MX2012006574A - Inmunogenos, proceso para preparacion y uso en sistemas de produccion de anticuerpos policlonales. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden una secuencia de aminoácido de un fragmento H que corresponde a un fragmento de una proteína de unión a calcio excretada-secretada por gusanos adultos de Fasciola hepatica, seguido por una secuencia de aminoácido que corresponde a una proteína o fragmento de proteína no relacionada, composiciones farmacéuticas, vacunas y adyuvantes que contienen el inmunógeno, a un proceso para su preparación, otro proceso para la producción de anticuerpos y su uso. La presente invención se refiere a la preparación de inmunógenos por la adición de una secuencia peptídica. De este modo, la presente invención es útil para producir una respuesta inmune, con incremento en tituladores de anticuerpo específicos en suero contra proteínas u otros antígenos y puede ser aplicada en particular para la producción de anticuerpos policlonales específicos, inmunoterapia e inmunoprofilaxis. La adición del péptido a un antígeno diana, ya sea a través de la producción de proteínas recombinantes que contienen el polipéptido o por adición o fusión de este polipéptido con el antígeno diana, induce un incremento significante en la inmunogenicidad de estas moléculas, amplificando la respuesta inmune provocada por inyección de esta molécula en un sujeto susceptible a producir anticuerpos.

Description

INMUNÓGENOS, PROCESO PARA PREPARACIÓN Y USO EN SISTEMAS PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la preparación de inmunógenos, un proceso para su preparación y su uso en sistemas de expresión para la producción de proteínas recombinantes .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención describe una secuencia que se agrega conjugando, ya sea por métodos químicos o físicos, a un antígeno no relacionado, o a través de la incorporación en un antígeno recombinante o en una cadena de ADN plasmídico que contiene la secuencia no relacionada para el antígeno con el propósito de desarrollar una respuesta inmune contra el antígeno no relacionado.

La presente invención describe un nuevo adyuvante cuya aplicación puede conducir a la producción de inmunógenos (que incluyen proteínas recombinantes que contienen la secuencia peptídica) que inducen una respuesta inmune caracterizada por la producción de anticuerpos específicos. En esta solicitud los fragmentos no relacionados desarrollan características inmunológicas (para antígenos pobremente inmunogénicos ) que conducen al desarrollo, simplemente por su administración al hospedero, de una respuesta inmunológica por el hospedero, caracterizada en particular por la producción de inmunoglobulinas especificas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN El propósito de la presente invención es describir un proceso para producir inmunógenos que resultan de la adición del péptido con la secuencia: MPSVQEVEKLL llamada fragmento H, derivado de una proteina de unión a calcio de Fasciola hepática , a un antigeno no relacionado. La construcción resultante tiene características inmunogénicas que desencadenan una respuesta inmune cuando se administra a un individuo, caracterizada por la producción de anticuerpos específicos contra el antígeno no relacionado.

La presente invención es útil para cualquier aplicación con el propósito de producir una respuesta inmune contra un antígeno por un individuo, por la administración de un inmunógeno que consiste del fragmento H y el antígeno no relacionado. La presente invención describe una aplicación de un nuevo adyuvante que puede ser aplicado, tanto a niveles de investigación y desarrollo, como industriales, en áreas tales como en la producción de anticuerpos "monoclonales y policlonales , inmunoterapia e inmunoprofilaxis .

La presente invención representa una alternativa a los adyuvantes actuales y, cuando se usa en sistemas para expresión de antigenos recombinantes permite la producción de proteínas con características inmunogénicas que, sin algún otro aditivo, conducen al desarrollo de una respuesta inmune en un individuo que es capaz de desarrollar una respuesta inmune. Actualmente, uno de los mayores desafíos en el desarrollo de anticuerpos es obtener un antígeno suficientemente inmunogénico para desarrollar la respuesta inmune. Cuando el antígeno no es o es pobremente inmunogénico, se usa la administración del antígeno con adyuvantes para mejorar la respuesta inmune. Estos adyuvantes son potencialmente tóxicos, pueden causar dolor en el hospedero inyectado y por lo tanto su uso es muy desalentador, o en muchos adyuvantes es incluso prohibido. La ventaja de las aplicaciones actuales reside en este punto en el estado de la técnica, puesto que describe una metodología que permite la obtención de antígenos modificados con características inmunogénicas para desarrollar una respuesta inmune sin el uso de adyuvantes.

Uno de los objetivos de la presente invención es la descripción de un inmunógeno comprendido por: parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína de unión a calcio excretada/secretada por gusanos adultos de Fasciola hepática con la secuencia idéntica o al menos 90% estructuralmente similar a la SEC ID NO 2, designada por fragmento H; una proteína o fragmento de proteína no relacionada de interés.

Otra implementación preferencial de la presente invención es que la proteína o fragmento de proteína de interés es una proteína patogénica tal como una proteína viral, una proteína bacteriana o una proteína de protozoario. Aún más preferiblemente, la proteína o fragmento, de proteína de interés puede ser la C G, CD4, IL5, Pfsp, Ent, PAL, CP12, LEC, BG o las proteínas Toxo o fragmentos proteicos.

En una realización preferencial adicional los inmunógenos descritos anteriormente se pueden usar como medicinas. Aún más preferencialmente se pueden usar como vacunas o adyuvantes. Se nota que en algunos casos aún más preferencialmente , se puede usar una vacuna que comprende solamente : parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína de unión a calcio excretada/secretada por gusanos adultos de Fasciola hepática con la secuencia idéntica o al menos 90% estructuralmente similar a la SEC ID NO 2, designada por fragmento H; una proteína o fragmento de proteína no relacionada de interés.

Otro objetivo preferencial es la descripción de composiciones que contienen los inmunogenos descritos anteriormente, y preferiblemente las composiciones pueden contener los inmunogenos en cantidades terapéuticamente efectivas y con un vehículo farmacológicamente adecuado, tal como excipientes, adyuvantes, entre otros.

En otra implementación preferencial, las composiciones pueden contener solamente 100% de uno de los inmunogenos descritos anteriormente.

En una realización aún más preferencial, las composiciones se pueden constituir por los siguientes elementos: por inmunogenos descritos anteriormente con concentración entre 1 a 100 \iq diluida en un volumen entre 100 a 1000 µ? de solución de fosfato amortiguada (fosfato 0.01M, NaCl 0.1M, pH 7.2) .

Otro objetivo de la presente invención es la descripción de un adyuvante que comprende uno de los inmunogenos descritos anteriormente o una de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente.

Se usó un adyuvante que contiene: el fragmento H agregado a los fragmentos CWG y CP12 entre 1 y 100 diluidos en un volumen entre 100 y 1000 µ? de amortiguador de fosfato - fosfato 0.01 , NaCl 0.1M, pH 7.2 administrado a ratones, esta administración induce un incremento en la intensidad y la velocidad con la cual se desarrolla una respuesta inmune contra fragmentos CWG y CP12 específicos.

Todavía otra modalidad de la presente invención es la descripción de una vacuna que incluye uno de los inmunógenos descritos anteriormente o una de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente. Se usó un adyuvante que contiene: el fragmento H agregado a los fragmentos CWG, BG y CP12 entre 1 y 100 diluido en un volumen entre 100 y 1000 µ? de amortiguador de fosfato -fosfato 0.01M, NaCl 0.1 , pH 7.2 administrado a ratones, la administración de esta vacuna reduce la intensidad de infección encontrada en la infección experimental por Cryptosporium y Giardia.

En aún otra implementación preferencial , se desarrolló un método para la preparación de inmunógenos descritos anteriormente el cual comprende la adición de un polipéptido de fragmento H no relacionado en cualquier posición en la secuencia correspondiente al polipéptido de interés, la adición del fragmento H al inicio, fin o en la localización del polipéptido de interés. Aún más preferencialmente se puede usar por varios fragmentos proteicos y/o proteínas tales como CWG, CD4, IL5, Pfsp, Ent, PAL, CP12, LEC, GB o Toxo.

En aún otra modalidad más preferencial , se describe un método para la producción de anticuerpos policlonales , aislados y purificados, o un fragmento funcional que es capaz de reconocer un inmunogeno como se describe anteriormente u obtiene por el método descrito anteriormente, en donde el método para obtener anticuerpos comprende las siguientes etapas: inmunización de un sujeto mamífero no humano con cualquiera de los inmunógenos descritos anteriormente o con una de las composiciones descritas anteriormente; selección de anticuerpos que son capaces de reconocer el inmunogeno descrito anteriormente u obtenido por el método de preparación de inmunógenos usando métodos descritos para este propósito. Por ejemplo, el uso de columnas de CNBr-sefarosa acopladas con el inmunogeno en el cual, por cromatografía de afinidad, se aislan los anticuerpos que reconocen el inmunogeno.

Así la presente invención es útil para producir una respuesta inmune, con incremento en niveles de anticuerpo específico en suero contra proteínas u otros antígenos y se puede aplicar, en particular, para la producción de anticuerpos específicos policlonales, inmunoterapia e inmunoprofilaxis , en la producción de vacunas, adyuvantes, métodos de diagnóstico y otras aplicaciones directamente obtenidas a través del desarrollo de una respuesta inmune específica.

La adición del polipéptido se dirige al fragmento H de la SEC ID No. 2, ya sea a través de la producción de proteínas recombinantes que contienen el polipéptido o por la adición o fusión de este polipéptido con el antígeno objetivo, induce un incremento significativo en la inmunogenicidad de estas moléculas, que permite amplificar la respuesta inmune provocada por inyección de esta molécula en un sujeto susceptible para producir anticuerpos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los antisueros son usualmente producidos por la inyección de un inmunógeno de interés en un animal, a menudo en combinación con un adyuvante para incrementar la respuesta inmune. La respuesta se puede incrementar por administraciones subsecuentes del antígeno, con o sin adyuvante. La cantidad de inmunógeno a ser administrada para producir la respuesta deseada varía extremadamente dependiendo de las especies y/o subespecies del animal usado, el adyuvante usado, la ruta de administración, frecuencia de inyecciones e inmunogenicidad de los mismos antígenos. La cantidad y calidad de los anticuerpos obtenidos depende del tamaño y condición del inmunógeno. Los polipéptidos y moléculas no protéicas pequeñas pueden requerir una combinación de proteínas más grandes para originar una respuesta inmune.

Un área de aplicación de las sustancias tipo adyuvante puede ser vacunologia. En general, varios cientos de compuestos naturales y sintéticos se identifican por tener actividad adyuvante. Parece que la toxicidad de estos es el principal obstáculo para su uso, incluyendo a nivel humano. La mayoría de los efectos secundarios ocasionados en la producción de anticuerpos policlonales , tanto en severidad como duración, se originan como resultado de la presencia del adyuvante .

Los adyuvantes se pueden usar con propósitos diferentes, incluyendo: mejorar la inmunogenicidad de un antígeno purificado o recombinante, reducir la cantidad del antígeno o el número de inmunizaciones requeridas para inducir inmunidad protectora, y mejorar la efectividad de la vacuna en recién nacidos, el adulto o individuos con un sistema inmunológico comprometido; como sistema de suministro del antígeno o absorción del antígeno a través de la mucosa. Los beneficios de incorporar el adyuvante en cualquier formulación deben ser balanceados con el riesgo de reacciones adversas. Uno de los grandes retos en la búsqueda de un adyuvante es incrementar el poder y minimizar la toxicidad.

Debido a los efectos de tamaño, la carga eléctrica e hidrofobicidad, los cuales regulan la incorporación de proteínas en la formulación del adyuvante, es difícil pronosticar cual podrá ser el adyuvante más efectivo para una proteina o péptido particular. Además, pueden ocurrir cambios en los epítopos durante la formulación o combinación. En el caso de proteínas de transporte, la existencia de inmunidad hacia la proteína es una limitación principal. Además, cada adyuvante genera una respuesta inmune característica. El uso incrementado de vacunas compuestas de subunidades recombinantes ha hecho la necesidad de mejorar el procesamiento una prioridad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 - Caracterización de la proteína de unión a calcio FH8 y del fragmento H del péptido. Fh8, la secuencia de aminoácido deducido para el polipéptido FH8 (SEC ID NO 1), Frag H, secuencia de aminoácido deducida para el polipéptido referido como fragmento H (SEC ID NO 2) .

Figura 2 - Esquema de subclonación usado para evaluar el efecto del fragmento H en la inducción de la respuesta inmune.

Figura 3 - Resultados de las demostraciones realizadas con los constructos que contienen el fragmento CWG. 3A - SDS-PAGE Tris-Tricina teñida con Azul Coomassie. PM - Marcador de preteñido SDS-PAGE estándar (BioRad) . Pozos Fl, F2 - Fracciones 1, 2 de CWG recolectado de la columna Ni-NTA; Pozos F4, F5 - Fracciones 1, 2 de HCWG recolectadas de la columna Ni-NTA. Pozos F7, F8 - Fracciones 1, 2 de FCWG recolectadas de la columna Ni-NTA. 3B - Densidades ópticas de ELISA realizadas con suero de ratones CDl inoculados con CWG (grupo CWG) , HCWG (grupo HCWG) FCWG (grupo FCWG) y CDl sin tratamiento (Grupo Neg) . Los valores representan el promedio de densidades ópticas de 3 CDl usados en cada grupo. Los CDl se inoculan periódicamente y se lleva a cabo la recolección de suero periódicamente, de conformidad con el protocolo descrito en la Tabla 2, a) Resultados obtenidos con placas que contienen el antigeno recombinante CWG b) Resultados obtenidos con placas que contienen el antigeno recombinante HCWG; 3C - Resultados de las densidades ópticas de ELISA realizadas con suero recolectado de ratones CDl 83 días después de la última inoculación con CWG (grupo CWG) , HCWG (grupo HCWG) FCWG (grupo FCWG) y CDl sin tratamiento (Grupo Neg) . Los valores representan el promedio de densidades ópticas de 3 CDl usados en cada grupo. 3D - Inmunoblots realizados con una membrana de nitrocelulosa que contienen el antigeno recombinante FCWG. FG - antigeno de membrana de nitrocelulosa FCWG teñido con solución de Schwartz. PM -Pesos moleculares. Combinaciones de suero del grupo negativo (a y d) , el grupo inoculado con CWG (b y e) e inoculado con HCWG (c y f ) , de las recolecciones realizadas 9 días después de la 5ta. IP (a, b y c) y después de la 6ta. IP (d, e y f) diluidas a 1/200 se incubaron con una tira de NC que contiene el antigeno FCWG ON a 4°C. g y h) inmunoblots realizados con suero negativo de conejo (g) e inmunizados nuevamente con el antigeno F (h) diluido a 1/100. Como conjugado se usó la proteina G-HRP diluida a 1/1000 se procedió a la revelación con 4-cloro-naftol . 3E - Inmunofluorescencia de Giardia lamblia con suero de ratones del grupo HC G. a) microscopio de luz, una amplificación de 20x. b) microscopio UV con amplificación 20x. La flecha indica un quiste de Giardia lamblia.

Figura 4 - Resultados de las demostraciones realizadas con los constructos que contienen el fragmento CP12. 4A - geles SDS-PAGE Tris-Tricina teñidos con Azul Coomassie. PM - Marcadores preteñidos con SDS-PAGE estándar (BioRad) . (a) Fracciones 1, 2 y 3 de CP12 recolectadas de la columna Ni-NTA. (b) Fracciones 1, 2 de HCP12 recolectadas de la columna Ni-NTA. (c) Fracciones 1, 2 de FCP12 recolectadas de la columna de Ni-NTA; 4B - Densidades ópticas de ELISA realizadas con suero de ratones CDl estimulados con CP12 (grupo CP12), HCP12 (grupo HCP12) y CDl sin tratamiento (Grupo NEG) . Los valores representan el promedio de densidades ópticas de 3 CDl usados en cada grupo. Los CDl se inocularon periódicamente y se llevaron a recolección de suero periódicamente, de conformidad con el protocolo descrito en la Tabla 2, a) Resultados obtenidos con placas que contienen el antigeno recombinante CP12, b) Resultados obtenidos con placas que contienen el antigeno recombinante HCP12; 4C - Inmunoblots realizados con una membrana de nitrocelulosa que contiene el antigeno recombinante FCP12. FC - membrana de nitrocelulosa que contiene el antigeno FCP12 teñida con solución de Schwartz. PM - Pesos moleculares. Suero recolectado después de la 8va. IP del grupo negativo (g, h e i), del grupo inoculado con CP12 (d, e y f) e inoculado con HCP12 (a, b y c) , diluido a 1/1000, se incubó con una tira que contiene el NC con el antigeno FCP12 ON a 4°C. Como conjugado se usó la proteina G-HRP diluida 1/1000 y se procedió a revelación con 4-cloro-naftol . La flecha blanca indica la localización del antigeno FCP12 determinado por inmunoblots realizados con suero de conejos inmunizados contra el antigeno F. 4D - Inmunofluorescencia de Cryptosporidium parvum en suero de ratones inmunizados con la proteina HCP12, amplificación de 20X.

Figura 5 - Resultados de las demostraciones realizadas con los constructos que contienen el fragmento BG. 5A - Gel SDS-PAGE Tris-Tricina teñido con Azul Coomassie. PM - Marcadores preteñidos con SDS-PAGE estándar (BioRad) . Pozos Fl, F2 - Fracciones 1, 2 de BG recolectadas de la columna Ni-NTA; Pozos F4, F5 - Fracciones 1, 2 de HBG recolectadas de la columna Ni-NTA; 5B - Densidades ópticas de ELISA realizadas con suero de ratones CD1 inoculados con HBG (grupo HBG) y CD1 sin algún tratamiento (Grupo NEG) . Los valores representan el promedio de densidades ópticas de 3 CD1 usados. Los CD1 se inocularon periódicamente y se llevaron a recolección de suero periódicamente, de conformidad con el protocolo descrito en la Tabla 2. 5C -Inmunoblots realizados con una membrana de nitrocelulosa que contiene el antigeno recombinante BG. BG - membrana de nitrocelulosa que contiene el antigeno GB teñido con solución Schwartz. PM - pesos moleculares. Suero recolectado después de la 7ma. IP del grupo negativo (d, e y f) del grupo inoculado con HBG (a, b y c) , diluido a 1/1000, se incubó con una tira de NC que contiene al antigeno BG ON a 4°C. Como conjugado se usó la proteina G-HRP diluida 1/1000 y se procesó para revelación con 4-cloro-naftol . 5D Inmunofluorescencia con Giardia lamblia usando suero de ratones del grupo HBG. a) microscopio normal, una amplificación de 40x. b) microscopio UV con amplificación de 40x. La flecha indica dos trofozoitos de Giardia lamblia.

Figura 6 - Resultados de las demostraciones realizadas con los constructos que contienen el fragmento Ent . 6A - Densidades ópticas de ELISA realizadas con suero de ratones inoculados con HEnt CD1 (grupo HEnt) y CD1 sin tratamiento (Grupo NEG) . Los valores representan el promedio de densidades ópticas de 3 CDl usados. Los CDl se inocularon periódicamente y se llevaron a recolección de suero periódicamente, de conformidad con el protocolo descrito- en la Tabla 2, 6B - Inmunoblots realizados con una membrana de nitrocelulosa que contiene el antigeno recombinante Fent. Fent - membrana de nitrocelulosa que contiene el antígeno Fent teñida con solución de Schwartz. PM - Pesos moleculares. Suero recolectado después de la 7ma . IP del grupo negativo (a, b y c) y del grupo inoculado con HEnt (d, e y f ) , diluido a 1/1000, se incubó con una tira de NC que contiene el antigeno FEnt ON a 4°C. Como conjugado se usó la proteina G-HRP diluida 1/1000 y se procedió a revelación con 4-cloro-naftol. La flecha blanca indica la localización del antigeno determinado por inmunoblots FEnt realizados con suero de conejos inmunizados contra el antigeno F. 6C Inmunofluorescencia con trofozoitos de Entamoeba histolytica usando suero de ratones inmunizados con HENT, amplificación de 20X.

Figura 7 - Resultados de las demostraciones realizadas con los constructos que contienen el fragmento Pfsp. 7A - Densidades ópticas de ELISA realizadas con suero de ratones CDl inoculados con HPfsp (grupo HPfsp) y CDl sin algún tratamiento (Grupo NEG) . Los valores representan el promedio de densidades ópticas de 3 CD1 usados. Los CD1 se inoculan periódicamente y se llevó a cabo la recolección de suero periódicamente, de conformidad con el protocolo descrito en la Tabla 2, 7B - Inmunoblots realizados con una membrana de nitrocelulosa que contienen el antigeno recombinante FPfsp. Combinaciones de suero del grupo negativo (c) , del grupo inoculado con HPfsp (d y f ) recolectado realizado después de la 6ta. IP (d) y 14 días después de la 7ma . IP (f) diluido a 1/200, se incubaron con una tira de NC que contiene el antigeno FPfsp ON a 4°C. b) inmunoblots realizados con suero del conejo negativo (a) e inmunizados contra el antigeno F (b) diluido a 1/100. Como conjugado se usó la proteina G-HRP diluida a 1/1000 se procedió a la revelación con 4-cloro-naftol .

Figura 8 - Resultados de las demostraciones realizadas con los constructos que contienen el fragmento IL5. 8A - Densidades ópticas de ELISA realizadas con suero de ratones CD1 inoculados con IL5 (grupo HIL5) y CD1 sin tratamiento (Grupo NEG) . Los valores representan el promedio de densidades ópticas de 3 CD1 usados. Los CD1 se inocularon periódicamente y se llevaron a recolección de suero periódicamente, de conformidad con el protocolo descrito en la Tabla 2. 8B - Inmunoblots realizados con una membrana de nitrocelulosa que contiene el antigeno recombinante FIL5.

FIL5 - membrana de nitrocelulosa que contiene el antigeno FIL5 teñida con solución de Schwartz. PM - Pesos moleculares. Suero recolectado después de la 6ta. IP del grupo negativo (a, b y c) y del grupo inoculado con HIL5 (d, e) , diluido a 1/1000, se incubaron con una tira de NC que contiene el antigeno FIL5 ON a 4°C. Como conjugado se usó la proteina G-HRP diluida 1/1000 y se procedió a revelación con 4-cloro-naftol. La flecha blanca indica la localización del antigeno FIL5 determinado por inmunoblots realizados con suero de conejos inmunizados contra el antigeno F.

Figura 9 - Resultados de las demostraciones realizadas con los constructos que contienen el fragmento Toxo. 9A - Densidades ópticas de ELISA realizadas con suero de ratones CD1 inoculados con HToxo (grupo HToxo) y CD1 sin algún tratamiento (Grupo NEG) . Los valores representan el promedio de densidades ópticas de 3 CDl usados. Los CD1 se inoculan periódicamente y se llevó a cabo la recolección de suero periódicamente, de conformidad con el protocolo descrito en la Tabla 2. 9B - Inmunoblots realizados con una membrana de nitrocelulosa que contienen el antigeno Toxo recombinante . Toxo - membrana de nitrocelulosa que contiene el antigeno BG teñida con solución de Schwartz. PM - Pesos moleculares. Suero recolectado después de la 4ta. IP del grupo negativo (a, b y c) , grupo inoculado con HToxo (d, e y f ) , diluido a 1/1000, se incubaron con una tira de NC que contiene el antigeno Toxo ON a 4°C. Como conjugado se usó la proteina G-HRP diluida 1/1000 y se procedió a revelación con 4-cloro-naftol .

Figura 10 - Resultados de las demostraciones realizadas con los constructos que contienen el fragmento CD4. 10A - Densidades ópticas de ELISA realizadas con suero de ratones CDl inoculados con HCD4 (grupo HCD4) y CDl sin algún tratamiento (Grupo NEG) . Los valores representan el promedio de densidades ópticas de 3 CDl. Los CDl se inoculan periódicamente y se llevó a cabo la recolección de suero periódicamente, de conformidad con el protocolo descrito en la Tabla 2. 10B - Inmunoblots realizados con una membrana de nitrocelulosa que contienen el antigeno recombinante CD4. CD4 - membrana de nitrocelulosa que contiene el antigeno CD4 teñida con solución de Schwartz. PM - Pesos moleculares. Combinaciones de suero del grupo negativo (a) , del grupo inoculado con HCD4 (b) recolectado realizado después de 14 dias después de la 7ma. IP, diluido a 1/500, se incubaron con una tira de NC que contiene el antigeno CD4 ON a 4°C. Como conjugado se usó la proteina G-HRP diluida a 1/1000 y se procedió a la revelación con 4-cloro-naftol .

Figura 11 - Resultados de las demostraciones realizadas con los constructos que contienen el fragmento PAL. 11A - Densidades ópticas de ELISA realizadas con suero de ratones inoculados con HPAL CD1 (grupo HPAL) y CD1 sin algún tratamiento (Grupo NEG) . Los valores representan el promedio de densidades ópticas de 3 CD1 usados. Los CD1 se inoculan periódicamente y se llevó a cabo la recolección de suero periódicamente, de conformidad con el protocolo descrito en la Tabla 2. 11B - Inmunoblots realizados con una membrana de nitrocelulosa que contienen el antigeno recombinante HPAL. HPAL - membrana de nitrocelulosa que contiene el antigeno HPAL teñida con solución de Schwartz. PM - Pesos moleculares. Suero recolectado después de la 4ta. IP del grupo negativo (a, b y c) , el grupo inoculado con HPAL (d, e y f ) , diluido a 1/4000, se incubaron con una tira de NC que contiene el antigeno HPAL ON a 4°C. Como conjugado se usó la proteina G-HRP diluida a 1/1000 y se procedió a la revelación con 4-cloro-naftol .

Figura 12 - Resultados de las demostraciones realizadas con los constructos que contienen el fragmento LEC . 12A - Densidades ópticas de ELISA realizadas con suero de ratones CD1 inoculados con HLEC (grupo HLEC) y CD1 sin algún tratamiento (Grupo NEG) . Los valores representan el promedio de densidades ópticas de 3 CD1 usados. Los CD1 se inoculan periódicamente y se llevó a cabo la recolección de suero periódicamente, de conformidad con el protocolo descrito en la Tabla 2. 12B - Inmunoblots realizados con una membrana de nitrocelulosa que contienen el antígeno recombinante HLEC. HLEC - membrana de nitrocelulosa que contiene el antigeno HLEC teñida con solución de Schwartz. PM - Pesos moleculares. Suero recolectado después de la 6ta. IP del grupo negativo (a, b y c) y el grupo inoculado con HLEC (d, e) , diluido a 1/1000, se incubaron con una tira de NC que contiene el antígeno HLEC ON a 4°C. Como conjugado se usó la proteína G-HRP diluida a 1/1000 y se procedió a la revelación con 4-cloro-naftol .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a proteínas fusionadas que comprenden la estructura: (1) parte de la secuencia de aminoácido de proteínas de unión a calcio, excretada/secretada por gusanos adultos de Fasciola hepática, y una proteína o fragmento de proteína no relacionada de interés .

Es también el objeto de la presente invención, un proceso para la preparación de estas proteínas fusionadas que permiten un incremento dramático de la respuesta inmune de animales contra el fragmento de proteína no relacionada.

La adición de piezas pequeñas de proteínas de unión a calcio del helminto de Fasciola hepática , en lo sucesivo designado como fragmentos H (SEC ID NO 2) o secuencias similares, preferiblemente al menos con 90 hasta 95% de homología, preferiblemente con 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de similitud, a fragmentos de proteína o proteínas no relacionadas conduce a un incremento significativo en los niveles de inmunogenicidad de polipéptidos .

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a una proteína fusionada que comprende una secuencia de aminoácido con la estructura del fragmento H, seguido por una secuencia de aminoácido estructuralmente similar a un fragmento de proteina o proteína no relacionada.

Otro aspecto de la invención se refiere a un vector de expresión caracterizado porque comprende una secuencia de polinucleótido que codifica las proteínas fusionadas. Aún otro aspecto de la invención, se refiere a la preparación del antígeno para inyección en un animal capaz de desarrollar una respuesta inmune. La presente invención se refiere a un proceso de administración de antígenos recombinantes a animales que pueden desarrollar una respuesta inmune.

La invención también se refiere al uso de esta proteina de fusión para la producción de anticuerpos policlonales específicos a las proteínas o fragmentos de proteína agregados. La producción de estas proteínas de fusión puede dramáticamente incrementar la inmunogenicidad de los fragmentos o proteínas agregados, con ello incrementado su uso tanto para la investigación como desarrollo para propósitos industriales.

La inducción de la respuesta inmune específica contra un antígeno es un proceso complejo que involucra una amplia variedad de células y mecanismos, con frecuencia con actividades conflictivas . El desarrollo de metodologías que pueden conducir a la producción de un antígeno capaz de inducir una respuesta inmune más intensa, debido a las aplicaciones potenciales tanto en R & D así como también al' nivel industrial, en áreas tan importantes como el desarrollo de vacunas, diagnósticos, inmunoterapias , etc., ha sido una constante de ello en evolución. Aunque se conocen varias sustancias, tales como adyuvantes para incrementar significativamente la respuesta inmune producida contra un antígeno objetivo, muchos de estas tienen efectos secundarios que limitan su uso. Por otra parte, aún no se ha desarrollado una aplicación que permite el incremento endógeno de inmunogenicidad de un antígeno objetivo.

Se describe una invención que tiene, como característica principal, permitir el incremento en la inmunogenicidad de la molécula objetivo, después de la adición de una secuencia peptídica (fragmento H) . Se describen como ejemplos, la aplicación de esta invención en la producción de proteínas recombinantes en las cuales el antígeno objetivo se produce con esta etiqueta. Esta construcción permite el incremento significativo en la inmunogenicidad del antígeno objetivo.

La presente invención se refiere a antígenos fusionados con secuencias de aminoácido presentes en proteínas de unión a calcio excretadas-secretadas por gusanos adultos de Fasciola hepática , en particular la proteína llamada FH8 o fasciolina (Número de Genbank AF213970) . Esta estrategia puede incrementar los niveles de inmunogenicidad de antígenos que se fusionan a los fragmentos H, y esta inmunogenicidad incrementada conduce a una mejora en la inducción de una respuesta inmune por individuos a quienes se les administra. Este sistema puede incrementar significativamente los niveles de inmunogenicidad del antígeno de interés permitiendo el desarrollo por el individuo al cual se le administra de una respuesta inmune más intensa, incluyendo la producción de anticuerpos específicos contra el antígeno de interés. Este proceso permite el uso de antígenos inmunogénicos bajos, que incluyen péptidos, en la producción de anticuerpos policlonales, vacunación, inmunoterapia u otras aplicaciones que pueden resultar del desarrollo de una respuesta inmune específica.

Las características inmunológicas del antígeno resultante a partir de la adición del fragmento H con el antigeno de interés, permiten el desarrollo de una respuesta especifica contra el antigeno de interés sin la presencia de una respuesta significativo contra el fragmento H. La respuesta inmune ocurre después de la inyección del inmunógeno sin otros aditivos, incluyendo la presencia de otros adyuvantes, el antigeno se puede administrar desnaturalizado o no. Los resultados en apoyo a esta invención se refieren a demostraciones usando el fragmento amino-terminal de 11 aminoácidos de la proteina FH8 para incrementar la inmunogenicidad de proteínas o fragmentos de proteina no relacionada que se usan como un ejemplo. Estos procedimientos pueden ser, sin embargo, potencialmente extendidos a cualquier polipéptido. Las demostraciones descritas se basan en la producción de proteínas recombinantes que contienen la secuencia N-terminal que corresponde al fragmento H. Este modelo de solicitud potencia el uso de esta invención ya que no requiere la combinación del péptido por métodos químicos o físicos. Esta solicitud también mejora el uso de sistemas de producción de antígenos recombinantes para producir inmunógenos recombinantes en particular para uso en la producción de anticuerpos policlonales y preparación de vacunas.

Las declaraciones descritas para validar la solicitud se basan en el uso del vector pQE (QIAGEN) , comúnmente usado para propósitos de investigación. Los varios constructos se subclonaron en el vector de expresión en Escherichia coli pQE (Qiagen) , el cual resulta en la producción de proteínas recombinantes expresadas en la siguiente secuencia N-terminal de 6 histidinas, esta producción realizada en E. coli M15 (pREP4) (Qiagen), permite su aislamiento por cromatografía de afinidad con una columna de agarosa NINTA (Qiagen) , con base en protocolos proporcionados por el fabricante (Castro, 2001, Silva and al., 2004) . Todos los productos se hicieron usando este sistema, y se realizó el aislamiento del antígeno recombinante bajo condiciones de desnaturalización para permitir el aislamiento más efectivo.

Para la producción y aislamiento de la proteína de interés es posible usar cualquier sistema de expresión y aislamiento de proteína recombinante, siempre que no comprometa la exposición del fragmento H en el sistema inmune. El sistema usado para obtener las construcciones debe ser visto como el vehículo usado en la investigación para obtener altas cantidades de proteína necesarias para demostraciones experimentales.

La misma metodología puede ser usada en otros sistemas de producción de proteína, en particular sistemas eucarióticos o fúngicos.

Los resultados se refieren a los ejemplos usando el fragmento H de FH8 (SEC ID NO 1 y 2) .

Uno de los principios de la invención se caracteriza por la adición de los fragmentos H, que corresponden a la secuencia del fragmento N-terminal de FH8, específicamente la adición del polipéptido de la SEC ID NO 2, por procesos de biología molecular, antes de que la secuencia polipeptídica pretenda usarlo como inmunógeno. Estas construcciones pueden ser realizadas por la inclusión de esta secuencia por técnicas de biología molecular, que incluyen usar enzimas de restricción apropiadas para agregar este fragmento en sitios de restricción apropiados, metodología usada en las demostraciones descritas, o por otros procesos tales como agregar fragmentos de ADN con la secuencia de interés ( enlazadores ) a un producto de PCR u otros procedimientos. La amplitud reducida del fragmento H permite el uso de una variedad de estrategias para la fusión con el polipéptido de interés.

Otra posibilidad para la construcción es la preparación de una proteína fusionada usando el polipéptido que corresponde a la secuencia del polipéptido FH8 a ser manufacturado. El proceso de insertar el siguiente FH8 puede ser realizado usando las técnicas de biología molecular, que incluyen el uso de enzimas de restricción, una metodología usada en el proceso de demostración.

La invención ha sido aplicada a varios fragmentos y proteínas con diferentes características inmunogénicas , que incluyen proteínas o fragmentos descritos como no o pobremente inmunogénicos como CWG, CD4, o fragmentos que, debido a sus características, que incluyen su peso molecular podrían ser menos inmunogénicos, tales como IL5, Pfsp y Ent, proteínas descritas como muy inmunogénicas como PAL, y proteínas y fragmentos proteicos moderadamente inmunogénicos, tales como CP12 y LEC, así como también otros objetivos con características desconocidas tales como BG y Toxo . También se aplicó a través de los experimentos varios protocolos diferentes que varían en concentración de proteína de administraciones dadas al ratón y los periodos de tiempo entre estas. Estos varios protocolos se usaron para demostrar la versatilidad de la invención. También se evaluó la posibilidad de administrar el antígeno bajo condiciones desnaturalizantes, como en el caso de LEC o en no desnaturalización, como el caso de los fragmentos y proteínas restantes. Para todas las demostraciones realizadas se usaron ratones como modelos experimentales y se realizó la administración de antígenos vía intraperitoneal . La producción de anticuerpos a objetivos CWP, IL5, Ent, Toxo, BG y CP12 también se evaluó en conejos usando administración subcutánea con resultados similares (no mostrados) . Los antigenos se produjeron y aislaron bajo condiciones de desnaturalización usando las mismas condiciones con resina de agarosa NINTA (QIAGEN) . Los antigenos se prepararon para inmunización después de la diálisis contra PBS y esterilización por filtración a través de un filtro de 0.22 µ· Para demostrar el efecto especifico ejercido por el fragmento al nivel de inmunogenicidad se usaron dos objetivos, es decir: - CWG: CWP (Proteina de la pared del quiste) proteina del quiste de Giardia lamblia. En la conclusión de los trabajos se usó una parte de la secuencia de C P2 de 427 pb, la secuencia original tiene 1089 pb y la región a ser amplificada se localiza 527 pb a 931 pb (GenBank acceso No. XM_001710190) . El fragmento se amplificó por PCR y subclonó en el vector pQE (CWP) , también se prepararon constructos que contienen el fragmento H seguido por CWP (HCWP) y que contiene la secuencia de FH8 fusionado con la secuencia del CWP (Fh8CWP). Se administraron inóculos con la misma cantidad de proteina (50 µ?) a intervalos descritos en la Tabla 2. Los resultados muestran la producción de niveles significativos de anti-CWP solamente en el grupo HCWP sibiles después de la 5ta. IP cuya presencia se mantuvo a través del resto del experimento, incluyendo 83 días después de la última administración de la proteína. Los blots hechos usando el antígeno Fh8C G confirman los resultados de ELISA y demuestran la especificidad de los anticuerpos producidos. El ensayo de inmunofluorescencia con el parásito mostró que los anticuerpos producidos reconocen la proteína nativa que existe en la pared de esta estructura.

- CP12: La CP12 es una proteína de la superficie de Cryptosporidium parvum. El fragmento CP12 (GenBank No. XM_625821) usado en este trabajo tiene 213 pb y corresponde a la secuencia de nucleotido de la proteína CP12 sin su dominio de la transmembrana. El fragmento se amplificó por PCR y subclonó en el vector pQE (CP12), también se prepararon constructos que contienen el fragmento H seguido por CP12 (HCP12). Los antígenos se produjeron y aislaron bajo condiciones de desnaturalización usando las mismas condiciones con resina agarosa NINTA (QIAGEN) . Se administraron inóculos con la misma cantidad de proteína (20 µg) con la periodicidad mostrada en la Tabla 2. Los resultados muestran un incremento significativo en la producción de anticuerpos entre los grupos CP12 y HCP12, tanto en intensidad como velocidad, estos niveles permanecen significativomente incrementados a través del experimento.

Los blots hechos con Fh8CP12 confirman los resultados de ELISA y demuestran la especificidad de los anticuerpos producidos. Los ensayos de inmunofluorescencia con el parásito muestran que los anticuerpos producidos reconocen que la proteina nativa existe en la pared de esta estructura.

Para los objetivos restantes se han preparados grupos inmunizados con la construcción que contiene la etiqueta H para demostrar la presencia de una respuesta inmune. Para los ejemplos descritos abajo, se amplificaron fragmentos por PCR con la excepción del fragmento LEC que se proporcionó por otras instituciones, y subclonó en el vector pQE que contiene el fragmento H seguido por el fragmento objetivo. Las condiciones para obtener tales fragmentos se describen en la Tabla 1.

- BG: Se subclonó la secuencia completa del gen de ß-Giardina de Giardia lamblia el cual tiene un tamaño de 850 pb, con una supresión (691 pb hasta 787 pb) (GenBank acceso No. X85985) , que codifica una proteina de 33 kDa. Se administraron inoculaciones con la misma cantidad de proteina (20 iq) con la periodicidad mostrada en la Tabla 2. Los resultados muestran un incremento significativo después de la nivelación de la 3ra. IP después de la 4ta IP. Los blots hechos con la proteina BG confirman la especificidad de los anticuerpos producidos. El mantenimiento de tituladores de anticuerpo se detectó aún 47 días después de la última inoculación hecha. Las pruebas de inmunofluorescencia con el parásito mostraron que los anticuerpos producidos reconocen la proteina nativa existente en la pared de esta estructura.

- Ent : El amplicón en funcionamiento tiene un tamaño del63 pb codificando una proteina con 5 kDa y está en la región entre 291 pb-453 pb de un gen con un tamaño de 455 pb (Sin acceso a GenBank XM_645825) de la pared del quiste de Entamoeba histolytica especifico de la glicoproteina Jacob. Se administraron inóculos con la misma cantidad de proteina (50 ]ig) con la periodicidad mostrada en la Tabla 2. Los resultados muestran un incremento significativo después de la 4ta. IP. Los blots hechos con la proteina Fh8Ent confirman la especificidad de los anticuerpos producidos. También se ha podido confirmar el mantenimiento de los tituladores de anticuerpo aún 90 días después de la última inoculación hecha. El ensayo de inmunofluorescencia con el parásito mostró que los anticuerpos producidos reconocen que la proteina nativa existe en la pared de esta estructura.

- Pfsp: En este estudio se usó una pequeña parte de la secuencia (165 pb) de falcipaina-1, la cual se insertó en la secuencia del precursor de proteinasa cisteina del trofozoito de Plasmodium falciparum 37D (1423 pb - 1587 pb) (N° acceso GenBank XM 001348691.1). Los inóculos se administraron con 50 \iq con la periodicidad mostrada en la Tabla 2. Los resultados muestran un incremento significativo después que la 4ta. IP alcanzó el titulo máximo después de la 7ma . IP. Se puede confirmar la presencia de anticuerpos específicos contra el fragmento Pfsp, 82 días después de la última inoculación. Los blots hechos con la proteína Fh8Pfsp confirman la especificidad de los anticuerpos producidos.

- IL5 : La interleucina humana 5 es un factor de crecimiento hematopoyético , que tiene una secuencia de nucleótido de 816 pb que codifica para 134 aminoácidos (GenBank No. BC069137.1). El fragmento usado para evaluación de IL5 es una parte muy pequeña de IL5, que consiste de 144 pb que corresponden a un exón del extremo 5' de IL5 que codifica para 48 aminoácidos. Se administraron inóculos con la misma cantidad de proteína (20 g) con la periodicidad mostrada en la Tabla 2. Los resultados muestran un incremento significativo después de la 4ta. IP. Los blots hechos con la proteína Fh8lL5 confirman la especificidad de los anticuerpos producidos .

- Toxo - La proteína Tox es una proteína de la pared del oocisto de Toxoplasma gondii con 1846 pb que codifica para 499 aminoácidos (GenBank No. EU851867.1). El fragmento Toxo corresponde al exón 2, entre los 2875 y 3238 pb. Se administraron inóculos con la misma cantidad de proteina (20 pg) con la periodicidad mostrada en la Tabla 2. Los resultados muestran un incremento significativo después de la 4ta. IP. Los blots hechos con la proteina Toxo confirman la especificidad de los anticuerpos producidos.

- CD : La proteina CD4 es un recipiente de la pared de linfocitos de Dicentrarchus labrax (GenBank No. AMB849812.1) . El fragmento CD4 corresponde a los dos dominios de este receptor entre 193 y 714 pb. Se administraron inóculos que contienen 30 pg con la periodicidad mostrada en la Tabla 2. Los resultados muestran un incremento significativo después de la 4ta. IP. Los blots hechos con la proteina CD4 confirman la especificidad de los anticuerpos producidos .

- PAL: La proteina PAL (precursor de lipoproteina asociado al Peptidoglicano) de Legionella pneumophila es una proteina de la pared de esta bacteria (GenBank No. YP001250824 ) . La PAL corresponde a la proteina completa. Se administró un inoculo con 30 \iq con la periodicidad mostrada en la Tabla 2. Los resultados muestran un incremento significativo después de la 2da. IP. Los blots hechos con la proteina PAL confirman la especificidad de los anticuerpos producidos .

- LEC: El fragmento de ADN de lectina de Artocarpus incisa con 846 pb contiene el lugar para las enzimas Sac I y Kpnl . Puesto que este antígeno es de actividad hemaglutinante potencial cuando está en una forma no desnaturalizante, se procedió con la preparación del inoculo de proteina bajo condiciones desnaturalizantes. Para eliminar la cantidad máxima de urea (concentración final menor de 10 mM) , se procedió con la diálisis contra amortiguador de PBS con 50 mM de urea y al tiempo de la preparación de la muestra se diluyó el antígeno en PBS y filtró a través de 0.22 µ. Se administró con un inoculo de 12.5 con la periodicidad mostrada en la Tabla 2. Los resultados muestran un incremento significativo después de la 4ta. IP. Los blots hechos con la proteína HLEC confirman la especificidad de los anticuerpos producidos.

En los ejemplos descritos anteriormente, la evaluación de la respuesta se realizó por ELISA usando el antígeno correspondiente. En procedimientos de blot se evaluó la respuesta al antígeno cuya producción fue más eficiente. Para el blot realizado con proteínas recombinantes que contienen la etiqueta FH8, debido a la posibilidad de formar polímeros, se procedió a la localización de la proteína recombinante con el anticuerpo policlonal específico para FH8. En muchos casos, se incluyó en el blot una tira de nitrocelulosa que contiene un antígeno con el fragmento H, usualmente el FH8 recombinante, para evaluación de la respuesta contra este fragmento y, aparte de la respuesta obtenida en el grupo inoculado con Fh8CWP, no se detectó la presencia de niveles significativos de anticuerpos anti-H.

En los ejemplos anteriores las inoculaciones fueron siempre hechas solamente por el antigeno diluido en PBS, con la excepción de HLEC cuyo inoculo consiste de 10 mM de urea en PBS.

Caracterización del antígeno y su fragmento FH8 H: El antigeno FH8 fue previamente aislado y caracterizado por elementos en la lista de inventores (Castro, 2001, Silva et al., 2004, Eguino et al., 1999) ( Figura 1 ) .

El aislamiento de Fh8 se llevó a cabo de la selección de un banco de ADNc de F. hepática (Figura 1) . Los clones codifican para un polipéptido de 69 aminoácidos con una masa molecular calculada de 8 kDa, la cual se designó por FH8 o fasciolina (número de Genbank AF213970) .

La proteina recombinante FH8 es producida a altos niveles de proteina en sistemas de expresión de E. coli con el vector pQE (> 5 mg/litro de cultivo) . Los estudios con mutantes FH8 conducen de manera hipotética que la secuencia N-terminal de este antigeno tiene un papel importante en la estabilidad de la proteina. La demostración de esta hipótesis originó la invención descrita en la Patente No. 20091000005031. Otra característica fue su alta inmunogenicidad, esta característica se extiende a otra familia de proteínas de unión a calcio, presentes en el extracto secretado por gusanos adultos de Fasciola hepática , la familia de FH22 (número E BL AJ003821, número EMBL AJ003822) . Ambos antígenos probaron ser capaces de inducir una respuesta inmune con tituladores de anticuerpo con alta especificidad (Castro, 2001, Silva et al., 2004). Estos resultados también sugieren su uso como una etiqueta para la producción de proteína recombinante con el objetivo de producir anticuerpos. La demostración de que el fragmento H fue esencial para la estabilidad del antígeno y que la adición de este fragmento a otras proteínas o fragmentos no relacionados permite un incremento en la producción de la proteína, presumiblemente debido a la estabilidad incrementada de la proteína fusionada, sugiriendo la hipótesis de que la adición del fragmento H, por las mismas razones, podría incrementar la inmunogenicidad de tal antígeno. Esta interferencia parece a partir del hecho de que la estabilidad de una proteína está frecuentemente relacionada con su inmunogenicidad. Esta hipótesis se confirmó por las demostraciones descritas anteriormente.

Cepas usadas En este estudio, se usaron cepas de Escherichia coli XL1 Blue (Stratagene) y Escherichia coli M15 [pREP4] (QIAGEN) para la clonación de los plásmidos pGE -T Easy (Promega) y plásmido pQE30 (QIAGEN), respectivamente.

Para la expresión de proteina se usó la cepa de Escherichia coli M15 [pREP4].

El ADN de plásmido se aisló y purificó por el Kit del Sistema de Purificación de ADN Wizard ® Plus SV inipreps de Promega, de cultivos bacterianos que crecen a 37 °C durante la noche, siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante .

Constructos El diseño de las construcciones usadas para evaluar el elemento estructural de 11 aminoácidos (fragmento H) como un factor de la inducción de inmunogenicidad de proteínas recombinantes se muestra en la Figura 2.

Los constructos mostrados en la Figura 2 se obtuvieron por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y clonaron en pGEM y después en pQE, se muestran en la Tabla 1, como se indica abajo. Los constructos referidos a otros antígenos usados para evaluar la respuesta inmune se obtuvieron por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y clonaron en pGEM y después en pQE, se muestran en la Tabla 1.

Las construcciones restantes se obtuvieron por técnicas de subclonacion descritas abajo.

PCR Los cebadores usados en la PCR se describen en la Tabla 1.

Para obtener los fragmentos H y Fh8RSac, que contienen los sitios de restricción BamHI y SacI, se usó como plantilla para la reacción de PCR el vector pQE30 que contiene el gen que codifica para el polipéptido FH8 (Castro, 2001, Silva et al., 2004) . La reacción de PCR comienza con una etapa de desnaturalización de 1 minuto a 95°C, seguido por 30 ciclos de amplificación, con 45 segundos de desnaturalización a 94°C, 30 segundos de templado a 50°C y 45 segundos de polimerización a 72°C. Se hizo una etapa de polimerización adicional por 11 minutos a 72°C.

Los fragmentos elegidos (CWG, CP12, BG, Ent, PFSP, IL5, Toxo, CD4, PAL y LEC) para valorar la capacidad de las proteínas recombinantes preparadas por la fusión de polipéptidos no relacionados con el fragmento H, para producir una respuesta inmune, como se mide la apariencia de anticuerpos específicos contra la proteína o fragmento en cuestión, se amplificaron por PCR. Esta reacción de PCR también se agregó a las enzimas de restricción SacI y Kpnl a sus fragmentos .

-¦ ..--Tabla 1. Lis a—de reacciones de PCR real zadas para obtener cons.tructos usados para evaluar l actividad del fragmento H, muestras de ADN, cebadores y programa de PCR 5 10 15 5 10 15 5 Oh- ención P-V.Para : 5 T A A G G¦-A- -G A .T del G A G C T c A T G A A A G C C 4 ' min. a 95°C, seg fragmento ADN genómico de -3' por 30 ciclos PAL amplificación (30 s Legionella pneumophila PALRev : 5' - A T T T T T T G C 95°C, 30 s a 55°C y G G T A C c T c A T C T T G T a 72°C) . 7 min. a 72° T G C -3 5 10 15 :.

¦ Tabla 2. Descripción del protocolo Reacciones de PCR, asi como también plantillas de ADN usadas para la preparación de los varios fragmentos se realizaron bajo las condiciones descritas en la Tabla 1. Para la preparación de ADN genómico se usó el kit para extraer el ADN, kit mini ADN QIAamp de QIAGEN siguiendo el protocolo del fabricante. El ciclizador térmico usado para todas las reacciones de PCR fue el Ciclizador Térmico y CyclerTM (BioRad) .

La mezcla de las reacciones de PCR llevadas a cabo consiste de 1 µ? de muestra (ADN plantilla) , 2 µ? de cloruro de magnesio, 1 µ? de dNTPs (Roche, 1 µ? de cebador delantero y 1 µ? de cebador reverso, 5 µ? de amortiguador de polimerasa Taq (Thermo Scientific) , 1 unidad/reacción de polimerasa Taq (Thermo Scientific) y agua destilada para completar un volumen final de 50 µ? .

Constructos elaborados con los ejemplos descritos : Los productos de PCR se clonaron en el vector pGEM y después de la digestión con las enzimas de restricción SacI y Kpnl se subclonaron en el vector pQE30, pQE30 que contiene el fragmento H (pQEH) o pQE30 que contiene el fragmento FH8 (pQEF) , digerido con SacI y Kpnl.

Extracción y purificación de ADN de geles de agarosa Para aislar los productos de PCR y bandas de ADN que resultan de la digestión con enzimas de restricción de electroforesis de gel, se usó el Kit de Purificación de Banda de Gel y ADN illustraTM GFX PCR (GE Healthcare) , siguiendo el procedimiento descrito por el fabricante.

Ligación al vector pGEM La reacción de unión al vector pGEM-T Easy consiste en el mezclado de 3 µ? de muestra de ADN (producto de PCR o digestión con las enzimas de restricción) , con 1 µ? del vector pGEM-T Easy (Promega), 5 µ? de amortiguador de enzima de ligasa de ADN 2X (Promega) y 1 µ? de enzima de ligasa de ADN T4 (Promega) a un volumen final de 10 µ? . Esta reacción ocurre a temperatura ambiente durante la noche o por 1 hora y 30 minutos a 37°C.

Confirmación de transformantes por digestión con enzimas de restricción Después de la reacción de ligasa con el vector pGEM, se transformó E. coli XL1 Blue con el producto. Las células entonces se dispersaron en placas de LB/Ampicilina/X-GAL/IPTG e incubaron durante la noche a 37 °C. Los clones transformados que se usaron para preparar los cultivos líquidos en LB/ampicilina y subsecuentemente para realizar la extracción de ADN del plásmido de E. coli.

La presencia de fragmentos de ADN de objetivo se realizaron por digestión con la enzima de restricción EcoRI (Promega), para cada reacción se usaron 7 µ? de ADN del plásmido, 2 µ? de amortiguador de H 10X y 1 µ? de EcoRI, dando un volumen final de 10 µ?. La reacción ocurrió por 2 hasta 3 horas a 37°C, y el resultado de la digestión se desplegó en gel de agarosa con porcentaje apropiado (p/v) . Ligación al vector pQE Los insertos que resultan de la digestión con las enzimas de restricción se insertaron en el vector pQE, pQEH o pQEFh8 mezclando 6 µ? del inserto con 2 µ? de vector pQE, 1 µ? de amortiguador de ligasa 10X (Promega) y 1 µ? de ligasa de ADN de enzima T4 (Promega) . Esta reacción ocurre a temperatura ambiente durante la noche o por 1 hora y 30 minutos a 37 °C.

Después de conectar el inserto con el vector, se transformaron E. coli M15 [pREP4] con el producto de la reacción. Las células entonces se dispersaron en placas de LB/Ampicilina/Canamicina e incubaron durante la noche a 37 °C. Los transformantes se transfirieron a cultivos líquidos de LB/ampicilina/canamicina y subsecuentemente usaron para extraer el ADN de plásmido de E. coli.

La confirmación de los transformantes se realizó por digestión con enzimas de restricción Kpnl y BamHI (Promega). Primero, se realizó digestión con Kpnl, mezclando 26 µ? de ADN de plásmido, 3 µ? de amortiguador de J 10X (Promega) y 1 µ? de Kpnl (Promega) para un volumen final de 30 µ?. 10 µ? de digestión se analizaron en gel de agarosa y posteriormente se procedió a la segunda digestión con BamHI, para tal propósito se agregaron a la primera reacción restante, 2 µ? de amortiguador K 10X (Promega) y 1 µ? de BamHI (Promega) . El resultado de la digestión se visualizó en gel de agarosa con porcentaje apropiado (w/v) .

Secuenciamiento de los constructos elaborados Todos los constructos elaborados con los insertos en los vectores pGEM y pQE se confirmaron por secuenciamiento en el Operón Eurofins M G (Alemania) .

Expresión y aislamiento de proteínas recombinantes Un precultivo de 200 mi, se puso a crecimiento durante la noche a 37 °C con agitación, y se usó para preparar 2 litros de cultivo inducido colocando 100 mi de cultivo saturado y 900 mi de medio LB que contiene 100 g/ml de ampicilina, 50 g/ml de canamicina y 1 mM de IPTG. Después de 5 horas de incubación se procedió a recolectar las células por centrifugación 20 minutos a 4000 rpm a 4°C. La lisis celular se realizó por incubación de las células con 40 mi de 8M de urea, pH 8.0, dejando bajo agitación durante la noche. El extracto se centrifugó a 13,000 rpm por 15 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante se recolectó. Después de la recuperación, el sobrenadante se filtró por una columna de lana de vidrio y aplicó a la columna de Ni-NTA (Amersham Biosciences) , pre-equilibrada con 8M de urea, pH 8.0.

El sobrendante se pasó por la columna por gravedad, la columna se lavó con 5 VC (volúmenes de columna) de amortiguador de 8 de urea, pH 8.0, seguido por 5 VC de amortiguador de 8M de urea con 10% de glicerol, pH 6.5. La elución se hizo con amortiguador de 8M de urea, pH 4.5, y se recolectaron fracciones de 4 mi. El contenido de proteina de las fracciones eluidas se cuantificó por el método Bradford y las fracciones se analizaron en SDS-PAGE Tris-Tricina, como se describe abajo.

Cuantificacion de proteína La cuantificacion de proteina se realizó por el método Bradford, con el reactivo de Ensayo de Proteina (BioRad) diluido 1:5, y para leer la densidad óptica a una longitud de onda de 595 nm. La curva de calibración se obtuvo leyendo la densidad óptica a 595 nm de soluciones de concentración conocida de albúmina de suero bovino (BSA) con este reactivo.

Preparación de inóculos : Las proteínas recombinantes usadas para las demostraciones descritas, excepto HLEC, se aislaron bajo condiciones de desnaturalización en 8M de urea. Después de la cuantificacion de la proteína y análisis de las fracciones, se procedió a diálisis extensiva contra amortiguador PBS preparado con agua no pirogénica. Después de la diálisis, se realizó la filtración de la proteína (bajo no desnaturalización) usando un filtro de 2.0 u para esterilizar. El volumen del inoculo fue alcanzado con un PBS no pirogénico estéril de 500 ul . La cantidad de proteina administrada varia entre diferentes muestras, entre 1 y 50 pg, como se describe anteriormente para cada caso.

La HLEC de proteina recombinante se preparó en 8M de urea y se dializó contra amortiguador de PBS que contiene 50 mM de urea, preparada con agua apirogénica, posteriormente los antigenos se concentraron usando membrana centricon (Amicon) con cortes de 3 kDa. Los inóculos se prepararon extemporáneamente diluyendo la proteina concentrada en el volumen apropiado de PBS estéril, no pirogénico, para asegurar que la concentración de urea es menor de 10 mM, y mantener la filtración del inoculo a través de un filtro pirogénico 0.2 µ.

Pruebas en ratones : Experimentos llevados a cabo en este trabajo se realizaron en modelos de ratones CD1 obtenidos de Charles River SA Barcelona. Los animales se alojaron y mantuvieron con alimento y bebida a albedrio. El mantenimiento y cuidado de los animales se hizo de conformidad con las normas existentes. Cada grupo consiste de 3 ratones y la inoculación se administró intraperitonealmente periódicamente, de conformidad con los protocolos descritos en la Tabla 2, el muestreado de sangre ha sido conducido periódicamente en la venta de la cola, de conformidad con los protocolos descritos en la Tabla 2. Después de la recolección de la sangre, el suero se obtuvo por centrifugación a 2500 rpm por 10 minutos y mantuvo a -20°C.

Electroforesis en gel de poliacrilamida de SDS-PAGE Tris-Tricina Los geles de Tris-Tricina usados para analizar las fracciones recolectadas se basan en el sistema de Tris-Tricina de Schagger, H. y Jagow, G. (1987) y SDS-PAGE de Laemmli (1970). De este modo, el sistema adoptado consiste de dos geles: un gel resolvente de 15% y un gel de envasado de 4%. El gel resolvente contiene 3.3 mi de 30% de acrilamida, 2.205 mi de gel, 705 mi de glicerol, 367.5 mi de agua, 150 µ? de PSA 10% y 9 µ? de TEMED. El gel envasado contiene 700 µ? de 30% de acrilamida, 1.25 mi de gel, 3 mi de agua, 200 µ? de 10% PSA y 5 µ? de TEMED.

El sistema de electroforesis usado se compone de dos reservorios, superior (de los geles) e inferior, en los cuales se colocaron el amortiguador de cátodo y amortiguador de ánodo, respectivamente. Se aplicó una diferencia de potencial (DDP) de 100 V el gel envasado y una ddp de 140 volts para el gel resolvente.

Las muestras (en condiciones nativas o desnaturalizante) antes de ser aplicadas al gel, se trataron con amortiguador de muestra Tris-Tricina IX. Las muestras en condiciones nativas también se colocaron en el baño a 100°C por 2 minutos, después de llegar a 4°C hasta que estén cargadas en el gel.

Los geles se tiñeron con Azul Coomassie.

Transferencia a membranas de nitrocelulosa Se sumergieron en amortiguador de transferencia (25 mM de Tris, 0.2 M de glicina, 100 mi de metanol) , 2 papeles filtro, la membrana de nitrocelulosa, el SDS-PAGE en el cual las proteínas se corrieron, y esponjas necesarias para montaje del intercalado. Después de remojarse en amortiguador se procedió a montar el intercalado, y se realizó transferencia usando el sistema TE 80 (Hoefer) . La transferencia tomó lugar en el amortiguador de transferencia, por 1 h a una diferencia de potencial constante de 80V.

Inmunoblot Después de la transferencia, 0.45 µt de membrana de nitrocelulosa (Schleicher & Schell) se saturaron con PBS-leche al 5%, por lh a temperatura ambiente. Se lavó la membrana con PBS 2X-0.3% de Tween (PBS-T). Se incubó la membrana con suero diluido en PBS-leche con la concentración apropiada, durante la noche a 4°C. Se lavó la membrana 3X con PBS-T. La proteína G-peroxidasa conjugada (Bio Rad) se agregó para diluir a 1/1000 en PBS-leche, e incubó a temperatura ambiente por 2 h. Se lavó la membrana 3X con PBS-T y reveló con 15 mg de 4-cloro-l-naftol disuelto en 5 mi de metanol frió, 20 mi de PBS y 25 µ? de 30% de H202.

Inmunoensayo por ELISA El recubrimiento de microplacas de poliestireno (Nunc) se realizó con 100 µ?/por cavidad de antigeno a 10 g/ml de antigeno en amortiguador de carbonato/bicarbonato 0.1 M a pH 9.5 ON a 4°C. Las cavidades se lavaron con PBS-T al 0.3%, después saturaron con 200 µ? de PBS-0.1% de gelatina por cavidad a 37 °C por 30 minutos en la cámara de humedad y se lavó nuevamente con PBS-T. Se agregaron a cada cavidad 100 µ? de suero diluido a 1/400 en PBS-T y pusieron a incubar en la cámara de humedad durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron 3X con PBS-T. Se agregaron a cada cavidad 100 µ? de peroxidasa acoplada a la proteina G (Biorad) diluida a 1/2000 en PBS-T, y pusieron a incubar por 1 h a 37 °C en la cámara de humedad. Las cavidades se lavaron 3X con PBS-T. La reacción de sustrato contiene 1 mg de OPD por mi de 0.2 M de fosfato a pH 5.6. Para cada mi de esta solución se agregaron 1 µ? de H202 al 30%. Se agregaron 100 µ? de sustrato por cavidad y la reacción se detuvo con 100 µ? de HCl 3M por cavidad.

La densidad óptica se leyó a 490 nm en una placa de ELISA Modelo 680 (Biorad) .

Inmunofulorescencia El material biológico para las pruebas, la inmunofluorescencia se obtuvo de muestras de agua y heces, en el caso de Cryptosporidium parvum (CP12) y Giardia lamblia (C G) , para Entamoeba histolytica (ENT) , se obtuvieron laminillas del proveedor Biomérieux diagnosis. En el caso de ß-Giardina (BG) , se usaron cultivos Axénicos de trofozoitos.

Para preparar las laminillas con material parasitario, se agregaron muestras de parásitos a cada cavidad de la laminilla para determina inmunofluorescencia y se dejó secar en el horno hasta que el sedimento permaneció fijo. Se agregaron dos gotas de acetona para secar completamente. Se dejó secar a temperatura ambiente más de cinco minutos más en el horno a 37 °C. Para la inmnunofluorescencia se agregaron 10 µ? de suero (anticuerpo primario) en la dilución correspondiente, y se dejó en la cámara de humedad a 37 °C aproximadamente 1 hora y se lavó 3X con PBS. El IgG anti-ratón conjugado etiquetado con FITC (Sigma) diluido en PBST se agregó a la laminilla e incubó en una cámara de humedad por 1 h a 37 °C. Las laminillas se lavaron. Se agregaron la solución contrastante (Evans blue) y después 10 µ? de medio de montaje. Las laminillas se observaron bajo un microscopio de inmunofluorescencia Nikon Optiphot .

Ejemplos Para un entendimiento más fácil de la invención se describen abajo ejemplos preferenciales de aplicación de la invención, los cuales, sin embargo, no están propuestos para limitar el alcance de esta invención.

El antigeno recombinante bajo estudio en este trabajo se caracteriza por inducir una respuesta inmune que puede ser valorada por la producción de anticuerpos policlonales específicos. Los estudios han indicado previamente que el fragmento H juega un papel clave en las características inmunológicas y estabilidad del antígeno FH8: los antígenos derivados de FH8 cuya secuencia H ha sido suprimida muestran una reducción drástica en su estabilidad e inmunogenicidad .

Las estrategias presentadas tenían, como punto de partida estas presunciones, los fragmentos se eligieron para variar ampliamente en su origen, naturaleza y características inmunológicas, así como también diferentes protocolos de aplicación propuestos para evaluar el uso de esta solicitud en la inducción de respuestas inmune específicas sin el uso de otros constituyentes (adyuvantes) que el antígeno mismo. Con este fin se procedió a la selección de fragmentos cuyas características inmunológicas en la presencia de adyuvantes, han sido previamente evaluadas, tales como CD4 y fragmentos CWG que han sido probados por ser pobremente inmunogénicos , los fragmentos CP12 y LEC, los cuales se mostraron por tener características inmunogénicas intermedias o el PAL que es un antígeno muy inmunogénico, o fragmentos, como fragmentos Ent, IL5 y Pfsp cuyas características bioquímicas, que incluyen familia de proteína, peso molecular y secuencia de aminoácido, determinan que podrían ser escasamente o nada inmunogénicas. Finalmente también se usaron fragmentos, tales como Toxo y BG en los cuales las características inmunológicas fueron completamente desconocidas. Para valorar el impacto actual del fragmento H en la inmunogenicidad del antígeno al cual se agrega, se condujeron demostraciones que valoran la capacidad para inducir una respuesta inmune por fragmentos CWG y CP12 en la ausencia y presencia del fragmento H.

Ejemplo 1 - Evaluación de la respuesta inmune en proteínas que resultan de los constructos con el fragmento CGN.

Después de obtener los constructos pQECWG, pQEHCWG y pQEFCWG se procedió a la producción y análisis de los antígenos recombinantes respectivos bajos condiciones de desnaturalización (Figura 3A) .

En el análisis de geles SDS-PAGE Tris-Tricina (Figura 3A) se puede ver que la proteína CWG tiene un peso molecular de 16 kDa, como se esperaba, mientras la proteina de fusión HCWG tiene un peso de aproximadamente 17 kDa y el antigeno recombinante FCWG tiene un peso de aproximadamente 24 kDa.

La demostración del efecto de la presencia del fragmento H en la inducción de una respuesta inmune especifica contra el C G ha sido realizada por inoculación con 3 grupos de ratones CD1 con 50 µg de antigeno CWG, HCWG y FCWG, regularmente (Tabla 2) por administración IP. Se usó también un grupo de 3 CD1 con las mismas características que no recibieron inoculación. Hubo una recolección regular de sangre (Tabla 2) para evaluación adicional de la presencia de Ig anti-CWP. La evaluación de la presencia de respuesta de anticuerpo específico se realizó por ELISA con placas que contienen antígenos CWG (Figura 3B.a) HCWG (Figura 3B.b) y FCWG. Esta es la apariencia de inmunoglobulina G (IgG) anti-CWG significativo a partir de la 4ta inoculación hacia adelante pero solamente en el grupo HCWG. En el grupo FCWG se verificó la presencia de IG anti-FH8 pero podría no confirmar la presencia de IgG específico contra el fragmento CWG (datos no mostrados) . La presencia de IgG anti-CWG, en el grupo HCWG, se detectó aún 83 días después de la última administración indicando la existencia de una memoria específica para este antígeno. Para valorar la especificidad de anticuerpos policlonales se realizaron blots usando como antigeno el FCWG. La ubicación de la proteina recombinante FCWG asi como también polímeros posibles se llevó a cabo con el antisuero producido contra FH8 (Figura 3D.i), diluido 1/100, que permite la observación de polímeros FCWG. Usando combinaciones de suero del grupo negativo, el grupo CWG y el grupo HCWG obtenido 9 días después de la 5ta IP y posterior 6ta. IP, diluida 1/200, la apariencia de precipitados que corresponden a FCWG. La realización de inmunoblots con las mismas diluciones usando el antígeno FH8 (para evaluar la producción de IgG anti-fragmento H) no mostró la aparición de algún precipitado. Todos estos resultados muestran que los anticuerpos desarrollados por el grupo HCWG son específicos del fragmento CWG. No se observó la presencia de reacciones cruzadas significativos con antígenos de E. coli o la presencia de Ig anti-fragmento H. Para valorar si los Ig producidos fueron capaces de reconocer la proteína nativa existente en la pared de quistes de Giardia, se procedió a la realización de inmunofluorescencia con suero del grupo HCWG el cual reveló la presencia de estructuras de pared fluorescentes (Figura 3E) .

Ejemplo 2 - Evaluación de la respuesta inmune para proteínas de los constructos con el fragmento CP12 Después de obtener los constructos pQECP12 y PQEHCP12 se procedió a la producción y análisis de los antigenos recombinantes respectivos bajo condiciones de desnaturalización (Figura 4A) .

En el análisis de geles de SDS-PAGE Tris-Tricina (Figura 3A) se pudo ver que la proteina CP12 tiene un peso molecular de 9 kDa, como se esperaba, mientras la proteina de fusión HCP12 tiene un peso de aproximadamente 10 kDa y el antigeno recombinante FCP12 representa un antigeno con peso de aproximadamente 29 kDa. Habiendo considerado al PM calculado para el antigeno recombinante, la banda de 29 kDa puede ser un polímero de FCP12. La demostración del efecto de la presencia del fragmento H en la inducción de una respuesta inmune específica contra el CP12 ha sido realizada por inoculación con 2 grupos de ratones CD1 con 20 g de antígeno CP12 y HCP12 periódicamente (Tabla 2) por administración IP. También se usó un grupo de 3 CD1 con las mismas características que no recibieron inoculación. Hubo una recolección regular de sangre (Tabla 2) para evaluación adicional de la presencia de Ig anti-CP12. La evaluación de la presencia de la respuesta de anticuerpo específico se realizó por ELISA con placas que contienen el antígeno CP12 (Figura 4B.a) HCP12 (Figura 4B.b). Hubo la apariencia de anti-CP12 de la 4ta inclusión en adelante en el grupo HCP12, siendo también visible la aparición en el grupo CP12 de Ig anti-CP12 de la 6ta. IP en adelante. En ambos grupos los tituladores de Ig anti-CP12 se desprendieron a través del experimento. En este ejemplo el incremento de inmunogenicidad puede ser observado por la respuesta inmune temprana y la cantidad superior de IgG anti-CPl2 presente en el grupo HCP12.

Para valorar la especificidad de anticuerpos policlonales producidos se realizaron blots usando como antigeno el FCP12. La ubicación de la proteina recombinante FCP12 se llevó a cabo en el anticuerpo especifico de Fh8 (Figura 4C) , diluido 1/100, que permite la observación de polímeros FCP12, cuyas ubicaciones están indicadas por las flechas. Existe, usando suero de los grupos: negativo, CP12 y HCP12, recolectados posterior a la 8ava. IP, y diluido 1/1000, la aparición de precipitados que corresponden a las proteínas identificadas por suero anti-FH8. La intensidad más alta presente en el grupo HCP12, cuando se compara con el grupo CP12, confirma el incremento de la respuesta inmune que ocurre en el grupo HCP12. Los inmunoblots realizados con el mismo suero usando antígeno FH8 no muestran la^aparición de algún precipitado. Todos estos resultados muestran que los anticuerpos desarrollados por el grupo HCP12 son específicos al fragmento CP12 puesto se observó la presencia de reacciones cruzadas significativos con antígenos de E. coli o la presencia del fragmento H anti-Ig. Para valorar si los Ig producidos fueron capaces de reconocer la proteina nativa existente en la pared de oocistos de Cryprosporidium se procedió a la realización de inmunofluorescencia con suero del grupo HCP12 lo cual reveló la presencia de fluorescencia en estructuras de la pared (Figura 4D) .

Ejemplo 3 - Evaluación de proteínas de la respuesta inmune y fragmentos que resultan de la construcción con el fragmento H.

Para cada uno de los fragmentos descritos se procedió a la demostración en la producción de la respuesta inmune inoculando 3 grupos de ratones CD1 con el antigeno correspondiente a intervalos regulares (Tabla 2) por administración IP. También se usó un grupo de 3 CD1 con las mismas características que no recibió inoculación. Hubo recolección regular de sangre (Tabla 2) para evaluación adicional de la presencia de Ig dirigido contra el antígeno obj etivo .

Proteína BG: Las características inmunológicas en este fragmento fueron desconocidas. Después de obtener el constructo pQEHBG se procedió a la producción y análisis de los antígenos recombinantes respectivos (Figura 5A) . La demostración del efecto de la presencia del fragmento H en la inducción de una respuesta inmune específica contra el BG se ha realizado por inoculación a grupos de 3 ratones CD1 con 20 µg de antigeno HBG. La evaluación de la presencia de respuesta de anticuerpo especifico se realizó por ELISA con placas que contienen el antigeno HBG (Figura 5B) . Existe la aparición de Ig G anti-BG a partir de la 3era inoculación en adelante. Los niveles de anticuerpo alcanzaron una meseta después de la 4ta. IP que ha sido mantenida aún 47 días después de la última inoculación.

Para valorar la especificidad de anticuerpos policlonales producidos se realizaron blots usando como antigeno el BG. Hubo, usando el suero de grupos HBG y negativos recolectados posteriores a la 7ma. IP, diluidos 1/1000, diluidos 1/1000, la aparición de precipitados que corresponden a BG. No se detectó la presencia de reactivo cruzado significativo con antigenos de E. coli. Para valorar si los Ig producidos fueron capaces de reconocer la proteina nativa existente en la pared de Giardia, se consideró la realización de inmunofluorescencia con suero del grupo HBG lo cual reveló la presencia de inmunofluorescencia en la pared de estas estructuras.

Fragmento de proteina Ent : Debido al bajo peso molecular de este polipéptido (7Kda) y puesto que representa solamente una porción de una proteina, este fragmento tiene características asociadas con baja inmunogenicidad .

Después de obtener el constructo pQEHEnt se procedió a la producción y análisis de sus antigenos recombinantes . La demostración de la producción de la respuesta inmune se realizó procediendo a inoculaciones de 3 ratones CD1 con 50 g de antigeno HEnt . La evaluación de la presencia de respuesta de anticuerpo especifico se realizó por ELISA con placas que contienen el antigeno HEnt (Figura 5B) . Existe la aparición de Ig G anti-Ent a partir de la 5ta IP en adelante. Los niveles de anticuerpo alcanzaron una meseta después de la 5ta. IP que se mantuvo aún 90 días después de la última inoculación. Para valorar la especificidad de anticuerpos policlonales producidos se realizaron blots usando como antigeno el FEnt . La proteina recombinante FEnt además se identificó con antisuero especifico anti FH8 (Figura 6B) , diluido 1/100, que permite la observación de polímero FEnt, cuyas ubicaciones están indicadas por las flechas. Hubo, usando el suero de grupos HEnt y negativos, recolectados posteriores a la 7ma . IP, y diluidos 1/1000, la aparición de precipitados, en el grupo HEnt que corresponden a FEnt. Inmunoblots realizados con el mismo suero usando el antígeno FH8 no mostraron la aparición de precipitado. Todos estos resultados muestran que los anticuerpos desarrollados por el grupo HEnt son específicos del fragmento Ent puesto que no se detectó la presencia de reacciones cruzadas significativos con antigenos de E. coli o la presencia de fragmento H anti-Ig.

Para valorar si los Ig producidos fueron capaces de reconocer la proteina nativa existente en la pared de trofozoitos de Entamoeba se realizó inmunofluorescencia con suero del grupo Hent la cual reveló la presencia de estructuras de la pared fluorescentes (Figura 6C) .

Fragmento de proteina PFSP: Debido al polipéptido de bajo peso molecular (7 kDa) y puesto que representa solamente una porción de una proteina, este fragmento tiene características asociadas con baja ínmunogenicidad .

Después de obtener el constructo pQEHPfsp se procedió a la producción y análisis de los antígenos recombinantes respectivos bajo condiciones de desnaturalización .

La demostración de la producción de la respuesta inmune se realizó procediendo a la inoculación de ratones CD1 con 50 µg de antígeno HPfsp. La evaluación de la presencia de respuesta de anticuerpo específico se realizó por ELISA con placas que contienen el antígeno HPfsp (Figura 7B) . Existe la aparición de IgG anti-Pfsp a partir de la 4ta. IP en adelante. Los niveles de anticuerpo alcanzaron una meseta después de la 7ma. IP que ha sido mantenida aún 82 días después de la última inoculación.

Para valorar la especificidad de anticuerpos policlonales producidos se realizó blot usando como antigeno el FPfsp. La proteina recombinante se localizó con antisuero anti-FH8 especifico (Figura 7B.a), diluido a 1/100, que permite la observación de polímeros FPfsp. Usando combinación de suero a partir de grupos HPfsp y negativos recolectados posteriores a la 6ma . IP y 14 días posteriores a la 7ma . IP, diluidos 1/200, se observó la aparición de precipitados que corresponden a FPfsp.

Inmunoblots realizados con el mismo suero usando el antígeno FH8 no mostraron la aparición de precipitado. Todos estos resultados muestran que los anticuerpos desarrollados por el grupo HPfsp son específicos del fragmento Pfsp puesto que no se detectó la presencia de reacciones cruzadas significativos con antígenos de E. coli o la presencia de fragmento H anti-Ig.

Fragmento de proteína IL5: Debido al polipéptido de bajo peso molecular (7 kDa) y puesto que representa solamente una porción de una proteína con alta homología con el IL de 5 ratones y ha sido descrito como no inmunogénico, este fragmento tiene características asociadas con baja inmunogenicidad.

Después de obtener el constructo pQEHIL5 se procedió a la producción y análisis de los antígenos recombinantes respectivos bajo condiciones de desnaturalización .

La demostración de la producción de la respuesta inmune se realizó inoculando ratones CD1 con aproximadamente 20 pg de HIL5 (Tabla 2). La evaluación de la presencia de respuesta de anticuerpo especifico se realizó por ELISA con placas que contienen el antigeno HIL5 (Figura 8A) . Existe la aparición de Ig G anti-IL5 a partir de la 4ta. IP en adelante. El nivel de anticuerpo crece debido a las inoculaciones a través del periodo de estudio.

Para valorar la especificidad de anticuerpos policlonales producidos se realizaron blots usando como antigeno el FIL5. La ubicación de la proteina recombinante FIL5 se llevó a cabo con el antisuero anti-FH8 especifico diluido a 1/100, que permite la observación de polímeros FIL5 indicados con flechas. Se encontró (Figura 8B) , usando suero de grupos negativos y HIL5 obtenidos posteriores a la 6ta. IP, diluidos a 1/1000, la aparición de precipitados que corresponden a FIL5.

Inmunoblots realizados con el mismo suero usando el antígeno FH8 no mostraron la aparición de precipitado. Todos estos resultados muestran que los anticuerpos desarrollados por el grupo HIL5 son específicos del fragmento IL5 puesto que no se detectó la presencia de reacciones cruzadas significativos con antigenos de E. coli o la presencia de fragmento H anti-Ig.

Proteina Toxo: Las características inmunológicas en este fragmento fueron desconocidas. Después de obtener el constructo pQEHToxo se procedió a la producción y análisis de sus antígenos recombinantes .

La demostración de la producción de la respuesta inmune se realizó inoculando ratones CD1 con 20 µg de antígeno HToxo (Tabla 2) . La evaluación de la presencia de respuesta de anticuerpo específico se realizó por ELISA con placas que contienen el antígeno HToxo (Figura 9A) . Existe la aparición de IgG anti-Toxo a partir de la 4ta inoculación en adelante .

Para valorar la especificidad de anticuerpos policlonales producidos se realizaron blots usando como antígeno Toxo. Hubo, usando suero recolectado posterior a la 4ta. IP, diluido a 1/1000, la aparición de precipitados que corresponden a Toxo recombinante en el grupo HToxo. No se observó la presencia de reacciones cruzadas significativos con antígenos de E. coli.

Fragmento CD : Este fragmento se mostró por ser pobremente inmunogénico . Después de obtener el constructo PQEHCD4 se procedió a la producción y análisis de los antígenos recombinantes respectivos bajo condiciones de desnaturalización .

La demostración de la producción de la respuesta inmune se realizó inoculando ratones CD1 con 30 de antigeno HCD4 (Tabla 2) . La evaluación de la presencia de respuesta de anticuerpo especifico se realizó por ELISA con placas que contienen el antigeno HCD4 (Figura 10A) . Existe la aparición de anti-CD4 a partir de la 4ta. inoculación en adelante. Los niveles de anticuerpo alcanzaron una meseta después de la 4ta. IP que permanece 82 días después de la última inoculación.

Para valorar la especificidad de anticuerpos policlonales producidos se realizaron blots usando como antigeno el CD4 recombinante . Usando una combinación de suero recolectado 14 días después de la 7ma. IP y diluido 1/500, la aparición de precipitados que corresponden a CD4 se observa en el grupo HCD4, (Figura 10 B) .

Proteina PAL: Esta proteina se mostró por ser muy inmunogénica . Después de obtener el constructo pQEHPAL se procedió a la producción y análisis de sus antigenos recombinantes . La demostración de la producción de la respuesta inmune se realizó inoculando ratones CD1 con 30 pg de antigeno HPAL (Tabla 2) . La evaluación de la presencia de respuesta de anticuerpo especifico se realizó por ELISA con placas que contienen el antigeno HPAL (Figura 11A) . Existe la aparición de Ig G anti-PAL a partir de la 2da. inoculación en adelante .

Para valorar la especificidad de anticuerpos policlonales producidos se realizaron blots usando como antigeno el HPAL. Hubo, usando el suero de la 4ta. IP postrecolección, diluido 1/4000, la aparición de precipitados que corresponden a PAL recombinante (Figura 11 B) en el grupo HPAL .

Proteina LEC: Esta proteina se consideró moderadamente inmunogénica pero debido a su actividad hemaglutinante , cuando está en forma nativa, se han desarrollado anticuerpos específicos contra el antígeno en condiciones desnaturalizadas.

Se procedió a la producción y análisis del antígeno HLEC recombinante bajo condiciones de desnaturalización.

La demostración de la producción de la respuesta inmune se realizó inoculando ratones CD1 con 12.5 pg de antígeno HLEC. La evaluación de la presencia de respuesta de anticuerpo específico se realizó por ELISA con placas que contienen el antígeno HLEC (Figura 12A) . Existe la aparición de IgG anti-LEC a partir de la 4ta. inoculación en adelante. Los niveles de anticuerpo alcanzaron una meseta después de la 4ta. IP que se mantiene durante el periodo bajo observación, Para valorar la especificidad de anticuerpos policlonales producidos se realizaron blots usando como antigeno el HLEC. Hubo, usando suero recolectados posteriores a la 6ta. IP, diluidos 1/1000, diluidos 1/1000, la aparición de precipitados que corresponden a HLEC (Figura 12 B) para el grupo HLEC.

Las demostraciones descritas para los fragmentos C G y CP12 mostraron que la presencia del fragmento H en la proteina recombinante pueden incrementar significativomente la respuesta inmune especifica desarrollada por el ratón. De este modo el incremento en inmunogenicidad es una característica asociada con el antígeno recombinante la cual permite la producción de anticuerpos policlonales específicos, aún a pesar de que en algunas de las extracciones, que incluyen HEnt, HIL5, HPfsp HLEC la presencia de contaminantes de E. coli fue significativo. Así, debido a la contaminación con proteínas a partir de E. coli, los anticuerpos producidos son esencialmente específicos para el fragmento objetivo.

El desarrollo de anticuerpos policlonales contra un antígeno recombinante puede estar asociado con la protección de hospederos donde desarrollan anticuerpos contra el organismo infeccioso que contiene el antígeno correspondiente. Esto depende de un número de factores; especialmente del papel o importancia que este antígeno tiene en el mecanismo de infección del organismo infeccioso. En el caso de ratones inoculados con las proteínas HCP12, HC G y HBG, estos antígenos representan, en el mecanismo de infección por Cryptosporidium (CP12) y Giardia (CWG y BG) , un papel crucial en la invasión o adhesión celular al organismo hospedero, y por lo tanto, como se describe en la literatura, son candidatos de objetivo para el desarrollo de vacunas. El desarrollo de anticuerpos contra los mismos antígenos ha sido descrito en la literatura ya que protege de la infección por agentes infecciosos (Tellez et al., 2003, Jenkins et al., 1998, Abdul-Wahid et al., 2007). En una forma muy similar a aquella descrita en la literatura previa, y para valorar la protección de ratones inyectados con HCP12, HCWG HBG frente a la infección por los parásitos Cryptosporidium y Giardia, se tienen indicaciones de que existe un efecto de protección contra la infección de ratones pre-inoculados con estos antígenos .

El uso de inóculos que consisten de proteínas solubles elimina muchos de los efectos indeseables causados por los adyuvantes. En ninguno de los ratones usados en los experimentos descritos, se detectaron efectos secundarios que pueden resultar de la inoculación de antígenos. También se realizó la producción de suero policlonal contra algunos de los fragmentos descritos anteriormente (HCWG, HCP12, HToxo, HIL5, Hent y HBG) en el modelo de conejo usando inoculaciones subcutáneas en el muslo interior y, como en el ratón, no se observaron algunos efectos secundarios a partir de la administración de antigenos. Como en modelos de ratón, los conejos producidos es evidencia de anticuerpos policlonales muy significativos contra el antígeno de interés. En todos los objetivos evaluados se pudo demostrar la existencia de una respuesta inmune significativo demostrando la producción de Ig específico. Otra característica muy importante, observada particularmente en el caso de la respuesta contra HC G, HCD4, HPfsp, Hent y HBG, es que fue posible detectar la respuesta específica hasta 3 meses después de la última inmunización, sugiriendo el desarrollo de células de memoria, una característica esencial para el desarrollo de vacunas.

Aunque los ejemplos proporcionados se basan en modelos para la producción de proteínas recombinantes que producen fusión de antígeno que contiene el fragmento H, este fragmento puede ser agregado a los objetivos a través de otros procesos. La actividad mostrada debe ser incluida en el campo de adyuvantes y ya que pueden ser usados en varias formulaciones para mejorar o incrementar la intensidad y especificidad de la respuesta inmune que resulta de la aplicación de un antígeno objetivo.

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Claims (14)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Inmunógeno caracterizado porque está comprendido de: a. parte de la secuencia de aminoácido que se une a proteínas, calcio excretada/secretada por gusanos adultos de Fasciola hepática con la secuencia idéntica a, o al menos 90% estructuralmente similar a la SEC ID NO 2, designada por el fragmento H; b. una proteína o fragmento de proteína de interés no relacionado.

2. Inmunógeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es una proteína o fragmento de proteína de interés que es una proteína patogénica, como por ejemplo una proteína viral, una proteína bacteriana o una proteína de un protozoario.

3. Inmunógeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es una proteína o fragmento de proteína de interés que es la C G, CD4, IL5, Pfsp Ent, PAL, CP12, LEC, BG o Toxo.

4. Inmunógeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones previas, caracterizado porque es usado como una medicina.

5. Composiciones caracterizadas porque contienen cualquiera de los inmunógenos descritos en las reivindicaciones 1-4.

6. Composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende los inmunógenos en cantidades terapéuticamente efectivas y todavía un vehículo farmacológicamente adecuado.

7. Composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque está comprendida de 100% de uno de los inmunógenos descritos.

8. Composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque está comprendida de: un inmunógeno descrito en las reivindicaciones 1-4, con una concentración de 1 a 100 ]iq en un volumen entre 100 y 1000 µ? diluido en amortiguador de fosfato - 0.01 de fosfato, 0.1 M de NaCl, pH 7.2.

9. Adyuvante caracterizado porque comprende los inmunógenos descritos en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en las reivindicaciones 5-8.

10. Vacuna caracterizada porque comprende los inmunógenos descritos en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en las reivindicaciones 5-8.

11. Método para la preparación de inmunógenos, caracterizado por el uso de un inmunógeno descrito en las reivindicaciones 1-4, que comprende la adición de un fragmento H a un polipéptido no relacionado en cualquier posición razonable de la secuencia que corresponde al polipéptido a ser utilizado como inmunógeno.

12. Método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque usa fragmentos múltiples y proteínas tales como la C G, CD4, IL5, Pfsp, Ent, PAL, CP12, LEC, BG o Toxo .

13. Método para la producción de anticuerpos policlonales , aislados y purificados, o un fragmento funcional caracterizado porque es capaz de reconocer a inmunógenos descritos en las reivindicaciones 1-4, o se obtienen por el método descrito en las reivindicaciones 11-12, donde este método incluye las siguientes etapas: 0 inmunización de un sujeto mamífero no humano con cualquiera de los inmunógenos descritos en las reivindicaciones 1-4 o con cualquiera de las composiciones descritas en 5-8; selección de anticuerpos que son capaces de reconocer los inmunógenos descritos de conformidad con las reivindicaciones 1-4, o se obtienen de conformidad con las reivindicaciones 11-12 usando los métodos descritos para este propósito .

14. Uso de inmunógenos descritos en las reivindicaciones 1-4 y las composiciones descritas en las reivindicaciones 5-8, los cuales son aplicados en la producción de anticuerpos policlonales específicos de inmunoterapia , inmunoprofilaxis , la producción de vacunas, adyuvantes, diagnósticos y otras aplicaciones directamente obtenidas a través del desarrollo de una respuesta inmune específica .