WO2012041260A1 - Composicion vacunal para el control de las infestaciones por ectoparasitos. - Google Patents

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Alina Rodriguez Mallon
Erlinda Fernandez Diaz
Mario Pablo Estrada Garcia
Yamila Carpio Gonzalez
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Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia
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Definitions

  • the present invention falls within the field of veterinary medicine, in particular with the control of infestations by ectoparasites and the transmission of their associated pathogens. Such control is achieved through the use of a P0 ribosomal protein peptide in the manufacture of vaccine compositions. Vaccine formulations comprising said peptide confer protection without generating autoimmunity in the host organism.
  • Terrestrial hematophagous ectoparasites such as mosquitoes, fleas and ticks are vectors for the transmission of infectious agents that cause disease. Some of these diseases directly affect the human being and / or his affective animals, while others are the cause of large economic losses in the agricultural sphere. Examples of diseases that are transmitted by ectoparasites are malaria, leishmaniasis, dengue, erythrocytosis and Lyme disease. Ticks are considered the second transmitters of diseases to humans, after mosquitoes (Parola P. and Raoult D .; Clin. Microbiol. Infect. 2001, 7: 80-83).
  • Tick-borne hemoparasitic infections cause annual losses on the order of billions of US dollars within the livestock industry, fundamentally affecting bovine production in tropical and subtropical areas.
  • diseases in this regard are anaplasmosis, babesiosis, Lyme disease (produced by Borrelia burdogferi) and the so-called East Coast Fever (produced by Theiler ⁇ a parva).
  • Ectoparasites known as sea lice constitute the most widespread marine pathogen in the last 30 years in the salmon industry, extending over the past 15 years to other fish species in culture and to wild salmonid populations (Pike, AW and Wadsworth, SL Advances in Parasitology 2000, 44: 233-337, Ragias, V. et al. Aquaculture 2004, 242: 727-733).
  • the greatest economic losses are caused by the organisms of the genus Caligus and Lepeophtheirus.
  • sea lice can cause physiological changes in their hosts, which include the development of a stress response, the reduction of immune functions, failure in osmoregulation and death, if the infection is not treated (Johnson, SC, et al. Zool Studies 2004, 43: 8-19). There is also some evidence to suggest that sea lice could constitute vectors for the transmission of infections caused by viruses and bacteria to fish (Barker, ED, er a. Parasitology Research 2009, 105: 1173-1177).
  • Vaccination is considered a promising alternative for the control of ectoparasite infestations from the point of view of its efficacy, environmental safety and economic sustainability.
  • DNA dexosiribonucleic acid
  • vitelogenin-like molecules and host adhesion proteins have also been studied (Johnson, SC et al. Zool Studies 2004, 43: 8-19; Boxaspen, K. ICES Journal of Marine Science 2006, 63: 1304-1316) , but due to little knowledge of the mechanisms and pathology of salmon infestation by sea lice, the identification of targets for the prevention and treatment of this infestation have not been successful. In any case, the results of research carried out in the evaluation of different vaccine candidates in immunization tests have shown that the combined use of several molecules, involved in different physiological processes, constitutes a feasible method to control infestations by ectoparasites.
  • P proteins contain a conserved C-terminal region of approximately 17 amino acids, whose last six residues are highly conserved, which forms the basis of reactivity Cross immunological between them and with the P proteins of other species.
  • the P0 protein is essential for the assembly of the 60S ribosomal subunit, where it binds directly to P1, P2, the 28S rRNA and the eEF2 factor. Its absence leads to the generation of deficient ribosomes of the 60S subunit, which are inactive for protein synthesis, leading to cell death.
  • the ribosomal protein P0 in particular, constitutes a promising vaccine candidate against several protozoa and bacteria. It was immunogenic as a recombinant antigen (either using the complete protein or the C-terminal region consisting of the last 11-16 amino acids) or by immunization with naked DNA, against Toxoplasma gondii, Neospora caninum (Zhang H. ef al. Mol. Biochem. Parasitol 2007, 153: 141-148), Trypanosoma cruzi (Skeiky YA et al. J.
  • the immune response obtained in most of these experiments was characterized by the generation of high specific antibody titers, capable of conferring active and passive protection against infection, activation of T lymphocytes and the production of gamma interferon (IFNy) as part of a response pattern of type Th1.
  • IFNy gamma interferon
  • the present invention solves the aforementioned problem by providing a vaccine composition for the control of infestations by ectoparasites comprising a peptide of the ribosomal protein P0 of said ectoparasites.
  • Said composition comprises, as an antigen, an immunogenic region of the ribosomal protein P0 that is poorly conserved between the ectoparasites and the organisms affected by them, according to the results of a study disclosed in this invention, for the first time.
  • the region identified within the ribosomal protein P0 is between amino acids 267 and 301 thereof.
  • polypeptide sequences corresponding to the P0 proteins of the R. sanguineus and R. microplus ectoparasites were identical to each other, and were designated SEQ ID NO. 3.
  • This sequence and that of C. rogercresseyi P0 presented a sequence identity greater than 70% with the P0 of their host organisms, being even greater for the last 16 amino acids that make up the C-terminal region, described as the zone more immunogenic within the protein.
  • the area of least similarity in the amino acid sequence which at the same time has the possibility of being exposed and of being immunogenic, was detected in all cases in the region between amino acids 267 and 301 (SEQ ID NO.4, corresponding peptide in Rhipicephalus microplus P0 protein [pPO]; SEQ ID NO.6, corresponding peptide in Ixodes scapularis P0 protein [pPOIs]; SEQ ID NO.8, corresponding peptide in Caligus clemensi P0 protein [pPOCc], SEQ ID NO.9, corresponding peptide in the protein P0 from L. salmonis_ [pPOLs] and SEQ ID NO.10, corresponding peptide in the P0 protein of C. rogercresseyi [pPOCr]).
  • the vaccine composition comprises a peptide with an amino acid sequence identified as SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9 or SEQ ID NO. 10, a fragment of said sequences, or a peptide or polypeptide that exhibits at least 70% identity with said sequences.
  • the present invention is also related to those vaccine compositions where the indicated P0 peptide is fused, conjugated or co-administered with another molecule, to increase its immunogenicity or enhance its protective effect.
  • these molecules are carrier and immunopotentiator proteins.
  • said molecule is selected from the group consisting of hemocyanin, the T cell epitopes, the proteins that form virus-like particles, the Bm86 protein from the R. microplus tick, the Rs86 protein from the tick R. sanguineus and the my32 protein of the sea louse C. rogercresseyi or L. salmonis.
  • Peptides identified as SEQ ID NO. 4, 6, 9 and 10, between 35 and 36 amino acids, and fragments of these of 20 amino acids, were obtained by chemical synthesis and conjugated to hemocyanin (from English Keyhole Limpet Hemocyanin, abbreviated KLH) of Megathura crenulata, to enhance its immunogenicity Immunization experiments were performed with the conjugates, with challenge under controlled conditions, to assess their protective abilities.
  • the pPO peptide (SEQ ID NO. 4) was tested against R. sanguineus and R. microplus in rabbits and cattle, respectively, the pPOIs (SEQ ID NO. 6) was evaluated against /. scapularis in rabbits.
  • pPOLs and pPOCr peptides were evaluated against L. salmonis and C. rogercresseyi, respectively, both in Salmo salar.
  • Vaccination of salmon with the pPOLs-KLH and pPOCr-KLH conjugates induced protection against infestations by both species of sea lice, evidenced by a significant decrease in the number of parasites per fish.
  • immunization experiments were performed with the pPO and pPOCr obtained recombinantly, fused to the T epitopes of the tetanus toxin and the measles virus fusion protein (Measles Virus Fusion protein, abbreviated MVF) in The same genetic construction.
  • MVF measles virus Fusion protein
  • fusion to promiscuous T epitopes significantly improves protection, compared to the antigen conjugated to KLH.
  • the pPO was also fused to virus-like particles (from the English Virus-like Partióles, abbreviated VLPs) of the Rabbit Hemorrhagic Disease Virus (from the English Rabbit Hemorrhagic Disease Virus, abbreviated RHDV), and it was also found that when the peptide was fuses to the Bm86 antigen, the protective effect of the peptide is enhanced.
  • compositions based on the pPO peptide are effective for the control of infestations by ectoparasites, such as ticks and sea lice. Therefore, the compositions based on pPO are also useful for the control of the transmission of the pathogens associated with said ectoparasites.
  • This vaccine comprises an immunologically effective amount of antigen in a pharmaceutically acceptable adjuvant, by which infestations by these pathogens can be controlled.
  • the antigen in this vaccine consists of a peptide of the P0 ribosomal protein of these ectoparasites, comprised between amino acids 267 and 301 of said protein, which corresponds to the area of least similarity in the amino acid sequence of the protein of ectoparasites with the same region of the protein in their respective host organisms.
  • Said peptide is obtained recombinantly or by chemical synthesis.
  • Fused polypeptides comprising the pPO peptide can also be obtained recombinantly.
  • an expression system in yeasts, bacteria, plants, insect larvae, insect cells or mammalian cells can be used to obtain said antigens by recombinant route.
  • the vaccine compositions thereof may additionally comprise a vaccine adjuvant.
  • vaccine adjuvants comprising an oil-type adjuvant were evaluated.
  • aluminum salts, liposomal vesicles, molecules related to the immune system such as cytokines, among others, can be used as adjuvants.
  • compositions of the invention can be administered in many different ways.
  • the composition is administered by injection.
  • they are administered by feed formulations.
  • the compositions are administered to fish it is possible to apply them by means of immersion baths.
  • the subject of the present invention is also a vaccine composition for the control of ectoparasite infestations comprising nucleic acids encoding the ribosomal protein P0 peptide of said ectoparasites, corresponding to the region between amino acids 267 and 301 of the protein, and that generates an immune response against said peptide by immunization with naked DNA.
  • said peptide has an amino acid sequence identified as SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9 or SEQ ID NO. 10, is a fragment of said sequences, or is a peptide or polypeptide that exhibits at least 70% identity with said sequences.
  • the invention also relates to the use of the region between amino acids 267 and 301 of the P0 ribosomal protein of ectoparasites for the manufacture of a vaccine composition for the control of infestations by these parasites or the transmission of associated pathogens. to them.
  • said peptide has an amino acid sequence identified as SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9 or SEQ ID NO. 10, is a fragment of said sequences, or is a peptide or polypeptide that exhibits at least 70% identity with said sequences.
  • Figure 1 Prediction of the degree of accessibility of amino acid residues present in the ribosomal protein P0 of R. microplus and R. sanguineus.
  • the region corresponding to the sequence defined as SEQ ID NO.4 is indicated by a circle.
  • Figure 2 Response of specific anti-P0 peptide IgG antibodies, detected by ELISA in the serum of BALB / c mice immunized with the pPO-KLH conjugate.
  • the data are expressed as the reciprocal of the average antibody titer, determined as the last serum dilution with an average optical density (OD) greater than three times the average OD of a negative serum. Standard deviations are represented by positive error bars. No antibody titers were detected for any of the animals on day zero.
  • FIG. 3 Expression pattern of the P0 ribosomal protein of Rhipicephalus ticks in the rabbit RK-13 cell line analyzed by Western blotting with the polyclonal antibody generated in mice against P0.
  • 1. Molecular weight pattern 2. lysate of RK-13 cells transfected with pAdTrack-PORs plasmid under reducing conditions, 3. lysate of RK-13 cells transfected with pAdTrack-PORs plasmid under non-reducing conditions, 4. Lysate of RK-13 cells not transfected under reducing conditions, 5.
  • Figure 4 Response of anti-KLH, anti-P0 and anti-Bm86 IgG antibodies detected by ELISA in the serum of rabbits immunized with these antigens (Example 6).
  • the data are expressed as the reciprocal of the average antibody titer, determined as the last serum dilution with an average OD greater than three times the average OD of the negative control groups as appropriate. Standard deviations are represented by positive error bars. No specific antibody titers against the antigens were detected for any of the groups on day zero of the assay.
  • Figure 5 Recovery of larvae, nymphs and adults of R. sanguineus in the immunized rabbits of Example 6.
  • the data are expressed as the average of the percent of larvae, nymphs and adults recovered in the different experimental groups.
  • the standard deviations of the groups are represented by error bars in the positive direction.
  • the graph shows with different letters, the statistically significant differences between the experimental groups (ANOVA and Bonferroni multiple comparisons test [p ⁇ 0.01].)
  • the data were previously transformed to the arch of its square root ).
  • FIG. Freshly molted nymphs of R. sanguineus from the larvae fed on the different experimental groups of Example 6.
  • A Negative control group
  • B Immunized with Bm86
  • C Immunized with the pPO-KLH conjugate
  • D Appearance of dead nymphs molted from larvae fed on rabbits immunized with pPO-KLH.
  • FIG. 7 Hatching percentage of R. sanguineus birds from teleogins fed on rabbits immunized in Example 6. The data are expressed as the average per group. The standard deviations for each group are represented by positive error bars. Statistically significant differences are represented by an asterisk (ANOVA and a Bonferroni multiple comparisons test (p ⁇ 0.05).
  • Figure 8 Response of P0 (A) anti-peptide IgG antibodies and larval, nymph and adult survival of R. sanguineus (B) corresponding to rabbits immunized with the variants of this peptide fused to different immunopotentiating molecules. Standard deviations are represented by positive error bars.
  • Figure 9 Western blotting analysis of the expression pattern of the chimeric protein Bm86-pP0 in the rupture precipitate of P. pastoris strain MP36, using hyperimmune sera generated against the pPO peptide (A) and against the Bm86 protein (B ). For both cases, line 1. Rupture precipitate under reducing conditions, 2. Rupture precipitate under non-reducing conditions, 3. Deglycosylated protein by digestion with the enzyme PNGase F.
  • Figure 10 Response of anti-P0 and anti-Bm86 peptide IgG antibodies, detected by ELISA in the serum of bovines immunized with these antigens individually, in combination or with the chimeric protein Bm86-pP0.
  • the data are expressed as the reciprocal of the average antibody titer, determined as the last serum dilution with an average OD greater than three times the average OD of the negative control group. Standard deviations are represented by positive error bars. No antibody titers were detected for any of the groups at the start of the assay.
  • FIG. 11 Average weight of teleogins and R. microplus bird fed in bovine immunized in Example 8.
  • the graph shows the statistically significant differences between the experimental groups and each one with respect to the group negative control by different letters (ANOVA and Newman-Keuls multiple comparisons test [p ⁇ 0.05]).
  • Figure 12 Response of anti-pPOI IgG antibodies detected by ELISA in the serum of rabbits immunized with this antigen and subsequently challenged with /. scapularis The data are expressed as the reciprocal of the average antibody titer, determined as the last serum dilution with an average OD greater than three times the average OD of the negative control group. Standard deviations are represented by positive error bars. No antibody titers were detected for any of the groups on day zero of the assay.
  • Figure 13 Behavior of the biological parameters of /. scapuláris in rabbits immunized with the pPOIs-KLH conjugate.
  • the viability of the larvae and the recovery of nymphs and adults (A) and the percentage of hatching of the birds (B) are represented. Data are expressed as the average per group. Standard deviations are represented by positive error bars. The graph shows with an asterisk the statistically significant differences existing with respect to the negative control group (ANOVA and Bonferroni multiple comparisons test [p ⁇ 0.05]).
  • the present invention demonstrates the protective capacity of a vaccine formulation, which contains a peptide comprised between amino acids 267 and 301 of the ribosomal protein P0 of different ectoparasites, against the ticks R. microplus, R. sanguineus e /. scapuláris, and the ectoparasites known as sea lice L salmonis and C. rogercresseyi, without the occurrence of cross reactions with the protein of the host organism.
  • pPO was administered conjugated or fused to an immunopotentiating molecule to improve the immune response of the animals.
  • this peptide (or fragments thereof) fused to the Bm86 protein or combined with it induces a greater degree of impairment of the viability, and of the biological parameters of these arthropods, than that caused by said antigens when they are used individually. Therefore, the application of this chimeric protein or the combination of them as part of an integrated control program, could result in greater control of infestations by these or other tick species, as well as in the decrease in the incidence of diseases hemoparasitic transmitted by them. In the case of sea lice, their greatest involvement was observed when the pPOCr was fused to promiscuous T epitopes and my32 protein.
  • Example 1 Amplification and cloning of the nucleotide sequences encoding the ribosomal protein P0 of R. microplus, R. sanguineus and C. rogercresseyi.
  • Complementary DNAs were obtained by reverse-transcription reactions from total RNA larvae of R. microplus and R. sanguineus and adults of C. rogercressey. The reactions were carried out following the instructions described in the "Reverse Transcription System” kit (Promega, USA # A3500). From the complementary DNAs obtained, the nucleotide sequences encoding the ribosomal protein P0 of R. microplus and R. sanguineus (SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2) were amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR). ) and the sequence of the P0 of C. rogercresseyi.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • Synthetic oligonucleotides designed from the nucleotide sequence reported in the Genebank gene bank, for Haemaphysalis longicornis P0 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/), were used as primers for tick PCRs. Under accession number EU048401:
  • Degenerative synthetic oligonucleotides designed from the nucleotide sequences reported in the Genebank gene bank for P0 of different tick species were used as primers for amplification from C. rogercresseyi cDNA.
  • insects Drosophila melanogaster, Culex quinquefasciatus and / Aedes aegypti:
  • This sequence also presented an identity of 96% with the polypeptide sequence deduced from a partial reading frame included within TC533 of the Amblyoma variegatum database, and 99% with those deduced from two open reading frames , contained in TC1424 and TC9038, of the EST databases of R. appendiculatus and R. microplus, respectively (http://compbio.dfci.harvard.edu/index.html).
  • the polypeptide sequence corresponding to the P0 protein of R. sanguineus and R. microplus designated as SEQ ID NO. 3 also has a 70% sequence identity with bovine P0 (Bos taurus, Genebank accession number AAX09097), being 87% for the last 16 amino acids that make up the C-terminal region, described as the most immunogenic zone within of protein.
  • This sequence also has a sequence identity of 71% with the dog P0 protein ⁇ Canis familiaris, Genebank accession number XM535894).
  • the amino acid sequence of the P0 deduced from the complementary DNA sequence of C. rogercresseyi a high percentage of identity was observed with the sequences reported for other species of sea lice, such as C. clemensi and L. salmonis
  • there was a high sequence identity between the P0 of the lice of sea with respect to the PO of Salmo salar (Genebank accession number ACI70184).
  • the region of the PO protein of both tick species that shows less sequence similarity with mammalian PO proteins is between amino acids 267 and 301 (SEQ ID NO.4).
  • SEQ ID NO.4 The region of the PO protein of both tick species that shows less sequence similarity with mammalian PO proteins.
  • Peptides defined as SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 9 and SEQ ID NO.10, and 20 amino acid fragments of said peptides were obtained by chemical synthesis and purified by reverse phase chromatography using an HPLC system (Reverse Phase-High Pressure Liquid Chromatograph). 15 milligrams of each synthetic peptide was obtained, with a purity of 99.3%. The molecular mass of each was verified by mass spectrometry. In order to enhance the immunogenic abilities of the peptides, they were fused to the KLH protein. The conjugations of the synthetic peptides with KLH were performed by the soluble carbodiimide method. The binding of these was performed using succinic anhydride as a spacing agent. Conjugate separation was performed by gel filtration chromatography. The final concentration of each conjugate was estimated by the bicinconinic acid method.
  • Example 4 Obtaining mouse hyperimmune serum against the ribosomal protein P0 peptide of R. microplus and R. sanguineus (pPO).
  • mice Six male Balb / c mice, 6 weeks old, with body masses between 18 and 22 g were used, which were immunized subcutaneously on days 0, 14, 21 and 28 with 250 pg of the pPO-conjugate.
  • KLH Equivalent to 125 pg of the peptide and 125 pg of KLH
  • Blood extractions were performed on days 0, 7, 14, 21, 40 and 65.
  • the animals were bled at 65 days and the sera were obtained by centrifugation for 10 minutes at 3500 rpm.
  • the kinetics of antibodies were monitored by an indirect ELISA.
  • Immunized animals showed specific antibody titers against the peptide from day 14 of the experiment, which became 1: 10240 for two of the animals on day 65 ( Figure 2).
  • a mixture containing the same amount of hyperimmune sera obtained from the six mice immunized with the pPO-KLH conjugate was used as a polyclonal antibody in "in vitro" cross-reactivity and expression assays.
  • Example 5 Expression of the ribosomal PO protein from Rhipicephalus ticks in the RK-13 cell line and "in vitro" cross-reactivity assay.
  • the DNA sequence encoding the R. sanguineus ribosomal PO protein was cloned into pAdTrack-CMV plasmid (9.2 kb), under the control of the immediate / early human cytomegalovirus promoter / enhancer (pCMVITh) and the late termination / polyadenylation signal of SV40 simian vesicular virus.
  • This vector contains in its sequence the reporter gene that codes for the green fluorescent protein (in English: Green Fluorescent Protein, abbreviated GFP) and the gene that confers kanamycin resistance (He TC ef al .; Proc Nati Acad Sci US A. 1998 , 95: 2509-2514).
  • the resulting plasmid was used to transfect the RK-13 rabbit kidney cell line. Transfection was performed using lipofectamine (Invitrogen, United States), according to the manufacturer's instructions. The efficiency of the transfection was checked after 24 hours, by observing the expression of the GFP under the optical microscope, using ultraviolet light and a magnification of 40X.
  • the expression pattern of Rhipicephalus tick ribosomal protein P0 was analyzed by Western blotting, using as a primary antibody the polyclonal serum against the peptide obtained in mice (diluted 1: 3000) and as a secondary antibody a peroxidase-conjugated mouse anti-lgG in dilution 1: 10000 ( Figure 3).
  • a primary antibody the polyclonal serum against the peptide obtained in mice (diluted 1: 3000) and as a secondary antibody a peroxidase-conjugated mouse anti-lgG in dilution 1: 10000
  • Figure 3 The expression pattern of Rhipicephalus tick ribosomal protein P0 was analyzed by Western blotting, using as a primary antibody the polyclonal serum against the peptide obtained in mice (diluted 1: 3000) and as a secondary antibody a peroxidase-conjugated mouse anti-lgG in dilution 1: 10000 ( Figure 3).
  • a single band was detected
  • Example 6 Determination of the immunogenicity of the phip peptide of Rhipicephalus ticks and their protective capacity against infestations with the R. sanguineus tick.
  • the utility of the ribosomal P0 protein peptide of R. microplus and R. sanguineus as a vaccine antigen against the R. sanguineus tick was evaluated.
  • 20 white New Zealand rabbits, male, between 12 and 14 weeks of age and body mass over 2.5 kg were randomly distributed in three experimental groups of seven rabbits for the pPO-KLH and Bm86 and 6 rabbits for the negative control group immunized with KLH.
  • the immunogens, contained in PBS1X were adjuvated in Montanide 888 VG (10% prepared in mineral oil) in a 60/40 ratio of immunogen / adjuvant.
  • the experimental groups were distributed as follows:
  • Group 1 Immunization by subcutaneous route with the pPO-KLH conjugate in doses of 500 pg / animal (equivalent to 250 pg peptide / animal) on days 0, 21, 36 and 60.
  • Group 2 Immunization by subcutaneous route with KLH in doses of 250 pg / animal on days 0, 21, 36 and 60.
  • Group 3 Immunization by subcutaneous route with the Bm86 protein of R. microplus in doses of 100 pg / animal on days 0 and 28.
  • the trial lasted 120 days. Serum samples were taken from the animals to measure the antibody response on days 0, 14, 21, 28, 36, 59, 73 and 87. Their general behavior and body temperature were observed daily throughout the test. . Three chambers were placed per animal on day 72 of the experiment and each animal was infested on day 73 with approximately 250 larvae, 100 nymphs and 50 neoginas (20 males and 30 females) of R. sanguineus. The collection, counting, weighing and analysis of the change of ticks was carried out between days 75 and 120. The larvae and nymphs collected were kept in an incubator at 28 ° C, with 80% relative humidity and a photoperiod of 12: 12 h (light: dark). The engulfed female teleoginas are they kept in individual plastic plates immobilized until oviposition under the same conditions.
  • the humoral response generated against each of the immunogens was studied by indirect ELISA similar to that described above, coating the plates with 1 ⁇ g per well of each antigen and using in this case a rabbit anti-peroxide conjugated rabbit anti-IgG antibody (SIGMA) in dilution 1: 10000.
  • SIGMA rabbit anti-peroxide conjugated rabbit anti-IgG antibody
  • the mean antibody titers were determined from the individual values in each group. Specific titers against Bm86 were only obtained in group 3 animals immunized with Bm 86.
  • the larvae, nymphs and neogins of the group immunized with Bm86 took longer to feed than the same stages on the control animals and vaccinated with the P0 peptide.
  • the larval, nymph and neogin recovery values between the three groups were compared using an ANOVA and the Bonferroni multiple comparisons test (p ⁇ 0.01).
  • survival or viability was analyzed as the final amount of the next stage that was able to infest virgin animals with respect to the amount of larvae and molted nymphs.
  • survival was measured as the final number of ticks capable of surviving after incubation and capable of ovipositing.
  • Example 7 Determination of the immunogenicity of R. microplus and R. blood pPOs fused to different immunopotentiating molecules.
  • RHDV VP60 capsid protein (strain AST / 89) has been obtained with high levels of expression in the Pichi ' a pastoris yeast rupture supernatant.
  • This recombinant protein obtained forms high molecular weight multimers with antigenic and structural characteristics similar to the native viral particle (Farnós O. et al .; Antiv. Res. 2009, 81: 25-36).
  • VLPs virus-like particles
  • nucleotide sequence that codes for the 20 aa fragment from position 15 to 35 of SEQ ID No.4 of said peptide (AAGGGAAAAKPEESKKEEAK) was inserted into plasmid pNAOVP60, at the position of the protuberant domain of the gene of VP60 protein.
  • This construction allows the pPO to express itself fused to the C-terminal end of the VP60, a region that is exposed to the outside after the assembly of the VLPs.
  • the recombinant plasmid obtained was used to transform P. pastoris strain MP36.
  • the VP60pP0 protein was obtained soluble in the rupture supernatant at levels of 350 mg / L.
  • VLPs The exposure of the C-terminal region and the formation of VLPs were verified by a sandwich ELISA using an anti-RHDV hyperimmune serum and the 6H6 and 1 H8 monoclonal antibodies (kindly donated by Dr. Lorenzo Capucci of the Sopimentale della Lombardia Zooprophylactic Institute, Brescia, Italy), which recognize epitopes present in the C-terminal region of the VP60 protein and in correctly assembled viral particles or VLPs, respectively (Capucci L. er a / .; Virus. Res. 1995, 37: 221-238) .
  • the VP60pP0 VLPs were purified by HPLC on a TSK-G3000PW column, obtained with an approximate purity of 50%.
  • the other recombinant construct was performed with the same peptide from 20 a. to. of P0 coupled to several promiscuous T cell epitopes. Specifically, ttP2 epitopes of the tetanus toxoid and the T-cell epitope of measles virus (TT-MVF) were used. Several copies of the DNA sequence of the 20 aa pPO (AAGGGAAAAKPEESKKEEAK) and promiscuous T antigens fused to the Saccharomyces cerevisiae intein were inserted into the plasmid pTBY 12 under the control of the T7 promoter and the lac operon repressor that allows the fusion protein expression only after induction with IPTG.
  • the recombinant plasmid obtained was used to transform the ER2566 strain of E coli.
  • the chimeric peptide TT-MVF-pP0-intein was detected in the rupture supernatant of this strain by the murine polyclonal serum anti-pPO. Expression levels were estimated at approximately 100 mg / L of culture.
  • the peptide was purified by affinity to a chitin column and self-digested in the presence of thiol groups to release the peptide of interest.
  • Group 1 Immunization by subcutaneous route with the pPO-KLH conjugate in doses of 500 pg / animal (equivalent to 250 pg peptide / animal).
  • Group 2 Immunization by subcutaneous route with KLH in doses of 250 pg / animal.
  • Group 3 Immunization by subcutaneous route with VLPsVP60pP0 in doses equivalent to 250 pg of protein / animal.
  • Group 4 Immunization by subcutaneous route with the chimeric peptide TT-MVF-pP0, in a dose equivalent to 250 pg of peptide / animal.
  • the trial lasted for 90 days. Animals were immunized on days 0, 21 and 36. Extractions of sera, determination of antibody titers, and tick infestation and collection, were performed in a manner similar to that described in Example 6.
  • tick recovery and viability values were subjected to an analysis of variance (ANOVA) and a Bonferroni multiple comparisons test.
  • ANOVA analysis of variance
  • the highest titers of anti-P0 peptide antibodies were detected in animals vaccinated with the VLPsVP60pP0 chimera from day 14 post-immunization. These antibodies reached titres higher than: 5000 for the chimeric variant VLPsVP60pP0 from day 21, and from day 28 for animals immunized with the TT-MVF-pPO chimera. Titles were maintained until the end of the experiment (Figure 8 A).
  • Example 8 Determination of the protective capacity of the chimeric protein Bm86-pP0 with respect to that of pPO, against infestations with the R. microplus tick.
  • the Bm86 antigen of the R. microplus tick was previously expressed in P. pastor ⁇ s strain MP36 (Valle MR et al., J. Biotech. 1994, 33: 135-146). In that construction, the fragments of the gene corresponding to the signal peptide and the transmembrane region of the protein (SEQ ID NO. 5) were removed.
  • the nucleotide sequence of the Bm86 protein described above was inserted, following the secretion signal of sucrose invertase from S. cerevisiae (ssUCZ) in plasmid pPS10 under the control of the AOX promoter 1.
  • the DNA sequence encoding the 35 amino acid peptide of the ribosomal protein P0 of R. microplus was fused to this sequence of Bm86.
  • the MP36 strain of P. pastor ⁇ s was transformed with the resulting plasmid and the transformants were selected by reversing the histidine amino acid auxotrophy.
  • the obtained clones were induced with methanol after reaching an OD between 3 and 4 in the cell culture.
  • the expression analysis was performed by Western blotting, using an anti-pPO murine hyperimmune serum (referred to in Example 4) and by a polyclonal anti-Bm86 antibody ( Figure 9A and 9B).
  • the recombinant protein was detected in the cell break precipitate at levels of 300 mg / L.
  • Group 1 Immunization by intramuscular route with the pPO-KLH conjugate in doses of 500 pg of conjugate / animal (equivalent to 250 pg of peptide / animal) with the scheme of 0, 4 and 7 weeks.
  • Group 2 Immunization by intramuscular route with KLH in doses of 250 pg / animal with the scheme of 0, 4 and 7 weeks.
  • Group 3 Immunization by intramuscular route with the Bm86 protein of R. microplus in doses of 250 pg / animal with the scheme of 0, 4 and 7 weeks.
  • Group 4 Immunization by intramuscular route with the chimeric protein Bm86-pP0 in doses of 250 pg / animal with the scheme of 0, 4 and 7 weeks.
  • Group 5 Immunization by intramuscular route with the Bm86 protein and the pPO-KLH conjugate in doses of 250 pg of Bm86 / animal and 500 pg of the conjugate / animal with the scheme of 0, 4 and 7 weeks.
  • the trial lasted a total of 140 days. Serum samples were taken from the animals to measure the antibody response on days 0, 14, 28, 49, 70, 82, 120 and 140. Four chambers were placed per animal on day 82 of the experiment and infested with 3000 larvae per chamber (12,000 larvae per animal) of R. microplus at 4000 daily larvae between days 84 and 86. Tick collection, counting and weighing was performed between days 107 and 117. The engulfed female teleoginas were maintained. in individual plastic plates at 28 ° C, 90% relative humidity and with a photoperiod of 12 hours of light.
  • the kinetics of anti-pPO and anti-Bm86 antibodies were studied by ELISA, using in this case an anti-bovine peroxidase conjugate (SIGMA) in dilution 1: 10000.
  • SIGMA anti-bovine peroxidase conjugate
  • a response of specific IgG antibodies against Bm86 and against pPO was detected from day 14, in all animals immunized with these antigens.
  • These antibodies reached titers greater than 1: 5000 after day 28 for Bm86 and between days 60 and 90 for the case of the P0 peptide, which were maintained until the end of the experiment.
  • Example 9 Determination of the protective capacity of the Ixodes scapularis PO protein peptide (pPOIs) against tick infestations. scapularis
  • the immunogenic capacity of the peptide comprised between amino acids 267-302 of the ribosomal protein P0 of / was evaluated.
  • scapularis homologous to the immunogenic peptide of the P0 proteins of R. microplus and R. sanguineus. These peptides have a sequence identity between them of 68%.
  • the chemical synthesis of the peptide of /. scapularis and conjugation to hemocyanin KLH was performed in a manner similar to that described in Example 3. Subsequently, 12 white New Zealand rabbits, males, were randomized into two experimental groups of six rabbits each, which were immunized and challenged with larvae, nymphs and neoginas of /. scapularis
  • the immunogens were adjuvated in Montanide 888 VG in a 60/40 ratio of immunogen / adjuvant and applied as follows:
  • Group 1 Immunization by subcutaneous route with the pP0ls-KLH conjugate in doses of 500 pg / animal (equivalent to 250 pg peptide / animal).
  • Group 2 Immunization by subcutaneous route with KLH in doses of 250 pg / animal.
  • Anti-pPOI antibody titers were detected in animals immunized with the pP0ls-KLH conjugate from day 14 post-immunization. These antibodies reached titers greater than 1: 3500 on day 36, which were maintained until the end of the experiment ( Figure 12).
  • Example 10 Determination of the protective capacity of the L. salmonis pPO (pPOLs).
  • 80 salmon with an average weight of 80 g were distributed in 4 groups of 20 fish each.
  • Two groups were injected intraperitoneally (ip) with the POLs-KLH conjugate, at a dose of 10 ⁇ g of the conjugate / g body weight of salmon (equivalent to 5 ⁇ g of pP0Ls / g of salmon weight), formulated in the oily adjuvant Montanide 888.
  • the other two groups were negative controls immunized with 5 ⁇ g of KLH / g body weight, adjuvant in Montanide 888.
  • the salmon After 500 arbitrary thermal units, the salmon adapted to seawater and were infested with 2000 ⁇ 200 copepoditos per pond.
  • the challenge was carried out under conditions of darkness, constant aeration, support oxygenation, temperature control (15-17 ° C) and salinity (approx. 30 ppm).
  • temperature control 15-17 ° C
  • salinity approximately 15 ppm
  • the flow of water in the ponds was kept closed and manual replacement was carried out every 48 hours. in addition to that 220 ⁇ sieves were installed in the drain pipes.
  • the time of inclusion of the copepodites was defined as day 0. These conditions were maintained for 40 days from the start of the challenge.
  • EYLADPSKFASVAAAPAAGA were conjugated to KLH. Although all peptides conferred protection, the best results were obtained with the peptide corresponding to the last 20 amino acids of pPOLs.
  • Example 11 Determination of the protective capacity of the C. rogercresseyi P0 protein peptide (pPOCr) fused to promiscuous T epitopes and the pPOCr-KLH conjugate.
  • the immunogenic capacity of the pPOCr-KLH conjugate and of the pPOCr fused to other immunopotentiating molecules such as promiscuous T epitopes was evaluated.
  • the ttP2 epitopes of the toxoid were also used Tetanus and the T-cell epitope of measles virus (TT-MVF).
  • TT-MVF measles virus
  • pastor ⁇ s strain MP36 transformed with a plasmid containing a copy of the coding sequence for the fused pPOCr at its N-terminal end at two copies of the Promiscuous T epitopes under the control of the alcohol oxidase 1 promoter (AOX 1), all preceded by the secretion signal of sucrose invertase from S. cerevisiae (ssUC2). Expression levels were estimated at approximately 150 mg / L of culture.
  • this polypeptide obtained recombinantly, as a vaccine antigen was evaluated and compared with the effects of the pPOCr-KLH conjugate.
  • 120 salmon with an average weight of 80 g were distributed in 6 groups, of 20 fish each.
  • the experimental groups were:
  • Groups 1 and 2 They were injected via i.p. with the pPOCr-KLH conjugate, at a dose of 10 ⁇ g / g body weight (equivalent to 5 ⁇ g of pPOCr / g weight).
  • Groups 3 and 4 They were injected via i.p. with KLH, at a dose of 5 ⁇ g / g of weight.
  • Groups 5 v 6 They were injected via i.p. with the chimeric protein TT-MVF-pP0Cr, at a dose of 5 ⁇ g / g in weight.
  • the immunogen was formulated in the oily adjuvant Montanide 888.
  • the experimental procedure was similar to that of Example 10, only in this case as the sea rooster C. rogercresseyi has a shorter life cycle, at 24 days (after completing two life cycles of the parasite) the fish were eliminated, by an anesthetic overdose, and the results were evaluated by means of the parasite count.
  • the following table shows the results that showed a significant decrease in the number of parasites per fish in the groups vaccinated with pPOCr-KLH and TT-MVF-pP0Cr, compared to the negative controls vaccinated only with KLH. The highest protection, evaluated as the number of parasites / fish, was observed in the TT-MVF-pP0Cr group.
  • Table 4 Results of the parasite count at the conclusion of the challenge experiment.
  • Example 12 Determination of the immunogenicity of pPOCr fused to the my32 polypeptide.
  • the chimeric peptide my32-pP0Cr was generated, using the same procedure described in the previous examples for all fusion proteins.
  • the plasmid with which P. pastoris strain MP36 was transformed contained a copy of the pPOCr fused by its N-terminal end to a copy of my32, under the control of the AOX 1 promoter, preceded by the secretion signal ssSUC2.
  • the chimeric my32-pP0Cr peptide was detected in the culture supernatant at a concentration of approximately 135 mg / L of culture.
  • Groups 1 v 2 They were injected with the pPOCr-KLH conjugate at a dose of 10 ⁇ g g body weight (equivalent to 5 g POCr / g weight).
  • Groups 3 v 4 They were injected with KLH at a dose of 5 ⁇ g / g body weight.
  • Groups 5 v 6 They were injected with the chimeric protein my32-pP0Cr, at a dose of 5 g / g weight.
  • Groups 7 v 8 They were injected with the my32 protein, obtained recombinantly, at a dose of 5 ⁇ g g. All animals received the immunogen via ip and adjuvant in Montanide 888. The experimental procedure followed was the same as in Example 11. Table 5 shows the results of sampling at 24 days post-challenge, which show a significant decrease in number of parasites per fish in the groups vaccinated with pPOCr-KLH, my32-pP0Cr and my32, compared to animals inoculated only with KLH. The highest protection, evaluated as the number of parasites / fish, was observed in the my32-pP ⁇ Cr group.

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Abstract

La presente invención se relaciona con el uso de un péptido de la proteína ribosomal PO en la fabricación de una composición vacunal para el control de las infestaciones por ectoparásitos y, por consiguiente, de la transmisión de sus patógenos asociados. Dicho péptido se localiza entre los aminoácidos 267 y 301 de la proteína PO, y puede ser obtenido por vía recombinante o mediante síntesis química. Dicho péptido puede ser fusionado a una proteína o péptido portador, o a un inmunopotenciador y ser incluido en una formulación oleosa. Las formulaciones vacunales que comprenden dicho péptido confieren protección contra las garrapatas y los ectoparásitos conocidos como "piojos de mar", sin que ocurra generación de autoinmunidad en el organismo hospedante. Entre dichas garrapatas se pueden mencionar las especies Rhipicephalus microplus, Rhipicephalus sanguineus e Ixodes scapularis, y entre los piojos de mar se encuentran aquellos de los géneros Caligus y Lepeophtheirus.

Description

COMPOSICION VACUNAL PARA EL CONTROL DE LAS INFESTACIONES
POR ECTOPARÁSITOS
Campo de la técnica
La presente invención se encuadra dentro del campo de la medicina veterinaria, en particular con el control de las infestaciones por ectoparásitos y de la transmisión de sus patógenos asociados. Dicho control se logra mediante el uso de un péptido de la proteína ribosomal P0 en la fabricación de composiciones vacunales. Las formulaciones vacunales que comprenden dicho péptido confieren protección sin que ocurra generación de autoinmunidad en el organismo hospedante.
Estado de la técnica anterior
Los ectoparásitos hematófagos terrestres tales como mosquitos, pulgas y garrapatas constituyen vectores para la transmisión de agentes infecciosos causantes de enfermedades. Algunas de estas enfermedades afectan directamente al ser humano y/o a sus animales afectivos, mientras que otras son causantes de grandes pérdidas económicas en la esfera agropecuaria. Ejemplos de enfermedades que son transmitidas por ectoparásitos lo constituyen la malaria, la leishmaniasis, el dengue, la erliquiosis y la enfermedad de Lyme. Las garrapatas son consideradas los segundos transmisores de enfermedades a los humanos, luego de los mosquitos (Parola P. y Raoult D.; Clin. Microbiol. Infect. 2001 , 7: 80- 83). Las infecciones hemoparasitarias transmitidas por garrapatas causan pérdidas anuales en el orden de billones de dólares estadounidenses dentro de la industria ganadera, afectando fundamentalmente la producción bovina en las áreas tropicales y subtropicales. Dentro de las enfermedades de mayor relevancia en este sentido se encuentran la anaplasmosis, la babesiosis, la Enfermedad de Lyme (producida por Borrelia burdogferi) y la llamada Fiebre de la Costa Este (producida por Theilería parva).
Los ectoparásitos conocidos como piojos de mar (Copepoda, Caligidae) constituyen el patógeno marino más expandido en los últimos 30 años en la industria salmonera, extendiéndose en los últimos 15 años a otras especies de peces en cultivo y a las poblaciones salvajes de salmónidos (Pike, A.W. y Wadsworth, S.L. Advances in Parasitology 2000, 44:233-337, Ragias, V. et al. Aquaculture 2004, 242: 727-733). Las mayores pérdidas económicas son ocasionadas por los organismos de los géneros Caligus y Lepeophtheirus. Los llamados piojos de mar pueden causar cambios fisiológicos en sus huéspedes, que incluyen el desarrollo de una respuesta de stress, la reducción de las funciones inmunes, fallo en la osmorregulación y la muerte, si no se trata la infección (Johnson, S.C., et al. Zool Studies 2004, 43: 8-19). Existen además algunas evidencias que sugieren que los piojos de mar podrían constituir vectores para la transmisión de infecciones producidas por virus y bacterias a los peces (Barker, E.D., er a/. Parasitology Research 2009, 105: 1173-1177).
Una amplia variedad de agentes químicos y fármacos han sido utilizados para controlar las infestaciones producidas por garrapatas y piojos de mar. El uso de pesticidas químicos como amidinas, organofosforados, el peróxido de hidrógeno y otros constituye en la actualidad la medida fundamental para el control de estos ectoparásitos. No obstante, el uso intensivo de estos tiene como inconvenientes la contaminación de los alimentos (peces, carne y leche) con residuos químicos, la afectación medioambiental y el desarrollo de resistencia por parte de los ectoparásitos (Shahein Y. E. Vet. Immunol. and Immunopathol. 2008, 121 : 281- 289, Denholm, I. Pest Manag Sci 2002, 58: 528-536; Bravo, S. et al. Aquaculture 2008, 282: 7-12; Lees et al. J. Fish Dis. 2008, 31 : 947-951).
La vacunación se considera una alternativa promisoria para el control de las infestaciones por ectoparásitos desde el punto de vista de su eficacia, seguridad ambiental y sostenibilidad económica. La factibilidad del uso de antígenos producidos por técnicas de ácido dexosirribonucleico (ADN) recombinante con este propósito se ha demostrado con las vacunas comerciales contra la garrapata Rhipicephalus microplus, basadas en la proteína Bm86 recombinante (TickGARD, de Hoechst Animal Health, Australia; y GAVAC, comercializada por Heber Biotec, Cuba). Ésta última ha resultado efectiva en estudios de campo cuando su aplicación se encuentra incluida dentro de un programa de control integrado. En el caso del piojo de mar existen algunos avances en el uso de proteínas como candidatos vacunales, como es el caso akirin-2 de Caligus rogercresseyi, al que se denominó my32, y la realización de ensayos de reto con resultados promisorios (Solicitud de Patente WO2008/145074 "Secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos, y vacuna para el control de infestaciones por ectoparásitos en peces"). La identificación de nuevos antígenos protectivos constituye la etapa limitante para incrementar la eficacia de estas vacunas. Aunque nuevas proteínas de garrapatas se han identificado recientemente, y se han propuesto como posibles moléculas protectivas, solo un número limitado de ellas se han evaluado como antígenos producidos por vía recombinante en ensayos de vacunación. En el caso de los piojos de mar, que son ectoparásitos que se alimentan del mucus, la piel y la sangre del huésped y, por tanto, tienen sólo un contacto limitado con el sistema inmune del mismo (Boxaspen, K. ICES Journal of Marine Science 2006, 63: 1304- 1316), se han investigado, como candidatos vacunales, proteínas inmunomoduladoras del parásito que suprimen la respuesta inmune del huésped en el sitio de adhesión y alimentación (Wikel, S. K. et al., "Arthropod modulation of host immune responses". En: The Immunology of Host-Ectoparasitic Arthropod Relationships. Editors: Wikel, S. K., CAB Int., 1996, pp. 107-130). También se han estudiado otras moléculas semejantes a la vitelogenina y proteínas de adhesión al huésped (Johnson, S.C. et al. Zool Studies 2004, 43: 8-19; Boxaspen, K. ICES Journal of Marine Science 2006, 63: 1304-1316), pero debido al poco conocimiento de los mecanismos y la patología de la infestación de los salmones por el piojo de mar, la identificación de blancos para la prevención y el tratamiento de esta infestación no han sido exitosos. De todas formas, los resultados de las investigaciones realizadas en la evaluación de diferentes candidatos vacunales en ensayos de inmunización han demostrado que el uso combinado de varias moléculas, involucradas en diferentes procesos fisiológicos, constituye un método factible para controlar las infestaciones por ectoparásitos.
Los ribosomas eucarióticos están conformados por moléculas individuales de ácido ribonucleico ribosomal (ARNr) y más de 80 proteínas organizadas dentro de las subunidades mayor y menor. La mayoría de las proteínas ribosomales son básicas (punto isoeléctrico (pl)>8,5), pero existe además un grupo de proteínas ácidas (pl=3, 0-5,0) que forman una estructura similar a un tallo en la subunidad mayor del ribosoma. Estas proteínas ácidas se denominan proteínas P (P0, P1 y P2), debido a su capacidad de ser fosforiladas, lo cual desempeña un rol fundamental en la regulación de la actividad traduccional de los ribosomas (Wojda I. et al. Acta Bioch. Pol. 2002, 49: 947-957). Las proteínas P contienen una región C-terminal conservada, de aproximadamente 17 aminoácidos, cuyos últimos seis residuos se encuentran altamente conservados, lo cual constituye la base de la reactividad ¡nmunológica cruzada entre ellas y con las proteínas P de otras especies. La proteína P0 es fundamental para el ensamblaje de la subunidad ribosomal 60S, donde se une directamente a P1 , P2, al ARNr 28S y al factor eEF2. Su ausencia conduce a la generación de ribosomas deficientes de la subunidad 60S, los cuales son inactivos para la síntesis de proteínas, conllevando a la muerte celular.
Las proteínas P son altamente ¡nmunogénicas, y se han estudiado extensamente en humanos, debido a su asociación con enfermedades autoinmunes y con la carcinogénesis. Estas aplicaciones de las proteínas ribosomales se han protegido mediante patentes por sus respectivos autores. La proteína ribosomal P0, en particular, constituye un candidato vacunal prometedor contra varios protozoos y bacterias. La misma resultó inmunogénica como antígeno recombinante (ya sea empleando la proteína completa o la región C-terminal consistente en los últimos 11-16 aminoácidos) o mediante la inmunización con ADN desnudo, contra Toxoplasma gondii, Neospora caninum (Zhang H. ef al. Mol. Biochem. Parasitol 2007, 153: 141-148), Trypanosoma cruzi (Skeiky Y. A. et al. J. Immunol. 1993, 151 : 5504-5515), Leishmania infantum (Iborra S. et al.; Infect. Immunol. 2003, 71 : 6562- 6572 y 2005, 72: 5515-5521) y varias especies de Babesia (Terkawi M. A. et al.; Vaccine 2007, 25: 2027-2035; Terkawi M. A. et al. Parasitol. Res. 2007, 102: 35- 40) y Plasmodium (Chatterjee S. et al. Infect. Immunol. 2000, 68: 4312-4318; Rajeshwari K. et al. Infect. Immunol. 2004, 72: 5515-5521). La respuesta inmune obtenida en la mayoría de estos experimentos se caracterizó por la generación de altos títulos de anticuerpos específicos, capaces de conferir protección de manera activa y pasiva contra la infección, la activación de linfocitos T y la producción de interferón gamma (IFNy) como parte de un patrón de respuesta del tipo Th1.
Su uso como inmunógeno contra varias bacterias y protozoos, sin el reporte de reacciones de naturaleza autoinmune en el hospedero se debió a la relativamente baja identidad de secuencia aminoacídica de esta proteína entre estos microorganismos y los mamíferos. El caso más llamativo lo constituyó la inmunización de ratones con un péptido consistente en los últimos 16 aminoácidos de la proteína ribosomal P0 de Plasmodium falciparum (Rajeshwari K. ef al.; Infect. Immunol. 2004, 72: 5515-5521), el cual presenta una identidad del 68% con la región C-terminal de esta misma proteína en ratones. Sin embargo, el uso de esta proteína, o de la región C-terminal de la misma, como inmunógeno para el control de las infestaciones por garrapatas y piojos de mar se encuentra limitado por el alto grado de identidad aminoacídica existente para este antígeno entre los ectoparásitos y sus organismos hospederos.
Experimentos realizados recientemente con ARN de interferencia específico para el silenciamiento de la expresión de esta proteína en la garrapata Haemaphysalis longicornis mostraron una disminución considerable en la ganancia de peso de las garrapatas, y una mortalidad del 96%, provocada por afectaciones estructurales a nivel de glándula salival y cutícula; lo cual sugiere que la proteína ribosomal P0 es necesaria para la ingestión de sangre y la viabilidad de las garrapatas y, posiblemente, de otros ectoparásitos (Gong H. er a/. Vet. Parasitol. 2008, 151 : 268- 278). No obstante, el desarrollo de un candidato vacunal basado en este antígeno tiene como inconvenientes el alto grado de identidad existente entre las secuencias reportadas de vertebrados y ectoparásitos como garrapatas y piojos de mar, la cual es superior en la región C-terminal de la proteína, lo que puede traer como consecuencia la inducción de tolerancia o la generación de una respuesta de autoanticuerpos en el organismo hospedante.
El uso intensivo de agentes químicos y fármacos para controlar las infestaciones producidas por garrapatas y piojos de mar tiene como inconvenientes la contaminación de los alimentos con residuos químicos, la afectación medioambiental y el desarrollo de resistencia por parte de los ectoparásitos. Por ello, la vacunación se considera una alternativa promisoria y existe la necesidad de identificar nuevos antígenos vacunales que sean capaces de conferir protección por sí solos o puedan ser incorporados a las vacunas existentes.
Explicación de la invención
La presente invención resuelve el problema antes mencionado al proveer una composición vacunal para el control de las infestaciones por ectoparásitos que comprende un péptido de la proteína ribosomal P0 de dichos ectoparásitos. Dicha composición comprende, como antígeno, una región inmunogénica de la proteína ribosomal P0 que es poco conservada entre los ectoparásitos y los organismos afectados por los mismos, según los resultados de un estudio que se revela en esta invención, por primera vez. La región identificada dentro de la proteína ribosomal P0 está comprendida entre los aminoácidos 267 y 301 de la misma. La presencia de la proteína P0 en todos los organismos, como un componente estructural de los ribosomas que es fundamental para la viabilidad celular, constituye una ventaja para el uso de estas secuencias con el objetivo de obtener candidatos vacunales contra diferentes especies de ectoparásitos. Sin embargo, el uso de esta proteína, o de la región C-terminal de la misma, como inmunógeno para el control de las infestaciones por garrapatas y piojos de mar se encuentra limitado por el alto grado de identidad aminoacídica existente para este antígeno entre los ectoparásitos y sus organismos hospederos.
En esta invención se logra evadir esta situación, por primera vez, al identificar regiones altamente inmunogénicas dentro de la proteína, que coinciden con zonas de baja similitud de secuencia entre estos grupos de organismos. Mediante predicciones bioinformáticas, se comprobó que esta región coincide con una zona de baja hidrofobicidad y de alto grado de accesibilidad de la proteína, que la convierte en una secuencia aminoacídica con altas probabilidades de encontrarse expuesta.
A partir de ARN total de larvas de las garrapatas Rhipicephalus microplus y R. sanguineus, y de piojos de mar adultos de la especie Caligus rogercresseyi se generaron ADNs complementarios mediante reverso-transcripción. Las secuencias nucleotídicas que codifican para la proteína ribosomal PO de estas garrapatas (SEQ ID NO. 1 y SEQ NO. 2) y de este piojo de mar se amplificaron mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (del inglés Polymerase Chain Reaction, abreviado PCR,), a partir de estos ADNs complementarios y oligonucleótidos específicos.
La secuencias polipeptídicas correspondientes a las proteínas P0 de los ectoparásitos R. sanguineus y R. microplus fueron idénticas entre ellas, y se designaron como SEQ ID NO. 3. Esta secuencia y la de la P0 de C. rogercresseyi presentaron una identidad de secuencia mayor del 70% con la P0 de sus organismos hospedantes, siendo aún mayor para los últimos 16 aminoácidos que componen la región C-terminal, descrita como la zona más inmunogénica dentro de la proteína. La zona de menor similitud en la secuencia aminoacídica, que a la vez tiene posibilidades de resultar expuesta y de ser inmunogénica, se detectó en todos los casos en la región comprendida entre los aminoácidos 267 y 301 (SEQ ID NO.4, péptído correspondiente en la proteína P0 de Rhipicephalus microplus [pPO]; SEQ ID NO.6, péptido correspondiente en la proteína P0 de Ixodes scapularis [pPOIs]; SEQ ID NO.8, péptido correspondiente en la proteína P0 de Caligus clemensi ¡[pPOCc], SEQ ID NO.9, péptido correspondiente en la proteína P0 de L. salmonis_[pPOLs] y SEQ ID NO.10, péptido correspondiente en la proteína P0 de C. rogercresseyi [pPOCr]).
Por tanto, en una realización de la invención, la composición vacunal comprende un péptido con una secuencia aminoacídica identificada como SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9 o SEQ ID NO. 10, un fragmento de dichas secuencias, o un péptido o polipéptido que exhibe al menos una identidad del 70 % con dichas secuencias.
La presente invención está relacionada también con aquellas composiciones vacunales donde el péptido de P0 indicado se fusiona, se conjuga o se co- administra con otra molécula, para incrementar su inmunogenicidad o potenciar su efecto protector. Entre dichas moléculas se encuentran proteínas portadoras e inmunopotenciadores. En una materialización de la invención, dicha molécula se selecciona dentro del grupo compuesto por la hemocianina, los epitopos de células T, las proteínas que forman partículas semejantes a virus, la proteína Bm86 de la garrapata R. microplus, la proteína Rs86 de la garrapata R. sanguineus y la proteína my32 del piojo de mar C. rogercresseyi o L. salmonis.
Los péptidos identificados como SEQ ID NO. 4, 6, 9 y 10, de entre 35 y 36 aminoácidos, y fragmentos de estos de 20 aminoácidos, se obtuvieron mediante síntesis química y se conjugaron a la hemocianina (del inglés Keyhole Limpet Hemocyanin, abreviado KLH) de Megathura crenulata, para potenciar su inmunogenicidad. Con los conjugados se realizaron experimentos de inmunización, con reto en condiciones controladas, para evaluar sus capacidades protectivas. El péptido pPO (SEQ ID NO. 4) se ensayó contra R. sanguineus y R. microplus en conejos y bovinos, respectivamente, el pPOIs (SEQ ID NO. 6) se evaluó contra /. scapularis en conejos. Por su parte, los péptidos pPOLs y pPOCr (SEQ ID NO. 9 y SEQ ID NO.10, respectivamente) se evaluaron contra L. salmonis y C. rogercresseyi, respectivamente, ambos en Salmo salar.
La inmunización de conejos y bovinos con la formulación vacunal que contiene el conjugado proteico (pPO-KLH) y el adyuvante Montanide 888 fue capaz de inducir en ambos casos una potente respuesta inmune humoral específica contra el péptido. No se observaron indicios de la ocurrencia de una respuesta de naturaleza autoinmune en los animales de experimentación utilizados, que fuese provocada por el reconocimiento y la reactividad de la proteína P0 de estos mamíferos por parte de los anticuerpos generados contra el péptido pPO. Esto se confirmó mediante un ensayo de reactividad cruzada "in vitro" en la línea celular de riñon de conejo RK-13, empleando un suero hiperinmune contra el péptido obtenido en ratones. La vacunación con el conjugado pPO-KLH indujo protección contra las infestaciones por R. sanguineus y R. microplus, provocando afectaciones estructurales y de los parámetros biológicos en ambas especies de garrapatas. Además, se obtuvieron resultados similares contra la garrapata /. scapularis luego de la inmunización con el péptido sintético de la proteína P0 de esta garrapata (pPOIs) conjugado a hemocianina.
La vacunación de salmones con los conjugados pPOLs-KLH y pPOCr-KLH indujo protección contra las infestaciones por ambas especies de piojos de mar, evidenciado en una disminución significativa del número de parásitos por pez. Se realizaron, además, experimentos de inmunización con el pPO y el pPOCr obtenidos por vía recombinante, fusionados a los epitopos T de la toxina tetánica y de la proteína de fusión del virus del sarampión (del inglés Measles Virus Fusión protein, abreviado MVF) en una misma construcción genética. Como resultado de los experimentos de inmunización con estos antígenos quiméricos, para el caso del piojo de mar, se obtuvo que la fusión a los epitopos T promiscuos mejora significativamente la protección, en comparación con el antígeno conjugado a KLH. El pPO se fusionó también a partículas semejantes a virus (del inglés Virus-like Partióles, abreviado VLPs) del Virus de la Enfermedad Hemorrágica del Conejo (del inglés Rabbit Hemorrhagic Disease Virus, abreviado RHDV), y se comprobó además que cuando el péptido se fusiona al antígeno Bm86, el efecto protectivo del péptido se potencia. Esto pudiera deberse al efecto combinado de los anticuerpos producidos contra ambos inmunógenos, y/o al hecho de que el daño estructural provocado por los anticuerpos dirigidos contra el antígeno Bm86, a nivel del intestino de las garrapatas, favorezca la acción de los anticuerpos específicos contra el péptido de la proteína ribosomal P0. Por su parte, el pPOCr se fusionó a la proteína my32 en otra construcción genética, y en este caso se obtuvieron los efectos más relevantes en los daños a C. rogercresseyi, presumiblemente por la potenciación del efecto específico individual de los dos antígenos.
De esta forma, en la invención se demostró que las composiciones vacunales basadas en el péptido pPO son efectivas para el control de las infestaciones por ectoparásitos, como las garrapatas y los piojos de mar. Por ello, las composiciones basadas en pPO son útiles también para el control de la transmisión de los patógenos asociados a dichos ectoparásitos.
Esta vacuna comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de antígeno en un adyuvante farmacéuticamente aceptable, mediante la cual se pueden controlar las infestaciones por estos patógenos. Como ya se expresó el antígeno en esta vacuna consiste en un péptido de la proteína ribosomal P0 de estos ectoparásitos, comprendido entre los aminoácidos 267 y 301 de dicha proteína, que se corresponde con la zona de menor similitud en la secuencia aminoacídica de la proteína de los ectoparásitos con la misma región de la proteína en sus respectivos organismos hospedantes. Dicho péptido se obtiene por vía recombinante o por síntesis química. También se pueden obtener por vía recombinante los polipéptidos fusionados que comprenden al péptido pPO. Como es conocido por los versados en este campo de la técnica, para la obtención de dichos antígenos por vía recombinante, se puede emplear un sistema de expresión en levaduras, bacterias, plantas, larvas de insectos, células de insectos o células de mamíferos.
En una realización de la invención, las composiciones vacunales de la misma pueden comprender, adicionalmente, un adyuvante vacunal. En el contexto de la invención, se evaluaron formulaciones vacunales que comprenden un adyuvante de tipo oleoso. Sin embargo, como adyuvantes pueden emplearse sales de aluminio, vesículas liposomales, moléculas relacionadas con el sistema inmune como las citoquinas, entre otros.
Las composiciones de la invención se pueden administrar de muy diversas formas. En una realización de la invención, la composición se administra por inyección. En otra realización, se administran mediante formulaciones de pienso. En el caso de que las composiciones sean administradas a peces es posible aplicar las mismas mediante baños de inmersión.
Es también objeto de la presente invención una composición vacunal para el control de las infestaciones por ectoparásitos que comprende ácidos nucleicos que codifican para el péptido de la proteína ribosomal P0 de dichos ectoparásitos, correspondiente a la región entre los aminoácidos 267 y 301 de la proteína, y que genera una respuesta inmune contra dicho péptido mediante inmunización con ADN desnudo. En una materialización de la invención, dicho péptido tiene una secuencia aminoacídica identificada como SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9 o SEQ ID NO. 10, es un fragmento de dichas secuencias, o es un péptido o polipéptido que exhibe al menos una identidad del 70 % con dichas secuencias.
La invención, además, se relaciona con el uso de la región comprendida entre los aminoácidos 267 y 301 de la proteína ribosomal P0 de ectoparásitos para la fabricación de una composición vacunal para el control de las infestaciones por estos parásitos o la transmisión de los patógenos asociados a los mismos. En una materialización, dicho péptido tiene una secuencia aminoacídica identificada como SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9 o SEQ ID NO. 10, es un fragmento de dichas secuencias, o es un péptido o polipéptido que exhibe al menos una identidad del 70 % con dichas secuencias.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Predicción del grado de accesibilidad de los residuos aminoacídicos presentes en la proteína ribosomal P0 de R. microplus y R. sanguineus. La región correspondiente a la secuencia definida como SEQ ID NO.4 se encuentra señalada con un círculo.
Figura 2. Respuesta de anticuerpos IgG específicos anti-péptido P0, detectada por ELISA en el suero de ratones BALB/c inmunizados con el conjugado pPO-KLH. Los datos se expresan como el recíproco del título promedio de anticuerpos, determinado como la última dilución de suero con una media de densidad óptica (DO) mayor que el triple de la media de la DO de un suero negativo. Las desviaciones estándar se representan mediante barras de error en sentido positivo. No se detectaron títulos de anticuerpos para ninguno de los animales en el día cero.
Figura 3. Patrón de expresión de la proteína ribosomal P0 de garrapatas Rhipicephalus en la línea celular RK-13 de conejo analizada mediante Western blotting con el anticuerpo policlonal generado en ratones contra P0. 1. Patrón de peso molecular, 2. lisado de células RK-13 transfectadas con el plasmidio pAdTrack-PORs en condiciones reductoras, 3. lisado de células RK-13 transfectadas con el plasmidio pAdTrack-PORs en condiciones no reductoras, 4. Lisado de células RK-13 no transfectadas en condiciones reductoras, 5. Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de Dodecilosulfato de sodio (SDS-PAGE) en condiciones reductoras del lisado de células RK-13 transfectadas con el plasmidio pAdTrack-PORs.
Figura 4. Respuesta de anticuerpos IgG anti-KLH, anti-péptido P0 y anti-Bm86 detectados por ELISA en el suero de conejos inmunizados con estos antígenos (Ejemplo 6). Los datos se expresan como el recíproco del título promedio de anticuerpos, determinado como la última dilución de suero con una media de DO mayor que el triple de la media de la DO de los grupos controles negativos según corresponda. Las desviaciones estándar se representan mediante barras de error en sentido positivo. No se detectaron títulos de anticuerpos específicos contra los antígenos para ninguno de los grupos en el día cero del ensayo.
Figura 5. Recuperación de larvas, ninfas y adultas de R. sanguineus en los conejos inmunizados del Ejemplo 6. Los datos se expresan como el promedio de los porcientos de larvas, ninfas y adultas recuperadas en los diferentes grupos experimentales. Las desviaciones estándar de los grupos se representan mediante barras de error en sentido positivo. En la gráfica se muestran con letras diferentes, las diferencias estadísticamente significativas existentes entre los grupos experimentales (ANOVA y prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni [p<0.01]. Para el análisis, los datos en proporciones fueron previamente transformados al arcsen de su raíz cuadrada).
Figura 6. Ninfas recién mudadas de R. sanguineus a partir de las larvas alimentadas sobre los diferentes grupos experimentales del ejemplo 6. (A) Grupo control negativo (B) Inmunizados con Bm86 (C) Inmunizados con el conjugado pPO-KLH y (D) Apariencia de las ninfas muertas mudadas a partir de larvas alimentadas sobre los conejos inmunizados con el pPO-KLH.
Figura 7. Porciento de eclosión de los aoves de R. sanguineus a partir de teleoginas alimentadas sobre los conejos inmunizados en el Ejemplo 6. Los datos se expresan como el promedio por grupo. Las desviaciones estándar para cada grupo se representan mediante barras de error en sentido positivo. Las diferencias estadísticamente significativas se representan mediante un asterisco (ANOVA y una prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni (p<0,05).
Figura 8. Respuesta de anticuerpos IgG anti-péptido P0 (A) y supervivencia de larvas, ninfas y adultas de R. sanguineus (B) correspondientes a los conejos inmunizados con las variantes de este péptido fusionado a diferentes moléculas inmunopotenciadoras. Las desviaciones estándar se representan mediante barras de error en sentido positivo.
Figura 9. Análisis mediante Western blotting del patrón de expresión de la proteína quimérica Bm86-pP0 en el precipitado de ruptura de la cepa MP36 de P. pastoris, utilizando sueros hiperinmunes generados contra el péptido pPO (A) y contra la proteína Bm86 (B). Para ambos casos, línea 1. Precipitado de ruptura en condiciones reductoras, 2. Precipitado de ruptura en condiciones no reductoras, 3. Proteína desglicosilada por digestión con la enzima PNGasa F.
Figura 10. Respuesta de anticuerpos IgG anti-péptido P0 y anti-Bm86, detectada por ELISA en el suero de bovinos inmunizados con estos antígenos de manera individual, combinada o con la proteína quimérica Bm86-pP0. Los datos se expresan como el recíproco del título promedio de anticuerpos, determinado como la última dilución de suero con una media de DO mayor que el triple de la media de la DO del grupo control negativo. Las desviaciones estándar se representan mediante barras de error en sentido positivo. No se detectaron títulos de anticuerpos para ninguno de los grupos al inicio del ensayo.
Figura 11. Promedio del peso de las teleoginas y del aove de R. microplus alimentadas en los bovinos inmunizados en el Ejemplo 8. En la gráfica se muestran las diferencias estadísticamente significativas existentes entre los grupos experimentales y de cada uno de ellos con respecto al grupo control negativo mediante letras diferentes (ANOVA y prueba de comparaciones múltiples de Newman-Keuls [p<0.05]).
Figura 12. Respuesta de anticuerpos IgG anti-pPOIs detectada por ELISA en el suero de conejos inmunizados con este antígeno y posteriormente retados con /. scapularis. Los datos se expresan como el recíproco del título promedio de anticuerpos, determinado como la última dilución de suero con una media de DO mayor que el triple de la media de la DO del grupo control negativo. Las desviaciones estándar se representan mediante barras de error en sentido positivo. No se detectaron títulos de anticuerpos para ninguno de los grupos en el día cero del ensayo. Figura 13. Comportamiento de los parámetros biológicos de /. scapuláris en los conejos inmunizados con el conjugado pPOIs-KLH. Se representan la viabilidad de las larvas y la recuperación de ninfas y adultas (A) y el porciento de eclosión de los aoves (B). Los datos se expresan como el promedio por grupo. Las desviaciones estándar se representan mediante barras de error en sentido positivo. En la gráfica se muestran con un asterisco las diferencias estadísticamente significativas existentes con respecto al grupo control negativo (ANOVA y prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni [p<0.05]).
Ventajas de la solución propuesta: En la presente invención se demuestra la capacidad protectiva de una formulación vacunal, que contiene un péptido comprendido entre los aminoácidos 267 y 301 de la proteína ribosomal P0 de diferentes ectoparásitos, contra las garrapatas R. microplus, R. sanguineus e /. scapuláris, y los ectoparásitos conocidos como piojos de mar L salmonis y C. rogercresseyi, sin la ocurrencia de reacciones cruzadas con la proteína del organismo hospedante. En todas las inmunizaciones, el pPO se administró conjugado o fusionado a una molécula inmunopotenciadora para mejorar la respuesta inmune de los animales. En el caso de las garrapatas, la aplicación de este péptido (o fragmentos del mismo) fusionado a la proteína Bm86 o combinado con ella, induce un mayor grado de afectación de la viabilidad, y de los parámetros biológicos de estos artrópodos, que el provocado por dichos antígenos cuando son utilizados individualmente. Por tanto, la aplicación de esta proteína quimérica o la combinación de ellas como parte de un programa de lucha integrada, pudiera resultar en un mayor control de las infestaciones por estas u otras especies de garrapatas, así como en la disminución de la incidencia de enfermedades hemoparasitarias transmitidas por las mismas. En el caso de los piojos de mar, la mayor afectación de los mismos fue observada cuando se fusionó el pPOCr a los epítopes T promiscuos y a la proteína my32. El alto grado de conservación aminoacídica de dicho péptido entre la mayoría de las especies de artrópodos y piojos de mar, y la baja identidad de esta secuencia con el fragmento correspondiente de las proteínas de mamíferos y peces, convierten a este péptido de la proteína ribosomal P0 (o fragmentos del mismo) en un antígeno para el desarrollo de vacunas contra ectoparásitos. Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización
Ejemplo 1. Amplificación y clonaje de las secuencias nucleotídicas que codifican para la proteína ribosomal P0 de R. microplus, R. sanguineus y C. rogercresseyi.
Mediante reacciones de reverso-transcripción a partir de ARN total de larvas de R. microplus y R. sanguineus y adultos de C. rogercressey se obtuvieron ADNs complementarios. Las reacciones se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones descritas en el kit "Reverse Transcription System" (Promega, USA #A3500). A partir de los ADNs complementarios obtenidos se amplificaron mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) las secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína ribosomal P0 de R. microplus y R. sanguineus (SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2) y la secuencia de la P0 de C. rogercresseyi. Como cebadores para los PCRs de garrapatas se utilizaron oligonucleótidos sintéticos diseñados a partir de la secuencia nucleotídica reportada en el banco de genes Genebank, para la P0 de Haemaphysalis longicornis (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) bajo el número de acceso EU048401 :
Oligonucleótido "Forward": 5' ATGGTCAGGGAGGACAAGACCACCTGG 3'
Oligonucleótido "Reverse": 5' CTAGTCGAAGAGTCCGAAGCCCATGTCG 3'
Como cebadores para la amplificación a partir de ADNc de C. rogercresseyi se utilizaron oligonucleótidos sintéticos degenerados diseñados a partir de las secuencias nucleotídicas reportadas en el banco de genes Genebank para la P0 de diferentes especies de garrapatas (Haemaphysal/s longicornis e Ixodes scapuiaris) e insectos (Drosophila melanogaster, Culex quinquefasciatus y /Aedes aegypti):
Oligonucleótidos "Forward":
F1 5' ATGGGCAAGAACAC(C/G)ATGAT(C/G)CGCAA(G/A)GC 3'
F2 5' ATGG(T/G)(T/C)AGGGAG(G/A)ACAA(G/A)(A/G)C(C/A T)(G/A)C(C/G)TGGAA 3'
Oligonucleótido "Reverse":
R1 5' TC(G/A)AA(A/C/G)AG(G/A/T)C(C/T)GAA(T/G/A)CCCAT(A/G)TC(A/G)TC 3'
Como resultado de las reacciones con ADN complementarios de garrapatas se obtuvo una banda de ADN de aproximadamente 957 pb en ambos casos, las cuales se clonaron en el vector comercial pGEM-TEasy (Promega, USA) para su secuenciación. En el caso de la reacción de PCR a partir de ADN complementario de C. rogercresseyi, se obtuvo una banda de ADN de aproximadamente 780 pb para la combinación de oligonucleótidos F1-R1 y una banda de aproximadamente 960 pb para la combinación de oligonucleótidos F2-R1. En ambos casos, las bandas se clonaron en el vector comercial pGEM-TEasy (Promega, USA) para su secuenciación.
Ejemplo 2. Análisis bioinformático.
Los análisis de identidad de secuencias aminoacídicas se realizaron mediante el uso de los programas BlastX y ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/). Las secuencias de 318 aminoácidos deducidas a partir de las secuencias de ADN amplificadas de los ADN compelmentarios de garrapatas fueron idénticas entre ellas (SEQ ID NO. 3) y presentaron una identidad del 95% y del 93%, con respecto a las secuencias de la proteína ribosomal P0 de Haemaphysalis longicornis y de Ixodes scapularis (Genebank, número de acceso DQ066213), respectivamente. Esta secuencia presentó además una identidad del 96% con la secuencia polipeptídica deducida a partir de un marco de lectura parcial incluido dentro del TC533 de la base de datos de Amblyoma variegatum, y del 99% con las deducidas a partir de dos marcos abiertos de lectura, contenidos en el TC1424 y el TC9038, de las bases de datos de ESTs de R. appendiculatus y R. microplus, respectivamente (http://compbio.dfci.harvard.edu/index.html).
La secuencia polipeptídica correspondiente a la proteína P0 de R. sanguineus y R. microplus denominada como SEQ ID NO. 3 presenta además una identidad de secuencia del 70% con la P0 de bovino (Bos taurus, Genebank número de acceso AAX09097), siendo del 87% para los últimos 16 aminoácidos que componen la región C-terminal, descrita como la zona más inmunogénica dentro de la proteína. Esta secuencia presenta además una identidad de secuencia del 71% con la proteína P0 de perro {Canis familiarís, Genebank número de acceso XM535894). En el caso de la secuencia aminoacídica de la P0 deducida a partir de la secuencia de ADN complementario de C. rogercresseyi, se observó un alto porciento de identidad con las secuencias informadas para otras especies de piojos de mar, como C. clemensi y L. salmonis. Al igual que en el caso de las garrapatas y sus hospederos, existió una elevada identidad de secuencia entre la P0 de los piojos de mar con respecto a la PO de Salmo salar (Genebank número de acceso ACI70184).
La elevada identidad de secuencia existente entre las PO de estos ectoparásitos con respecto a las PO de sus organismos hospedantes hace muy riesgoso utilizar esta molécula como antígeno vacunal para controlar sus infestaciones, debido a la posibilidad de generar autoinmunidad contra la proteína del hospedero. Este riesgo se incrementa para el uso de la región C-terminal (últimos 11-16 aminoácidos), la cual se encuentra altamente conservada entre todos estos organismos.
La región de la proteína PO de ambas especies de garrapatas que presenta menor similitud de secuencia con las proteínas PO de mamíferos se encuentra comprendida entre los aminoácidos 267 y 301 (SEQ ID NO.4). Mediante el uso de herramientas bioinformáticas incluidas en el sitio http://www.ca.expasv.org/sprot , se comprobó que esta región de la proteína coincide con una zona de baja hidrofobicidad, la cual tiene altas posibilidades de encontrarse expuesta en la proteína (Figura 1). Con posterioridad, se evaluó la capacidad inmunogénica de este péptido y su utilidad como antígeno vacunal para el control de las infestaciones por estas u otras especies de garrapatas.
Al traducir la secuencia del gen clonado que codifica para la proteína PO del piojo de mar Caligus rogercresseyi, se identificó un péptido similar, de baja homología con la P0 de Salmo salar en la misma región comprendida entre los aminoácidos 267 y 301 (SEQ ID NO. 10, pPOCr). Además, se identificaron también las mismas regiones de menor similitud aminoacídica (SEQ ID NO. 8 y 9, pPOCc y pPOLs) en las proteínas P0 reportadas para Caligus clemensi (Genebank número de acceso AC014779) y Lepeophtheirus salmonis (Genebank, número de acceso ACO12290).
Ejemplo 3. Síntesis de los péptidos y conjugación a la KLH.
Los péptidos definidos como SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 9 y SEQ ID NO.10, y fragmentos de 20 aminoácidos de dichos péptidos, se obtuvieron por síntesis química y se purificaron mediante cromatografía en fase reversa empleando un sistema de HPLC (del inglés: Reverse Phase-High Pressure Liquid Chromatograph). Se obtuvieron 15 miligramos de cada péptido sintético, con una pureza del 99,3%. La masa molecular de cada uno se verificó mediante espectrometría de masas. Con el propósito de potenciar las capacidades inmunogénicas de los péptidos se fusionaron a la proteína KLH. Las conjugaciones de los péptidos sintéticos con KLH se realizaron mediante el método de la carbodiimida soluble. La unión de estos se realizó utilizando el anhídrido succínico como agente espaciador. La separación de los conjugados se realizó mediante cromatografía de filtración en gel. La concentración final de cada conjugado se estimó mediante el método del ácido bicinconínico.
Ejemplo 4. Obtención de suero hiperinmune de ratón contra el péptido de la proteína ribosomal P0 de R. microplus y R. sanguineus (pPO).
Se emplearon seis ratones Balb/c, machos, de 6 semanas de edad, con masas corporales entre los 18 y 22 g, los cuales se inmunizaron por vía subcutánea en los días 0, 14, 21 y 28 con 250 pg del conjugado pPO-KLH (equivalente a 125 pg del péptido y 125 pg de KLH) en adyuvante de Freund. Las extracciones de sangre se realizaron en los días 0, 7, 14, 21, 40 y 65. Los animales se desangraron a los 65 días y los sueros se obtuvieron por centrifugación durante 10 minutos a 3500 rpm. La cinética de anticuerpos se monitoreó mediante un ELISA indirecto. Para el recubrimiento de las placas se utilizó 1 pg por pocilio del pPO y la detección se realizó con un anti IgG de ratón conjugado a peroxidasa de rábano picante en dilución 1:15000. El revelado se llevó a cabo empleando una Solución Sustrato que contenía o-fenilendiamina 0,4 mg/mL en ácido cítrico 0,1 M; NaH2P0 0,2 M; pH 5,0 y peróxido de hidrógeno 0,015%. La reacción se detuvo con H2SO4 2,5 M. El título de anticuerpos se estableció como el inverso de la mayor dilución a la cual la media de la DO del suero en cuestión es tres veces la media de la DO de un suero control negativo.
Los animales inmunizados mostraron títulos de anticuerpos específicos contra el péptido a partir del día 14 del experimento, los cuales llegaron a ser de 1 :10240 para dos de los animales en el día 65 (Figura 2). Una mezcla que contiene igual cantidad de los sueros hiperinmunes obtenidos a partir de los seis ratones inmunizados con el conjugado pPO-KLH se empleó como anticuerpo policlonal en los ensayos de expresión y de reactividad cruzada "in vitro". Ejemplo 5. Expresión de la proteína ribosomal PO de garrapatas Rhipicephalus en la línea celular RK-13 y ensayo de reactividad cruzada "in vitro".
La secuencia de ADN que codifica para la proteína ribosomal PO de R. sanguineus (SEQ ID NO.2) se clonó en el plasmidio pAdTrack-CMV (9,2 kb), bajo el control del promotor/potenciador inmediato/temprano del citomegalovirus humano (pCMVITh) y la señal de terminación/poliadenilación tardía del virus vesicular de los simios SV40. Este vector contiene en su secuencia el gen reportero que codifica para la proteína fluorescente verde (del inglés: Green Fluorescent Protein, abreviado GFP) y el gen que confiere resistencia a kanamicina (He T. C. ef al.; Proc Nati Acad Sci U S A. 1998, 95: 2509-2514). El plasmidio resultante se utilizó para transfectar la línea celular RK-13 de riñon de conejo. La transfección se realizó utilizando lipofectamina (Invitrogen, Estados Unidos), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La eficiencia de la transfección se comprobó luego de 24 horas, mediante la observación de la expresión de la GFP al microscopio óptico, empleando luz ultravioleta y una magnificación de 40X.
Luego de 48 h se procedió a la lisis celular y los extractos celulares obtenidos se sometieron a una electroforesis en gel de poliacrilamida al 10 % (SDS-PAGE), empleando condiciones reductoras y desnaturalizantes, según la técnica descrita por Laemmli (Laemmli U. K.; Nature 1970, 227: 680-685).
El patrón de expresión de la proteína ribosomal P0 de garrapatas Rhipicephalus se analizó mediante Western blotting, utilizando como anticuerpo primario el suero policlonal contra el péptido obtenido en ratones (diluido 1 :3000) y como anticuerpo secundario un anti-lgG de ratón conjugado a peroxidasa en dilución 1 :10000 (Figura 3). En la muestra correspondiente a las células transfectadas con el plasmidio se detectó una banda única a la talla esperada para la proteína P0, de aproximadamente 35 kDa. La presencia de una banda similar en la muestra corrida en condiciones no reductoras indicó que este péptido se encuentra expuesto en la estructura tridimensional de la proteína. No se detectó ninguna banda en el carril correspondiente a la muestra control negativo (células RK-13 de conejos no transfectadas), lo que indicó que los anticuerpos generados en ratón contra el péptido de 35 aminoácidos de la proteína P0 de garrapatas Rhipicephalus no son capaces de reconocer al péptido correspondiente en la proteína P0 de conejo quedando demostrada la ausencia de reactividad cruzada entre el péptido inmunogénico de garrapatas y el péptido correspondiente en la proteína ribosomal P0 de conejo.
Ejemplo 6. Determinación de la inmunogenicidad del péptido pPO de garrapatas Rhipicephalus y de su capacidad protectiva frente a infestaciones con la garrapata R. sanguineus.
Se procedió a evaluar la utilidad del péptido de la proteína ribosomal P0 de R. microplus y R. sanguineus como antígeno vacunal contra la garrapata R. sanguineus. Para ello, 20 conejos Nueva Zelanda blancos, machos, de entre 12 y 14 semanas de vida y masa corporal sobre los 2,5 kg se distribuyeron al azar en tres grupos experimentales de siete conejos para los grupos de pPO-KLH y Bm86 y de 6 conejos para el grupo control negativo inmunizado con KLH. Los inmunógenos, contenidos en PBS1X, se adyuvaron en Montanide 888 VG (preparado al 10% en aceite mineral) en una proporción 60/40 de inmunógeno/adyuvante. Los grupos experimentales se distribuyeron de la siguiente forma:
Grupo 1: Inmunización por vía subcutánea con el conjugado pPO-KLH en dosis de 500 pg/animal (equivalente a 250 pg de péptido/animal) en los días 0, 21 , 36 y 60.
Grupo 2 (control negativo): Inmunización por vía subcutánea con KLH en dosis de 250 pg/animal en los días 0, 21 , 36 y 60.
Grupo 3 (control positivo): Inmunización por vía subcutánea con la proteína Bm86 de R. microplus en dosis de 100 pg/animal en los días 0 y 28.
El ensayo tuvo una duración de 120 días. Se tomaron muestras de suero a los animales para medir la respuesta de anticuerpos en los días 0, 14, 21 , 28, 36, 59, 73 y 87. Se observó diariamente el comportamiento general y la temperatura corporal de los mismos durante todo el ensayo. Se colocaron tres cámaras por animal en el día 72 del experimento y se infestó cada animal en el día 73 con aproximadamente 250 larvas, 100 ninfas y 50 neoginas (20 machos y 30 hembras) de R. sanguineus. La colecta, conteo, pesaje y análisis de la muda de las garrapatas se realizó entre los días 75 y 120. Las larvas y ninfas colectadas se mantuvieron en una incubadora a 28°C, con 80% de humedad relativa y un fotoperíodo de 12:12 h (luz: oscuridad). Las teleoginas hembras ingurgitadas se mantuvieron en placas plásticas individuales inmovilizadas hasta oviposición en las mismas condiciones.
No se observó cambio en el comportamiento normal, ni fiebre en ninguno de los animales. La respuesta humoral generada contra cada uno de los inmunógenos se estudió mediante ELISA indirecto similar al descrito anteriormente, recubriendo las placas con 1 μg por pocilio de cada antígeno y utilizando en este caso un anticuerpo anti-lgG de conejo conjugado a peroxidada (SIGMA) en dilución 1:10000. Las medias de los títulos de anticuerpos se determinaron a partir de los valores individuales en cada grupo. Títulos específicos contra Bm86 sólo se obtuvieron en los animales del grupo 3 inmunizados con Bm 86. Títulos específicos contra el péptido de P0 (pPO) se obtuvieron sólo en el grupo 1 de animales inmunizados con el conjugado pPO-KLH y títulos específicos contra KLH se obtuvieron en los grupos 1 y 2 inmunizados con el conjugado pPO-KLH y con KLH sola (Figura 4).
Para estudiar el efecto de los inmunógenos sobre las garrapatas R. sanguineus se analizó el comportamiento de varios parámetros biológicos de las mismas. En larvas, ninfas y adultas se analizó el tiempo promedio de alimentación y la recuperación. En el caso de larvas y ninfas se analizó además la muda y la capacidad del estadio posterior obtenido, de infestar un animal virgen. En el caso de adultas se estudió además el peso de la hembra ingurgitada, el peso del aove y el porcentaje de eclosión. El índice de eficiencia de conversión a huevos se calculó según se ha descrito previamente (Bennett G. F. et al.; Acarologia 1974, 16: 52- 61), como el porcentaje de peso de la hembra convertido en huevos. De manera general, las larvas, ninfas y neoginas del grupo inmunizado con Bm86 tardaron más tiempo en alimentarse que los mismos estadios sobre los animales controles y vacunados con el péptido P0. Los valores de recuperación de larvas, ninfas y neoginas entre los tres grupos se compararon mediante un ANOVA y la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni (p<0.01). En el caso de las larvas y ninfas se analizó la supervivencia o viabilidad como la cantidad final del estadio siguiente que fue capaz de infestar animales vírgenes con respecto a la cantidad de larvas y ninfas mudadas. Para las neoginas, la supervivencia se midió como el número final de garrapatas capaces de sobrevivir luego de la incubación y con capacidad de ovipositar. La media de la recuperación de larvas no mostró diferencias estadísticamente significativas entre los grupos experimentales. En el caso de la recuperación de ninfas, a pesar de una tendencia a recuperar menos ninfas alimentadas sobre los grupos inmunizados tanto con pPO-KLH como con Bm86 no existieron diferencias estadísticamente significativas respecto al grupo control inmunizado con KLH. En el caso de las adultas, la recuperación mostró diferencias estadísticamente significativas para el grupo vacunado con el antígeno pPO con relación a los grupos control negativo y vacunados con Bm86. (Figura 5).
Se observaron serias afectaciones en la viabilidad y apariencia de las ninfas recién mudadas a partir de las larvas alimentadas en los grupos vacunados con ambos antígenos respecto a las colectadas sobre el grupo control. En el grupo vacunado con el pPO-KLH se observó una elevada mortalidad de las ninfas recién mudadas con una afectación evidente de la morfología, existiendo diferencias estadísticamente significativas de este parámetro en el grupo vacunado con el pPO-KLH respecto a los grupos control negativo y al vacunado con Bm86. Hay además diferencias significativas en la viabilidad entre el grupo vacunado con Bm86 y el grupo control negativo (Figura 6). En la Tabla 1 aparecen los porcientos de mortalidad en cada grupo experimental.
Tabla 1. Porcientos de mortalidad de las ninfas recién mudadas a partir de larvas alimentadas en los tres grupos experimentales. Las letras diferentes significan diferencias estadísticamente significativas obtenidas por un ANOVA seguido de una prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni (P<0,001) de los datos transformados.
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La capacidad de las ninfas y neoginas recién mudadas y de las larvas recién eclosionadas provenientes de los grupos experimentales para infestar un nuevo animal se determinó mediante la infestación de perros vírgenes con los ejemplares recuperados, mudados y viables de cada grupo. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas para este parámetro entre los grupos experimentales. El análisis estadístico de los datos de peso de la teleogina y del aove se realizó mediante un ANOVA y una prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni (p<0,05). No se encontraron diferencias significativas para ambos parámetros entre los grupos experimentales. El índice de eficiencia de conversión a huevos tampoco presentó diferencias significativas entre los grupos vacunados y el grupo control. En este punto debemos destacar que el 10% de las neoginas alimentadas sobre conejos inmunizados con pPO-KLH no pusieron huevos respecto a un 3% en el grupo control inmunizado con KLH y un 6% no puso huevos en el grupo alimentado sobre conejos inmunizados con Bm86. Se observaron diferencias estadísticamente significativas (p<0.01) en el % de eclosión de los huevos en el grupo inmunizado con pPO-KLH respecto al grupo control inmunizado con KLH (Figura 7). Aunque en el grupo inmunizado con Bm86 hubo un porciento de eclosión menor que en el grupo control negativo, estas diferencias no resultaron significativas desde el punto de vista estadístico. Las larvas eclosionadas de los huevos de los tres grupos experimentales fueron capaces de infestar perros y alimentarse normalmente.
Se realizaron experimentos con resultados similares a los descritos previamente en este ejemplo, inmunizando los conejos con fragmentos de 20 aminoácidos del pPO. Los péptidos evaluados tienen las siguientes secuencias aminoacídicas: AAGGGAAAAKPEESKKEEAK, EYLKDPSKFAAAAAPAAGGG y
FAAAAAPAAGGGAAAAKPEE. Dichos péptidos se conjugaron a KLH. Los mejores resultados se obtuvieron con el péptido correspondiente a los últimos 20 aminoácidos del pPO.
Ejemplo 7. Determinación de la inmunogenicidad del pPO de R. microplus y R. sanguíneas fusionado a diferentes moléculas inmunopotenciadoras.
La proteína de la cápsida VP60 del RHDV (cepa AST/89) se ha obtenido con altos niveles de expresión en el sobrenadante de ruptura de la levadura Pichi'a pastoris. Esta proteína obtenida por vía recombinante forma multímeros de alto peso molecular con características antigénicas y estructurales similares a la partícula viral nativa (Farnós O. et al.; Antiv. Res. 2009, 81 : 25-36). Aprovechando la alta capacidad inmunogénica de estas partículas semejantes a virus (VLPs), se generó una construcción de ADN recombinante para obtener el pPO expuesto sobre la superficie de las VLPs del RHDV. Para ello, la secuencia nucleotídica que codifica para el fragmento de 20 aa desde la posición 15 a la 35 de la SEQ ID No.4 de dicho péptido (AAGGGAAAAKPEESKKEEAK) se insertó en el plasmidio pNAOVP60, en la posición del dominio protuberante del gen de la proteína VP60. Esta construcción permite que el pPO se exprese fusionado al extremo C-terminal de la VP60, región que queda expuesta al exterior luego del ensamblaje de las VLPs. El plasmidio recombinante obtenido se empleó para transformar la cepa MP36 de P. pastoris. La proteína VP60pP0 se obtuvo soluble en el sobrenadante de ruptura a niveles de 350 mg/L. La exposición de la región C-terminal y la formación de VLPs se verificaron mediante un ELISA sandwich utilizando un suero hiperinmune anti-RHDV y los anticuerpos monoclonales 6H6 y 1 H8 (gentilmente donados por el Dr. Lorenzo Capucci del Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia, Brescia, Italia), que reconocen epitopos presentes en la región C- terminal de la proteína VP60 y en partículas virales o VLPs correctamente ensambladas, respectivamente (Capucci L. er a/.; Virus. Res. 1995, 37: 221-238). Las VLPs de VP60pP0 se purificaron mediante HPLC en una columna TSK- G3000PW, obteniéndose con una pureza aproximada del 50 %.
La otra construcción recombinante fue realizada con el mismo péptido de 20 a. a. de P0 acoplado a varios epitopos de células T promiscuos. Específicamente, se usaron epitopos ttP2 del toxoide tetánico y el epitopo de células T del virus del sarampión (TT-MVF). Se insertaron varias copias de la secuencia de ADN del pPO de 20 a.a (AAGGGAAAAKPEESKKEEAK) y de los antígenos T promiscuos fusionados a la inteina de Saccharomyces cerevisiae en el plasmidio pTBY 12 bajo el control del promotor T7 y el represor del operón lac que permite la expresión de la proteína de fusión sólo después de la inducción con IPTG. El plasmidio recombinante obtenido se utilizó para transformar la cepa ER2566 de E coli . El péptido quimérico TT-MVF-pP0- inteina fue detectado en el sobrenadante de ruptura de esta cepa por el suero policlonal murino anti-pPO. Los niveles de expresión se estimaron en aproximadamente 100 mg/L de cultivo. El péptido fue purificado por afinidad a una columna de quitina y autodigerido en la presencia de grupos tioles para liberar el péptido de interés.
Se realizó un experimento de inmunización en conejos para evaluar la capacidad inmunogénica de las variantes quiméricas obtenidas y el efecto de los anticuerpos generados sobre las larvas, ninfas y neoginas de R. sanguineus en comparación al efecto del péptido sintético de la proteína ribosomal P0 conjugado a hemocianina. Para ello, 28 conejos Nueva Zelanda, blancos y machos, se distribuyeron al azar en 4 grupos de 7 animales cada uno. Los inmunógenos se adyuvaron en Montanide 888 VG y se administraron de la siguiente forma:
Grupo 1 : Inmunización por vía subcutánea con el conjugado pPO-KLH en dosis de 500 pg/animal (equivalente a 250 pg de péptido/animal).
Grupo 2 (control negativo): Inmunización por vía subcutánea con KLH en dosis de 250 pg/animal.
Grupo 3: Inmunización por vía subcutánea con las VLPsVP60pP0 en dosis equivalente a 250 pg de proteína/animal.
Grupo 4: Inmunización por vía subcutánea con el péptido quimérico TT-MVF-pP0, en dosis equivalente a 250 pg de péptido/animal.
El ensayo tuvo una duración de 90 días. Los animales se inmunizaron los días 0, 21 y 36. Las extracciones de los sueros, la determinación de los títulos de anticuerpos, y la infestación y colecta de las garrapatas, se realizaron de manera similar a lo descrito en el Ejemplo 6.
Para el análisis estadístico, los valores de recuperación y viabilidad de garrapatas se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA) y a una prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni. Se detectaron los mayores títulos de anticuerpos anti-péptido P0 en los animales vacunados con la quimera VLPsVP60pP0 a partir del día 14 post-inmunización. Estos anticuerpos alcanzaron títulos superiores a :5000 para la variante quimérica VLPsVP60pP0 a partir del día 21 , y a partir del día 28 para los animales inmunizados con la quimera TT- MVF-pPO. Los títulos se mantuvieron hasta el final del experimento (Figura 8 A).
La media de la viabilidad de las larvas y la recuperación de ninfas y neoginas mostró diferencias significativas (p<0,05) para los grupos vacunados con las variantes quiméricas del péptido de la P0 con respecto al grupo control negativo, inmunizado con KLH. (Figura 8 B). En la Tabla 2 aparece la disminución respecto al grupo control negativo en el porcentaje de viabilidad de las larvas y en el porcentaje de recuperación de ninfas y adultas por grupos experimentales. Tabla 2. Disminución en el porcentaje de recuperación de garrapatas en cada estadio respecto al grupo control inmunizado con KLH.
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Ejemplo 8. Determinación de la capacidad protectiva de la proteína quimérica Bm86-pP0 respecto a la del pPO, frente a infestaciones con la garrapata R. microplus.
El antígeno Bm86 de la garrapata R. microplus se expresó con anterioridad en la cepa MP36 de P. pastorís (Valle M. R. et al., J. Biotech. 1994, 33: 135-146). En esa construcción se eliminaron los fragmentos del gen correspondientes al péptido señal y a la región transmembrana de la proteína (SEQ ID NO. 5). Para la construcción de la proteína quimérica Bm86-pP0 se insertó la secuencia nucleotídica de la proteína Bm86 descrita anteriormente, a continuación de la señal de secreción de la sacarosa invertasa de S. cerevisiae (ssSUCZ) en el plasmidio pPS10 bajo el control del promotor AOX 1. A esta secuencia de Bm86 se fusionó la secuencia de ADN que codifica para el péptido de 35 aminoácidos de la proteína ribosomal P0 de R. microplus. La cepa MP36 de P. pastorís se transformó con el plasmidio resultante y los transformantes se seleccionaron mediante la reversión de la auxotrofía al aminoácido histidina. Los clones obtenidos se indujeron con metanol después de alcanzar una DO entre 3 y 4 en el cultivo celular. Luego de 96 horas de inducción se realizó el análisis de expresión mediante Western blotting, utilizando un suero hiperinmune murino anti-pPO (referido en el Ejemplo 4) y por un anticuerpo policlonal anti-Bm86 (Figura 9A y 9B). La proteína recombinante se detectó en el precipitado de ruptura celular a niveles de 300 mg/L. En dicho análisis se observó una banda de 100 kDa, correspondiente a la proteína glicosilada, la cual se redujo a una banda de aproximadamente 70 kDa, coincidente con la talla esperada para la proteína, luego de la digestión con la enzima PNGasa F. No se observó ninguna banda en la muestra analizada en condiciones no reductoras, lo cual sugirió la formación de estructuras multiméricas, que fueron incapaces de entrar en el gel de poliacrilamida. La presencia de estos agregados proteicos de alto peso molecular en el precipitado de ruptura se verificó mediante microscopía electrónica. La proteína quimérica se purificó por el método de precipitación ácida, obteniéndose con una pureza de aproximadamente 95%.
Se realizó un ensayo de inmunización en bovinos donde se compararon los efectos sobre R. microplus del pPO conjugado a KLH, de la proteína Bm86, de la proteína quimérica Bm86-pP0 y de la co administración de los antígenos pP0_KLH y Bm86 como candidatos vacunales. Para ello, 20 bovinos libres de garrapatas, de más de 240 kg de peso se distribuyeron al azar en cinco grupos experimentales de 4 animales cada uno. Los inmunogenos se administraron en Montanide 888 VG (preparado al 10% en aceite mineral) en proporción 60/40 de fase acuosa/fase oleosa. Los grupos experimentales se concibieron de la siguiente forma:
Grupo 1 : Inmunización por vía intramuscular con el conjugado pPO-KLH en dosis de 500 pg de conjugado/animal (equivalente a 250 pg de péptido/animal) con el esquema de 0, 4 y 7 semanas.
Grupo 2 (control negativo): Inmunización por vía intramuscular con KLH en dosis de 250 pg/animal con el esquema de 0, 4 y 7 semanas.
Grupo 3 (control positivo): Inmunización por vía intramuscular con la proteína Bm86 de R. microplus en dosis de 250 pg/animal con el esquema de 0, 4 y 7 semanas.
Grupo 4: Inmunización por vía intramuscular con la proteína quimérica Bm86-pP0 en dosis de 250 pg/animal con el esquema de 0, 4 y 7 semanas.
Grupo 5: Inmunización por vía intramuscular con la proteína Bm86 y el conjugado pPO-KLH en dosis de 250 pg de Bm86/animal y 500 pg del conjugado/animal con el esquema de 0, 4 y 7 semanas.
El ensayo tuvo una duración total de 140 días. Se tomaron muestras de suero a los animales para medir la respuesta de anticuerpos en los días 0, 14, 28, 49, 70, 82, 120 y 140. Se colocaron cuatro cámaras por animal en el día 82 del experimento y se infestó con 3000 larvas por cámara (12000 larvas por animal) de R. microplus a razón de 4000 larvas diarias entre los días 84 y 86. La colecta, conteo y pesaje de las garrapatas se realizó entre los días 107 y 117. Las teleoginas hembras ingurgitadas se mantuvieron en placas plásticas individuales a 28°C, 90 % de humedad relativa y con un fotoperíodo de 12 horas de luz. La cinética de anticuerpos anti-pPO y anti-Bm86 se estudió por ELISA, utilizando en este caso un conjugado anti-bovino-peroxidasa (SIGMA) en dilución 1 :10000. Se detectó una respuesta de anticuerpos IgG específicos contra Bm86 y contra el pPO a partir del día 14, en todos los animales inmunizados con estos antígenos. Estos anticuerpos alcanzaron títulos superiores a 1 :5000 luego del día 28 para Bm86 y entre los días 60 y 90 para el caso del péptido P0, los que se mantuvieron hasta el final del experimento. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas para los títulos de anticuerpos anti-Bm86 ni anti-pPO entre los grupos inoculados con ambos antígenos por separado o combinados, ni con respecto al grupo vacunado con la quimera Bm86-pP0 (Figura 0).
Se analizó el efecto de los anticuerpos generados sobre la recuperación, el peso de la teleogina y del aove y el porcentaje de eclosión de R. microplus. La recuperación de teleoginas disminuyó de manera significativa en todos los grupos vacunados con respecto al grupo control negativo del experimento. Para el grupo inmunizado con Bm86 respecto al grupo control negativo la disminución de la recuperación de garrapatas fue del 32,6%, del 55,2 % para el grupo inmunizado con pPO-KLH, del 62,13 % para el grupo inmunizado con los dos antígenos individuales y del 65,2% para el grupo inmuniado con la quimera Bm86-pP0. Este parámetro fue significativamente menor para los grupos inmunizados con la quimera Bm86-pP0 y con la combinación de Bm86 y pPO-KLH respecto a los grupos donde estos antígenos fueron aplicados de manera individual. No hubo diferencias significativas del grupo inmunizado con la quimera con respecto al grupo inmunizado con la combinación de los dos antígenos. Los parámetros de peso de la teleogina y peso del aove mostraron una afectación significativa en los grupos inmunizados con Bm86 respecto al control negativo (ANOVA y prueba de comparaciones múltiples de Newman-Keuls fp<0,05]). Se observó una disminución significativa para estos parámetros biológicos en los grupos inmunizados con la quimera Bm86-pP0 y con la combinación de los antígenos, con respecto a los grupos vacunados con los antígenos individuales (Figura 1). El porciento de eclosión de los huevos en el grupo control negativo fue del 87,4%, mientras que para los grupos inmunizados con Bm86, pPO-KLH, la combinación de Bm86 y pPO- KLH y la quimera Bm86-pP0 fue de 75,1%, 64,6%, 54.8% y 55,9%; respectivamente, mostrando una disminución significativa en todos los grupos respecto al control. Estos resultados evidencian que la vacunación con una formulación que contiene el péptido de la proteína ribosomal PO objeto de esta invención ya sea fusionado a la proteína Bm86 que combinado con ella provoca una mayor afectación en la supervivencia y parámetros biológicos de R. microplus, lo que se traduce en un control más eficiente de las infestaciones de esta garrapata.
Ejemplo 9. Determinación de la capacidad protectiva del péptido de la proteína PO de Ixodes scapularis (pPOIs) frente a infestaciones con la garrapata /. scapularis.
Se procedió a evaluar la capacidad inmunogénica del péptido comprendido entre los aminoácidos 267-302 de la proteína ribosomal P0 de /. scapularis, homólogo al péptido inmunogénico de la proteínas P0 de R. microplus y R. sanguineus. Estos péptidos presentan una identidad de secuencia entre ellos del 68%. La síntesis química del péptido de /. scapularis y la conjugación a la hemocianina KLH se realizó de manera similar a lo descrito en el Ejemplo 3. Posteriormente, 12 conejos Nueva Zelanda blancos, machos, se distribuyeron al azar en dos grupos experimentales de seis conejos cada uno, los cuales se inmunizaron y retaron con larvas, ninfas y neoginas de /. scapularis. Los inmunógenos se adyuvaron en Montanide 888 VG en una proporción 60/40 de ¡nmunógeno/adyuvante y se aplicaron de la siguiente forma:
Grupo 1 : Inmunización por vía subcutánea con el conjugado pP0ls-KLH en dosis de 500 pg/animal (equivalente a 250 pg de péptido/animal).
Grupo 2 (control negativo): Inmunización por vía subcutánea con KLH en dosis de 250 pg/animal.
Ambos grupos se inmunizaron en los días 0, 21 y 36. Las extracciones de los sueros se realizaron a los días 0, 14, 21 , 28, 36 y 60 de comenzado el experimento. La determinación de los títulos de anticuerpos anti-péptidoPO y la infestación, colecta, conteo y mantenimiento de las garrapatas se realizaron de manera similar a lo descrito en el Ejemplo 6.
No se observó cambio en el comportamiento normal, ni fiebre en ninguno de los animales. Se detectaron títulos de anticuerpos anti-pPOIs en los animales inmunizados con el conjugado pP0ls-KLH a partir del día 14 post-inmunización. Estos anticuerpos alcanzaron títulos superiores a 1 :3500 en el día 36, los que se mantuvieron hasta el final del experimento (Figura 12).
A las 168 horas, ya se habían colectado todas los estadios alimentados de los dos grupos. La recuperación y viabilidad de todos los estadios de garrapatas con que se infestaron los animales, el peso de las teleoginas y del aove y el % de eclosión de los huevos se compararon entre los grupos mediante un ANOVA y la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni (p<0.05). La recuperación de ninfas y teleoginas mostraron diferencias estadísticamente significativas en el grupo vacunado con el conjugado pPOIs-KLH con respecto al grupo control negativo Se evidenció una elevada mortalidad de larvas alimentadas y recién mudadas con diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (Figura 13 A). El peso de las teleoginas y del aove no presentaron diferencias estadísticamente significativas. El índice de eficiencia de conversión a huevos fue del 45,49% en el grupo control negativo y del 40,19% en el inmunizado con el conjugado pPOIs-KLH y el porcentaje de eclosión de los huevos fue del 95,20% para el control negativo y del 83,10% para el grupo inmunizado con el conjugado. Este último parámetro resultó significativo cuando se le realizó el análisis estadístico (Figura 13 B).
Ejemplo 10. Determinación de la capacidad protectiva del pPO de L. salmonis (pPOLs).
Para evaluar la utilidad del pPOLs como antígeno vacunal se distribuyeron 80 salmones de un peso promedio de 80 g en 4 grupos, de 20 peces cada uno. Dos grupos se inyectaron por vía intraperitoneal (i.p.) con el conjugado POLs-KLH, a una dosis de 10 μg del conjugado/g de peso corporal de los salmones (equivale a 5 μg de pP0Ls/g de peso del salmón), formulado en el adyuvante oleoso Montanide 888. Los otros dos grupos fueron controles negativos inmunizados con 5 μg de KLH /g de peso corporal, adyuvado en Montanide 888. Transcurridas 500 unidades térmicas arbitrarias, los salmones se adaptaron a agua de mar y se infestaron con 2000 ± 200 copepoditos por estanque. El desafío se llevó a cabo bajo condiciones de oscuridad, aireación constante, oxigenación de apoyo, control de temperatura (15-17 °C) y salinidad (aprox. 30 ppm). Con el fin de evitar la pérdida de copepoditos y facilitar la fijación de los mismos, el flujo de agua en los estanques se mantuvo cerrado y se efectuó el recambio manual cada 48 horas además de que se instalaron tamices de 220 μ en los tubos de desagüe. El momento de la inclusión de los copepoditos se definió como el día 0. Estas condiciones se mantuvieron por 40 días desde el inicio del desafío.
A los 40 días se sacrificaron los peces, por una sobredosis de anestesia, y se procedió a la evaluación de los resultados mediante el conteo de parásitos. Los resultados que aparecen en la Tabla 3 mostraron una disminución significativa en el número de parásitos por pez en los grupos vacunados con pPOLs-KLH, en comparación con los controles negativos vacunados solamente con KLH.
Tabla 3. Resultados del conteo de parásitos al concluir el experimento de reto.
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Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas. Se aplicó un test de comparaciones múltiples de Dunn (p<0,001).
De igual forma, se realizaron experimentos con resultados similares a los descritos en este ejemplo, pero los salmones se inmunizaron con fragmentos de 20 aminoácidos del péptido pPOLs. Los péptidos evaluados tenían la secuencia PAAGATKAAAAAPAKADEPE, SKFASVAAAPAAGATKAAAA, y
EYLADPSKFASVAAAPAAGA, respectivamente, y se conjugaron a KLH. Aunque todos los péptidos confirieron protección, los mejores resultados se obtuvieron con el péptido correspondiente a los últimos 20 aminoácidos del pPOLs. Ejemplo 11. Determinación de la capacidad protectiva del péptido de la proteína P0 de C. rogercresseyi (pPOCr) fusionado a epitopos T promiscuos y del conjugado pPOCr-KLH.
Se evaluó la capacidad inmunogénica del conjugado pPOCr-KLH y del pPOCr fusionado a otras moléculas inmunopotenciadoras como los epitopes T promiscuos. En este caso se utilizaron igualmente los epitopos ttP2 del toxoide tetánico y el epitopo de células T del virus del sarampión (TT-MVF). El péptido quimérico TT-MVF-pP0Cr fue detectado en el sobrenadante de cultivo de la cepa MP36 de P. pastorís transformada con un plasmidio que contenía una copia de la secuencia codificante para el pPOCr fusionada en su extremo N-terminal a dos copias de los epitopos T promiscuos bajo el control del promotor de la alcohol oxidasa 1 (AOX 1), precedido todo por la señal de secreción de la sacarosa invertasa de S. cerevisiae (ssSUC2). Los niveles de expresión se estimaron en aproximadamente 150 mg/L de cultivo.
Se procedió a evaluar la utilidad de este polipéptido, obtenido por vía recombinante, como antígeno vacunal y compararlo con los efectos del conjugado pPOCr-KLH. Para ello 120 salmones de un peso promedio de 80 g se distribuyeron en 6 grupos, de 20 peces cada uno. Los grupos experimentales fueron:
Grupos 1 y 2: Se inyectaron por vía i.p. con el conjugado pPOCr-KLH, a una dosis de 10 μg/g de peso corporal (equivalente a 5 μg de pPOCr /g de peso). Grupos 3 y 4: Se inyectaron por vía i.p. con KLH, a una dosis de 5 μg/g de peso.
Grupos 5 v 6: Se inyectaron por vía i.p. con la proteína quimérica TT-MVF-pP0Cr, a una dosis de 5 μg/g de peso.
En todos los casos, el inmunogeno fue formulado en el adyuvante oleoso Montanide 888. El procedimiento experimental fue similar al del Ejemplo 10, sólo que en este caso como el piojo de mar C. rogercresseyi tiene un ciclo de vida más corto, a los 24 días (después de completar dos ciclos de vida del parásito) se eliminaron los peces, por una sobredosis de anestesia, y se procedió a la evaluación de los resultados mediante el conteo de parásitos. En la tabla siguiente aparecen los resultados que mostraron una disminución significativa en el número de parásitos por pez en los grupos vacunados con pPOCr-KLH y TT-MVF-pP0Cr, en comparación con los controles negativos vacunados solamente con KLH. La mayor protección, evaluada como número de parásitos/pez, se observó en el grupo TT-MVF-pP0Cr. Tabla 4. Resultados del conteo de parásitos al concluir el experimento de reto.
Figure imgf000033_0001
Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas. Se aplicó un test de comparaciones múltiples de Dunn (p<0,001).
Ejemplo 12. Determinación de la inmunogenicidad del pPOCr fusionado al polipéptido my32.
Para evaluar la capacidad inmunogénica del pPOCr fusionado al antígeno my32, previamente conocido, se generó el péptido quimérico my32-pP0Cr, utilizando el mismo procedimiento descrito en los ejemplos anteriores para todas las proteínas de fusión. En este caso, el plasmidio con el que se transformó la cepa MP36 de P. pastoris contenía una copia del pPOCr fusionado por su extremo N-terminal a una copia de my32, bajo el control del promotor AOX 1, precedida por la señal de secreción ssSUC2. El péptido quimérico my32-pP0Cr fue detectado en el sobrenadante de cultivo en una concentración de aproximadamente 135 mg/L de cultivo.
Para evaluar la utilidad de este polipéptido obtenido por vía recombinante como antígeno vacunal, 160 salmones de un peso promedio de 80 g se distribuyeron en grupos, de 20 peces cada uno. Los grupos experimentales fueron:
Grupos 1 v 2: Se inyectaron con el conjugado pPOCr-KLH a una dosis de 10 μg g de peso corporal (equivalente a 5 g de POCr /g de peso). Grupos 3 v 4: Se inyectaron con KLH a una dosis de 5 μg/g de peso corporal.
Grupos 5 v 6: Se inyectaron con la proteína quimérica my32-pP0Cr, a una dosis de 5 g/g de peso.
Grupos 7 v 8: Se inyectaron con la proteína my32, obtenida por vía recombinante, a una dosis de 5 μg g de peso. Todos los animales recibieron el inmunogeno por vía i.p. y adyuvado en Montanide 888. El procedimiento experimental seguido fue igual al del Ejemplo 11. En la Tabla 5 aparecen los resultados del muestreo a los 24 días post-reto, que evidencian una disminución significativa en el número de parásitos por pez en los grupos vacunados con pPOCr-KLH, my32-pP0Cr y my32, en comparación con los animales inoculados solamente con KLH. La mayor protección, evaluada como número de parásitos/pez, se observó en el grupo my32-pPÓCr.
Tabla 5. Resultados del conteo de parásitos al concluir el experimento de reto.
Figure imgf000034_0001
Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas. Se aplicó un test de comparaciones múltiples de Dunn (p<0,001).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Composición vacunal para el control de las infestaciones por ectoparásitos que comprende un péptido de la proteína ribosomal P0 de dichos ectoparásitos, correspondiente a la región entre los aminoácidos 267 y 301 de la proteína.
2. La composición según la reivindicación 1 donde dicho péptido tiene una secuencia aminoacídica identificada como SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9 o SEQ ID NO. 10, es un fragmento de dichas secuencias, o es un péptido o polipéptido que exhibe al menos una identidad del 70 % con dichas secuencias.
3. La composición según las reivindicaciones 1 y 2 donde dicho péptido ha sido fusionado, conjugado o co-administrado con otra molécula para incrementar su ¡nmunogenicidad o potenciar su efecto protector.
4. La composición según la reivindicación 3 donde dicha molécula se selecciona dentro del grupo compuesto por la hemocianina, un epitopo de células T proveniente de la toxina tetánica o de la proteína de fusión del virus del sarampión, proteínas que forman partículas semejantes a virus del Virus de la Enfermedad Hemorrágica del Conejo, la proteína Bm86 de la garrapata R. microplus, la proteína Rs86 de la garrapata R. sanguineus y la proteína my32 del piojo de mar C. rogercresseyi o L. salmonis.
5. La composición según la reivindicación 1 , que se caracteriza por ser efectiva para el control de las infestaciones por garrapatas y/o piojos de mar y/o la transmisión de sus patógenos asociados.
6. La composición según las reivindicaciones 1 y 2 donde dicho péptido se obtiene por vía recombinante o síntesis química.
7. La composición según la reivindicación 6 donde la obtención del péptido por vía recombinante se logra mediante un sistema de expresión en levaduras, bacterias, plantas, larvas de insectos, células de insectos o células de mamíferos.
8. La composición según la reivindicación 1 que adicionalmente comprende un adyuvante vacunal.
9. La composición según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizada porque se administra por inyección, en un rango de 0,001-25 μg de péptido/g de peso del animal vacunado; mediante formulaciones de pienso en un rango de 0,01-300 μg de péptido/g de pienso o mediante baños de inmersión para peces en un rango de 0,01-10 mg de péptido/L de agua.
10. Composición vacunal para el control de las infestaciones por ectoparásitos que comprende ácidos nucleicos que codifican para un péptido de la proteína ribosomal P0 de dichos ectoparásitos, correspondiente a la región entre los aminoácidos 267 y 301 de la proteína, y que genera una respuesta inmune contra dicho péptido mediante inmunización con ADN desnudo.
11. La composición según la reivindicación 10 donde dicho péptido tiene una secuencia aminoacídica identificada como SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9 o SEQ ID NO. 10, es un fragmento de dichas secuencias, o es un péptido o polipéptido que exhibe al menos una identidad del 70 % con dichas secuencias.
12. Uso de un péptido de la proteína ribosomal P0 de ectoparásitos, correspondiente a la región entre los aminoácidos 267 y 301 de dicha proteína, en la fabricación de una composición vacunal para el control de las infestaciones por ectoparásitos o la transmisión de los patógenos asociados a los mismos.
13. El uso de la reivindicación 12 donde dicho péptido tiene una secuencia aminoacídica identificada como SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9 o SEQ ID NO. 10, es un fragmento de dichas secuencias, o es un péptido o polipéptido que exhibe al menos una identidad del 70 % con dichas secuencias.
14. El uso de la reivindicación 12 donde la composición vacunal se administra por inyección, en un rango de 0,001-25 μg de péptido/g de peso del animal vacunado; mediante formulaciones de pienso en un rango de 0,01-300 μg de péptido/g de pienso o mediante baños de inmersión para peces en un rango de 0,01-10 mg de péptido/L de agua.
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