WO2017150695A1 - 変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素及びアンブレインの製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明の目的は、簡便にアンブレインを得ることができるアンブレインの製造方法を提供することにある。 前記課題は、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、（ａ）前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、及びＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、ＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、及びＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフを有し、そしてＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さず、（ｂ）配列番号１又は１３で表されるアミノ酸配列との同一性が４０％以上であり、そして（ｃ）スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示す、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素によって解決することができる。
Description
龍涎香（ambergris）は、７世紀ごろから世界各地で使用されてきた高級香料であり、漢方薬としても使用されている。龍涎香は、マッコウクジラが食物（タコ、イカ等）の不消化物を消化管分泌物により結石化させ、排泄したものと考えられているが、詳細な生成メカニズムは不明である。龍涎香の主成分はアンブレインであり、龍涎香が海上を浮遊する間に日光と酸素によって酸化分解を受け、各種の香りを持つ化合物を生成すると考えられている。
龍涎香の主成分アンブレインは、香料又は薬剤として用いられているが、自然界から大量に入手することは不可能である。このため、種々の有機合成法が提案されている。
例えば、特許文献１には、（＋）－アンブレインを簡便かつ安価に効率よく製造する方法として、アンブレノリドから、新規なスルホン酸誘導体を製造し、これにγ－シクロゲラニルハライドの光学活性体をカップリングさせる工程を含む方法が開示されている。
また、非特許文献１には、（±）（５，５，８ａ－トリメチルオクタヒドロ－１Ｈ－スピロ［ナフタレン－２，２’－オキシラン］－１－イル）メタノールから合成した２－（（１Ｒ，２Ｒ，４ａＳ，８ａＳ）－２－（メトキシメトキシ）－２，５，５，８ａ－テトラメチルデカヒドロナフタレン－１－イル）アセトアルデヒドと、（±）メチル ６－ヒドロキシ－２，２－ジメチルシクロヘキサンカルボキシレートから合成した５－（（４－（（Ｓ）－２，２－ジメチル－６－メチレンシクロヘキシル）ブタン－２－イル）スルホニル）－１－フェニル－１Ｈ－テトラゾールとを、Ｊｕｌｉａカップリング反応によって収束的合成して、アンブレインを得る方法が開示されている。
しかしながら、従来のアンブレインの有機合成法は、多くの合成段階を必要とすることから、反応系が複雑であり、事業化には至っていない。
しかしながら、従来のアンブレインの有機合成法は、多くの合成段階を必要とすることから、反応系が複雑であり、事業化には至っていない。
Tetrahedron Asymmetry, (2006) Vol.17, pp.3037-3045
Biosci. Biotechnol. Biochem., (1999) Vol.63, pp.2189-2198
Biosci. Biotechnol. Biochem., (2001) Vol.65, pp.2233-2242
Biosci. Biotechnol. Biochem., (2002) Vol.66, pp.1660-1670
J. Am. Chem. Soc., (2011) Vol.133, pp.17540-17543
J. Am. Chem. Soc., (2013) Vol.135, pp.18335-18338
一方、スクアレン－ホペン環化酵素の変異型酵素（D377C、D377N、Y420H、Y420W等）を用いることによって、スクアレンから、単環性トリテルペンである３－デオキシアキレオールＡを得る方法が知られている（非特許文献２～４）。
本発明者らは、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成可能な変異型スクアレン－ホペン環化酵素をスクアレンに反応させることによって、３－デオキシアキレオールＡを得、さらにテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を反応させることによって、アンブレインの製造ができることを見出した（特許文献２）。
しかしながら、特許文献２の方法は多段階反応であり、また収率についても改善の余地があった。
従って、本発明の目的は、簡便にアンブレインを得ることができるアンブレインの製造方法を提供することにある。
本発明者らは、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成可能な変異型スクアレン－ホペン環化酵素をスクアレンに反応させることによって、３－デオキシアキレオールＡを得、さらにテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を反応させることによって、アンブレインの製造ができることを見出した（特許文献２）。
しかしながら、特許文献２の方法は多段階反応であり、また収率についても改善の余地があった。
従って、本発明の目的は、簡便にアンブレインを得ることができるアンブレインの製造方法を提供することにある。
本発明者らは、アンブレインを効率よく製造する方法について鋭意研究した結果、特定の変異を有する変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素がスクアレンからアンブレインを生成する活性を有することを見出した。このスクアレンからアンブレインの産生は、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素が、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成することにより達成されるものである。また、スクアレンからアンブレインの産生は、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素が、２環性の８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインを生成することにより達成されるものである。本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素がこのような酵素活性を示すことは、驚くべきことである。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］ＤＸＤＤモチーフの第４番目アミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換している変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素であって、（ａ）前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、及びＣ末端側に１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフを有し、そしてＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さず、（ｂ）配列番号１又は１３で表されるアミノ酸配列との同一性が４０％以上であり、そして（ｃ）スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示す、
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、
［２］前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、又は（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド
である、［１］に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、
［３］前記配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸、又は前記配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸が、システイン又はグリシンに置換している、［１］又は［２］に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、
［４］［１］～［３］のいずれかに記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチド、
［５］［４］に記載のポリヌクレオチドを有する微生物、
［６］ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを更に有する［５］に記載の微生物、
［７］［４］に記載のポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター、
［８］［７］に記載のベクターを有する形質転換体、
［９］ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクターを更に有する［８］に記載の形質転換体、
［１０］［１］～［３］のいずれかに記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をスクアレンに反応させて、アンブレインを得ることを特徴とする、アンブレインの製造方法、及び
［１１］［５］又は［６］に記載の微生物、又は［８］又は［９］に記載の形質転換体を培養することを特徴とするアンブレインの製造方法、
に関する。
［１］ＤＸＤＤモチーフの第４番目アミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換している変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素であって、（ａ）前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、及びＣ末端側に１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフを有し、そしてＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さず、（ｂ）配列番号１又は１３で表されるアミノ酸配列との同一性が４０％以上であり、そして（ｃ）スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示す、
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、
［２］前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、又は（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド
である、［１］に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、
［３］前記配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸、又は前記配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸が、システイン又はグリシンに置換している、［１］又は［２］に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、
［４］［１］～［３］のいずれかに記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチド、
［５］［４］に記載のポリヌクレオチドを有する微生物、
［６］ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを更に有する［５］に記載の微生物、
［７］［４］に記載のポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター、
［８］［７］に記載のベクターを有する形質転換体、
［９］ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクターを更に有する［８］に記載の形質転換体、
［１０］［１］～［３］のいずれかに記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をスクアレンに反応させて、アンブレインを得ることを特徴とする、アンブレインの製造方法、及び
［１１］［５］又は［６］に記載の微生物、又は［８］又は［９］に記載の形質転換体を培養することを特徴とするアンブレインの製造方法、
に関する。
本発明によれば、変異型スクアレン－ホペン環化酵素を併用しなくとも、スクアレンを基質としてアンブレインを１ステップで合成することができる。また、微生物発酵により培養液に含まれる炭素源から効率的にアンブレインを合成することができる。
本発明に用いる変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成することができる。また、本発明に用いる変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、２環性トリテルペン（８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン）からアンブレインを生成することができる。
本発明に用いる変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成することができる。また、本発明に用いる変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、２環性トリテルペン（８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン）からアンブレインを生成することができる。
以下、本発明について詳述する。
［１］変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換している変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素であって、（ａ）前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、及びＣ末端側に１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフを有し、そしてＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さず、（ｂ）配列番号１又は１３で表されるアミノ酸配列との同一性が４０％以上であり、そして（ｃ）スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示す。
ここで、各モチーフや配列を定義しているアルファベットはアミノ酸の一文字略号を表しており、「Ｘ」は任意のアミノ酸を意味する。すなわち、ＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフの場合、Ｎ末端側からＣ末端側に向かってグルタミン（Ｑ）、任意のアミノ酸（Ｘ）が３つ、グリシン（Ｇ）、任意のアミノ酸（Ｘ）、さらにトリプトファン（Ｗ）又はフェニルアラニン（Ｆ）のいずれか、が配列することを示す。また、「ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフを有する」とは、ＤＸＤＤモチーフとＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフの間に１００アミノ酸残基以上存在することを意味するものとし、その他モチーフの特定についても同様である。以下、特に記載のない限り同様である。
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の好ましい態様としては、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、又は
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド
である。
また、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の最も好ましい態様としては、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるBacillus megaterium由来のポリペプチド、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるBacillus subtilis由来のポリペプチドを挙げることができる。これらの変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がシステインに置換している。
［１］変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換している変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素であって、（ａ）前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、及びＣ末端側に１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフを有し、そしてＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さず、（ｂ）配列番号１又は１３で表されるアミノ酸配列との同一性が４０％以上であり、そして（ｃ）スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示す。
ここで、各モチーフや配列を定義しているアルファベットはアミノ酸の一文字略号を表しており、「Ｘ」は任意のアミノ酸を意味する。すなわち、ＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフの場合、Ｎ末端側からＣ末端側に向かってグルタミン（Ｑ）、任意のアミノ酸（Ｘ）が３つ、グリシン（Ｇ）、任意のアミノ酸（Ｘ）、さらにトリプトファン（Ｗ）又はフェニルアラニン（Ｆ）のいずれか、が配列することを示す。また、「ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフを有する」とは、ＤＸＤＤモチーフとＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフの間に１００アミノ酸残基以上存在することを意味するものとし、その他モチーフの特定についても同様である。以下、特に記載のない限り同様である。
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の好ましい態様としては、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、又は
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド
である。
また、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の最も好ましい態様としては、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるBacillus megaterium由来のポリペプチド、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるBacillus subtilis由来のポリペプチドを挙げることができる。これらの変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がシステインに置換している。
（テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素）
テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（以下、ＴＣと称することがある）は、片末端に単環を有する３－デオキシアキレオールＡを基質として利用し、アンブレインを生成することができる。すなわち、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、３－デオキシアキレオールＡを基質として利用すると、３－デオキシアキレオールＡの環状化されていない端を選択的に環化させて、両末端環化化合物を生成することができる。
また、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、スクアレンを基質とし、２環性の８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンを生成することができる（非特許文献５）。更に、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、２環性の８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンの環状化されていない端を選択的に環化させて、両末端環化化合物のオノセランオキサイドと１４β－ヒドロキシオノセラ－８（２６）－エンを生成することができる（非特許文献６）。
テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（以下、ＴＣと称することがある）は、片末端に単環を有する３－デオキシアキレオールＡを基質として利用し、アンブレインを生成することができる。すなわち、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、３－デオキシアキレオールＡを基質として利用すると、３－デオキシアキレオールＡの環状化されていない端を選択的に環化させて、両末端環化化合物を生成することができる。
また、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、スクアレンを基質とし、２環性の８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンを生成することができる（非特許文献５）。更に、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、２環性の８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンの環状化されていない端を選択的に環化させて、両末端環化化合物のオノセランオキサイドと１４β－ヒドロキシオノセラ－８（２６）－エンを生成することができる（非特許文献６）。
すなわち、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、ＥＣ４．２．１．１２９に分類され、水とテトラプレニル－β－クルクメンからバチテルペノールＡを生成する反応、又は、スクアレンから８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンを生成する反応を触媒し得る酵素である。
テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、例えばバチルス属、ブレビバチルス属、パエニバチルス属、又はジオバチルス属などの細菌が有している。バチルス属の細菌としては、枯草菌（バチルス・サブチルス）、バチルス・メガテリウム、又はバチルス・リケニフォルミスを挙げることができる。テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、及びＣ末端側に１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフを有している。後述のスクアレン－ホペン環化酵素も、前記のモチーフを有しているが、更にＤＸＤＤモチーフのＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有している。一方、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、前記ＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有していない。更に、スクアレン－ホペン環化酵素は、ＱＸＸＸＧＸＷモチーフのＣ末側にＧＸＧＦＰ配列を有し、その４番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）であるという特徴を有する。テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素もＧＸＧＦＰ配列に似たＧＸＧＸＰ配列を有するが、４番目のアミノ酸がフェニルアラニンではなく、例えばロイシン（L）、メチオニン（M）、又はアルギニン（R）などである。
テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、例えばバチルス属、ブレビバチルス属、パエニバチルス属、又はジオバチルス属などの細菌が有している。バチルス属の細菌としては、枯草菌（バチルス・サブチルス）、バチルス・メガテリウム、又はバチルス・リケニフォルミスを挙げることができる。テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、及びＣ末端側に１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフを有している。後述のスクアレン－ホペン環化酵素も、前記のモチーフを有しているが、更にＤＸＤＤモチーフのＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有している。一方、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、前記ＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有していない。更に、スクアレン－ホペン環化酵素は、ＱＸＸＸＧＸＷモチーフのＣ末側にＧＸＧＦＰ配列を有し、その４番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）であるという特徴を有する。テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素もＧＸＧＦＰ配列に似たＧＸＧＸＰ配列を有するが、４番目のアミノ酸がフェニルアラニンではなく、例えばロイシン（L）、メチオニン（M）、又はアルギニン（R）などである。
（アスパラギン酸の置換）
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（以下、変異型ＴＣと称することがある）においては、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換している。アスパラギン酸以外のアミノ酸は、本発明の効果が得られる限りにおいて、限定されるものではなく、アラニン、システイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、又はチロシンを挙げることができるが、好ましくはシステイン又はグリシンであり、より好ましくはシステインである。図８にバチルス・メガテリウムの野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素及び３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換した変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸配列を示す。
３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換することによって、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成することができ、そして８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインを生成することができる。また、バチルス・サブチリスの野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素及び３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸（特には、システイン）に置換することによって、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成することができ、そして８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインを生成することができる。
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の由来は、特に限定されるものではなく、全てのテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を用いることができる。すなわち、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸（好ましくはシステイン又はグリシン）に置換している変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、本発明の効果を示すことができる。すなわち、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、及びＣ末端側に１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフを有しており、ＤＸＤＤモチーフのＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有しておらず、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸（好ましくはシステイン又はグリシン）に置換している変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、本発明の効果を示すことができる。例えば、バチルス・サブチルスとバチルス・メガテリウムとのポリペプチドのアミノ酸配列の同一性は５０％程度であるが、実施例に示すように、本発明の特徴を有することにより、いずれの酵素もスクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成することができ、そして８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインを生成することができる。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、バチルス・メガテリウムのテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸配列であり、配列番号１３に記載のアミノ酸配列はバチルス・サブチルスのテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸配列である。
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（以下、変異型ＴＣと称することがある）においては、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換している。アスパラギン酸以外のアミノ酸は、本発明の効果が得られる限りにおいて、限定されるものではなく、アラニン、システイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、又はチロシンを挙げることができるが、好ましくはシステイン又はグリシンであり、より好ましくはシステインである。図８にバチルス・メガテリウムの野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素及び３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換した変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸配列を示す。
３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換することによって、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成することができ、そして８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインを生成することができる。また、バチルス・サブチリスの野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素及び３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸（特には、システイン）に置換することによって、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成することができ、そして８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインを生成することができる。
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の由来は、特に限定されるものではなく、全てのテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を用いることができる。すなわち、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸（好ましくはシステイン又はグリシン）に置換している変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、本発明の効果を示すことができる。すなわち、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、及びＣ末端側に１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフを有しており、ＤＸＤＤモチーフのＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有しておらず、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸（好ましくはシステイン又はグリシン）に置換している変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、本発明の効果を示すことができる。例えば、バチルス・サブチルスとバチルス・メガテリウムとのポリペプチドのアミノ酸配列の同一性は５０％程度であるが、実施例に示すように、本発明の特徴を有することにより、いずれの酵素もスクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成することができ、そして８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインを生成することができる。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、バチルス・メガテリウムのテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸配列であり、配列番号１３に記載のアミノ酸配列はバチルス・サブチルスのテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸配列である。
図１に記載のように、従来スクアレンからアンブレインを生成する場合、スクアレンを変異型スクアレン－ホペン環化酵素（以下、変異型ＳＨＣと称することがある）によって、３－デオキシアキレオールＡに変換し、そして３－デオキシアキレオールＡを野生型のテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素によって、アンブレインに変換することによって製造されていた（特許文献２）。
一方、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を用いて、スクアレンからアンブレインを生成する場合、図２に示すように単環性の３－デオキシアキレオールＡを中間体とする経路（以下、単環性経路と称することがある）と、８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンを中間体とする経路（以下、２環性経路と称することがある）によって製造される。
（単環性経路）
前記単環性経路においては、変異型ＴＣによって、スクアレンから単環性の３－デオキシアキレオールＡが生成される。そして変異型ＴＣによって、３－デオキシアキレオールＡからアンブレインが生成される。従来の野生型ＴＣは、３－デオキシアキレオールＡをアンブレインに変換することができたが、スクアレンを単環性の３－デオキシアキレオールＡに変換することはできなかった。本発明の変異型ＴＣは、スクアレンを単環性の３－デオキシアキレオールＡに変換することが可能であり、従って図２に示すように、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡへの変換（図２の反応（ａ））及び３－デオキシアキレオールＡからアンブレインへの変換（図２の反応（ｂ））の２つの反応を１つの酵素によって、行うことが可能になった。
前記単環性経路においては、変異型ＴＣによって、スクアレンから単環性の３－デオキシアキレオールＡが生成される。そして変異型ＴＣによって、３－デオキシアキレオールＡからアンブレインが生成される。従来の野生型ＴＣは、３－デオキシアキレオールＡをアンブレインに変換することができたが、スクアレンを単環性の３－デオキシアキレオールＡに変換することはできなかった。本発明の変異型ＴＣは、スクアレンを単環性の３－デオキシアキレオールＡに変換することが可能であり、従って図２に示すように、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡへの変換（図２の反応（ａ））及び３－デオキシアキレオールＡからアンブレインへの変換（図２の反応（ｂ））の２つの反応を１つの酵素によって、行うことが可能になった。
（２環性経路）
一方、２環性経路においては、変異型ＴＣによって、スクアレンから８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンが生成される。そして変異型ＴＣによって、８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインが生成される。従来の野生型ＴＣは、スクアレンを８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンに変換することができたが、８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンをアンブレインに変換することはできなかった。本発明の変異型ＴＣは、８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンをアンブレインに変換することが可能であり、従って図２に示すようにスクアレンから８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンへの変換（図２の反応（ｃ））及び８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインへの変換（図２の反応（ｄ））の２つの反応を１つの酵素によって、行うことが可能になった。
一方、２環性経路においては、変異型ＴＣによって、スクアレンから８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンが生成される。そして変異型ＴＣによって、８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインが生成される。従来の野生型ＴＣは、スクアレンを８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンに変換することができたが、８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンをアンブレインに変換することはできなかった。本発明の変異型ＴＣは、８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンをアンブレインに変換することが可能であり、従って図２に示すようにスクアレンから８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンへの変換（図２の反応（ｃ））及び８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインへの変換（図２の反応（ｄ））の２つの反応を１つの酵素によって、行うことが可能になった。
本発明の変異型ＴＣは、スクアレンからアンブレインを製造する工程において、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡへの変換（反応（ａ））、３－デオキシアキレオールＡからアンブレインへの変換（反応（ｂ））、スクアレンから８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンへの変換（反応（ｃ））、及び８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインへの変換（反応（ｄ））の４つの反応を１つの酵素で行うことができる。
（ＤＸＤＤモチーフ）
前記のとおり、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素において、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目の置換又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目の置換は、ＤＸＤＤモチーフと呼ばれる領域に存在する。すなわち、ＤＸＤＤモチーフは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から３７０～３７３番目、又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から３７５～３７８番目に位置する。Ｎ末端側から３７３番目、又は３７８番目のアミノ酸の置換は、ＤＸＤＤモチーフのうち、Ｎ末端側から第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換されたものである。ＤＸＤＤモチーフのアスパラギン酸は極めて保存性が高く、通常Ｎ末端側から４番目のアミノ酸残基はアスパラギン酸である。本発明は、この保存性の高い特定のアミノ酸を変異させることで、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素が、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を有するようになることを見出したものである。
前記のとおり、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素において、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目の置換又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目の置換は、ＤＸＤＤモチーフと呼ばれる領域に存在する。すなわち、ＤＸＤＤモチーフは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から３７０～３７３番目、又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から３７５～３７８番目に位置する。Ｎ末端側から３７３番目、又は３７８番目のアミノ酸の置換は、ＤＸＤＤモチーフのうち、Ｎ末端側から第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換されたものである。ＤＸＤＤモチーフのアスパラギン酸は極めて保存性が高く、通常Ｎ末端側から４番目のアミノ酸残基はアスパラギン酸である。本発明は、この保存性の高い特定のアミノ酸を変異させることで、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素が、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を有するようになることを見出したものである。
（１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列）
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のポリペプチドは、配列番号１又は１３のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。そして、前記ポリペプチドは、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチドである。すなわち、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示さないポリペプチドは、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のポリペプチドに含まれない。本明細書において、「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、アミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、例えば１～３３０個、１～３００個、１～２５０個、１～２００個、１～１５０個、１～１００個、又は１～５０個であることができ、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～５個、最も好ましくは１～２個である。本発明に用いることのできる変異ペプチドの改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１又は数個（好ましくは、１、２、３又は４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のポリペプチドは、配列番号１又は１３のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。そして、前記ポリペプチドは、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチドである。すなわち、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示さないポリペプチドは、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のポリペプチドに含まれない。本明細書において、「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、アミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、例えば１～３３０個、１～３００個、１～２５０個、１～２００個、１～１５０個、１～１００個、又は１～５０個であることができ、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～５個、最も好ましくは１～２個である。本発明に用いることのできる変異ペプチドの改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１又は数個（好ましくは、１、２、３又は４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
（アミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列）
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１３のアミノ酸配列に対してアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。そして、前記ポリペプチドは、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチドである。すなわち、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示さないポリペプチドは、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のポリペプチドに含まれない。より好ましくは該同一性が４５％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは５０％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは６０％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは７０％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは８０％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは９０％以上であるアミノ酸配列、最も好ましくは該同一性が９５％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、且つスクアレンからアンブレインを生成する活性を有するポリペプチドからなる変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素である。
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１３のアミノ酸配列に対してアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。そして、前記ポリペプチドは、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチドである。すなわち、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示さないポリペプチドは、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のポリペプチドに含まれない。より好ましくは該同一性が４５％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは５０％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは６０％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは７０％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは８０％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは９０％以上であるアミノ酸配列、最も好ましくは該同一性が９５％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、且つスクアレンからアンブレインを生成する活性を有するポリペプチドからなる変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素である。
前記配列番号１又は１３のアミノ酸配列において「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」又は「同一性が４０％以上であるアミノ酸配列」は、配列番号１又は１３のアミノ酸配列が置換されたものであるが、このアミノ酸配列の置換は、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の機能を維持する保存的置換である。「保存的置換」とは、限定されるものではないが、アミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことでできる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。正電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素におけるＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸をアスパラギン酸以外のアミノ酸へ変異（置換）させるのは、スクアレンを基質としてアンブレイン生成する活性を付与するための、積極的な置換（変異）であるが、前記保存的置換はスクアレンを基質としてアンブレインを生成する活性を維持するための置換であり、当業者であれば容易に実施することのできるものである。
（変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のモチーフ）
図９にバチルス・メガテリウム（配列番号１）、バチルス・サブチリス（配列番号１３）、及びバチルス・リケニフォルミス（配列番号１７）のテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、並びにアリシクロバチルス・アシドカリダリウスのスクアレン－ホペン環化酵素（配列番号１８）のアラインメントを示した。本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素においては、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ（以下、本発明においてモチーフＡということもある）を有する。好ましくは、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側１００アミノ酸残基以上離れた位置にモチーフＡを２個有する。
また、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側１０～５０アミノ酸残基の位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ（以下、本発明においてモチーフＢということもある）を有し、前記ＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）がＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）ＤＷであることが好ましい。
また、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｃ末端側２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ（以下、本発明においてモチーフＣということもある）を有し、前記ＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフがＱＮＸＸＧＧ（Ｗ／Ｆ）であることが好ましい。
また、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｃ末端側５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ（以下、本発明においてモチーフＤということもある）を有し、前記ＱＸＸＸＧＸＷモチーフがＱＸＸ（Ｎ／Ｄ）Ｇ（Ｓ／Ａ）Ｗであることが好ましい。
また、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｃ末端側１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフ（以下、本発明においてモチーフＥということもある）を有し、前記ＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフがＱＸＸ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（Ｓ／Ｇ）（Ｆ／Ｗ）であることがより好ましい。
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素においては、ＤＸＤＤモチーフのほかに上記モチーフＡ～Ｅすべてを有するものである。
また、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素においては、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｃ末端側１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さないものである。
図９にバチルス・メガテリウム（配列番号１）、バチルス・サブチリス（配列番号１３）、及びバチルス・リケニフォルミス（配列番号１７）のテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、並びにアリシクロバチルス・アシドカリダリウスのスクアレン－ホペン環化酵素（配列番号１８）のアラインメントを示した。本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素においては、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ（以下、本発明においてモチーフＡということもある）を有する。好ましくは、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側１００アミノ酸残基以上離れた位置にモチーフＡを２個有する。
また、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側１０～５０アミノ酸残基の位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ（以下、本発明においてモチーフＢということもある）を有し、前記ＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）がＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）ＤＷであることが好ましい。
また、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｃ末端側２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ（以下、本発明においてモチーフＣということもある）を有し、前記ＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフがＱＮＸＸＧＧ（Ｗ／Ｆ）であることが好ましい。
また、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｃ末端側５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ（以下、本発明においてモチーフＤということもある）を有し、前記ＱＸＸＸＧＸＷモチーフがＱＸＸ（Ｎ／Ｄ）Ｇ（Ｓ／Ａ）Ｗであることが好ましい。
また、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｃ末端側１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフ（以下、本発明においてモチーフＥということもある）を有し、前記ＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフがＱＸＸ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（Ｓ／Ｇ）（Ｆ／Ｗ）であることがより好ましい。
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素においては、ＤＸＤＤモチーフのほかに上記モチーフＡ～Ｅすべてを有するものである。
また、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素においては、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｃ末端側１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さないものである。
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、公知の遺伝子組換え技術などを用いて取得することができる。例えば、バチルス・メガテリウムの染色体ＤＮＡを取得し、適当なプライマーを用いて、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を、ＰＣＲなどによって増幅する。得られた遺伝子を、適当なベクターに組み込み、遺伝子配列を決定する。ＤＸＤＤモチーフのうち、Ｎ末端側から第４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸である場合は、それ以外のアミノ酸への変異を導入することによって、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードする遺伝子を取得することができる。その遺伝子を、酵母等の宿主に組み込み、発現させることによって、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を得ることが可能である。
またテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、バチルス・メガテリウムの他に、バチルス属等の細菌に存在することが知られており、バチルス・サブチリス由来酵素（アクセッション番号：ＡＢ６１８２０６），バチルス・リケニフォルミス由来酵素（アクセッション番号：ＡＡＵ４１１３４）等を取得することも可能である。
またテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、バチルス・メガテリウムの他に、バチルス属等の細菌に存在することが知られており、バチルス・サブチリス由来酵素（アクセッション番号：ＡＢ６１８２０６），バチルス・リケニフォルミス由来酵素（アクセッション番号：ＡＡＵ４１１３４）等を取得することも可能である。
また、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードする遺伝子は、公知の合成遺伝子の合成方法、例えば、Ｋｈｏｒａｎａらの方法（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，１９６８）、Ｎａｒａｎｇらの方法（Ｓｃａｒｐｕｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８２）、又はＲｏｓｓｉらの方法（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２）によって合成することも可能である。そして、合成された遺伝子を発現させることにより、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を得ることができる。
［２］ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドである限りにおいて、特に限定されるものではない。すなわち、ＤＸＤＤモチーフのうち、Ｎ末端側から第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異（置換）されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
具体的には、本発明のポリヌクレオチドとして、例えばＤＸＤＤモチーフの、Ｎ末端側から第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がシステインに変異（置換）されたポリペプチドをコードする配列番号２、又は配列番号１４で表される塩基配列からなる配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
更には、配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、スクアレンからアンブレインを生成する活性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、それを導入する微生物又は宿主細胞に合わせて、最適なコドンの塩基配列に変更することが好ましい。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドである限りにおいて、特に限定されるものではない。すなわち、ＤＸＤＤモチーフのうち、Ｎ末端側から第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異（置換）されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
具体的には、本発明のポリヌクレオチドとして、例えばＤＸＤＤモチーフの、Ｎ末端側から第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がシステインに変異（置換）されたポリペプチドをコードする配列番号２、又は配列番号１４で表される塩基配列からなる配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
更には、配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、スクアレンからアンブレインを生成する活性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、それを導入する微生物又は宿主細胞に合わせて、最適なコドンの塩基配列に変更することが好ましい。
［３］微生物
本発明の微生物は、本発明のポリヌクレオチドを有する微生物である。すなわち、本発明のポリヌクレオチドを細胞内に含む限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属菌、放線菌、パン酵母、麹菌、又はアカパンカビを挙げることができる。
本発明の微生物は、本発明のポリヌクレオチドを有する微生物である。すなわち、本発明のポリヌクレオチドを細胞内に含む限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属菌、放線菌、パン酵母、麹菌、又はアカパンカビを挙げることができる。
《ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ》
本発明の微生物は、好ましくはヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（以下、ＨＭＧＲと称することがある）をコードするポリヌクレオチドを更に有する。
ＨＭＧＲはファルネシルピロリン酸の合成経路において、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素である。ファルネシルピロリン酸が２分子結合することにより、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の基質であるスクアレンが生成される。ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの活性を向上させることによって、微生物におけるスクアレンの生成を促進し、微生物を用いたアンブレインの製造を増加させることができる。
本発明の微生物は、好ましくはヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（以下、ＨＭＧＲと称することがある）をコードするポリヌクレオチドを更に有する。
ＨＭＧＲはファルネシルピロリン酸の合成経路において、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素である。ファルネシルピロリン酸が２分子結合することにより、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の基質であるスクアレンが生成される。ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの活性を向上させることによって、微生物におけるスクアレンの生成を促進し、微生物を用いたアンブレインの製造を増加させることができる。
前記ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼのポリペプチドは、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ活性を有する限りにおいて、特に限定されるものではないが、好ましくは（１）配列番号３で表されるアミノ酸配列の５１４番～１０２２番のアミノ酸配列、（２）配列番号３で表されるアミノ酸配列の５１４番～１０２２番からなるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列の５１４番～１０２２番からなるアミノ酸配列との同一性が８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）であるアミノ酸配列或いは（１）配列番号３で表されるアミノ酸配列、（２）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
前記のアミノ酸配列からなるヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼは、優れたレダクターゼ活性を示す。従って、配列番号３で表されるアミノ酸配列の５１４番～１０２２番のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの膜結合領域を除いたアミノ酸配列であり、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの優れた活性を示すものである。配列番号４にヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードする核酸配列（塩基配列）の１つの態様を示す。
前記のアミノ酸配列からなるヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼは、優れたレダクターゼ活性を示す。従って、配列番号３で表されるアミノ酸配列の５１４番～１０２２番のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの膜結合領域を除いたアミノ酸配列であり、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの優れた活性を示すものである。配列番号４にヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードする核酸配列（塩基配列）の１つの態様を示す。
［４］ベクター
本発明のベクターは、上記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクターである。すなわち、本発明のベクターは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明による前記ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるベクターを挙げることができる。
本発明のベクターは、上記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクターである。すなわち、本発明のベクターは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明による前記ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるベクターを挙げることができる。
発現ベクターとしては、宿主である大腸菌、パン酵母等において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、外来タンパク質の発現効率の高いものが好ましい。前記ポリヌクレオチドを発現させるための発現ベクターは、微生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、前記ＤＮＡ及び転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
より具体的には、発現ベクターとして、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３－２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ－８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＱＥ－３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭＢＰ－５４０７）、ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０８）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴ－３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＵＣ１８〔ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３－２３３７９８号公報）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＣｏｌｄII、ｐＣｏｌｄIII、ｐＣｏｌｄIV、ｐＮＩＤＮＡ、ｐＮＩ－ＨｉｓＤＮＡ（タカラバイオ社製）等を例示することができる。
プロモーターとしては、宿主である大腸菌、パン酵母等の細胞中で発現することができるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌｅｔＩプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。酵素法による生産（スクアレンを基質とした酵素反応による生体外での生合成）で酵素を生産するには、強いプロモーターとして機能し、目的タンパク質の大量生産が可能なプロモーターが好ましく、誘導型プロモーターがより好ましい。誘導型プロモーターとしては、例えば低温で発現誘導されるコールドショック遺伝子cspAのプロモーター、誘導剤であるＩＰＴＧの添加により誘導されるＴ７プロモーター等をあげることができる。また発酵生産（グルコースなどを炭素源とした宿主による生体内での生合成）においては、上記プロモーターの中でも組織を問わず常時目的遺伝子を発現させるプロモーター、すなわち構成的プロモーターであることがより好ましい。構成的プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子（ＡＤＨ１）、翻訳伸長因子ＴＦ－１α遺伝子（ＴＥＦ１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ＴＰＩ１）、トリオースリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤＨ３）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（ＰＹＫ１）のプロモーターが挙げられる。
［５］形質転換体
本発明の形質転換体も、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明による前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含むベクターの形で含有する形質転換体であることもできる。また、本発明によるポリペプチドを発現している形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明によるポリペプチドを発現していない形質転換体であることもできる。本発明の形質転換体は、例えば、本発明による前記ベクターにより、あるいは、本発明による前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
本発明の形質転換体も、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明による前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含むベクターの形で含有する形質転換体であることもできる。また、本発明によるポリペプチドを発現している形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明によるポリペプチドを発現していない形質転換体であることもできる。本発明の形質転換体は、例えば、本発明による前記ベクターにより、あるいは、本発明による前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
宿主細胞は、特に限定されないが、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属菌、放線菌、酵母、麹菌、アカパンカビ等取り扱いが容易な菌株が好ましいが、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞などを用いることも可能である。しかしながら、酵素法による生産（スクアレンを基質とした酵素反応による生体外での生合成）で酵素を生産するには、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属菌、麹菌が好ましく、大腸菌が最も好ましい。また発酵生産（グルコースなどを炭素源とした宿主による生体内での生合成）で最も好ましくは酵母である。最も好ましい酵母株としては、清酒酵母が挙げられる。特に好ましくは、清酒酵母協会７号又は７０１号が挙げられる。協会７０１号酵母は、協会７号から育種された泡なし酵母で高泡を形成しない特長があるが、他の性質は同じである。
発酵生産（グルコースなどを炭素源とした宿主による生体内での生合成）においては、本発明の形質転換体は、好ましくはヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクターを有する。前記ベクターを含むことによって、形質転換体を用いたアンブレインの製造における産生量を増加させることができる。ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼは、前記「微生物」の項に記載のものである。
なお、上記「ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクターを有する」とは、上記「変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター」にヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡが含まれるようにしてもよく、また「変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター」と「ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター」をそれぞれ調製し、形質転換させてもよい。
なお、上記「ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクターを有する」とは、上記「変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター」にヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡが含まれるようにしてもよく、また「変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター」と「ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター」をそれぞれ調製し、形質転換させてもよい。
［６］アンブレインの製造方法
本発明のアンブレインの製造方法は、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をスクアレンに反応させて、アンブレインを得ることを特徴とするものである。
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、酵素発現用ベクターを細菌等に導入することによって得られた形質転換体を培養することにより生成できる。形質転換体の培養に用いられる培地は、通常用いられる培地でよく、宿主の種類に応じて適宜選択される。例えば、大腸菌を培養する場合には、ＬＢ培地等が用いられる。培地には、選択マーカーの種類に応じた抗生物質が添加されていてもよい。
本発明のアンブレインの製造方法は、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をスクアレンに反応させて、アンブレインを得ることを特徴とするものである。
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、酵素発現用ベクターを細菌等に導入することによって得られた形質転換体を培養することにより生成できる。形質転換体の培養に用いられる培地は、通常用いられる培地でよく、宿主の種類に応じて適宜選択される。例えば、大腸菌を培養する場合には、ＬＢ培地等が用いられる。培地には、選択マーカーの種類に応じた抗生物質が添加されていてもよい。
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、前記酵素を発現可能な形質転換体を培養することにより得られた培養液から酵素を抽出し精製したものであってもよい。また、あらかじめ本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のポリペプチドのＮ末側又はＣ末側にトリガーファクター（TF）又はＨｉｓタグなどを融合させた融合タンパク質として発現させ、精製などを容易にしてもよい。また、培養液中の形質転換体から抽出された酵素を含む抽出液をそのまま用いてもよい。形質転換体からの酵素の抽出方法は、公知の方法を適用してよい。酵素の抽出工程は、例えば、形質転換体を抽出溶媒中で破砕し、細胞内容物を形質転換体の破砕片と分離することを含んでよい。得られた細胞内容物には、目的とする変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素が含まれている。
形質転換体の破砕方法としては、形質転換体を破砕して、酵素液を回収可能な公知の方法を適用してよく、例えば、超音波破砕、ガラスビーズ破砕等が挙げられる。破砕の条件は、特に制限はなく、１０℃以下及び１５分間などの、酵素が失活しない条件であればよい。
細胞内容物と微生物体の破砕片との分離方法としては、沈降分離、遠心分離、濾過分離及びこれらの２つ以上の分離方法の組み合わせ等が挙げられる。これらの方法を用いた分離条件は当業者には公知であり、遠心分離の場合には例えば、８，０００×ｇ～１５，０００×ｇ及び１０分間～２０分間である。
細胞内容物と微生物体の破砕片との分離方法としては、沈降分離、遠心分離、濾過分離及びこれらの２つ以上の分離方法の組み合わせ等が挙げられる。これらの方法を用いた分離条件は当業者には公知であり、遠心分離の場合には例えば、８，０００×ｇ～１５，０００×ｇ及び１０分間～２０分間である。
抽出溶媒としては、酵素抽出の溶媒として通常用いられるものでよく、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、リン酸カリウム緩衝液等が挙げられる。抽出溶媒のｐＨは、酵素の安定性の点で、３～１０が好ましく、６～８がより好ましい。
抽出溶媒には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、両性イオン界面活性等が挙げられる。非イオン界面活性剤としては、ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレイン酸エステル（Tween 80）等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ｎ－オクチルβ－Ｄ－グルコシド等のアルキルグルコシド、ショ糖ステアリン酸エステル等のショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリンステアリン酸エステル等のポリグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。両性イオン界面活性剤としては、アルキルベタインであるＮ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ドデシルグリシンベタイン等が挙げられる。これら以外にも、トライトンＸ－１００（Triton X-100）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Brij-58）、ノニルフェノールエトキシレート（Tergitol NP-40）等の当技術分野で一般的に用いられる界面活性剤が利用可能である。
抽出溶媒中の界面活性剤の濃度は、酵素の安定性の観点から、０．００１質量％～１０質量％が好ましく、０．１０質量％～３．０質量％がより好ましく、０．１０質量％～１．０質量％が更に好ましい。
抽出溶媒中の界面活性剤の濃度は、酵素の安定性の観点から、０．００１質量％～１０質量％が好ましく、０．１０質量％～３．０質量％がより好ましく、０．１０質量％～１．０質量％が更に好ましい。
抽出溶媒には、酵素活性の観点から、ジチオスレイトール、β－メルカプトエタノール等の還元剤が含まれていることが好ましい。還元剤としては、ジチオスレイトールが好ましい。抽出溶媒中のジチオスレイトールの濃度は、０．１ｍＭ～１Ｍが好ましく、１ｍＭ～１０ｍＭがより好ましい。抽出溶媒中にジチオスレイトールが存在することによって、酵素におけるジスルフィド結合等の構造が保持されやすくなり、酵素活性がより上昇する傾向がある。
抽出溶媒には、酵素活性の観点から、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤が含まれていることが好ましい。抽出溶媒中のＥＤＴＡの濃度は、０．０１ｍＭ～１Ｍが好ましく、０．１ｍＭ～１０ｍＭがより好ましい。抽出溶媒中にＥＤＴＡが存在することによって、酵素活性を低下させ得る金属イオンがキレートされるため、酵素活性がより上昇する傾向がある。
抽出溶媒には、上記の成分以外に、酵素抽出溶媒に添加可能な公知の成分が含まれていてよい。
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素とスクアレンとの反応の条件は、酵素反応が進行可能な条件であれば特に制限はない。例えば、反応温度及び反応時間は、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の活性等に基づいて適宜選択することができる。反応温度及び反応時間は、反応効率の観点から、例えば４℃～１００℃及び１時間～３０日であり、３０℃～６０℃及び１６時間～２０日が好ましい。ｐＨ条件は、反応効率の観点から、例えば３～１０であり、６～８が好ましい。
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素とスクアレンとの反応の条件は、酵素反応が進行可能な条件であれば特に制限はない。例えば、反応温度及び反応時間は、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の活性等に基づいて適宜選択することができる。反応温度及び反応時間は、反応効率の観点から、例えば４℃～１００℃及び１時間～３０日であり、３０℃～６０℃及び１６時間～２０日が好ましい。ｐＨ条件は、反応効率の観点から、例えば３～１０であり、６～８が好ましい。
反応溶媒は、酵素反応を阻害しないものであれば特に制限はなく、通常用いられる緩衝液等を用いることができる。また、例えば、酵素の抽出工程で使用する抽出溶媒と同一のものを用いることができる。また、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を含む抽出液（例えば、無細胞抽出液）を酵素液としてそのまま反応に用いてもよい。
アンブレイン生成反応における変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素と、その基質であるスクアレンとの濃度比は、反応効率の観点から、酵素に対する基質のモル濃度比（基質／酵素）として、１～１００００が好ましく、１０～５０００がより好ましく、１００～３０００がより好ましく、１０００～２０００が更に好ましい。
酵素反応に用いるスクアレンの濃度は、反応効率の観点から、反応溶媒の全質量に対して０．０００００１質量％～１０質量％が好ましく、０．００００１質量％～１質量％がより好ましい。
酵素反応に用いるスクアレンの濃度は、反応効率の観点から、反応溶媒の全質量に対して０．０００００１質量％～１０質量％が好ましく、０．００００１質量％～１質量％がより好ましい。
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素とスクアレンとが反応する反応工程は、複数回繰り返してもよい。これにより、アンブレインの収率を高めることができる。反応工程を複数回繰り返す場合には、基質となるスクアレンを反応系に再投入する工程、公知の方法により酵素を失活させた後、反応液中の反応生成物を回収及び精製する工程等を含むものであってもよい。スクアレンの再投入を行う場合には、反応液中の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の濃度、反応液中に残存する基質量等によって、投入する時期、投入量を適宜設定することができる。
本発明のアンブレインの製造方法の別の実施態様においては、本発明の微生物又は形質転換体を培養することを特徴とする。
前記微生物又は発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって、アンブレインを製造することができる。例えば、酵母について記載すると、酵母は通常用いられるＹＰＤ培地などで培養すればよい。相同組換えにより遺伝子導入された酵母、又は発現ベクターを有する酵母を前培養し、更にＹＰＤ培地などに植菌し、そして２４～２４０時間、好ましくは７２～１２０時間程度培養する。培地中に分泌されたアンブレインは、そのまま、又は公知の方法により精製して用いることができる。精製方法としては、具体的には、溶媒抽出、再結晶、蒸留、カラムクロマトグラフィー、及びＨＰＬＣ等が挙げられる。
前記微生物又は発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって、アンブレインを製造することができる。例えば、酵母について記載すると、酵母は通常用いられるＹＰＤ培地などで培養すればよい。相同組換えにより遺伝子導入された酵母、又は発現ベクターを有する酵母を前培養し、更にＹＰＤ培地などに植菌し、そして２４～２４０時間、好ましくは７２～１２０時間程度培養する。培地中に分泌されたアンブレインは、そのまま、又は公知の方法により精製して用いることができる。精製方法としては、具体的には、溶媒抽出、再結晶、蒸留、カラムクロマトグラフィー、及びＨＰＬＣ等が挙げられる。
《作用》
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素が、前記単環性経路において、スクアレンを単環性の３－デオキシアキレオールＡに変換できるメカニズム、及び前記２環性経路において、８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンをアンブレインに変換できるメカニズムは詳細に解析されたわけではないが、以下のように推定される。しかしながら、本発明は以下の推定によって限定されるものではない。 本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、前記のとおり、ＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ（モチーフＡ）、ＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ（モチーフＢ）、ＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ（モチーフＣ）、ＱＸＸＸＧＸＷモチーフ（モチーフＤ）、及びＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフ（モチーフＥ）を有している。本発明の変異型ＴＣにおいては、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸（好ましくは、システイン又はグリシン）に置換された変異型ＤＸＤＤモチーフが、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素に広く存在する前記モチーフＡ～Ｅと何らかの相互作用により酵素活性が安定的に発揮される可能性がある。
一方で、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素においては、スクアレン－ホペン環化酵素が有しているＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さない。スクアレン－ホペン環化酵素は、前記モチーフＡ～Ｅを有しているが、変異型ＤＸＤＤモチーフに変換しても、本発明の効果は得られないため、スクアレン－ホペン環化酵素が有しているＱＸＸＸＧＸＷモチーフは、本発明で得られる酵素活性を抑制的に働いている可能性がある。
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素が、前記単環性経路において、スクアレンを単環性の３－デオキシアキレオールＡに変換できるメカニズム、及び前記２環性経路において、８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンをアンブレインに変換できるメカニズムは詳細に解析されたわけではないが、以下のように推定される。しかしながら、本発明は以下の推定によって限定されるものではない。 本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、前記のとおり、ＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ（モチーフＡ）、ＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ（モチーフＢ）、ＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ（モチーフＣ）、ＱＸＸＸＧＸＷモチーフ（モチーフＤ）、及びＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフ（モチーフＥ）を有している。本発明の変異型ＴＣにおいては、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸（好ましくは、システイン又はグリシン）に置換された変異型ＤＸＤＤモチーフが、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素に広く存在する前記モチーフＡ～Ｅと何らかの相互作用により酵素活性が安定的に発揮される可能性がある。
一方で、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素においては、スクアレン－ホペン環化酵素が有しているＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さない。スクアレン－ホペン環化酵素は、前記モチーフＡ～Ｅを有しているが、変異型ＤＸＤＤモチーフに変換しても、本発明の効果は得られないため、スクアレン－ホペン環化酵素が有しているＱＸＸＸＧＸＷモチーフは、本発明で得られる酵素活性を抑制的に働いている可能性がある。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１》
本実施例では、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のクローニング及び発現ベクター構築を行った。
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子をpCold-TFベクター（NdeI-XhoI部位）へ導入した。
バチルス・メガテリウム染色体ＤＮＡを鋳型として用いて、ＰＣＲにより野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドを取得した。前記ポリヌクレオチドをpCold-TFベクターのNdeI-XhoI部位に挿入した。得られたベクターを鋳型として用いて、３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換されるように、クイックチェンジ法により部位特異的変異を導入し、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターを得た。
続いて、得られた変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体を作製した。
本実施例では、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のクローニング及び発現ベクター構築を行った。
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子をpCold-TFベクター（NdeI-XhoI部位）へ導入した。
バチルス・メガテリウム染色体ＤＮＡを鋳型として用いて、ＰＣＲにより野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドを取得した。前記ポリヌクレオチドをpCold-TFベクターのNdeI-XhoI部位に挿入した。得られたベクターを鋳型として用いて、３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換されるように、クイックチェンジ法により部位特異的変異を導入し、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターを得た。
続いて、得られた変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体を作製した。
《実施例２》
本実施例では、スクアレン、３－デオキシアキレオールＡ、又は８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンを基質として、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の酵素活性を検討した。
本実施例では、スクアレン、３－デオキシアキレオールＡ、又は８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンを基質として、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の酵素活性を検討した。
実施例１で作製した形質転換体をアンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）含有ＬＢ培地（１Ｌ）に植菌し、３７℃で３時間振とう培養した。培養後、０．１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、１５℃で２４時間振とうを行い、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の発現を誘導した。
その後、遠心（６，０００×ｇ、１０分間）によって集菌した菌体を、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、３０ｍＬの緩衝液Ａ［５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｖ／ｖ％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２．５ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＥＤＴＡを含有。］で懸濁し、ＵＰ２００５ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germany）を用いて超音波破砕（４℃、２０分間）した。破砕処理後の試料を遠心（１２，３００×ｇ、２０分間）し、遠心後に得られた上清を無細胞抽出液Ａとした。
スクアレン（２５０μｇ）をＴｒｉｔｏｎＸ－１００（５ｍｇ）に混合して可溶化した後に緩衝液Ａ（１ｍＬ）に添加してスクアレン液を調製した。このスクアレン液の全量を無細胞抽出液Ａ（４ｍＬ）に加えて反応液とし、３０℃で６４時間インキュベートした。反応液において、スクアレン（基質）と変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（酵素）とのモル比（基質／酵素）は、約２００であった。
インキュベート後に、メタノール（６ｍＬ）を反応液へ添加し、酵素反応を停止させた。その後、反応液へｎ－ヘキサン（５ｍＬ）を添加して、反応生成物の抽出を３回行った。
得られた抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１００：２０、容量比）に供し、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１００：２０画分を得た。得られた画分を濃縮し、GC/MSでの解析結果を図３に示す。
（ただし、「ＢｍｅＴＣ Ｄ３７３Ｃ」はバチルス・メガテリウム由来のテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の３７３位のアミノ酸をアスパラギン酸（Ｄ）からシステイン（Ｃ）へ変異させたものであることを示す。また、「ＳＱ」は「スクアレン」を示し、「単環」「単環性プロダクト」は「３－デオキシアキレオールＡ」を示し、「２環」「２環性プロダクト」は「８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン」を示す。以下同じ。）
（ただし、「ＢｍｅＴＣ Ｄ３７３Ｃ」はバチルス・メガテリウム由来のテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の３７３位のアミノ酸をアスパラギン酸（Ｄ）からシステイン（Ｃ）へ変異させたものであることを示す。また、「ＳＱ」は「スクアレン」を示し、「単環」「単環性プロダクト」は「３－デオキシアキレオールＡ」を示し、「２環」「２環性プロダクト」は「８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン」を示す。以下同じ。）
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素とスクアレンとを反応させることによって、アンブレインが得られた。また、３－デオキシアキレオールＡ及び８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンも産生されていた。従って、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素によって、図２に記載の（ａ）及び（ｂ）の単環性経路、並びに（ｃ）及び（ｄ）の２環性経路によってアンブレインが生成されていると考えられる。また、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素と３－デオキシアキレオールＡとを反応させることによって、アンブレインが得られ、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素と８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンとを反応させることによっても、アンブレインが得られた。これらの結果は、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素により、前記単環性経路、及び２環性経路によってアンブレインが生成されていることを支持している。
《実施例３》
３０℃で６４時間インキュベートする代わりとして３０℃で５日間インキュベートしたことを除いては、実施例２の操作を繰り返して、アンブレインを製造した。
図４は、５日後、１０日後、及び１５日後のスクアレン、アンブレイン、３－デオキシアキレオールＡ、及び８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンの生成物量を示す。経時的に、スクアレンが、３－デオキシアキレオールＡ、及び８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンに変換され、更にそれらがアンブレインに変換されていると考えられる。図５に示すように、酵素反応５日後には、スクアレンに対するアンブレインの生成率は８％であった。酵素反応１０日後には、スクアレンに対するアンブレインの生成率は２０％まで増加した。酵素反応１５日後には、スクアレンに対するアンブレインの生成率はさらに５０％まで増加した。
３０℃で６４時間インキュベートする代わりとして３０℃で５日間インキュベートしたことを除いては、実施例２の操作を繰り返して、アンブレインを製造した。
図４は、５日後、１０日後、及び１５日後のスクアレン、アンブレイン、３－デオキシアキレオールＡ、及び８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンの生成物量を示す。経時的に、スクアレンが、３－デオキシアキレオールＡ、及び８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンに変換され、更にそれらがアンブレインに変換されていると考えられる。図５に示すように、酵素反応５日後には、スクアレンに対するアンブレインの生成率は８％であった。酵素反応１０日後には、スクアレンに対するアンブレインの生成率は２０％まで増加した。酵素反応１５日後には、スクアレンに対するアンブレインの生成率はさらに５０％まで増加した。
本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素によれば、変異型スクアレン－ホペン環化酵素を併用しなくとも、スクアレンを基質としてアンブレインを１ステップで合成することができる。
《比較例１》
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子に代えて、変異を有さないテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を使用すること以外、実施例１～実施例３と同様の操作を行い、変異を有さないテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素であってもスクアレンからアンブレインを生成できるのか検討した。
その結果、図６に示すように、アンブレインを生成できるのはテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素と３－デオキシアキレオールＡを反応させた時のみであり、スクアレンを基質としてアンブレインを合成することはできなかった。
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子に代えて、変異を有さないテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を使用すること以外、実施例１～実施例３と同様の操作を行い、変異を有さないテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素であってもスクアレンからアンブレインを生成できるのか検討した。
その結果、図６に示すように、アンブレインを生成できるのはテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素と３－デオキシアキレオールＡを反応させた時のみであり、スクアレンを基質としてアンブレインを合成することはできなかった。
《実施例４》
本実施例では、酵母にＨＭＧＲ及び変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を発現させる形質転換体を得るために、ＨＭＧＲ遺伝子および変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子のクローニングを行った。
酵母（Saccharomycopsis fibuligera）を、ＭＬ－２３６Ｂを含む培地を用いて培養して得られた、ＭＬ－２３６Ｂ耐性株からＨＭＧＲ遺伝子を取得した（配列番号４、以下、該ＭＬ－２３６Ｂ耐性株から得られたＨＭＧＲ遺伝子を「ＡＤＫ４６５３」又は「ＡＤＫ４６５３遺伝子」と呼ぶこともある）。
本実施例では、酵母にＨＭＧＲ及び変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を発現させる形質転換体を得るために、ＨＭＧＲ遺伝子および変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子のクローニングを行った。
酵母（Saccharomycopsis fibuligera）を、ＭＬ－２３６Ｂを含む培地を用いて培養して得られた、ＭＬ－２３６Ｂ耐性株からＨＭＧＲ遺伝子を取得した（配列番号４、以下、該ＭＬ－２３６Ｂ耐性株から得られたＨＭＧＲ遺伝子を「ＡＤＫ４６５３」又は「ＡＤＫ４６５３遺伝子」と呼ぶこともある）。
（１）変異型ＨＭＧＲ（ｔＨＭＧＲ）遺伝子（短縮型）のクローニング及び発現ベクターの構築
ＭＬ－２３６Ｂ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５及び６に示したプライマーを用いてＰＣＲ法により変異型ＨＭＧＲ遺伝子（短縮型、配列番号４の１５４０～３０６６番の塩基配列）を増幅した。
ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動による確認後に、発現用ベクターｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ社）に挿入し、ＭＬ－２３６Ｂ耐性株の短縮型ＨＭＧＲ（以下、「ＡＤＫ４６５３＿ｔＨＭＧＲ」ということもある）の発現ベクターを取得した。
ＭＬ－２３６Ｂ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５及び６に示したプライマーを用いてＰＣＲ法により変異型ＨＭＧＲ遺伝子（短縮型、配列番号４の１５４０～３０６６番の塩基配列）を増幅した。
ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動による確認後に、発現用ベクターｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ社）に挿入し、ＭＬ－２３６Ｂ耐性株の短縮型ＨＭＧＲ（以下、「ＡＤＫ４６５３＿ｔＨＭＧＲ」ということもある）の発現ベクターを取得した。
（２）変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子のクローニング
野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子は、当該酵素のアミノ酸配列をもとに、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）にコドンを最適化して合成した。合成した遺伝子は、ベクターｐＵＣＦ（ファスマック社）のクローニングサイト（制限酵素ＥｃｏＲＶサイト）に挿入した。次に、野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子に対しアミノ酸置換変異を導入した。具体的には、野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の第３７３位のアミノ酸をアスパラギン酸からシステインに置換した変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を取得した。
変異を導入したベクターの調製は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を使用し、配列番号７及び８に示した変異導入用プライマーを用いて、取扱説明書に従って行った。
野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子は、当該酵素のアミノ酸配列をもとに、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）にコドンを最適化して合成した。合成した遺伝子は、ベクターｐＵＣＦ（ファスマック社）のクローニングサイト（制限酵素ＥｃｏＲＶサイト）に挿入した。次に、野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子に対しアミノ酸置換変異を導入した。具体的には、野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の第３７３位のアミノ酸をアスパラギン酸からシステインに置換した変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を取得した。
変異を導入したベクターの調製は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を使用し、配列番号７及び８に示した変異導入用プライマーを用いて、取扱説明書に従って行った。
（３）発現ベクターの構築
発現ベクターの構築には、実施例４（１）で短縮型ＨＭＧＲ（ｔＨＭＧＲ）遺伝子をクローニングしたタンパク質発現用のシャトルベクター（ｐＡＵＲ１２３、タカラバイオ社）を使用した。
先ず出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネターから構成される発現カセットを上記ベクターｐＡＵＲ１２３の塩基配列６９８２位および１位の間に挿入した。次に本ベクターを鋳型として、ＰＣＲ法により配列番号９及び１０に示したプライマーを用いて変異型ＨＭＧＲ（ｔＨＭＧＲ）遺伝子を含む発現ベクター断片を調製した。
発現ベクターの構築には、実施例４（１）で短縮型ＨＭＧＲ（ｔＨＭＧＲ）遺伝子をクローニングしたタンパク質発現用のシャトルベクター（ｐＡＵＲ１２３、タカラバイオ社）を使用した。
先ず出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネターから構成される発現カセットを上記ベクターｐＡＵＲ１２３の塩基配列６９８２位および１位の間に挿入した。次に本ベクターを鋳型として、ＰＣＲ法により配列番号９及び１０に示したプライマーを用いて変異型ＨＭＧＲ（ｔＨＭＧＲ）遺伝子を含む発現ベクター断片を調製した。
また実施例４（２）で取得したベクターを鋳型として、同様にして配列番号１１及び１２に示したプライマーを用いて変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子断片を調製した。
ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動による増幅確認の後に、制限酵素（ＤＰＮＩ）処理を行い、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐカラム（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社）を使用して精製を行った。目的遺伝子の実施例４（３）で作成したベクターへのクローニングは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用し、ユーザーマニュアルに従って反応を行った。反応液は、そのまま大腸菌コンピテントセル（ＨＳＴ０８、タカラバイオ社）による形質転換に使用した。陽性クローンは、コロニーＰＣＲにより目的遺伝子が導入されていることを確認し、発現ベクターを取得した。
《実施例５》
本実施例では、実施例４（３）で得られたベクターを用いて、酵母の形質転換体を取得した。その形質転換体を用いて、スクアレン、アンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）又は二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）の生産を確認した。
本実施例では、実施例４（３）で得られたベクターを用いて、酵母の形質転換体を取得した。その形質転換体を用いて、スクアレン、アンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）又は二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）の生産を確認した。
（１）酵母の形質転換
実施例４（３）で得られた発現ベクターを用いて清酒酵母（Saccharomyces cerevisiae 協会７０１号）を形質転換した。ベクターは、あらかじめ制限酵素（ＥｃｏＯ６５Ｉ（BstEII、BstPＩ）、タカラバイオ社）により耐性マーカー遺伝子内の一箇所で切断し、直鎖状にして使用することで相同組換えによる遺伝子導入を行った。酵母の形質転換は、Ｆｒｏｚｅｎ－ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ II（ＺＹＭＯ ＲＥＳＡＲＣＨ社）を使用し、定法である酢酸リチウム法に準じた方法で行った。得られたクローンは、コロニーＰＣＲにより目的遺伝子が導入されていることを確認した。
実施例４（３）で得られた発現ベクターを用いて清酒酵母（Saccharomyces cerevisiae 協会７０１号）を形質転換した。ベクターは、あらかじめ制限酵素（ＥｃｏＯ６５Ｉ（BstEII、BstPＩ）、タカラバイオ社）により耐性マーカー遺伝子内の一箇所で切断し、直鎖状にして使用することで相同組換えによる遺伝子導入を行った。酵母の形質転換は、Ｆｒｏｚｅｎ－ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ II（ＺＹＭＯ ＲＥＳＡＲＣＨ社）を使用し、定法である酢酸リチウム法に準じた方法で行った。得られたクローンは、コロニーＰＣＲにより目的遺伝子が導入されていることを確認した。
（２）酵母形質転換体によるスクアレン、アンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）又は二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）の生産
（酵母形質転換体の培養）
短縮型ＡＤＫ４６５３遺伝子はアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子プロモーター（ＡＤＨ１）により、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子はホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター（ＰＧＫ１）により共に構成的に発現させた。清酒酵母が本来有しているＨＭＧＲ遺伝子に加え、形質転換により導入されたＡＤＫ４６５３遺伝子の過剰発現によりメバロン酸経路が増強されることを、当該経路の代謝産物であるスクアレンを測定することで確認した。また清酒酵母が本来は生産しないアンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）又は二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）の生産の有無を確認した。
培養は、容量５００ｍＬのバッフル付き三角フラスコを使用し、ＹＰＤ培地５０ｍＬ（グルコース濃度５％）にＹＰＤ培地で２４時間前培養した培養液を０．５ｍＬ接種し、２８℃、２５０ｒｐｍで旋回攪拌しながら培養した。５日後にサンプルを採取し、菌体中に蓄積されたスクアレン、アンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）又は二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）の分析を行った。
（酵母形質転換体の培養）
短縮型ＡＤＫ４６５３遺伝子はアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子プロモーター（ＡＤＨ１）により、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子はホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター（ＰＧＫ１）により共に構成的に発現させた。清酒酵母が本来有しているＨＭＧＲ遺伝子に加え、形質転換により導入されたＡＤＫ４６５３遺伝子の過剰発現によりメバロン酸経路が増強されることを、当該経路の代謝産物であるスクアレンを測定することで確認した。また清酒酵母が本来は生産しないアンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）又は二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）の生産の有無を確認した。
培養は、容量５００ｍＬのバッフル付き三角フラスコを使用し、ＹＰＤ培地５０ｍＬ（グルコース濃度５％）にＹＰＤ培地で２４時間前培養した培養液を０．５ｍＬ接種し、２８℃、２５０ｒｐｍで旋回攪拌しながら培養した。５日後にサンプルを採取し、菌体中に蓄積されたスクアレン、アンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）又は二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）の分析を行った。
《比較例２》
本比較例では、短縮型ＡＤＫ４６５３遺伝子および野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子のクローニングを行った。テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子は、変異を導入前の野生型遺伝子を用いて、実施例４（３）と同様の方法でベクターを構築した。
本比較例では、短縮型ＡＤＫ４６５３遺伝子および野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子のクローニングを行った。テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子は、変異を導入前の野生型遺伝子を用いて、実施例４（３）と同様の方法でベクターを構築した。
《比較例３》
本比較例では、比較例２で得られたベクターを用いて、酵母の形質転換体を取得した。その形質転換体を用いて、スクアレン、アンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）又は二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）の生産を確認した。（１）酵母の形質転換及び（２）酵母形質転換体によるスクアレン、アンブレイン、単環性化合物又は二環性化合物の生産については、実施例５と同様の方法で行った。
本比較例では、比較例２で得られたベクターを用いて、酵母の形質転換体を取得した。その形質転換体を用いて、スクアレン、アンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）又は二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）の生産を確認した。（１）酵母の形質転換及び（２）酵母形質転換体によるスクアレン、アンブレイン、単環性化合物又は二環性化合物の生産については、実施例５と同様の方法で行った。
（生産物の分析）
前記実施例５及び比較例３で得られた菌体を破砕後にヘキサン抽出して試料を調製した。培養液３ｍＬを遠心して上清を除いた後、菌体にジルコニアビーズ（ＹＴＺボール、φ０．５ｍｍ、ニッカトー社）を１．５ｍＬ容量添加し、ビーズクラッシャー（タイテック社、ｕＴ－１２）による粉砕（３２００ｒｐｍ／ｍｉｎ）を１分間５回繰り返した。破砕液にヘキサン１．５ｍＬを加え、上記ビーズクラッシャーにより１分間の攪拌（１８００ｒｐｍ／ｍｉｎ）を３回繰り返しながら抽出し、遠心分離（１６０００ｒｐｍ／ｍｉｎ）後に、有機層を回収した。抽出物を窒素ガス気流下で乾固し、４００ｕＬのヘキサンに再溶解しＧＣ分析に供した。ＧＣ分析は、ガスクロマトグラフＧＣ－２０１４（島津製作所社）により、ＨＰ５キャピラリーカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５ｕｍ、アジレント・テクノロジー社）、検出器はＦＩＤを使用した。分析条件は、ＳＰＬ温度３００℃、ＦＩＤ温度３２０℃、スプリット比３０．０、全流量２５．０ｍＬ／ｍｉｎ、線速度１９．３ｃｍ／ｓｅｃ、カラム温度２２０－３００℃（昇温速度１℃／ｍｉｎ）、３００℃１０ｍｉｎ保持に設定した。
前記実施例５及び比較例３で得られた菌体を破砕後にヘキサン抽出して試料を調製した。培養液３ｍＬを遠心して上清を除いた後、菌体にジルコニアビーズ（ＹＴＺボール、φ０．５ｍｍ、ニッカトー社）を１．５ｍＬ容量添加し、ビーズクラッシャー（タイテック社、ｕＴ－１２）による粉砕（３２００ｒｐｍ／ｍｉｎ）を１分間５回繰り返した。破砕液にヘキサン１．５ｍＬを加え、上記ビーズクラッシャーにより１分間の攪拌（１８００ｒｐｍ／ｍｉｎ）を３回繰り返しながら抽出し、遠心分離（１６０００ｒｐｍ／ｍｉｎ）後に、有機層を回収した。抽出物を窒素ガス気流下で乾固し、４００ｕＬのヘキサンに再溶解しＧＣ分析に供した。ＧＣ分析は、ガスクロマトグラフＧＣ－２０１４（島津製作所社）により、ＨＰ５キャピラリーカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５ｕｍ、アジレント・テクノロジー社）、検出器はＦＩＤを使用した。分析条件は、ＳＰＬ温度３００℃、ＦＩＤ温度３２０℃、スプリット比３０．０、全流量２５．０ｍＬ／ｍｉｎ、線速度１９．３ｃｍ／ｓｅｃ、カラム温度２２０－３００℃（昇温速度１℃／ｍｉｎ）、３００℃１０ｍｉｎ保持に設定した。
ガスクロマトグラフによる分析結果を図７に示した。実施例４及び５の変異型ＨＭＧＲ遺伝子および変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を同時に発現させた宿主から、スクアレン、アンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）および二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）を検出した（図７）。
変異型ＨＭＧＲ遺伝子（短縮型）を発現させた清酒酵母のスクアレンの生産量は、顕著な増加を示しており、代謝の律速段階として、本来厳密に制御されているメバロン酸経路の増強効果が確認できた。また変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子の同時発現により、本来清酒酵母が生産しないアンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）又は二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）が生産されることが確認できた。つまり、変異型ＨＭＧＲ遺伝子および変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を同時に発現させた宿主を分子育種することにより、酵母でのアンブレインの生産が可能になることを示している。
一方、比較例２及び３の変異型ＨＭＧＲ遺伝子および野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を同時に発現させた宿主では、スクアレンおよび二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）を検出した。変異型ＨＭＧＲ遺伝子（短縮型）を発現させた清酒酵母のスクアレンの生産量は、顕著な増加を示しておりメバロン酸経路の増強効果が確認できた。また野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子の同時発現により、本来清酒酵母が生産しない二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）が生産されることが確認できたが、アンブレイン、又は単環性化合物（3-deoxyachilleol A）は検出されず、生産されていないことを確認した。つまり野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を発現しても、酵母ではアンブレインは生産されないことを示している。
またメバロン酸経路の酵素の１つであるＨＭＧＲ（ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ）として、特定のアミノ酸配列を有する変異型ＨＭＧＲ遺伝子（短縮型）を酵母で発現させることによって、メバロン酸経路の下流の化合物、特にはスクアレンの生産量が飛躍的に増加することが知られている。よって変異型ＨＭＧＲ遺伝子（短縮型）および野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子の同時発現することにより、酵母でのアンブレインの生産が可能になる。
変異型ＨＭＧＲ遺伝子（短縮型）を発現させた清酒酵母のスクアレンの生産量は、顕著な増加を示しており、代謝の律速段階として、本来厳密に制御されているメバロン酸経路の増強効果が確認できた。また変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子の同時発現により、本来清酒酵母が生産しないアンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）又は二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）が生産されることが確認できた。つまり、変異型ＨＭＧＲ遺伝子および変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を同時に発現させた宿主を分子育種することにより、酵母でのアンブレインの生産が可能になることを示している。
一方、比較例２及び３の変異型ＨＭＧＲ遺伝子および野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を同時に発現させた宿主では、スクアレンおよび二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）を検出した。変異型ＨＭＧＲ遺伝子（短縮型）を発現させた清酒酵母のスクアレンの生産量は、顕著な増加を示しておりメバロン酸経路の増強効果が確認できた。また野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子の同時発現により、本来清酒酵母が生産しない二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）が生産されることが確認できたが、アンブレイン、又は単環性化合物（3-deoxyachilleol A）は検出されず、生産されていないことを確認した。つまり野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を発現しても、酵母ではアンブレインは生産されないことを示している。
またメバロン酸経路の酵素の１つであるＨＭＧＲ（ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ）として、特定のアミノ酸配列を有する変異型ＨＭＧＲ遺伝子（短縮型）を酵母で発現させることによって、メバロン酸経路の下流の化合物、特にはスクアレンの生産量が飛躍的に増加することが知られている。よって変異型ＨＭＧＲ遺伝子（短縮型）および野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子の同時発現することにより、酵母でのアンブレインの生産が可能になる。
《実施例６》
本実施例では、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）由来の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を作成し、アンブレインを製造した。なお、バチルス・サブチリスと、バチルス・メガテリウムのテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸の同一性は５０％である。
バチルス・サブチリス由来のテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ６１８２０６）をもとに変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を合成した。遺伝子は、ＤＸＤＤモチーフの４番目のアミノ酸であるアスパラギン酸がシステインに置換されるように設計し、大腸菌での発現に最適化して合成し、pCold-TFベクターのNdeI-XhoI部位に挿入した。得られた変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体を作製した。
その後、実施例２と同様に、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を含む無細胞抽出液を得た。
続いて、スクアレン（５０μｇ）をＴｗｅｅｎ－８０（１ｍｇ）に混合して可溶化した後に緩衝液Ｂ［５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ－８０、０．１ｗ／ｖ％のアスコルビン酸ナトリウム、２．５ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＥＤＴＡを含有］（１ｍＬ）に添加してスクアレン液を調製した。このスクアレン液の全量を無細胞抽出液（４ｍＬ）に加えて反応液とし、３０℃で６４時間インキュベートした。反応液において、スクアレン（基質）と変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（酵素）とのモル比（基質／酵素）は、約１０００であった。
インキュベート後に、１５質量％水酸化カリウム含有メタノール（６ｍＬ）を反応液へ添加し、酵素反応を停止させた。その後、反応液へｎ－ヘキサン（５ｍＬ）を添加して、反応生成物の抽出を３回行った。
得られた抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１００：２０、容量比）に供し、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１００：２０画分を得た。得られた画分を濃縮し、ガスクロマトグラフィー質量分析計（GC-MS）による分析を行い、アンブレインが生成していることを確認した。
本実施例では、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）由来の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を作成し、アンブレインを製造した。なお、バチルス・サブチリスと、バチルス・メガテリウムのテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸の同一性は５０％である。
バチルス・サブチリス由来のテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ６１８２０６）をもとに変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を合成した。遺伝子は、ＤＸＤＤモチーフの４番目のアミノ酸であるアスパラギン酸がシステインに置換されるように設計し、大腸菌での発現に最適化して合成し、pCold-TFベクターのNdeI-XhoI部位に挿入した。得られた変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体を作製した。
その後、実施例２と同様に、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を含む無細胞抽出液を得た。
続いて、スクアレン（５０μｇ）をＴｗｅｅｎ－８０（１ｍｇ）に混合して可溶化した後に緩衝液Ｂ［５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ－８０、０．１ｗ／ｖ％のアスコルビン酸ナトリウム、２．５ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＥＤＴＡを含有］（１ｍＬ）に添加してスクアレン液を調製した。このスクアレン液の全量を無細胞抽出液（４ｍＬ）に加えて反応液とし、３０℃で６４時間インキュベートした。反応液において、スクアレン（基質）と変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（酵素）とのモル比（基質／酵素）は、約１０００であった。
インキュベート後に、１５質量％水酸化カリウム含有メタノール（６ｍＬ）を反応液へ添加し、酵素反応を停止させた。その後、反応液へｎ－ヘキサン（５ｍＬ）を添加して、反応生成物の抽出を３回行った。
得られた抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１００：２０、容量比）に供し、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１００：２０画分を得た。得られた画分を濃縮し、ガスクロマトグラフィー質量分析計（GC-MS）による分析を行い、アンブレインが生成していることを確認した。
本発明によれば、アンブレインの生産において、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を用いることにより、スクアレンを基質として用いて１ステップでアンブレインを製造することができる。本発明によって得られる、アンブレインは、例えば医薬品などの生産の原料として用いることができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変法や改良は本発明の範囲に含まれる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変法や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (11)
- ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換している変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素であって、
（ａ）前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、及びＣ末端側に１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフを有し、そしてＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さず、
（ｂ）配列番号１又は１３で表されるアミノ酸配列との同一性が４０％以上であり、そして
（ｃ）スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示す、
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素。 - 前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、又は
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド
である、請求項１に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素。 - 前記配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸、又は前記配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸が、システイン又はグリシンに置換している、請求項１又は２に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項４に記載のポリヌクレオチドを有する微生物。
- ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを更に有する請求項５に記載の微生物。
- 請求項４に記載のポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター。
- 請求項７に記載のベクターを有する形質転換体。
- ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクターを更に有する請求項８に記載の形質転換体。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をスクアレンに反応させて、アンブレインを得ることを特徴とする、アンブレインの製造方法。
- 請求項５又は６に記載の微生物、又は請求項８又は９に記載の形質転換体を培養することを特徴とするアンブレインの製造方法。
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