CN113970598B - 一种联合型代谢标志物及应用和试剂盒与评分方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种评估肝癌手术预后风险的联合型代谢标志物检测试剂盒，及其在肝癌预后风险评估中的应用。本发明通过检测受试者血清样本中苯丙氨酸、半乳糖、异丙基‑β‑硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇等小分子代谢物的相对浓度，基于Cox比例风险回归分析，通过偏回归系数加权求和建立受试者风险评分模型RSOS，反映肝癌患者术后死亡风险，以评分中位数为截点值可显著区分肝癌术后死亡高、低风险群(p<0.05)，低风险评分患者的中位总生存期显著长于高风险评分患者。所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测本发明涉及的几种小分子代谢物，且具有检测成本低，重复性好的特点。本发明可作为辅助手段应用于临床预测肝癌患者手术预后，从而对患者进行风险评估和监测。

Description

一种联合型代谢标志物及应用和试剂盒与评分方法
技术领域
本发明涉及一种新的小分子联合型标志物检测试剂盒，及其在肝癌预后风险评估中的应用。属于分析化学及临床医学领域。
背景技术
肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范围内最常见的原发性恶性肿瘤之一，全球发病率和死亡率分别占总癌症的4.7％和8.2％，在所有癌症种类中排第6位和第4位(参考文献1：Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,et al.Global cancer statistics2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36cancers in185countries[J].CA:A Cancer Journal for Clinicians,2018,68(6):394–424)。中国是世界上肝癌发病率和死亡率较高的国家之一，在中国肝癌致死率仅次于肺癌和胃癌(参考文章2：Chen W Q,Zheng R S,Baade P D,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA:A Cancer Journal for Clinicians,2016,66(2):115-132)。目前在临床上肝切除术依然是早期肝癌患者治疗的金标准，肝动脉栓塞化疗(transarterialchemoembolization,TACE)作为中晚期患者的重要治疗方法，也可有效抑制肿瘤进展从而延长患者生存期，除此之外，肝移植术、立体定向放射治疗、消融术、分子靶向药物治疗等也为肝癌治疗提供了更多选择。由于肝癌早期症状不明显，具有进展迅速、侵袭性强，易早期转移等特点，使得临床上早诊困难，预后效果差，因此有效的评估预后风险对于指导临床决策显得尤为重要。
目前，临床上为评估肝癌预后建立了许多分期系统，包括巴塞罗那临床肝癌(BCLC)分期、美国癌症联合委员会(AJCC)提出的新TMN分期、意大利肝癌计划(CLIP)评分、日本综合分期(JIS)和Child-Pugh等，但对最佳风险分层工具的选择尚无定论。Sirivatanauksorn等人比较了以上分期系统，发现TNM分期和Child-Pugh对肝癌外科切除手术的总生存率有较好的预期能力(参考文献3：Sirivatanauksorn Y,TovikkaiC.Comparison of Staging Systems of Hepatocellular Carcinoma[J].HPB Surgery,2011,2011:1-7)。也有研究报道例如二核苷酸(CpGs)甲基化(参考文献4：Jiang H Y,NingG,Wang Y S,et al.14-CpG-Based Signature Improves the Prognosis Prediction ofHepatocellular Carcinoma Patients[J].BioMed research international,2020,2020:9762067)、自噬相关基因(ATGs)(参考文献5：Mao D L,Zhang Z,Zhao X,et al.Autophagy-related genes prognosis signature as potential predictive markers forimmunotherapy in hepatocellular carcinoma[J].PeerJ.2020；8:e8383)和MicroRNA(miRNA)(参考文献6：Zhang Y,Wei C,Guo C C,et al.Prognostic value of microRNAsin hepatocellular carcinoma:A meta-analysis[J].Oncotarget,2015,8(63):107237-107257)等的表达水平与肝癌的总生存率显著相关，但以上研究主要集中在大分子或某些临床病理特征，预测效果存在一定的局限性，因此肝癌的预后评估工作仍存在严峻的挑战。肝脏是代谢器官，参与糖类、脂类、氨基酸、蛋白质等物质的代谢，有研究表明肝癌的发生发展与其代谢过程密切相关，因此有必要尝试于代谢小分子层面进行肝癌预后风险的评估，以给予患者更精准的个性化治疗和及时有效的风险监测。
近年来，代谢组学被广泛运用于癌症相关研究中，色谱质谱联用技术是代谢组学的主要研究手段，其检测小分子代谢物在疾病诊断相关的应用中已有成功的案例，包括检测甘氨鹅脱氧胆酸用于肝癌诊断和预后评价(参考文献7：Wang B H,Chen D Y,Chen Y,etal.Metabonomic Profiles Discriminate Hepatocellular Carcinoma from LiverCirrhosis by Ultraperformance Liquid Chromatography–Mass Spectrometry[J].Journal of Proteome Research,2012,11(2):1217-1227)，检测甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16:1和苯丙氨酰色氨酸用于肝癌早期诊断(参考文献8：Luo P,Yin P Y,Hua R,et al.A large-scale,multi-center serum metabolitebiomarkers identification study for the early detection of hepatocellularcarcinoma[J].Hepatology,2017,67(2):662-675)等。
本发明采用气相色谱-质谱监测血清样品代谢谱，以术后死亡为状态结局，利用基于网络的变量筛选方法以及Cox比例风险回归分析，得到关键代谢物苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇，通过偏回归系数加权求和建立受试者风险评分模型RSOS，反映肝癌患者术后死亡风险。目前尚无将上述代谢物作为联合型标志物用于评估肝癌预后风险的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血清联合型代谢标志物在制备用于肝癌手术预后风险评估试剂盒中的应用，该血清联合型代谢标志物包括苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇，并提供了检测上述联合型标志物的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
(1)利用气相色谱-质谱联用的代谢组学技术，对接受肝切除术的肝癌患者的术前血清进行了代谢轮廓分析。通过变量筛选，发现并定性十三种代谢物与患者术后生存与否相关(苏糖醇、来苏糖胺、3-羟基丙酸、正癸酸、蔗糖、α-酮戊二酸、苯丙氨酸、N-乙酰基丝氨酸、半乳糖、核糖醇、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷、2-甲基-3-羟基丙酸、丙三醇)。
(2)基于R语言survival包中的coxph函数对上述十三种代谢物进行单因素Cox比例风险回归分析，保留4个p<0.2的代谢物(苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇)。
(3)进一步对苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇进行多变量Cox比例风险回归分析，通过偏回归系数加权求和建立受试者风险评分模型。回归方程如下：
h(t)＝h0(t)×exp(β苯丙氨酸×c苯丙氨酸+β半乳糖×c半乳糖+β异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷×c异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷+β丙三醇×c丙三醇)
其中h0(t)为t时刻时的基线死亡风险率，h(t)为存在因素苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇影响情况下病人t时刻的死亡风险率，β苯丙氨酸、β半乳糖、β异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和β丙三醇分别对应各因素的偏回归系数，分析得系数值为0.285、0.427、-0.603和-0.016。
根据方程中各变量对应的偏回归系数建立死亡风险评分模型如下：
RSOS＝0.285×c苯丙氨酸+0.427×c半乳糖-0.603×c异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷-0.016×c丙三醇，其中RSOS为受试者术后死亡风险评分，c代谢物为各代谢物经内标校正后的相对浓度。
(4)确定试剂盒组成：
a.血清样品前处理试剂包括：
标准化学品：苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇，所述标准品分别用于对应的血清样品代谢物苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇的定性；
含内标化合物的提取液：所述提取液用于预处理来自受试者的血清样品，即含内标化合物缬氨酸-d8、琥珀酸-d4、苯丙氨酸-d5和十三酸的浓度均为4-7ug/mL的甲醇溶液；
衍生化试剂：所述衍生试剂用于预处理提取后的血清冻干样品，包括溶于吡啶的浓度为18-22mg/mL的甲氧胺溶液，用于对含羰基的代谢物进行肟化反应，以防止其开环闭环；以及N-甲基-N(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，用于代谢物的硅烷化衍生，以增加代谢物的挥发性，利于气相色谱-质谱检测；
b.仪器分析条件：
所述的气相色谱条件：DB-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm,AgilentTechnologies,USA)；柱温采用程序升温，70℃保持3min，以5℃/min的速度升至300℃，保持10min。进样口温度300℃，进样体积1μL，分流比1:10。以氦气(99.9995％,China)作为载气，柱内流速为1.19mL/min，保持恒速模式；
所述质谱条件：EI源，70eV，传输线和离子源温度分别是280℃和230℃。采用全扫描模式采集数据(m/z 33-600)或选择离子模式采集数据，扫描速度为0.25s/scan，起始数据采集时间为5.7min，检测电压参考调谐文件的电压值；
(5)计算受试者风险评分的方法如下：
受试者血清样本预处理：使用含内标化合物的提取液沉淀血清样品中的蛋白并提取代谢物，将上清液冷冻干燥后，用溶于吡啶的浓度为18-22mg/mL的甲氧胺溶液和N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺分别对冻干样品进行衍生化反应，取上清液，采用气相色谱-质谱联用仪检测；
根据全扫描模式的数据对代谢物定性，将质谱图与NIST17质谱库里苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇的标准质谱图进行比对，并采用标准品验证。
根据对血清样品全扫描模式采集的数据进行处理，选择代谢物的特征离子，对样本进行选择离子扫描采集数据，灵敏度高，重复性好，可提高数据质量。其中苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇的特征离子分别是m/z 120/192、319、217、205，内标化合物缬氨酸-d8、琥珀酸-d4、苯丙氨酸-d5和十三酸的特征离子分别是m/z 80/152、251、125/197和271；其中异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷采用缬氨酸-d8校正，丙三醇采用琥珀酸-d4校正，苯丙氨酸采用苯丙氨酸-d5校正，半乳糖采用十三酸校正；
对每一个受试者血清样品中所述联合型标志物经标准品定性后的峰面积分别与对应内标化合物的峰面积比较，再乘内标化合物浓度，得到其相对浓度。
将肝癌患者的这四种代谢物的相对浓度代入上述死亡风险评分公式中，以评分中位数0.82作为截点值，可将患者明显区分为高、低风险群，术后死亡风险与风险评分呈正相关。
本发明提供了一种方便快速准确、低成本的预测肝癌预后的试剂盒，对肝癌患者进行预后风险分群和监测。本发明通过检测受试者血清样本中苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇等小分子代谢物的相对浓度，基于Cox比例风险回归分析，通过偏回归系数加权求和建立受试者风险评分模型RSOS，反映肝癌患者术后死亡风险，以评分中位数为截点值可显著区分肝癌术后死亡高、低风险群(p<0.05)，低风险评分患者的中位总生存期显著长于高风险评分患者。可作为辅助手段应用于临床预测肝癌患者手术预后，从而对患者进行风险评估和监测。
本发明优点在于：
1.本发明所涉及的检测试剂盒，对联合型标志物苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇的检测，检测成本低，具有操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性好等优点；
2.本发明所涉及的联合型标志物，能很好的区分不同肝癌预后风险群，可作为辅助手段应用于临床预测肝癌患者术后死亡风险，指导制定个性化治疗方案，实现精准化治疗。
附图说明
图1预测模型评估肝癌患者术后死亡风险的Kaplan-Meier生存曲线图。
图2该试剂盒预测肝癌患者术后1年、2年与5年死亡风险的ROC曲线。
图3该试剂盒预测肝癌患者总生存率的校正曲线。A-C分别为1年、2年与5年的肝癌术后实际总生存率与预测总生存率的校正曲线。
图4该试剂盒辅助临床常用分期系统(TNM分期、BCLC分期)预测肝癌患者术后死亡风险的ROC曲线。A-C分别为1年、2年与5年的临床常用分期系统(TNM分期、BCLC分期)以及结合本试剂盒模型后的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
1.血清样品采集：本研究纳入东方肝胆外科医院78例于2012年6月-2012年7月收治的肝癌患者。以手术时间为起始时间，术后随访5年。受试者的血清样本于术前相同条件下收集，后转入-80℃冰箱中保存备用。所有受试者在样品收集前签署书面同意书。研究协议得到了东方肝胆外科医院伦理委员会的批准，并按照1975年修订的1964版赫尔辛基宣言的指导方针进行。
所有受试者的生存时间信息见表1。
总生存期的定义是指在随访期内，初次手术后直至因任何原因引起死亡的时间。
表1.
Figure BDA0002595955590000061
Figure BDA0002595955590000071
Figure BDA0002595955590000081
2.分析方法
2.1血清样品预处理
样品在4℃条件下解冻，取40μL血清，加入160μL含内标化合物的甲醇提取液(内标化合物缬氨酸-d8、琥珀酸-d4、苯丙氨酸-d5和十三酸的浓度均为5μg/mL)，用涡旋混合仪震荡混匀30s，在低温高速离心机中离心(14000rpm×15min，4℃)，吸取上清液冻干。于冻干样本中，加入50μL溶于吡啶的浓度为20mg/mL的甲氧胺溶液，室温超声1min，再涡旋混合仪震荡混匀30s，放置于37℃下水浴90min。然后加入40μL N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，涡旋混合仪震荡混匀10s，于37℃下水浴60min。低温高速离心机离心(14000rpm×10min，4℃)，取上清液，待GC-MS检测分析。
2.2气相色谱-质谱联用仪分析
色谱条件：DB-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm,Agilent Technologies,USA)；柱温采用程序升温，70℃保持3min，以5℃/min的速度升至300℃，保持10min。进样口温度300℃，进样体积1μL，分流比1:10。以氦气(99.9995％,China)作为载气，柱内流速为1.19mL/min，保持恒速模式。
所述质谱条件：EI源，70eV，传输线和离子源温度分别是280℃和230℃。采用选择离子模式采集数据(联合型标志物苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇的特征离子分别是m/z 120/192、319、217、205，内标化合物缬氨酸-d8、琥珀酸-d4、苯丙氨酸-d5和十三酸的特征离子分别是m/z 80/152、251、125/197和271)，扫描速度为0.25s/scan，起始数据采集时间为5.7min，检测电压参考调谐文件的电压值。
3、血清测试结果及辅助预测分析
提取经标准品验证后的联合型标志物苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇，内标化合物缬氨酸-d8、琥珀酸-d4、苯丙氨酸-d5和十三酸的峰面积，对代谢物的峰面积进行内标校正，再乘对应内标化合物浓度，得到其相对浓度。(其中异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷采用缬氨酸-d8校正，丙三醇采用琥珀酸-d4校正，苯丙氨酸采用苯丙氨酸-d5校正，半乳糖采用十三酸校正)。
进一步基于R语言survival包中的coxph函数，对苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇进行多因素Cox比例风险回归分析(表2)。多因素Cox比例风险回归的R语言命令如下：
res.cox<-coxph(Surv(总生存期,结局变量)～c苯丙氨酸+c半乳糖+c异丙基_β_硫代半乳糖吡喃糖苷+c丙三醇,data＝data)
>summary(res.cox)
其中结局变量赋值为1(5年内死亡)和0(5年内未死亡)，c代谢物为各代谢物经内标校正后的相对浓度；
根据各变量对应的偏回归系数建立死亡风险评分模型如下：
RSOS＝0.285×c苯丙氨酸+0.427×c半乳糖-0.603×c异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷-0.016×c丙三醇，其中RSOS为受试者术后死亡风险评分，c代谢物为各代谢物经内标校正后的相对浓度；
表2.与总生存期相关的多因素Cox分析
Figure BDA0002595955590000091
本发明以术后死亡风险评分的中位数(0.82)为截点值，将肝癌患者区分为死亡高、低风险群。根据RSOS预测肝癌患者预后的Kaplan-Meier总生存曲线如图1所示，死亡高、低风险群得到明显区分，Logrank检验的结果等于0.0005，说明高、低风险群的生存曲线分布存在显著的统计学差异，低死亡风险患者具有更长的中位总生存期。根据以上模型，计算得到1号(术后5年内未死亡)和4号(术后5年内死亡)患者的死亡风险评分分别为-1.13和1.84，验证该模型可准确筛选出高死亡风险的患者。
时间依赖性受试者工作曲线(tdROC曲线)显示，总生存情况评估系统的1年、2年、5年ROC曲线下面积(AUC)分别为0.611，0.656，0.681(见图2)，说明该模型预测术后生存情况的区分度较好。
以风险评分模型预测肝癌术后总生存率的C指数为0.670(95％CI 0.586-0.754)，采用Bootstrap法(1000次)对其进行内部验证后，得到1年、2年与5年的肝癌术后实际总生存率与预测总生存率的校正曲线(见图3)，结果显示该风险评分模型对肝癌手术预后风险的预估能力较好。
分别以1年、2年、5年为时间节点，测试死亡风险评分模型RSOS是否可以提高目前临床常用的肝癌分期系统(包括TNM分期和BCLC分期)对预后总体生存的评估性能。结果如图4所示，RSOS与TNM分期系统相结合得到1年、2年、5年的AUC分别为0.805，0.812，0.839，RSOS与BCLC分期系统相结合得到1年、2年、5年的AUC分别为0.797，0.791，0.842，说明该预测模型的加入明显改善了临床分期系统的预后评估性能。
本发明所述试剂盒在对肝癌患者术后总体生存情况的预测中具有检测成本低，稳定性好，区分度和准确度高的特点。同时，本发明可作为临床分期系统的辅助手段应用于肝癌患者术后死亡风险预测，指导制定个性化治疗方案，实现精准化治疗，尽可能将风险降到最低。综上，本发明具有较高的开发价值。
以上已对本发明创造的实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (3)

1.联合型标志物在制备用于肝癌手术预后风险评估的试剂盒中的应用，
所述联合型标志物由苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇组成；所述预后风险是指肝癌手术后死亡的风险。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的试剂盒为采用气相色谱-质谱联用仪检测受试者术前血清样品中苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇含量的试剂的组合。
3.根据权利要求2所述的应用，所述的采用气相色谱-质谱联用仪检测受试者术前血清样品中苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇含量的试剂盒包括：
（1）标准化学品：苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇，所述标准化学品分别用于对应的血清样品代谢物苯丙氨酸、半乳糖、异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷和丙三醇的定性；
（2）含内标化合物的提取液：所述提取液用于预处理来自受试者的血清样品，即含内标化合物缬氨酸-d8、琥珀酸-d4、苯丙氨酸-d5和十三酸的浓度均分别为4-7 微克/mL的甲醇溶液；
（3）衍生化试剂：所述衍生化试剂用于预处理提取后的血清冻干样品，即溶于吡啶的浓度为18-22 mg/mL的甲氧胺溶液和N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺。
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