäure als Kohlenstoffquelle nutzte.
4-2: Bestätigung der Produktion von Valerolactam aus Glucose unter Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus
Der in Beispiel 3-5 hergestellte rekombinante Mikroorganismus (XQ56/pKE112-davAB/pTac15k-act) wurde in 10 ml LB-Medium eingeimpft, 8 Stunden lang bei 37°C vorkultiviert, und 1,5 ml des vorkultivierten Mediums wurden in einem 350-ml-Kolben in 50 ml modifiziertes MR-3-Medium eingeimpft und kultiviert.
Die Zusammensetzung des modifizierten MR-3-Mediums (pH 7,0) enthielt 10 g Glucose, 9 g (NH₄)₂SO₄, 6,67 g KH₂PO₄, 4,0 g (NH₄)₂HPO₄, 0,8 g Zitronensäure, 0,8 g MgSO₄·7H₂O, 0,01 g CaCl₂·2H₂O, 5 ml Spurenmetalllösung (10 g FeSO₄·7H₂O, 2,2 g ZnSO₄·4H₂O, 0,58 g MnSO₄·4H₂O, 1 g CuSO₄·5H₂O, 0,1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 0,02 g Na₂B₄O₇·10H₂O pro 1 Liter destilliertes Wasser) pro 1 Liter destilliertes Wasser. Die Glucose wurde in der obigen Zusammensetzung als Kohlenstoffquelle zugeführt. Die Kultur wurde 36 Stunden lang in einem Schüttelinkubator (jSR, Korea) durchgeführt, der bei 37°C und mit 200 U/min betrieben wurde. Nachdem die Kultur beendet war, wurde die Kulturlösung 10 Minuten lang mit 13 200 U/min zentrifugiert, und nur der Überstand wurde gewonnen und einer HPLC-MS-Analyse unterzogen, um die Produktion von Valerolactam zu bestätigen.
Wie in Tabelle 3 gezeigt ist, wurde als Ergebnis bestätigt, dass der rekombinante Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Offenbarung 28,36 mg/l Valerolactam produzierte, während das Valerolactam in dem rekombinanten Mikroorganismus, der mit einem leeren Vektor transformiert wurde, überhaupt nicht produziert wurde.
Anhand dieser Ergebnisse wurde bestätigt, dass der rekombinante Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Offenbarung erfolgreich Valerolactam produzierte, wobei er Glucose als Kohlenstoffquelle nutzte. Tabelle 3 Produktionsmenge (mg/l) von Valerolactam durch den rekombinanten Mikroorganismus

Stamm Produktionsmenge von Valerolactam (mg/l)

XQ56/pKE112-davAB/pTac15k 0

XQ56/pKE112-davAB/pTac15k-act 28,36
4-3: Bestätigung der Produktion von 2-Pyrrolidon aus Glucose unter Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus
Der in Beispiel 3-5 hergestellte rekombinante Mikroorganismus (ATCC 13032/pEKEx1_act_gadB) wurde in 5 ml RG-Medium (40 g/l Hirn-Herz-Bouillon, 10 g/l Glucose, 10 g/l Rinderextrakt, 30 g/l Sorbit) eingeimpft, 12 Stunden lang bei 30°C vorkultiviert, und 1,5 ml des vorkultivierten Mediums wurden in einem 350-ml-Kolben in 50 ml GP-1-Medium eingeimpft und kultiviert.
Die Zusammensetzung des GP1-Mediums (pH 7,0) enthielt 50 g Glucose, 50 g (NH₄)₂SO₄, 1,0 g K₂HPO₄, 3,0 g Harnstoff, 0,4 g MgSO₄·7H₂O, 50 g Pepton, 0,01 g FeSO₄, 0,01 g MnSO₄·5H₂O, 200 μg Thiamin, 0,1 mM Pyridoxal-5-phosphathydrat, 50 μg Biotin pro 1 Liter destilliertes Wasser. In der obigen Zusammensetzung wurde die Glucose als Kohlenstoffquelle zugeführt. Die Kultur wurde 96 Stunden lang in einem Schüttelinkubator (jSR, Korea) durchgeführt, der bei 30°C und mit 200 U/min betrieben wurde. Nachdem die Kultur beendet war, wurde die Kulturlösung 10 Minuten lang mit 13 200 U/min zentrifugiert, und nur der Überstand wurde gewonnen und einer HPLC-MS-Analyse unterzogen, um die Produktion von Valerolactam zu bestätigen. Tabelle 4 Produktionsmenge (mg/l) von 2-Pyrrolidon durch den rekombinanten Mikroorganismus
Obwohl oben spezielle Teile des Zusammenhangs der vorliegenden Offenbarung ausführlich beschrieben wurden, wird sich der Fachmann darüber im Klaren sein, dass eine solche spezielle Beschreibung lediglich bevorzugte beispielhafte Ausführungsformen betrifft und dass der Umfang der vorliegenden Offenbarung nicht darauf beschränkt ist. Daher wird der tatsächliche Umfang der vorliegenden Offenbarung durch die beigefügten Ansprüche und deren Äquivalente definiert.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Der rekombinante Mikroorganismus der vorliegenden Offenbarung kann verschiedene Lactamverbindungen, wie Propiolactam, 2-Pyrrolidon, Valerolactam, Caprolactam und Heptanolactam, aus Omega-Aminosäuren produzieren und ist somit für die industrielle Produktion von Lactamen geeignet.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Rekombinanter Mikroorganismus, der Lactam aus einer Omega-Aminosäure produzieren kann, wobei ein Gen, das eine beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase codiert, in einen Mikroorganismus eingeführt ist, der inhärent einen Omega-Aminosäure-Biosynthese-Stoffwechselweg aufweist oder in den ein Omega-Aminosäure-Biosynthese-Stoffwechselweg eingeführt ist.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem Gen, das die beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase codiert, um von Clostridium propionicum abgeleitetes act handelt.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei das Lactam aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Propiolactam, 2-Pyrrolidon, Valerolactam, Caprolactam, Heptanolactam, Octanolactam, Nonanolactam, Decanolactam, Undecanolactam und Dodecanolactam besteht.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei die Omega-Aminosäure aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus beta-Alanin, gamma-Aminobuttersäure (GABA), 5-Aminovaleriansäure (5AVA), 6-Aminocapronsäure (6ACA), 7-Aminoheptansäure (7AHA), 8-Aminooctansäure, 9-Aminononansäure, 10-Aminodecansäure, 11-Aminoundecansäure und 12-Aminododecansäure besteht.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem Omega-Aminosäure-Biosynthese-Stoffwechselweg um den gamma-Aminobuttersäure(GABA)-Biosynthese-Stoffwechselweg handelt.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem Omega-Aminosäure-Biosynthese-Stoffwechselweg um den 5-Aminovaleriansäure(5AVA)-Biosynthese-Stoffwechselweg handelt.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 6, wobei der 5-Aminovaleriansäure(5AVA)-Biosynthese-Stoffwechselweg darin besteht, dass ein Gen, das delta-Aminovaleramidase codiert, und ein Gen, das Lysin-2-Monooxygenase codiert, eingeführt werden.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 7, wobei es sich bei dem Gen, das delta-Aminovaleramidase codiert, um davA, das von Pseudomonas putida abgeleitet ist, und bei dem Gen, das Lysin-2-Monooxygenase codiert, um davB, das von Pseudomonas putida abgeleitet ist, handelt.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei die Omega-Aminosäure aus einer Kohlenstoffquelle biosynthetisiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Monosacchariden, Disacchariden und Polysacchariden einschließlich Glucose, Saccharose, Galactose, Maltose, Xylose, Glycerin, Fructose und Zuckerrohr besteht.
Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei der rekombinante Mikroorganismus aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bakterien, Hefe und Pilzen besteht.
Verfahren zur Herstellung eines Lactams aus einer Omega-Aminosäure umfassend: (a) Kultivieren des rekombinanten Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, so dass er ein Lactam produziert; und (b) Gewinnen des produzierten Lactams.
Verfahren zur Herstellung eines Lactams aus einer Omega-Aminosäure umfassend: (a) Mischen einer beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase mit einer Reaktionslösung, die die Omega-Aminosäure enthält, und Umsetzen zur Herstellung eines Omega-Aminoacyl-CoA; und (b) Herstellen des Lactams durch Bilden einer Ringstruktur aus der hergestellten Omega-Aminoacyl-CoA.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei es sich bei dem Gen, das die beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase codiert, um von Clostridium propionicum abgeleitetes act handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das Lactam aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Propiolactam, 2-Pyrrolidon, Valerolactam, Caprolactam, Heptanolactam, Octanolactam, Nonanolactam, Decanolactam, Undecanolactam und Dodecanolactam besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Omega-Aminosäure aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus beta-Alanin, gamma-Aminobuttersäure (GABA), 5-Aminovaleriansäure (5AVA), 6-Aminocapronsäure (6ACA), 7-Aminoheptansäure (7AHA), 8-Aminooctansäure, 9-Aminononansäure, 10-Aminodecansäure, 11-Aminoundecansäure und 12-Aminododecansäure besteht.
Verfahren zur Herstellung eines Omega-Aminoacyl-CoA aus einer Omega-Aminosäure, umfassend: (a) Kultivieren des rekombinanten Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, so dass er das Omega-Aminoacyl-CoA produziert; und (b) Gewinnen des produzierten Omega-Aminoacyl-CoA.
Verfahren zur Herstellung eines Omega-Aminoacyl-CoA aus einer Omega-Aminosäure, umfassend das Mischen einer beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase in einer Reaktionslösung, die die Omega-Aminosäure enthält, und dann Umsetzen zur Herstellung des Omega-Aminoacyl-CoA.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei es sich bei dem Gen, das die beta-Alanin-Coenzym-A-Transferase codiert, um von Clostridium propionicum abgeleitetes act handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die Omega-Aminosäure aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus beta-Alanin, gamma-Aminobuttersäure (GABA), 5-Aminovaleriansäure (5AVA), 6-Aminocapronsäure (6ACA), 7-Aminoheptansäure (7AHA), 8-Aminooctansäure, 9-Aminononansäure, 10-Aminodecansäure, 11-Aminoundecansäure und 12-Aminododecansäure besteht.