CN107438667A - 内酰胺的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有从ω‑氨基酸内酰胺生产能力的重组微生物，其中引入在具有氨基酸的ω‑氨基酸生物合成代谢途径的微生物上编码β‑丙氨酸辅酶A转移酶的基因，以及使用所述重组微生物生产各种内酰胺和ω‑氨酰基‑CoA的方法。本发明的重组微生物和生产内酰胺的方法可用于从各种ω‑氨基酸制备各种内酰胺，如丙内酰胺、2‑吡咯烷酮、戊内酰胺、己内酰胺、庚内酰胺等。
Description
技术领域
本发明涉及使用酶制备内酰胺的方法，并且更具体地，涉及使用将ω-氨基酸转化为ω-氨酰基-CoA的酶，或使用向其中引入编码所述酶的基因的重组微生物制备内酰胺的方法。
背景技术
近来，由于石油矿藏耗减和环境问题，许多关注集中在使用微生物制备各种可持续增值的化工产品上。在各种增值的化合物中，进行了许多研究以制备各种内酰胺(其为尼龙的前体)。然而，至今为止，没有使用重组微生物制备各种内酰胺的成功实例。
然而，有许多使用常规代谢工程法制备ω-氨基酸(其为内酰胺的前体)，的重组微生物的报道。已知的实例是制备ω-氨基酸，如γ-氨基丁酸(GABA)、5-氨基戊酸(5AVA)和6-氨基己酸(6ACA)，其是作为关于内酰胺的典型实例的2-吡咯烷酮、戊内酰胺和己内酰胺的前体。首先，正在使用基于棒状杆菌(Corynebacterium)(Shi等人,Biotechol.Lett.33:2469-2474 2011；Shi等人,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.40:1285-1296,2013；Takahashi等人,Enzyme Microb.Tech.51:171-176,2012)和乳酸菌(Li等人,Microb.Cell.Fact.9:85,2010)的重组微生物进行GABA的生产研究。使用大肠杆菌(Park等人,Metab.Eng.16:42-47,2013；Adkins等人,Biotechnol.Bioeng.110:1726-1734,2013)制备5AVA。最终，基于产甲烷古菌(methanogens)代谢途径，6ACA通过5-甲酰基戊酸(US 2012/0028320A1)成功获得6ACA制备专利(US 2014/0134681)。
尚未报道使用重组微生物直接制备内酰胺，但是有设计出能够在微生物中制备己内酰胺(一种最需要的内酰胺)的代谢环路的专利(US 2013/0303723 A1)。然而，在该专利中，没有关于实际上可导致所述代谢途径发生的己内酰胺制备和酶的实际数据。
因此，本发明的发明人做出努力以开发使用微生物有效制备各种内酰胺的方法。因此，他们发现了以ω-氨基酸作为底物并转化为ω-氨酰基-CoA的酶。确定内酰胺可使用酶本身或引入基因的重组微生物来制备，从而完成本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种向其中引入编码酶的基因的重组微生物，其中所述酶将ω-氨基酸转化为ω-氨酰基-CoA。
本发明的另一个目的是提供一种使用该重组微生物由ω-氨基酸制备各种内酰胺的方法。
本发明的又一个目的是提供一种使用将ω-氨基酸转化为ω-氨酰基-CoA的酶从ω-氨基酸制备各种内酰胺的方法。
本发明的还一个目的是提供一种使用向其中引入编码酶的基因的重组微生物从ω-氨基酸制备各种ω-氨酰基-CoA的方法，其中所述酶将将ω-氨基酸转化为ω-氨酰基-CoA。
本发明的再一个目的是提供一种使用将ω-氨基酸转化为ω-氨酰基-CoA的酶从ω-氨基酸制备各种ω-氨酰基-CoA的方法。
为了实现上述目的，本发明提供一种具有从ω-氨基酸生产内酰胺的能力的重组微生物，其中将编码β-丙氨酸辅酶A转移酶的基因引入微生物，所述微生物固有地具有ω-氨基酸生物合成代谢途径或引入ω-氨基酸生物合成代谢途径。
本发明还提供一种使用向其中引入β-丙氨酸辅酶A转移酶基因的重组微生物从ω-氨基酸制备内酰胺的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)培养重组微生物以制备内酰胺；和(b)回收所制备的内酰胺。
本发明还提供了一种使用β-丙氨酸辅酶A转移酶从ω-氨基酸制备内酰胺的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)将β-丙氨酸辅酶A转移酶与含有ω-氨基酸的反应溶液混合，然后反应以制备ω-氨酰基-CoA；和(b)通过形成所制备的ω-氨酰基-CoA的环结构来制备内酰胺。
本发明还提供了一种使用向其中引入β-丙氨酸辅酶A转移酶基因的重组微生物从ω-氨基酸制备ω-氨酰基-CoA的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)培养重组微生物以制备ω-氨酰基-CoA；和(b)回收所制备的ω-氨酰基-CoA。
本发明还涉及使用β-丙氨酸辅酶A转移酶从ω-氨基酸制备ω-氨酰基-CoA的方法，其中所述方法包括以下步骤：在含有ω-氨基酸的反应溶液中混合β-丙氨酸辅酶A转移酶，然后反应以制备ω-氨酰基-CoA。
附图说明
图1显示通过ω-氨酰基辅酶A转移酶从ω-氨基酸制备各种内酰胺的途径。
图2显示其中插入带his标签的act基因纯化β-丙氨酸辅酶A转移酶的过度表达pET30αhis-act的质粒。
图3是所纯化的β-丙氨酸辅酶A转移酶的SDS-PAGE照片。
图4显示使用酶即β-丙氨酸辅酶A转移酶在体外条件下制备的GABA-CoA的分析结果。
图5显示使用酶即β-丙氨酸辅酶A转移酶在体外条件下制备的6ACA-CoA的分析结果。
图6显示使用酶即β-丙氨酸辅酶A转移酶在体外条件下制备的2-吡咯烷酮的分析结果。
图7显示使用酶即β-丙氨酸辅酶A转移酶在体外条件下制备的己内酰胺的分析结果。
图8显示用于在插入act基因的微生物中表达β-丙氨酸辅酶A转移酶而制备的pTac15k_act质粒。
图9显示通过培养向其中引入载体的重组微生物而制备的2-吡咯烷酮的分析结果。
图10显示使用酶即β-丙氨酸辅酶A转移酶在体外条件下制备的7AHA-CoA的分析结果。
图11显示使用酶即β-丙氨酸辅酶A转移酶在体外条件下制备的戊内酰胺的分析结果。
图12显示在本发明的一个示例性实施方案中从赖氨酸制备戊内酰胺的代谢途径。
图13显示用于在插入act基因的微生物中表达β-丙氨酸辅酶A转移酶而制备的pEKEx1_act质粒。
图14显示用于在插入gadB基因的微生物中表达谷氨酸脱羧酶而制备的pEKEx1_gadB质粒。
图15显示用于在插入act和gadB基因的微生物中表达β-丙氨酸辅酶A转移酶和谷氨酸脱羧酶而制备的pEKEx1_act_gadB质粒。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。通常，本文所使用的术语是本领域公知且常用的。
在本发明中，确定酶(β-丙氨酸辅酶A转移酶)以除作为天然ω-氨基酸底物的β-丙氨酸之外的各种ω-氨基酸作为底物，以形成相应的ω-氨酰基辅酶A，在没有酶帮助的情况下，所述ω-氨酰基辅酶A被转化为相应的内酰胺，并且因此可建立能够使用酶从ω-氨基酸制备各种内酰胺的系统(图1)。
在本发明中，进行实验以研究使用向其中引入编码β-丙氨酸辅酶A转移酶的基因的微生物制备内酰胺的可能性，β-丙氨酸辅酶A转移酶是一种将ω-氨基酸转化为ω-氨酰基-CoA的酶。因此，确定当使用向其中引入编码酶的基因的微生物时，制备内酰胺。
换言之，在本发明的一个实施方案中，为了确定是否通过GABA辅酶A由作为微生物中代表性ω-氨基酸的GABA制备2-吡咯烷酮，制备了其中克隆编码β-丙氨酸辅酶A转移酶的基因act的pTac15k_act载体(见图8)，然后将其引入野生大肠杆菌(Escherichia coli)。此外，GABA的前体谷氨酸与葡萄糖一起作为碳源提供，以在微生物中提供GABA。由于在上述培养条件下培养重组微生物，因此能够确定在微生物培养溶液中制备2-吡咯烷酮(一种内酰胺)(见图9)。
因此，在本发明的一方面，其涉及具有从ω-氨基酸生产内酰胺的能力的重组微生物，其中将编码β-丙氨酸辅酶A转移酶的基因引入微生物，所述微生物固有地具有ω-氨基酸生物合成代谢途径或引入ω-氨基酸生物合成代谢途径。
本发明中，术语“固有(inherent)”指其中微生物自身具有，而不通过基因重组将其添加到微生物中的代谢途径。例如，在本发明的一个实施方案中进行的从谷氨酸制备GABA的大肠杆菌代谢途径是通过糖酵解从葡萄糖生物合成谷氨酸，然后通过经内在谷氨酸脱羧酶(GadA或GadB)制备GABA的途径。
在本发明中，ω-氨基酸生物合成代谢途径可通过引入相应的基因而引入。例如，其特征可在于在大肠杆菌中引入从赖氨酸生物合成5-氨基戊酸(5AVA)的代谢途径。
在本发明中，从赖氨酸的5-氨基戊酸生物合成途径的特征可在于但不限于，引入编码δ-氨基戊酰胺酶的基因和编码赖氨酸2-单氧合酶的基因，并且编码δ-氨基戊酰胺酶的基因是来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的davA，并且编码赖氨酸2-单氧酶的基因是来源于恶臭假单胞菌的davB。
在本发明中，编码β-丙氨酸辅酶A转移酶的基因的特征可在于但不限于，来源于丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的act。
在本发明中，来源于丙酸梭菌的act的特征可在于但不限于，通过SEQ ID NO:1来描述。
在本发明中，β-丙氨酸辅酶A转移酶的特征可在于但不限于，通过SEQ ID NO:2来描述。
在本发明中，酶的特征可在于同源性，即序列相似性为50％以上，优选60％以上，并且更优选70％以上。
在本发明中，内酰胺可为任一化学物质，其特征在于具有杂环环结构，并且在环中具有酰胺键，但是优选的特征可在于下组中的一种：丙内酰胺、2-吡咯烷酮、戊内酰胺、己内酰胺、庚内酰胺、辛内酰胺、壬内酰胺、癸内酰胺、十一内酰胺和十二内酰胺。
在本发明中，ω-氨基酸可为任一化学物质，其特征在于同时具有胺和羧酸官能团，但是优选的特征可在于下组中的一种：β-丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、5-氨基戊酸(5AVA)、6-氨基己酸(6ACA)、7-氨基庚酸(7AHA)、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸、10-氨基癸酸、11-氨基十一酸和12-氨基十二酸。
在本发明中，β-丙氨酸的特征可在于但不限于，具有通过L-天冬氨酸-α-脱羧酶从天冬氨酸生物合成的途径，GABA的特征可在于但不限于，具有通过谷氨酸羧化酶(GadA或GadB)从谷氨酸生物合成的途径，5AVA的特征可在于具有通过δ-氨基戊酰胺酶(DavA)和赖氨酸2-单氧合酶(DavB)从赖氨酸生物合成的途径，6ACA和7AHA的特征可在于具有通过高柠檬酸合成酶、3-异丙基苹果酸脱水酶，异丙基苹果酸脱氢酶/异高柠檬酸脱氢酶，支链α-酮酸脱羧酶和丙酮酸转氨酶从α-酮谷氨酸生物合成的途径。
在本发明中，ω-氨基酸的特征可在于但不限于，从选自下组的碳源生物合成：单糖、二糖和多糖，其包括葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、木糖、甘油、果糖和甘蔗(sugarcane)。
在本发明中，重组微生物可为能够制备作为其前体的ω-氨基酸或用作碳源的任一微生物，并且其优选的特征可在于选自下组中的一种：细菌、酵母和真菌。
在本发明中，细菌的特征可在于但不限于，选自棒状杆菌属(Corynebacteriumgenus)和大肠杆菌中的一种。
在本发明的另一方面，其涉及从ω-氨基酸制备内酰胺的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)培养根据上述说明书所述的重组微生物以制备内酰胺；(b)回收所制备的内酰胺。
在本发明中，重组微生物的培养过程可使用常规已知的培养方法进行。除了用于本发明的实施例的特定培养基和特定培养方法之外，可使用除了增甜液体如乳清和玉米浆(CSL)之外的培养基，并且可使用各种方法，如补料分批培养和连续培养(Lee等人,Bioprocess Biosyst.Eng.,26:63,2003；Lee等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,58:663,2002；Lee等人,Biotechnol.Lett.,25:111,2003；Lee等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,54:23,2000；Lee等人,Biotechnol.Bioeng.,72:41,2001)。
与此同时，预测当在体外环境下使用酶时，各种内酰胺可由ω-氨基酸制备。
在本发明的另一个示例性实施方案中，进行酶测定以确证β-丙氨酸辅酶A转移酶对ω-氨基酸如GABA、6ACA和7AHA及β-丙氨酸(一种天然底物)起作用。首先，为了获得纯化的酶，通过克隆编码附接his标签的β-丙氨酸辅酶A转移酶的his-act基因来制备pET30α_his_act载体(图2)，并且纯化具有his标签的β-丙氨酸辅酶A转移酶(图3)。添加所纯化的蛋白质乙酰辅酶A和GABA、6ACA和7AHA以进行酶测定。此后，GABA辅酶A、6ACA辅酶A和7AHA辅酶A、ω-氨酰基辅酶A形成，使用HPLC-MS/MS或HPLC-MS确证各自的ω-氨基酸(图4、5和10)。
在本发明的又一个实施方案中，进行实验以确定在没有酶帮助的情况下，GABA辅酶A、5AVA辅酶A和6ACA辅酶A(其为一种代表性ω-氨酰基-CoA)被转化为相应的内酰胺。酶测定显示在不添加任一酶的情况下，制备GABA辅酶A、5AVA辅酶A和6ACA辅酶A，导致分别形成2-吡咯烷酮、戊内酰胺和己内酰胺(图6、7和11)。
因此，在本发明的另一方面，其提供从ω-氨基酸制备内酰胺的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)将β-丙氨酸辅酶A转移酶与含有ω-氨基酸的反应溶液混合，然后反应以制备ω-氨酰基-CoA；和(b)通过形成所制备的ω-氨酰基-CoA的环结构来制备内酰胺。
在本发明中，编码β-丙氨酸辅酶A转移酶的基因的特征可在于但不限于，是来源于丙酸梭菌的act。
在本发明中，内酰胺可为任一化学物质，其特征在于具有杂环环结构，并且在环中具有酰胺键，但是优选的特征可在于选自下组中的一种：丙内酰胺、2-吡咯烷酮、戊内酰胺、己内酰胺、庚内酰胺、辛内酰胺、壬内酰胺、癸内酰胺、十一内酰胺和十二内酰胺。
在本发明的又一个方面，其提供了使用向其中引入β-丙氨酸辅酶A转移酶基因的重组微生物从ω-氨基酸制备ω-氨酰基-CoA的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)培养重组微生物以制备ω-氨酰基-CoA；(b)回收所制备的ω-氨酰基-CoA。
在本发明中，回收所制备的ω-氨酰基-CoA的步骤的特征可在于但不限于，包括以下步骤：破坏细胞以获得含有ω-氨酰基-CoA的混合物；和通过纯化过程回收ω-氨酰基-CoA。
本发明所述的细胞破坏可通过本领域的技术人员已知的各种方法进行，并且优选特征在于但不限于使用声波方法进行。纯化过程的特征可在于但不限于使用色谱进行。
在本发明中，回收所制备的ω-氨酰基-CoA的步骤的特征在于进一步包括破坏细胞前固定细胞的步骤，或处理化合物以防止ω-氨酰基-CoA的环形成的步骤。
在本发明的又一方面，其涉及从ω-氨基酸制备ω-氨酰基-CoA的方法，其中所述方法包括以下步骤：在含有ω-氨基酸的反应溶液中混合β-丙氨酸辅酶A转移酶，然后反应以制备ω-氨酰基-CoA。
在本发明中，编码β-丙氨酸辅酶A转移酶的基因的特征可在于但不限于，是来源于丙酸梭菌的act。
在本发明中，ω-氨基酸可为任一化学物质，其特征在于同时具有胺和羧酸官能团，但是优选的特征可在于选自下组中的一种：β-丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、5-氨基戊酸(5AVA)、6-氨基己酸(6ACA)、7-氨基庚酸(7AHA)、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸、10-氨基癸酸、11-氨基十一酸和12-氨基十二酸。
在本发明中，术语“载体”指DNA产品，其含有可操作地连接到在适合宿主中能够表达DNA的适当调控序列的DNA序列。所述载体可为质粒、噬菌体颗粒或只是潜在基因组插入。一旦转化到适合的宿主中，载体可独立于宿主基因组复制和起作用，或在一些情况下，整合到宿主自己的基因组中。质粒是现有载体的最常用形式，术语“质粒”和“载体”在本发明的上下文中有时互换使用。然而，本发明包括具有与已知或本领域中已知的那些功能等效的其他形式的载体。用于哺乳动物细胞培养表达的典型表达载体基于例如，pRK5(EP 307,247)、pSV16B(WO 91/08291)和pVL1392(Pharmingen)。
短语“表达调控序列”指表达可操作地连接到特定宿主有机体的编码序列必需的DNA序列。所述调控序列包括进行转录的启动子、控制所述转录的任一操纵子序列、编码适合的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。例如，适合于原核生物细胞的调控序列包括启动子、任一操纵子序列和核糖体结合位点。真核生物细胞包括启动子、多腺苷酸化信号和增强子。质粒中基因表达水平的最重要的影响因子是启动子。作为高度表达的启动子，优选使用SRα启动子、巨细胞病毒来源的启动子等。
为了表达本发明所述的DNA序列，各种表达调控序列的任一种可用于载体。有用的表达调控序列的实例包括，例如SV40或腺病毒的早期启动子和后期启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T3和T7启动子、噬菌体λ的主要操纵子和启动子、fd编码蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、磷酸酶的启动子，如Pho5、酵母α-交配系统和已知控制这些病毒的基因表达的原核细胞或真核细胞或构成的启动子，和其他诱导序列以及它们的组合。T7RNA聚合酶启动子Ф10在大肠杆菌中可用于表达蛋白质NSP。
当与另一核酸序列处于功能关系中时，核酸是“可操作地连接的”。这可为当适合的分子(例如，转录激活蛋白)与(一种或多种)调控序列组合时以能够基因表达的方式连接的基因和(一种或多种)调控序列。例如，当作为参与多肽分泌的前体蛋白表达时，前肽序列(pre-sequence)或分泌的前导序列(leader)的DNA可操作地连接到多肽的DNA；当启动子或增强子影响序列的转录时，其可操作地连接到编码序列；当核糖体结合位点影响序列的转录时，其可操作地连接到编码序列；或当位于简单的翻译中时，核糖体结合位点可操作地连接到编码序列。通常，“可操作地连接”指所连接的DNA序列与读码框架接触，并且在分泌前导序列的情况下，与读码框架接触并位于读码框架中。然而，增强子不需要接触。这些序列的连接通过在合适的限制性酶切位点处接合(连结)而进行。如果所述位点不存在，则使用根据常规方法的合成寡核酸适配体(adapter)或接头(linker)。
本文使用的术语“表达载体”通常是向其中插入异源DNA的片段的重组载体，并且通常指双链DNA的片段。在此，异源DNA指不会天然存在于宿主细胞中的异源DNA。当表达载体在宿主细胞中时，其可独立于宿主染色体DNA复制，并且可产生载体和其插入的(异源)DNA的若干拷贝。
如本领域中熟知的，为了增加宿主细胞中转染基因的表达水平，相应的基因必须可操作地连接至在选择表达宿主发挥功能的转录和翻译表达调控序列。优选地，表达调控序列和相应的基因被包含在含有细菌选择标志物和复制起点的表达载体中。如果表达宿主是真核细胞，则表达载体应当进一步包括真核表达宿主中有用的表达标志物。
使用上述表达载体转化或转染的宿主细胞构成本发明的另一方面。本文使用的术语“转化”指将DNA引入到宿主中以使DNA可作为额外染色体因子复制或通过染色体整合复制。本文使用的术语“转染”指表达载体被宿主接受，无论是否实际表达任一编码序列。
本发明的宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。此外，通常使用具有高效引入DNA和高效表达所引入的DNA的宿主。已知真核和原核宿主如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、杆茵属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、真菌和酵母，昆虫细胞如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda(SF9))、动物细胞如CHO和小鼠细胞，非洲绿猴细胞如COS1、COS 7、BSC 1、BSC 40和BMT 10，以及组织培养的人细胞是可使用的宿主细胞的实例。当克隆本发明的编码NSP蛋白质的cDNA时，优选的是动物细胞用作宿主。在使用COS细胞的情况下，由于SV40大T抗原在COS细胞中表达，具有SV40复制起点的质粒作为细胞中附加体的多份拷贝存在，并且可预期比普通更高的表达。所引入的DNA序列可从与宿主细胞相同的物种中获得，或可从与宿主细胞不同的物种中获得，或其可为包括任一异源或同源DNA的杂交DNA序列。
此外，应当理解的是，不是所有载体和表达调控序列在表达本发明的DNA序列上发挥同样良好的作用。同样地，不是所有宿主对相同表达系统发挥相同作用。然而，在没有不适当的实验和不脱离本发明的范围的情况下，本领域技术人员能够在各种载体、表达调控序列和宿主中做出适当选择。例如，在选择载体中，应当考虑宿主，因为载体必须在其中复制。也必须考虑载体的拷贝数量、控制拷贝数量的能力和由相应载体编码的其他蛋白质的表达，如抗生素标志物。在选择表达调控序列中，必须考虑多种因素。例如，应当考虑序列的相对强度、与本发明的DNA序列的可控性和相容性，尤其是关于可能的二级结构。单一细胞宿主应当通过考虑如下因素来选择：选择的载体、由本发明的DNA序列编码的产物的毒性、分泌特征、正确折叠蛋白质的能力、培养和发酵的要求、容易从宿主中精制由本发明的DNA序列编码的产物。在这些变量的范围内，本领域技术人员可选择可在发酵或大型动物培养中表达本发明的DNA序列的各种载体/表达调控序列/宿主的组合。作为通过表达克隆而克隆NSP蛋白质的cDNA的筛选方法，可使用结合法(binding method)、淘选法(panningmethod)、膜乳液法(film emulsion method)等。
本发明的定义“基本上纯净”指根据本发明的多肽和编码多肽的DNA序列基本上不包含来源于细菌的其他蛋白质。
用于表达重组蛋白质的宿主细胞被广泛用于原核细胞，如大肠杆菌和枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)，其能够在短时间内培养高密度细胞，容易操作基因，并且具有良好的遗传和生理特征。然而，为了解决翻译后修饰、分泌过程、活性三维结构和蛋白质的活化状态的问题，由于近来，范围从单细胞真核细胞到更高的生物体的细胞，如酵母系列(毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)等)、丝状真菌、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞，用作制备重组蛋白质的宿主细胞，使用其他宿主细胞和在实施例中例示的大肠杆菌易于适用于本领域普通技术人员。
在下文中，将参考实施例详细描述本发明。本领域技术人员应当理解的是，这些实施例仅用于说明本发明，并且本发明的范围不被解释为被这些实施例限制。
实施例1.确证β-丙氨酸辅酶A转移酶的体外活性
1-1:pET30α_his_act载体的制备
来源于丙酸梭菌菌株的β-丙氨酸辅酶A转移酶的氨基酸序列和编码它的act基因的核酸序列分别示于SEQ ID NO:2和1。
使用丙酸梭菌菌株的染色体DNA作为模板及SEQ ID NO:3和4的引物进行PCR以制备编码在N端具有his标签的β-丙氨酸辅酶A的his_act基因片段。
[SEQ ID NO:3]ckphisact(NdeI,F):
5’-AGACAGCATATGCACCATCATCATCATCATAAAAGACCCTTGGA AGGTATTCG-3’
[SEQ ID NO:4]ckpact(SalI,R):
5’-AGACAGGTCGACTTAGATGACATTTTTCTCTTCCAGTGA-3’
随后，用限制性内切酶(NdeI和SalI)处理his_act片段和pET30α质粒，然后用T4DNA接合酶处理，以便使用限制性内切酶消化his_act片段，并且组合pET30α质粒以制备重组质粒pET30α_his_act(见图2)。
1-2:β-丙氨酸辅酶A转移酶的纯化
为了纯化β-丙氨酸辅酶A转移酶，将实施例1-1中获得的质粒pETa_his_act引入大肠杆菌BL21(DE3)(F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)(一种带有T7RNA聚合酶基因的前噬菌体)(New England Biolabs,USA)。
将转化菌株接种至10mL含有25mg/L卡那霉素(kanamycin)的LB液体培养基(10g/L胰化胨、5g/L酵母提取液和10g/L NaCl)并在37℃以200rpm连续震荡的早期培养之后，细胞在200ml上述培养基中接种1％，并且在37℃以200rpm不断震荡培养。然后，当在600nm波长测量的光密度(OD)在分光光度计中是0.4时，添加1mM IPTG以诱导his_act表达。
表达诱导4小时之后，在离心机(Hanil Science Industrial,Korea)中于4℃以3000rpm处理培养物10分钟以分离微生物并移除上清液。将所分离的微生物置于40mL平衡缓冲液(50mM Na3PO4,300mM NaCl,pH 7.0)，然后通过使用细胞超声波震荡器(Sonics&Materials,Inc.,USA)在30％强度脉冲5秒并静置5秒持续2小时的方法溶解，然后在4℃以13200rpm离心10分钟以移除细胞碎片然后获得细胞裂解液。
使用0.45μm过滤器纯化细胞裂解液，并且带his标签的β-丙氨酸辅酶A转移酶使用Talon树脂(Clontech Laboratories,Inc.,USA)分离。附着在Talon树脂上的β-丙氨酸辅酶A转移酶的分离分别使用含有7.5、15、30、45、60、90、120和150mM咪唑的平衡缓冲溶液进行。此后，全细胞裂解液、通过talon树脂的蛋白质溶液和使用各浓度咪唑获得的蛋白质溶液与5×Laemmli样品缓冲溶液(LPS Solution,Korea)混合的样品使用12％SDS-PAGE分离，并且使用考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)R250(Bio-Rad,USA)溶液染色(见图3)。因此，使用纯化为最高纯度120mM的β-丙氨酸辅酶A转移酶。
1-3:β-丙氨酸辅酶A转移酶的酶测定
酶测定在50mM磷酸钾缓冲溶液(pH 7.5)中进行。酶测定需要的底物和酶如下添加。添加10mM GABA、6ACA或7AHA,1mM乙酰基-CoA和2.5μg纯化的β-丙氨酸辅酶A转移酶，并且在30℃反应2小时。为了从酶测定混合物中分离仅有的辅酶A衍生物，使用以下方案和OASIS HLB SPE管柱(cartridge)(Waters,USA)。
第一管柱倒入1mL甲醇、接着2mL 0.15％TCA溶液。之后，使酶测定的混合物流过，然后再次流过1mL 0.15％TCA溶液。最后，流过体积比为99:1的1mL甲醇和NH4OH的溶液，以获得纯化的辅酶A衍生物。使用真空离心机吹走溶剂，并且在-24℃储存样品。
就在使用HPLC-MS(质谱仪:LC/MSD VL,Agilent,USA,HPLC:Agilent,USA)或HPLC-MS/MS(质谱仪:API3200QTRAP,SCIEX,USA,HPLC:Shimadzu,Japan)分析之前，将样品溶解在蒸馏水中，然后分析辅酶A衍生物。在酶测定混合物使用GABA和6ACA作为底物的情况下，使用HPLC-MS/MS以阳性模式进行分析，而在测定混合物使用7AHA作为底物的情况下，使用HPLC-MS以阴性模式进行分析。
因此，使用GABA作为底物的酶测定混合物的初次MS分析显示852.2的峰值，其与GABA辅酶A的预期m/z值853相似。该峰值使用二次MS片段化，并且进行分析。因此，确证243.1、345.5和428.1的峰值，其分别与预期峰值m/z＝244、346和428相似(见图4)。此外，使用6ACA作为底物的酶测定混合物的初次MS分析显示881.3的峰值，其与GABA辅酶A的预期m/z值881相似。该峰值使用二次MS片段化，并且进行分析。因此，确证272.2、374.3和428.2的峰值，其分别与预期峰值m/z＝272、374和428相似(见图5)。此外，在使用7AHA作为底物的酶测定混合物的情况下，确证新的CoA衍生物峰值出现在t＝9.844分钟，并且具有与7AHA辅酶A的预期m/z值893.2相同的值
从这些结果中，确证根据本发明β-丙氨酸辅酶A转移酶成功地将GABA、6ACA和7AHA分别转化为GABA辅酶A、6ACA辅酶A和7AHA辅酶A。
实施例2.确证体外产生2-吡咯烷酮、戊内酰胺和己内酰胺
GABA辅酶A、5AVA辅酶A和6ACA辅酶A通过使用实施例1-3所述的方法进行酶测定。在没有任何处理的情况下，使所得GABA辅酶A、5AVA辅酶A和6ACA辅酶A在37℃静置48小时，然后使用HPLC-MS分析以确证产生2-吡咯烷酮、戊内酰胺和己内酰胺。
因此，标准的2-吡咯烷酮试剂(Sigma-Aldrich,USA)通过HPLC-MS进行分析，以检测2-吡咯烷酮在6.352分钟的峰值，并且该峰值通过MS分析进行分析，以确证示于m/z＝86.1和108.1的峰值。作为对照，分析不含有β-丙氨酸辅酶A转移酶，即不产生GABA辅酶A的测定混合物。因此，确证没有峰值出现在6分钟频段。
在其中添加β-丙氨酸辅酶A转移酶以制备GABA辅酶A的测定混合物样品中，在6.348分钟检测到峰值，其与标准2-吡咯烷酮试剂的峰值相似。峰值的MS分析显示，在m/z＝86.0和108.0检测到峰值，其与标准2-吡咯烷酮试剂的峰值相似(见图6)。此外，作为通过HPLC-MS进行标准戊内酰胺试剂(Sigma-Aldrich,USA)的分析结果，在8.098分钟检测到戊内酰胺的峰值，峰值的MS分析显示，峰值出现在m/z＝100.1。
在其中添加β-丙氨酸辅酶A转移酶以制备5AVA辅酶A的测定混合物样品中，在8.092分钟检测到峰值，其与标准戊内酰胺试剂的峰值相似。峰值的MS分析显示，在m/z＝100.1检测到峰值，其与标准戊内酰胺试剂的峰值相似(见图11)。通过HPLC-MS进行标准己内酰胺试剂(Sigma-Aldrich,USA)的分析显示，在9.395分钟检测到己内酰胺的峰值。峰值的MS分析显示峰值分别出现在m/z＝114.1和136.0。
在其中因为β-丙氨酸辅酶A转移酶不进入所以不产生6ACA辅酶A的测定混合物的情况下，因为上述逻辑，在9分钟频段没有检测到峰值。在其中添加β-丙氨酸辅酶A转移酶以制备6ACA辅酶A的测定混合物样品的情况下，在9.469分钟检测到峰值，与标准己内酰胺的峰值相似。该峰值的MS分析确证，在m/z＝114.1和136.0检测到峰值，与标准己内酰胺的峰值相似(见图7)。
从这些结果中，确证在没有酶的帮助的情况下，使用根据本发明的β-丙氨酸辅酶A转移酶制备的GABA辅酶A、5AVA辅酶A和6ACA辅酶A分别被转化为2-吡咯烷酮、戊内酰胺和己内酰胺。
实施例3.使用重组微生物从ω-氨基酸产生内酰胺
3-1:pTac15k_act载体的制备
编码β-丙氨酸辅酶A的act基因片段通过使用SEQ ID NO:5和6的引物并以丙酸梭菌菌株的染色体DNA作为模板进行PCR来制备。
[SEQ ID NO:5]ckpact(EcoRI,F):
5’-AGACAGGAATTCATGAAAAGACCCTTGGAAGGTATT-3’
[SEQ ID NO:6]ckpact(SacI,R):
5’-AGACAGGTCGACTTAGATGACATTTTTCTCTTCCAGTG-3’
随后，用限制性内切酶(EcoRI和SacI)处理进行act片段和tac启动子的强基因表达的pTac15k(Hiszczyn’ska-Sawicka and Kur,1997)质粒，然后用T4DNA接合酶处理，以便接合限制性内切酶切割的act片段和pTac15k质粒以制备重组质粒pTac15k_act(见图8)。
3-2:pEKEx1_act载体的制备
用限制性内切酶(EcoRI和BamHI)处理进行实施例3-1中制备的act片段和tac启动子的强基因表达的pEKEx1(Eikmanns等人,Gene.102,93-98,1991)质粒，然后用T4DNA接合酶处理，以便接合限制性内切酶切割的act片段和pEKEx1质粒以制备重组质粒pEKEx_act(见图13)。
3-3:pEKEx1_gadB载体的制备
使用大肠杆菌菌株的染色体DNA作为模板，使用SEQ ID NO:8和9的引物进行PCR以制备编码谷氨酸脱羧酶的gadB基因片段。
[SEQ ID NO:7]ecjgadB(BamHI,RBS,F):
5’-AGACAGGGATCCTTTCACACAGGAAACAATGGATAAGAAGCAAGTAACGGATT-3’
[SEQ ID NO:8]ecjgadB(Sall,R):
5’-AGACAGGTCGACTCAGGTATGTTTAAAGCTGTTCTGTT-3’
随后，使用限制性内切酶(BamHI和SacI)处理进行gadB片段和tac启动子的强基因表达的pEKEx1(Eikmanns等人,Gene.102,93-98,1991)质粒，然后用T4DNA接合酶处理，以便接合限制性内切酶切割的gadB片段和pEKEx1质粒以制备重组质粒pEKEx_gadB(见图14)。
3-4:pEKEx1_act_gadB载体的制备
使用限制性内切酶(BamHI和SacI)处理实施例3-2中制备的pEKEx1-act质粒和实施例3-2中制备的gadB片段，然后用T4DNA接合酶处理，以便接合限制性内切酶切割的gadB片段和pEKEx1_act质粒以制备重组质粒pEKEx_act_gadB(见图15)。
3-5:制备重组微生物
将实施例3-1中制备的pTac15k_act质粒引入大肠杆菌WL3110(Lee等人.,Mol.Syst.Biol.3:149 2007)中，以便编码β-丙氨酸辅酶A基因的act基因在微生物中表达，从而制备重组微生物(WL3110/pTac15k-act)，并且使用向其中引入pTac15k空载体的大肠杆菌(WL3110/pTac15k)作为对照菌株。
此外，为了检测各种碳源制备的可能性，将实施例3-1中制备的pTac15k_act质粒引入到大肠杆菌XQ56/pKE112-davAB(Park等人,Metab.Eng.16:42-47 2013)中，以便编码β-丙氨酸辅酶A基因的act基因在微生物中表达，从而制备重组微生物(XQ56/pKE112-davAB/pTac15k-act)，并且使用向其中引入pTac15k空载体的大肠杆菌(XQ56/pKE112-davAB/pTac15k)作为对照菌株。
此外，为了检测各种碳源制备的可能性，将实施例3-4中制备的pEKEx1_act_gadB质粒引入到野生型谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)(ATCC 13032)中，以便编码用于GABA生物合成的谷氨酸脱羧酶基因的gadB基因和编码β-丙氨酸辅酶A基因的act基因在微生物中表达，从而制备重组微生物(ATCC 13032/pEKEx1_act_gadB)。向其中引入pEKEx1_gadB质粒的谷氨酸棒状杆菌(ATCC 13032/pEKEx1_gadB)用作对照菌株。pEKEx1_gadB质粒在实施例3-3中制备，并且仅表达gadB基因。
3-6:确证使用重组微生物从GABA产生2-吡咯烷酮
将实施例3-5中制备的重组微生物(WL3110/pTac15k-act)接种在10mL LB培养基中，在37℃预培养8小时，并且将1.5mL预培养的培养基接种在350mL瓶的50mL改良MR-1培养基中并培养。
改良的MR-1培养基的组合物(pH 7.0)含有每1升蒸馏水10g葡萄糖、5g GABA、9g(NH4)2SO4、6.67g KH2PO4、4.0g(NH4)2HPO4、0.8g柠檬酸、0.8g MgSO4·7H2O、0.01g CaCl2·2H2O、5mL微量金属溶液(每1升蒸馏水10g FeSO4·7H2O、2.2g ZnSO4·4H2O、0.58g MnSO4·4H2O、1g CuSO4·5H2O、0.1g(NH4)6Mo7O24·4H2O、0.02g Na2B4O7·10H2O)。在上述组合物中提供作为碳源的GABA。培养在37℃和200rpm运转的震荡培养箱(jSR,Korea)中进行48小时。在完成培养后，培养溶液在13,200rpm离心10分钟，并且仅收集上清液，并经过HPLC-MS分析以确证产生2-吡咯烷酮。
因此，如表1所示，确证根据本发明所述的重组微生物产生193.78mg/L 2-吡咯烷酮，而在向其中转化空载体的重组微生物中根本不产生2-吡咯烷酮。
从这些结果中，确证根据本发明的重组微生物使用GABA作为碳源成功地产生2-吡咯烷酮。
[表1]
重组微生物的2-吡咯烷酮的产量(mg/L)
| 菌株 | 2-吡咯烷酮的产量(mg/L) |
| WL3110/pTac15k | 0 |
| WL3110/pTac15k-act | 193.78 |
3-7:确证使用重组微生物从5AVA产生戊内酰胺
将实施例3-5中制备的重组微生物(WL3110/pTac15k-act)接种在10mL LB培养基中，在37℃预培养8小时，并且将1.5mL预培养的培养基接种在350mL瓶的50mL改良MR-2培养基中并培养。
改良的MR-2培养基的组合物(pH 7.0)含有每1升蒸馏水10g葡萄糖、5g5AVA、9g(NH4)2SO4、6.67g KH2PO4、4.0g(NH4)2HPO4、0.8g柠檬酸、0.8g MgSO4·7H2O、0.01g CaCl2·2H2O、5mL微量金属溶液(每1升蒸馏水10g FeSO4·7H2O、2.2g ZnSO4·4H2O、0.58g MnSO4·4H2O、1g CuSO4·5H2O、0.1g(NH4)6Mo7O24·4H2O、0.02g Na2B4O7·10H2O)。在上述组合物中提供作为碳源的5AVA。培养在37℃和200rpm运转的震荡培养箱(jSR,Korea)中进行48小时。在完成培养后，培养溶液在13,200rpm离心10分钟，并且仅收集上清液，并经过HPLC-MS分析以确证产生2-吡咯烷酮。
因此，如表2所示，确证根据本发明所述的重组微生物产生592.68mg/L戊内酰胺。
从这些结果中，确证根据本发明的重组微生物使用5AVA作为碳源成功地产生戊内酰胺。
[表2]
重组微生物的戊内酰胺的产量(mg/L)
| 菌株 | 戊内酰胺的产量(mg/L) |
| WL3110/pTac15k-act | 592.68 |
实施例4.使用重组微生物从其他碳源产生内酰胺
4-1:确证使用重组微生物从谷氨酸产生2-吡咯烷酮
将实施例3-5中制备的重组微生物(WL3110/pTac15k-act)接种在10mL LB培养基中，在37℃预培养8小时，并且将1.5mL预培养的培养基接种在350mL瓶的50mL改良M9培养基中并培养。
改良的M9培养基的组合物(pH 7.0)含有每1升蒸馏水10g葡萄糖、5g谷氨酸、6.78gNa2HPO4、3.0g KH2PO4、0.5g NaCl、1.0g NH4Cl、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2、10mg硫胺。在上述组合物中，提供作为碳源的谷氨酸以在微生物中提供GABA。培养在37℃和200rpm运转的震荡培养箱(jSR,Korea)中进行48小时。在完成培养后，培养溶液在13,200rpm离心10分钟，并且仅收集上清液，并经过HPLC-MS分析以确证产生2-吡咯烷酮。
因此，如图9所示，确证根据本发明所述的重组微生物在6.445分钟显示与2-吡咯烷酮标准物质的峰相似的峰，并且峰的分析显示，在m/z＝86.0和108.0检测到与标准2-吡咯烷酮的峰相同的峰，而在向其中转化空载体的重组微生物中根本不产生2-吡咯烷酮。
从这些结果中，确证根据本发明的重组微生物使用谷氨酸作为碳源成功地产生2-吡咯烷酮。
4-2:确证使用重组微生物从葡萄糖产生戊内酰胺
将实施例3-5中制备的重组微生物(XQ56/pKE112-davAB/pTac15k-act)接种在10mL LB培养基中，在37℃预培养8小时，并且将1.5mL预培养的培养基接种在350mL瓶的50mL改良MR-3培养基中并培养。
改良的MR-3培养基的组合物(pH 7.0)含有每1升蒸馏水10g葡萄糖、9g(NH4)2SO4、6.67g KH2PO4、4.0g(NH4)2HPO4、0.8g柠檬酸、0.8g MgSO4·7H2O、0.01g CaCl2·2H2O、5mL微量金属溶液(每1升蒸馏水10g FeSO4·7H2O、2.2g ZnSO4·4H2O、0.58g MnSO4·4H2O、1gCuSO4·5H2O、0.1g(NH4)6Mo7O24·4H2O、0.02g Na2B4O7·10H2O)。在上述组合物中提供作为碳源的葡萄糖。培养在37℃和200rpm运转的震荡培养箱(jSR,Korea)中进行36小时。在完成培养后，培养溶液在13,200rpm离心10分钟，并且仅收集上清液，并经过HPLC-MS分析以确证产生戊内酰胺。
因此，如表3所示，确证根据本发明所述的重组微生物制备28.36mg/L戊内酰胺，而在向其中转化空载体的重组微生物中根本不产生戊内酰胺。
从这些结果中，确证根据本发明的重组微生物使用葡萄糖作为碳源成功地产生戊内酰胺。
[表3]
重组微生物的戊内酰胺的产量(mg/L)
| 菌株 | 戊内酰胺的产量(mg/L) |
| XQ56/pKE112-davAB/pTac15k | 0 |
| XQ56/pKE112-davAB/pTac15k-act | 28.36 |
4-3:确证使用重组微生物从葡萄糖产生2-吡咯烷酮
将实施例3-5中制备的重组微生物(ATCC 13032/pEKEx1_act_gadB)接种在5mL RG培养基(40g/L脑心浸液、10g/L葡萄糖、10g/L浓缩牛肉汁、30g/L山梨糖醇)中，在30℃预培养12小时，并且将1.5mL预培养的培养基接种在350mL瓶的50mL GP1培养基中并培养。
GP1培养基的组合物(pH 7.0)含有每1升蒸馏水50g葡萄糖、50g(NH4)2SO4、1.0gK2HPO4、3.0g尿素、0.4g MgSO4·7H2O、50g蛋白胨、0.01g FeSO4、0.01g MnSO4·5H2O、200μg硫胺、0.1mM5-磷酸吡哆醛水合物、50μg生物素。在上述组合物中提供作为碳源的葡萄糖。培养在30℃和200rpm运转的震荡培养箱(jSR,Korea)中进行96小时。在完成培养后，培养溶液在13,200rpm离心10分钟，并且仅收集上清液，并经过HPLC-MS分析以确证产生戊内酰胺。
[表4]
重组微生物的2-吡咯烷酮的产量(mg/L)
| 菌株 | 2-吡咯烷酮的产量(mg/L) |
| ATCC 13032/pEKEx1_gadB | 0 |
| ATCC 13032/pEKEx1_act_gadB | 75.92 |
尽管本发明的上下文的特定部分已经如上进行详细描述，本领域技术人员将理解的是，这些特定说明仅仅是优选的示例性实施方案，并且本发明的范围不限于此。因此，本发明的实际范围将通过所附权利要求及其等同物来限定。
工业实用性
本发明的重组微生物能够从ω-氨基酸制备各种内酰胺化合物，如丙内酰胺、2-吡咯烷酮、戊内酰胺和己内酰胺，并且因此可用于内酰胺的工业化生产。
序列表
<110> 韩国科学技术院
<120> 内酰胺的制备方法
<130> PF-B1914-CN
<140> PCT/KR2016/003758
<141> 2016-04-11
<150> 10-2015-0051994
<151> 2015-04-13
<150> 10-2016-0043539
<151> 2016-04-08
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1194
<212> DNA
<213> act 基因
<400> 1
atgaaaagac ccttggaagg tattcgtgta cttgatttaa cacaggctta cagtggcccc 60
ttttgtacaa tgaatcttgc tgatcatggt gctgaggtta ttaaaattga gcgccccggc 120
agtggagatc aaacaagagg ttgggggcct atggaaaatg actacagtgg ctactatgct 180
tacattaacc gtaataaaaa aggaatcacc ttaaatcttg cttccgaaga aggaaagaaa 240
gtttttgccg aattggttaa atctgccgat gtgatttgcg aaaactataa ggttggtgtt 300
ttagaaaaat taggcttttc ctatgaggtc ttaaaagaac tcaacccccg catcatttat 360
ggctccatca gcggttttgg attaacaggt gaattgtcct cccgcccctg ctatgatatc 420
gtcgctcaag caatgagcgg aatgatgagt gtaaccggct ttgcagacgg tcctccctgc 480
aaaatcggcc cttctgtagg agatagctat actggtgcat atttgtgcat gggtgttttg 540
atggcattat acgaaagaga aaaaacaggc gttggccgcc gtatcgatgt gggaatggta 600
gataccctgt tctctacaat ggaaaacttt gttgttgaat acaccattgc tggtaagcat 660
ccccaccgtg caggcaatca agatccaagt attgcccctt ttgactcctt tagggcaaaa 720
gattcggatt ttgtaatggg gtgtggcaca aacaaaatgt ttgcaggact atgtaaagca 780
atgggcagag aggatttgat tgatgatcct cgtttcaata caaacctgaa tcgttgtgat 840
aactatttaa atgacttaaa gccaatcatc gaagaatgga cccaaacaaa gaccgttgca 900
gagttagagg aaatcatctg cggactttcc attcccttcg gcccaatcct cacgattccc 960
gagatttctg agcattcctt aacaaaagaa agaaatatgc tttgggaagt ttatcagcct 1020
ggcatggata gaacaattcg cattcccggc tcccctatta aaatccacgg tgaagaagat 1080
aaggctcaga aaggtgcccc tattctggga gaagacaatt ttgctgtcta cgcagaaatt 1140
ttaggtctct cagtagaaga aattaaatca ctggaagaga aaaatgtcat ctaa 1194
<210> 2
<211> 397
<212> PRT
<213> act 蛋白质
<400> 2
Met Lys Arg Pro Leu Glu Gly Ile Arg Val Leu Asp Leu Thr Gln Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Gly Pro Phe Cys Thr Met Asn Leu Ala Asp His Gly Ala Glu
20 25 30
Val Ile Lys Ile Glu Arg Pro Gly Ser Gly Asp Gln Thr Arg Gly Trp
35 40 45
Gly Pro Met Glu Asn Asp Tyr Ser Gly Tyr Tyr Ala Tyr Ile Asn Arg
50 55 60
Asn Lys Lys Gly Ile Thr Leu Asn Leu Ala Ser Glu Glu Gly Lys Lys
65 70 75 80
Val Phe Ala Glu Leu Val Lys Ser Ala Asp Val Ile Cys Glu Asn Tyr
85 90 95
Lys Val Gly Val Leu Glu Lys Leu Gly Phe Ser Tyr Glu Val Leu Lys
100 105 110
Glu Leu Asn Pro Arg Ile Ile Tyr Gly Ser Ile Ser Gly Phe Gly Leu
115 120 125
Thr Gly Glu Leu Ser Ser Arg Pro Cys Tyr Asp Ile Val Ala Gln Ala
130 135 140
Met Ser Gly Met Met Ser Val Thr Gly Phe Ala Asp Gly Pro Pro Cys
145 150 155 160
Lys Ile Gly Pro Ser Val Gly Asp Ser Tyr Thr Gly Ala Tyr Leu Cys
165 170 175
Met Gly Val Leu Met Ala Leu Tyr Glu Arg Glu Lys Thr Gly Val Gly
180 185 190
Arg Arg Ile Asp Val Gly Met Val Asp Thr Leu Phe Ser Thr Met Glu
195 200 205
Asn Phe Val Val Glu Tyr Thr Ile Ala Gly Lys His Pro His Arg Ala
210 215 220
Gly Asn Gln Asp Pro Ser Ile Ala Pro Phe Asp Ser Phe Arg Ala Lys
225 230 235 240
Asp Ser Asp Phe Val Met Gly Cys Gly Thr Asn Lys Met Phe Ala Gly
245 250 255
Leu Cys Lys Ala Met Gly Arg Glu Asp Leu Ile Asp Asp Pro Arg Phe
260 265 270
Asn Thr Asn Leu Asn Arg Cys Asp Asn Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Pro
275 280 285
Ile Ile Glu Glu Trp Thr Gln Thr Lys Thr Val Ala Glu Leu Glu Glu
290 295 300
Ile Ile Cys Gly Leu Ser Ile Pro Phe Gly Pro Ile Leu Thr Ile Pro
305 310 315 320
Glu Ile Ser Glu His Ser Leu Thr Lys Glu Arg Asn Met Leu Trp Glu
325 330 335
Val Tyr Gln Pro Gly Met Asp Arg Thr Ile Arg Ile Pro Gly Ser Pro
340 345 350
Ile Lys Ile His Gly Glu Glu Asp Lys Ala Gln Lys Gly Ala Pro Ile
355 360 365
Leu Gly Glu Asp Asn Phe Ala Val Tyr Ala Glu Ile Leu Gly Leu Ser
370 375 380
Val Glu Glu Ile Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asn Val Ile
385 390 395
<210> 3
<211> 53
<212> DNA
<213> ckphisact
<400> 3
agacagcata tgcaccatca tcatcatcat aaaagaccct tggaaggtat tcg 53
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> ckpact(SalI, R)
<400> 4
agacaggtcg acttagatga catttttctc ttccagtga 39
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> ckpact(EcoRI, F)
<400> 5
agacaggaat tcatgaaaag acccttggaa ggtatt 36
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> ckpact(SacI, R)
<400> 6
agacaggtcg acttagatga catttttctc ttccagtg 38
<210> 7
<211> 53
<212> DNA
<213> ecjgadB(BamHI, RBS, F)
<400> 7
agacagggat cctttcacac aggaaacaat ggataagaag caagtaacgg att 53
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> ecjgadB(SalI, R)
<400> 8
agacaggtcg actcaggtat gtttaaagct gttctgtt 38
Claims (19)
1.一种具有从ω-氨基酸生产内酰胺的能力的重组微生物，其中将编码β-丙氨酸辅酶A转移酶的基因引入微生物，所述微生物固有地具有ω-氨基酸生物合成代谢途径或引入ω-氨基酸生物合成代谢途径。
2.权利要求1的重组微生物，其中所述编码β-丙氨酸辅酶A转移酶的基因是来源于丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的act。
3.权利要求1的重组微生物，其中所述内酰胺选自下组：丙内酰胺、2-吡咯烷酮、戊内酰胺、己内酰胺、庚内酰胺、辛内酰胺、壬内酰胺、癸内酰胺、十一内酰胺和十二内酰胺。
4.权利要求1的重组微生物，其中所述ω-氨基酸选自下组：β-丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、5-氨基戊酸(5AVA)、6-氨基己酸(6ACA)、7-氨基庚酸(7AHA)、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸、10-氨基癸酸、11-氨基十一酸和12-氨基十二酸。
5.权利要求1的重组微生物，其中所述ω-氨基酸生物合成途径是γ-氨基丁酸(GABA)生物合成代谢途径。
6.权利要求1的重组微生物，其中所述ω-氨基酸生物合成途径是5-氨基戊酸(5AVA)生物合成代谢途径。
7.权利要求6的重组微生物，其中所述5-氨基戊酸(5AVA)生物合成代谢途径引入编码δ-氨基戊酰胺酶的基因和编码赖氨酸2-单氧合酶的基因。
8.权利要求7的重组微生物，其中所述编码δ-氨基戊酰胺酶的基因是来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的davA并且所述编码赖氨酸2-单氧合酶的基因是来源于恶臭假单胞菌的davB。
9.权利要求1的重组微生物，其中所述ω-氨基酸从选自下组的碳源进行生物合成：单糖、二糖和多糖，包括葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、木糖、甘油、果糖和甘蔗。
10.权利要求1的重组微生物，其中所述重组微生物选自下组：细菌、酵母和真菌。
11.一种从ω-氨基酸制备内酰胺的方法，其包括：
(a)培养权利要求1的重组微生物以产生内酰胺；和
(b)回收所产生的内酰胺。
12.一种从ω-氨基酸制备内酰胺的方法，其包括：
(a)将β-丙氨酸辅酶A转移酶与含有ω-氨基酸的反应溶液混合并且反应以制备ω-氨酰基-CoA；和
(b)通过形成所产生的ω-氨酰基-CoA的环结构来制备内酰胺。
13.权利要求12的方法，其中编码β-丙氨酸辅酶A转移酶的基因是来源于丙酸梭菌的act。
14.权利要求12的方法，其中所述内酰胺选自下组：丙内酰胺、2-吡咯烷酮、戊内酰胺、己内酰胺、庚内酰胺、辛内酰胺、壬内酰胺、癸内酰胺、十一内酰胺和十二内酰胺。
15.权利要求12的方法，其中所述ω-氨基酸选自下组：β-丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、5-氨基戊酸(5AVA)、6-氨基己酸(6ACA)、7-氨基庚酸(7AHA)、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸、10-氨基癸酸、11-氨基十一酸和12-氨基十二酸。
16.一种从ω-氨基酸制备ω-氨酰基-CoA的方法：
(a)培养权利要求1的重组微生物以产生ω-氨酰基-CoA；和
(b)回收所产生的ω-氨酰基-CoA。
17.一种从ω-氨基酸制备ω-氨酰基-CoA的方法，其包括：在含有ω-氨基酸的反应溶液中混合β-丙氨酸辅酶A转移酶，然后反应以制备ω-氨酰基-CoA。
18.权利要求17的方法，其中编码β-丙氨酸辅酶A转移酶的基因是来源于丙酸梭菌的act。
19.权利要求17的方法，其中所述ω-氨基酸选自下组：β-丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、5-氨基戊酸(5AVA)、6-氨基己酸(6ACA)、7-氨基庚酸(7AHA)、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸、10-氨基癸酸、11-氨基十一酸和12-氨基十二酸。
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