CN101014709B

CN101014709B - 由粗糙脉孢菌产生的γ-丁基甜菜碱羟化酶

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Publication number: CN101014709B
Application number: CN2005800063086A
Authority: CN
Inventors: 钟孙欧; 李宏克; 康万库; 久杰永; 寇运孙; 帕孙斯; 帕永宏
Original assignee: CJ Corp
Current assignee: CJ Corp
Priority date: 2004-02-26
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2025-02-25
Also published as: EP1725663B1; EP1725663A1; US20080050788A1; EP1725663A4; JP4549384B2; JP2007525221A; ATE509105T1; KR100565732B1; WO2005083089A1; CN101014709A; ES2362488T3; US8597924B2; KR20050087302A

Abstract

本发明公开了由粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)产生的编码γ-丁基甜菜碱羟化酶(γ-BBH)的多聚核苷酸。还公开了包含该多聚核苷酸的重组载体，用该重组载体转化的转化体，由该多聚核苷酸编码的γ-BBH，以及一种制备L-肉碱的方法，所述方法包括使用由该多聚核苷酸编码的γ-BBH将γ-三甲铵丁酸羟基化。

Description

由粗糙脉孢菌产生的γ-丁基甜菜碱羟化酶

技术领域

本发明涉及一种由粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)产生的γ-丁基甜菜碱羟化酶(γ-BBH)。特别是本发明涉及由粗糙脉孢菌产生的编码γ-丁基甜菜碱羟化酶的多聚核苷酸，包含该多聚核苷酸的重组载体，用该重组载体转化的转化体，由该多聚核苷酸编码的γ-丁基甜菜碱羟化酶，以及一种使用该多聚核苷酸编码的γ-丁基甜菜碱羟化酶使γ-三甲铵丁酸(γ-butyrobetaine)羟基化制备L-肉碱的方法。

背景技术

L-肉碱(3-羟基-4-三甲铵基-丁酸)也称维生素Bt，是一种在人体代谢中非常重要的天然的维生素类似物。L-肉碱由2名俄国科学家Gulewitsch和Krimberg于1905年首先从牛的肌肉组织中分离出来，并于1932年确定了其化学结构。几乎在所有的机体细胞中都可以发现L-肉碱，它输送活化后的游离长链脂肪酸穿过线粒体内膜。由于线粒体内膜对于脂酰基-辅酶A来说是无法通过的屏障，因此游离的长链脂肪酸在细胞质中活化为脂酰CoA，并经L-肉碱酯化后可通过该膜。当骨骼肌，肝，心，肾中的L-肉碱水平较低时，游离长链脂肪酸难以作为能量源加以利用。这种异常的肉碱代谢可引起多种疾病，包括发育迟缓，心肌炎和肌无力等。当机体中不能合成足够量的L-肉碱时，应由食物摄入肉碱以防止肉碱缺乏症状。尤其对于不能生物合成L-肉碱的婴儿来说，L-肉碱是一种必需营养素。

L-肉碱可作为药物制剂中的一种活性成份。需要外源性补充L-肉碱以治疗肉碱缺乏症及其他疾病，尤其是心脏疾病。近来，L-肉碱的治疗作用日显重要(R.A.Frenkel和J.D.Mc Garry，”肉碱的生物合成，代谢和功能”，学院出版社，1980)。

已确认L-肉碱对于机体有多种重要作用。但是，传统的生产方法包括生物提取法不适合大规模生产L-肉碱。一种可容易获取L-肉碱的方法是利用包括光学异构体的DL-肉碱。但该方法在机体可引起副作用，因其含有D-肉碱(Curr.Ther.Res.28，195-198，1980)。在很多情况下，D-肉碱在机体内与L-肉碱进行竞争，并阻碍游离长链脂肪酸在线粒体上的β-氧化。对于肾功能严重损伤的患者来说，这种长链脂肪酸的代谢障碍，可引起更严重抑制。

为获得光学纯L-肉碱，进行了多种尝试，其中包括化学光学拆分方法(美国专利No.5,166,426)，使用微生物或酶的生物方法(美国专利No.5,187,093)和使用手性化合物作为起始化合物生产L-肉碱的方法(美国专利No.6,420,599B2)。

在各种获得L-肉碱的方法中，使用微生物或酶的生物方法是使用了一种生物酶-γ-丁基甜菜碱羟化酶来生产光学活性的L-肉碱。在鼠和人中都分离到了该生物酶(Rebouche和Engel，J Biol Chem 255：8700-8705，1980)，并测定了其核苷酸序列。高等生物(包括哺乳动物)利用蛋白质的氨基酸残基-赖氨酸作为L-肉碱生物合成的前体，而粗糙脉孢菌由游离的赖氨酸制备光学纯L-肉碱(Fraenkel，Biol Bull，104：359-377，1953)。该L-肉碱的生物合成机理简述如下。肉碱的合成起始于由S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体对赖氨酸进行甲基化，形成ε-N-三甲基赖氨酸。三甲赖氨酸经酶催化转化为β-羟基-三甲基赖氨酸。由所合成的β-羟基-三甲基赖氨酸形成三甲基氨基丁醛，然后转化为γ-三甲铵丁酸。

在本发明之前，从粗糙脉孢菌中生产出来并使用通过上述机制产生的γ-三甲铵丁酸作为前体生产L-肉碱的编码γ-丁基甜菜碱羟化酶的核苷酸序列还未被鉴定。

发明内容

基于以上背景知识，本发明人测定了粗糙脉孢菌产生的编码γ-丁基甜菜碱羟化酶的新基因，并通过生物方法成功的由γ-三甲铵丁酸生产L-肉碱，所述的生物方法是使用该基因表达γ-丁基甜菜碱羟化酶。

附图的简要说明

从下面的详细说明及其附图可更清楚地阐明本发明的上述以及其他目的，特点和其他优点，其中：

图1显示了不含γ-丁基甜菜碱羟化酶(γ-BBH)基因的大肠杆菌(E.coli)BL21菌株和含γ-BBH基因并用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡哺糖苷)进行诱导的E.coliBL21菌株的细胞溶解产物离心上清液的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析结果。

图2显示克隆到pT7-7的γ-BBH的cDNA扩增基因的0.8％琼脂糖凝胶电泳结果。

图3是多序列比对，其中将来自粗糙脉孢菌的γ-BBH的氨基酸序列与来自人，大鼠和假单胞菌的γ-BBH的氨基酸序列进行比对。

图4是pT7-BBH2质粒的图示；和。

图5是由γ-三甲铵丁酸制备L-肉碱的生产流程示意图。

本发明的最佳实施方式

一方面，本发明提供了由粗糙脉孢菌产生的编码γ-丁基甜菜碱羟化酶的基因，该基因用SEQ ID No.1表示。

为获得由丝状真菌粗糙脉孢菌产生的编码γ-丁基甜菜碱羟化酶的基因，本发明人首先比较了编码γ-丁基甜菜碱羟化酶的不同基因以找到“保存区”。对保存区及登记在基因数据库中的粗糙脉孢菌的整个基因序列进行同源性搜索。从具有部分类似序列的基因中，选择显示γ-丁基甜菜碱羟化酶活性的候选基因。为克隆该候选基因，首先合成该基因特定的引物。制备粗糙脉孢菌的cDNA文库，并使用合成的引物筛选目标基因。将由此获得的cDNA克隆插入适当的载体内。将得到的重组体载体转入大肠杆菌，对该转化体进行的试验表明基因被成功克隆。通过IPTG处理诱导该重组体载体携带的该基因进行蛋白质表达，并用SDS-PAGE法进行分析。与对照试验进行比较，发现显示特定蛋白质表达的大肠杆菌转化体可利用三甲铵丁酸作为底物产生L-肉碱(表1)。

本发明基于发现了粗糙脉孢菌产生的编码γ-丁基甜菜碱羟化酶新基因，按上述方法测定了该基因，而在本发明中之前该基因没有被测定。本发明人首次测定了粗糙脉孢菌产生的γ-丁基甜菜碱羟化酶的多聚核苷酸序列，表示为SEQ ID No.1。

编码具有γ-丁基甜菜碱羟化酶活性的多肽的SEQ ID No.1的多聚核苷酸的各种变体，如片段和衍生物也都包括在本发明的范围内，只要在它们被表达的形式中含有具有SEQ ID No.1的多聚核苷酸的基因。

另一方面，本发明提供了一种多聚核苷酸，所述的多聚核苷酸所编码的蛋白质与SEQID No.1的多聚核苷酸具有70％或以上同源性并具有γ-丁基甜菜碱羟化酶活性。

对于多聚核苷酸序列或由所述多聚核苷酸序列编码的蛋白质或多肽，本文中所使用的术语“同源性”系指野生型氨基酸序列之间或野生型核苷酸序列之间的序列相似性。在蛋白质的情况下，“同源”包括75％氨基酸序列或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，以及最优选95％或更高与本发明的γ-丁基甜菜碱羟化酶蛋白质的氨基酸序列相同。典型的，蛋白质同源可含有与目标蛋白质相同的活性部位。在基因的情况下，“同源”包括基因序列75％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，以及最优选95％或更高与本发明的编码γ-丁基甜菜碱羟化酶蛋白质的多聚核苷酸序列相同。同源性评价可用肉眼或使用商业软件进行。使用商业软件时，两个或更多序列之间的同源性可表示为百分率(％)，相邻序列间的同源性(％)就可以进行评价了。

在一个优先方面，本发明提供一种多聚核苷酸，所述多聚核苷酸编码的蛋白质与SEQID No.1序列有75％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，甚至最优选95％的同源性并有γ-丁基甜菜碱羟化酶活性。

在另一方面，本发明提供编码SEQ ID No.2表示的γ-丁基甜菜碱羟化酶的多聚核苷酸。

根据本发明通过将粗糙脉孢菌产生的编码γ-丁基甜菜碱羟化酶的多聚核苷酸基因插入一载体，并诱导所得到的重组载体表达蛋白质可大规模生产γ-丁基甜菜碱羟化酶。

因此，在又一方面，本发明提供了一重组体载体，该重组载体含有由粗糙脉孢菌产生的编码γ-丁基甜菜碱羟化酶的多聚核苷酸基因。

本文中使用的术语“载体”系指DNA构建体，该构建体含有可操作性连接到调控序列的DNA序列以及为便于其他基因操作及优化蛋白质表达而导入的序列，其中所述的调控序列能调控蛋白质在合适宿主中的表达。该调控序列包括用于调控转录的启动子，为了调控转录而选择性加入的操纵子，合适的mRNA核糖体结合位点，以及调控转录/翻译终止的序列。用于插入外源基因的载体可以是质粒，病毒，黏粒等。

载体包括克隆载体和表达载体。克隆载体是一插入外源DNA的可复制质粒，并将外源DNA带入宿主细胞，宿主细胞由此被转化。“表达载体”一般指插入一段外源DNA片段，通常为为双链DNA片段。“外源DNA”指非宿主细胞自然形成的异源DNA。表达载体可在宿主细胞中独立于宿主染色体DNA进行复制，因此可生产被插入的外源DNA。根据现有技术，为提高宿主细胞中转染基因的表达水平，应将该基因可操作性地连接到被选作表达系统的宿主细胞中有功能的转录/翻译调控序列上。

根据本发明构建的pT7-BBH2载体(Eshcherichia coli DH5αCJ2004)用于表达粗糙脉孢菌产生的编码γ-丁基甜菜碱羟化酶的多聚核苷酸，该载体于2004年1月27日保存在国际保藏机构，韩国微生物培养中心(KCCM)，登记号为KCCM-10557。

在又一方面，本发明提供了使用含有所述基因的重组载体进行转化的转化体。

本文使用的术语“转化”是指将DNA导入合适的宿主细胞，使该DNA作为染色体外元件或通过染色体整合进行复制。本发明中用于转化的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。此外，典型使用具有外源DNA导入效率高并对所导入的DNA具有高表达水平的宿主细胞。宿主细胞的实例包括原核细胞及真核细胞，如细菌，例如埃希氏菌属(Escherichia sp.)，假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，杆状菌属(bacillus sp)和链霉菌属(Streptomyces sp.)，真菌和酵母菌，昆虫细胞，如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(sf9)，和动物细胞，如CHO，COS1，COS7，BSC1，BSC40和BMT10。可优先使用大肠杆菌(Escherichia coli)。

由SEQ ID No.1的多聚核苷酸编码的氨基酸序列表示为SEQ ID No.2。因此，在另一个方面，本发明提供由粗糙脉孢菌产生的并具有SEQ ID No.2氨基酸序列的γ-丁基甜菜碱羟化酶。

仍然在另一个方面，本发明提供了选自包括下列变体的γ-丁基甜菜碱羟化酶，所述的变体与SEQ ID No.2的序列具有75％或更高，优选85％或更高，更优选90％或更高，以及甚至最优选95％的同源性，并且具有γ-丁基甜菜碱羟化酶活性。

如图5所示，可使用本发明的γ-丁基甜菜碱羟化酶由γ-三甲铵丁酸生产L-肉碱，由此获得光学纯的L-肉碱。

因此，仍然在另一个方面，本发明提供一种制备L-肉碱的方法，所述方法包括使用前述γ-丁基甜菜碱羟化酶使γ-三甲铵丁酸羟基化。

如上述方法制得的L-肉碱可作为L-肉碱补充剂，治疗肉碱缺乏症及其他治疗性的目的。

通过下列所列举的用于说明的实例将有助于更好地理解本发明，这些实例不能解释为限于本发明。

实例1：粗糙脉孢菌cDNA文库的构建。

为获得粗糙脉孢菌的cDNA，首先从粗糙脉孢菌中分离出mRNA，并通过PCR(聚合酶链式反应)使用多聚胸腺嘧啶(polyT)引物由分离的mRNA合成cDNA。将cDNA插入AD5克隆载体的EcoR1/XhoI位点，并按下述方法在质粒中构建cDNA库。将大肠杆菌BNN322菌株在添加了卡那霉素和0.2％麦芽糖的LB培养基中培养过夜，离心收集，并在1ml的10mM MgSO₄中悬浮。将该细菌悬浮液与构建cDNA文库的3.5×10⁷λ噬菌体在30℃下一起培养30分钟，不作搅拌。在培养物中加入2ml LB培养基，将感染菌株在30℃下培养60分钟，并同时搅拌。将最终的培养物涂布在含氨苄西林(75μl-/ml)的LB平板上。从长出的菌落中分离出质粒，由此构建了cDNA文库。

实例2：为获得γ-丁基甜菜碱羟化酶基因制备引物。

将粗糙脉孢菌产生的γ-丁基甜菜碱羟化酶(γ-BBH)的氨基酸序列与由人，大鼠及假单胞菌产生的γ-BBH的氨基酸序列进行比较(图3)。序列1代表粗糙脉孢菌产生的γ-BBH的氨基酸序列，序列2代表人的γ-BBH的氨基酸序列，序列3代表鼠的γ-BBH的氨基酸序列，以及序列4代表假单胞菌的γ-BBH的氨基酸序列。序列同源性结果如下(以双序列比对开始)：

序列(1∶2)排列，得分：11％；

序列(1∶3)排列，得分：11％；

序列(1∶4)排列，得分：10％；

序列(2∶3)排列，得分：88％；

序列(2∶4)排列，得分：29％；

序列(3∶4)排列，得分：29％。

发现粗糙脉孢菌产生的γ-BBH与由人的γ-BBH有11％的同源性。

为克隆粗糙脉孢菌产生的γ-BBH，根据粗糙脉孢菌基因组的序列资料设计了下列一对引物。

引物1(SEQ ID No.3)：

5’-ATG AAT TCC ATA TGA TGG CCA CGG CAG CGG TTC AG-3’

引物2(SEQ ID No.4)：

5’-ATT AGT CGA CTC AAT ACC CTC CCC CAC CCT G-3’

实例3：γ-BBH的编码基因的获得。

由实例1制备的粗糙脉孢菌cDNA文库，通过PCR方法，使用实例2中制备的一对引物，将γ-BBH基因扩增。将PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，在约1.4kb处观察到一条带。使用自动DNA测序仪测定被扩增基因的核苷酸序列。同时，使用NCBI公司的BLAST程序对测定的核苷酸序列进行同源性搜索。结果在粗糙脉孢菌的基因组序列中发现与被扩增基因100％相同的基因，并且被发现的基因的翻译产物的功能仅为一种假想的蛋白质。然后将PCR产物用EcoRI和Sal I消化，与用相同限制酶消化的pUC19连接，并导入大肠杆菌DH5。使用蓝/白斑筛选法鉴定转化体。当质粒从转化体中分离出来并进行分析时，发现γ-丁基甜菜碱羟化酶基因已成功插入质粒中。

实例4：pT7-BBH2质粒的构建

将制得的含有γ-丁基甜菜碱羟化酶基因的质粒用Nde I和Sal I进行消化，并在低熔点的琼脂糖凝胶上进行电泳。从凝胶上切除与γ-丁基甜菜碱羟化酶基因对应的DNA片段，纯化，并插入用Nde I和Sal I处理过的pT7-7内(图4)。将获得的质粒转入大肠杆菌DH5，并在含氨苄西林的固体平板上生长。从长出的菌落中分离重组质粒。当用Nde I和Sal I消化该重组质粒后，发现γ-BBH基因已成功插入质粒(图2)。因此，该重组质粒称为”pT7-BBH2”。将该重组体质粒导入大肠杆菌DH5α。由此获得的转化体称为“大肠杆菌Escherichia coliDH5α CJ2004”，该转化体于2004年1月27日保存在韩国微生物培养中心(KCCM)，登记号为KCCM-10557。

实例5：将pT7-BBH2质粒转入表达性细菌菌株大肠杆菌BL21(DE3)

将具有氨苄西林选择性标记的pT7-BBH2质粒转入表达性细菌菌株大肠杆菌BL21(DE3)。大肠杆菌BL21(DE3)菌株在有乳糖或IPTG的存在下可产生T7 RNA聚合酶，乳糖或IPTG可诱导γ-丁基甜菜碱羟化酶基因的翻译。将转化细胞涂布于含氨苄西林的固体培养基上。从长出的菌落中纯化质粒，并用Nde I和Sal I消化，以测定所插入的基因及质粒的大小。结果发现，pT7-BBH2已成功导入大肠杆菌BL21(DE3)。

实例6：γ-丁基甜菜碱羟化酶的表达

将BL21(DE3)/pT7-BBH2转化体进行培养，以评估γ-丁基甜菜碱羟化酶的表达，所述BL21(DE3)/pT7-BBH2转化体通过将pT7-BBH2质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)已在实施例5中被制备。在含50ml LB培养基或加入氨苄西林的LB培养基的250ml锥形瓶(baffle flask)中培养该转化菌株。当培养物的OD600值达0.6时，向培养基加入1mM IPTG后，转化株细胞再培养4小时。将转化株细胞离心分离(4,000×g)15分钟进行收集，再在1ml裂解缓冲液(140mM NaCl，200g/升甘油，1mM DTT，10mM磷酸钠缓冲液，pH7.4)中悬浮。将细胞悬浮液放入冰浴，并以超声发生器进行超声振荡10秒×5次，以破坏细胞。破坏后的细胞在4℃下离心分离(10,000×g)20-30分钟。收集上清液后将细胞碎屑丢弃。SDS-PAGE分析显示了与γ-丁基甜菜碱羟化酶大小一致的约49kDa的带(图1)。根据预期用途使用Bradford分析法测定蛋白质浓度。

实例7：L-肉碱的测定

将粗糙脉孢菌的粗提物在500ul分析缓冲液(20mM KCl，3mM酮戊二酸，10mM抗坏血酸钠，2g/升三硝基甲苯X-100，0.25mM(NH₄)₂Fe(SO₄)₂，0.2mM γ-三甲铵丁酸，20mM磷酸钾缓冲液，pH7.0)中在37℃下孵育1小时。将500μl提取物上清液与500μl 1.2M高氯酸混合。混合液在室温下孵育10分钟后，离心分离5分钟。将600ul上清液与320μl 0.7M K₃PO₄混合后，在冰浴中孵育20分钟。混合液离心分离5分钟后，将750μl上清液用250μl无菌蒸馏水稀释。稀释后的上清液加入100μl DNTB/H₂O₂后，在室温下孵育10分钟。向反应后混合液中加入50μl过氧化氢酶溶液后，在室温下孵育30分钟，然后离心分离。将1ml上清液与50μl乙酰基-辅酶A混合后，在室温下孵育10分钟。在405nm处测定吸收值，并计算L-肉碱浓度。

实例8：评估粗糙脉孢菌产生的γ-丁基甜菜碱羟化酶利用γ-三甲铵丁酸作为底物生产L-肉碱的能力

将实例5中用γ-丁基甜菜碱羟化酶基因转染的大肠杆菌BL21(DE3)菌株在含50mlLB培养基或加入氨苄西林的LB培养基的250ml锥形瓶中进行培养。当培养物的OD600值达0.6时，向培养基中加入1mM IPTG，并将细胞在25℃下培养8小时以上，以防止在诱导形成蛋白质正确的三级结构时形成包涵体。然后，通过离心(4,000×g)15分钟收集细胞，并按实例6中相同方法制备蛋白质粗提物。将含1.0mg/ml蛋白质的粗提物在含0.5mg/ml γ-三甲铵丁酸的反应缓冲液中孵育4小时。按实例7相同方法测定L-肉碱浓度，结果如下列表1所示。

表1

分析混合物 L-肉碱浓度(μg/ml)

γ-BBH分析缓冲液+1.0mg/m l 0.0

BL21(DE3)粗提物

γ-BBH分析缓冲液+1.0mg/ml 0.8

BL21(DE3)/pT7-BBH2(由IPTG诱导)

相提物

工业实用性

如前所述，这种新型的由粗糙脉孢菌产生的编码γ-丁基甜菜碱羟化酶的基因，可用于从γ-三甲铵丁酸生产光学纯L-肉碱。

关于国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约

国际表格

致：希杰株式会社初次受理

韩国，首尔，中区由韩国国际保存管理机构根据条约

南大门路5街500号 7.1的规定(在本页的底部确认)

1根据条约6.4(d)，该日期为获得国际保存管理机构资格的日期；在获得国际保存管理机构资格之后，在将布达佩斯条约之外所做的保藏转为布达佩斯条约之下的保藏的情况下，则该日期为该国际保存管理机构收到该微生物的日期。

序列表

<110>CJ Corp.

<120>由粗糙脉孢菌产生的γ-丁基甜菜碱羟化酶

<160>4

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>1346

<212>DNA

<213>Neurospora crassa

<400>1

atggccacgg cagcggttca ggtttcagtc ccagctccgg ttggacaacc agatatcggg 60

tacgctcctg accacgacaa gtacctcgca agagtcaaaa gacgacgaga aaacgagaag 120

ctggagtcgt ctcttccgcc aggtttccct cgaagactag actcggacct tgtgtgggac 180

ggcaacaccc tcgccgagac gtacgactgg acctacagac tgacagaaga ggccattgat 240

gaaatcgagg ccgcgcttcg tcattttaag a 271

g cctcaacaag cccctaggct 292

acatcaacca agaaaccttc ccccttcccc gcctacacca cactctccgc tccctctccc 352

acgagctcca ccacggccac ggcttcaaag tcctccgcgg gctccccgtc acctcccata 412

cacgcgagga aaacatcatc atctacgccg gcgtctcctc gcatgtcgct cctatccgcg 472

gccgccagga caaccagcac aacggccacc cagccgacgt agtcctagca cacatcaaag 532

acctgtccac gactgtttct gacgtgagca aaatcggtgc acccgcctac accaccgaga 592

aacaagtctt ccacaccgac gcaggcgaca tcgtcgccct cttttgcttg ggagaggccg 652

ccgagggcgg acagagttac ctgtccagca gctggaaggt gtacaacgag ctggcagcca 712

ctcggcccga tctggttcgc acgctggcgg agccgtgggt ggcggacgag tttggcaagg 772

aagggaggaa gttttctgtg cgaccgcttt tgcattttca gtctactgct gctgctgctt 832

ctagggaagc aaagcccgag tctgaacggc tcatcatcca gtacgcccgc cgcacgttta 892

cggggtattg gggattaccg aggtcggcgg atatcccgcc cattacggag gcgcaggcgg 952

aggcgttgga tgcgctgcac tttacggcgg agaagtacgc ggtggcgctg gatttcaggc 1012

agggggatgt ccagtttgtg aataacttga gtgtgttcca ttcgagggcg gggtttagag 1072

atgaggggga gaagcagagg catttggtta ggttgtggtt gagagatccg gagaatgcgt 1132

gggagacgcc cgaggcgttg aaggaacggt gggaacgcgt gtatggcggg gtgagtccgg 1192

agagggaggt gtttccgctt gagccgcaga ttaggagcgc gagtaagggg gagagcgtgg 1252

ggacgcaggg tgggggaggg tattga 1278

<210>2

<211>425

<212>PRT

<213>Neurospora crassa

<400>2

Met Ala Thr Ala Ala Val Gln Val Ser Val Pro Ala Pro Val Gly Gln

1 5 10 15

Pro Asp Ile Gly Tyr Ala Pro Asp His Asp Lys Tyr Leu Ala Arg Val

20 25 30

Lys Arg Arg Arg Glu Asn Glu Lys Leu Glu Ser Ser Leu Pro Pro Gly

35 40 45

Phe Pro Arg Arg Leu Asp Ser Asp Leu Val Trp Asp Gly Asn Thr Leu

50 55 60

Ala Glu Thr Tyr Asp Trp Thr Tyr Arg Leu Thr Glu Glu Ala Ile Asp

65 70 75 80

Glu Ile Glu Ala Ala Leu Arg His Phe Lys Ser Leu Asn Lys Pro Leu

85 90 95

Gly Tyr Ile Asn Gln Glu Thr Phe Pro Leu Pro Arg Leu His His Thr

100 105 110

Leu Arg Ser Leu Ser His Glu Leu His His Gly His Gly Phe Lys Val

115 120 125

Leu Arg Gly Leu Pro Val Thr Ser His Thr Arg Glu Glu Asn Ile Ile

130 135 140

Ile Tyr Ala Gly Val Ser Ser His Val Ala Pro Ile Arg Gly Arg Gln

145 150 155 160

Asp Asn Gln His Asn Gly His Pro Ala Asp Val Val Leu Ala His Ile

165 170 175

Lys Asp Leu Ser Thr Thr Val Ser Asp Val Ser Lys Ile Gly Ala Pro

180 185 190

Ala Tyr Thr Thr Glu Lys Gln Val Phe His Thr Asp Ala Gly Asp Ile

195 200 205

Val Ala Leu Phe Cys Leu Gly Glu Ala Ala Glu Gly Gly Gln Ser Tyr

210 215 220

Leu Ser Ser Ser Trp Lys Val Tyr Asn Glu Leu Ala Ala Thr Arg Pro

225 230 235 240

Asp Leu Val Arg Thr Leu Ala Glu Pro Trp Val Ala Asp Glu Phe Gly

245 250 255

Lys Glu Gly Arg Lys Phe Ser Val Arg Pro Leu Leu His Phe Gln Ser

260 265 270

Thr Ala Ala Ala Ala Ser Arg Glu Ala Lys Pro Glu Ser Glu Arg Leu

275 280 285

Ile Ile Gln Tyr Ala Arg Arg Thr Phe Thr Gly Tyr Trp Gly Leu Pro

290 295 300

Arg Ser Ala Asp Ile Pro Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ala Glu Ala Leu

305 310 315 320

Asp Ala Leu His Phe Thr Ala Glu Lys Tyr Ala Val Ala Leu Asp Phe

325 330 335

Arg Gln Gly Asp Val Gln Phe Val Asn Asn Leu Ser Val Phe His Ser

340 345 350

Arg Ala Gly Phe Arg Asp Glu Gly Glu Lys Gln Arg His Leu Val Arg

355 360 365

Leu Trp Leu Arg Asp Pro Glu Asn Ala Trp Glu Thr Pro Glu Ala Leu

370 375 380

Lys Glu Arg Trp Glu Arg Val Tyr Gly Gly Val Ser Pro Glu Arg Glu

385 390 395 400

Val Phe Pro Leu Glu Pro Gln Ile Arg Ser Ala Ser Lys Gly Glu Ser

405 410 415

Val Gly Thr Gln Gly Gly Gly Gly Tyr

420 425

<210>3

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增由粗糙脉孢菌产生的γ-丁基甜菜碱羟化酶的基因的引物

<400>3

atgaattcca tatgatggcc acggcagcgg ttcag 35

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>4

attagtcgac tcaataccct cccccaccct g 31

Claims

1.由SEQ ID No.1表示的多聚核苷酸的基因所编码的蛋白质或由SEQ ID No.2表示的氨基酸序列作为γ-丁基甜菜碱羟化酶的应用。

2.包含由SEQ ID No.1表示的多聚核苷酸的基因的重组载体的转化体制备γ-丁基甜菜碱羟化酶的应用，其中所述的转化体选自埃希氏菌属、假单胞菌属、杆状菌属、链霉菌属、真菌、昆虫细胞、COS1，COS7，BSC1，BSC40和BMT10。

3.根据权利要求2所述的转化体制备γ-丁基甜菜碱羟化酶的应用，其中所述的转化体是大肠杆菌。

4.权利要求3所述的转化体制备γ-丁基甜菜碱羟化酶的应用，其中所述的转化体是大肠杆菌KCCM-10557。

5.γ-丁基甜菜碱羟化酶通过使γ-三甲铵丁酸羟基化来制备L-肉碱的应用，其中所述的γ-丁基甜菜碱羟化酶的氨基酸序列选自由SEQ ID No.1表示的多聚核苷酸编码的氨基酸序列或者由SEQ ID No.2表示的氨基酸序列。

6.一种制备L-肉碱的方法，该方法包括使用γ-丁基甜菜碱羟化酶使γ-三甲铵丁酸羟基化，其中所述的γ-丁基甜菜碱羟化酶的氨基酸序列选自由SEQ ID No.1表示的多聚核苷酸编码的氨基酸序列或者由SEQ ID No.2表示的氨基酸序列。