CN100375785C - 镰形扇头蜱RhcA和RhcB基因的克隆、表达和抗蜱免疫保护作用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物基因技术领域。镰形扇头蜱RhcA和RhcB基因的序列、镰形扇头蜱RhcA和RhcB基因的克隆、以及在大肠杆菌中的表达和兔体抗蜱免疫保护作用。本发明克隆到镰形扇头蜱而个半胱氨酸蛋白酶新基因，为应用半胱氨酸蛋白酶分子进行抗蜱及蜱传病疫苗或创制新药提供基础。

Description

镰形扇头蜱RhcA和RhcB基因的克隆、表达和抗蜱免疫保护作用

技术领域

本发明属于生物基因技术领域。具体涉及镰形扇头蜱RhcA和RhcB基因的序列、镰形扇头蜱RhcA和RhcB基因的克隆、以及在大肠杆菌中的表达和兔体抗蜱免疫保护作用。

背景技术

蜱是一类最常见的动物体表寄生虫，它们侵袭哺乳动物、鸟类、爬行类，甚至两栖类，广泛分布于世界各地。目前，世界上已发现的蜱超过850种，在中国已记录的蜱有110种。蜱的危害不仅是作为动物外寄生虫，更重要的是作为许多人和动物重要疾病的传播媒介。蜱是仅次于蚊子的第二大类病原传播者，据粗略统计，经蜱传播和携带的病毒有126种(如森林脑炎、出血热)，立克次氏体20种(如Q热、蜱媒斑疹热)，螺旋体18种(如莱姆病)，细菌14种(如土拉菌、布氏杆菌)和原虫26种(如巴贝西虫、泰勒虫)。经蜱传播的人莱姆病、Q热和森林脑炎等疾病已严重危害着人类健康；蜱在蛇类、鸟类和野生哺乳动物的普遍寄生和经常更换宿主，可以将野生动物的疾病传给人，因此，蜱在自然疫源性疾病的传播中，起着很重要作用，给公共卫生的安全带来严重威胁。目前，蜱和蜱传播疾病的控制主要依靠化学杀虫剂，但由于蜱抗药性的出现、环境污染以及食品安全等，必迫切需要新的控制策略。自从Willadsen第一次将微小牛蜱中肠抗原Bm86免疫牛获得成功以后，免疫预防被认为是最有前途的蜱控制方法，因此，筛选有潜力的候选疫苗分子是蜱和蜱传播疾病研究的热点之一。

近来许多研究表明，半胱氨酸蛋白酶在许多寄生虫的致病性方面起着很重要的作用。如，在恶性疟原虫中可降解血红蛋白，在肝片吸虫中可切割宿主的免疫球蛋白等。半胱氨酸蛋白酶在蜱的生命活动中也起到重要的作用，初步研究表明，可能与降解宿主的血红蛋白有关。由于寄生虫的半胱氨酸蛋白酶在其生命活动中的重要性，以及它们与哺乳动物的半胱氨酸蛋白酶在结构上的差异，因此，半胱氨酸蛋白酶分子已作为抗虫药物设计的靶点和研制疫苗的候选抗原之一。例如，用半胱氨酸蛋白酶抑制剂可抑制犬恶丝虫的第三期和第四期幼虫的蜕皮，用日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶DNA疫苗免疫小鼠，可获得24.2％的减虫率和34.9％肝卵减少率，但半胱氨酸蛋白酶在蜱及蜱传病防制中的应用还缺少研究。本发明克隆到镰形扇头蜱二个半胱氨酸蛋白酶新基因，并对其作为抗蜱疫苗候选分子进行了研究，将为探索应用半胱氨酸蛋白酶分子进行抗蜱及蜱传病疫苗或发展新药物提供基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于研究应用半胱氨酸蛋白酶分子进行抗蜱及蜱传病疫苗等新的防治药物。

本发明提供了镰形扇头蜱RhcA和RhcB基因的序列。

本发明根据半胱氨酸蛋白酶的活性位点保守性氨基酸序列及镰形扇头蜱氨基酸密码子使用偏好设计引物，PCR扩增、测序并分析得到两个镰形扇头蜱的半胱氨酸蛋白酶基因片断，再通过5’RACE的方法得到全长基因序列。RhcA全长1168bp，在3’端有polyA及其信号序列AATAAA，开放阅读框从第58个碱基到第1053个碱基，编码332个氨基酸序列，预测分子量为36KDa。对氨基酸的信号肽分析，发现有一个16个氨基酸的信号肽，切割点在第16和第17个氨基酸之间；RhcB全长1153bp，在3’端有polyA及其信号序列AATAAA，开放阅读框从第43个碱基到第1047个碱基，编码335个氨基酸，预测分子量约为37KDa，对氨基酸的信号肽分析，发现有18个氨基酸的信号肽，切割点在第18和第19个氨基酸之间。同源性分析表明，这两个序列均含有半胱氨酸蛋白酶活性位点C25、H150和N175处的保守性氨基酸序列，且与其它物种的组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶有很高的同源性，其中，RhcA与其他蜱种或物种的半胱氨酸蛋白酶在氨基酸水平上的同源性为58.5％-79.8％；RhcB与其他蜱种或物种的半胱氨酸蛋白酶在氨基酸水平上的同源性为56.7％～89.8％。尽管同源性分析表明，二个基因均为组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶基因，但RhcA和RhcB核苷酸序列的同源性只有63％。因此，将RhcA和RhcB命名为镰形扇头蜱两个新的组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶基因。

本发明的镰形扇头蜱RhcA基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列见图1。

本发明的镰形扇头蜱RhcB基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列见图2。

经RT-PCR分析表明，RhcA和RhcB在镰形扇头蜱的不同发育阶段表达情况不一。

本发明的另一目的是提供了镰形扇头蜱RhcA和RhcB基因的克隆和表达。

将RhcA和RhcB基因亚克隆到表达质粒pET32a(+)中，构建重组质粒pET32a/RhcA和pET32a/RhcB，转化到BL21(DE3)表达菌后，经IPTG诱导表达。SDS-PAGE表明，重组质粒pET32a/RhcA和pET32a/RhcB均得到高效表达。重组融合蛋白大小均为55kD左右，考虑到Trx融合蛋白为20kD左右，重组融合蛋白与预期分析的大小相一致。Western Blot显示二个重组蛋白均可被蜱抗唾液抗体识别，表明重组蛋白有良好的抗原性，为兔体抗蜱免疫实验提供基础。

本发明的又一目的是提供了镰形扇头蜱RhcA和RhcB基因重组蛋白的抗蜱免疫保护作用。

二个重组蛋白纯化后，按常规免疫程序免疫实验兔，即纯化蛋白按300μg/只剂量，加等体积的弗氏完全佐剂，兔背部皮内多点注射进行首免。两周后以按150μg/只剂量进行二免，纯化蛋白加弗氏不完全佐剂皮内多点注射。二免10天后，按150μg/只剂量进行三免，不加任何佐剂，腿部肌肉注射。三免结束一周后，兔耳静脉采血，检测抗体效价，并进行成蜱感染实验。结果表明，与对照组相比，免疫组兔子对镰形扇头蜱侵袭和吸血显示出明显的保护作用。对照Trx免疫组，接种蜱48小时后，吸附率为68％，而RhcA和RhcB免疫组仅为17％和16％。对照组蜱的饱血率为54％，而RhcA和RhcB免疫组仅为42％和22％。

通过下列具体实施方式将进一步详细说明本发明的内容。

附图说明

图1：镰形扇头蜱RhcA基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列↑处为信号肽切割点，^**代表活性位点的氨基酸，^*表示终止密码

图2：镰形扇头蜱RhcB基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列↑处为信号肽切割点，^**代表活性位点的氨基酸，^*表示终止密码

图3：镰形扇头蜱RhcA和RhcB与其他物种组织蛋白酶L-样的半胱氨酸同源性比较

镰形扇头蜱RhcA和RhcB的氨基酸与具尾扇头蜱组织蛋白酶L-样的半胱氨酸(AY208824-1)的同源性分别为79.8％and56.7％，与微小牛蜱(AF227957-1)的同源性分别为89.2％and66.6％，与伪步行虫(AY207373-1)的同源性分别为63.1％and61.1％，与具尾扇头蜱(AY208822-1)的同源性分别为64.5％and89.8％，麻蝇(D16533-1)的同源性分别为58.5％and61.4％。方框表示活性位点处保守的氨基酸序列

图4：镰形扇头蜱RhcA(A)和RhcB(B)基因在不同发育阶段的RT-PCR表达分析

泳道1，卵；泳道2，幼蜱；泳道3，若蜱；泳道4，未吸血成蜱；泳道5，半饱血成蜱；泳道6，重组质粒阳性对照；泳道7，兔白细胞阴性对照

图5：镰形扇头蜱RhcA(A)和RhcB(B)基因在大肠杆菌中的重组表达

泳道M，表示标准分子量蛋白，泳道1为未诱导菌体蛋白，泳道2为诱导后菌体蛋白，泳道3为纯化的重组蛋白，泳道4为空载体诱导蛋白

图6：Western blot分析抗蜱唾液抗体对RhcA和RhcB的重组蛋白识别

泳道1，RhcA重组蛋白，泳道2，Trx对照蛋白，泳道3，RhcB重组蛋白，泳道4，为预染标准分子量蛋白

具体实施方式

实施例1镰形扇头蜱两个组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶新基因RhcA和RhcB的克隆与序列分析

1.材料与方法

1.1.蜱

镰形扇头蜱，采自湖北武昌，经兔体人工饲养获得蜱的单雌蜱蜱群。

1.2.试剂

TRIZOL试剂、3’-RACE和5’-RACE试剂盒购自Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司；玻璃珠DNA胶回收试剂盒购自上海生物工程公司；pGEM-T Easy载体购自Promega公司；所用引物由赛百盛公司合成。

1.3.镰形扇头蜱总RNA的提取及反转录

取在兔体吸血4天的半饱血成蜱，清洁后，在液氮中充分研磨，加TRIZOL试剂，在匀浆器中充分匀浆。按TRIZOL试剂说明书的步骤提取镰形扇头蜱半饱血成蜱的总RNA。约5μg的总RNA用于反转录得cDNA第一链。

1.4.目的基因片段的克隆与测序

根据半胱氨酸蛋白酶活性位点处的保守性氨基酸序列^[6，7](GQCGSCWA和YWLVKMSW)和蜱的氨基酸密码子的使用频率，设计了一对PCR引物：

上游引物：5’ACC AGG GCC AGT GCG GCT CCT GCT G3’

下游引物：5’CCC AGC TGT TCT TGA CGA GC3’

用镰形扇头蜱半饱血成蜱的cDNA为模板，用所设计的上下游引物进行PCR扩增，扩增条件：94℃3min预变性；94℃40s，50℃40s，72℃1min，30个循环；72℃延伸7min。

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳、回收目的条带，连接到pGEM-T Easy载体上，转化E.coli DH5α细胞，经PCR鉴定后，目的基因测序。

1.5.快速扩增cDNA5’端(5’RACE)

根据目的基因片段的测序结果设计5’RACE所用引物，RhcA：GSP1＝5’-AGTGTCCAGCGTCAATGGCTA-3’，GSP2＝5’-GATGTCTACAAAGCCGGTGTCGG-TTG-3’，nestedGSP＝5’-ACCAGGGCCAGTGCGGCTCCTGCTG-3’；RhcB：GSP1＝5’-TAGACAC-CTTCCGAGTAGAAC-3’，GSP2＝5’-CGTGGCTGGCGTCGATGGCAACTGAGAC-3’，nestedGSP＝5’-ACCAGGGCCAGTGCGGCTCCTGCTG-3’。根据5’RACE的方法扩增cDNA的5’端，回收目的条带、连入pGEM-T Easy载体上，转化E.coli DH5α细胞，经PCR鉴定后，测序。

1.6.全长cDNA的克隆与测序

根据5’端的测序结果设计扩增全长基因的上游引物，

(RhcA：GSP＝5’-GAGCTCTCCACCAGGTGCACC-3’，RhcB：GSP＝5’-AGGTCACTTGGGGTCTCCGGC-3’)。根据3’RACE的方法扩增RhcA和RhcB的全长cDNA。扩增条件：94℃预变性4min；94℃40s，53℃40s，72℃2min，35个循环；72℃延伸7min。PCR产物回收，连入pGEM-T Easy载体，转化E.coliDH5α细胞，经PCR鉴定后，测序。

1.7.序列分析

用Blastx进行同源性分析；同时，采用Gentyx-MAC软件对该基因的开放阅读框、保守性氨基酸序列进行分析。

1.8.RT-PCR分析RhcA和RhcB在镰形扇头蜱的不同发育阶段的表达情况

为了判断cysA，cysB在不同发育阶段表达情况，从不同发育阶段的镰形扇头蜱，包括卵、幼蜱、若蜱、未吸血成蜱、半饱血成蜱中分别提取总RNA。分别以1μg总RNA反转录合成第一链cDNA，并取2μl反转录产物作为PCR扩增模板。

RhcA基因特异性引物：

上游，5’-AAGCTTCTTGCCTCCACCATGCTGAG-3’

下游，5’-CTCGAGGACGAGTGGGTAGCTGGCC-3’

RhcB基因特异性引物：

上游，5’-GAATTCATGCGGGGGTACATTGTTTTGTGCTGC-3’

下游，5’-GCGGCCGCGACGAGAGGATAGCTGGCG-3’

用RhcA和RhcB的重组质粒为模板的PCR反应设为阳性对照，用兔白细胞总RNA的反转录产物为模板的PCR反应设为阴性对照。取5μlPCR产物，经1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

2.结果与分析

2.1.目的基因片段的克隆与测序

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在约500bp位置有一明亮的带。该产物连接到质粒载体并转化，随机选取20个阳性克隆测序，结果获得2个序列明显不同的基因片段，经NCBI网站Blastx分析，这两个基因片段与已登录的其它物种的半胱氨酸蛋白酶序列有很高的同源性，初步鉴定为二个半胱氨酸蛋白酶基因片段，分别命名为RhcA和RhcB。

2.2.快速扩增cDNA5’端(5’-RACE)

5’-RACE第一次PCR均没有特异带出现，Nested PCR获得500bp左右的基因片段，插入pGEM-T Easy载体，经PCR鉴定后，挑取阳性克隆测序，结果获得5’端序列。

2.3.二个基因全长cDNA的克隆与测序

根据5’-RACE结果，设计基因特异性引物，按3’-RACE的方法扩增全长基因。PCR产物电泳，在1.2kb左右出现单一的亮带，与预期的大小基本相符。目的条带成功连入pGEM-T Easy载体，经PCR鉴定后，选取阳性克隆测序，结果获得全长基因。RhcA(如图1)全长1168bp，在3’端有polyA和polyA的信号序列AATAAA，有一个开放阅读框，从第58个碱基到第1053个碱基，编码332个氨基酸序列，分子量为36.33KDa；对氨基酸的信号肽分析，有一个16个氨基酸的信号肽，切割点在第16和第17个氨基酸间；RhcB(如图2)全长1153bp，在3’端有polyA和polyA的信号序列AATAAA，开放阅读框从第43个碱基到第1047个碱基，编码335个氨基酸，分子量为37.56KDa，对氨基酸的信号肽分析，有一个18个氨基酸的信号肽，切割点在第18和第19个氨基酸之间。尽管同源性分析表明，二个基因均为组织L-样半胱氨酸蛋白酶基因，但核苷酸序列的同源性只有63％。

2.4.与其它半胱氨酸蛋白酶的同源性分析

将RhcA和RhcB的氨基酸序列同已报道的具尾扇头蜱、微小牛蜱、伪步行虫(Tenebrio molitor)、麻蝇(Sarcophaga peregrina)的半胱氨酸蛋白酶进行同源性比较，结果这两个序列均含有半胱氨酸蛋白酶活性位点C²⁵、H¹⁵⁰和N¹⁷⁵处的保守性氨基酸序列(如图3)，且它们与其它蜱种或物种的组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶有很高的同源性，其中，RhcA与其他蜱种或物种的半胱氨酸蛋白酶在氨基酸水平上的同源性为58.5％-79.8％；RhcB与其他蜱种或物种的半胱氨酸蛋白酶在氨基酸水平上的同源性为56.7％-89.8％。

2.5.RhcA和RhcB在镰形扇头蜱的不同发育时期的表达分析

从蜱的不同发育阶段提取RNA，反转录成cDNA，取等量cDNA为模板，用二个基因的特异性引物分别进行RT-PCR。结果如图4所示，兔白细胞cDNA中均没有扩增出特异基因片段，排除了RhcA和RhcB受兔血污染的可能性，RhcA在镰形扇头蜱的幼蜱、若蜱、未吸血成蜱和半饱血雌蜱中均有较高表达，但在卵中的表达量很少。RhcB在镰形扇头蜱的卵、幼蜱、若蜱、半饱血雌蜱中均有较高表达，但在未吸血成蜱中表达量极低，这一结果反映出RhcA和RhcB在蜱的不同发育时期的表达差异，推测与二个基因在体内不同的生物学功能有关。

实施例2镰形扇头蜱RhcA和RhcB基因的体外表达和抗蜱免疫保护实验

1.材料和方法

1.1.试剂

Taq DNA聚合酶购自BioStar公司；T4DNA连接酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司；pGEM-T easy载体购自Promega公司；质粒DNA提取试剂盒购自赛百盛公司；PCR引物由赛百盛公司合成；BugBuster His Bind Purification Kit为Novagen公司产品；低分子量蛋白Marker由中国科学院上海生物化学研究所监制，BCA蛋白分析试剂盒是PIERCE公司产品。

1.2.菌株与质粒

大肠杆菌菌株DH5α、BL21(DE3)及质粒pET-32a均为本所实验室提供。

1.3.实验动物

新西兰大白兔购自中科院上海实验动物中心。

1.4.RhcA和RhcB重组表达质粒的构建和体外表达

根据RhcA和RhcB基因编码蛋白质序列，分别设计一对含有酶切  位  点  的  特  异  性  引  物(RhcA：5’-CACGGATATCTCTCATGAAATCCTACGCACCC-3’和5’-CACGAA GCTTGACGAGTGGGTAGCTGG-3’分别含EcoR V和HindIII 酶  切  位  点；RhcB，5’-GTAGAATTCGAGCTCGTTGGTGCTGAGTGG-3’和5’-GTAGCGGCCGCGACGAGAGGATAGCTGGCG-3’分别含EcoR I和Not I酶切位点)，分别以本实验室构建的重组质粒pGEM-T/RhcA和pGEM-T/RhcB为模板，PCR扩增编码蛋白质序列，亚克隆到pGEM-T载体，重组质粒酶切消化后，再连接到表达载体pET-32(a+)。经测序确证后，重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)。将转化阳性菌接种于3ml含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm，培养过夜。取过夜培养的菌液按1∶100接种于新鲜的LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD₆₀₀在0.6-0.8左右时，向培养基中加入IPTG，使终浓度为1mmol/L，继续培养6h，离心收集菌体，经15％SDS-PAGE分析。重组表达蛋白用BugBuster His Bind PurificationKit进行纯化，BCA法测定蛋白浓度。

1.5.Western blot分析

二个重组蛋白和对照蛋白Trx经SDA-PAGE电泳后，转印到硝酸纤维素膜上，5％脱脂奶粉封闭过夜，以兔抗蜱唾液抗血清(1∶1000稀释)为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶1500稀释)为二抗进行杂交，DAB显色检测信号。

1.6.重组蛋白抗蜱免疫保护试验

6只新西兰大白兔用于免疫实验，其中2只用对照蛋白Trx免疫，2只用RhcA重组蛋白免疫，2只用于RhcB重组蛋白免疫。Trx蛋白和二个重组蛋白纯化后，按常规免疫程序免疫实验兔，即抗原按300μg/只剂量，加等体积的弗氏完全佐剂，兔背部皮内多点注射进行首免。两周后以按150μg/只剂量进行二免，纯化蛋白加弗氏不完全佐剂皮内多点注射。二免10天后，按150μg/只剂量进行三免，不加任何佐剂，腿部肌肉注射。三免结束一周后，兔耳静脉采血，检测抗体效价，并进行成蜱感染实验。蜱感染试验中，每只兔左、右耳分别接种50只成蜱(雌雄各半)，48小时后，检查蜱叮吸情况，计算吸附率。逐日统计饱血蜱数，计算饱血率。

2.结果

2.1.RhcA和RhcB基因重组表达质粒的构建

以重组质粒pGEM-T/RhcA和pGEM-T/RhcB为模板，PCR扩增编码蛋白质序列为均为1000bp左右，与预期大小相一致。通过DNA片段的回收、酶切、纯化、与载体pET32a的连接，构建出重组表达质粒pET-32a/RhcA和pET32-a/RhcB，PCR和酶切鉴定发现插入的基因片断与预期的大小一致，序列测定确证了外源片段正确插入，表明重组表达质粒构建成功。

2.2.cysA和cysB基因的表达与纯化

重组质粒pET-32a/RhcA和pET32-a/RhcB和空质粒pET32a在E.coli BL21中，经IPTG诱导均高效表达。SDS-PAGE表明，重组质粒pET32a/RhcA和pET32a/RhcB均得到高效表达(图5)。重组融合蛋白大小均为55kD左右，考虑到Trx融合蛋白为20kD左右，重组融合蛋白与预期分析的大小相一致。此两种融合蛋白均以不溶性的包涵体形式存在，表达产物用6M尿素变性溶解后，再经BugBuster HisBind Purification Kit的Ni柱纯化，纯化蛋白经透析复性后，BCA法测得蛋白浓度。

2.3Western blot结果

Western Blot显示对照蛋白Trx没有检测信号，而二个重组蛋白均可被蜱抗唾液抗体识别(图6)，表明重组蛋白有良好的抗原性，为兔体抗蜱免疫实验提供基础。

2.4.免疫试验结果

三免后的兔血清，琼脂扩散试验检测效价为1∶16。抗蜱免疫保护结果表明，与对照组相比，免疫组兔子对镰形扇头蜱侵袭和吸血显示出明显的保护作用。对照Trx免疫组，接种蜱48小时后，吸附率为68％，而RhcA和RhcB免疫组仅为17％和16％。对照组蜱的饱血率为54％，而RhcA和RhcB免疫组仅为42％和22％。

序列表

<110>中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所

农业部动物寄生虫学重点开放实验室

<120>镰形扇头蜱RhcA和RhcB基因的克隆、表达和抗蜱免疫保护作用

<130>说明书、权利要求书

<160>4

<170>PatentIn version3.2

<210>1

<211>1168

<212>DNA

<213>RhcA核苷酸序列

<400>1

gcagggtgca ttgaaagagt cgagctctcc accaggtgca ccgtccttgc ctccaccatg    60

ctgagattaa gcctactttg cgccattgtg gcggtaaccg ttgccgcaaa ctctcatgaa    120

atcctacgca cccaatggga ggcattcaaa actacacaca agaaatccta cgaatcgcac    180

atggaggagc tcctgaggtt caaaattttc actgaaaaca gcctgatcat tgccaagcac    240

aacgcgaagt atgccaaggg tctcgtttct tacaagctcg gaatgaacca gttcggagat    300

ctgctggcgc acgaattcgc caagatcttc aacggttacc gtggtcagcg cacatcccgc    360

ggatccacat tcatgccacc agcaaacgtc aacgacagca gcctgccaag cactgtcgac    420

tggcgcaaga aaggagctgt cacacctgtc aaggaccagg gccagtgcgg ctcctgctgg    480

gcgttcagtg ccactggatc tctggaggga cagcattttc tgaaggacgg cgagctggtt    540

tcactcagtg agcaaaactt ggtcgactgc tctcagtcct ttggcaacaa tggttgcgag    600

ggcggcctca tggacaacgc tttcaagtac attaaggcta acgatggtat cgacgccgag    660

gagagctatc catatgaggc tatggatgac aagtgtcgct tcaagaagga agacgttggt    720

gcaaccgaca ccggctttgt agacatcgag gggggatctg aggatgactt gaaaaaagcc    780

gtcgctaccg ttggcccaat ttccgtagcc attgacgctg gacactcgtc attccagctg    840

tattccgaag gagtgtacga tgagcccgag tgtagcagcg aagaactgga ccacggtgtg    900

cttgctgtcg gctatggtgt taaggacgga aagaagtatt ggctcgtcaa gaacagctgg    960

ggtgggtcct ggggagacaa cggctacatc ctgatgtccc gtgacaagaa caaccagtgc    1020

ggcattgcct cagcggccag ctacccactc gtctaaacaa gtgatttcac gtagtgacgt    1080

tcgcctgaat gtttcctaaa atgtacataa cttattaacc taaataaatt gcccatattt    1140

cgccactgtg aaaaaaaaaa aaaaaaaa                                       1168

<210>2d<211>332

<212>PRT

<213>RhcA氨基酸序列

<400>2

Met Leu Arg Leu Ser Leu Leu Cys Ala Ile Val Ala Val Thr Val Ala

1               5                   10          15

Ala Asn Ser His Glu Ile Leu Arg Thr Gln Trp Glu Ala Phe Lys Thr

            20                  25                  30

Thr His Lys Lys Ser Tyr Glu Ser His Met Glu Glu Leu Leu Arg Phe

        35                  40                  45

Lys Ile Phe Thr Glu Ash Ser Leu11e Ile Ala Lys His Asn Ala Lys

    50                  55                 60

Tyr Ala Lys Gly Leu Val Ser Tyr Lys Leu Gly Met Asn Gln Phe Gly

65                  70                  75                  80

Asp Leu Leu Ala His Glu Phe Ala Lys Ile Phe Asn Gly Tyr Arg Gly

                85                  90                  95

Gln Arg Thr Ser Arg Gly Ser Thr Phe Met Pro Pro Ala Asn Val Asn

            100                 105                 110

Asp Ser Ser Leu Pro Ser Thr Val Asp Trp Arg Lys Lys Gly Ala Val

        115                 120                 125

Thr Pro Val Lys Asp Gln Gly GlnCys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser

    130                 135                140

Ala Thr Gly Ser Leu Glu Gly Gln His Phe Leu Lys Asp Gly Glu Leu

145                 150                 155                 160

Val Ser Leu Ser Glu GlnAsn Leu Val Asp Cys Ser Gln Ser Phe Gly

                165                170                 175

Asn Asn Gly Cys Glu Gly Gly Leu Met Asp Asn Ala Phe Lys Tyr Ile

            180                 185                 190

Lys Ala Asn Asp Gly Ile Asp Ala Glu Glu Ser Tyr Pro Tyr Glu Ala

        195                 200                 205

Met Asp Asp Lys Cys Arg Phe Lys Lys Glu Asp Val Gly Ala Thr Asp

    210                 215                 220

Thr Gly Phe Val Asp Ile Glu Gly Gly Ser Glu Asp Asp Leu Lys Lys

225                 230                 235                 240

Ala Val Ala Thr Val Gly Pro Ile Ser Val Ala Ile Asp Ala Gly His

                245                 250                 255

Ser Ser Phe Gln Leu Tyr Ser Glu Gly Val Tyr Asp Glu Pro Glu Cys

            260                 265                 270

Ser Ser Glu Glu Leu Asp His Gly Val Leu Ala Val Gly Tyr Gly Val

            275             280                 285

Lys Asp Gly Lys Lys Tyr Trp Leu Val Lys Asn Ser Trp Gly Gly Ser

    290                 295                 300

Trp Gly AspAsn Gly Tyr Ile Leu Met Ser Arg Asp Lys Asn Asn Gln

305                310                 315                 320

Cys Gly Ile Ala Ser Ala Ala Ser Tyr Pro Leu Val

                325                 330

<210>3

<211>1153

<212>DNA

<213>RhcB核苷酸序列

<400>3

gaggtcactt ggggtgtccg gctccacacg cttcctaaaa aaatgcgggg gtacattgtt    60

ttgtgctgct tgttcgtgac tgctgctgca attacgcatc aagagctcgt tggtgctgag    120

tggtcagcgt tcaaggcatt acacggaaag gactatgcgt ctgacacaga agaatactac    180

aggctgaaga tctacatgga aaacaggttg aagattgcgc ggcacaatga gaagtacgcc    240

aaaagccagg tctcgtacaa gcttgcgatg aatgaatttg gcgacttgct acaccacgag    300

ttcgtcagca cacgcaacgg cttcaagcgc aactacaggg actctccacg agagggcagc    360

ttcttcgtcg agcctgaggg ctttgaggat ttgcagctgc ccaagactgt cgactggagg    420

aagaaaggcg ctgtgacccc tgtcaagaac cagggacagt gcggctcctg ctgggcattc    480

agcactacgg gatccctgga gggcccgcac ttccgcaaga cacgcaagct tgtgtccctc    540

agtgagcaga acctggtcga ctgctccaga agcttcggca acaacggctg cgagggtggt    600

ctcatggaca atgctttcaa gtacatcaag tccaacaagg gcattgacac agagtggagc    660

tacccttaca atgccacgga cggtgtctgc cacttcaaca ggagtgatgt gggtgccacc    720

gacactggct tcgtcgacat accagaaggg gacgagaaca agctgaagaa ggctgtggcc    780

gctgttggac ccgtctcagt tgccatcgac gccagccacg agtcattcca gttctactcg    840

gaaggtgtct atgatgaacc agagtgcagc agtgagcagc ttgaccacgg tgtccttgtt    900

gttggctatg gaaccaagga tggccaggac tattggctcg tcaagaacag ctggggcaca    960

acctggggag acgagggcta catctacatg acaaggaaca aggacaacca gtgcggaatc    1020

gccagctccg ccagctatcc tctcgtctag ttacgcgcgg ttttttacat gctcgtcttt    1080

gtttcatatt gcatccccgc tcactcggca caaataaact ttttttttgt acagtgaaaa    1140

aaaaaaaaaa aaa                                                       1153

<210>4

<211>335

<212>PRT

<213>RhcB氨基酸序列

<400>4

Met Arg Gly Tyr Ile Val Leu Cys Cys Leu Phe Val Thr Ala Ala Ala

1               5                   10              15

Ile Thr His Gln Glu Leu Val Gly Ala Glu Trp Ser Ala Phe Lys Ala

            20                  25                  30

Leu His Gly Lys Asp Tyr Ala Ser Asp Thr Glu Glu Tyr Tyr Arg Leu

        35                  40                  45

Lys Ile Tyr Met Glu Asn Arg Leu Lys Ile Ala Arg His Asn Glu Lys

    50                  55                  60

Tyr Ala Lys Ser Gln Val Ser Tyr Lys Leu Ala Met Asn Glu Phe Gly

65                  70                  75                  80

Asp Leu Leu His His Glu Phe Val Ser Thr Arg Asn Gly Phe Lys Arg

                85                  90                  95

Asn Tyr Arg Asp Ser Pro Arg Gl u Gly Ser Phe Phe Val Glu Pro Glu

            100                  105                 110

Gly Phe Glu Asp Leu Gln Leu Pro Lys Thr Val Asp Trp Arg Lys Lys

        115                 120                 125

Gly Ala Val Thr Pro Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp

    130                 135                 140

Ala Phe Ser Thr Thr Gly Ser Leu Glu Gly Pro His Phe Arg Lys Thr

145                 150                 155                 160

Arg Lys Leu Val Ser Leu Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp Cys Ser Arg

            165                     170                 175

Ser Phe Gly Asn Asn Gly Cys Glu Gly Gly Leu Met Asp Asn Ala Phe

            180                 185             190

Lys Tyr Ile Lys Ser Asn Lys Gly Ile Asp Thr Glu Trp Ser Tyr Pro

        195                 200                 205

Tyr Asn Ala Thr Asp Gly Val Cys His Phe Asn Arg Ser Asp Val Gly

    210                 215                 220

Ala Thr Asp Thr Gly Phe Val Asp Ile Pro Glu Gly Asp Glu Asn Lys

225                 230                 235                 240

Leu Lys Lys Ala Val Ala Ala Val Gly Pro Val Ser Val Ala Ile Asp

                245                 250                 255

Ala Ser His Glu Ser Phe Gln Phe Tyr Ser Glu Gly Val Tyr Asp Glu

            260                 265                 270

Pro Glu Cys Ser Ser Glu Gln Leu Asp His Gly Val Leu Val Val Gly

        275                 280                 285

Tyr Gly Thr Lys Asp Gly Gln Asp Tyr Trp Leu Val Lys Asn Ser Trp

    290                 295                 300

Gly Thr Thr Trp Gly Asp Glu Gly Tyr Ile Tyr Met Thr Arg Asn Lys

305                 310                 315                 320

Asp Asn Gln Cys Gly Ile Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Pro Leu Val

                  325                 330                 335

Claims (8)

1.一种镰形扇头蜱RhcA基因，其特征在于所述基因全长1168bp，在3’端有polyA和polyA的信号序列AATAAA，有一个开放阅读框，从第58个碱基到第1053个碱基，编码332个氨基酸序列，分子量为36.33Kda；对氨基酸的信号肽分析，有一个16个氨基酸的信号肽，切割点在第16和第17个氨基酸间；其中**代表活性位点的氨基酸，*表示终止密码；所述的序列如下所示：

2.一种镰形扇头蜱RhcB基因序列，其特征在于其中所述序列为全长1153bp，在3’端有polyA和polyA的信号序列AATAAA，开放阅读框从第43个碱基到第1047个碱基，编码335个氨基酸，分子量约为37.56KDa，对氨基酸的信号肽分析，有一个18个氨基酸的信号肽，切割点在第18和第19个氨基酸之间；其中**代表活性位点的氨基酸，*表示终止密码；所述的基因序列如下所示：

3.权利要求1所述的镰形扇头蜱RhcA基因的克隆方法，其特征在于根据半胱氨酸蛋白酶的活性位点保守性氨基酸序列及镰形扇头蜱氨基酸密码子使用偏好设计引物，PCR扩增、测序并分析得到两个镰形扇头蜱的半胱氨酸蛋白酶基因片断，再通过5’RACE的方法得到全长基因序列。

4.权利要求2所述的一种镰形扇头蜱RhcB基因的克隆方法，其特征在于根据半胱氨酸蛋白酶的活性位点保守性氨基酸序列及镰形扇头蜱氨基酸密码子使用偏好设计引物，PCR扩增、测序并分析得到两个镰形扇头蜱的半胱氨酸蛋白酶基因片断，再通过5’RACE的方法得到全长基因序列。

5.权利要求1所述的镰形扇头蜱RhcA基因在大肠杆菌中的表达方法，其特征在于将镰形扇头蜱RhcA基因克隆到表达质粒pET-32a(+)，构建出重组表达质粒pET-32a/RhcA，转化到宿主菌BL21(DE3)，通过IPTG诱导表达。

6.权利要求2所述的镰形扇头蜱RhcB基因在大肠杆菌中的表达方法，其特征在于将镰形扇头蜱RhcB基因克隆到表达质粒pET-32a(+)，构建出重组表达质粒pET-32a/RhcB，转化到宿主菌BL21(DE3)，通过IPTG诱导表达。

7.一种如权利要求1所述的镰形扇头蜱RhcA基因在制备具有抗蜱免疫保护作用的免疫制剂中的应用。

8.一种如权利要求2所述的镰形扇头蜱RhcB基因在制备具有抗蜱免疫保护作用的免疫制剂中的应用。

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