CN110540584B

CN110540584B - 镰形扇头蜱网格蛋白重链分子及其应用

Info

Publication number: CN110540584B
Application number: CN201810527718.4A
Authority: CN
Inventors: 周金林; 王方方; 旷策嫣; 龚海燕; 张厚双; 曹杰; 周勇志
Original assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Current assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Priority date: 2018-05-29
Filing date: 2018-05-29
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2038-05-29
Also published as: CN110540584A

Abstract

本发明公开了一种镰形扇头蜱网格蛋白重链分子，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明还公开了镰形扇头蜱网格蛋白重链分子基因，包含编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。本发明的镰形扇头蜱网格蛋白重链分子及其基因，经基因沉默或敲除后，能明显降低蜱的上体率，显著影响蜱的吸血，使蜱的死亡率达到100％，有望成为抗蜱疫苗和蜱传病防治的候选分子，具有广阔的应用前景。

Description

镰形扇头蜱网格蛋白重链分子及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种镰形扇头蜱网格蛋白重链分子及其应用。

背景技术

蜱是一类专门寄生于脊椎动物体表的非永久性寄生虫，是世界上仅次于蚊子的第二大传播媒介。蜱叮咬宿主并将病原体传播给宿主，对宿主造成伤害,严重阻碍了畜牧业的发展，造成了很大的经济损失。蜱还可传播各种病原体给人类，如莱姆病、出血热和新型布里亚病毒病等，造成全身感染，严重者会因多器官功能衰竭而造成人的死亡。然而现阶段预防蜱叮咬的方法比较局限，主要是化学药物驱蜱，不能从根本上解决蜱及蜱传病，而且容易产生耐药性，因此亟需找到新方法杀蜱，如疫苗或者双链RNA等生物杀虫剂。

蜱叮咬宿主并吸血，直到饱血后从宿主体表脱落下来，蜱的营养供给来自于宿主的血液，以满足蜱卵巢组织的发育成熟，进而繁殖后代。因此，营养物质如卵黄蛋白原进入卵细胞需要卵黄蛋白原受体的介导，可能还需要由卵细胞内网格蛋白依赖型内吞途径所产生的细胞信号转导级联反应，将卵黄蛋白原运输到卵细胞内，说明网格蛋白在营养物质入胞过程中发挥着重要作用。另外，病原体的入胞过程需要网格蛋白介导的内吞途径，那么蜱体内的网格蛋白重链(CHC)在蜱传病原体的传播过程中是否也发挥着重要作用？有文献报道，蜱可通过卵黄蛋白原受体垂直传播巴贝斯虫。卵黄蛋白原受体不仅可以激活胞内网格蛋白依赖型内吞途径，以维持组织器官发育中细胞间的信号转导，包括营养物质的吸收，细胞生长和分化以及免疫反应等，而且还有助于病原体入侵并感染宿主细胞。一直以来，网格蛋白介导的内吞途径在果蝇等其它物种中的研究较为广泛，而网格蛋白重链(CHC)基因在蜱中的研究还没有文献报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种镰形扇头蜱网格蛋白重链分子及其基因，该镰形扇头蜱网格蛋白重链分子可以作为抗蜱疫苗和蜱传病防治的候选分子。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种镰形扇头蜱网格蛋白重链分子，具有SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种镰形扇头蜱网格蛋白重链分子基因，其包含：编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

优选的，所述镰形扇头蜱网格蛋白重链分子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的另一方面，还提供了一种重组载体，包含上述镰形扇头蜱网格蛋白重链分子基因的核苷酸序列。

所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体的宿主细胞。

在本发明的另一方面，还提供了一种抑制上述镰形扇头蜱网格蛋白重链分子活性的物质，该物质包括各种蛋白活性抑制剂等。

在本发明的另一方面，还提供了一种抑制上述镰形扇头蜱网格蛋白重链分子基因表达的物质。所述物质包括：抑制上述镰形扇头蜱网格蛋白重链分子基因表达的dsRNA。

优选的，所述dsRNA为SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列和其反向互补序列组成的双链RNA。

在本发明的另一方面，还提供了一种抗蜱疫苗，包含上述镰形扇头蜱网格蛋白重链分子或其部分活性片段。

在本发明的另一方面，还提供了一种产品，包含抑制镰形扇头蜱网格蛋白重链分子活性或抑制镰形扇头蜱网格蛋白重链分子基因表达的物质，其具有下述(1)-(3)中任一种功能：(1)防治蜱传病；(2)防控蜱的叮咬；(3)抑制雌蜱产卵。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述镰形扇头蜱网格蛋白重链分子或镰形扇头蜱网格蛋白重链分子基因的应用，用于制备防治蜱传病的生物杀虫剂。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述抑制镰形扇头蜱网格蛋白重链分子活性或抑制镰形扇头蜱网格蛋白重链分子基因表达的物质的应用，用于制备防治蜱传病的生物杀虫剂。

本发明的镰形扇头蜱网格蛋白重链分子CHC，由RNA干扰实验证明，CHC基因沉默或敲除，能明显降低蜱的上体率，显著影响蜱的吸血，使蜱的死亡率达到100％，CHC基因有望成为抗蜱疫苗和蜱传病防治的候选分子，具有广阔的应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的镰形扇头蜱网格蛋白重链基因序列分析图；

图2是本发明实施例2的镰形扇头蜱网格蛋白重链基因的表达分布图；

图3是本发明实施例3的镰形扇头蜱网格蛋白重链基因干扰后对蜱生物学特性的影响结果图。

具体实施方式

为寻找到抗蜱疫苗或者蜱传病防治的候选分子，本发明首次从镰形扇头蜱中获得网格蛋白重链分子CHC基因，通过对镰形扇头蜱CHC基因的克隆、表达分布及其对蜱吸血等生物学特性的影响进行实验，结果表明，CHC基因沉默或敲除后，能显著降低蜱的上体和蜱的体积大小，使蜱的饱血率低至4.55％，死亡率高达100％，说明本发明的CHC基因适于作为抗蜱疫苗和蜱传病防治的候选分子。

实施例1镰形扇头蜱网格蛋白重链分子(CHC)的基因克隆和序列分析

1.材料与方法

1.1.蜱与实验动物

镰形扇头蜱(采自湖北武汉，后经本实验室繁殖传代)，主要是将蜱接种到新西兰大白兔耳朵上，让其吸血，待饱血后自行脱落，并在温度为25℃，相对湿度为95％的生化培养箱中培养蜕皮成下一个发育阶段，并保存。

1.2.细菌与质粒

质粒构建用到的是大肠杆菌Top 10细胞(TIANGEN)。克隆测序载体用到的是pMD-19T Easy(Takara)。

1.3.镰形扇头蜱不同吸血阶段以及不同组织器官材料的收集

为进一步研究镰形扇头蜱网格蛋白重链基因的表达特征，收集卵、未吸血状态下的幼蜱、若蜱和成蜱，以及半饱血状态下的幼蜱、若蜱和成蜱，并解剖了未吸血和半饱血状态下的成蜱，获得卵巢、唾液腺、脂肪体和中肠组织。解剖方法如下：

将雌蜱用胶粘在平皿上，背部朝上，固定好之后将蜱泡在1×PBS缓冲液中。在光学显微镜或者体视显微镜下，用手术刀将蜱的腹部与背部分开，脂肪体存在于背壳上，用弯镊子将脂肪体刮下，再用镊子和细针将唾液腺、肠道和卵巢分开，清洗干净后被放于含有Trizol液体的EP管中用于总RNA提取。

1.4.总RNA的提取及第一链cDNA的合成

用TRIzol reagent(Invitrogen)提取镰形扇头蜱不同吸血阶段以及不同组织器官的总RNA，首先将总RNA经过DNaseⅠ(TAKARA)消化，以去除其中的基因组DNA。通过反转录酶将总RNA合成第一链cDNA，进行后续的基因扩增和荧光定量PCR，整个步骤按照反转录试剂盒Reverse Transcription System Kit with gDNA eraser(perfect real time,Takara,Dalian,China)说明书进行操作。

1.5.网格蛋白重链的分子克隆

网格蛋白重链开放阅读框的扩增以镰形扇头蜱半饱血或者饱血成蜱的卵巢cDNA为模板，将序列分为两个片段设计引物，引物如下：

Chc F1:5’-ATGACGCAGATACTACCGATACGCT-3’(SEQ ID NO.3)；

Chc R1:5’-CATTGCACACCTGGACAAGCTCT-3’(SEQ ID NO.4)；

Chc F2:5’-TAGACTCCAACAACAACCCCGAG-3’(SEQ ID NO.5)；

Chc R2:5’-CATGCTGTAGCCTTGGTAGCCTG-3’(SEQ ID NO.6)；

纯化后的PCR扩增产物连接到克隆载体pMD-19 T Easy(Takara)中进行测序；最后再以上述两个扩增片段的质粒为模板，使用引物Chc F1和Chc R2，将网格蛋白重链的开放阅读框扩增出来，纯化后的PCR扩增产物连接到克隆载体pMD-19 T Easy(Takara)中进行测序。

2.结果

从镰形扇头蜱雌蜱卵巢的mRNA中，获得了基因CHC的开放阅读框5013bp(SEQ IDNO.2)，编码1670个氨基酸(SEQ ID NO.1)。预测的蛋白分子量为190.8kDa，等电点为5.52。预测其信号肽序列，发现CHC基因无信号肽。将CHC基因预测的氨基酸序列进行BLAST非冗余数据库分析，结果显示预测蛋白与其他物种的CHC具有一定的相似度。CHC的氨基酸序列与肩突硬蜱(Ixodes scapularis)CHC(XP_002406240.1)相似性为89.83％，与中国黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)CHC(NP_477042.1)的相似性为81.77％，与埃及伊蚊(Aedesaegypti)CHC(XP_021710115.1)的相似性为83.14％，与人(Homo sapiens)CHC(NP_009029.3)的相似性为77.43％(见图1A所示的进化树)。而且活性预测发现，网格蛋白重链基因有五个网格蛋白螺旋桨重复域，一个网格蛋白重链连接器，一个网格蛋白连接域和七个网格蛋白重链重复结构域，网格蛋白重链重复结构域分别是537-679氨基酸，686-828氨基酸，833-972氨基酸，979-1124氨基酸，1128-1269氨基酸，1274-1420氨基酸和1423-1582氨基酸，这些区域是网格蛋白和滤泡分拣蛋白域，每个大约有140个氨基酸，是由多个α螺旋组成(见图1B所示的网格蛋白重链基因结构域示意图)。

实施例2 RT-qPCR检测镰形扇头蜱网格蛋白重链CHC基因的动态分布

根据网格蛋白重链基因的ORF序列设计荧光定量PCR的引物，引物序列如下：

CHC-qRTPCR-F:5'-CTACGAGTGCTTTGGTGCCT-3'(SEQ ID NO.7)；

CHC-qRTPCR-R:5'-GTGATGTATTCCCGCATGACCT-3'(SEQ ID NO.8)。

根据内参基因的全长序列设计引物如下：

ELFⅠA-QRT-PCR-F:5’-CGTCTACAAGATTGGTGGCATT-3’(SEQ ID NO.9)；

ELFⅠA-QRT-PCR-R:5’-CTCAGTGGTCAGGTTGGCAG-3’(SEQ ID NO.10)。

荧光定量PCR的反应体系按照试剂盒说明书进行操作，以镰形扇头蜱不同材料反转录获得的cDNA为模板，进行两步法实时定量PCR法分析。根据Takara操作说明，ABI7500Real-time PCR系统，采用的两步法PCR扩增标准程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，共40个循环，随后添加上溶解曲线。

结果：为了检测CHC基因的表达分布情况，使用RT-qPCR方法检测CHC基因在镰形扇头蜱的不同发育阶段和半饱血状态下的不同组织器官中的转录水平。结果发现，CHC基因分布比较广泛，而且吸血可以促进CHC基因在幼蜱和若蜱的转录水平(图2A)，在半饱血状态下的成蜱中，CHC基因主要在卵巢和中肠中高表达(图2B)，说明CHC基因可能与营养物质的入胞吸收有一定的关系。图2中，A为在不同发育阶段的表达分布图；B为在半饱血状态下的不同组织器官中的表达分布图。

实施例3镰形扇头蜱网格蛋白重链dsRNA的合成及RNA干扰

以CHC-pMD-19 T easy质粒(RNAi序列长度在830bp左右)为模板，以CHC RNAi-1F、CHC RNAi-1R、CHC RNAi-2F、CHC RNAi-2R为引物(斜体加粗部分为T7启动子序列)，PCR扩增含有T7启动子序列的网格蛋白重链序列，然后对PCR产物进行胶回收纯化。其中，RNAi以luciferase基因RNAi(RNAi序列在600bp左右)作为对照组。随后，以上述PCR扩增获得的含T7启动子序列的网格蛋白重链序列为模板(SEQ ID NO.19所示的DNA序列)，利用T7RiboMAX^TMExpress RNAi System(Promega)试剂盒，体外转录生成网格蛋白重链的双链RNA(dsRNA)，该双链RNA由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，其反义链的核苷酸序列为SEQ ID NO.20的反向互补序列。

CHC RNAi-1F:5’-TAATACGACTCACTATAGGCAGATAGTGGACGTGTTCATGG-3’(SEQ IDNO.11)；

CHC RNAi-1R:5’-TCGGCACAGTCCACATCCA-3’(SEQ ID NO.12)；

CHC RNAi-2F:5’-CAGATAGTGGACGTGTTCATGG-3’(SEQ ID NO.13)；

CHC RNAi-2R:5’-TAATACGACTCACTATAGGTCGGCACAGTCCACATCCA-3’(SEQ IDNO.14)。

Luciferase

RNAi-1F:5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGCTTCCATCTTCCAGGGATAC-3’(SEQ IDNO.15)；

Luciferase RNAi-1R:5’-CGTCCACAAACACAACTCCTCC-3’(SEQ ID NO.16)；

Luciferase RNAi-2F:5’-GCTTCCATCTTCCAGGGATACG-3’(SEQ ID NO.17)；

Luciferase

RNAi-2R:5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCGTCCACAAACACAACTCCTC-3’(SEQ IDNO.18)。

选择同一批未吸血状态下的镰形扇头蜱成蜱(雌蜱和雄蜱)，分为实验组和对照组，实验组雌蜱注射CHC基因的dsRNA，对照组雌蜱注射Luciferase基因的dsRNA。在光学显微镜下找到蜱的第4肢基节部位，将CHC基因和luciferase基因dsRNA分别显微注射到蜱体内，雄蜱不作任何处理；注射后的蜱在25℃，95％相对湿度的生化培养箱中放置24h，观察蜱的生活状态及死亡率。第二天，将实验组的雌雄蜱接种在兔子的一只耳朵上，对照组接种在该兔子的另一只耳朵上，并观察蜱的24h上体率、死亡率、饱血重量、饱血率和产卵率等，以判断CHC基因沉默后对蜱的生物学特征的影响。

结果：CHC基因沉默或敲除后，显著降低了蜱的上体和蜱的体积大小(图3A)；CHC基因干扰组只有两只蜱达到饱血状态，且饱血体重低于对照组(图3B)；CHC基因干扰组的饱血率低至4.55％，死亡率高达100％(图3C)。图3中，A为上体率图；B为饱血体重图；C为对其它生物学特性的影响图。

以上结果说明CHC基因沉默或敲除后显著影响蜱的吸血，CHC基因可以作为抗蜱疫苗和蜱传病防治的候选分子。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

<120> 镰形扇头蜱网格蛋白重链分子及其应用

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1670

<212> PRT

<213> 镰形扇头蜱（Rhipicephalus haemaphysaloide）

<400> 1

Met Thr Gln Ile Leu Pro Ile Arg Phe Gln Glu His Leu Gln Leu Thr

1 5 10 15

Asn Ile Gly Ile Asn Ala Ala Asn Val Gly Phe Asn Thr Leu Thr Met

20 25 30

Glu Ser Asp Lys Phe Ile Cys Val Arg Glu Lys Val Gly Asp Ala Ala

35 40 45

Gln Val Val Ile Val Asp Met Ala Asn Pro Thr Asn Pro Ile Arg Arg

50 55 60

Pro Ile Ser Ala Asp Ser Ala Ile Met Asn Pro Ala Ser Arg Val Ile

65 70 75 80

Ala Leu Lys Ala Ser Arg Thr Leu Gln Ile Phe Asn Ile Glu Met Lys

85 90 95

Ser Lys Val Lys Ala His Thr Met Thr Glu Asp Val Val Phe Trp Lys

100 105 110

Trp Ile Asn Val Asn Thr Ile Ala Leu Val Thr Glu Gly Ala Val Tyr

115 120 125

His Trp Ser Met Glu Gly Asp Ser Gln Pro Gln Lys Met Phe Asp Arg

130 135 140

His Ser Ser Leu Ser Gly Cys Gln Ile Ile Asn Tyr Arg Thr Asp Ala

145 150 155 160

Lys Ile Gln Trp Leu Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ala Gln Gln Asn Arg

165 170 175

Val Ala Gly Ala Met Gln Leu Tyr Ser Met Glu Arg Lys Val Ser Gln

180 185 190

Pro Ile Glu Gly His Ala Ala Ala Phe Ala Gln Phe Lys Gln Glu Gly

195 200 205

Asn Thr Glu Ala Ser Thr Leu Phe Cys Phe Ala Val Arg Thr Pro His

210 215 220

Gly Gly Lys Leu His Ile Ile Glu Val Gly Gln Pro Ala Pro Gly Asn

225 230 235 240

Gln Ala Tyr Pro Lys Lys Ala Val Asp Val Phe Phe Pro Pro Glu Ala

245 250 255

Gln Asn Asp Phe Pro Val Ala Met Gln Met Ser Pro Lys His Asp Val

260 265 270

Val Phe Leu Ile Thr Lys Tyr Gly Tyr Val His Leu Tyr Asp Leu Glu

275 280 285

Thr Gly Thr Cys Ile Tyr Met Asn Arg Ile Ser Ala Asp Thr Ile Phe

290 295 300

Val Thr Ala Pro His Glu Ala Thr Ser Gly Ile Ile Gly Val Asn Arg

305 310 315 320

Lys Gly Gln Val Leu Ser Val Ser Val Glu Glu Glu Asn Ile Ile Pro

325 330 335

Tyr Ile Thr Asn Val Leu Gln Asn Pro Asp Leu Ala Leu Arg Met Ala

340 345 350

Val Arg Asn Asn Leu Ser Gly Ala Glu Asp Leu Phe Val Val Arg Phe

355 360 365

Asn Thr Leu Phe Ser Ser Gly Gln Tyr Ser Glu Ala Ala Lys Val Ala

370 375 380

Ala Asn Ala Pro Arg Gly Val Leu Arg Thr Pro Gln Thr Ile Gln Arg

385 390 395 400

Phe Gln Gln Val Pro Asn Gln Pro Gly Gln Thr Ser Pro Leu Leu Gln

405 410 415

Tyr Phe Gly Ile Leu Leu Asp Gln Gly Gln Leu Asn Lys Tyr Glu Ser

420 425 430

Leu Glu Leu Cys Arg Pro Val Leu Gln Gln Gly Arg Lys Gln Leu Leu

435 440 445

Glu Lys Trp Leu Lys Asp Asp Lys Leu Glu Cys Ser Glu Glu Leu Gly

450 455 460

Asp Leu Val Lys Gln Val Asp Pro Thr Leu Ala Leu Ser Val Tyr Leu

465 470 475 480

Arg Ala Asn Val Pro Ala Lys Val Ile Gln Cys Phe Ala Glu Thr Gly

485 490 495

Gln Phe Gln Lys Ile Val Leu Tyr Ala Lys Lys Val Gly Tyr Thr Pro

500 505 510

Asp Tyr Val Leu Leu Leu Arg Gln Val Met Arg Leu Ser Pro Asp Gln

515 520 525

Gly Thr Ala Phe Ala Gln Met Leu Val Gln Asp Glu Glu Pro Leu Ala

530 535 540

Asp Ile Asn Gln Ile Val Asp Val Phe Met Glu Ser Asn Leu Val Gln

545 550 555 560

Gln Cys Thr Ala Phe Leu Leu Asp Ala Leu Lys Asn Asn Arg Pro Ser

565 570 575

Glu Ser His Leu Gln Thr Arg Leu Leu Glu Met Asn Leu Met Thr Ala

580 585 590

Pro Gln Val Ala Asp Ala Ile Leu Gly Asn Gln Met Phe Thr His Tyr

595 600 605

Asp Arg Ala His Val Ala Gln Leu Cys Glu Lys Ala Gly Leu Leu Gln

610 615 620

Arg Ala Leu Glu His Tyr Thr Asp Leu Tyr Asp Ile Lys Arg Ala Ile

625 630 635 640

Val His Thr His Leu Leu Asn Ala Glu Trp Leu Val Asn Tyr Phe Gly

645 650 655

Ser Leu Ser Val Glu Asp Ser Leu Glu Cys Leu Arg Ala Met Leu Thr

660 665 670

His Asn Leu Arg Gln Asn Leu Gln Ile Cys Val Gln Val Ala Thr Lys

675 680 685

Tyr His Glu Gln Leu Thr Thr Thr Ala Leu Ile Asp Leu Phe Glu Ser

690 695 700

Phe Lys Ser Tyr Glu Gly Leu Phe Tyr Phe Leu Gly Ser Ile Val Asn

705 710 715 720

Phe Ser Gln Asp Pro Glu Val His Phe Lys Tyr Ile Gln Ala Ala Cys

725 730 735

Lys Thr Gly Gln Ile Lys Glu Val Glu Arg Ile Cys Arg Glu Ser Asn

740 745 750

Cys Tyr Asn Ala Glu Arg Val Lys Asn Phe Leu Lys Glu Ala Lys Leu

755 760 765

Thr Asp Gln Leu Pro Leu Ile Ile Val Cys Asp Arg Phe Asp Phe Val

770 775 780

His Asp Leu Val Leu Tyr Leu Tyr Arg Asn Ser Leu Gln Lys Tyr Ile

785 790 795 800

Glu Ile Tyr Val Gln Lys Val Asn Pro Ser Arg Leu Pro Val Val Val

805 810 815

Gly Gly Leu Leu Asp Val Asp Cys Ala Glu Glu Val Ile Lys Asn Leu

820 825 830

Ile Leu Val Val Arg Gly Gln Phe Ser Thr Asp Glu Leu Val Ala Glu

835 840 845

Val Glu Lys Arg Asn Arg Leu Lys Leu Leu Leu Pro Trp Leu Glu Gly

850 855 860

Arg Leu His Glu Gly Cys Gln Glu Pro Ala Thr His Asn Ala Leu Ala

865 870 875 880

Lys Ile Tyr Ile Asp Ser Asn Asn Asn Pro Glu Arg Phe Leu Arg Glu

885 890 895

Asn Pro Phe Tyr Asp Ser Thr Val Val Gly Arg Tyr Cys Glu Lys Arg

900 905 910

Asp Pro His Leu Ala Cys Ile Ala Tyr Glu Arg Gly Gln Cys Asp Arg

915 920 925

Glu Leu Val Gln Val Cys Asn Glu Asn Ser Leu Phe Lys Ser Glu Ala

930 935 940

Arg Tyr Leu Val Arg Arg Arg Asp Pro Asp Leu Trp Ala Glu Val Leu

945 950 955 960

Ala Glu Ser Asn Pro Phe Arg Arg Pro Leu Ile Asp Gln Val Val Gln

965 970 975

Thr Ala Leu Ser Glu Thr Gln Asp Pro Glu Asp Ile Ser Val Thr Val

980 985 990

Lys Ala Phe Met Thr Ala Asp Leu Pro Asn Glu Leu Ile Glu Leu Leu

995 1000 1005

Glu Lys Ile Val Leu Glu Asn Ser Val Phe Ser Asp His Arg Asn

1010 1015 1020

Leu Gln Asn Leu Leu Ile Leu Thr Ala Ile Lys Ala Asp Arg Ser

1025 1030 1035

Arg Val Met Glu Tyr Ile Asn Arg Leu Asp Asn Tyr Asp Ala Pro

1040 1045 1050

Asp Ile Ala Asn Ile Ala Ile Gly Ser Glu Leu Tyr Glu Glu Ala

1055 1060 1065

Phe Ala Ile Phe Arg Lys Phe Asp Val Asn Thr Ser Ala Ile Gln

1070 1075 1080

Val Leu Ile Glu His Ile Gln Asn Leu Asp Arg Ala Tyr Glu Phe

1085 1090 1095

Ala Glu Arg Cys Asn Glu Pro Gly Val Trp Ser Gln Leu Ala Arg

1100 1105 1110

Ala Gln Leu Ser Gln Gly Met Val Lys Glu Ala Ile Asp Ser Phe

1115 1120 1125

Ile Lys Ala Gly Asp His Thr Ala Tyr Leu Asp Val Val Gln Thr

1130 1135 1140

Ala His Lys Thr Gly Ser Trp Glu Asp Leu Val Arg Tyr Leu Gln

1145 1150 1155

Met Ala Arg Lys Lys Gly Arg Glu Ser Tyr Val Glu Ser Glu Leu

1160 1165 1170

Ile Tyr Ala Tyr Ala Lys Thr Asn Arg Leu Ala Asp Leu Glu Glu

1175 1180 1185

Phe Val Ser Gly Pro Asn His Ala Asp Val Gln Arg Ile Gly Asp

1190 1195 1200

Arg Cys Phe Glu Asp Gly Leu Tyr Glu Pro Ala Lys Leu Leu Tyr

1205 1210 1215

Asn Asn Val Ser Asn Phe Ala Arg Leu Ala Ile Thr Leu Val His

1220 1225 1230

Leu Lys Glu Phe Gln Gly Ala Val Asp Ser Ala Arg Lys Ala Asn

1235 1240 1245

Ser Thr Arg Thr Trp Lys Glu Val Cys Phe Ala Cys Val Asp Ser

1250 1255 1260

Glu Glu Phe Arg Leu Ala Gln Met Cys Gly Leu His Ile Val Val

1265 1270 1275

His Ala Asp Glu Leu Glu Asp Leu Ile Asn Tyr Tyr Gln Asp Arg

1280 1285 1290

Gly Tyr Phe Glu Glu Leu Ile Ser Leu Leu Glu Ala Ala Leu Gly

1295 1300 1305

Leu Glu Arg Ala His Met Gly Met Phe Thr Glu Leu Ala Ile Leu

1310 1315 1320

Tyr Ser Lys Tyr Lys Pro Gly Lys Met Arg Glu His Leu Glu Leu

1325 1330 1335

Phe Trp Ser Arg Val Asn Ile Pro Lys Val Leu Arg Ala Ala Glu

1340 1345 1350

Gln Ala His Leu Trp Ala Glu Leu Val Phe Leu Tyr Asp Lys Tyr

1355 1360 1365

Glu Glu Phe Asp Asn Ala Val Val Thr Met Met Gln His Pro Thr

1370 1375 1380

Glu Ala Trp Arg Glu Ala His Phe Lys Glu Ile Ile Thr Lys Val

1385 1390 1395

Ala Asn Ile Glu Leu Tyr Tyr Arg Ala Val Gln Phe Tyr Leu Asp

1400 1405 1410

His Lys Pro Met Leu Leu Asn Asp Leu Leu Leu Val Leu Ala Pro

1415 1420 1425

Arg Met Asp His Thr Arg Ala Val Gly His Phe Ser Arg Val Gly

1430 1435 1440

His Leu Pro Leu Val Lys Pro Tyr Leu Arg Ser Val Gln Ser Leu

1445 1450 1455

Asn Asn Lys Ala Val Asn Glu Ala Leu Asn Gly Leu Leu Ile Glu

1460 1465 1470

Glu Glu Asp Phe Gln Gly Leu Arg Thr Ser Ile Asp Ala Phe Asp

1475 1480 1485

Asn Phe Asp Asn Ile Ala Leu Ala Gln Arg Leu Glu Arg His Asp

1490 1495 1500

Leu Val Glu Phe Arg Arg Leu Ala Ala Tyr Leu Tyr Lys Gly Asn

1505 1510 1515

Asn Arg Trp Lys Gln Ser Val Glu Leu Cys Lys Lys Asp Arg Leu

1520 1525 1530

Phe Arg Asp Ala Met Glu Tyr Ala Ala Glu Ser Lys Asn Ala Glu

1535 1540 1545

Thr Ala Glu Glu Leu Leu Ser Trp Phe Leu Asp Glu Lys Asn Tyr

1550 1555 1560

Glu Cys Phe Gly Ala Cys Leu Phe Gln Cys Tyr Asp Leu Leu His

1565 1570 1575

Pro Asp Val Ile Leu Glu Leu Ala Trp Lys His Asn Ile Met Asp

1580 1585 1590

Phe Ala Met Pro Tyr Phe Val Gln Val Met Arg Glu Tyr Ile Thr

1595 1600 1605

Lys Val Asp Lys Leu Glu Glu Asn Glu Asn Gln Arg Leu Glu Glu

1610 1615 1620

Ser Ala Gln Asn Glu Gln Lys Pro Leu Val Tyr Ala Pro Glu Pro

1625 1630 1635

Gln Leu Met Leu Thr Ala Pro Pro Gly Met Leu Gly Ala Pro Gly

1640 1645 1650

Tyr Ala Pro Pro Tyr Gly Ala Pro Met Pro Gly Tyr Gln Gly Tyr

1655 1660 1665

Ser Met

1670

<210> 2

<211> 5013

<212> DNA

<213> 镰形扇头蜱（Rhipicephalus haemaphysaloide）

<400> 2

atgacgcaga tactaccgat acgcttccaa gagcacttac agctcaccaa catagggatc 60

aatgcagcca acgtgggttt caacacactc accatggagt cggacaagtt catctgcgtc 120

cgagagaaag tcggggacgc tgcacaggtg gttattgtgg acatggccaa cccgaccaac 180

cccatccggc ggcccatctc ggccgactcg gccatcatga accccgcctc gcgagtcatc 240

gccctcaagg cgtcgcgcac cctgcagatc ttcaacattg agatgaagag caaagtgaag 300

gcgcacacca tgacggagga cgtggtcttc tggaagtgga tcaacgtcaa cacgatcgct 360

ctggtcacag agggggccgt ctaccactgg agcatggagg gggactccca accgcagaag 420

atgttcgacc gccactccag cctcagcggc tgccagatca tcaactaccg gactgacgcc 480

aagatccagt ggctgctcct gatcggcatc tcggcccagc agaaccgggt ggccggggcc 540

atgcagctct actcgatgga gcgtaaagtg agtcagccca tcgagggcca cgccgccgcc 600

tttgcccagt tcaagcagga gggcaacaca gaggcctcga cgctcttctg ctttgccgtg 660

cggacgccgc acggtggcaa gctgcacata atcgaggtgg gccagcccgc gcccggcaac 720

caggcgtatc cgaagaaggc ggtggatgtg ttcttcccgc ccgaggcaca gaacgacttc 780

ccggtggcca tgcagatgag ccccaagcac gacgtggtgt tcctcatcac gaaatacggc 840

tacgtgcact tgtacgacct ggagactggc acctgtatct acatgaaccg tatctcggcc 900

gacactattt tcgttaccgc gccccacgag gccacttcgg gcatcatcgg agtcaaccgc 960

aagggacagg tcctgtcagt gagtgtggaa gaagagaaca tcatcccgta catcacaaac 1020

gtcctccaga acccagacct ggcactgcgc atggcagtgc gtaacaacct gtcgggtgcc 1080

gaggacctct ttgttgtgcg cttcaacaca ctgttcagca gcggccagta ctctgaggcg 1140

gccaaggtgg cggccaacgc cccgcgcggg gtcctgcgca cgccgcagac gatccagcgc 1200

ttccagcagg tgcccaacca gccgggccag acatcgccgc tgctgcagta ctttggcatc 1260

ctgctggacc aaggccagct gaacaagtac gagtccctgg agctgtgtcg gcccgtgctg 1320

cagcagggcc gcaagcagct gctcgagaag tggctcaagg atgacaagct cgagtgcagc 1380

gaagagctcg gtgacctcgt gaagcaggtg gacccgacgc tggcactgtc cgtctacctg 1440

cgtgccaacg tgcccgccaa ggtgattcag tgctttgccg agacgggcca gttccagaag 1500

attgtgctgt acgccaagaa ggtgggctac acgcccgact acgtgctgct gctgcgtcag 1560

gtgatgcggc tcagccccga ccagggcact gcctttgccc agatgctggt gcaggacgag 1620

gagcccctgg ccgacataaa ccagatagtg gacgtgttca tggagtccaa cttagtccag 1680

cagtgcacgg cattcctgct ggatgccctg aagaacaacc gaccctctga aagccacctc 1740

cagacgagac tgctggagat gaacctgatg acggcgccgc aggtggccga tgccatcctg 1800

ggcaaccaga tgttcaccca ctacgaccgt gcccacgtgg cacagctctg tgagaaggcg 1860

ggcctcctcc agcgggccct ggaacactac accgacctgt acgacataaa gcgggccatc 1920

gtgcacaccc acctcctgaa cgctgagtgg ctggtgaact actttggctc gctgtcagtg 1980

gaggactccc tggagtgcct gcgggccatg ctgacacaca acctgcgaca gaacctgcag 2040

atttgcgtgc aggtggccac caagtaccac gagcagctga cgactacggc tctcatcgac 2100

cttttcgagt cgttcaagag ctacgagggc ctcttctact tcctcggctc cattgtgaac 2160

ttcagccagg acccggaggt gcacttcaag tacatccagg ccgcctgcaa gacggggcag 2220

atcaaggagg tggagcgtat ctgccgagag agcaactgct acaatgctga gcgagtcaag 2280

aacttcctca aggaggccaa gctgactgac cagctgccgc tgatcatcgt atgtgaccgc 2340

ttcgacttcg tccacgacct tgtactctac ctgtaccgaa actccctgca gaagtacatc 2400

gagatctacg tccaaaaggt gaacccttca cgtctgcccg tggtggtggg cggtctgctg 2460

gatgtggact gtgccgagga ggtgatcaag aacctcatcc tggtggtgcg tggccagttt 2520

tcgactgacg agctggtggc cgaggtggag aagcgcaacc ggctcaagct gctgctgccc 2580

tggctcgagg ggcggctgca cgagggctgc caggagccgg ccacccacaa tgccctggcc 2640

aagatctaca tagactccaa caacaacccc gagcggttcc tgcgcgagaa tcctttctac 2700

gacagcactg ttgtgggccg gtactgcgag aagcgcgacc cccatctggc ctgcatcgcc 2760

tacgagcggg gacagtgtga ccgagagctt gtccaggtgt gcaatgagaa ctcgctcttc 2820

aagagcgagg ctcgctacct ggttcggcgg cgagatccgg acctctgggc ggaggttctg 2880

gcagagagca atccgttccg gcgccccctc atcgaccagg tggtccagac ggccctctcg 2940

gagacacagg accccgagga catctcggtg acagtcaagg cattcatgac ggctgacctg 3000

cccaatgagc tgattgagct gctcgagaag attgtgttgg agaactcagt tttctcggac 3060

caccgcaacc tgcagaacct gctcattttg actgccatca aggcggaccg ctcgcgtgtc 3120

atggagtaca tcaaccgact ggacaactac gatgcccccg acattgccaa cattgccatt 3180

ggcagtgaac tctacgagga ggcctttgcc atcttccgca agttcgacgt caacacgtca 3240

gccattcagg tgctgattga gcacatccag aacctggacc gggcgtacga gtttgccgag 3300

cggtgcaacg agcccggtgt ctggagccag ctggcccgtg cccagctgag ccaaggcatg 3360

gtcaaggagg ccatcgactc gttcatcaag gcgggcgacc acaccgccta cctggacgtg 3420

gtgcagactg cccacaagac gggctcgtgg gaggacctgg tgcggtacct gcagatggcg 3480

cgcaagaagg ggcgggagtc gtacgtcgag tctgagctga tctatgcata cgccaagacc 3540

aaccgtctgg ccgacctgga ggagtttgtg tcgggcccca accacgcgga cgtgcagcgc 3600

atcggcgacc gttgcttcga ggacggcctg tacgagccgg ccaagctcct gtacaacaac 3660

gtgtccaact ttgcccgcct ggccatcacc ttggtgcacc tgaaggagtt ccagggtgcc 3720

gtggactcgg cgcgcaaggc caactcgacg cgcacctgga aggaggtgtg ctttgcatgc 3780

gtggacagcg aggagtttcg gctggctcag atgtgcggcc tgcacattgt ggtgcacgcc 3840

gacgagctcg aggacctcat caactactac caggacaggg gttacttcga ggagctcatc 3900

tctctgctgg aggccgctct ggggctggaa cgtgcccaca tgggcatgtt caccgagctg 3960

gccatcctct actccaagta caagcccggc aagatgcgcg agcacctcga gctcttctgg 4020

tcgcgcgtca acattcccaa ggtgctgcga gccgccgagc aggcgcacct gtgggccgaa 4080

ctggtgttcc tctacgacaa gtacgaggag tttgacaatg ctgtggtcac catgatgcag 4140

cacccgacgg aagcctggcg ggaggcacac ttcaaggaaa tcatcaccaa ggttgcgaac 4200

atcgagctct actatcgggc tgtgcaattt tacctggacc acaaaccaat gctgctgaac 4260

gacctgctgc tggtgctggc cccccgcatg gaccacacgc gtgccgtggg ccacttcagt 4320

cgagtggggc acttgcccct ggtcaagccg tacctgcgct cggtgcagag cctcaacaac 4380

aaggctgtca acgaggccct caacggcctg ctgatcgagg aggaggactt ccagggtctg 4440

cgcacctcca tcgacgcctt cgacaacttc gacaacattg ccctggcaca gcggctggag 4500

cggcacgacc tggtggagtt cagacgcctg gccgcttatc tgtacaaggg caataaccgc 4560

tggaagcagt cggtggaact gtgcaagaag gatcgcctgt tccgggacgc gatggagtat 4620

gcggcagagt ccaagaatgc cgagacggcc gaggagctgc tgagttggtt cctggacgag 4680

aagaactacg agtgctttgg tgcctgtctg ttccagtgct acgacctgct gcaccccgac 4740

gtcatcctcg agcttgcatg gaagcacaac atcatggact ttgctatgcc ctactttgtg 4800

caggtcatgc gggaatacat caccaaggtt gacaagctag aagagaacga gaaccagagg 4860

ctggaagaat ctgcacagaa tgaacagaag ccccttgtct acgccccgga gccccagcta 4920

atgttgacag caccaccagg catgttgggt gcaccaggct acgcacctcc ctatggggca 4980

cccatgccag gctaccaagg ctacagcatg tag 5013

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 3

atgacgcaga tactaccgat acgct 25

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 4

cattgcacac ctggacaagc tct 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 5

tagactccaa caacaacccc gag 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 6

catgctgtag ccttggtagc ctg 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 7

ctacgagtgc tttggtgcct 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 8

gtgatgtatt cccgcatgac ct 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 9

cgtctacaag attggtggca tt 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 10

ctcagtggtc aggttggcag 20

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 11

taatacgact cactataggc agatagtgga cgtgttcatg g 41

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 12

tcggcacagt ccacatcca 19

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 13

cagatagtgg acgtgttcat gg 22

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 14

taatacgact cactataggt cggcacagtc cacatcca 38

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 15

ggatcctaat acgactcact atagggcttc catcttccag ggatac 46

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 16

cgtccacaaa cacaactcct cc 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 17

gcttccatct tccagggata cg 22

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 18

ggatcctaat acgactcact ataggcgtcc acaaacacaa ctcctc 46

<210> 19

<211> 836

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 19

cagatagtgg acgtgttcat ggagtccaac ttagtccagc agtgcacggc attcctgctg 60

gatgccctga agaacaaccg accctctgaa agccacctcc agacgagact gctggagatg 120

aacctgatga cggcgccgca ggtggccgat gccatcctgg gcaaccagat gttcacccac 180

tacgaccgtg cccacgtggc acagctctgt gagaaggcgg gcctcctcca gcgggccctg 240

gaacactaca ccgacctgta cgacataaag cgggccatcg tgcacaccca cctcctgaac 300

gctgagtggc tggtgaacta ctttggctcg ctgtcagtgg aggactccct ggagtgcctg 360

cgggccatgc tgacacacaa cctgcgacag aacctgcaga tttgcgtgca ggtggccacc 420

aagtaccacg agcagctgac gactacggct ctcatcgacc ttttcgagtc gttcaagagc 480

tacgagggcc tcttctactt cctcggctcc attgtgaact tcagccagga cccggaggtg 540

cacttcaagt acatccaggc cgcctgcaag acggggcaga tcaaggaggt ggagcgtatc 600

tgccgagaga gcaactgcta caatgctgag cgagtcaaga acttcctcaa ggaggccaag 660

ctgactgacc agctgccgct gatcatcgta tgtgaccgct tcgacttcgt ccacgacctt 720

gtactctacc tgtaccgaaa ctccctgcag aagtacatcg agatctacgt ccaaaaggtg 780

aacccttcac gtctgcccgt ggtggtgggc ggtctgctgg atgtggactg tgccga 836

<210> 20

<211> 836

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 20

cagauagugg acguguucau ggaguccaac uuaguccagc agugcacggc auuccugcug 60

gaugcccuga agaacaaccg acccucugaa agccaccucc agacgagacu gcuggagaug 120

aaccugauga cggcgccgca gguggccgau gccauccugg gcaaccagau guucacccac 180

uacgaccgug cccacguggc acagcucugu gagaaggcgg gccuccucca gcgggcccug 240

gaacacuaca ccgaccugua cgacauaaag cgggccaucg ugcacaccca ccuccugaac 300

gcugaguggc uggugaacua cuuuggcucg cugucagugg aggacucccu ggagugccug 360

cgggccaugc ugacacacaa ccugcgacag aaccugcaga uuugcgugca gguggccacc 420

aaguaccacg agcagcugac gacuacggcu cucaucgacc uuuucgaguc guucaagagc 480

uacgagggcc ucuucuacuu ccucggcucc auugugaacu ucagccagga cccggaggug 540

cacuucaagu acauccaggc cgccugcaag acggggcaga ucaaggaggu ggagcguauc 600

ugccgagaga gcaacugcua caaugcugag cgagucaaga acuuccucaa ggaggccaag 660

cugacugacc agcugccgcu gaucaucgua ugugaccgcu ucgacuucgu ccacgaccuu 720

guacucuacc uguaccgaaa cucccugcag aaguacaucg agaucuacgu ccaaaaggug 780

aacccuucac gucugcccgu gguggugggc ggucugcugg auguggacug ugccga 836

Claims

1.一种镰形扇头蜱网格蛋白重链分子，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种镰形扇头蜱网格蛋白重链分子基因，其基因序列为编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的镰形扇头蜱网格蛋白重链分子基因，其特征在于，所述镰形扇头蜱网格蛋白重链分子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.抑制权利要求2所述镰形扇头蜱网格蛋白重链分子基因表达的物质，所述物质包括：抑制权利要求2所述镰形扇头蜱网格蛋白重链分子基因表达的dsRNA。

5.根据权利要求4所述的物质，其特征在于，所述dsRNA为SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列和其反向互补序列组成的双链RNA。

6.一种抗蜱疫苗，包含权利要求1所述的镰形扇头蜱网格蛋白重链分子。

7.一种产品，包含权利要求4或5所述的物质，其具有下述(1)-(3)中任一种功能：

(1)防治蜱传病；

(2)防控蜱的叮咬；

(3)抑制雌蜱产卵。

8.权利要求1所述镰形扇头蜱网格蛋白重链分子或权利要求2所述镰形扇头蜱网格蛋白重链分子基因或权利要求4或5所述物质的应用，用于制备防治蜱传病的生物杀虫剂。