CN105886514A - 蜱核糖体蛋白p0基因、其双链rna及杀蜱生物制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蜱核糖体蛋白基因，该基因为镰形扇头蜱的核糖体蛋白P0基因，其包含编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。本发明还公开了一种能够抑制上述蜱核糖体蛋白P0基因表达的双链RNA。本发明基于蜱核糖体蛋白P0基因的双链RNA，适用于制备新型杀蜱生物制剂，该杀蜱生物制剂不仅有效、安全，而且广谱、稳定，具有广阔的应用前景。

Description

蜱核糖体蛋白P0基因、其双链RNA及杀蜱生物制剂的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种蜱核糖体蛋白P0基因、其双链RNA(dsRNA)、及该dsRNA用于杀蜱生物制剂的应用。

背景技术

作为专性体表寄生虫，蜱主要侵袭哺乳类、鸟类、爬行类以及两栖类等，其危害不仅仅在于蜱摄食人和宿主动物的血液，而是通过吸血可传播病毒、细菌和原虫等病原，引起人和动物的蜱传病。到目前为止，已经有超过900种蜱被鉴定，大致分为硬蜱和软蜱两大类。化学药物防治是目前蜱防控的主要方法，但由于化学药物的长期使用而出现的食品安全、环境污染以及蜱的抗药性问题，迫切需要研究新型防治技术。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。它是在研究秀丽新小杆线虫(C.elegans)反义RNA(antisense RNA)的过程中发现的。此后dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中，并逐渐证实植物中的转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)、共抑制(cosuppression)及RNA介导的病毒抗性、真菌抑制(quelling)现象均属于RNAi在不同物种的表现形式。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。2003年，Aljamali等发表了第一篇应用RNAi技术研究蜱的功能基因的论文。之后，RNAi技术在鉴定蜱基因功能、疫苗抗原筛选以及蜱与蜱传病原体的相互作用研究上都不断有报道。但是，至今尚无用双链RNA(dsRNA)制备新型杀蜱生物制剂的公开报道。

发明内容

本发明要解决目前缺乏安全、有效防控蜱的生物制剂的技术问题，提供一种蜱核糖体蛋白P0基因及其dsRNA，该dsRNA可用于制备新型杀蜱生物制剂。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种蜱核糖体蛋白基因，所述基因为镰形扇头蜱的核糖体蛋白P0基因，该P0基因包含：编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

优选的，所述蜱核糖体蛋白P0基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种蜱核糖体蛋白，所述核糖体蛋白为镰形扇头蜱的核糖体蛋白P0，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种双链RNA，该双链RNA能够抑制上述蜱核糖体蛋白P0基因的表达。

优选的，所述双链RNA包含SEQ ID NO.3所示核苷酸序列或其互补序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种杀蜱生物制剂，包含上述双链RNA及透皮剂。

在本发明中，透皮剂可介导双链RNA有效导入蜱体内，发挥基因沉默效果，通过影响蜱的吸血、蜕皮或生殖发挥杀蜱作用。

所述透皮剂包括脂质体。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述蜱核糖体蛋白基因在制备杀蜱生物制剂中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述双链RNA在制备杀蜱生物制剂中的应用。

本发明基于蜱核糖体蛋白P0基因的双链RNA(dsRNA)，用作杀蜱生物制剂，具有以下优点：一是有效，在蜱体，注射长链dsRNA干扰效果明显。二是安全，哺乳动物细胞不吸收长链dsRNA，对畜禽安全，另外，特异基因P0的dsRNA不伤害其他生物，环境安全。三是广谱，由于P0基因是蜱不同种间的保守基因，因此针对蜱P0基因的dsRNA，可广谱杀蜱。四是稳定，双链RNA十分稳定，易于储存运输。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1镰形扇头蜱P0基因全长序列及推测的氨基酸序列示意图；

图2是本发明实施例1镰形扇头蜱P0分子(Rh-P0)与其他蜱种P0分子的同源性比较图；

图3是本发明实施例2合成的dsRNA的电泳图；

图4是本发明实施例2不同脂质体介导dsRNA吸收干扰效果的比较图；

图5是本发明实施例2不同浓度双链RNA的脂质体制剂对干扰效果影响的比较图；

图6是本发明实施例2不同浸泡时间(小时)对dsRNA透皮吸收干扰的影响比较图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

本发明从镰形扇头蜱克隆到一个核糖体蛋白P0的全长编码基因，该基因全长为1142bp，具有一个编码318个氨基酸的开放阅读框，没有信号肽序列。镰形扇头蜱P0基因与其他蜱种具有很高的同源性，为保守的管家基因。根据P0基因序列，设计合成双链RNA，在透皮脂质体介导下，双链RNA可有效导入蜱体内，发挥基因沉默效果，影响蜱的吸血、蜕皮或生殖，显示了很好的杀蜱作用。因此，基于蜱的特定靶基因序列合成双链RNA与适合透皮剂可制备新型杀蜱生物制剂，应用于蜱的防治工作。

实施例1镰形扇头蜱P0分子的基因克隆和序列分析

1.材料与方法

1.1试验动物：镰形扇头蜱来自本实验室经兔体人工饲血繁殖传代。昆明小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.2材料：Trizol试剂,购于Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶,DNA胶回收试剂盒,反转录试剂盒,pMD18T载体、Premix Taq^TM、低分子量蛋白Marker、限制性内切酶BamHI以及XhoI购于TaKaRa公司；PCR胶回收试剂盒购自Axygen；质粒纯化试剂盒购于OMEGA公司。

1.3基因3’端克隆

从本实验室已构建镰形扇头蜱cDNA文库中挑出P0基因部分序列，根据保守区所得的基因片段，设计3'RACE的引物：GSP(Gene specific primer)：5'-CTCGCCCTTCTCGTATGGTCTGA-3'(SEQ ID NO.4)；Nested GSP：5'-CATTGCCATTGCGGTGGAGACAG-3'(SEQ ID NO.5)。根据3'RACE试剂盒说明书扩增P0基因的3'端，胶回收目的条带，连入pMD-18T载体，转化到E.coliDH5α细胞中，挑选5-10个单菌落，经菌液PCR鉴定为阳性的样品，送英俊(上海)贸易有限公司进行测序。

1.4基因5’端克隆

根据所得的保守区及3'RACE测序结果，设计5'RACE所用的引物：GSP1：5'-AACACCCTCAACGAAT-3'(SEQ ID NO.6)，GSP2：5'-ACGAGAAGGGCGAGATGTT-3'(SEQ ID NO.7)；Nested GSP：5'-CGTTGCCCTTGATGTGCGG-3'(SEQ ID NO.8)。根据5'RACE试剂盒说明书扩增P0基因的5'端，胶回收目的条带，连入pMD-18T载体，转化到E.coliDH5α细胞中，经菌液PCR鉴定后送英俊(上海)贸易有限公司进行测序。

1.5全长基因的克隆

根据两次RACE结果及保守区拼接后所得的全长引物序列，设计全长引物：上游引物：5'-CTTCAACTTCCTTTCATACGG-3'(SEQ ID NO.9)；下游引物：5'-GCAACTTTATTGGGCGGTA-3'(SEQID NO.10)。以cDNA为模板，扩增P0基因全长序列，扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30s，55℃45s，72℃1min,，35个循环；最后于72℃延伸10min，同样进行胶回收、连接、转化，经PCR鉴定后进行序列测定，同时保存阳性菌种，提取含全长基因的重组质粒。

1.6序列分析

通过Blastx对该基因进行同源性分析；用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html寻找该基因ORF；用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/预测信号肽。

2.结果与分析

通过拼接5′RACE、保守区和3′RACE克隆结果设计全长引物，以cDNA为模板，通过PCR扩增得到全长为1118bp的P0基因(SEQ ID NO.2，如图1所示，“*”为终止密码子)。通过对P0全长基因序列进行分析，可以得知：P0全长基因具有一个编码318个氨基酸的开放阅读框(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，没有信号肽序列。推测P0的蛋白大小约为35kDa。镰形扇头蜱P0基因与其他蜱种具有很高的同源性，与微小扇头蜱(登录号：KC845304)、长角血蜱(登录号：EU048401)和间突硬蜱(登录号XM002399569)的P0基因的同源性分别为94％、87％和85％(见图2，在图2中，Rh-P0是镰形扇头蜱P0，Rm-P0是微小扇头蜱P0,Hl-P0是长角血蜱P0,Is-P0是间突硬蜱P0)。

实施例2蜱P0基因dsRNA的合成及其透皮吸收干扰效果评估

1.材料与方法

1.1基于P0基因的dsRNA合成

根据镰形扇头蜱的P0基因序列分别设计含T7 RNA聚合酶启动子序列的两套引物P0-U1，P0-D1和P0-U2，P0-D2；以及依据对照Luciferase基因序列设计含T7 RNA聚合酶启动子序列的两套引物Luci-U1，Luci-D1 and Luci-U2，Luci-D2(表1)。以实验室已构建的含P0全长基因的重组质粒为模板，用各自两套引物分别进行常规PCR引入T7启动子序列，扩增P0全长基因1-736区间的基因序列。将PCR产物经DNA胶回收后作为RNA合成的模板，利用T7 RiboMAXTM Express RNAi system kit(Promega,Madison,WI,USA)合成单链RNA(ssRNA)，再经互补后获得dsRNA(SEQ ID NO.3)，最后经纯化去除剩余ssRNA等杂质，得到高纯度高浓度的目的dsRNA，电泳鉴定。对照Luciferase基因按同样方法合成dsRNA。

1.2基因沉默的Real-time PCR分析

根据镰形扇头蜱的P0基因序列设计Real-time PCR的引物，P0-L1和P0-R1(表1),所设计下游引物为位于合成的dsRNA序列之外，扩增628-783基因片段，避免蜱体浸泡后未洗净的dsRNA作为模板进行扩增。以镰形扇头蜱看家基因Actin为内参基因，设计引物Actin-F和Actin-R(表1)。将样本蜱液氮研磨提取RNA。根据SYBR PrimeScript RT-PCR Kit的说明书进行逆转录反应，得到总cDNA。以逆转录得到的总cDNA为模板，利用非特异性SYBRGreen Ⅰ染料法进行两步法real-time PCR，根据与对照组的2^-△△ct计算沉默效果。

表1双链RNA合成和定量PCR分析的引物设计

1.3不同脂质体介导双链RNA的吸收干扰效果比较

脂质体Lipofectamine2000(Invitrogen),CellfectinⅡ(Invitrogen)和DMRIE-C(Invitrogen)用于双链RNA介导吸收实验。P0基因dsRNA溶解于超纯水，浓度为2μg/μL，分别与三种不同脂质体按体积比1：1混合。对照为P0基因dsRNA与等体积超纯水混合。未吸血的镰形扇头蜱20只成蜱，50只若蜱，100只幼蜱分别浸泡在不同脂质体混合的dsRNA液体内，保持12小时湿润，然后蜱用水清洗，纸巾干燥，放置在25℃.，92％湿度条件下24小时，收集活蜱样本，液氮下磨碎，提取RNA，作为Real-PCR检测模板，进行基因表达相对定量分析。每组实验重复三次。

1.4不同浓度的双链RNA的脂质体制剂对透皮吸收干扰效果的影响

P0基因dsRNA溶解于超纯水，浓度为2μg/μL，分别与脂质体DMRIE-C按1：2,1:1和2:1的体积比混合，对照为无dsRNA的DMRIE-C。20只成蜱，50只若蜱，100只幼蜱分别按1.3方案进行试验采样，然后提取RNA，进行基因表达分析。

1.5不同浸泡时间对双链RNA透皮吸收干扰效果的影响

P0基因dsRNA溶解于超纯水，浓度为2μg/μL，分别与脂质体DMRIE-C按体积比1：1混合，20只成蜱，50只若蜱，100只幼蜱分别在浸泡0,3h,6h,12h,18h和24h后，按1.3方案进行试验，提取RNA,进行基因表达分析。

2.结果与分析

2.1基因的双链RNA合成

合成的双链RNA电泳后如图3所示，大小与预期736bp一致，无杂带，表明合成的P0基因dsRNA和对照Luciferase基因dsRNA符合要求。在图3中，M,分子量Marker；1，P0基因dsRNA；2，对照Luciferase基因dsRNA。

2.2不同脂质体介导dsRNA吸收干扰效果的比较

与对照相比，Lipofectamine2000,CellfectinⅡ和DMRIE-C三种不同商品化脂质体，均显示了明显的协助双链RNA透皮吸收干扰效果作用(图4)。在成蜱和若蜱，DMRIE-C效果均优于其他二者，在幼蜱居中。综合三个脂质体协助双链RNA的效果，选择对不同发育阶段均表现较好的DMRIE-C作为进一步研究的脂质体。在图4中，纵坐标是幼蜱(larvae)、若蜱(nymph)和成蜱(adult)P0基因的相对表达量。

2.3不同浓度的双链RNA的脂质体制剂对透皮吸收干扰的影响

不同浓度双链RNA的脂质体制剂对干扰效果影响如图5所示，高、中、低三种浓度中，低浓度的制剂(0.5ug/ul)对幼蜱影响显著减少，若蜱和成蜱阶段无差别，根据成本考虑，将选择中浓度(1ug/ul)进行进一步实验。

2.4不同浸泡时间对dsRNA透皮吸收干扰的影响

以未浸泡(0h)为对照，幼蜱，若蜱和成蜱分别浸泡3h,6h,12h,24h,可以发现P0基因干扰效果随时间延长，效果更佳，但总体差别不明显(图6)，综合考虑应用时间成本，选择浸泡6小时作为应用时间。

实施例3双链RNA制剂对蜱的吸血、发育和繁殖的影响

1.材料和方法

1.1蜱及实验动物

镰形扇头蜱来自上海兽医研究所繁殖蜱群，在实验室经人工兔体饲血和恒温孵育，幼蜱来自饱血雌蜱产卵孵化，若蜱来自饱血后蜕皮的幼蜱，成蜱来自饱血后蜕皮的若蜱，实验所用蜱无特别说明均来自同一批次。新西兰大白兔和昆明系小白鼠，均购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.2双链RNA与脂质体制剂的制备

根据前期研究结果，制备基于P0基因的双链RNA新型杀蜱制剂，具体配方是：溶于水的双链RNA 2ug/ul与等体积脂质体DMRIE-C混合用于成蜱和若蜱。对照组用蜱体无关的Luciferase基因的双链RNA按同样方法制备。

1.3双链RNA制剂对蜱吸血、发育和繁殖的影响

成蜱，双链RNA制剂浸泡6小时后，存活的蜱接种到新西兰大白兔耳朵上进行吸血实验，记录24小时蜱吸附率，饱血率，饱血重量和饱血雌蜱产卵率。若蜱，双链RNA制剂浸泡6小时后，存活的蜱接种到昆明鼠背部进行吸血实验，记录24小时蜱吸附率，饱血率，蜕皮率。对照组为蜱不相关的基因Luciferase的dsRNA。实验组和对照组分别分为三组，每组成蜱30只，若蜱100只左右。结果进行统计分析。

2.结果和分析

2.1成蜱浸泡后吸血和生殖的影响

成蜱浸泡6小时后，接种到新西兰大白兔耳朵上进行吸血和生殖生物学特征观察，结果统计发现，24小时吸附率无显著差异，但饱血重量实验组显著低于对照组，饱血率和饱血雌蜱产卵率也显著低于对照组(见表2)，表明杀蜱制剂降低了成蜱吸血能力，并且导致生殖能力显著下降，具有较显著的控蜱作用。

表2双链RNA制剂处理成蜱后对蜱的吸血和生殖的影响

2.2若蜱浸泡后吸血和发育的影响

若蜱浸泡6小时后，接种到昆明鼠背上进行吸血和发育蜕皮的生物学特征观察，结果统计发现，24小时吸附率和饱血率无显著差异，但实验组蜕皮率为零，显著低于对照组(见表3)，表明杀蜱制剂破坏了若蜱发育蜕皮能力，具有较显著的控蜱作用。

表3双链RNA制剂处理若蜱后对蜱的吸血和蜕皮的影响

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种蜱核糖体蛋白基因，其特征在于，所述基因为镰形扇头蜱的核糖体蛋白P0基因，该P0基因包含：编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的蜱核糖体蛋白基因，其特征在于，所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.一种蜱核糖体蛋白，其特征在于，所述核糖体蛋白为镰形扇头蜱的核糖体蛋白P0，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

4.一种双链RNA，其特征在于，所述双链RNA能够抑制权利要求1或2所述蜱核糖体蛋白P0基因的表达。

5.根据权利要求4所述的双链RNA，其特征在于，所述双链RNA包含SEQ ID NO.3所示核苷酸序列或其互补序列。

6.一种杀蜱生物制剂，其特征在于，包含权利要求4所述双链RNA及透皮剂。

7.根据权利要求6所述的杀蜱生物制剂，其特征在于，所述透皮剂包括脂质体。

8.根据权利要求6所述的杀蜱生物制剂，其特征在于，所述生物制剂适用于广谱杀蜱。

9.权利要求1所述蜱核糖体蛋白基因在制备杀蜱生物制剂中的应用。

10.权利要求4所述双链RNA在制备杀蜱生物制剂中的应用。