CN109576233A - 一种蜱源性基因工程疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种免疫原，其包含与载体连接的抗原性BUD肽，其中所述抗原性BUD肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2。本发明还提供相应的免疫原性组合物和药物组合物，以及提供它们在制备控制蜱虫繁殖的药物中的应用。用本发明的重组蛋白pGEX‑4T‑1+BUD免疫后，综合评价该基因工程疫苗可有效影响蜱的发育，极大减少蜱的数量。

Description

一种蜱源性基因工程疫苗

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种蜱源性基因工程疫苗。

背景技术

蜱作为野生节肢动物，隶属于蛛形纲，蜱螨目，成虫在躯体背面有壳质化较强的盾板，通称为硬蜱，属硬蜱科；无盾板者，通称为软蜱，属软蜱科。全世界已发现的约800余种，计硬蜱科约700多种，软蜱科约150种，纳蜱科1种(仅存于欧洲)。中国已记录的硬蜱科约100种，软蜱科10种。蜱是许多种脊椎动物体表的暂时性寄生虫，是一些人兽共患病的传播媒介和贮存宿主。蜱不仅可以通过叮咬造成动物的机械损伤，还可以传播诸如森林脑炎，新疆出血热，布尼亚病毒以及布氏杆菌，伯氏疏螺旋体(莱姆病)，贝纳柯克斯体(Q热)等细菌，还可以传播诸如巴贝斯虫以及泰勒虫等。因此，蜱的寄生对宿主及家畜养殖业造成了极大的危害。

近年来，随着人类活动的频繁，常有蜱叮咬人，并致人患病或死亡的报道。因此蜱虫已经被国际兽医局(OIE.Office International DesEpizooties.2012)将其列为B类疫病，我国将其列为二类疫病。因此，蜱及其传播病原的防控就显得尤为重要。早在80年代初期澳大利亚科研工作者首次从被感染牛血液中提取到了微小牛蜱(Boophilus microplus)抗蜱抗体，并将该抗体制备成抗蜱类疫苗加以商业化。但是这种疫苗产生的保护作用并不稳定。之后的广大研究者将注意力逐渐集中与蜱源性的特定蛋白作为抗原免疫宿主，用于蜱虫的防控。这期间最为成功的当属Bm86基因，该基因是蜱消化细胞表面的糖蛋白，可以抑制消化系统细胞的吞噬作用，也是目前应用最为广泛的抗蜱疫苗。在此之后出现的一些抗蜱疫苗的候选抗原(例如Bm91)，但是都不及Bm86免疫效果好。尽管如此，抗蜱疫苗的发展依然非常的缓慢。各地方每年依然投入大量的人力、物力、财力进行蜱虫的防控以及相关措施的制定。但是仍然没有收到良好的效果。因此，目前蜱的防控仍然以化学药物为主，传统药物在使用过程中容易造成药物残留，环境污染等情况，对人类的健康有着极大的危害。为了家畜养殖业的健康发展，研制安全，高效的疫苗依然是当下最为迫切的需要。也是防控蜱虫肆意寄生的首要途径。

发明内容

本发明从长角血蜱饥饿雌蜱表达文库中筛选获得一段酮戊二酸双加氧酶(BUD)基因序列，并通过RACE技术获得了该基因的5’端和3’端序列。并PCR扩增得到该基因的全长序列。拼接后的序列设计引物分别从我国主要流行的长角血蜱(Haemaphysalislongicornis)，青海血蜱(Haemaphysalis qinghaiensis)，森林革蜱(Dermacentorsilvarum)cDNA样品中进行BUD基因的PCR扩增，多序列比对显示，BUD基因在不同来源蜱种具有良好的保守性。基于该基因制备的基因工程疫苗免疫兔体后进行攻蜱实验，显示该疫苗对免疫新西兰大白兔产生抗体具有广谱性，致使吸食了免疫动物的血液后蜱虫产卵率显著下降，卵的孵化率明显降低，饱血成蜱雌蜱死亡率提高到55％。可以说基于蜱源的BUD基因工程疫苗可以有效降低蜱虫繁殖，对畜牧业养殖有着积极的意义。

本发明提供一种免疫原，其包含与载体连接的抗原性BUD肽，其中所述抗原性BUD肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2。

作为优选，所述载体为pGEX-4T-1。

本发明提供免疫原性组合物，包括上述的免疫原和至少一种佐剂。

作为优选，所述佐剂为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。

本发明提供药物组合物，其包含：

1)权利要求1或2所述的免疫原或者权利要求3所述的免疫原性组合物；

2)药物可接受的赋形剂。

本发明提供上述免疫原、或者免疫原性组合物、或者药物组合物在制备控制蜱虫繁殖的药物中的应用。

作为优选，所述控制蜱虫繁殖为降低蜱虫产卵率、或降低蜱虫饱血体重、或降低蜱虫卵孵化效率、或提高饱血成蜱雌蜱死亡率。

本发明提供编码上述的免疫原的核酸。

本发明提供包含上述核酸的表达载体。

本发明提供包含上述表达载体的宿主细胞。

本发明以中国主要流行蜱种长角血蜱，青海血蜱，森林革蜱为研究对象提取总RNA为模板，通过RT-PCR技术扩增出不同蜱源BUD基因；通过对扩增出的BUD基因DNA序列分析证实该扩增基因与斑点钝眼蜱(Amblyomma macμlatum)，肩突硬蜱(Ixodes scapμlaris)氨基酸序列一致性高达95％，表明我们成功克隆出了蜱源性BUD基因。通过DNA重组技术，将克隆出的BUD基因与表达载体pGEX-4T-1构建成重组质粒，并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)plysS中，成功的构建出含蜱BUD基因的基因工程菌株。通过对工程菌株的诱导表达并对大量诱导表达的蛋白进行切胶处理，利用透析法纯化出重组蛋白pGEX-4T-1+BUD。经免疫学鉴定初步说明pGEX-4T-1+BUD有较好的抗原性及免疫原性，具有抑制蜱发育疫苗候选分子的潜能。通过上述步骤获得的重组蛋白pGEX-4T-1+BUD背部皮下三点注射免疫新西兰大白兔，每两周免疫1次，共3次。免疫期间每周采集少量新西兰大白兔血液分离血清，检测抗体滴度。当抗体滴度趋于均衡时用清洁的长角血蜱饥饿成蜱进行攻蜱实验。待蜱饱血脱落后收集。统计蜱在饱血时间、饱血体重、产卵率、平均卵重、孵化率、死亡率等各项生理指标。根据Dempster计算免疫保护力，公式：免疫保护力(％)＝(1-免疫组平均蜱数/对照组平均蜱数)×100％。经计算用重组蛋白pGEX-4T-1+BUD免疫新西兰大白兔后，综合评价该基因工程疫苗可有效影响蜱的发育，极大减少蜱的数量。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为3’RACE产物电泳结果。其中，M:2000DNA分子量marker；1:3’RACE产物条带。

图2为5’RACE产物电泳结果。其中，M:2000DNA分子量marker；1:5’RACE产物条带。

图3为长角血蜱BUD基因PCR产物电泳图。其中，M:2000DNA分子量marker；1:HLBUD扩增产物电泳图。

图4为不同蜱种来源BUD基因氨基酸比对结果。

图5为重组蛋白pGEX-4T-1+BUD的SDS-PAGE分析结果。其中，1：pGEX-4T-1载体非诱导菌液；2：GST标签蛋白诱导8小时菌液；3：长角血蜱重组蛋白诱导8小时菌液。

图6为长角血蜱pGEX-4T-1+BUD重组蛋白Western blot反应原性鉴定结果。其中，1：长角血蜱pGEX-4T-1+BUD重组蛋白与兔抗长角血蜱饥饿雌蜱血清一抗反应结果；M:蛋白分子量marker；2：GST标签蛋白与兔抗长角血蜱饥饿雌蜱血清一抗反应结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

1.基于长角血蜱cDNA文库筛选目标基因片段

首先利用本申请人保存的长角血蜱cDNA文库的测序序列筛选到BUD基因部分序列，设计5’端和3’端RACE引物。PCR扩增得到蜱源性BUD全长基因序列，为了获得最佳候选基因本发明又扩增了青海血蜱，森林革蜱BUD基因，并利用生物信息学方法对该基因序列进行分析。确定BUD基因在蜱虫中是一类保守的，且对机体保护起着关键作用的基因。遂选取BUD基因作为基因工程疫苗的候选基因。

2.合成引物

根据长角血蜱cDNA文库中BUD部分序列，设计5’端和3’端RACE引物序列分别标注5’RACE和3’RACE。BUD全长基因扩增引物序列分别标注为BUD IDNO.1和BUD IDNO.2。

BUD基因完整ORF表达引物序列分别标注为BUD PRNO.3和BUD PRNO.4。

第一对引物是用于扩增蜱源性BUD基因克隆的引物，其中

BUD IDNO.1 5'-ATGGGGGGGTCGTCTGCAG-3'

BUD IDNO.2 5'-TCTATGTATGTACATTGC-3'

第二对引物是基于第一对引物结果酶切位点修饰后表达引物，其中用于扩增蜱源性BUD目的基因的引物，其中

BUD PRNO.3 5'-GCGGATCCATGGGGGGGTCGTCTGCAG-3'

横线部分 BamH I

BUD PRNO.4 5'-GCGAATTCTCTATGTATGTACATTGC-3'

横线部分 EcoR I

5’-RACE引物序列如下：

5′-RACE CDS 5'-TTCACCTGGCACCCGGAGACC-3'

3′-RACE CDS 5'-TGGTAGCATCGNTGAGCNGT-3'。

3.蜱虫总RNA的提取

取饥饿长角血蜱成蜱约5只，参照Invitrogen公司TRIzol使用说明并稍加改进，在提取过程中，所有的设备及试剂都要在无RNase条件下提总RNA。

提取方法的改进点为：液氮中研磨蜱会造成液氮的飞溅，因此本发明将需要研磨的蜱虫以及相关容器在低温(-80℃)条件处理。并置于冰上利用研磨器(OSE-Y30)快速研磨。在获取总RNA过程中所有的试剂均在-20℃条件下放置备用。

4.RACE模板cDNA的合成

具体步骤参考大连宝生物RACE试剂盒说明：

无RNase的薄壁离心管(0.2ml)中加入下列组分：

以上试剂混合加入0.2ml薄壁离心管混匀后离心使液体集中到管底，70℃条件下孵育2min。立即在冰盒中静置2min，低速离心使液体集中。

在反应管中继续加入下列组分：

上述试剂均匀混合混匀后42℃条件下温育1.5h。用Tris-EDTA缓冲液对合成的cDNA进行稀释，72℃温育7min后-20℃保存备用。

5.基因cDNA末端的扩增及克隆

分别利用基因特异性的5′末端(5’RACE)及3′末端(3’RACE)扩增引物进行PCR，在无RNase的PCR(0.2ml)管中依次加入下列成分：具体操作如下：

混匀后离心然后在管中依次加入下列成分：

PCR扩增，程序如下：

PCR产物(图1和图2)，于1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，对阳性条带切胶回收，胶回收过程参考Gel Extraction Kit(OMEGA)操作手册进行。

以上获得胶回收产物进行T-easy载体克隆，过程如下：

置于4℃过夜。

转化

(1)将以上连接产物10μl加入30μl的大肠杆菌JM109感受态细胞，轻柔混匀后置冰上30min。

(2)42℃热激90s后，立即置冰上3min。

(3)以上混合液中加入事先37℃预热的LB培养液800μl，轻柔吹打混匀液体，置37℃温和振荡1h。

(4)待菌液有稍许浑浊后5,000×g离心5min后弃上清，保留少量的培养液。

(5)上述菌液中加入16μl X-gal(20mg/ml)和4μl IPTG(50mg/ml)充分混匀，用玻璃棒均匀涂布于含氨苄青霉素的LB平板上(含氨苄青霉素50μg/ml)。

(6)37℃温箱倒置培养过夜。

待平板长出合适大小的菌斑后，挑斑摇菌。然后以上述菌液为模板，以T-easy载体通用引物T7、SP6为引物进行检测。阳性的样品送至上海生物工程有限公司进行测序。并对正确的序列进行拼接。

6.目的基因的克隆

以制备的长角血蜱一链c DNA为模板，反应体系如下：

以上液体充分混合，进行PCR扩增。扩增程序如下：

PCR扩增完成后，取2μl PCR产物进行核酸电泳检测(图3所示)。

PCR阳性产物，参考上述连接转化方法进行BUD基因的克隆并送公司测序。正确的序列利用Clustal x软件进行多序列比对(图4所示)。结果显示，不同蜱源的BUD基因非常保守，这也决定了该基因功能的广谱性。因此，以该基因为基础发展控蜱疫苗的研究是可行的。

PCR扩增产物的核苷酸序列为：

GGGGGGTCGTCTGCAGATGAGAAGCAGCGAGAGCAGTTCGGCGCCTTGCGGCGGAGCGGGGAACCCATTTCGACGTCACGGAGGCCAGGGACGCCTGAGTTTCGAAGCAGCCGGCGGCCCGGCTCGAGCATTGAAGATAAACACGCCGAGCTCCTGAGACGGCCGTCTGCTGAAAAGCGCAGGGCTTCCAACATGCAAGCCTGCCGGAGACTGCTGTTTTCCGGCCTGGTGCGCGGTCGCAGCGCACTCAGCAATGGCATTGGAGGCAACGGAGGGGCGGCTGCGGTGCGTAGTATCACGTCAGACCTCGCGGAGATGGACGACGAGGAGAACGTTCCCAAGCCGAGCATCCGCAACGTGCACAAGGTGAACGAAAGCACCCTGTGCGTCACCTTCTCGGACGACACCAAGTGCCACTTCAACAGCCTCTGGCTTCGCGACAGCTGCACGTGCTCGGCGTGCGTGCATCCCGCCACGCGGCAGAAGCTGCTGAGCAGCGTCAAGATCAGCCCCGACATCCAGCCGCTGTCTTGGGCCGTCGAGGACGGCGAGAAGCTTGAGATCTGCTGGCCCCAGGCCTCCTCGGCCCCGCCCCACTCCAGCACTTACTCCTGTGACTGGCTGTACCAGTTCGCAAAGTTATTCGAGAACAAGGAAGGCGAACCGCCCGAGGTGTCCGACCTGTTCTACACTAACACCAAGTCGTCGACGATCGTGTGGACACGAGAAGAGTTCGAGGAGAACCCTCCCGAGCTGGACTACAAGACCTTCATGGAAGAGCGCTCGGGCCTCAAGCAGATGGTCAAGAACATCGTGAAGTACGGCATCTCCGTGCTACATGGTGTTCCCCCGCACGAGGACGAGTTGGAGAAGGTGGCCATGCGCATGGGCTACATCCGAGAGACGGGCATGGGCCGCGTGTTCGACGCCACATGCCAACCGGATGCCCACCGGGGCTCCCGCTTCCACCAGCACACCGAGCTGCCCGACAGGGAGAGCGCTCCTGGCGTGAAGCTGCTTCTATGCTTATCGTCCGACGTGCCGAAGCAGACACTGAGCGGCACACCCAGCAAAGGGAAAACGTTCTTCGTGGATGGTTTCTACATCGCCCAGTGGATGAAGTACAACCACCCCGAATACTTCAGGCTGCTCGTATCTACGCCGGTCACATTCTCGTACTACGACTCGCGCCGTGGGGTGTGGCTGCGCGACACATTCCCTATAATCAGGACAAATAACTACGGCAAAATTAAGAAGATTCACTACAGCACTTTCTCCATGAGGCCACCACTGCTGTCGCCCGGCGAAGCTACCAAGTTTTATGAGGCTTACGGTATGTTCACGAAGCGTATGGAACAAGAGTCGTCCCAGTACGCGTTTCACCTGGCACCCGGAGACCTGGTGGCCTTCAACAACCGCCGCATCTTGCACGGCATGAAGGAACTGGACCCCAACCACAAGGATGTCATCCTCAGGGGCTGCTACATGGACATGGACGAGATTGCCTCCCTGTACGAGAAGATGAGGAGAGATGACGACCCCCGAGCCAGCCAGGCTACCGTCCTCGGAACAGCACTCTCGCCGCCGAAGCACACGAGCGCTGTCTTCAGCAATGTACATACATAGA

PCR扩增产物的氨基酸序列为：

GGSSADEKQREQFGALRRSGEPISTSRRPGTPEFRSSRRPGSSIEDKHAELLRRPSAEKRRASNMQACRRLLFSGLVRGRSALSNGIGGNGGAAAVRSITSDLAEMDDEENVPKPSIRNVHKVNESTLCVTFSDDTKCHFNSLWLRDSCTCSACVHPATRQKLLSSVKISPDIQPLSWAVEDGEKLEICWPQASSAPPHSSTYSCDWLYQFAKLFENKEGEPPEVSDLFYTNTKSSTIVWTREEFEENPPELDYKTFMEERSGLKQMVKNIVKYGISVLHGVPPHEDELEKVAMRMGYIRETGMGRVFDATCQPDAHRGSRFHQHTELPDRESAPGVKLLLCLSSDVPKQTLSGTPSKGKTFFVDGFYIAQWMKYNHPEYFRLLVSTPVTFSYYDSRRGVWLRDTFPIIRTNNYGKIKKIHYSTFSMRPPLLSPGEATKFYEAYGMFTKRMEQESSQYAFHLAPGDLVAFNNRRILHGMKELDPNHKDVILRGCYMDMDEIASLYEKMRRDDDPRASQATVLGTALSPPKHTSAVFSNVHT

7.产物的双酶切

用同一对酶对目的基因产物及载体质粒进行双酶切，按下列体系于37℃水浴酶切5h：

上述酶切产物胶回收处理，并和表达载体pGEX-4T-1进行连接后转化至BL21(DE3)plysS感受态细胞。具体操作如下：

上述连接混合液置16℃条件下过夜连接。并做BL21(DE3)plysS感受态细胞转化。具体方法参考5(转化)操作。转化后的菌斑进行PCR和双酶切鉴定，出现特异性目的片段即可判断目标基因重组成功。

8.蛋白的表达及纯化

构建好的重组质粒接种至新鲜的含有0.1％氨苄青霉素的2×YT培养基中37℃条件下进行菌液的复苏，当菌液浓度达到OD600时，向菌液中加入0.1％IPTG(终浓度为1.0mmol/L)于37℃诱导，空载体诱导作为对照，并进行SDS-PAGE蛋白表达检测。本发明选取8h,180rpm条件再次进行菌液的大量诱导表达，表达的蛋白切胶置于事先煮沸10min处理好的透析袋中，透析袋置于装满蛋白电泳液的电泳槽中，40V透析8h，最后在透析液中按1:3体积加入丙酮沉淀目的蛋白。蛋白稀释液重溶目的蛋白后测定浓度，浓度为2mg，-20℃保存备用(图5所示)。

9.免疫印迹分析

用2×SDS上样缓冲液加入重组蛋白混匀99℃热激5min变性处理。随后进行SDS-PAGE蛋白电泳。电泳后用半干转法将目的条带转到硝酸纤维素膜(PVDF)上，5％脱脂奶粉封闭过夜。兔抗长角血蜱饥饿雌蜱全蜱阳性血清作为一抗孵育1h，兔阴性血清作为对照。PBST洗净三次。碱性磷酸酶AP标记的羊抗兔二抗孵育1h，PBST洗涤三次。最后用NBT和BCIP配制显色液进行底物显色，观察结果并照相记录(图6所示)。结果表明该重组蛋白作为抗原可以很好的于羊抗兔二抗反应，具有良好的反应原性。

10.蛋白免疫及攻蜱试验及免疫保护力计算

上述纯化的重组蛋白pGEX-4T-1+BUD与等体积的佐剂混合后进行乳化。选取6只新西兰大白兔随机分为两组每组3只作为实验组和对照组。实验组用乳化好的重组蛋白进行免疫，对照组用PBS分别于皮下分三点注射。初次免疫重组蛋白用弗氏完全佐剂进行乳化兔体注射量为0.8mg/只；两周后用弗氏不完全佐剂乳化后的重组蛋白对兔体再次免疫注射量为0.5mg/只；两周后再次加强免疫方法同第二次免疫。从初次免疫开始，每周采血一次。最后一加强次免疫经过两周后，对实验组和对照组兔体分别接种蜱虫进行动物实验，每只兔体接种50只蜱虫，并记录蜱的饱血时间、饱血体重，待蜱虫饱血脱落后统计蜱虫产卵时间、产卵率、平均卵重以及孵化率等生理指标，统计结果如表1所示。

表1蜱虫叮咬重组蛋白免疫兔体的各项生理指标统计

由表1可知，pGEX-4T-1+BUD疫苗接种兔体，尽管蜱叮咬动物的时间有所延长，但是使得蜱虫饱血体重下降了将近80％，蜱的产卵率显著下降到25.5％较对照组有明显的影响；孵化率也下降了63％左右；此外，该基因制备的疫苗使得饱血成蜱雌蜱死亡率提高到55％。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种蜱源性基因工程疫苗

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1627

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggggggtcgt ctgcagatga gaagcagcga gagcagttcg gcgccttgcg gcggagcggg 60

gaacccattt cgacgtcacg gaggccaggg acgcctgagt ttcgaagcag ccggcggccc 120

ggctcgagca ttgaagataa acacgccgag ctcctgagac ggccgtctgc tgaaaagcgc 180

agggcttcca acatgcaagc ctgccggaga ctgctgtttt ccggcctggt gcgcggtcgc 240

agcgcactca gcaatggcat tggaggcaac ggaggggcgg ctgcggtgcg tagtatcacg 300

tcagacctcg cggagatgga cgacgaggag aacgttccca agccgagcat ccgcaacgtg 360

cacaaggtga acgaaagcac cctgtgcgtc accttctcgg acgacaccaa gtgccacttc 420

aacagcctct ggcttcgcga cagctgcacg tgctcggcgt gcgtgcatcc cgccacgcgg 480

cagaagctgc tgagcagcgt caagatcagc cccgacatcc agccgctgtc ttgggccgtc 540

gaggacggcg agaagcttga gatctgctgg ccccaggcct cctcggcccc gccccactcc 600

agcacttact cctgtgactg gctgtaccag ttcgcaaagt tattcgagaa caaggaaggc 660

gaaccgcccg aggtgtccga cctgttctac actaacacca agtcgtcgac gatcgtgtgg 720

acacgagaag agttcgagga gaaccctccc gagctggact acaagacctt catggaagag 780

cgctcgggcc tcaagcagat ggtcaagaac atcgtgaagt acggcatctc cgtgctacat 840

ggtgttcccc cgcacgagga cgagttggag aaggtggcca tgcgcatggg ctacatccga 900

gagacgggca tgggccgcgt gttcgacgcc acatgccaac cggatgccca ccggggctcc 960

cgcttccacc agcacaccga gctgcccgac agggagagcg ctcctggcgt gaagctgctt 1020

ctatgcttat cgtccgacgt gccgaagcag acactgagcg gcacacccag caaagggaaa 1080

acgttcttcg tggatggttt ctacatcgcc cagtggatga agtacaacca ccccgaatac 1140

ttcaggctgc tcgtatctac gccggtcaca ttctcgtact acgactcgcg ccgtggggtg 1200

tggctgcgcg acacattccc tataatcagg acaaataact acggcaaaat taagaagatt 1260

cactacagca ctttctccat gaggccacca ctgctgtcgc ccggcgaagc taccaagttt 1320

tatgaggctt acggtatgtt cacgaagcgt atggaacaag agtcgtccca gtacgcgttt 1380

cacctggcac ccggagacct ggtggccttc aacaaccgcc gcatcttgca cggcatgaag 1440

gaactggacc ccaaccacaa ggatgtcatc ctcaggggct gctacatgga catggacgag 1500

attgcctccc tgtacgagaa gatgaggaga gatgacgacc cccgagccag ccaggctacc 1560

gtcctcggaa cagcactctc gccgccgaag cacacgagcg ctgtcttcag caatgtacat 1620

acataga 1627

<210> 2

<211> 541

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Gly Ser Ser Ala Asp Glu Lys Gln Arg Glu Gln Phe Gly Ala Leu

1 5 10 15

Arg Arg Ser Gly Glu Pro Ile Ser Thr Ser Arg Arg Pro Gly Thr Pro

20 25 30

Glu Phe Arg Ser Ser Arg Arg Pro Gly Ser Ser Ile Glu Asp Lys His

35 40 45

Ala Glu Leu Leu Arg Arg Pro Ser Ala Glu Lys Arg Arg Ala Ser Asn

50 55 60

Met Gln Ala Cys Arg Arg Leu Leu Phe Ser Gly Leu Val Arg Gly Arg

65 70 75 80

Ser Ala Leu Ser Asn Gly Ile Gly Gly Asn Gly Gly Ala Ala Ala Val

85 90 95

Arg Ser Ile Thr Ser Asp Leu Ala Glu Met Asp Asp Glu Glu Asn Val

100 105 110

Pro Lys Pro Ser Ile Arg Asn Val His Lys Val Asn Glu Ser Thr Leu

115 120 125

Cys Val Thr Phe Ser Asp Asp Thr Lys Cys His Phe Asn Ser Leu Trp

130 135 140

Leu Arg Asp Ser Cys Thr Cys Ser Ala Cys Val His Pro Ala Thr Arg

145 150 155 160

Gln Lys Leu Leu Ser Ser Val Lys Ile Ser Pro Asp Ile Gln Pro Leu

165 170 175

Ser Trp Ala Val Glu Asp Gly Glu Lys Leu Glu Ile Cys Trp Pro Gln

180 185 190

Ala Ser Ser Ala Pro Pro His Ser Ser Thr Tyr Ser Cys Asp Trp Leu

195 200 205

Tyr Gln Phe Ala Lys Leu Phe Glu Asn Lys Glu Gly Glu Pro Pro Glu

210 215 220

Val Ser Asp Leu Phe Tyr Thr Asn Thr Lys Ser Ser Thr Ile Val Trp

225 230 235 240

Thr Arg Glu Glu Phe Glu Glu Asn Pro Pro Glu Leu Asp Tyr Lys Thr

245 250 255

Phe Met Glu Glu Arg Ser Gly Leu Lys Gln Met Val Lys Asn Ile Val

260 265 270

Lys Tyr Gly Ile Ser Val Leu His Gly Val Pro Pro His Glu Asp Glu

275 280 285

Leu Glu Lys Val Ala Met Arg Met Gly Tyr Ile Arg Glu Thr Gly Met

290 295 300

Gly Arg Val Phe Asp Ala Thr Cys Gln Pro Asp Ala His Arg Gly Ser

305 310 315 320

Arg Phe His Gln His Thr Glu Leu Pro Asp Arg Glu Ser Ala Pro Gly

325 330 335

Val Lys Leu Leu Leu Cys Leu Ser Ser Asp Val Pro Lys Gln Thr Leu

340 345 350

Ser Gly Thr Pro Ser Lys Gly Lys Thr Phe Phe Val Asp Gly Phe Tyr

355 360 365

Ile Ala Gln Trp Met Lys Tyr Asn His Pro Glu Tyr Phe Arg Leu Leu

370 375 380

Val Ser Thr Pro Val Thr Phe Ser Tyr Tyr Asp Ser Arg Arg Gly Val

385 390 395 400

Trp Leu Arg Asp Thr Phe Pro Ile Ile Arg Thr Asn Asn Tyr Gly Lys

405 410 415

Ile Lys Lys Ile His Tyr Ser Thr Phe Ser Met Arg Pro Pro Leu Leu

420 425 430

Ser Pro Gly Glu Ala Thr Lys Phe Tyr Glu Ala Tyr Gly Met Phe Thr

435 440 445

Lys Arg Met Glu Gln Glu Ser Ser Gln Tyr Ala Phe His Leu Ala Pro

450 455 460

Gly Asp Leu Val Ala Phe Asn Asn Arg Arg Ile Leu His Gly Met Lys

465 470 475 480

Glu Leu Asp Pro Asn His Lys Asp Val Ile Leu Arg Gly Cys Tyr Met

485 490 495

Asp Met Asp Glu Ile Ala Ser Leu Tyr Glu Lys Met Arg Arg Asp Asp

500 505 510

Asp Pro Arg Ala Ser Gln Ala Thr Val Leu Gly Thr Ala Leu Ser Pro

515 520 525

Pro Lys His Thr Ser Ala Val Phe Ser Asn Val His Thr

530 535 540

Claims (10)

1.一种免疫原，其包含与载体连接的抗原性BUD肽，其中所述抗原性BUD肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2。

2.根据权利要求1所述的免疫原，其特征在于：所述载体为pGEX-4T-1。

3.免疫原性组合物，其特征在于：包括权利要求1或2所述的免疫原和至少一种佐剂。

4.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其特征在于：所述佐剂为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。

5.药物组合物，其包含：

1)权利要求1或2所述的免疫原或者权利要求3所述的免疫原性组合物；

2)药物可接受的赋形剂。

6.权利要求1或2所述的免疫原、或者权利要求3或4所述的免疫原性组合物、或者权利要求5所述的药物组合物在制备控制蜱虫繁殖的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述控制蜱虫繁殖为降低蜱虫产卵率、或降低蜱虫饱血体重、或降低蜱虫卵孵化效率、或提高饱血成蜱雌蜱死亡率。

8.编码权利要求1或2所述的免疫原的核酸。

9.包含权利要求8的核酸的表达载体。

10.包含权利要求9的表达载体的宿主细胞。