CN109072216A

CN109072216A - 变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶及龙涎香醇的制备方法

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Publication number: CN109072216A
Application number: CN201780015243.4A
Authority: CN
Inventors: 佐藤努; 奥野琴音; 竹花稔彦; 小池诚治
Original assignee: Niigata University NUC; Asahi Denka Kogyo KK
Current assignee: Adeka Corp; Niigata University NUC
Priority date: 2016-03-04
Filing date: 2017-03-03
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2037-03-03
Also published as: EP3441463A1; JP7036386B2; EP3441463A4; JPWO2017150695A1; CN109072216B; WO2017150695A1; CN115011572A; US20190078120A1; US10844407B2; MX2018010682A; EP3441463B1

Abstract

本发明的目的在于提供一种可简便地得到龙涎香醇的龙涎香醇的制备方法。可利用作为DXDD模体的第4位的氨基酸残基的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的四异戊烯基‑β‑姜黄烯环化酶解决所述技术问题，该环化酶：(a)以所述DXDD模体为基准，在N末端侧具有QXXXGX(W/F)模体及QXXXX(G/A)X(F/W/Y)模体，在C末端侧具有QXXXGX(F/W/Y)模体、QXXXGXW模体及QXXXGX(F/W)模体，且在距离C末端侧170个氨基酸残基以上的位置上不具有QXXXGXW模体，(b)与序列号1或13所表示的氨基酸序列的同一性为40％以上，且(c)将角鲨烯作为基质并表现出龙涎香醇生成活性。

Description

变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶及龙涎香醇的制备方法

背景技术

龙涎香(ambergris)是一种7世纪开始在世界各地得到使用的高级香料，也被用作中药。龙涎香被认为是抹香鲸利用消化管分泌物将食物(章鱼、乌贼等)的不消化物结石化并排泄出的物质，但详细的生成机制尚不明确。龙涎香的主要成分为龙涎香醇，认为龙涎香在漂浮在海上的期间因阳光和氧而受到氧化分解，生成具有各种香气的化合物。

作为龙涎香的主要成分的龙涎香醇被用作香料或药剂，但无法从自然界中大量获得。因此，人们提出了各种有机合成方法。

例如，在专利文献1中公开了一种简便廉价且效率良好地制备(+)-龙涎香醇的方法，该方法包括由龙涎香内酯(ambreinolide)制备新的磺酸衍生物，并使其与γ-环香叶基卤化物的光学活性体进行偶联的工序。

此外，在非专利文献1中公开了一种方法，其通过朱利亚(Julia)偶联反应，使由(±)(5,5,8a-三甲基八氢化-1H-螺[萘-2,2’-环氧乙烷]-1-基)甲醇合成的2-((1R,2R,4aS,8aS)-2-(甲氧基甲氧基)-2,5,5,8a-四甲基十氢化萘-1-基)乙醛与由(±)甲基6-羟基-2,2-二甲基环己烷羧酸酯合成的5-((4-((S)-2,2-二甲基-6-亚甲基环己基)丁烷-2-基)磺酰基)-1-苯基-1H-四唑进行汇集合成，得到龙涎香醇。

然而，由于以往的龙涎香醇的有机合成方法需要较多的合成阶段，反应体系复杂，因此尚未达成工业化。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平10-236996号公报

专利文献2：国际公开WO2015/033746号手册

非专利文献

非专利文献1：Tetrahedron Asymmetry,(2006)Vol.17,pp.3037-3045

非专利文献2：Biosci.Biotechnol.Biochem.,(1999)Vol.63,pp.2189-2198

非专利文献3：Biosci.Biotechnol.Biochem.,(2001)Vol.65,pp.2233-2242

非专利文献4：Biosci.Biotechnol.Biochem.,(2002)Vol.66,pp.1660-1670

非专利文献5：J.Am.Chem.Soc.,(2011)Vol.133,pp.17540-17543

非专利文献6：J.Am.Chem.Soc.,(2013)Vol.135,pp.18335-18338

发明内容

本发明要解决的技术问题

另一方面，已知有通过使用角鲨烯-藿烯环化酶的变异型酶(D377C、D377N、Y420H、Y420W等)而由角鲨烯得到作为单环性三萜的3-脱氧蓍醇A(3-deoxyachilleol A)的方法(非专利文献2～4)。

本申请的发明人发现，通过使可由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A的变异型角鲨烯-藿烯环化酶与角鲨烯进行反应，得到3-脱氧蓍醇A，进一步通过使其与四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶进行反应，可制备龙涎香醇(专利文献2)。

然而，专利文献2的方法为多阶段反应，且收率仍有改善的余地。

因此，本发明的目的在于提供一种能够简便地得到龙涎香醇的龙涎香醇的制备方法。

解决技术问题的技术手段

本申请的发明人对效率良好地制备龙涎香醇的方法进行了深入研究，结果发现，存在特定变异的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶具有由角鲨烯生成龙涎香醇的活性。该由角鲨烯产生龙涎香醇是通过利用本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A而达成的。此外，由角鲨烯产生龙涎香醇是通过利用本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，由二环性的8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯(8α-hydroxypolypoda-13,17,21-triene)生成龙涎香醇而达成的。本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶表现出上述酶活性，令人惊讶。

本发明是基于上述见解而完成的。

因此，本发明涉及：

[1]一种变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，其为作为DXDD模体的第4位的氨基酸残基的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，

(a)所述变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶以所述DXDD模体为基准，在距离N末端侧100个氨基酸残基以上的位置上具有QXXXGX(W/F)模体，在距离N末端侧10～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXX(G/A)X(F/W/Y)模体，在距离C末端侧20～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W/Y)模体，在距离C末端侧50～120个氨基酸残基的位置上具有QXXXGXW模体，及在距离C末端侧120～170个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W)模体，且在距离C末端侧170个氨基酸残基以上的位置上不具有QXXXGXW模体，(b)与序列号1或13所表示的氨基酸序列的同一性为40％以上，且(c)以角鲨烯为基质，表现出龙涎香醇生成活性。

[2]根据[1]所述的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，其中，构成所述变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的多肽为：

(1)序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的多肽、或序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的多肽；(2)由在下述氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列构成、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列、或序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列；(3)由下述氨基酸序列构成、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：与序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列的同一性为40％以上的氨基酸序列、或与序列号13所表示的氨基酸序列中中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列的同一性为40％以上的氨基酸序列；(4)包含下述氨基酸序列、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列、或序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列；(5)包含下述氨基酸序列、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：在序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列，或在序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1个或数个的氨基酸而成的氨基酸序列；或(6)包含下述氨基酸序列、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：与序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列的同一性为40％以上的氨基酸序列、或与序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列的同一性为40％以上的氨基酸序列。

[3]根据[1]或[2]所述的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，其中，所述序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸、或所述序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被半胱氨酸或甘氨酸取代。

[4]一种多核苷酸，其编码[1]～[3]中任一项所述的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶。

[5]一种微生物，其具有[4]所述的多核苷酸。

[6]根据[5]所述的微生物，其进一步具有编码羟甲基戊二酰CoA还原酶的多核苷酸。

[7]一种载体，其包含具有[4]所述的多核苷酸的DNA。

[8]一种转化体，其具有[7]所述的载体。

[9]根据[8]所述的转化体，其进一步具有载体，该载体包含具有编码羟甲基戊二酰CoA还原酶的多核苷酸的DNA。

[10]一种龙涎香醇的制备方法，其特征在于，使[1]～[3]中任一项所述的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶与角鲨烯反应，得到龙涎香醇。

[11]一种龙涎香醇的制备方法，其特征在于，培养[5]或[6]所述的微生物、或[8]或[9]所述的转化体。

发明效果

根据本发明，即使不同时使用变异型角鲨烯-藿烯环化酶，也能够以角鲨烯为基质一步合成龙涎香醇。此外，还能够通过微生物发酵，由包含在培养液中的碳源效率良好地合成龙涎香醇。

用于本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶能够由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A。此外，用于本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶能够由二环性三萜(8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯)生成龙涎香醇。

附图说明

图1为表示使用变异型角鲨烯-藿烯环化酶及四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，且以角鲨烯为基质的以往的龙涎香醇合成途径的图。

图2为表示使用本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的、由角鲨烯生成龙涎香醇的两个途径的图。

图3为表示将角鲨烯(A)、3-脱氧蓍醇A(B)、或二环性三萜(C)用作基质，使其与本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶进行反应时的生成物的图。

图4为表示本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶与作为基质的角鲨烯进行反应时产生的3-脱氧蓍醇A、二环性三萜及龙涎香醇的量在5天、10天及15天后的变化的图表。

图5为表示本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶与角鲨烯反应时，与酶反应时间的增加成正比例上升的龙涎香醇生成率的图。

图6为表示将野生型的四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因与角鲨烯反应时的生成物的图。

图7为表示通过气相色谱法对含有变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的酵母转化体的产物进行分析的色谱图的图。变异型TC为使变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶(D373C)基因表达的酵母，野生型TC为使野生型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因表达的酵母。单环性产物为3-脱氧蓍醇A，二环性产物为8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯。

图8为表示野生型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶及第373位的天冬氨酸被半胱氨酸取代的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的氨基酸序列的图。

图9为表示巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌的四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的氨基酸序列，以及酸热脂环酸芽孢杆菌的角鲨烯-藿烯环化酶的氨基酸序列的比对的图。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

[1]变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶

本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶为作为DXDD模体的第4位的氨基酸残基的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，(a)所述变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶以所述DXDD模体为基准，在距离N末端侧100个氨基酸残基以上的位置上具有QXXXGX(W/F)模体，在距离N末端侧10～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXX(G/A)X(F/W/Y)模体，在距离C末端侧20～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W/Y)模体，在距离C末端侧50～120个氨基酸残基的位置上具有QXXXGXW模体，及在距离C末端侧120～170个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W)模体，且在距离C末端侧170个氨基酸残基以上的位置上不具有QXXXGXW模体，(b)与序列号1或13所表示的氨基酸序列的同一性为40％以上，且(c)以角鲨烯为基质，表现出龙涎香醇生成活性。

其中，定义各模体或序列的罗马字母表示氨基酸的单字母缩写符号，“X”指任意的氨基酸。即，QXXXGX(W/F)模体表示从N末端侧出发向C末端侧排列有谷氨酰胺(Q)、3个任意的氨基酸(X)、甘氨酸(G)、任意的氨基酸(X)、还排列有色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)中的任一种。此外，“以DXDD模体为基准，在距离N末端侧100个氨基酸残基以上的位置上具有QXXXGX(W/F)模体”是指在DXDD模体与QXXXGX(W/F)模体之间存在100个以上的氨基酸残基，对于其他模体的特定也相同。以下只要没有特别说明，均为相同含义。

作为本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的优选形态，构成变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的多肽为：

(1)序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的多肽、或序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的多肽；

(2)由在下述氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列构成、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列、或序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列；

(3)由下述氨基酸序列构成、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：与序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列的同一性为40％以上的氨基酸序列、或与序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列的同一性为40％以上的氨基酸序列；

(4)包含下述氨基酸序列、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列、或序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列；

(5)包含下述氨基酸序列、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：在序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列，或在序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1或数个的氨基酸而成的氨基酸序列；或者

(6)包含下述氨基酸序列、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：与序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列的同一性为40％以上的氨基酸序列、或与序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列的同一性为40％以上的氨基酸序列。

此外，作为本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的最优选形态，作为构成变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的多肽，可列举出由序列号15所表示的氨基酸序列构成的来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的多肽、或由序列号16所表示的氨基酸序列构成的来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的多肽。这些变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶中，作为DXDD模体的第4位的氨基酸残基的天冬氨酸被半胱氨酸取代。

(四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶)

四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶(以下，有时称作TC)能够将在一个末端具有单环的3-脱氧蓍醇A用作基质，生成龙涎香醇。即，将3-脱氧蓍醇A用作基质时，四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶能够使3-脱氧蓍醇A未环化的一端进行选择性环化，生成两末端环化化合物。

此外，四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶能够以角鲨烯为基质，生成二环性的8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯(非专利文献5)。进一步，四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶能够使二环性的8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯未环化的一端进行选择性环化，生成作为两末端环化化合物的芒柄花环氧化物(onoceranoxide)与14β-羟基芒柄花-8(26)-烯(14β-hydroxyonocera-8(26)-e ne)。

即，四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶被分类为EC4.2.1.129，其为能够催化由水与四异戊烯基-β-姜黄烯生成バチテルペノールA(baciterpenol A)的反应、或由角鲨烯生成8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯的反应的酶。

四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，例如为芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、或土芽孢杆菌属等细菌所具有。作为芽孢杆菌属的细菌，可列举出枯草菌(枯草芽胞杆菌)、巨大芽孢杆菌、或地衣芽孢杆菌。四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶以DXDD模体为基准，在距离N末端侧100个氨基酸残基以上的位置上具有QXXXGX(W/F)模体，在距离N末端侧10～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXX(G/A)X(F/W/Y)模体，在距离C末端侧20～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W/Y)模体，在距离C末端侧50～120个氨基酸残基的位置上具有QXXXGXW模体，及在距离C末端侧120～170个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W)模体。后述的角鲨烯-藿烯环化酶也具有所述的模体，但在距离DXDD模体的C末端侧170个氨基酸残基以上的位置上进一步具有QXXXGXW模体。而四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶不具有所述QXXXGXW模体。进一步，角鲨烯-藿烯环化酶具有以下特征：在QXXXGXW模体的C末侧具有GXGFP序列，其第4位的氨基酸为苯丙氨酸(F)。四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶也具有与GXGFP序列相似的GXGXP序列，但第4位的氨基酸例如为亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、或精氨酸(R)等，并非苯丙氨酸。

(天冬氨酸的取代)

在本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶(以下，有时称作变异型TC)中，例如，序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代，或序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代。只要能够获得本发明的效果，则除天冬氨酸以外的氨基酸没有限定，可列举出丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、或酪氨酸，但优选为半胱氨酸或甘氨酸，更优选为半胱氨酸。图8中示出了巨大芽孢杆菌的野生型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶及第373位的天冬氨酸被半胱氨酸取代的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的氨基酸序列。

通过将第373位的天冬氨酸取代为除天冬氨酸以外的氨基酸，本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶可由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A，且可由8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯生成龙涎香醇。此外，通过将枯草芽孢杆菌的野生型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶及第378位的天冬氨酸取代为除天冬氨酸以外的氨基酸(特别是半胱氨酸)，本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶可由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A，且可由8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯生成龙涎香醇。

本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的来源没有特别限定，可使用所有的四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶。即，作为DXDD模体的第4位的氨基酸残基的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸(优选为半胱氨酸或甘氨酸)取代的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶能够体现出本发明的效果。即，以DXDD模体为基准，在距离N末端侧100个氨基酸残基以上的位置上具有QXXXGX(W/F)模体，在距离N末端侧10～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXX(G/A)X(F/W/Y)模体，在距离C末端侧20～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W/Y)模体，在距离C末端侧50～120个氨基酸残基的位置上具有QXXXGXW模体，及在距离C末端侧120～170个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W)模体，在距离DXDD模体的C末端侧170个氨基酸残基以上的位置上不具有QXXXGXW模体，作为DXDD模体的第4位的氨基酸残基的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸(优选为半胱氨酸或甘氨酸)取代的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶能够体现出本发明的效果。例如，虽然枯草芽胞杆菌与巨大芽孢杆菌的多肽的氨基酸序列的同一性为50％左右，但如实施例所示，通过具有本发明的特征，任何酶均可由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A，且可由8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯生成龙涎香醇。另外，序列号1中记载的氨基酸序列为巨大芽孢杆菌的四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的氨基酸序列，序列号13中记载的氨基酸序列为枯草芽胞杆菌的四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的氨基酸序列。

如图1所示，在以往，由角鲨烯生成龙涎香醇时，角鲨烯通过变异型角鲨烯-藿烯环化酶(以下，有时称作变异型SHC)变换为3-脱氧蓍醇A，并利用野生型的四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶将3-脱氧蓍醇A变换为龙涎香醇，由此进行了制备(专利文献2)。

而在使用本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，由角鲨烯生成龙涎香醇时，如图2所示，通过以单环性的3-脱氧蓍醇A为中间体的途径(以下，有时称作单环性途径)与以8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯为中间体的途径(以下，有时称作二环性途径)进行制备。

(单环性途径)

在所述单环性途径中，利用变异型TC由角鲨烯生成单环性的3-脱氧蓍醇A。然后，利用变异型TC由3-脱氧蓍醇A生成龙涎香醇。以往的野生型TC虽然能够将3-脱氧蓍醇A变换为龙涎香醇，但无法将角鲨烯变换为单环性的3-脱氧蓍醇A。本发明的变异型TC能够将角鲨烯变换为单环性的3-脱氧蓍醇A，因此，如图2所示，可利用一种酶进行由角鲨烯至3-脱氧蓍醇A的变换(图2的反应(a))及由3-脱氧蓍醇A至龙涎香醇的变换(图2的反应(b))这两个反应。

(二环性途径)

另一方面，在二环性途径中，利用变异型TC由角鲨烯生成8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯。然后，利用变异型TC由8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯生成龙涎香醇。以往的野生型TC虽然能够将角鲨烯变换为8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯，但无法将8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯变换为龙涎香醇。本发明的变异型TC能够将8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯变换为龙涎香醇，因此，如图2所示，可利用一种酶进行由角鲨烯至8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯的变换(图2的反应(c))及由8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯至龙涎香醇的变换(图2的反应(d))这两个反应。

对于本发明的变异型TC而言，在由角鲨烯制备龙涎香醇的工序中，可利用一种酶进行由角鲨烯至3-脱氧蓍醇A的变换(反应(a))、由3-脱氧蓍醇A至龙涎香醇的变换(反应(b))、由角鲨烯至8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯的变换(反应(c))、及由8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯至龙涎香醇的变换(反应(d))这四个反应。

(DXDD模体)

如上所述，在本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶中，例如，序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的取代或序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的取代存在于被称作DXDD模体的区域中。即，DXDD模体位于序列号1所表示的氨基酸序列的从N末端数起的第370～373位、或序列号12所表示的氨基酸序列的从N末端数起的第375～378位。从N末端数起的第373位或第378位的氨基酸的取代相当于，作为DXDD模体中从N末端数起的第4位的氨基酸残基的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代。DXDD模体的天冬氨酸的保守性极高，通常从N末端数起的第4位的氨基酸残基为天冬氨酸。在本发明中发现：通过使该保守性高的特定的氨基酸变异，四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶以角鲨烯为基质并具有龙涎香醇生成活性。

(缺失、取代、插入和/或添加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列)

本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的多肽也可以是由在序列号1或13的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1个或数个的氨基酸而成的氨基酸序列构成的多肽。此外，所述多肽为以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽。即，以角鲨烯为基质但不表现出龙涎香醇生成活性的多肽不包含在本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的多肽中。在本说明书中，“缺失、取代、插入和/或添加1个或数个的氨基酸而成的氨基酸序列”是指其通过氨基酸的取代等而进行了改变。氨基酸的改变个数例如可以是1～330个、1～300个、1～250个、1～200个、1～150个、1～100个或1～50个，优选为1～30个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个，最优选为1～2个。关于可用于本发明的变异肽的改变氨基酸序列的例子，可优选其氨基酸具有1个或数个(优选为1、2、3或4个)保守性取代的氨基酸序列。

(与氨基酸序列的同一性为40％以上的氨基酸序列)

本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的多肽可以是由相对于序列号1或序列号13的氨基酸序列，与氨基酸序列的同一性为40％以上的氨基酸序列构成的多肽。且所述多肽为以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽。即，以角鲨烯为基质但不表现出龙涎香醇生成活性的多肽不包含在本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的多肽中。变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶由具有由角鲨烯生成龙涎香醇的活性的多肽构成，且该多肽更优选由所述同一性为45％以上的氨基酸序列构成，更优选由所述同一性为50％以上的氨基酸序列构成，更优选由所述同一性为60％以上的氨基酸序列构成，更优选由所述同一性为70％以上的氨基酸序列构成，更优选由所述同一性为80％以上的氨基酸序列构成，更优选由所述同一性为90％以上的氨基酸序列构成，最优选由所述同一性为95％以上的氨基酸序列构成。

所述序列号1或13的氨基酸序列中，“缺失、取代、插入和/或添加1个或数个的氨基酸而成的氨基酸序列”或“同一性为40％以上的氨基酸序列”为序列号1或13的氨基酸序列经取代的序列，但该氨基酸序列的取代为维持本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶功能的保守性取代。“保守性取代”没有限定，其指使用其他化学上类似的氨基酸残基替换氨基酸残基。例如可列举出利用其他疏水性残基取代某些疏水性残基的情况，利用具有相同电荷的其他极性残基取代某些极性残基的情况等。对于能够进行上述取代的、功能类似的氨基酸，每个氨基酸在该技术领域中为公知。作为非极性(疏水性)氨基酸，例如可列举出丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，例如可列举出甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为具有正电荷的(碱性)氨基酸，可列举出精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。此外，作为具有负电荷的(酸性)氨基酸，可列举出天冬氨酸、谷氨酸等。

将本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶中作为DXDD模体的第4位的氨基酸残基的天冬氨酸变异(取代)为除天冬氨酸以外的氨基酸，是用于赋予以角鲨烯为基质生成龙涎香醇的活性的积极性取代(变异)，而所述保守性取代为用于维持以角鲨烯为基质生成龙涎香醇的活性的取代，本领域技术人员可容易地实施所述保守性取代。

(变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的模体)

图9中示出了巨大芽孢杆菌(序列号1)、枯草芽孢杆菌(序列号13)、及地衣芽孢杆菌(序列号17)的四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶、以及酸热脂环酸芽孢杆菌的角鲨烯-藿烯环化酶(序列号18)的比对。在本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶中，以所述DXDD模体为基准，在距离N末端侧100个氨基酸残基以上的位置上具有QXXXGX(W/F)模体(以下，在本发明中有时也称作模体A)。优选以所述DXDD模体为基准，在距离N末端侧100个氨基酸残基以上的位置上具有2个模体A。

此外，优选以DXDD模体为基准，在N末端侧10～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXX(G/A)X(F/W/Y)模体(以下，在本发明中有时也称作模体B)，且所述QXXXX(G/A)X(F/W/Y)为QXXXX(G/A)DW。

此外，优选以DXDD模体为基准，在距离C末端侧20～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W/Y)模体(以下，在本发明中有时也称作模体C)，且所述QXXXGX(F/W/Y)模体为QNXXGG(W/F)。

此外，优选以DXDD模体为基准，在距离C末端侧50～120个氨基酸残基的位置上具有QXXXGXW模体(以下，在本发明中有时也称作模体D)，且所述QXXXGXW模体为QXX(N/D)G(S/A)W。

此外，更优选以DXDD模体为基准，在距离C末端侧120～170个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W)模体(以下，在本发明中有时也称作模体E)，且所述QXXXGX(F/W)模体为QXX(D/N)G(S/G)(F/W)。

在本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶中，除了DXDD模体，还具有上述模体A～E全部。

此外，在本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶中，以所述DXDD模体为基准，在距离C末端侧170个氨基酸残基以上的位置上不具有QXXXGXW模体。

本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶可使用公知的基因重组技术等而取得。例如取得巨大芽孢杆菌的染色体DNA，使用适当的引物，利用PCR等扩增四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶。将得到的基因编入适当的载体中，确定基因序列。当DXDD模体中从N末端数起的第4位的氨基酸残基为天冬氨酸时，通过导入向除其以外的氨基酸的变异，可取得编码本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的基因。通过将该基因编入酵母等宿主中使其表达，可得到本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶。

此外，已知除了巨大芽孢杆菌以外，四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶还存在于芽孢杆菌属等细菌中，也可取得来自枯草芽孢杆菌的酶(accession number：AB618206)、来自地衣芽孢杆菌的酶(accession number：AAU41134)等。

此外，编码本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的基因也可通过公知的合成基因的合成方法进行合成，例如Khorana等的方法(Gupta et al.,1968)、Narang等的方法(Scarpulla et al.,1982)或Rossi等的方法(Rossi et al.,1982)。此外，通过使合成的基因进行表达，可得到本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶。

[2]多核苷酸

只要是编码本发明的四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的多核苷酸，则本发明的多核苷酸没有特别限定。即，可列举出编码下述多肽的多核苷酸：作为DXDD模体中从N末端数起的第4位氨基酸残基的天冬氨酸变异(取代)为除天冬氨酸以外的氨基酸的多肽。

具体而言，作为本发明的多核苷酸，例如可列举出含有下述序列的多核苷酸：由对作为DXDD模体的从N末端数起的第4位氨基酸残基的天冬氨酸变异(取代)为半胱氨酸的多肽进行编码的、序列号2或序列号14所表示的碱基序列构成的序列。

进一步，可列举出在严格条件下与由序列号2所表示的碱基序列构成的多核苷酸杂交，且具有由角鲨烯生成龙涎香醇的活性的多核苷酸。另外，本说明书的用语“多核苷酸”包括DNA及RNA这两者。

此外，本发明的多核苷酸优选根据导入该多核苷酸的微生物或宿主细胞变更为最适宜的密码子的碱基序列。

[3]微生物

本发明的微生物为具有本发明的多核苷酸的微生物。即，只要在细胞内含有本发明的多核苷酸则没有特别限定，例如可列举出大肠杆菌、枯草菌、短芽孢杆菌属菌、放线菌、面包酵母、米曲霉或粗糙脉孢菌。

《羟甲基戊二酰CoA还原酶》

本发明的微生物优选进一步具有编码羟甲基戊二酰CoA还原酶(以下，有时称作HMGR)的多核苷酸。

在法尼基焦磷酸的合成途径中，HMGR为将羟甲基戊二酰CoA变换为甲羟戊酸的酶。通过结合2分子的法尼基焦磷酸，生成作为本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的基质的角鲨烯。通过提高羟甲基戊二酰CoA还原酶的活性，能够促进微生物中角鲨烯的生成，增加使用了微生物的龙涎香醇的制备。

只要具有羟甲基戊二酰CoA还原酶活性，则所述羟甲基戊二酰CoA还原酶的多肽没有特别限定，优选为由(1)序列号3所表示的氨基酸序列的第514～1022位的氨基酸序列、(2)在由序列号3所表示的氨基酸序列的第514～1022位构成的氨基酸序列中，缺失、取代、插入和/或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列、或(3)与由序列号3所表示的氨基酸序列的第514～1022位构成的氨基酸序列的同一性为80％以上(优选为90％以上，更优选为95％以上)的氨基酸序列构成的多肽，或者由(1)序列号3所表示的氨基酸序列、(2)在序列号3所表示的氨基酸序列中，缺失、取代、插入和/或添加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列、或(3)与序列号3所表示的氨基酸序列的同一性为80％以上的氨基酸序列构成的多肽。

由所述的氨基酸序列构成的羟甲基戊二酰CoA还原酶表现出优异的还原酶活性。因此，含有序列号3所表示的氨基酸序列的第514～1022位的氨基酸序列的多肽为除去了羟甲基戊二酰CoA还原酶的膜结合区域的氨基酸序列，表现出羟甲基戊二酰CoA还原酶的优异活性。在序列号4中示出编码羟甲基戊二酰CoA还原酶的核酸序列(碱基序列)的一个形态。

[4]载体

本发明的载体为包含DNA的载体，该DNA具有编码上述变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的多核苷酸。即，本发明的载体只要包含本发明的所述多核苷酸则没有特别限定，例如可列举出在根据所使用的宿主细胞适当选择的公知的表达载体中，插入本发明的所述多核苷酸而得到的载体。

作为表达载体，优选在作为宿主的大肠杆菌、面包酵母等中可自我复制并可编入染色体中的、外来蛋白质的表达效率高的载体。用于使所述多核苷酸进行表达的表达载体优选为可在微生物中自我复制，且由启动子、核糖体结合序列、所述DNA及转录终止序列构成的重组载体。此外，也可含有控制启动子的基因。

更具体而言，作为表达载体，例如可例示出pBTrp2、pBTac1、pBT ac2(均为Boehringer Mannheim K.K.公司贩售)、pKK233-2(Pharmacia公司制造)、pSE280(Invitrogen公司制造)、pGEMEX-1(Promega公司制造)、pQE-8(QIAGEN公司制造)、pQE-30(QIAGEN公司制造)、pKYP 10(日本特开昭58-110600)、pKYP200[Agricultural BiologicalChemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK+、pBluescri pt II SK(-)(Stratagene公司制造)、pTrS30(FERMBP-5407),pTrS32(FER M BP-5408),pGEX(Pharmacia公司制造)、pET-3(Novagen公司制造)、；pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18[gene,33,103(1985)]、pUC19[Gene,33,103(1985)]、pSTV28(TAKARASHUZOCO.,LTD.制造)、pSTV29(TAKARASH UZOCO.,LTD.制造)、pUC118(TAKARASHUZOCO.,LTD.制造)、pPA1(日本特开昭63-233798号公报)、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pColdI、pColdII、pColdIII、pColdIV、pNIDNA、pNI-HisDNA(Ta karaBioInc.制造)等。

作为启动子，只要能够在作为宿主的大肠杆菌、面包酵母等细胞中进行表达，则可以为任意。例如可列举出trp启动子(Ptrp)、lac启动子(Plac)、PL启动子、PR启动子、PSE启动子等来自大肠杆菌或噬菌体等的启动子、SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等。此外，也可使用如将2个Ptrp串联的启动子(Ptrp×2)、tac启动子、letI启动子、lacT7启动子这样的经过人为设计改变的启动子等。在通过利用酶法的生产(通过以角鲨烯为基质的酶反应在生物体外的生物合成)对酶进行生产时，优选作为强启动子发挥功能的、能够大量生产目标蛋白质的启动子，更优选诱导型启动子。作为诱导型启动子，例如可列举出在低温下受到表达诱导的冷休克基因cspA的启动子、因作为诱导剂的IPTG的添加而受到诱导的T7启动子等。此外，在发酵生产(以葡萄糖等为碳源的宿主在生物体内的生物合成)中，在上述启动子中，更优选不论组织如何而始终使目标基因进行表达的启动子，即组成型启动子。作为组成型启动子，可列举出醇脱氢酶1基因(ADH1)、翻译延伸因子TF-1α基因(TEF1)、磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)、磷酸丙糖异构酶基因(TPI1)、磷酸丙糖脱氢酶基因(TDH3)、丙酮酸激酶基因(PYK1)的启动子。

[5]转化体

只要含有本发明的所述多核苷酸，则本发明的转化体没有特别限定，例如也可以是将本发明的所述多核苷酸编入宿主细胞的染色体的转化体，或者也可以是以含有本发明的所述多核苷酸的载体的形态含有本发明的所述多核苷酸的转化体。此外，还可以是表达本发明的多肽的转化体，或者也可以是未表达本发明的多肽的转化体。例如可利用本发明的所述载体或本发明的所述多核苷酸自身，转化所需的宿主细胞而得到本发明的转化体。

宿主细胞没有特别限定，优选为大肠杆菌、枯草菌、短芽孢杆菌属菌、放线菌、酵母、米曲霉、粗糙脉孢菌等容易操作的菌株，也可使用昆虫细胞、植物细胞、动物细胞等。然而，在通过利用酶法的生产(通过以角鲨烯为基质的酶反应在生物体外的生物合成)对酶进行生产时，优选大肠杆菌、枯草菌、短芽孢杆菌属菌、米曲霉，最优选大肠杆菌。此外，在发酵生产(以葡萄糖等为碳源的宿主在生物体内的生物合成)中，最优选酵母，作为最优选的酵母株，可列举出清酒酵母。可特别优选列举出清酒酵母协会7号或701号。协会701号酵母为由协会7号育种而成的无泡酵母，具有不形成高泡的特点，其他性质相同。

在发酵生产(以葡萄糖等为碳源的宿主在生物体内的生物合成)中，优选本发明的转化体具有包含DNA的载体，所述DNA具有编码羟甲基戊二酰CoA还原酶的多核苷酸。通过含有所述载体，可增加在使用转化体的龙涎香醇的制备中的产量。羟甲基戊二酰CoA还原酶为记载在所述“微生物”一项中的酶。

另外，上述“具有包含DNA的载体，所述DNA具有编码羟甲基戊二酰CoA还原酶的多核苷酸”是指，可以使上述“包含具有编码变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的多核苷酸的DNA的载体”含有具有编码羟甲基戊二酰CoA还原酶的多核苷酸的DNA，此外，也可以分别制备“包含具有编码变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的多核苷酸的DNA的载体”与“包含具有编码羟甲基戊二酰CoA还原酶的多核苷酸的DNA的载体”，使其进行转化。

[6]龙涎香醇的制备方法

本发明的龙涎香醇的制备方法的特征在于，使变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶与角鲨烯反应，得到龙涎香醇。

变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶可通过将酶表达用载体导入细菌等，对得到的转化体进行培养而生成。用于转化体培养的培养基可以是常用的培养基，可根据宿主的种类进行适当选择。例如，在培养大肠杆菌时，使用LB培养基等。也可根据选择标识的种类在培养基中添加抗生物质。

变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶可以通过培养可表达所述酶的转化体，并由所得到的培养液中提取并提纯酶而得到。此外，也可以使预先在本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的多肽的N末端侧或C末端侧融合有引发因子(TF)或His tag等的融合蛋白质表达，使提纯等变得容易。此外，可以直接使用含有由培养液中的转化体中提取的酶的提取液。由转化体中提取酶的方法可使用公知的方法。酶的提取工序例如可包括在提取溶剂中破碎转化体，将细胞内容物与转化体的碎片分离的步骤。在得到的细胞内容物中，含有目标变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶。

作为转化体的破碎方法，可使用将转化体破碎并能够回收酶液的公知方法，例如可列举出超声波破碎、玻璃珠破碎等。破碎的条件没有特别限制，只要是10℃以下及15分钟等酶不失活的条件即可。

作为细胞内容物与微生物体的碎片的分离方法，可列举出沉降分离、离心分离、过滤分离及这些分离方法的两种以上的组合等。使用所述方法的分离条件对本领域技术人员而言是公知的，在离心分离时，例如为8,000×g～15,000×g及10分钟～20分钟。

提取溶剂为通常用作酶提取的溶剂即可，例如可列举出Tris-HCl缓冲液、磷酸钾缓冲液等。就酶的稳定性这一点而言，提取溶剂的pH优选为3～10，更优选为6～8。

提取溶剂中可含有表面活性剂。作为表面活性剂，可列举出非离子表面活性剂、两性离子表面活性剂等。作为非离子表面活性剂，可列举出聚(氧乙烯基)山梨醇酐单油酸酯(Tween 80)等聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、正辛基-β-D-葡萄糖苷等烷基葡萄糖苷、蔗糖硬脂酸酯等蔗糖脂肪酸酯、聚丙三醇硬脂酸酯等聚丙三醇脂肪酸酯等。作为两性离子表面活性剂，可列举出作为烷基甜菜碱的N,N-二甲基-N-十二烷基胺乙内酯甜菜碱等。除此之外，还可使用Triton X-100(Triton X-100)、聚氧乙烯(20)十六醚(Brij-58)、壬基酚聚氧乙烯醚(Tergitol NP-40)等在本技术领域中常用的表面活性剂。

从酶的稳定性的角度出发，提取溶剂中的表面活性剂的浓度优选为0.001质量％～10质量％，更优选为0.10质量％～3.0质量％，进一步优选为0.10质量％～1.0质量％。

从酶活性的角度出发，优选提取溶剂中含有二硫苏糖醇、β-巯基乙醇等还原剂。作为还原剂，优选二硫苏糖醇。提取溶剂中的二硫苏糖醇的浓度优选为0.1mM～1M，更优选为1mM～10mM。通过使二硫苏糖醇存在于提取溶剂中，易于保持酶中的二硫键等结构，存在酶活性进一步得到提升的倾向。

从酶活性的角度出发，优选提取溶剂中含有乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合剂。提取溶剂中的EDTA的浓度优选为0.01mM～1M，更优选为0.1mM～10mM。通过使EDTA存在于提取溶剂中，可使酶活性降低的金属离子受到螯合，因此存在酶活性进一步得到提升的倾向。

除了上述的成分以外，提取溶剂也可含有能够添加在酶提取溶剂中的公知的成分。

变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶可单独使用一种，也可组合使用两种以上。

只要是能够进行酶反应的条件，则变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶与角鲨烯的反应条件没有特别限定。例如，反应温度及反应时间可根据变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的活性等进行适当选择。从反应效率的角度出发，反应温度及反应时间例如为4℃～100℃及1小时～30天，优选为30℃～60℃及16小时～20天。从反应效率的角度出发，pH条件例如为3～10，优选为6～8。

反应溶剂只要不阻碍酶反应则没有特别限定，可使用常用的缓冲液等。此外，例如可使用与在酶的提取工序中使用的提取溶剂相同的溶剂。此外，也可将含有变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的提取液(例如，无细胞提取液)作为酶液而直接用于反应。

从反应效率的角度出发，以基质对酶的摩尔浓度比(基质/酶)计，龙涎香醇生成反应中的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶与作为其基质的角鲨烯的浓度比优选为1～10000，更优选为10～5000，更优选为100～3000，进一步优选为1000～2000。

从反应效率的角度出发，相对于反应溶剂的总质量，用于酶反应的角鲨烯的浓度优选为0.000001质量％～10质量％，更优选为0.00001质量％～1质量％。

变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶与角鲨烯进行反应的反应工序可重复数次。由此，能够提高龙涎香醇的收率。在重复多次反应工序时，也可包含将作为基质的角鲨烯再次投入到反应体系中的工序、通过公知的方法使酶失活后，对反应液中的反应生成物进行回收及提纯的工序等。在再次投入角鲨烯时，可根据反应液中的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的浓度、反应液中残存的基质的量等而适当设定投入的时机、投入量。

本发明的龙涎香醇的制备方法的其他实施方式的特征在于，培养本发明的微生物或转化体。

通过培养利用所述微生物或表达载体进行转化的宿主细胞，可制备龙涎香醇。例如，若对酵母进行记载，则酵母使用常用的YPD培养基等进行培养即可。对通过相同重组导入了基因的酵母、或具有表达载体的酵母进行前培养，进一步接种于YPD培养基等，然后培养24～240小时左右，优选培养72～120小时左右。分泌在培养基中的龙涎香醇可直接使用或通过公知的方法进行提纯而使用。作为提纯方法，具体而言，可列举出溶剂提取、再结晶、蒸馏、柱层析、及HPLC等。

《作用》

本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，在所述单环性途径中能够使角鲨烯变换为单环性的3-脱氧蓍醇A的机制，以及在所述二环性途径中能够使8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯变换为龙涎香醇的机制尚未得到详细解析，但可做出以下推定。然而，本发明并不受以下推定的限定。如上文所述，本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶具有QXXXGX(W/F)模体(模体A)、QXXXX(G/A)X(F/W/Y)模体(模体B)、QXXXGX(F/W/Y)模体(模体C)、QXXXGXW模体(模体D)、及QXXXGX(F/W)模体(模体E)。在本发明的变异型TC中存在以下可能性：DXDD模体的第4位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸(优选为半胱氨酸或甘氨酸)取代的变异型DXDD模体，与广泛存在于四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶中的所述模体A～E进行某种相互作用，由此稳定地发挥酶活性。

另一方面，在本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶中，不具有角鲨烯-藿烯环化酶所具备的QXXXGXW模体。角鲨烯-藿烯环化酶虽然具有所述模体A～E，但即使变换为变异型DXDD模体，也得不到本发明的效果，因此存在角鲨烯-藿烯环化酶所具有的QXXXGXW模体抑制了本发明所得到的酶活性的可能性。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但这些实施例并不限定本发明的范围。

《实施例1》

在本实施例中，进行变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的克隆及表达载体构建。

将变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因导入pCold-TF载体(NdeI-XhoI部位)。

将巨大芽孢杆菌染色体DNA用作模板，通过PCR取得编码野生型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的多核苷酸。将所述多核苷酸插入pCold-TF载体的NdeI-XhoI部位。将得到的载体用作模板，以使第373位的天冬氨酸被半胱氨酸取代的方式，通过quick change法导入部位特异性变异，得到含有变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因的表达载体。

然后，利用得到的含有变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因的表达载体，制作大肠杆菌BL21(DE3)的转化体。

《实施例2》

在本实施例中，以角鲨烯、3-脱氧蓍醇A、或8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯为基质，研究变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的酶活性。

将在实施例1中制作的转化体接种于含氨比西林(50mg/L)的LB培养基(1L)中，在37℃下进行3小时的振荡培养。培养后，添加0.1M的异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，在15℃下进行24小时的振荡培养，诱导变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的表达。

然后，利用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)清洗通过离心(6,000×g，10分钟)进行了集菌的菌体后，在30mL的缓冲液A[含有50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、0.1v/v％的Triton X-100、2.5mM的二硫苏糖醇、1mM的EDTA]中进行悬浊，使用UP 2005sonicator(Hielscher Ultrasonics,Teltow,Germany)进行超声波破碎(4℃，20分钟)。对破碎处理后的试样进行离心(12,300×g，20分钟)，将离心后得到的上清作为无细胞提取液A。

将角鲨烯(250μg)与Triton X-100(5mg)混合进行可溶化后，添加至缓冲液A(1mL)中，制备角鲨烯液。将该角鲨烯液的全量加入无细胞提取液A(4mL)中，制成反应液，在30℃下培养64小时。在反应液中，角鲨烯(基质)与变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶(酶)的摩尔比(基质/酶)约为200。

培养后，向反应液中添加甲醇(6mL)，使酶反应停止。然后，向反应液中添加正己烷(5mL)，进行3次反应生成物的提取。

将得到的提取物供给于硅胶柱色谱(溶剂：正己烷:乙酸乙酯＝100：20，容量比)，得到了正己烷:乙酸乙酯＝100:20的级分。浓缩得到的级分，将使用GC/MS的解析结果示于图3。

其中，“BmeTC D373C”表示将来自巨大芽孢杆菌的四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的第373位的氨基酸由天冬氨酸(D)变异为半胱氨酸(C)的酶。此外，“SQ”表示“角鲨烯”，“单环”、“单环性产物”表示“3-脱氧蓍醇A”，“二环”、“二环性产物”表示“8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯”。以下相同。

通过使变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶与角鲨烯反应，得到龙涎香醇。此外，还产生了3-脱氧蓍醇A及8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯。因此认为，利用变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，通过图2所示的(a)及(b)的单环性途径、以及(c)及(d)的二环性途径生成龙涎香醇。此外，通过使变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶与3-脱氧蓍醇A反应，得到龙涎香醇，通过使变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶与8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯反应，也得到了龙涎香醇。这些结果支持了利用变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶、通过所述单环性途径及二环性途径生成龙涎香醇这一点。

《实施例3》

除了在30℃下培养5天来替代在30℃下培养64小时之外，重复实施例2的操作，制备龙涎香醇。

图4表示5天后、10天后及15天后的角鲨烯、龙涎香醇、3-脱氧蓍醇A及8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯的生成物量。认为角鲨烯经时性地变换为3-脱氧蓍醇A及8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯，且这些物质进一步变换为龙涎香醇。如图5所示，在酶反应5天后，龙涎香醇相对于角鲨烯的生成率为8％，在酶反应10天后，龙涎香精相对于角鲨烯的生成率增加至20％。在酶反应15天后，龙涎香醇相对于角鲨烯的生成率进一步增加至50％。

根据本发明的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，即使不同时使用变异型角鲨烯-藿烯环化酶，也能够以角鲨烯为基质，一步合成龙涎香醇。

《比较例1》

除了使用不具有变异的四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因代替变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因以外，进行与实施例1～实施例3相同的操作，对不具有变异的四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶是否能够由角鲨烯生成龙涎香醇进行研究。

其结果如图6所示，只有在使四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶与3-脱氧蓍醇A反应时才能够生成龙涎香醇，未能以角鲨烯为基质合成龙涎香醇。

《实施例4》

在本实施例中，为了得到使HMGR及变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶在酵母中进行表达的转化体，进行了HMGR基因及变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因的克隆。

由使用含有ML-236B的培养基对扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)进行培养而得到的ML-236B耐性株中取得HMGR基因(序列号4，以下，有时也将由该ML-236B耐性株得到的HMGR基因称作“ADK4653”或“ADK4653基因”)。

(1)变异型HMGR(tHMGR)基因(短缩型)的克隆及表达载体的构建

以ML-236B耐性株的基因组DNA为模板，使用序列号5及6所示的引物，通过PCR法对变异型HMGR基因(短缩型，序列号4的第1540～3066位的碱基序列)进行增幅。

通过琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物后，插入表达用载体pAUR123(Takara BioInc.)中，取得ML-236B耐性株的短缩型HMGR(以下，有时也称作“ADK4653_tHMGR”)的表达载体。

(2)变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因的克隆

关于野生型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因，以该酶的氨基酸序列为基础，使密码子对出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)最适化而进行合成。将合成的基因插入载体pUCF(Fasmac Co.,Ltd.)的克隆位点(限制酶EcoRV位点)。然后，对野生型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因导入氨基酸取代变异。具体而言，得到了将野生型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的第373位的氨基酸由天冬氨酸取代为半胱氨酸的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因。

使用PrimeSTAR DNA Polymerase(Takara Bio Inc.)，使用序列号7及8所示的变异导入用引物，根据操作说明书制备导入有变异的载体。

(3)表达载体的构建

在表达载体的构建中，使用了实施例4(1)中克隆短缩型HMGR(tHMGR)基因的蛋白质表达用的穿梭载体(pAUR123，Takara Bio Inc.)。

首先将由来自出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)的磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子及CYC1终止子构成的表达盒插入上述载体pAUR123的碱基序列的第6982位及第1位之间。然后以本载体为模板，通过PCR法，使用序列号9及10所示的引物，制备含有变异型HMGR(tHMGR)基因的表达载体片段。

此外，以实施例4(2)中取得的载体为模板，以同样的方式，使用序列号11及12所示的引物，制备变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因片段。

通过琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物的增幅后，进行限制酶(DPNI)处理，使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up柱(MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG)进行提纯。使用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech公司)，按照用户手册进行由目标基因向实施例4(3)中制作的载体的克隆反应。反应液直接用于利用大肠杆菌感受态细胞(HST08、Takara BioInc.)的转化中。对于阳性克隆，利用菌落PCR确认目标基因的导入，得到表达载体。

《实施例5》

在本实施例中，使用在实施例4(3)中得到的载体，得到酵母的转化体。使用该转化体，确认角鲨烯、龙涎香醇、单环性化合物(3-脱氧蓍醇A)或二环性化合物(8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯)的产生。

(1)酵母的转化

使用实施例4(3)中得到的表达载体，转化清酒酵母(Saccharomyces cerevisiae协会701号)。载体预先利用限制酶(EcoO65I(BstEII、BstPI)，Takara Bio Inc.)切断耐性标记基因内的一处，通过以直链状使用，进行基于相同重组的基因导入。使用Frozen-EZYeast Transformation II(ZYMO RESARCH公司)，利用以作为通用方法的乙酸锂法为基准的方法进行酵母的转化。对于所得到的克隆，利用菌落PCR确认目标基因的导入。

(2)利用酵母转化体的角鲨烯、龙涎香醇、单环性化合物(3-脱氧蓍醇A)或二环性化合物(8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯)的生产

(酵母转化体的培养)

短缩型ADK4653基因通过醇脱氢酶1基因启动子(ADH1)、变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因通过磷酸甘油酸激酶基因启动子(PGK1)同时进行组成性表达。除了清酒酵母本身具有的HMGR基因，通过测定作为甲羟戊酸途径的代谢产物的角鲨烯确认到：甲羟戊酸途径因通过转化而导入的ADK4653基因的过量表达而增强。此外，确认是否产生清酒酵母原本不生产的龙涎香醇、单环性化合物(3-脱氧蓍醇A)或二环性化合物(8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯)。

使用容量500mL的带有紊流器的三角烧瓶，将在YPD培养基中进行了24小时前培养的培养液0.5mL接种于50mL的YPD培养基(葡萄糖浓度5％)，以28℃、250rpm进行旋转搅拌，同时进行培养。在5天后取样，进行在菌体中累积的角鲨烯、龙涎香醇、单环性化合物(3-脱氧蓍醇A)或二环性化合物(8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯)的分析。

《比较例2》

在本比较例中，进行短缩型ADK4653基因及野生型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因的克隆。四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因使用导入变异前的野生型基因，以与实施例4(3)相同的方法构建载体。

《比较例3》

在本比较例中，使用比较例2中得到的载体，得到酵母的转化体。使用该转化体，确认到角鲨烯、龙涎香醇、单环性化合物(3-脱氧蓍醇A)或二环性化合物(8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯)的产生。以与实施例5相同的方法进行基于(1)酵母的转化及(2)酵母转化体的角鲨烯、龙涎香醇、单环性化合物或二环性化合物的生产。

(产物的分析)

将所述实施例5及比较例3中得到的菌体破碎后，进行己烷提取，制备试样。离心3mL的培养液，去除上清后，向菌体中添加1.5mL容量的氧化锆珠(YTZ珠，φ0.5mm，NikkatoCo.,Ltd.)，利用珠磨机(TAITEC CORPORATION，uT-12)进行1分钟粉碎(3200rpm/min)，重复5次。向破碎液中加入1.5mL的己烷，利用上述珠磨机重复3次1分钟的搅拌(1800rpm/min)并进行提取，离心分离(16000rpm/min)后回收有机层。在氮气气流下对提取物进行干燥，再溶解于400uL的己烷中，供于GC分析。GC分析中，利用气相色谱仪GC-2014(ShimadzuCorporation)、使用HP5毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm、Agilent Technologies Japan,Ltd.)、且使用FID作为检测器。分析条件设定为：SPL温度300℃、FID温度320℃、分流比30.0、总流量25.0mL/min、线速度19.3cm/sec、柱温度220-300℃(升温速度1℃/min)、在300℃保持10min。

将气相色谱仪的分析结果示于图7。从实施例4及5的变异型HMGR基因及变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因同时进行表达的宿主中检测到了角鲨烯、龙涎香醇、单环性化合物(3-脱氧蓍醇A)及二环性化合物(8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯)(图7)。

使变异型HMGR基因(短缩型)进行表达的清酒酵母的角鲨烯的生产量表现出显著的增加，确认到作为代谢的律速阶段的、原本被严格控制的甲羟戊酸途径的增强效果。此外，确认到通过变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因的同时表达，生产出原本清酒酵母所不生产的龙涎香醇、单环性化合物(3-脱氧蓍醇A)或二环性化合物(8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯)。即表现出通过对变异型HMGR基因及变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因同时进行表达的宿主进行分子育种，酵母中的龙涎香醇的生产成为可能。

另一方面，在比较例2及3的变异型HMGR基因及野生型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因同时进行表达的宿主中，检测到了角鲨烯及二环性化合物(8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯)。使变异型HMGR基因(短缩型)进行表达的清酒酵母的角鲨烯的生产量表现出显著的增加，确认到甲羟戊酸途径的增强效果。此外，确认到通过野生型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因的同时表达，生产出原本清酒酵母所不生产的二环性化合物(8α-羟基水龙骨萜-13,17,21-三烯)，但未检测到龙涎香醇或单环性化合物(3-脱氧蓍醇A)，确认到未生产这些物质。即表现出：即使野生型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因进行表达，也不能在酵母中生产龙涎香醇。

此外，得知通过使作为甲羟戊酸途径的酶之一的HMGR(羟甲基戊二酰CoA还原酶)的、具有特定氨基酸序列的变异型HMGR基因(短缩型)在酵母中进行表达，甲羟戊酸途径的下游化合物、特别是角鲨烯的生产量有飞跃性的增加。因此，通过使变异型HMGR基因(短缩型)及野生型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因同时表达，可在酵母中生产龙涎香醇。

《实施例6》

在本实施例中，制作来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，制备龙涎香醇。另外，枯草芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌的四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的氨基酸的同一性为50％。

以来自枯草芽孢杆菌的四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的氨基酸序列(基因银行编号：AB618206)为基础合成变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因。以将作为DXDD模体的第4位的氨基酸的天冬氨酸取代为半胱氨酸的方式设计基因，使其在大肠杆菌中的表达最适化来进行合成，插入pCold-TF载体的NdeI-XhoI部位。利用得到的含有变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶基因的表达载体，制作大肠杆菌BL21(DE3)的转化体。

然后，以与实施例2相同的方式，得到含有变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的无细胞提取液。

然后，将角鲨烯(50μg)与Tween-80(1mg)混合，进行可溶化后，添加于缓冲液B[含有50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、0.1v/v％的Tween-80、0.1w/v％的抗坏血酸钠、2.5mM的二硫苏糖醇、1mM的EDTA](1mL)中，制备角鲨烯液。向无细胞提取液(4mL)中加入该角鲨烯液的全量，制成反应液，在30℃下培养64小时。在反应液中，角鲨烯(基质)与变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶(酶)的摩尔比(基质/酶)约为1000。

在培养后，向反应液中添加含有15质量％氢氧化钾的甲醇(6mL)，使酶反应停止。然后向反应液中添加正己烷(5mL)，进行3次反应生成物的提取。

将得到的提取物供给于硅胶柱色谱(溶剂：正己烷:乙酸乙酯＝100:20，容量比)，得到正己烷:乙酸乙酯＝100:20的级分。浓缩得到的级分，利用气相色谱法质量分析计(GC-MS)进行分析，确认到龙涎香醇的生成。

工业实用性

根据本发明，通过在龙涎香醇的生产中使用变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，能够以角鲨烯为基质，一步制备龙涎香醇。通过本发明而得到的龙涎香醇例如可用作医药品等的生产原料。

以上，通过特定的形式对本发明进行了说明，但对于本领域技术人员而言显而易见的变更或改良均包含在本发明的范围内。

序列表

<110> 株式会社ADEKA

国立大学法人新潟大学

<120> 变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶及龙涎香醇的制备方法

<130> ADK-003

<150> JP 2016-042661

<151> 2016-03-04

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 1

Met Ile Ile Leu Leu Lys Glu Val Gln Leu Glu Ile Gln Arg Arg Ile

1 5 10 15

Ala Tyr Leu Arg Pro Thr Gln Lys Asn Asp Gly Ser Phe Arg Tyr Cys

20 25 30

Phe Glu Thr Gly Val Met Pro Asp Ala Phe Leu Ile Met Leu Leu Arg

35 40 45

Thr Phe Asp Leu Asp Lys Glu Val Leu Ile Lys Gln Leu Thr Glu Arg

50 55 60

Ile Val Ser Leu Gln Asn Glu Asp Gly Leu Trp Thr Leu Phe Asp Asp

65 70 75 80

Glu Glu His Asn Leu Ser Ala Thr Ile Gln Ala Tyr Thr Ala Leu Leu

85 90 95

Tyr Ser Gly Tyr Tyr Gln Lys Asn Asp Arg Ile Leu Arg Lys Ala Glu

100 105 110

Arg Tyr Ile Ile Asp Ser Gly Gly Ile Ser Arg Ala His Phe Leu Thr

115 120 125

Arg Trp Met Leu Ser Val Asn Gly Leu Tyr Glu Trp Pro Lys Leu Phe

130 135 140

Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Leu Leu Val Pro Thr Tyr Val Pro Leu Asn

145 150 155 160

Phe Tyr Glu Leu Ser Thr Tyr Ala Arg Ile His Phe Val Pro Met Met

165 170 175

Val Ala Gly Asn Lys Lys Phe Ser Leu Thr Ser Arg His Thr Pro Ser

180 185 190

Leu Ser His Leu Asp Val Arg Glu Gln Lys Gln Glu Ser Glu Glu Thr

195 200 205

Thr Gln Glu Ser Arg Ala Ser Ile Phe Leu Val Asp His Leu Lys Gln

210 215 220

Leu Ala Ser Leu Pro Ser Tyr Ile His Lys Leu Gly Tyr Gln Ala Ala

225 230 235 240

Glu Arg Tyr Met Leu Glu Arg Ile Glu Lys Asp Gly Thr Leu Tyr Ser

245 250 255

Tyr Ala Thr Ser Thr Phe Phe Met Ile Tyr Gly Leu Leu Ala Leu Gly

260 265 270

Tyr Lys Lys Asp Ser Phe Val Ile Gln Lys Ala Ile Asp Gly Ile Cys

275 280 285

Ser Leu Leu Ser Thr Cys Ser Gly His Val His Val Glu Asn Ser Thr

290 295 300

Ser Thr Val Trp Asp Thr Ala Leu Leu Ser Tyr Ala Leu Gln Glu Ala

305 310 315 320

Gly Val Pro Gln Gln Asp Pro Met Ile Lys Gly Thr Thr Arg Tyr Leu

325 330 335

Lys Lys Arg Gln His Thr Lys Leu Gly Asp Trp Gln Phe His Asn Pro

340 345 350

Asn Thr Ala Pro Gly Gly Trp Gly Phe Ser Asp Ile Asn Thr Asn Asn

355 360 365

Pro Asp Leu Asp Asp Thr Ser Ala Ala Ile Arg Ala Leu Ser Arg Arg

370 375 380

Ala Gln Thr Asp Thr Asp Tyr Leu Glu Ser Trp Gln Arg Gly Ile Asn

385 390 395 400

Trp Leu Leu Ser Met Gln Asn Lys Asp Gly Gly Phe Ala Ala Phe Glu

405 410 415

Lys Asn Thr Asp Ser Ile Leu Phe Thr Tyr Leu Pro Leu Glu Asn Ala

420 425 430

Lys Asp Ala Ala Thr Asp Pro Ala Thr Ala Asp Leu Thr Gly Arg Val

435 440 445

Leu Glu Cys Leu Gly Asn Phe Ala Gly Met Asn Lys Ser His Pro Ser

450 455 460

Ile Lys Ala Ala Val Lys Trp Leu Phe Asp His Gln Leu Asp Asn Gly

465 470 475 480

Ser Trp Tyr Gly Arg Trp Gly Val Cys Tyr Ile Tyr Gly Thr Trp Ala

485 490 495

Ala Ile Thr Gly Leu Arg Ala Val Gly Val Ser Ala Ser Asp Pro Arg

500 505 510

Ile Ile Lys Ala Ile Asn Trp Leu Lys Ser Ile Gln Gln Glu Asp Gly

515 520 525

Gly Phe Gly Glu Ser Cys Tyr Ser Ala Ser Leu Lys Lys Tyr Val Pro

530 535 540

Leu Ser Phe Ser Thr Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu Asp Ala Leu

545 550 555 560

Met Thr Ile Cys Pro Leu Lys Asp Gln Ser Val Glu Lys Gly Ile Lys

565 570 575

Phe Leu Leu Asn Pro Asn Leu Thr Glu Gln Gln Thr His Tyr Pro Thr

580 585 590

Gly Ile Gly Leu Pro Gly Gln Phe Tyr Ile Gln Tyr His Ser Tyr Asn

595 600 605

Asp Ile Phe Pro Leu Leu Ala Leu Ala His Tyr Ala Lys Lys His Ser

610 615 620

Ser

625

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<223> n是a,c,g或t

<400> 2

atgatcatat tgctaaagga agttcagcta gagattcagc gaagaatcgc ctatctgcgc 60

ccaacacaaa aaaatgacgg gtcatttcgc tactgttttg aaacaggcgt tatgcctgat 120

gcgtttttaa ttatgcttct tcgcaccttt gatttagata aagaagtgtt gattaaacaa 180

ttaaccgaac ggatcgtttc ccttcaaaat gaagatggtc tttggacgtt gtttgatgat 240

gaagaacata acttatctgc cactattcaa gcttatacag ctcttttata ttcaggatat 300

taccaaaaaa acgaccggat tttgcgaaaa gcagaaagat atattataga ttcaggaggc 360

atttcgcgcg ctcattttct cacaagatgg atgctttctg ttaacggtct atacgagtgg 420

ccaaagctat tttacctccc gctttctctt ttgctcgtgc ctacctatgt accgcttaac 480

ttttatgaat taagcactta tgccagaatt cacttcgttc cgatgatggt agcaggaaac 540

aaaaaatttt cacttacttc taggcataca ccttctcttt ctcatttaga tgtaagagaa 600

cagaaacagg aatcggagga aactactcaa gaatcacgcg cttcaatttt tctagtcgac 660

catttaaaac agctggcttc tttaccttct tacatccaca aacttggtta tcaagcagcc 720

gagcgttaca tgctagaaag aattgaaaaa gatggaacac tctacagcta cgccacctct 780

acttttttta tgatttacgg tcttttggct cttggctata aaaaagattc atttgtgatc 840

caaaaagcaa ttgacgggat ttgttcacta cttagtacat gcagcggcca cgtgcacgta 900

gaaaactcca cgtcaaccgt ttgggatacc gcgctgctct cttacgctct acaggaagca 960

ggtgtaccgc agcaagatcc catgattaaa ggcacaactc gctacttaaa gaaaagacag 1020

catacaaagc ttggagattg gcagtttcat aacccaaata cagcacctgg aggctggggg 1080

ttttccgata ttaatacaaa taaccctgac ttagactgta cgtctgctgc tatcagagct 1140

ctttctagaa gagcgcaaac cgatacagat tatttggagt cttggcaaag agggattaac 1200

tggctgctgt ccatgcaaaa caaagatggg ggttttgctg catttgaaaa aaataccgac 1260

tctattttat ttacttatct gccgcttgaa aatgcaaaag atgcagcgac ggatccggct 1320

actgccgatt taaccggtcg agtgcttgag tgtctcggaa actttgctgg tatgaataaa 1380

tcccaccctt cgattaaagc tgcagtaaaa tggctgtttg atcatcaatt ggataacggg 1440

agctggtacg gccggtgggg agtttgctat atttacggaa cgtgggccgc tattacagga 1500

ctccgtgctg taggggtttc tgcttctgat ccgcgtatca tcaaagctat caactggctc 1560

aaaagcattc aacaagaaga cggtggattc ggagaatcat gctatagcgc ttctttaaaa 1620

aaatatgtgc cactatcgtt tagcaccccc tctcaaacgg cttgggctct cgatgcttta 1680

atgacaatat gtccgttaaa agatcaatcc gttgaaaaag gaattaaatt tttactaaat 1740

ccaaatctta cagagcagca aactcattac cccacgggaa ttggtcttcc tggacaattt 1800

tatattcagt accacagcta caatgatatt tttcctcttc ttgcacttgc ccactacgca 1860

aaaaaacatt cttcgtaa 1878

<210> 3

<211> 1022

<212> PRT

<213> 扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）

<400> 3

Met Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Val Ser Asn Trp Leu Ala Ser Leu Ala

1 5 10 15

Arg Leu Ser Ala His Lys Pro Ile His Val Ile Phe Leu Thr Thr Leu

20 25 30

Leu Thr Ala Val Ala Tyr Leu Ser Val Val Asp Glu Tyr Leu Asn Phe

35 40 45

Asp Ser Phe Asp Ile Ser Asn Val Ser Phe Tyr His Pro Pro Ser Ser

50 55 60

Lys Asp Tyr Lys Asp Trp Thr Leu Ile Glu Asp Ala Ser Ala Tyr Pro

65 70 75 80

Asn Ala Ala Arg Ile Ala Ile Thr Pro Leu Glu Phe Arg Arg Ile Ala

85 90 95

Lys His Glu Ile Pro Ala Ile Ala Asn Thr Phe Tyr Gly Val Asp Ser

100 105 110

Thr Glu Lys Tyr Leu Ile Ser Glu Tyr Glu Asn Ala Gln Asp Ser Ile

115 120 125

Asp Ser Ile Arg Thr Val Val Ser Asn Asp Gly Thr Ala Trp Lys Ile

130 135 140

Val His Gln Tyr Lys Thr Ser Lys Tyr Gln Glu Tyr Leu Lys Asn Ala

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Leu Gln Ser Val Ile Arg Gly Ala Glu Thr Tyr Asp Ile

165 170 175

Ala Ile Ile Thr Ile Ala Tyr Ala Ala Met Tyr Tyr Thr Phe Phe Lys

180 185 190

Leu Phe Tyr Asp Met Arg Thr Gln Ala Asn Ser Lys Phe Trp Leu Gly

195 200 205

Phe Ala Ser Ala Ser Ser Ser Leu Phe Ala Phe Leu Leu Ala Val Gly

210 215 220

Thr Ala Lys Ile Phe Asn Ile Arg Val Ser Leu Leu Ser Leu Ser Glu

225 230 235 240

Gly Ile Pro Phe Leu Val Ala Thr Val Gly Phe Asn Arg Ile Val Lys

245 250 255

Leu Ser Ala Ala Val Leu Asn Ala Ala Ala Val Asp Lys Glu Ser His

260 265 270

Ser Ile Ser Leu Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Lys Asp Lys Ala Leu Asn

275 280 285

Phe Val Lys Asp Gln Leu Leu Cys Ala Ala Ala Phe Val Gly Cys Ser

290 295 300

Ile Tyr Ala Ser His Leu Glu Gly Leu Arg Ser Phe Cys Leu Leu Ser

305 310 315 320

Ala Phe Ile Met Ile Tyr Asp Val Leu Leu Thr Tyr Ser Tyr Tyr Ser

325 330 335

Ala Val Leu Ala Leu Lys Val Glu Ile Asn Met Ile His Gln Ser Ile

340 345 350

Ala Leu Lys Asp Ala Leu Glu Glu Asp Gly Ile Pro Glu Leu Ala Ala

355 360 365

Arg Gln Ala Ser Leu Ala Ser Phe Gly Ser Gln Lys Glu Leu Ser Leu

370 375 380

Gly Pro Asn Ser Gly Tyr Val Thr Ala Phe Lys Ile Ala Ser Val Ala

385 390 395 400

Phe Phe Phe Ala Phe His Ala Tyr Leu Val Gly Ser Asn Trp Val Phe

405 410 415

Leu Ser Ser Asn Glu Asp Ile Ile Glu Gly His Asn Leu Ser Lys Ser

420 425 430

Ile Ala Lys His Ile Ser Ile Gly Ser Thr Gly Thr Val Val Thr Leu

435 440 445

Leu Glu Pro Lys Ile Tyr Val Pro Lys Asn Ile Leu Phe Gln Val Glu

450 455 460

Asp Leu Val Ile Ser Ile Leu Glu Lys Leu Ser Thr Ala Ile Arg Asp

465 470 475 480

Lys Phe Ile Ser Lys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ser Ser Ala

485 490 495

Ile Asn Val Tyr Leu Leu Asn Ala Ala Arg Ala His Ser Ile Asp Lys

500 505 510

Pro Ser Gln Arg Leu Ser Lys Ala Ile Ala Ser Lys Glu Ala Ser Arg

515 520 525

Arg Ala Lys Ala Ala Tyr Glu Ser Gln Lys Ser Val Ser Lys Ser Thr

530 535 540

Asp Asp Thr Ala Ser Ser Glu Pro Thr Phe Asp Val Lys Asn Ile Leu

545 550 555 560

Pro Asn Ser Gly Ile Glu His Thr Phe Glu Glu Leu Val Asp Ile Leu

565 570 575

Lys Asn Gly Glu Val Ser Ser Leu Ser Asn Glu Glu Val Thr Thr Leu

580 585 590

Val Val Lys Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ala Leu Glu Lys Lys Leu Gly

595 600 605

Asp Thr Thr Arg Ala Val Ala Val Arg Arg Gln Ala Ile Ser Lys Leu

610 615 620

Ala Lys Ser Pro Ile Val Asp Ser Ser Ser Val Pro Tyr Leu Asn Tyr

625 630 635 640

Asp Tyr Asp Lys Val Phe Gly Ala Cys Cys Glu Asn Val Ile Gly Tyr

645 650 655

Ile Pro Leu Pro Leu Gly Val Ala Gly Pro Leu Leu Ile Asp Gly Lys

660 665 670

Pro Phe His Ile Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser

675 680 685

Thr Met Arg Gly Cys Lys Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Val Ser Thr

690 695 700

Val Leu Thr Arg Asp Gly Met Thr Arg Gly Pro Cys Val Lys Phe Pro

705 710 715 720

Ser Leu Gln Arg Ala Gly Ala Cys Lys Ile Trp Leu Asp Ser Glu Glu

725 730 735

Gly Gln Asn Leu Leu Lys Lys Ser Phe Asn Ser Thr Ser Arg Phe Ala

740 745 750

Arg Leu Gln His Val Gln Thr Ala Ile Ala Gly Ser Leu Leu Phe Ile

755 760 765

Arg Phe Arg Thr Thr Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Ile Ser

770 775 780

Lys Gly Val Glu Phe Thr Leu Lys Gln Met Val Glu Glu Tyr Gly Trp

785 790 795 800

Ser Asp Met Asp Val Ile Ser Val Ser Gly Asn Tyr Cys Thr Asp Lys

805 810 815

Lys Ala Ala Ser Ile Asn Trp Thr Asn Gly Arg Gly Lys Ser Ile Val

820 825 830

Ala Glu Ala Arg Ile Pro Gly Glu Val Val Arg Lys Val Leu Lys Ser

835 840 845

Asp Val Asp Ala Leu Val Glu Leu Asn Val Ser Lys Asn Leu Ile Gly

850 855 860

Ser Ala Met Ala Gly Ser Ile Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ala Asn

865 870 875 880

Leu Val Thr Ala Val Phe Leu Ala Cys Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn

885 890 895

Val Glu Ser Ser Asn Cys Ile Thr Leu Ile Asp Asn Val Asp Gly Asp

900 905 910

Leu Gln Ile Ser Val Ser Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Ile Gly

915 920 925

Gly Gly Thr Ile Leu Glu Pro Gln Gly Ala Met Leu Asp Leu Leu Gly

930 935 940

Val Arg Gly Pro His Pro Thr Thr Pro Gly Ala Asn Ala His Gln Leu

945 950 955 960

Ala Lys Val Val Ala Ser Ala Val Leu Ala Ala Glu Leu Ser Leu Cys

965 970 975

Ser Ala Leu Ala Ala Gly His Leu Val Gln Ser His Met Gln His Asn

980 985 990

Arg Gly Lys Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ser Ser Lys Ala Asp

995 1000 1005

Val Gln Arg Leu Thr Asp Gly Ser Lys Ile Cys Ile Lys Ser

1010 1015 1020

<210> 4

<211> 3069

<212> DNA

<213> 扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）

<400> 4

atgtttagcc ttagtaatta tgtgtccaat tggctcgcgt cattggcaag gttgtcggca 60

cacaaaccaa tccacgttat attcttaaca acgttgttaa ccgctgttgc ttacttgtct 120

gtcgtcgacg agtatctcaa ctttgactca ttcgatatct ccaatgtttc cttctatcat 180

cctccatctt caaaggacta taaagattgg actttaattg aggatgctag tgcttatcca 240

aacgcagctc gtattgcaat cactccactt gagtttagaa gaattgctaa acatgaaatc 300

ccggctatag caaacacttt ttacggcgtc gactccaccg agaaatactt gatttctgag 360

tacgaaaatg cccaggacag cattgactca atcagaactg ttgtttccaa tgatgggact 420

gcttggaaga ttgttcacca gtacaagacc agcaaatatc aagaatacct caaaaatgct 480

tacaaaacct tacagtctgt tattcgtggt gctgaaactt atgatattgc tatcattaca 540

attgcctacg ctgccatgta ctacaccttt tttaagctct tttatgatat gagaacccaa 600

gccaactcca agttctggtt gggttttgct tcagcctcat catctctgtt tgcatttttg 660

cttgctgttg gaactgccaa aatctttaat attagagttt ccttattgag cttgtctgaa 720

ggcattccat ttttggttgc cacggttgga ttcaacagaa ttgtaaagct ttccgccgct 780

gttttgaacg ccgctgcagt tgacaaagag tctcatagta tcagtttatt gatttataga 840

caacttaagg ataaagccct caattttgtc aaagatcaat tgttatgtgc tgctgcattt 900

gttgggtgct caatttatgc atcgcacttg gaaggattga gaagcttttg tttattgagt 960

gcattcatca tgatttacga cgtgcttttg acttattcct actattctgc tgtcttggct 1020

cttaaagttg aaatcaacat gattcaccaa tctattgctc ttaaggatgc attagaagaa 1080

gacggtattc ctgaacttgc tgctagacaa gcttctttgg catcatttgg gtcacaaaaa 1140

gaacttagct tgggtccaaa cagcggatat gttaccgcat tcaaaattgc tagcgttgca 1200

tttttcttcg cattccatgc ttacttagtg ggcagtaact gggttttctt gagcagcaat 1260

gaggacatta tcgaaggcca caacttgtcc aagtcgattg ctaaacatat ttctattgga 1320

tcaaccggta ctgttgtcac tttattggaa ccgaaaattt acgttccaaa gaacatttta 1380

tttcaagttg aagatcttgt tatcagtatt cttgaaaaat tgtctactgc tatcagagat 1440

aaatttatta gtaagacttt gcttttcttt ttgggtacca gttctgccat caatgtctac 1500

ttgttgaacg ctgctagagc ccactccatt gataagccat ctcaacgtct tagcaaggct 1560

attgcttcaa aagaagcatc tagaagagca aaagctgctt atgaatcaca aaagagtgtt 1620

tcaaagagca ccgatgatac tgctagtagc gagccaactt ttgacgtaaa gaatatattg 1680

ccaaatagtg gtattgaaca tacttttgaa gaattagttg acattctcaa gaatggcgaa 1740

gtttctagct tgtctaatga agaagttact acccttgttg ttaaagataa attgccatta 1800

tatgctcttg aaaagaagtt aggtgacact actcgtgctg ttgctgttcg tcgtcaagct 1860

atttccaaat tggccaaaag cccaattgtt gatagctcta gtgttccata cttgaattac 1920

gattatgata aggtgtttgg cgcatgttgt gaaaacgtca ttggttatat tccattgcct 1980

cttggtgttg ctggtccatt gttaattgat ggtaagccat tccatattcc aatggctact 2040

actgaaggtt gtcttgttgc ttctaccatg cgcggttgta aagctattaa tgctggtggc 2100

ggtgttagca ccgtcttgac tagagatggt atgacaagag gtccttgtgt taaattccca 2160

tctttgcaac gtgccggtgc ttgtaagatt tggttagatt ctgaagaagg tcaaaacttg 2220

ttgaaaaaat cattcaattc tacttctaga tttgctagat tgcaacatgt tcaaactgcc 2280

attgctggtt ctttgctttt cattagattt agaactacta ctggtgatgc tatgggtatg 2340

aatatgattt ccaaaggtgt tgaatttaca ttgaaacaaa tggttgaaga atatggttgg 2400

tctgatatgg atgttatctc tgtttccggt aactactgta ctgataagaa agccgcttct 2460

attaactgga ccaatggtcg tggtaagagt attgttgctg aagctcgtat tcctggagaa 2520

gttgtcagaa aagttcttaa gagtgacgtt gatgctcttg ttgaattaaa cgtcagcaag 2580

aatttgattg gttctgcaat ggccggctct attggtggtt tcaatgctca tgctgcaaat 2640

ttggtcactg ctgttttctt agcctgcggt caagatcctg ctcaaaatgt tgaaagttcc 2700

aactgtatca ctttaattga taatgttgat ggcgatttgc aaatatccgt ttctatgcca 2760

tctattgaag ttggtactat tggtggtggt actattcttg aacctcaagg tgctatgctt 2820

gatttattgg gagttcgtgg tccacatcca actactccag gggctaatgc tcatcagctt 2880

gcaaaggttg ttgcttctgc tgttttggcc gctgaattat cattgtgttc agcattggct 2940

gctggtcatt tagttcaaag tcatatgcaa cataaccgtg gtaaacctgc tgctccagcg 3000

gccgctccat caagcaaggc tgatgttcag cgtttgactg atggatcaaa gatctgtatc 3060

aaatcttaa 3069

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> tHGMR 引物-1

<400> 5

aatcaactgg tacccgggat gtctcaacgt cttagcaagg ctatt 45

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> tHGMR 引物-1

<400> 6

ttagttaacc tctagagctc ttaagatttg atacagatct ttga 44

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> TC mut 引物-1

<400> 7

ctggattgta cttctgccgc cataagg 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> TC mut 引物-2

<400> 8

agaagtacaa tccagatcag gattatt 27

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> tHMGR frag 引物-1

<400> 9

tcgacatgga acagaagttg 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> tHMGR frag 引物-2

<400> 10

gatccttgtt ttatatttgt tg 22

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> TC frag 引物-1

<400> 11

tataaaacaa ggatccatga ttatcctatt gaaggag 37

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> TC frag 引物-2

<400> 12

tctgttccat gtcgacttat gaggaatgct tctttgc 37

<210> 13

<211> 632

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 13

Met Gly Thr Leu Gln Glu Lys Val Arg Arg Tyr Gln Lys Lys Thr Ile

1 5 10 15

Ala Glu Leu Lys Asn Arg Gln Asn Ala Asp Gly Ser Trp Thr Phe Cys

20 25 30

Phe Glu Gly Pro Ile Met Thr Asn Ser Phe Phe Ile Leu Leu Leu Thr

35 40 45

Ser Leu Asp Glu Gly Glu Asn Glu Lys Glu Leu Ile Ser Ala Leu Ala

50 55 60

Ala Gly Ile Arg Glu Lys Gln Gln Pro Asp Gly Thr Phe Ile Asn Tyr

65 70 75 80

Pro Asp Glu Thr Ser Gly Asn Ile Thr Ala Thr Val Gln Gly Tyr Val

85 90 95

Gly Met Leu Ala Ser Gly Cys Phe His Arg Ser Asp Pro His Met Arg

100 105 110

Lys Ala Glu Gln Ser Ile Ile Ser His Gly Gly Leu Arg His Val His

115 120 125

Phe Met Thr Lys Trp Met Leu Ala Val Asn Gly Leu Tyr Pro Trp Pro

130 135 140

Val Leu Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Met Ala Leu Pro Pro Thr Leu Pro

145 150 155 160

Val His Phe Tyr Gln Phe Ser Ala Tyr Ala Arg Ile His Phe Ala Pro

165 170 175

Met Ala Val Thr Leu Asn Gln Arg Phe Val Leu Lys Asn Arg Asn Ile

180 185 190

Pro Ser Leu Arg His Leu Asp Pro His Met Thr Lys Asn Pro Phe Thr

195 200 205

Trp Leu Arg Ser Asp Ala Phe Glu Glu Arg Asp Leu Thr Ser Ile Trp

210 215 220

Ser His Trp Asn Arg Ile Phe His Ala Pro Phe Ala Phe Gln Gln Leu

225 230 235 240

Gly Leu Gln Thr Ala Lys Thr Tyr Met Leu Asp Arg Ile Glu Lys Asp

245 250 255

Gly Thr Leu Tyr Ser Tyr Ala Ser Ala Thr Ile Phe Met Val Tyr Ser

260 265 270

Leu Leu Ser Leu Gly Val Ser Arg Tyr Ser Pro Val Ile Lys Arg Ala

275 280 285

Ile Asn Gly Ile Lys Ser Leu Met Thr Lys Cys Asn Gly Ile Pro Tyr

290 295 300

Leu Glu Asn Ser Thr Ser Thr Val Trp Asp Thr Ala Leu Ile Ser Tyr

305 310 315 320

Ala Leu Gln Lys Asn Gly Val Thr Glu Thr Asp Gly Ser Ile Thr Lys

325 330 335

Ala Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Arg Gln His Thr Lys Arg Ala Asp Trp

340 345 350

Ser Val Lys Asn Pro Ser Ala Ala Pro Gly Gly Trp Gly Phe Ser Asn

355 360 365

Ile Asn Thr Asn Asn Pro Asp Cys Asp Asp Thr Ala Ala Val Leu Lys

370 375 380

Ala Ile Pro His Ser Tyr Ser Pro Ser Ala Trp Glu Arg Gly Val Ser

385 390 395 400

Trp Leu Leu Ser Met Gln Asn Asn Asp Gly Gly Phe Ser Ala Phe Glu

405 410 415

Lys Asn Val Asn His Pro Leu Ile Arg Leu Leu Pro Leu Glu Ser Ala

420 425 430

Glu Asp Ala Ala Val Asp Pro Ser Thr Ala Asp Leu Thr Gly Arg Val

435 440 445

Leu His Phe Leu Gly Glu Lys Ala Gly Phe Thr Glu Lys His Gln His

450 455 460

Ile Gln Arg Ala Val Asn Trp Leu Phe Glu His Gln Glu Gln Asn Gly

465 470 475 480

Ser Trp Tyr Gly Arg Trp Gly Val Cys Tyr Ile Tyr Gly Thr Trp Ala

485 490 495

Ala Leu Thr Gly Met His Ala Cys Glu Val Asp Arg Lys His Pro Ala

500 505 510

Ile Gln Lys Ala Leu Arg Trp Leu Lys Ser Ile Gln His Asp Asp Gly

515 520 525

Ser Trp Gly Glu Ser Cys Asn Ser Ala Glu Val Lys Thr Tyr Val Pro

530 535 540

Leu His Lys Gly Thr Ile Val Gln Thr Ala Trp Ala Leu Asp Ala Leu

545 550 555 560

Leu Thr Tyr Glu Ser Ser Glu His Pro Ser Val Val Lys Gly Met Gln

565 570 575

Tyr Leu Thr Asp Ser Ser Tyr His Gly Ala Asp Ser Leu Ala Tyr Pro

580 585 590

Ala Gly Ile Gly Leu Pro Lys Gln Phe Tyr Ile Arg Tyr His Ser Tyr

595 600 605

Pro Tyr Val Phe Ser Leu Leu Ala Val Gly Lys Tyr Leu Asn Ser Ile

610 615 620

Glu Lys Glu Thr Ala Asn Glu Thr

625 630

<210> 14

<211> 1899

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 14

atgggcaccc tgcaggagaa agtgcgtcgc tatcagaaga aaactatcgc cgaactgaag 60

aaccgccaga acgccgatgg tagctggacc ttctgcttcg aaggcccgat catgacaaat 120

agttttttca ttctgctgct gaccagtctg gacgaaggtg agaacgagaa ggaactgatt 180

agcgcactgg ccgcaggtat ccgcgagaag cagcagccgg acggcacatt tattaactac 240

ccggacgaaa ccagcggcaa tatcaccgcc accgtgcagg gctatgttgg catgctggcc 300

agtggctgct ttcaccgcag tgatccgcac atgcgcaaag ccgaacagag catcattagc 360

catggcggcc tgcgccatgt gcattttatg acaaaatgga tgctggccgt gaatggtctg 420

tatccgtggc ctgttctgta cttaccgctg agcttaatgg ccctgccgcc gacactgccg 480

gtgcactttt atcagttcag cgcctacgcc cgtattcact tcgcccctat ggccgtgacc 540

ctgaatcaac gcttcgtgtt aaaaaaccgt aatattccga gtctgcgcca tctggacccg 600

cacatgacaa agaacccgtt cacctggctg cgcagcgacg ccttcgaaga acgcgacctg 660

accagcattt ggagccactg gaatcgtatc tttcacgcac cgttcgcatt ccagcagctg 720

ggcctgcaga ccgccaaaac ctatatgctg gaccgcattg aaaaggacgg caccctgtac 780

agctatgcca gcgcaaccat cttcatggtg tatagcctgc tgagcctggg tgttagtcgc 840

tacagcccgg ttatcaaacg cgcaattaat ggcattaaaa gtctgatgac caagtgcaac 900

ggtatcccgt atctggagaa tagcacaagc accgtttggg ataccgccct gatcagctat 960

gccctgcaga agaatggcgt taccgaaacc gacggcagca ttaccaaagc cgccgcctat 1020

ctgctggagc gccagcatac caaacgcgca gactggagcg tgaagaatcc tagtgccgca 1080

cctggcggct ggggtttcag taacatcaac accaataacc cggactgcga ttgtaccgca 1140

gcagtgttaa aggccattcc gcatagttat agcccgagcg catgggagcg cggtgttagc 1200

tggctgctga gtatgcagaa caatgatggc ggcttcagcg ccttcgaaaa gaacgtgaat 1260

catccgctga tccgcctgct gccgctggag agtgcagaag atgccgcagt ggatccgagc 1320

accgcagatc tgaccggccg cgtgttacac tttctgggtg aaaaggcagg cttcaccgag 1380

aaacaccagc atatccagcg cgcagtgaat tggctgtttg agcaccagga gcagaatggt 1440

agttggtacg gccgctgggg cgtttgttat atctacggta cctgggccgc cctgaccggc 1500

atgcacgcct gcgaagtgga tcgcaaacat ccggccattc agaaagccct gcgctggctg 1560

aaaagcattc agcatgacga tggcagctgg ggtgaaagct gcaacagtgc cgaggtgaag 1620

acctatgttc cgctgcacaa gggcaccatc gtgcagacag catgggccct ggacgccctg 1680

ctgacctacg aaagcagtga gcatcctagc gtggtgaagg gcatgcagta cctgacagac 1740

agtagctatc acggtgccga cagtttagcc tacccggcag gcattggcct gccgaagcag 1800

ttttacatcc gttaccacag ctacccgtac gtgtttagcc tgctggcagt gggcaagtac 1860

ctgaacagca tcgaaaagga gacagccaac gagacctaa 1899

<210> 15

<211> 625

<212> PRT

<213> 巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）

<400> 15

Met Ile Ile Leu Leu Lys Glu Val Gln Leu Glu Ile Gln Arg Arg Ile

1 5 10 15

Ala Tyr Leu Arg Pro Thr Gln Lys Asn Asp Gly Ser Phe Arg Tyr Cys

20 25 30

Phe Glu Thr Gly Val Met Pro Asp Ala Phe Leu Ile Met Leu Leu Arg

35 40 45

Thr Phe Asp Leu Asp Lys Glu Val Leu Ile Lys Gln Leu Thr Glu Arg

50 55 60

Ile Val Ser Leu Gln Asn Glu Asp Gly Leu Trp Thr Leu Phe Asp Asp

65 70 75 80

Glu Glu His Asn Leu Ser Ala Thr Ile Gln Ala Tyr Thr Ala Leu Leu

85 90 95

Tyr Ser Gly Tyr Tyr Gln Lys Asn Asp Arg Ile Leu Arg Lys Ala Glu

100 105 110

Arg Tyr Ile Ile Asp Ser Gly Gly Ile Ser Arg Ala His Phe Leu Thr

115 120 125

Arg Trp Met Leu Ser Val Asn Gly Leu Tyr Glu Trp Pro Lys Leu Phe

130 135 140

Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Leu Leu Val Pro Thr Tyr Val Pro Leu Asn

145 150 155 160

Phe Tyr Glu Leu Ser Thr Tyr Ala Arg Ile His Phe Val Pro Met Met

165 170 175

Val Ala Gly Asn Lys Lys Phe Ser Leu Thr Ser Arg His Thr Pro Ser

180 185 190

Leu Ser His Leu Asp Val Arg Glu Gln Lys Gln Glu Ser Glu Glu Thr

195 200 205

Thr Gln Glu Ser Arg Ala Ser Ile Phe Leu Val Asp His Leu Lys Gln

210 215 220

Leu Ala Ser Leu Pro Ser Tyr Ile His Lys Leu Gly Tyr Gln Ala Ala

225 230 235 240

Glu Arg Tyr Met Leu Glu Arg Ile Glu Lys Asp Gly Thr Leu Tyr Ser

245 250 255

Tyr Ala Thr Ser Thr Phe Phe Met Ile Tyr Gly Leu Leu Ala Leu Gly

260 265 270

Tyr Lys Lys Asp Ser Phe Val Ile Gln Lys Ala Ile Asp Gly Ile Cys

275 280 285

Ser Leu Leu Ser Thr Cys Ser Gly His Val His Val Glu Asn Ser Thr

290 295 300

Ser Thr Val Trp Asp Thr Ala Leu Leu Ser Tyr Ala Leu Gln Glu Ala

305 310 315 320

Gly Val Pro Gln Gln Asp Pro Met Ile Lys Gly Thr Thr Arg Tyr Leu

325 330 335

Lys Lys Arg Gln His Thr Lys Leu Gly Asp Trp Gln Phe His Asn Pro

340 345 350

Asn Thr Ala Pro Gly Gly Trp Gly Phe Ser Asp Ile Asn Thr Asn Asn

355 360 365

Pro Asp Leu Asp Cys Thr Ser Ala Ala Ile Arg Ala Leu Ser Arg Arg

370 375 380

Ala Gln Thr Asp Thr Asp Tyr Leu Glu Ser Trp Gln Arg Gly Ile Asn

385 390 395 400

Trp Leu Leu Ser Met Gln Asn Lys Asp Gly Gly Phe Ala Ala Phe Glu

405 410 415

Lys Asn Thr Asp Ser Ile Leu Phe Thr Tyr Leu Pro Leu Glu Asn Ala

420 425 430

Lys Asp Ala Ala Thr Asp Pro Ala Thr Ala Asp Leu Thr Gly Arg Val

435 440 445

Leu Glu Cys Leu Gly Asn Phe Ala Gly Met Asn Lys Ser His Pro Ser

450 455 460

Ile Lys Ala Ala Val Lys Trp Leu Phe Asp His Gln Leu Asp Asn Gly

465 470 475 480

Ser Trp Tyr Gly Arg Trp Gly Val Cys Tyr Ile Tyr Gly Thr Trp Ala

485 490 495

Ala Ile Thr Gly Leu Arg Ala Val Gly Val Ser Ala Ser Asp Pro Arg

500 505 510

Ile Ile Lys Ala Ile Asn Trp Leu Lys Ser Ile Gln Gln Glu Asp Gly

515 520 525

Gly Phe Gly Glu Ser Cys Tyr Ser Ala Ser Leu Lys Lys Tyr Val Pro

530 535 540

Leu Ser Phe Ser Thr Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu Asp Ala Leu

545 550 555 560

Met Thr Ile Cys Pro Leu Lys Asp Gln Ser Val Glu Lys Gly Ile Lys

565 570 575

Phe Leu Leu Asn Pro Asn Leu Thr Glu Gln Gln Thr His Tyr Pro Thr

580 585 590

Gly Ile Gly Leu Pro Gly Gln Phe Tyr Ile Gln Tyr His Ser Tyr Asn

595 600 605

Asp Ile Phe Pro Leu Leu Ala Leu Ala His Tyr Ala Lys Lys His Ser

610 615 620

Ser

625

<210> 16

<211> 632

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 16

Met Gly Thr Leu Gln Glu Lys Val Arg Arg Tyr Gln Lys Lys Thr Ile

1 5 10 15

Ala Glu Leu Lys Asn Arg Gln Asn Ala Asp Gly Ser Trp Thr Phe Cys

20 25 30

Phe Glu Gly Pro Ile Met Thr Asn Ser Phe Phe Ile Leu Leu Leu Thr

35 40 45

Ser Leu Asp Glu Gly Glu Asn Glu Lys Glu Leu Ile Ser Ala Leu Ala

50 55 60

Ala Gly Ile Arg Glu Lys Gln Gln Pro Asp Gly Thr Phe Ile Asn Tyr

65 70 75 80

Pro Asp Glu Thr Ser Gly Asn Ile Thr Ala Thr Val Gln Gly Tyr Val

85 90 95

Gly Met Leu Ala Ser Gly Cys Phe His Arg Ser Asp Pro His Met Arg

100 105 110

Lys Ala Glu Gln Ser Ile Ile Ser His Gly Gly Leu Arg His Val His

115 120 125

Phe Met Thr Lys Trp Met Leu Ala Val Asn Gly Leu Tyr Pro Trp Pro

130 135 140

Val Leu Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Met Ala Leu Pro Pro Thr Leu Pro

145 150 155 160

Val His Phe Tyr Gln Phe Ser Ala Tyr Ala Arg Ile His Phe Ala Pro

165 170 175

Met Ala Val Thr Leu Asn Gln Arg Phe Val Leu Lys Asn Arg Asn Ile

180 185 190

Pro Ser Leu Arg His Leu Asp Pro His Met Thr Lys Asn Pro Phe Thr

195 200 205

Trp Leu Arg Ser Asp Ala Phe Glu Glu Arg Asp Leu Thr Ser Ile Trp

210 215 220

Ser His Trp Asn Arg Ile Phe His Ala Pro Phe Ala Phe Gln Gln Leu

225 230 235 240

Gly Leu Gln Thr Ala Lys Thr Tyr Met Leu Asp Arg Ile Glu Lys Asp

245 250 255

Gly Thr Leu Tyr Ser Tyr Ala Ser Ala Thr Ile Phe Met Val Tyr Ser

260 265 270

Leu Leu Ser Leu Gly Val Ser Arg Tyr Ser Pro Val Ile Lys Arg Ala

275 280 285

Ile Asn Gly Ile Lys Ser Leu Met Thr Lys Cys Asn Gly Ile Pro Tyr

290 295 300

Leu Glu Asn Ser Thr Ser Thr Val Trp Asp Thr Ala Leu Ile Ser Tyr

305 310 315 320

Ala Leu Gln Lys Asn Gly Val Thr Glu Thr Asp Gly Ser Ile Thr Lys

325 330 335

Ala Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Arg Gln His Thr Lys Arg Ala Asp Trp

340 345 350

Ser Val Lys Asn Pro Ser Ala Ala Pro Gly Gly Trp Gly Phe Ser Asn

355 360 365

Ile Asn Thr Asn Asn Pro Asp Cys Asp Cys Thr Ala Ala Val Leu Lys

370 375 380

Ala Ile Pro His Ser Tyr Ser Pro Ser Ala Trp Glu Arg Gly Val Ser

385 390 395 400

Trp Leu Leu Ser Met Gln Asn Asn Asp Gly Gly Phe Ser Ala Phe Glu

405 410 415

Lys Asn Val Asn His Pro Leu Ile Arg Leu Leu Pro Leu Glu Ser Ala

420 425 430

Glu Asp Ala Ala Val Asp Pro Ser Thr Ala Asp Leu Thr Gly Arg Val

435 440 445

Leu His Phe Leu Gly Glu Lys Ala Gly Phe Thr Glu Lys His Gln His

450 455 460

Ile Gln Arg Ala Val Asn Trp Leu Phe Glu His Gln Glu Gln Asn Gly

465 470 475 480

Ser Trp Tyr Gly Arg Trp Gly Val Cys Tyr Ile Tyr Gly Thr Trp Ala

485 490 495

Ala Leu Thr Gly Met His Ala Cys Glu Val Asp Arg Lys His Pro Ala

500 505 510

Ile Gln Lys Ala Leu Arg Trp Leu Lys Ser Ile Gln His Asp Asp Gly

515 520 525

Ser Trp Gly Glu Ser Cys Asn Ser Ala Glu Val Lys Thr Tyr Val Pro

530 535 540

Leu His Lys Gly Thr Ile Val Gln Thr Ala Trp Ala Leu Asp Ala Leu

545 550 555 560

Leu Thr Tyr Glu Ser Ser Glu His Pro Ser Val Val Lys Gly Met Gln

565 570 575

Tyr Leu Thr Asp Ser Ser Tyr His Gly Ala Asp Ser Leu Ala Tyr Pro

580 585 590

Ala Gly Ile Gly Leu Pro Lys Gln Phe Tyr Ile Arg Tyr His Ser Tyr

595 600 605

Pro Tyr Val Phe Ser Leu Leu Ala Val Gly Lys Tyr Leu Asn Ser Ile

610 615 620

Glu Lys Glu Thr Ala Asn Glu Thr

625 630

<210> 17

<211> 592

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）

<400> 17

Met Thr Asp Ser Phe Phe Ile Leu Met Leu Thr Ser Leu Gly Asp Gln

1 5 10 15

Asp Ser Ser Leu Ile Ala Ser Leu Ala Glu Arg Ile Arg Ser Arg Gln

20 25 30

Ser Glu Asp Gly Ala Phe Arg Asn His Pro Asp Glu Arg Ala Gly Asn

35 40 45

Leu Thr Ala Thr Val Gln Gly Tyr Thr Gly Met Leu Ala Ser Gly Leu

50 55 60

Tyr Asp Arg Lys Ala Pro His Met Gln Lys Ala Glu Ala Phe Ile Lys

65 70 75 80

Asp Ala Gly Gly Leu Lys Gly Val His Phe Met Thr Lys Trp Met Leu

85 90 95

Ala Ala Asn Gly Leu Tyr Pro Trp Pro Arg Ala Tyr Ile Pro Leu Ser

100 105 110

Phe Leu Leu Ile Pro Ser Tyr Phe Pro Leu His Phe Tyr His Phe Ser

115 120 125

Thr Tyr Ala Arg Ile His Phe Val Pro Met Ala Ile Thr Phe Asn Arg

130 135 140

Arg Phe Ser Leu Lys Asn Asn Gln Ile Gly Ser Leu Arg His Leu Asp

145 150 155 160

Glu Ala Met Ser Lys Asn Pro Leu Glu Trp Leu Asn Ile Arg Ala Phe

165 170 175

Asp Glu Arg Thr Phe Tyr Ser Phe Asn Leu Gln Trp Lys Gln Leu Phe

180 185 190

Gln Trp Pro Ala Tyr Val His Gln Leu Gly Phe Glu Ala Gly Lys Lys

195 200 205

Tyr Met Leu Asp Arg Ile Glu Glu Asp Gly Thr Leu Tyr Ser Tyr Ala

210 215 220

Ser Ala Thr Met Phe Met Ile Tyr Ser Leu Leu Ala Met Gly Ile Ser

225 230 235 240

Lys Asn Ala Pro Val Val Lys Lys Ala Val Ser Gly Ile Lys Ser Leu

245 250 255

Ile Ser Ser Cys Gly Lys Glu Gly Ala His Leu Glu Asn Ser Thr Ser

260 265 270

Thr Val Trp Asp Thr Ala Leu Ile Ser Tyr Ala Met Gln Glu Ser Gly

275 280 285

Val Pro Glu Gln His Ser Ser Thr Ser Ser Ala Ala Asp Tyr Leu Leu

290 295 300

Lys Arg Gln His Val Lys Lys Ala Asp Trp Ala Val Ser Asn Pro Gln

305 310 315 320

Ala Val Pro Gly Gly Trp Gly Phe Ser His Ile Asn Thr Asn Asn Pro

325 330 335

Asp Leu Asp Asp Thr Ala Ala Ala Leu Lys Ala Ile Pro Phe Gln Arg

340 345 350

Arg Pro Asp Ala Trp Asn Arg Gly Leu Ala Trp Leu Leu Ser Met Gln

355 360 365

Asn Lys Asp Gly Gly Phe Ala Ala Phe Glu Lys Asp Val Asp His Pro

370 375 380

Leu Ile Arg Asn Leu Pro Leu Glu Ser Ala Ala Glu Ala Ala Val Asp

385 390 395 400

Pro Ser Thr Ala Asp Leu Thr Gly Arg Val Leu His Leu Leu Gly Leu

405 410 415

Lys Gly Arg Phe Thr Asp Asn His Pro Ala Val Arg Arg Ala Leu Arg

420 425 430

Trp Leu Asp His His Gln Lys Ala Asp Gly Ser Trp Tyr Gly Arg Trp

435 440 445

Gly Val Cys Phe Ile Tyr Gly Thr Trp Ala Ala Leu Thr Gly Met Lys

450 455 460

Ala Val Gly Val Ser Ala Asn Gln Thr Ser Val Lys Lys Ala Ile Ser

465 470 475 480

Trp Leu Lys Ser Ile Gln Arg Glu Asp Gly Ser Trp Gly Glu Ser Cys

485 490 495

Lys Ser Cys Glu Ala Lys Arg Phe Val Pro Leu His Phe Gly Thr Val

500 505 510

Val Gln Ser Ser Trp Ala Leu Glu Ala Leu Leu Gln Tyr Glu Arg Pro

515 520 525

Asp Asp Pro Gln Ile Ile Lys Gly Ile Arg Phe Leu Ile Asp Glu His

530 535 540

Glu Ser Ser Arg Glu Arg Leu Glu Tyr Pro Thr Gly Ile Gly Leu Pro

545 550 555 560

Asn Gln Phe Tyr Ile Arg Tyr His Ser Tyr Pro Phe Val Phe Ser Leu

565 570 575

Leu Ala Ser Ser Ala Phe Ile Lys Lys Ala Glu Met Arg Glu Thr Tyr

580 585 590

<210> 18

<211> 631

<212> PRT

<213> 酸热脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）

<400> 18

Met Ala Glu Gln Leu Val Glu Ala Pro Ala Tyr Ala Arg Thr Leu Asp

1 5 10 15

Arg Ala Val Glu Tyr Leu Leu Ser Cys Gln Lys Asp Glu Gly Tyr Trp

20 25 30

Trp Gly Pro Leu Leu Ser Asn Val Thr Met Glu Ala Glu Tyr Val Leu

35 40 45

Leu Cys His Ile Leu Asp Arg Val Asp Arg Asp Arg Met Glu Lys Ile

50 55 60

Arg Arg Tyr Leu Leu His Glu Gln Arg Glu Asp Gly Thr Trp Ala Leu

65 70 75 80

Tyr Pro Gly Gly Pro Pro Asp Leu Asp Thr Thr Ile Glu Ala Tyr Val

85 90 95

Ala Leu Lys Tyr Ile Gly Met Ser Arg Asp Glu Glu Pro Met Gln Lys

100 105 110

Ala Leu Arg Phe Ile Gln Ser Gln Gly Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val

115 120 125

Phe Thr Arg Met Trp Leu Ala Leu Val Gly Glu Tyr Pro Trp Glu Lys

130 135 140

Val Pro Met Val Pro Pro Glu Ile Met Phe Leu Gly Lys Arg Met Pro

145 150 155 160

Leu Asn Ile Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Ala Arg Ala Thr Val Val Ala

165 170 175

Leu Ser Ile Val Met Ser Arg Gln Pro Val Phe Pro Leu Pro Glu Arg

180 185 190

Ala Arg Val Pro Glu Leu Tyr Glu Thr Asp Val Pro Pro Arg Arg Arg

195 200 205

Gly Ala Lys Gly Gly Gly Gly Trp Ile Phe Asp Ala Leu Asp Arg Ala

210 215 220

Leu His Gly Tyr Gln Lys Leu Ser Val His Pro Phe Arg Arg Ala Ala

225 230 235 240

Glu Ile Arg Ala Leu Asp Trp Leu Leu Glu Arg Gln Ala Gly Asp Gly

245 250 255

Ser Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Phe Tyr Ala Leu Ile Ala Leu

260 265 270

Lys Ile Leu Asp Met Thr Gln His Pro Ala Phe Ile Lys Gly Trp Glu

275 280 285

Gly Leu Glu Leu Tyr Gly Val Glu Leu Asp Tyr Gly Gly Trp Met Phe

290 295 300

Gln Ala Ser Ile Ser Pro Val Trp Asp Thr Gly Leu Ala Val Leu Ala

305 310 315 320

Leu Arg Ala Ala Gly Leu Pro Ala Asp His Asp Arg Leu Val Lys Ala

325 330 335

Gly Glu Trp Leu Leu Asp Arg Gln Ile Thr Val Pro Gly Asp Trp Ala

340 345 350

Val Lys Arg Pro Asn Leu Lys Pro Gly Gly Phe Ala Phe Gln Phe Asp

355 360 365

Asn Val Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Val Val Trp Ala

370 375 380

Leu Asn Thr Leu Arg Leu Pro Asp Glu Arg Arg Arg Arg Asp Ala Met

385 390 395 400

Thr Lys Gly Phe Arg Trp Ile Val Gly Met Gln Ser Ser Asn Gly Gly

405 410 415

Trp Gly Ala Tyr Asp Val Asp Asn Thr Ser Asp Leu Pro Asn His Ile

420 425 430

Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Val Thr Asp Pro Pro Ser Glu Asp Val

435 440 445

Thr Ala His Val Leu Glu Cys Phe Gly Ser Phe Gly Tyr Asp Asp Ala

450 455 460

Trp Lys Val Ile Arg Arg Ala Val Glu Tyr Leu Lys Arg Glu Gln Lys

465 470 475 480

Pro Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Leu Tyr Gly

485 490 495

Thr Gly Ala Val Val Ser Ala Leu Lys Ala Val Gly Ile Asp Thr Arg

500 505 510

Glu Pro Tyr Ile Gln Lys Ala Leu Asp Trp Val Glu Gln His Gln Asn

515 520 525

Pro Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Cys Arg Ser Tyr Glu Asp Pro Ala

530 535 540

Tyr Ala Gly Lys Gly Ala Ser Thr Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu

545 550 555 560

Met Ala Leu Ile Ala Gly Gly Arg Ala Glu Ser Glu Ala Ala Arg Arg

565 570 575

Gly Val Gln Tyr Leu Val Glu Thr Gln Arg Pro Asp Gly Gly Trp Asp

580 585 590

Glu Pro Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Pro Gly Asp Phe Tyr Leu Gly

595 600 605

Tyr Thr Met Tyr Arg His Val Phe Pro Thr Leu Ala Leu Gly Arg Tyr

610 615 620

Lys Gln Ala Ile Glu Arg Arg

625 630

Claims

1.一种变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，其为作为DXDD模体的第4位的氨基酸残基的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，

(a)所述变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶以所述DXDD模体为基准，在距离N末端侧100个氨基酸残基以上的位置上具有QXXXGX(W/F)模体，在距离N末端侧10～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXX(G/A)X(F/W/Y)模体，在距离C末端侧20～50个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W/Y)模体，在距离C末端侧50～120个氨基酸残基的位置上具有QXXXGXW模体，及在距离C末端侧120～170个氨基酸残基的位置上具有QXXXGX(F/W)模体，且在距离C末端侧170个氨基酸残基以上的位置上不具有QXXXGXW模体，

(b)与序列号1或13所表示的氨基酸序列的同一性为40％以上，且

(c)以角鲨烯为基质，表现出龙涎香醇生成活性。

2.根据权利要求1所述的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，其中，构成所述变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶的多肽为：

(1)序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的多肽，或序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的多肽；

(5)包含下述氨基酸序列、且以角鲨烯为基质并表现出龙涎香醇生成活性的多肽：在序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列，或在序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1个或数个的氨基酸而成的氨基酸序列；或者

3.根据权利要求1或2所述的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶，其中，所述序列号1所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第373位的天冬氨酸、或所述序列号13所表示的氨基酸序列中从N末端数起的第378位的天冬氨酸被半胱氨酸或甘氨酸取代。

4.一种多核苷酸，其编码权利要求1～3中任一项所述的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶。

5.一种微生物，其具有权利要求4所述的多核苷酸。

6.根据权利要求5所述的微生物，其进一步具有编码羟甲基戊二酰CoA还原酶的多核苷酸。

7.一种载体，其包含具有权利要求4所述的多核苷酸的DNA。

8.一种转化体，其具有权利要求7所述的载体。

9.根据权利要求8所述的转化体，其进一步具有载体，该载体包含具有编码羟甲基戊二酰CoA还原酶的多核苷酸的DNA。

10.一种龙涎香醇的制备方法，其特征在于，使权利要求1～3中任一项所述的变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶与角鲨烯反应，得到龙涎香醇。

11.一种龙涎香醇的制备方法，其特征在于，培养权利要求5或6所述的微生物、或权利要求8或9所述的转化体。