JP2015522567A - がんを治療するための組成物及び方法 - Google Patents
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- C12Y302/02—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2)
- C12Y302/02022—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2) rRNA N-glycosylase (3.2.2.22)
Abstract
本発明は、免疫毒素の技術を使用してSAS1B陽性のがん細胞を標的化するための組成物を提供し、かつ腎臓及び膵臓のがん細胞はSAS1B陽性であるが正常な腎臓及び膵臓の細胞は陽性でないことを開示する。本発明は、正常組織の中では雌性の成長している卵母細胞においてのみ発現しているにもかかわらず、SAS1Bが男性及び女性いずれのがん細胞においても発現していることを開示する。
Description
本発明は、がんを治療するための組成物及び方法に関する。
背景
メタロエンドペプチダーゼのアスタシンファミリーは、1990年代にプロテアーゼの新しいファミリーとして認められた。アスタシンはメタロプロテイナーゼのメトジンシンスーパーファミリーのサブファミリーである。最初に特性解析がなされたのはザリガニ酵素のアスタシンである。現在までに200を超えるこのファミリーのメンバーが、細菌からヒトに至る生物種において同定されてきた。アスタシンは、発生上の形態形成、マトリクス集合、組織分化、および消化に関与する。ファミリーのメンバーには、プロコラーゲンC‐プロテイナーゼ(BMP1、骨形態形成タンパク質1)、トロイド及び哺乳類トロイド様(mammalian tolloid−like)、HMP(ヒドラ・ブルガリス(Hydra vulgaris)のメタロプロテイナーゼ)、ウニのBP10(胞胚タンパク質)及びSPAN(アメリカムラサキウニ(Strongylocentrotus purpuratus)のアスタシン)、アルベオリン(alveolin)を含む「ハッチング(孵化)」サブファミリー、オバスタシン(ovastacin)、LCE、HCE(「低(low)」及び「高(high)」卵膜破壊酵素(choriolytic enzyme))、ネフロシン(nephrosin)(コイの頭腎に由来)、カエル由来のUVS.2、並びにメプリンが挙げられる。ヒト及びマウスのゲノムには、6個のアスタシンファミリー遺伝子(2個のメプリン、3個のBMP1/トロイド様、1個のオバスタシン)が存在するが、線虫(Caenorhabditis elegans)では40個存在する。
メタロエンドペプチダーゼのアスタシンファミリーは、1990年代にプロテアーゼの新しいファミリーとして認められた。アスタシンはメタロプロテイナーゼのメトジンシンスーパーファミリーのサブファミリーである。最初に特性解析がなされたのはザリガニ酵素のアスタシンである。現在までに200を超えるこのファミリーのメンバーが、細菌からヒトに至る生物種において同定されてきた。アスタシンは、発生上の形態形成、マトリクス集合、組織分化、および消化に関与する。ファミリーのメンバーには、プロコラーゲンC‐プロテイナーゼ(BMP1、骨形態形成タンパク質1)、トロイド及び哺乳類トロイド様(mammalian tolloid−like)、HMP(ヒドラ・ブルガリス(Hydra vulgaris)のメタロプロテイナーゼ)、ウニのBP10(胞胚タンパク質)及びSPAN(アメリカムラサキウニ(Strongylocentrotus purpuratus)のアスタシン)、アルベオリン(alveolin)を含む「ハッチング(孵化)」サブファミリー、オバスタシン(ovastacin)、LCE、HCE(「低(low)」及び「高(high)」卵膜破壊酵素(choriolytic enzyme))、ネフロシン(nephrosin)(コイの頭腎に由来)、カエル由来のUVS.2、並びにメプリンが挙げられる。ヒト及びマウスのゲノムには、6個のアスタシンファミリー遺伝子(2個のメプリン、3個のBMP1/トロイド様、1個のオバスタシン)が存在するが、線虫(Caenorhabditis elegans)では40個存在する。
アスタシンファミリーは、特有の18アミノ酸のシグネチャ配列を特徴とし、該配列は、ほとんどのメタロエンドペプチダーゼに見出される5アミノ酸の亜鉛結合モチーフで始まる(ボンド(Bond)及びベニョン(Benyon)、1995年の総説を参照されたい)。該シグネチャ配列は、完全な成熟型ザリガニアスタシンであり該ファミリーの全メンバーの触媒すなわちプロテアーゼドメインである、およそ200アミノ酸の配列の一部である。シグナル配列およびプロ配列もファミリーのメンバーの共通した特徴であるが、QuCAM‐1は例外の可能性があり;上記のNH2末端ドメインはこのタンパク質についてはまだ見つかっていない。最近まで単にプロテアーゼドメインで始まる成熟タンパク質として研究されていたアスタシンは、今では49残基のプレプロセグメントを含有することが知られている。この一過性シグナルペプチドは該タンパク質を生合成中の小胞体の中へと向かわせるが、このことはこれまでに研究された該ファミリーのタンパク質がすべて分泌されるか原形質膜結合型であるという知見と一致している。プロ配列の大きさは極めて多様であって、ショウジョウバエのトロイド関連1(Drosophila tolloid−related−1、DrT/r‐1)については519個ものアミノ酸を含有しており、該プロテアーゼの調節活性及び恐らくは発現にとって重要である可能性が高い。例えば後者に関しては、DrT/r‐1の大きなプロ配列は、細胞周期が非常に短い胚発生の初期段階においてこの遺伝子産物の発現を抑えることが示唆されてきた。
メプリンは亜鉛依存性の膜結合型プロテアーゼであり、メタロプロテイナーゼの「アスタシンファミリー」のメンバーである(非特許文献1;非特許文献2)。この酵素はマルチドメインのオリゴマータンパク質である。その発現は転写及び翻訳のレベルで高度に調節されている。典型的には、該タンパク質は極性を有する上皮細胞の頂端側細胞膜に対して標的設定されている(非特許文献3)。様々な生長因子、サイトカイン、及び細胞外マ
トリックスタンパク質がメプリンの基質である。メプリンは白血球、がん細胞並びに腸及び腎臓において同定済みである。メプリンα及びβいずれの遺伝子も様々ながん細胞で発現される。結腸直腸の腫瘍組織では、メプリンαのmRNA、免疫反応性タンパク質及び酵素活性が検出される。しかしながら、正常な結腸とは対照的に、メプリンαサブユニットは腫瘍の間質内に分泌され、該間質内において蓄積し、かつ免疫組織化学的方法によって検出可能である。この異常な分泌の機構は、メプリンαを内因的に発現する結腸腺癌細胞株(Caco‐2)を使用して示された。transwell(登録商標)フィルタ支持体上で培養されると、メプリンは頂端側及び側底側の細胞膜ドメインから等しく分泌される。上皮細胞層の側底側において、メプリンαは、腸の繊維芽細胞由来のuPAによって触媒された活性化プロセスによりプラスミノーゲンから生成されるプラスミンによって、活性化される可能性がある(ロスマン(Roesmann)ら、2002年)。メプリンの発現は、腫瘍細胞の浸潤及び遊走において役割を担う可能性があり、かつそうすることで腫瘍の進行に関与する可能性がある(ステルキ(Sterchi)ら、2008年;非特許文献4)。
トリックスタンパク質がメプリンの基質である。メプリンは白血球、がん細胞並びに腸及び腎臓において同定済みである。メプリンα及びβいずれの遺伝子も様々ながん細胞で発現される。結腸直腸の腫瘍組織では、メプリンαのmRNA、免疫反応性タンパク質及び酵素活性が検出される。しかしながら、正常な結腸とは対照的に、メプリンαサブユニットは腫瘍の間質内に分泌され、該間質内において蓄積し、かつ免疫組織化学的方法によって検出可能である。この異常な分泌の機構は、メプリンαを内因的に発現する結腸腺癌細胞株(Caco‐2)を使用して示された。transwell(登録商標)フィルタ支持体上で培養されると、メプリンは頂端側及び側底側の細胞膜ドメインから等しく分泌される。上皮細胞層の側底側において、メプリンαは、腸の繊維芽細胞由来のuPAによって触媒された活性化プロセスによりプラスミノーゲンから生成されるプラスミンによって、活性化される可能性がある(ロスマン(Roesmann)ら、2002年)。メプリンの発現は、腫瘍細胞の浸潤及び遊走において役割を担う可能性があり、かつそうすることで腫瘍の進行に関与する可能性がある(ステルキ(Sterchi)ら、2008年;非特許文献4)。
ケサダ(Quesada)ら(非特許文献5)は、マウス及びヒトから新規なタンパク質を単離し、その卵巣組織における顕著な発現及びアスタシンとの明白な類似から、該タンパク質を「オバスタシン(ovastacin)」と命名した。ケサダは胚の孵化のプロセスに関与する候補メタロプロテイナーゼを探しており、新規なアスタシンメタロプロテイナーゼの探索にBLASTアルゴリズムを使用した。彼らはマウス及びヒトにおいて新規なタンパク質を発見して配列決定を行い、ヒトの遺伝子について場所をヒト染色体2q11.1に特定した。コンピュータ分析から、N末端シグナルペプチド、亜鉛依存性メタロプロテアーゼドメイン、及び恐らくプロテアーゼ潜伏時間の維持に関与するプロドメインが明らかとなった。しかしながら、オバスタシンは他のアスタシンでは見られない付加的な150アミノ酸のC末端ドメインを有することが見出された。ケサダらはさらに、該タンパク質がメタロプロテアーゼ活性を有すること、及び卵巣以外の正常組織では発現されないことも示した。彼らは、オバスタシンのその正常な機能がより下等な生物種のアスタシンファミリーである「孵化酵素」に似ていると考えられることを示唆した。加えて彼らは、オバスタシンがリンパ腫及び白血病の細胞株を含む一部のがん細胞において、ただし試験された5つの卵巣癌のうち2つのみにおいて発現されること、並びにそれはRT‐PCRを使用してのみ検出可能であることを見出した。他のグループは最近ではオバスタシンを「アスタシン様タンパク質(Astacin Like protein)」(ASTL)と呼んでいる。
本明細書中ではZEP、SAS1R、及びSAS1Bとも呼ばれるオバスタシンは近年では、配偶子融合の時に透明帯糖タンパク質ZP2を開裂するためのエンドプロテアーゼとして作用することにより多精子受精の防止に関与するとされている(非特許文献6)。
ケサダが「オバスタシン」を発見したのとほぼ同時期に、別のグループがこれを単離して最初は亜鉛エンドペプチダーゼ(ZEP)と称し(マーンダル(Mandal)らの2006年8月31日公開の国際特許出願である特許文献1)、その後、精子タンパク質SLLP1と相互作用することを上記グループが見出した卵母細胞タンパク質であることから精子先体SLLP1受容体(Sperm Acrosomal SLLP1 Receptor)(「SAS1R」)と称した(非特許文献7;ヘル(Herr)らの2010年5月14日公開の国際特許出願である特許文献2)。
マーンダル(Mandal)ら(特許文献1)は、ZEPが2つのバリアント、予測膜貫通ドメインを示す配列、切断部位、及び亜鉛結合シグネチャを有することを示した。マーンダルらは、ZEPがニホンウナギであるアンギラ・ジャポニカ(Anguilla japonica)の孵化酵素EHE7に相同であることを指摘し、ZEPがマウスの胚
発生において類似の機能を果たしているかもしれないと仮定した。マーンダルの生物情報科学分析は、該タンパク質が2つのグリコシル化部位、リン酸化部位、及びミリスチル化部位を有することを示した。マーンダルらは、該部位が膜タンパク質を示唆すること、及び膜貫通トポロジーも該タンパク質のN末端に強い膜貫通ドメインを予測したことに注目した。それらのデータから、該タンパク質が卵子特異的であること、及び卵子表面において微絨毛領域に局在するが発生的に調節されることが示された。該データはさらに、ZEPと精子表面タンパク質SLLP1との間の相互作用も示唆した。
発生において類似の機能を果たしているかもしれないと仮定した。マーンダルの生物情報科学分析は、該タンパク質が2つのグリコシル化部位、リン酸化部位、及びミリスチル化部位を有することを示した。マーンダルらは、該部位が膜タンパク質を示唆すること、及び膜貫通トポロジーも該タンパク質のN末端に強い膜貫通ドメインを予測したことに注目した。それらのデータから、該タンパク質が卵子特異的であること、及び卵子表面において微絨毛領域に局在するが発生的に調節されることが示された。該データはさらに、ZEPと精子表面タンパク質SLLP1との間の相互作用も示唆した。
マーンダル(Mandal)らの文献(非特許文献7)では、同グループはZEPをSAS1Rと呼び始めた。該著者らは、SAS1Rが成熟した生きた卵母細胞の微絨毛ドメインに局在し、受精後には著しく失われて胚盤胞では事実上検出不可能であることを見出した。該著者らは、完全長のSAS1RのcDNA構築物を用いたCHO‐K1細胞のトランスフェクションにより、該タンパク質を非透過性細胞の表面上で発現させることが可能になることを示したが、これは活性のある膜貫通ドメインの存在を示している。該著者らはさらに、プロテアーゼ特性及びSAS1Rが精子タンパク質SLLP1の受容体として作用する能力について記述している。
ヘル(Herr)ら(2010年5月14日公開の国際特許出願である特許文献2)が見出したのは、天然型SAS1Rが組換えSLLP1への結合を示すこと、並びに結合型組換えSAS1Rは組換えSLLP1を捕捉し;SAS1R及びSLLP1は酵母のツーハイブリッド分析により分子結合特性が明らかになり;組換えSAS1Rの免疫沈降により組換えSLLP1が回収され、かつ免疫沈降せしめられた組換えSLLP1はウサギ網状赤血球抽出液から組換えSAS1Rを回収し;組換えSLLP1は卵母細胞の微絨毛ドメインに結合して天然型SAS1Rとともに共局在化し;組換えSAS1Rは精子の先体に結合して天然型SLLP1とともに共局在化し;精子先体マトリックス由来の天然型SLLP1は天然型SAS1Rとともに局在化し;かつ、天然型SAS1R及び天然型SLLP1は卵母細胞及び精子の非イオン性界面活性剤抽出物の混合物から共沈すること、である。ヘル(Herr)らはさらに、体外受精のために取り出された生きたヒト卵子上にSAS1Rが局在すること、及び対象者への外来SAS1Rの投与はSAS1Rに対する免疫応答を誘発することも示した。ヘルらはさらに、思春期の卵形成においても成人の卵形成においても、出生後の卵形成時の二層性二次卵胞においてSAS1Rタンパク質が最初に生じることを実証した。このパターンは動物の年齢に関係なく一定である。成体マウスの卵巣では、SAS1Rの染色は二次卵胞及びその後のすべての段階において卵母細胞に限定される。原始卵母細胞及び一次卵母細胞はいずれの発生段階でもSAS1Rについて染色されない。ヘルらは、SAS1Rについて染色される卵巣内の唯一の細胞種が卵母細胞であること、及びSAS1Rの存在が発生的に調節されていることを見出した。
ヘル(Herr)ら(2012年2月9日に公開された特許文献3)は、SAS1Rが、卵巣、子宮、肺及び膀胱のがん細胞及び腫瘍、並びに卵巣がん幹細胞株を含む、様々ながんにおいて発現されるが、その分化した相当物においては発現されないことを示した。ヘルらはさらに、SAS1Rが細胞表面タンパク質であることも示した。
リボソーム不活性化タンパク質(RIP)は、不可逆的な方式でリボソームを、かつ恐らくは他の基質を損傷する、植物の酵素である。RIPは主として、一本鎖タンパク質で構成されている1型(例えばサポリン‐S6(SAP;サポナリア・オフィチナーリス・L.(Saponaria officinalis L.)の種子由来))と、酵素のA鎖がレクチンの性質を有するB鎖に連結されたもので構成されている2型とに分類される。RIPに対する関心は主として、標的細胞に対して特異的に毒性であるコンジュゲートを得るための、モノクローナル抗体(mAb)又は他の分子のような適切な担体に連結された後の潜在的適用に由来している。
ボンド(Bond)及びベイノン(Beynon)、プロテイン・サイエンス(Protein Sci.)、1995年、第4巻、p.1247‐1261
ステルキ(Sterchi)ら、モレキュラー・アスペクツ・オブ・メディシン(Molecular Aspects of Medicine)、2008年、第29巻、p.309−328
エルデリング(Eldering)ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Eur. J. Biochem.)、1997年、第247巻、p.920‐932
ロスマン(Rosmann)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)、2002年、第277巻、第43号、p.40650‐40658
ケサダ(Quesada)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)、2004年、第279巻、第25号、p.26627‐26634
バーカート(Burkart)ら、ザ・ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J. Cell Biol.)、2012年、第197巻、p.37‐44
マーンダル(Mandal)ら、バイオロジー・オブ・リプロダクション(Biol. of Reproduction)、2008年、第78巻、p.69:72
がんのための確定的な診断検査法の不足、及び転移性疾患の患者の予後不良を前提として、がんの診断検査法が当分野において長年にわたり必要とされている。
さらに、がんバイオマーカーを同定及び使用すること、並びにこれらのバイオマーカーを調節する方法を見出すこと、例えばがんの治療及び予防のためにバイオマーカーを標的化することも、当分野において長年にわたり必要とされている。
さらに、がんバイオマーカーを同定及び使用すること、並びにこれらのバイオマーカーを調節する方法を見出すこと、例えばがんの治療及び予防のためにバイオマーカーを標的化することも、当分野において長年にわたり必要とされている。
発明の概要
本発明は、がん細胞の表面上で異常発現される卵母細胞タンパク質であってオバスタシン、ZEP及びSAS1Rとも呼ばれるSAS1Bが、該細胞の殺滅又は該細胞の増殖阻害のために免疫毒素の標的となされうるという、本明細書中に開示された予想外の結果に基づいた、がんを治療するために有用な組成物及び方法を提供する。その全体が参照により本明細書中に組込まれるヘル(Herr)らの文献(2012年2月9日に公開された国際公開第2012/019184号)は、SAS1Rが複数種類のがんにおいて発現され、かつ細胞表面で発現されており、よってSAS1Rは発見された最初のがん‐卵母細胞抗原/バイオマーカーとなることを示した。がん‐卵母細胞抗原/バイオマーカーは、正常組織の中では卵母細胞のみにおいて、かつ卵胞形成の特定の段階のみにおいて、発現されるタンパク質として定義される。様々な腫瘍における、通常は卵母細胞に限定される
細胞表面タンパク質の発現は、該がん‐卵母細胞抗原標的を発現している対象物を同定するための併用診断を伴った時、腫瘍選択的な治療法のための特筆すべき機会を提供する。したがって、SAS1Bは、がんの検出及び診断のための有用なバイオマーカーである。
本発明は、がん細胞の表面上で異常発現される卵母細胞タンパク質であってオバスタシン、ZEP及びSAS1Rとも呼ばれるSAS1Bが、該細胞の殺滅又は該細胞の増殖阻害のために免疫毒素の標的となされうるという、本明細書中に開示された予想外の結果に基づいた、がんを治療するために有用な組成物及び方法を提供する。その全体が参照により本明細書中に組込まれるヘル(Herr)らの文献(2012年2月9日に公開された国際公開第2012/019184号)は、SAS1Rが複数種類のがんにおいて発現され、かつ細胞表面で発現されており、よってSAS1Rは発見された最初のがん‐卵母細胞抗原/バイオマーカーとなることを示した。がん‐卵母細胞抗原/バイオマーカーは、正常組織の中では卵母細胞のみにおいて、かつ卵胞形成の特定の段階のみにおいて、発現されるタンパク質として定義される。様々な腫瘍における、通常は卵母細胞に限定される
細胞表面タンパク質の発現は、該がん‐卵母細胞抗原標的を発現している対象物を同定するための併用診断を伴った時、腫瘍選択的な治療法のための特筆すべき機会を提供する。したがって、SAS1Bは、がんの検出及び診断のための有用なバイオマーカーである。
1つの実施形態(On embodiment)は、細胞毒性薬にコンジュゲートしたSAS1B抗原に特異的な抗体又は前記抗体の結合性フラグメントを含む免疫毒素分子を提供する。1つの実施形態では、細胞毒性薬はI型リボソーム不活性化タンパク質である。別の実施形態では、I型リボソーム不活性化タンパク質はサポリンである。別の実施形態は、細胞毒性薬としてトリコサンチン及びルフィンの使用を提供する。1つの実施形態では、前記(the)はモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト、又はヒト化である。別の実施形態では、抗体の結合性フラグメントはF(ab’)2、F(ab)2、Fab’、又はFabである。
1つの実施形態は、免疫毒素及び生理学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。
別の実施形態は、がん細胞を殺滅し、阻害し、又は脱落させる方法であって、前記方法を必要とする対象者に、本明細書中に記載された少なくとも1つの免疫毒素分子を投与することを含む方法を提供する。1つの実施形態では、がんは、癌腫(例えば頭頸部扁平上皮細胞癌)、肉腫、子宮がん、卵巣がん、肺がん、腺癌、肺の腺癌、扁平上皮癌、肺の扁平上皮癌、悪性混合ミュラー腫瘍、白血病、リンパ腫、神経芽腫、黒色腫、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、膀胱がん及び類内膜癌で構成されている群から選択される。
別の実施形態は、がん細胞を殺滅し、阻害し、又は脱落させる方法であって、前記方法を必要とする対象者に、本明細書中に記載された少なくとも1つの免疫毒素分子を投与することを含む方法を提供する。1つの実施形態では、がんは、癌腫(例えば頭頸部扁平上皮細胞癌)、肉腫、子宮がん、卵巣がん、肺がん、腺癌、肺の腺癌、扁平上皮癌、肺の扁平上皮癌、悪性混合ミュラー腫瘍、白血病、リンパ腫、神経芽腫、黒色腫、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、膀胱がん及び類内膜癌で構成されている群から選択される。
別の実施形態は、がんを治療する方法であって、前記方法を必要とする対象者に治療上有効な用量の免疫毒素コンジュゲートを投与することを含んでなり、前記免疫毒素コンジュゲートは、細胞毒性薬にコンジュゲートせしめられた抗体又は前記抗体の結合性フラグメントを含んでなり、前記免疫毒素コンジュゲートの前記抗体はがん細胞上のSAS1Bに結合し、かつ細胞上のSAS1B分子への前記免疫毒素分子の結合により、SAS1Bを発現している細胞の殺滅、脱落、又は増殖阻害がもたらされる、方法を提供する。1つの実施形態では、細胞毒性薬はI型リボソーム不活性化タンパク質である。別の実施形態では、I型リボソーム不活性化タンパク質はサポリンである。1つの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である。他の実施形態では、抗体の結合性フラグメントはF(ab’)2、F(ab)2、Fab’、又はFabである。1つの実施形態では、がんは、癌腫(例えば頭頸部扁平上皮細胞癌)、肉腫、子宮がん、卵巣がん、肺がん、腺癌、肺の腺癌、扁平上皮癌、肺の扁平上皮癌、悪性混合ミュラー腫瘍、白血病、リンパ腫、神経芽腫、黒色腫、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、膀胱及び類内膜癌で構成されている群から選択される。
1つの実施形態は、がんを治療する方法(a method treat cancer)であって、治療上有効な用量の、がん細胞上のSAS1Bに結合する第1の抗体又は前記抗体のフラグメント、及び第1の抗体に結合する第2の抗体であって細胞毒性薬にコンジュゲートせしめられた第2の抗体を、投与することを含む方法を提供する。1つの実施形態では、一方又は両方の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である。別の実施形態では、抗体の結合性フラグメントはF(ab’)2、F(ab)2、Fab’、又はFabである。1つの実施形態では、細胞毒性薬はI型リボソーム不活性化タンパク質である。別の実施形態では、I型リボソーム不活性化タンパク質はサポリンである。
1つの実施形態は、卵巣の、子宮の、膀胱、腎臓がん、膵臓がん又は頭頸部扁平上皮細胞癌(HNSCC)を診断する方法であって、対象者の腎臓、膵臓又は頭頸部からの生体試料中のSAS1Bを測定すること、及び、前記対象者の腎臓、膵臓又は頭頸部からの生
体試料中のSAS1Bの存在に基づいて前記対象者における腎臓がん、膵臓がん又は頭頸部扁平上皮細胞癌(HNSCC)を診断することを含む方法を提供する。1つの実施形態では、対象者は哺乳類である。別の実施形態では、SAS1BはSAS1Bのタンパク質、miRNA又はmRNAである。1つの実施形態では、検出は分析デバイス及び分析プログラムを用いて結果を分析することを含む。1つの実施形態(embodimenet)では、分析デバイスはコンピュータを含む。1つの実施形態では、分析デバイスは配列分析装置を含む。1つの実施形態では、SAS1Bのタンパク質、miRNA又はmRNAのレベルは分析デバイス及び分析プログラムを用いて定量される。別の実施形態では、SAS1Bのタンパク質、miRNA、又はmRNAは、ELISA、イムノアッセイ、免疫蛍光検査法、免疫組織化学法、免疫沈降、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法、PCR法、質量分析及び表面プラズモン共鳴で構成されている群から選択された方法を使用して検出される。1つの実施形態では、試料は組織生検である。
体試料中のSAS1Bの存在に基づいて前記対象者における腎臓がん、膵臓がん又は頭頸部扁平上皮細胞癌(HNSCC)を診断することを含む方法を提供する。1つの実施形態では、対象者は哺乳類である。別の実施形態では、SAS1BはSAS1Bのタンパク質、miRNA又はmRNAである。1つの実施形態では、検出は分析デバイス及び分析プログラムを用いて結果を分析することを含む。1つの実施形態(embodimenet)では、分析デバイスはコンピュータを含む。1つの実施形態では、分析デバイスは配列分析装置を含む。1つの実施形態では、SAS1Bのタンパク質、miRNA又はmRNAのレベルは分析デバイス及び分析プログラムを用いて定量される。別の実施形態では、SAS1Bのタンパク質、miRNA、又はmRNAは、ELISA、イムノアッセイ、免疫蛍光検査法、免疫組織化学法、免疫沈降、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法、PCR法、質量分析及び表面プラズモン共鳴で構成されている群から選択された方法を使用して検出される。1つの実施形態では、試料は組織生検である。
1つの実施形態では、SAS1B陽性のがん細胞をSAS1Bに対する抗体と接触させることにより、該細胞の形状の変化が引き起こされる。1つの実施形態では、SAS1B陽性のがん細胞をSAS1Bに対する抗体と接触させることにより、該細胞の大きさの変化が引き起こされる。1つの態様では、処理が施された細胞は大きさが減少する。
1つの態様では、SAS1Bに対する抗体は、表面のSAS1Bを有する細胞内において複合体のエンドサイトーシスを導くことができる。1つの態様では、SAS1Bに対する抗体は薬物又は毒素にコンジュゲートせしめられる。1つの態様では、SAS1Bに対する一次抗体に結合する二次抗体が使用され、薬物又は毒素は該二次抗体にコンジュゲートせしめられる。1以上の上記抗体/コンジュゲート又は抗体/二次抗体/コンジュゲート複合体が使用されうる。該複合体は、SAS1Bに対する抗体に、又はSAS1Bに対する抗体に結合する二次抗体に、コンジュゲートせしめられた薬物又は毒素を含むことができる。1つの態様では、コンジュゲートせしめられる薬物又は毒素はサポリンである。1つの態様では、導かれたエンドサイトーシスにより細胞の殺滅がもたらされる。1つの態様では、サポリンがコンジュゲートせしめられた抗体はSAS1B陽性細胞の脱落を仲介する。1つの態様では、細胞はがん細胞である。当業者には十分理解されることであるが、異なる種類の抗体、例えばモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が使用されることも可能である。1つの態様では、本発明の化合物及び組成物はSAS1B陽性細胞の成長停止を誘導するのに有用である。細胞内への抗体及び薬物/毒素のコンジュゲートの取り込みは、標的細胞の殺滅に有用である。SAS1Bを発現していない細胞は標的とされない。
1つの態様では、SAS1Bに対する抗体は補体結合能力を包含しており、腫瘍細胞表面のSAS1Bに結合するとすぐに補体カスケードの内在成分及び天然成分が腫瘍細胞の殺滅を引き起こす。
本発明はさらに、精密な、オーダーメイドの医療に有用な組成物及び方法を提供する。1つの実施形態では、本発明は、SAS1Bのアンタゴニスト又は阻害剤を用いた治療に応答するであろうがんを有する対象者を選択するための組成物及び方法であって、該対象者由来の試料中のSAS1Bのタンパク質、miRNA又はmRNAの存在を検出することを含んでなり、試料中のSAS1Bのタンパク質、miRNA又はmRNAの存在は、該対象者がSAS1Bのアンタゴニスト又は阻害剤を用いた治療に応答するであろうことを示す、組成物及び方法を提供する。試料標本は、血液、血清、唾液、精液、尿又は腫瘍生検抽出物の、組織液中からのものであってよい。
本発明はまた、SAS1B陽性のがんを予防及び治療するために有用な組成物及び方法を提供する。
1つの実施形態では、抗体は、一本鎖抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、合成抗体、ポリクローナル抗体、若しくはヒト化抗体、又はこれらの活性フラグメント若しくは相同体で構成されている群から選択される。1つの態様では、抗体は、SAS1Bヒトバリアント1(配列番号23)のアミノ酸1−25、26−50、51−75、76−100、101−125、126−150、151−175、176−200、201−225、226−250、251−275、276−300、301−325、326−350、351−375、376−400、401−425、及び426−431で構成されている群から選択された1つ以上のSAS1Bタンパク質フラグメントに結合する。1つの態様では、抗体は、SAS1Bヒトバリアント1(配列番号23)のアミノ酸1−20、21−40、41−60、61−80、81−100、101−120、121−140、141−160、161−180、181−200、201−220、221−240、241−260、261−280、281−300、301−320、321−340、341−360、361−380、381−400、401−420、421−431、及び411−431で構成されている群から選択された1つ以上のSAS1Bタンパク質フラグメントに結合する。
1つの実施形態では、抗体は、一本鎖抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、合成抗体、ポリクローナル抗体、若しくはヒト化抗体、又はこれらの活性フラグメント若しくは相同体で構成されている群から選択される。1つの態様では、抗体は、SAS1Bヒトバリアント1(配列番号23)のアミノ酸1−25、26−50、51−75、76−100、101−125、126−150、151−175、176−200、201−225、226−250、251−275、276−300、301−325、326−350、351−375、376−400、401−425、及び426−431で構成されている群から選択された1つ以上のSAS1Bタンパク質フラグメントに結合する。1つの態様では、抗体は、SAS1Bヒトバリアント1(配列番号23)のアミノ酸1−20、21−40、41−60、61−80、81−100、101−120、121−140、141−160、161−180、181−200、201−220、221−240、241−260、261−280、281−300、301−320、321−340、341−360、361−380、381−400、401−420、421−431、及び411−431で構成されている群から選択された1つ以上のSAS1Bタンパク質フラグメントに結合する。
本発明はさらに、がん細胞の殺滅及びがん細胞の増殖阻害のための組成物及び方法を提供する。SAS1B陽性のがん細胞の増殖阻害又は殺滅の方法は、前記がん細胞を有効な量のSAS1Bに対する抗体又はそのフラグメントと接触させることを含んでなり、SAS1Bに対する該抗体又はそのフラグメントはSAS1Bと結合することにより増殖を阻害するか又はがん細胞を殺滅する。1つの実施形態では、殺滅は補体依存性細胞毒性である。1つの態様では、補体は補足される。1つの実施形態では、本発明は、SAS1Bに対するポリクローナル若しくはモノクローナル抗体又はそれらのフラグメントを用いて、補体の存在下でがん細胞を溶解するための組成物及び方法を提供する。1つの実施形態では、殺滅又は増殖阻害されるがん細胞は、癌腫、肉腫、子宮がん、卵巣がん、肺がん、腺癌、肺の腺癌、扁平上皮癌、肺の扁平上皮癌、悪性混合ミュラー腫瘍、白血病、リンパ腫、腎臓がん、膀胱および類内膜癌で構成されている群から選択される。1つの態様では、抗体は別の分子又は構造物にコンジュゲートせしめられる。1つの態様では、別の分子又は構造物は、抗体、タンパク質、プロドラッグ、薬物、毒素、タンパク質毒素、リポソーム、放射性同位体、及び酵素で構成されている群から選択される。
1つの実施形態では、SAS1Bに対する抗体は、毒素若しくは薬物に直接コンジュゲートせしめられるか、又は、該薬物若しくは毒素がSAS1Bに対する抗体に結合する二次抗体にコンジュゲートされる時は間接的にコンジュゲートされる。1つの態様では、薬物又は毒素とコンジュゲートされた二次抗体が使用され、前記二次抗体はSAS1Bに対する抗体を標的とする。1つの態様では、必要とする対象者は、任意選択で薬物又は毒素にコンジュゲートせしめられた、少なくとも1つのSAS1Bに対する抗体を含む医薬組成物を投与することにより治療される。1つの態様では、SAS1Bに対する抗体に結合する二次抗体も使用され、かつ任意選択で該二次抗体は薬物又は毒素にコンジュゲートせしめられる。
本発明は、本発明の免疫毒素を使用してSAS1B陽性のがんを治療するのに有用な組成物及び方法を提供する。当業者には十分理解されることであるが、追加の治療薬が使用されうるように、本明細書中に記載されたものだけでなく他の薬物及び毒素も同様に使用されうる。それらの作用薬は、任意選択で毒素又は薬物にコンジュゲートせしめられた少なくとも1つのSAS1Bに対する抗体を含む本発明の医薬組成物に加えることが可能であり、かつ任意選択で、毒素又は薬物に同じく任意選択でコンジュゲートせしめられた二次抗体が使用される。該2つの抗体(第1の抗体及び第2の抗体)は、同時投与されてもよいし別々に投与されてもよい。
本願はさらに、SAS1Bが腎臓及び膵臓のがん並びに頭頸部扁平上皮細胞癌において発現されているという予想外の結果を開示する。したがって本発明は、腎臓がん及び膵臓がん並びに頭頸部扁平上皮細胞癌を診断及び治療するための組成物及び方法を包含する。
本発明はさらに、腫瘍を有する対象者が治療を受ける前に、本発明の免疫毒素による治療に対する感受性についてin vitroで腫瘍細胞を試験するための組成物及び方法を提供する。本明細書中に提供されるアッセイは、使用されかつ有効となりうる抗体及びコンジュゲートの範囲を実証する。本明細書中に開示されるのは有効な低用量という驚くべき結果である。
本発明の様々な態様及び実施形態は以下に一層詳細に記載される。
詳細な説明
[配列番号及びその説明の概要]
配列番号1:マウス(「m」)METの正常な核酸配列
配列番号2:マウスMETの正常なアミノ酸配列
配列番号3:マウスMETバリアントの核酸配列
配列番号4:マウスMETバリアントのアミノ酸配列
配列番号5:マウスSAS1Rバリアント2の正常な核酸配列(以前はZEP‐Normalと呼ばれたもの)
配列番号6:マウスSAS1Rバリアント2の正常なアミノ酸配列(以前はZEP‐Normalと呼ばれたもの)
配列番号7:マウスSAS1Rバリアント5の核酸配列(以前はZEPバリアント1と呼ばれたもの)
配列番号8:マウスSAS1Rバリアント5のアミノ酸配列(以前はZEPバリアント1と呼ばれたもの)
配列番号9:マウスSAS1Rバリアント3の核酸配列(以前はZEPバリアント2と呼ばれたもの)
配列番号10:マウスSAS1Rバリアント3のアミノ酸配列(以前はZEPバリアント2と呼ばれたもの)
配列番号11:マウスSLLP1の核酸配列
配列番号12:マウスSLLP1のアミノ酸配列
配列番号13:ヒト(「h」)SLLP1の核酸配列
配列番号14:ヒトSLLP1のアミノ酸配列
配列番号15:マウスSLLP2の核酸配列
配列番号16:マウスSLLP2の成熟タンパク質のアミノ酸配列
配列番号17:ヒトSLLP2の核酸配列
配列番号18:ヒトSLLP2のアミノ酸配列
配列番号19:マウスSAS1Rバリアント1のアミノ酸配列
配列番号20:マウスSAS1Rバリアント4のアミノ酸配列
配列番号21:マウスSAS1Rバリアント6のアミノ酸配列
配列番号22:ヒトSAS1Rの核酸配列(GenBank登録番号:NM_001002036、1296bpのmRNA)
配列番号23:ヒトSAS1Rのアミノ酸配列(GenBank登録番号:NP_001002036.3、431アミノ酸)
配列番号24:HELMHVLGFWH(SAS1R中のモチーフであってZn配位のた
めのヒスチジン残基を備え、かつ保存された触媒残基E(グルタミン酸)が、モチーフSVMHY(配列番号25)に埋め込まれたチロシン亜鉛リガンドと共に触媒ポケットの一部を形成する)
配列番号25:SVMHY(触媒ポケットに関連したSAS1R中のモチーフ)
配列番号26:HEXXHXXGXXH(配列番号24のコンセンサスモチーフは、そのモチーフの機能を除くことのない「X」で示されるような任意のアミノ酸と置換可能な残基を有しうる)
配列番号27:SXMHY(配列番号25のコンセンサスモチーフは、そのモチーフの機能を除くことのない「X」で示されるような任意のアミノ酸と置換可能な残基を有しうる)
配列番号28(1Fプライマー):GCGCCCCTGGCCTCCAGCTGCGCA配列番号29(2Rプライマー):CACGACACCACTACCACCCATGGG配列番号30(3Fプライマー):GGCTGCAGCCCAAGTGGCCCCAGG配列番号31(4Rプライマー):AGCAACACCGGGGGCACCTGCTCC配列番号32(5Fプライマー):GAGGTCCCCTTCCTGCTCTCCAGC配列番号33(6Rプライマー):GGCATGGGACCCTCTCCCACGGGG
配列番号1〜18は国際特許出願である国際公開第2006/091535号(PCT/US2006/005970;マーンダル(Mandal)ら;2006年8月31日公開)の配列番号1〜18と同一の配列であり、前記文献においてSAS1RはZEPと称されている。国際公開第2006/091535は全体が参照により本願に組込まれる。
[配列番号及びその説明の概要]
配列番号1:マウス(「m」)METの正常な核酸配列
配列番号2:マウスMETの正常なアミノ酸配列
配列番号3:マウスMETバリアントの核酸配列
配列番号4:マウスMETバリアントのアミノ酸配列
配列番号5:マウスSAS1Rバリアント2の正常な核酸配列(以前はZEP‐Normalと呼ばれたもの)
配列番号6:マウスSAS1Rバリアント2の正常なアミノ酸配列(以前はZEP‐Normalと呼ばれたもの)
配列番号7:マウスSAS1Rバリアント5の核酸配列(以前はZEPバリアント1と呼ばれたもの)
配列番号8:マウスSAS1Rバリアント5のアミノ酸配列(以前はZEPバリアント1と呼ばれたもの)
配列番号9:マウスSAS1Rバリアント3の核酸配列(以前はZEPバリアント2と呼ばれたもの)
配列番号10:マウスSAS1Rバリアント3のアミノ酸配列(以前はZEPバリアント2と呼ばれたもの)
配列番号11:マウスSLLP1の核酸配列
配列番号12:マウスSLLP1のアミノ酸配列
配列番号13:ヒト(「h」)SLLP1の核酸配列
配列番号14:ヒトSLLP1のアミノ酸配列
配列番号15:マウスSLLP2の核酸配列
配列番号16:マウスSLLP2の成熟タンパク質のアミノ酸配列
配列番号17:ヒトSLLP2の核酸配列
配列番号18:ヒトSLLP2のアミノ酸配列
配列番号19:マウスSAS1Rバリアント1のアミノ酸配列
配列番号20:マウスSAS1Rバリアント4のアミノ酸配列
配列番号21:マウスSAS1Rバリアント6のアミノ酸配列
配列番号22:ヒトSAS1Rの核酸配列(GenBank登録番号:NM_001002036、1296bpのmRNA)
配列番号23:ヒトSAS1Rのアミノ酸配列(GenBank登録番号:NP_001002036.3、431アミノ酸)
配列番号24:HELMHVLGFWH(SAS1R中のモチーフであってZn配位のた
めのヒスチジン残基を備え、かつ保存された触媒残基E(グルタミン酸)が、モチーフSVMHY(配列番号25)に埋め込まれたチロシン亜鉛リガンドと共に触媒ポケットの一部を形成する)
配列番号25:SVMHY(触媒ポケットに関連したSAS1R中のモチーフ)
配列番号26:HEXXHXXGXXH(配列番号24のコンセンサスモチーフは、そのモチーフの機能を除くことのない「X」で示されるような任意のアミノ酸と置換可能な残基を有しうる)
配列番号27:SXMHY(配列番号25のコンセンサスモチーフは、そのモチーフの機能を除くことのない「X」で示されるような任意のアミノ酸と置換可能な残基を有しうる)
配列番号28(1Fプライマー):GCGCCCCTGGCCTCCAGCTGCGCA配列番号29(2Rプライマー):CACGACACCACTACCACCCATGGG配列番号30(3Fプライマー):GGCTGCAGCCCAAGTGGCCCCAGG配列番号31(4Rプライマー):AGCAACACCGGGGGCACCTGCTCC配列番号32(5Fプライマー):GAGGTCCCCTTCCTGCTCTCCAGC配列番号33(6Rプライマー):GGCATGGGACCCTCTCCCACGGGG
配列番号1〜18は国際特許出願である国際公開第2006/091535号(PCT/US2006/005970;マーンダル(Mandal)ら;2006年8月31日公開)の配列番号1〜18と同一の配列であり、前記文献においてSAS1RはZEPと称されている。国際公開第2006/091535は全体が参照により本願に組込まれる。
配列番号1〜27は、2010年5月14日に国際公開第2010/054187号として公開された、2009年11月6日出願の国際特許出願PCT/US/2009/063540(ヘル(Herr)ら)において使用されているのと同一の27個の配列である。該PCT出願の優先権を主張する米国特許出願(第12/613,947号)は、2010年7月22日に公開第US2010/0183617号として公開されている。
配列番号28〜33はSAS1Rを検出するための新規なプライマーである。
配列番号1〜33はすべて、ヘル(Herr)らの文献(2012年2月9日に公開された国際公開第2012/019184号)において使用されている。
配列番号1〜33はすべて、ヘル(Herr)らの文献(2012年2月9日に公開された国際公開第2012/019184号)において使用されている。
[略語及び頭文字]
a.a.:アミノ酸
ADEPT:抗体指向酵素プロドラッグ療法(antibody−directed enzyme prodrug therapy)
ASTL:アスタシン様タンパク質(astacin−like protein);この名前は現在一般に使用され認められており、オバスタシン、ZEP、SAS1R及びSAS1Bとも呼ばれる同一のタンパク質を指す。
BSA:ウシ血清アルブミン
CDC:補体依存性細胞毒性
Co‐IP:共免疫沈降
FITC:イソチオシアン酸フルオレセイン
FRET:蛍光共鳴エネルギー転移
FW:ファーウエスタン法
GV:胚胞
h:ヒト(時間でもある)
HEK:ヒト胚腎臓
HPLC:逆相高速液体クロマトグラフィ
HS:高ストリンジェンシー
I:誘導型又は免疫
IF:間接免疫蛍光法
IP:免疫沈降
IPTG:イソプロピル‐β‐D‐チオガラクトピラノシド
LB:ルリアブロス
LC/MSは液体クロマトグラフィ/質量分析を意味する
LNA:ロックト核酸
LS:低ストリンジェンシー
IM:免疫
m:マウス
MET:マウス卵子特異的TolA(mouse egg−specific TolA)(仮特許出願においてはコルシン(Colcin)様取込みタンパク質又はコリシン取込みタンパク質と呼ばれている)
min:分
miRNA:マイクロRNA
MMMT:悪性混合ミュラー腫瘍
NGS:正常なヤギ血清
OL:オーバーレイ
P:精製(された)
PI:免疫前
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
PBST:0.05%のトゥイーン20を含むリン酸緩衝生理食塩水
PVA:ポリビニルアルコール
rec:組換え体(recは「r」と互換的に使用される)
SAS1B:「SAS1R」を参照
SAS1R:精子先体SLLP1受容体(Sperm Acrosomal SLLP1
Receptor);以前はZEPと称され、初めはケサダ(Quesada)らによって発見されて「オバスタシン」と呼ばれ;さらにはSAS1Bとも称され;SAS1Rをコードする遺伝子はASTLと呼ばれる。
rSAS1R:組換えSAS1R
sec:秒
SLLP:精子リゾチーム様タンパク質(sperm lysozyme−like protein)
SPECT:単光子放射型コンピュータ断層撮影法
SPR:表面プラズモン共鳴
U:非誘導(性)
ZEP:亜鉛エンドペプチダーゼ(zinc endopeptidase)(仮特許出願においては亜鉛ペプチダーゼ、又はZPと称され;SAS1R、SAS1B、オバスタシン及びASTLと互換的に使用される)
ZFE:透明帯除去卵子
ZIE:透明帯完全型卵子
[定義]
本発明について説明及び権利主張する際、次の用語は以下に述べる定義に従って使用されることになる。
a.a.:アミノ酸
ADEPT:抗体指向酵素プロドラッグ療法(antibody−directed enzyme prodrug therapy)
ASTL:アスタシン様タンパク質(astacin−like protein);この名前は現在一般に使用され認められており、オバスタシン、ZEP、SAS1R及びSAS1Bとも呼ばれる同一のタンパク質を指す。
BSA:ウシ血清アルブミン
CDC:補体依存性細胞毒性
Co‐IP:共免疫沈降
FITC:イソチオシアン酸フルオレセイン
FRET:蛍光共鳴エネルギー転移
FW:ファーウエスタン法
GV:胚胞
h:ヒト(時間でもある)
HEK:ヒト胚腎臓
HPLC:逆相高速液体クロマトグラフィ
HS:高ストリンジェンシー
I:誘導型又は免疫
IF:間接免疫蛍光法
IP:免疫沈降
IPTG:イソプロピル‐β‐D‐チオガラクトピラノシド
LB:ルリアブロス
LC/MSは液体クロマトグラフィ/質量分析を意味する
LNA:ロックト核酸
LS:低ストリンジェンシー
IM:免疫
m:マウス
MET:マウス卵子特異的TolA(mouse egg−specific TolA)(仮特許出願においてはコルシン(Colcin)様取込みタンパク質又はコリシン取込みタンパク質と呼ばれている)
min:分
miRNA:マイクロRNA
MMMT:悪性混合ミュラー腫瘍
NGS:正常なヤギ血清
OL:オーバーレイ
P:精製(された)
PI:免疫前
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
PBST:0.05%のトゥイーン20を含むリン酸緩衝生理食塩水
PVA:ポリビニルアルコール
rec:組換え体(recは「r」と互換的に使用される)
SAS1B:「SAS1R」を参照
SAS1R:精子先体SLLP1受容体(Sperm Acrosomal SLLP1
Receptor);以前はZEPと称され、初めはケサダ(Quesada)らによって発見されて「オバスタシン」と呼ばれ;さらにはSAS1Bとも称され;SAS1Rをコードする遺伝子はASTLと呼ばれる。
rSAS1R:組換えSAS1R
sec:秒
SLLP:精子リゾチーム様タンパク質(sperm lysozyme−like protein)
SPECT:単光子放射型コンピュータ断層撮影法
SPR:表面プラズモン共鳴
U:非誘導(性)
ZEP:亜鉛エンドペプチダーゼ(zinc endopeptidase)(仮特許出願においては亜鉛ペプチダーゼ、又はZPと称され;SAS1R、SAS1B、オバスタシン及びASTLと互換的に使用される)
ZFE:透明帯除去卵子
ZIE:透明帯完全型卵子
[定義]
本発明について説明及び権利主張する際、次の用語は以下に述べる定義に従って使用されることになる。
冠詞「1つの(a)」及び「1つの(an)」は、本明細書中において、1又は2以上(すなわち少なくとも1つ)の、その冠詞の文法上の対象を指すために使用される。例を挙げると、「1つの要素(an element)」は1つの要素又は2以上の要素を意味する。
用語「約」は、本明細書中で使用されるように、およそ〜、〜辺りの、概算で〜、又は〜前後、を意味する。用語「約」が数値範囲と共に使用される場合、該用語はその数値範囲を、記された数値の上下に境界を拡げることにより修飾する。一般に、用語「約」は本明細書中において、数値を表記された値の上下に10%の変動で修飾するために使用される。1つの態様では、用語「約」は、該用語が使用されている数字の数値のプラス又はマイナス20%を意味する。したがって、約50%は45%〜55%の範囲内を意味する。端点により本明細書中に記述された数値範囲は、その範囲内に包含される全ての数値及び分数を含む(例えば、1〜5は1、1.5、2、2.75、3、3.90、4、及び5を含む)。さらに当然のことながら、全ての数及びその分数は該用語「約」によって修飾されるとみなされる。
用語「追加の治療上活性な化合物」又は「追加の治療薬」は、本発明との関連で使用されるように、治療されている特定の外傷、疾患、又は障害のための追加の治療的用途のための化合物の使用又は投与を指す。そのような化合物には、例えば、無関係な疾患若しくは障害、又は治療されている外傷、疾患若しくは障害のための一次治療に応答しない可能性のある疾患若しくは障害を治療するために使用されるものが考えられる。
本明細書中で使用されるように、用語「アジュバント」とは、特異的抗原と組み合わせて使用された時に免疫応答の増強を誘発する物質を指す。
本明細書中で使用されるように、化合物「の投与」又は化合物「を投与すること」という用語は、治療を必要とする対象者に本発明の化合物又は本発明の化合物のプロドラッグを提供することを意味するものと了解されるべきである。
本明細書中で使用されるように、化合物「の投与」又は化合物「を投与すること」という用語は、治療を必要とする対象者に本発明の化合物又は本発明の化合物のプロドラッグを提供することを意味するものと了解されるべきである。
本明細書中で使用されるように、用語「エアロゾル」は空気中懸濁物を指す。特に、エアロゾルは、本発明の調合物の粒子化又は噴霧化及びその空気中懸濁物を指す。
本明細書中で使用されるように、「アゴニスト」とは、ヒトのような哺乳動物に投与された時、該哺乳動物中の対象とする標的化合物又は分子のレベル又は存在に起因する生物学的活性を増強又は拡張する物質組成物である。
本明細書中で使用されるように、「アゴニスト」とは、ヒトのような哺乳動物に投与された時、該哺乳動物中の対象とする標的化合物又は分子のレベル又は存在に起因する生物学的活性を増強又は拡張する物質組成物である。
「アンタゴニスト」とは、ヒトのような哺乳動物に投与された時、該哺乳動物中の対象とする化合物又は分子のレベル又は存在に起因する生物学的活性を阻害する物質組成物である。
本明細書中で使用されるように、「疾患又は障害の症状を緩和する」とは、該症状の重症度若しくはそのような症状を患者が経験する頻度、又はこれら両方を、低減することを意味する。
本明細書中で使用されるように、アミノ酸は、次の表に示されるように、その正式名によって、又はそれに対応する3文字記号によって、又はそれに対応する1文字記号によって、表わされる:
用語「アミノ酸」は「アミノ酸残基」と互換的に使用され、かつ遊離アミノ酸及びペプチドのアミノ酸残基を指すことができる。該用語が遊離アミノ酸を指しているかペプチドの残基を指しているかは、該用語が使用される文脈から明白となろう。
アミノ酸は次の一般構造:
を有している。
アミノ酸は側鎖Rに基づいて7つの群すなわち(1)脂肪族側鎖、(2)水酸(OH)基を含有する側鎖、(3)硫黄原子を含有する側鎖、(4)酸性基又はアミド基を含有する側鎖、(5)塩基性基を含有する側鎖、(6)芳香環を含有する側鎖、及び(7)側鎖がアミノ基に融合したイミノ酸であるプロリン、に分類されうる。
アミノ酸は側鎖Rに基づいて7つの群すなわち(1)脂肪族側鎖、(2)水酸(OH)基を含有する側鎖、(3)硫黄原子を含有する側鎖、(4)酸性基又はアミド基を含有する側鎖、(5)塩基性基を含有する側鎖、(6)芳香環を含有する側鎖、及び(7)側鎖がアミノ基に融合したイミノ酸であるプロリン、に分類されうる。
本発明のペプチド化合物について記載するために使用される命名法は、アミノ基が各アミノ酸残基の左に、かつカルボキシ基が右に提示される従来の慣例に従う。本発明の選択された特定の実施形態を表わす式において、アミノ末端及びカルボキシ末端の基は、具体的には示されていないが、別段の定めがない限り、前記基が生理学的pH値においてとるであろう形態であるものと了解されることになろう。
「塩基性」又は「正に荷電した」アミノ酸という用語は、本明細書中で使用されるように、R基がpH7.0において正味の陽電荷を有するアミノ酸を指し、限定するものではないが、標準的なアミノ酸であるリジン、アルギニン、およびヒスチジンが挙げられる。
本明細書中で使用されるように、化学化合物の「アナログ」とは、例を挙げると、構造がもう一方と似ているが必ずしも異性体ではない化合物である(例えば、5‐フルオロウラシルはチミンのアナログである)。
用語「抗体」は、本明細書中で使用されるように、抗原上の特異的エピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。抗体は天然の供給源又は組換えの供給源に由来する完全型の免疫グロブリンであってもよいし、完全型免疫グロブリンの免疫反応性の部分であってもよい。抗体は典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、様々な形態、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、Fab及びF(ab)2、並びに一本鎖抗体及びヒト化抗体などの形態で存在することができる。
用語「抗体」は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体並びにこれらの誘導体(例えばキメラ抗体、合成抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体)、例えば、完全な免疫グロブリン若しくは抗体又は標的抗原と結合する免疫グロブリン分子の任意の機能性フラグメント、及びこれらの組み合わせなどを指す。そのような機能性の実体の例には、完全抗体分子、抗体フラグメント、例えばFv、一本鎖Fv、相補性決定領域(CDR)、VL(軽鎖可変領域)、VH(重鎖可変領域)、Fab、F(ab’)2及びこれらの任意の組み合わせ又は標的抗原に結合することができる免疫グロブリンペプチドの任意の他の機能性部分が挙げられる。
抗体は、例えば、完全型の免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼを用いた消化によって生じるいくつかのよく特性解析されたフラグメントとして、存在する。したがって、例えば、ペプシンは抗体をヒンジ部のジスルフィド結合より下方で消化して、それ自体はジスルフィド結合によりVH‐CH1に接合された軽鎖であるFabの二量体であるF(ab’)2を生じる。F(ab’)2は、ヒンジ部のジスルフィド結合を壊す穏やかな条件下で還元されることにより、F(ab’)2二量体をFab1単量体に変換することができる。Fab1単量体は実質的にヒンジ部の一部を備えたFabである(W.E.ポール(Paul)編「基礎免疫学第3版(FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 3RD ED.)」、米国ニューヨークのレイブン・プレス(Raven Press)、1993年を参照のこと)。様々な抗体フラグメントが完全型の抗体の消化という観点から定義されているが、当業者であれば、そのようなフラグメントは化学的又は組換えDNA方法論の利用により新たに合成されうることを認識するであろう。よって、抗体という用語は、本明細書中で使用されるように、完全な抗体の改変によって生産された抗体フラグメント、又は組換えDNA方法論を用いて新たに合成された抗体フラグメントのいずれも含んでいる。
「抗体重鎖」とは、本明細書中で使用されるように、すべての抗体分子に存在する2種類のポリペプチド鎖のうち大きなものを指す。
「抗体軽鎖」とは、本明細書中で使用されるように、すべての抗体分子に存在する2種類のポリペプチド鎖のうち小さなものを指す。
「抗体軽鎖」とは、本明細書中で使用されるように、すべての抗体分子に存在する2種類のポリペプチド鎖のうち小さなものを指す。
用語「一本鎖抗体」とは、抗体の機能性フラグメントをコードする遺伝子情報が一本の連続した長さのDNA中にある抗体を指す。一本鎖抗体の詳細な説明については、ビレ(Bire)ら、サイエンス(Science)、1988年、第242巻、p.423、及びヒューストン(Huston)ら、米国科学アカデミー紀要(Proc. Natl
Acad. Sci. USA)、1988年、第85巻、p.5879を参照されたい。
Acad. Sci. USA)、1988年、第85巻、p.5879を参照されたい。
用語「ヒト化(された)」は、不変領域がヒト免疫グロブリンに対して少なくとも約80%以上の相同性を有する抗体を指す。加えて、ヒト以外、例えばネズミ科動物の可変領域アミノ酸残基の一部が、ヒト起源のアミノ酸残基を含むように改変されてもよい。
ヒト化抗体は「作り変え(reshaped)」抗体と称されてきた。相補性決定領域(CDR)の操作はヒト化抗体を達成する一方法である。例えば、いずれも参照により本願に組込まれるジョーンズ(Jones)ら、ネイチャー(Nature)、1988年、第321巻、p.522、及びリーヒマン(Riechmann)ら、ネイチャー(Nature)、1988年、第332巻、p.323を参照されたい。ヒト化抗体に関する総説については、参照により本願に組込まれるウィンター(Winter)及びミルシテイン(Milstein)、ネイチャー(Nature)、1991年、第349巻、p.293を参照されたい。
本発明の免疫毒素に関しての用語「接合された」は、共有結合形、例えばジスルフィド結合;水素結合;静電気結合;組換え融合;並びに立体配座結合、例えば抗体‐抗原、及びビオチン‐アビジンの結合によって構成部分同士(典型的には抗体及び毒素)を連結することを包含する。
用語「合成抗体」とは、本明細書中で使用されるように、例えば本明細書中に記載されるようなバクテリオファージにより発現される抗体のような、組換えDNA技術を使用して生成される抗体を意味する。該用語はまた、抗体をコードするDNA分子であって抗体タンパク質を発現するDNA分子、又は抗体を規定するアミノ酸配列、の合成によって生成された抗体であって、該DNA又はアミノ酸配列は当分野において利用可能かつ良く知られた合成DNA又はアミノ酸配列の技術を使用して得られたものである、抗体を意味するようにも解釈されるべきである。
本明細書中で使用されるような用語「抗原」は、免疫応答を引き起こす分子として定義される。この免疫応答は、抗体産生、若しくは特異的な免疫担当細胞の活性化のいずれか、又は両方を伴いうる。抗原は、生物体、タンパク質/抗原のサブユニット、殺滅又は不活性化された全細胞又は溶解物に由来するものであってよい。
本明細書中で使用されるような用語「抗原決定基」とは、特定の抗体と接触する抗原の一部分(すなわちエピトープ)を指す。タンパク質若しくはタンパク質のフラグメント、又は化学的構成部分が宿主動物を免疫化するために使用される場合、抗原の多数の領域が、タンパク質上の所与の領域又は三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘導する可能性があり;これらの領域又は構造は抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、抗体との結合に関して完全型の抗原(すなわち免疫応答を誘発するために使用される「免疫原」)に匹敵しうる。
本明細書中で使用されるような用語「抗微生物作用薬」は、何らかの天然、合成、若し
くは半合成の化合物若しくは組成物又はこれらの混合物であって、本発明の方法で実行されるようなヒト又は動物での使用について安全であり、かつ微生物の殺滅又は実質的な増殖阻害において有効であるものを指す。本明細書中で使用される「抗微生物薬」には、抗菌作用薬、抗真菌作用薬、及び抗ウイルス作用薬が挙げられる。
くは半合成の化合物若しくは組成物又はこれらの混合物であって、本発明の方法で実行されるようなヒト又は動物での使用について安全であり、かつ微生物の殺滅又は実質的な増殖阻害において有効であるものを指す。本明細書中で使用される「抗微生物薬」には、抗菌作用薬、抗真菌作用薬、及び抗ウイルス作用薬が挙げられる。
本明細書中で使用されるように、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又はアンチセンス核酸は、核酸ポリマーであって、少なくともその一部分が正常細胞又は病変細胞の中に存在する核酸に相補的である核酸ポリマーを意味する。「アンチセンス」とは、特に、タンパク質をコードする二本鎖DNA分子の非コード鎖の核酸配列、又は非コード鎖にほぼ相同な配列を指す。本明細書中に定義されるように、アンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖DNA分子の配列に相補的である。アンチセンス配列は、DNA分子のコード鎖のコード部分だけに相補的である必要はない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするDNA分子のコード鎖上に指定された調節配列であってコード配列の発現を制御する調節配列に相補的であってもよい。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドには、限定するものではないが、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びその他のオリゴヌクレオチド修飾物が挙げられる。
「アプタマー」は、別の化合物(例えば、本明細書中で同定されたタンパク質)に優先的に結合するようにin vitroで選択された化合物である。多くの場合、アプタマーは、ヌクレオチド又はアミノ酸(天然に存在するもの又は合成的に作製されたものの両方)から容易にランダム配列が大量に生成可能であることから核酸またはペプチドであるが、当然ながらこれらに限定される必要はない。
用語「結合すること、結合性」とは、分子相互の、例えば、限定するものではないが、酵素の基質への、リガンドの受容体への、抗体の抗原への、タンパク質のDNA結合性ドメインのDNAへの、及びDNA鎖又はRNA鎖の相補鎖への、接着を指す。
「結合パートナー」とは、本明細書中で使用されるように、他方の分子に結合することができる分子を指す。
用語「生体適合性(の)」とは、本明細書中で使用されるように、宿主において大幅な有害反応を誘発しない材料を指す。
用語「生体適合性(の)」とは、本明細書中で使用されるように、宿主において大幅な有害反応を誘発しない材料を指す。
本明細書中で使用されるように、ポリペプチドの「生物学的に活性なフラグメント」又は「生物活性フラグメント」という用語は、完全長タンパク質の天然又は合成の一部分であって、該タンパク質の天然リガンドへの特異的結合又は該タンパク質の機能の実施をなすことができる部分を包含する。
用語「生体試料」は、本明細書中で使用されるように、対象者から得られた試料、例えば、限定されるものではないが、皮膚、毛髪、組織、血液、血漿、細胞、汗及び尿などを指す。
「C19」及び「C23」は、「SLLP1」及びSLLP2」について同様に使用される名称である。
用語「がん」は、本明細書中で使用されるように、細胞の増殖であってその独自の特性
― 正常な制御の喪失 ― により無秩序な成長、分化の欠如、局部組織侵入、及び転移をもたらすものとして定義される。例としては、限定するものではないが、黒色腫、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎臓がん及び肺がんが挙げられる。
用語「がん」は、本明細書中で使用されるように、細胞の増殖であってその独自の特性
― 正常な制御の喪失 ― により無秩序な成長、分化の欠如、局部組織侵入、及び転移をもたらすものとして定義される。例としては、限定するものではないが、黒色腫、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎臓がん及び肺がんが挙げられる。
本明細書中で使用されるように、用語「担体分子」は、対象の抗原に化学的にコンジュ
ゲートせしめられた任意の分子であって、天然の該抗原に対する特異的な抗体をもたらす免疫応答を可能にするものを指す。
ゲートせしめられた任意の分子であって、天然の該抗原に対する特異的な抗体をもたらす免疫応答を可能にするものを指す。
用語「細胞表面タンパク質」は、タンパク質であって該タンパク質の少なくとも一部が細胞膜の外面に露出していることが見出されるタンパク質を意味する。例としては成長因子受容体が挙げられる。
本明細書中で使用されるように、用語「化学的にコンジュゲートせしめられた」、「化学的にコンジュゲートする」は、抗原を担体分子に連結することを指す。この連結は、抗原及び担体分子の両方のアミノ酸配列又はそれらの一部分を含有するハイブリッドタンパク質が生産されうる組換え技術を使用した遺伝子レベルで行われることが可能である。
このハイブリッドタンパク質は、抗原及び担体分子の両方又はそれらの一部分をコードするオリゴヌクレオチド配列によって生産される。この連結にはさらに、他の化学反応、例えば、限定するものではないがグルタルアルデヒド反応を使用して、抗原と担体タンパク質との間で作出された共有結合も含まれる。共有結合は、抗原を担体分子へと架橋する第3の分子を使用して作出されてもよい。これらの架橋剤は、抗原及び担体分子上の基、例えば、限定するものではないが、第一級アミン、スルフヒドリル、カルボニル、炭水化物、又はカルボン酸と、反応することができる。化学的コンジュゲーションにはさらに、抗原と担体分子との間の非共有結合も含まれる。
このハイブリッドタンパク質は、抗原及び担体分子の両方又はそれらの一部分をコードするオリゴヌクレオチド配列によって生産される。この連結にはさらに、他の化学反応、例えば、限定するものではないがグルタルアルデヒド反応を使用して、抗原と担体タンパク質との間で作出された共有結合も含まれる。共有結合は、抗原を担体分子へと架橋する第3の分子を使用して作出されてもよい。これらの架橋剤は、抗原及び担体分子上の基、例えば、限定するものではないが、第一級アミン、スルフヒドリル、カルボニル、炭水化物、又はカルボン酸と、反応することができる。化学的コンジュゲーションにはさらに、抗原と担体分子との間の非共有結合も含まれる。
遺伝子の「コード領域」は、該遺伝子の転写によって生産されるmRNA分子のコード領域にそれぞれ相同または相補的な、該遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基及び該遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドで構成されている。
用語「競合配列」とは、ペプチド又は該ペプチドの修飾物、フラグメント、誘導体、若しくは相同体であって、その同種の結合部位について別のペプチドと競合するものを指す。
本明細書中で使用されるような「相補性」は、2つの核酸、例えば2つのDNA分子の間のサブユニット配列の相補性という広い概念を指す。該分子両方におけるヌクレオチドの部位を、互いに塩基対をなすことが通常は可能なヌクレオチドが占めている場合、該核酸はその部位において互いに相補的であると考えられる。よって、2つの核酸は、該分子のうちそれぞれにおいて相当数(少なくとも50%)の対応する部位を、互いに正常に塩基対(例えばA:T及びG:Cヌクレオチド対)をなすヌクレオチドが占めているとき、互いに相補的である。このように、第1の核酸領域のアデニン残基は、その第1の領域に逆平行である第2の核酸領域の残基がチミンまたはウラシルである場合に、その第2の核酸領域の残基とともに特異的な水素結合(「塩基対合」)を形成できることが知られている。同様に、第1の核酸鎖のシトシン残基は、その第1の鎖に逆平行である第2の核酸鎖の残基がグアニンである場合に、その第2の核酸鎖の残基とともに塩基対合をなしうることが知られている。核酸の第1の領域が同一又は異なる核酸の第2の領域と相補的であるのは、該2つの領域が逆平行の様式で配置構成され、第1の領域の少なくとも1つのヌクレオチド残基が第2の領域の残基と塩基対合をなしうる場合である。好ましくは、第1の領域は第1の部分を含んでなりかつ第2の領域は第2の部分を含んでなり、それにより、その第1及び第2の部分が逆平行の様式で配置構成されているとき、第1の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約50%、及び好ましくは少なくとも約75%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%は、第2の部分のヌクレオチド残基と塩基対合をなすことができる。より好ましくは、第1の部分のヌクレオチド残基はすべて第2の部分のヌクレオチド残基と塩基対合をなすことができる。
「化合物」は、本明細書中で使用されるように、一般には薬物、又は薬物として使用す
るための候補物と考えられる任意の種類の物質又は作用薬、並びに上記のものの組み合わせ及び混合物を指す。
るための候補物と考えられる任意の種類の物質又は作用薬、並びに上記のものの組み合わせ及び混合物を指す。
本明細書中で使用されるように、用語「保存的アミノ酸置換」は、次の5群:
I.小さな脂肪族の非極性又はわずかに極性の残基:
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly;
II.極性の負に荷電した残基及びそれらのアミド:
Asp、Asn、Glu、Gln;
III.極性の正に荷電した残基:
His、Arg、Lys;
IV.大きな脂肪族の非極性残基:
Met Leu、Ile、Val、Cys
V.大きな芳香族残基:
Phe、Tyr、Trp
のうちの1つの中でのアミノ酸交換として本明細書中において定義される。
I.小さな脂肪族の非極性又はわずかに極性の残基:
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly;
II.極性の負に荷電した残基及びそれらのアミド:
Asp、Asn、Glu、Gln;
III.極性の正に荷電した残基:
His、Arg、Lys;
IV.大きな脂肪族の非極性残基:
Met Leu、Ile、Val、Cys
V.大きな芳香族残基:
Phe、Tyr、Trp
のうちの1つの中でのアミノ酸交換として本明細書中において定義される。
「対照」細胞は、試験細胞と同じ細胞型を有する細胞である。対照細胞は、例えば、試験細胞が検査されるのと正確に同時又はほとんど同時に検査されうる。対照細胞はさらに、例えば、試験細胞が検査される時とは離れた時点で検査されてもよく、かつ対照細胞の検査の結果が記録されて、記録された結果が試験細胞の検査によって得られた結果と比較されてもよい。
「試験」細胞は検査されている細胞である。
「サイトカイン」は、本明細書中で使用されるように、細胞間シグナル伝達分子を指し、そのうち最もよく知られているものは哺乳動物の体細胞の調節に関与する。その効果において増殖促進性及び増殖阻害性の両方の、いくつかのサイトカインファミリー、例えば、インターロイキン、インターフェロン、及び形質転換増殖因子について、特性解析がなされている。いくつかの他のサイトカインは当業者に周知である。これらのサイトカインの供給源、特性、標的及びエフェクタ活性については説明がなされている。
「サイトカイン」は、本明細書中で使用されるように、細胞間シグナル伝達分子を指し、そのうち最もよく知られているものは哺乳動物の体細胞の調節に関与する。その効果において増殖促進性及び増殖阻害性の両方の、いくつかのサイトカインファミリー、例えば、インターロイキン、インターフェロン、及び形質転換増殖因子について、特性解析がなされている。いくつかの他のサイトカインは当業者に周知である。これらのサイトカインの供給源、特性、標的及びエフェクタ活性については説明がなされている。
本明細書中で使用されるように、化合物の「誘導体」は、類似構造の別の化合物から、アルキル、アシル、又はアミノ基によるHの置き換えなどで1以上のステップで生産されうる化学化合物を指す。
「検出する」という語及びその文法的変化形の使用は、定量化を伴わないその分子種の測定を指す一方、「決定する」又は「測定する」という語に加えてそれらの文法的変化形の使用は、定量化を伴うその分子種の測定を指すことを意味する。用語「検出する」及び「同定する」は本明細書中では互換的に使用される。
本明細書中で使用されるように、「検出可能なマーカー」又は「リポーター分子」は、マーカーを備えていない類似化合物の存在下で該マーカーを含む化合物の特異的検出を可能にする原子又は分子である。検出可能なマーカー又はレポーター分子には、例えば、放射性同位体、抗原決定基、酵素、ハイブリダイゼーションに利用可能な核酸、発色団、発蛍光団、化学発光分子、電気化学的に検出可能な分子、及び変更型蛍光偏光又は変更型光散乱を提供する分子が挙げられる。
本明細書中で使用されるように、用語「診断」はSAS1Rを発現しているがんに起因する異常なSAS1発現を検出することを指す。いかなる診断方法においても、偽陽性及び偽陰性が存在する。いかなる診断方法も100%の正確さは提供しない。
「疾患」とは、動物の健康状態であって、該動物がホメオスタシスを維持することができず、かつその疾患が改善されない場合は該動物の健康は悪化し続ける、状態である。
これに対し、動物における「障害」とは、該動物がホメオスタシスを維持することができる健康状態であって、ただし該動物の健康状態は該障害が存在しない状態よりも良くない、状態である。治療を受けずに放置されても、障害は必ずしも該動物の健康状態のさらなる低下を引き起こさない。
これに対し、動物における「障害」とは、該動物がホメオスタシスを維持することができる健康状態であって、ただし該動物の健康状態は該障害が存在しない状態よりも良くない、状態である。治療を受けずに放置されても、障害は必ずしも該動物の健康状態のさらなる低下を引き起こさない。
本明細書中で使用されるように、用語「ドメイン」は、分子又は構造の一部であって、共通の物理化学的特徴、例えば、限定されるものではないが、疎水性、極性、球状及び螺旋状のドメインなど、又は性質、例えばリガンド結合、シグナル伝達、細胞透過など、を共有するものを指す。結合ドメインの具体例には、限定するものではないが、DNA結合ドメイン及びATP結合ドメインが挙げられる。
本明細書中で使用されるように、「有効な量」又は「治療上有効な量」とは、疾患又は障害の症状を緩和することのような選択された効果を生じるのに十分な量を意味する。複数化合物のような組み合わせの形態の化合物の投与という状況では、各化合物の量は、別の化合物との組み合わせで投与される場合、その化合物が単独で投与される場合とは異なる可能性がある。よって、化合物の組み合わせの有効な量はその組み合わせ全体をまとめて指しているが、各化合物の実際の量は様々となりうる。用語「より有効な」とは、その選択された効果が、ある治療によって、該治療が比較の対象とされている第2の治療に比べ、より大きく緩和されることを意味する。
本明細書中で使用されるように、用語「エフェクタドメイン」は、生化学経路を調節することができる、細胞質内のエフェクタ分子、化学物質、又は構造物と直接相互作用することができるドメインを指す。
本明細書中で使用されるように、「卵子タンパク質」又は「卵子特異的タンパク質」という語は、卵子又は卵巣中で独占的又は優勢的に発現されるタンパク質を指す。該タンパク質は卵子又は卵巣の発生のすべての段階で発現される必要はない。
用語「エリキシル剤」は、本明細書中で使用されるように、一般に、清澄な、甘味のついた、アルコールを含有する、通常は水アルコール性の、香味料物質及び時には活性薬剤を含有している液体を指す。
「コードしている」とは、遺伝子、cDNA、又はmRNAのようなポリヌクレオチド中の特定配列のヌクレオチドの固有の特質であって、生物学的プロセスにおける、規定の配列のヌクレオチド(すなわちrRNA、tRNA及びmRNAである)又は規定の配列のアミノ酸のいずれかを有しかつそこから生じる生物学的特質を有する他のポリマー及び巨大分子の合成のための鋳型としての役割を果たす特質を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写及び翻訳により細胞内又は他の生物系の中でタンパク質が生じる場合、該タンパク質をコードしている。そのヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり配列表において通常提示されるコード鎖、及び遺伝子又はcDNAの転写のための鋳型として使用される非コード鎖はいずれも、該タンパク質又はその遺伝子若しくはcDNAの他の生成物をコードしているとして言及されうる。
「エンハンサー」は、転写の開始部位に対する該エンハンサーの距離又は配置方向にかかわらず、転写の効率を増大させることができるDNA調節要素である。
本明細書中に使用されるような用語「エピトープ」は、抗体を誘発して該抗体と反応することができる抗原分子上の小さな化学基として定義される。抗原は1つ以上のエピトープを有しうる。ほとんどの抗原は多数のエピトープを有する;すなわちそれらは多価であ
る。一般に、エピトープは大きさが概算で5アミノ酸又は5糖である。当業者には、一般に分子の特定の直線状配列ではなく全体的な三次元構造が抗原特異性の主な基準であることが理解されている。
本明細書中に使用されるような用語「エピトープ」は、抗体を誘発して該抗体と反応することができる抗原分子上の小さな化学基として定義される。抗原は1つ以上のエピトープを有しうる。ほとんどの抗原は多数のエピトープを有する;すなわちそれらは多価であ
る。一般に、エピトープは大きさが概算で5アミノ酸又は5糖である。当業者には、一般に分子の特定の直線状配列ではなく全体的な三次元構造が抗原特異性の主な基準であることが理解されている。
本明細書中で使用されるように、特定のタンパク質又はペプチドの「実質的に純粋な」調製物とは、該調製物中のタンパク質又はペプチドのうち重量比で少なくとも約95%、及び好ましくは少なくとも約99%がその特定のタンパク質又はペプチドである調製物である。
「フラグメント」又は「セグメント」は、少なくとも1つのアミノ酸を含む、アミノ酸配列の一部分、又は少なくとも1つのヌクレオチドを含む、核酸配列の一部分である。用語「フラグメント」及び「セグメント」は本明細書中において互換的に使用される。
本明細書中で使用されるように、タンパク質又はペプチドに適用されるような、用語「フラグメント」は、通常は、長さが少なくとも約3〜15アミノ酸、少なくとも約15〜25アミノ酸、長さが少なくとも約25〜50アミノ酸、長さが少なくとも約50〜75アミノ酸、長さが少なくとも約75〜100アミノ酸であってよく、長さが100アミノ酸を越えてもよい。
本明細書中で使用されるように、核酸に適用されるような用語「フラグメント」は、通常は、長さが少なくとも約20のヌクレオチドであってよく、典型的には、少なくとも約50ヌクレオチド、より典型的には、約50〜約100ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約100〜約200ヌクレオチド、さらにより好ましくは、少なくとも約200〜約300ヌクレオチド、さらになおより好ましくは、少なくとも約300〜約350ヌクレオチド、さらにより好ましくは、少なくとも約350ヌクレオチド〜約500ヌクレオチド、さらになおより好ましくは、少なくとも約500〜約600、さらにより好ましくは、少なくとも約600ヌクレオチド〜約620ヌクレオチド、さらになおより好ましくは、少なくとも約620〜約650、最も好ましくは、核酸フラグメントは長さが約650ヌクレオチドより大きくなろう。
本明細書中で使用されるように、「機能的な」生体分子とは、該分子が特徴とする特質を該分子が示す形態をとっている生体分子である。例えば、機能的な酵素とは、該酵素が特徴とする特徴的な触媒活性を示すものである。
本明細書中で使用されるような「相同(な)」は、2つのポリマー分子の間の、例えば2つの核酸分子、例えば2つのDNA分子若しくは2つのRNA分子の間での、又は2つのポリペプチド分子の間の、サブユニット配列の類似性を指す。2つの分子両方におけるサブユニットの部位が同じ単量体サブユニットで占められている場合、例えば2つのDNA分子それぞれにおける部位がアデニンで占められている場合、該分子はその部位において相同である。2つの配列の間の相同性は、一致する部位すなわち相同な部位の数の一次関数であり、例えば、2つの化合物配列の部位の半分(例えば、長さ10サブユニットのポリマー中の5つの部位)が相同である場合、その2つの配列は50%相同であり、90%の部位(例えば10箇所のうち9箇所)が一致すなわち相同である場合、その2つの配列は90%の相同性を共有する。例をあげると、DNA塩基配列3’ATTGCC5’及び3’TATGGCは50%の相同性を共有する。
本明細書中で使用されるように、「相同性」は「同一性」と同義的に使用される。
2つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の間の一致率(%)の決定は、数学アルゴリズムを使用して遂行することができる。例えば、2つの配列を比較するのに有用な数学アルゴリズムは、カーリン(Karlin)及びアルトシュル(Altschul)(米国
科学アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、1990年、第87巻、p.2264−2268)のアルゴリズムであって、カーリン(Karlin)及びアルトシュル(Altschul)(米国科学アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、1993年、第90巻、p.5873−5877)において修正されたものである。このアルゴリズムは、アルトシュル(Altschul)ら(ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol.
Biol.)、1990年、第215巻、p.403−410)のNBLAST及びXBLASTのプログラムに組み込まれており、例えば、ユニバーサルリソースロケータを有する全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のワールドワイドウェブサイトにおいて、NCBIウェブサイトでBLASTツールを使用してアクセスすることができる。BLASTのヌクレオチド検索は、本明細書中に記載された核酸に相同なヌクレオチド配列を得るために、NBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と表される)を用いて、次のパラメータ:ギャップペナルティ(gap penalty)=5;ギャップ伸張ペナルティ(gap extension penalty)=2;不一致ペナルティ(mismatch penalty)=3;一致スコア付与(match reward)=1;期待値(expectation value)10.0;及びワードサイズ(word size)=11を使用して実施可能である。BLASTのタンパク質検索は、本明細書中に記載されたタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と表される)又はNCBI「blastp」プログラムを用いて、次のパラメータ:期待値10.0、BLOSUM62スコアリングマトリックスを使用して実施可能である。比較目的のギャップ有りアラインメントを得るために、アルトシュル(Altschul)らの文献(ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)、1997年、第25巻、p.3389−3402)に記載されているようにしてギャップ有りBLASTを利用することができる。別例として、PSI‐Blast又はPHI‐Blastが、分子間の距離関係(Id.)及び共通のパターンを有する分子間の関係を検出する反復検索を実施するために使用されることも可能である。BLAST、ギャップ有りBLAST、PSI‐Blast、及びPHI‐Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えばXBLAST及びNBLAST)のデフォルトパラメータが使用可能である。
2つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の間の一致率(%)の決定は、数学アルゴリズムを使用して遂行することができる。例えば、2つの配列を比較するのに有用な数学アルゴリズムは、カーリン(Karlin)及びアルトシュル(Altschul)(米国
科学アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、1990年、第87巻、p.2264−2268)のアルゴリズムであって、カーリン(Karlin)及びアルトシュル(Altschul)(米国科学アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、1993年、第90巻、p.5873−5877)において修正されたものである。このアルゴリズムは、アルトシュル(Altschul)ら(ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol.
Biol.)、1990年、第215巻、p.403−410)のNBLAST及びXBLASTのプログラムに組み込まれており、例えば、ユニバーサルリソースロケータを有する全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のワールドワイドウェブサイトにおいて、NCBIウェブサイトでBLASTツールを使用してアクセスすることができる。BLASTのヌクレオチド検索は、本明細書中に記載された核酸に相同なヌクレオチド配列を得るために、NBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と表される)を用いて、次のパラメータ:ギャップペナルティ(gap penalty)=5;ギャップ伸張ペナルティ(gap extension penalty)=2;不一致ペナルティ(mismatch penalty)=3;一致スコア付与(match reward)=1;期待値(expectation value)10.0;及びワードサイズ(word size)=11を使用して実施可能である。BLASTのタンパク質検索は、本明細書中に記載されたタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と表される)又はNCBI「blastp」プログラムを用いて、次のパラメータ:期待値10.0、BLOSUM62スコアリングマトリックスを使用して実施可能である。比較目的のギャップ有りアラインメントを得るために、アルトシュル(Altschul)らの文献(ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)、1997年、第25巻、p.3389−3402)に記載されているようにしてギャップ有りBLASTを利用することができる。別例として、PSI‐Blast又はPHI‐Blastが、分子間の距離関係(Id.)及び共通のパターンを有する分子間の関係を検出する反復検索を実施するために使用されることも可能である。BLAST、ギャップ有りBLAST、PSI‐Blast、及びPHI‐Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えばXBLAST及びNBLAST)のデフォルトパラメータが使用可能である。
2つの配列の間の一致率(%)は、ギャップを許容するにせよしないにせよ、上述の技法に類似の技法を使用して決定可能である。一致率(%)を計算する際、典型的には完全な一致が計数される。
本明細書中で使用されるように、用語「ハイブリダイゼーション」は相補的な核酸の対合に関して使用される。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強さ(すなわち核酸間の会合の強さ)は、核酸の間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドの長さ、及び核酸内のG:C比のような要因によって影響を受ける。
「抗原に対して対象者を免疫化する」という用語によって、組成物、タンパク質複合体、タンパク質複合体をコードするDNA、抗体又は抗体をコードするDNAであって、対象者において免疫応答を誘発し、かつ例えば、抗原によって引き起こされる疾患に対する防御を対象者に提供するか、又は抗原の機能を妨げるものを、該対象者に投与することが意味される。
用語「その免疫学的に活性なフラグメント」は、一般に、少なくともエピトープを含むポリペプチド抗原のフラグメントを指すように当分野では理解されることになり、これは、該フラグメントがポリペプチド抗原の配列由来の4個の連続したアミノ酸を少なくとも
含むことを意味する。
含むことを意味する。
本明細書中で使用されるように、用語「アポトーシスの誘導」とは、細胞がプログラム細胞死のプロセスを開始するようなかたちで作用を受けるプロセスであって、細胞が膜結合型の粒子へと断片化されて次に該粒子が食作用のプロセスによって除去されることを特徴とするプロセスを意味する。
本明細書中で使用されるように、用語「吸入器」は、例えば溶液状、散剤状などの薬物の経鼻投与及び経肺投与用のデバイスの両方を指す。例えば、用語「吸入器」は、推進剤駆動式の吸入器、例えば急性の喘息発作のための抗ヒスタミン薬の投与に使用されるような吸入器、及びプラスチック噴霧ボトル、例えばうっ血除去薬の投与に使用されるようなボトル、を包含するように意図されている。
用語「阻害する」は、本明細書中で使用されるように、化合物、作用薬、又は方法が、記載された機能、レベル、活性、速度などを、該用語「阻害する」が使用される文脈に基づいて低減又は妨害する能力を指す。好ましくは、阻害は、少なくとも10%、より好ましくは少なくとも25%、さらにより好ましくは少なくとも50%の阻害であり、最も好ましくは、機能は少なくとも75%阻害される。用語「阻害する」は、「低減する」及び「阻止する」と互換的に使用される。
用語「複合体を阻害する」とは、本明細書中で使用されるように、複合体の形成又は2以上のタンパク質の相互作用を阻害することに加えて、複合体の機能又は活性を阻害することを指す。該用語はさらに、形成された複合体を分裂させることも包含する。しかしながら該用語は、これらの機能のうち一つ一つが同時に阻害されねばならないことを暗示するものではない。
用語「タンパク質を阻害する」は、本明細書中で使用されるように、タンパク質の合成、レベル、活性、又は機能を阻害する任意の方法又は技法に加えて、対象とするタンパク質の合成、レベル、活性、又は機能の誘導又は刺激を阻害する方法をも指す。該用語はさらに、対象とするタンパク質の合成、レベル、活性、又は機能を調節することができる任意の代謝経路又は調節経路も指す。該用語は、他の分子との結合及び複合体形成を含む。したがって、用語「タンパク質阻害剤」は、任意の作用薬又は化合物であって、その適用によりタンパク質機能又はタンパク質経路機能の阻害がもたらされるものを指す。しかしながら該用語は、これらの機能のうち一つ一つが同時に阻害されねばならないことを暗示するものではない。
本明細書中で使用されるように、「注射すること又は適用すること」は、様々な経路による本発明の化合物の投与を含み、かつ、例えば、限定するものではないが、局所、経口、口腔内、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、骨腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、経膣、眼内、経肺、又は経直腸の手段を意味する。
本明細書中で使用されるように、「使用説明資料」には、本明細書中に列挙された様々な疾患又は障害の緩和の達成のためキット内の本発明のペプチドの有用性を伝えるために使用することが可能な、出版物、録音、略図、又は任意の他の表現媒体が含まれる。任意選択で、又は別例として、該使用説明資料は、哺乳動物の細胞又は組織における疾患又は障害を緩和する1つ以上の方法について記載されていてもよい。本発明のキットの使用説明資料は、例えば、同定された化合物発明が入っているコンテナに添付されてもよいし、同定された化合物が入っているコンテナと一緒に出荷されてもよい。別例として、使用説明資料は、使用説明資料及び化合物が受取人によって協調的に使用されるという意図をもって、コンテナとは別々に出荷されてもよい。
精子タンパク質と卵子タンパク質との間の「相互作用」によって、有精卵結合、融合、又は受精などのイベント又はプロセスが生じるのに必要な結合のような相互作用が意味される。1つの態様では、「相互作用」は受容体‐リガンド型の結合又は相互作用に類似しうる。
「単離(された)核酸」は、核酸のセグメント又はフラグメントであって、天然に存在する状態において該セグメント又はフラグメントに隣接する配列から分離されたもの、例えばDNAフラグメントであって通常は該フラグメントに隣接している配列(例えば該フラグメントが天然に存在するゲノム中で該フラグメントに隣接している配列)から取り出されたDNAフラグメント、を指す。該用語はさらに、核酸であって、天然において該核酸に伴う他の成分から、例えば天然において細胞内で核酸に伴うRNA若しくはDNA又はタンパク質から、ほぼ精製された核酸にも当てはまる。したがって該用語には、例えば、組換えDNAであって、ベクター、自律複製型のプラスミド若しくはウイルス、若しくは原核生物若しくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれたもの、又は他の配列とは無関係に別個の分子として(例えばPCR若しくは制限酵素消化によって生じたcDNA又はゲノムフラグメント若しくはcDNAフラグメントとして)存在するものが含まれる。該用語はさらに、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAも含む。
「リガンド」は標的受容体に特異的に結合する化合物である。
「受容体」はリガンドに特異的に結合する化合物である。
リガンド又は受容体(例えば抗体)は、種々雑多な化合物の試料中のある化合物の存在を決定する結合反応において該リガンド又は受容体が機能するとき、その化合物「に特異的に結合する」、又は「(その化合物)と特異的に免疫反応性である」。したがって、指定のアッセイ(例えばイムノアッセイ)条件下では、リガンド又は受容体は特定の化合物に優先的に結合し、かつ試料中に存在する他の化合物には多量には結合しない。例えば、ポリヌクレオチドは、相補的配列を含む化合物ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーション条件下で特異的に結合し;抗体は、該抗体が作り出された対象のエピトープを有する抗原にイムノアッセイ条件下で特異的に結合する。特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために、様々なイムノアッセイ形式が使用されうる。例えば、固相ELISAイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性のモノクローナル抗体を選択するために日常作業的に使用される。特異的な免疫反応性を決定するために使用可能なイムノアッセイの形式及び条件の説明については、ハーロー(Harlow)及びレーン(Lane)の文献(「抗体、実験の手引き(Antibodies, A Laboratory Manual)」、米国ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバー・パブリケーションズ(Cold Spring Harbor Publications)、1988年)を参照されたい。
「受容体」はリガンドに特異的に結合する化合物である。
リガンド又は受容体(例えば抗体)は、種々雑多な化合物の試料中のある化合物の存在を決定する結合反応において該リガンド又は受容体が機能するとき、その化合物「に特異的に結合する」、又は「(その化合物)と特異的に免疫反応性である」。したがって、指定のアッセイ(例えばイムノアッセイ)条件下では、リガンド又は受容体は特定の化合物に優先的に結合し、かつ試料中に存在する他の化合物には多量には結合しない。例えば、ポリヌクレオチドは、相補的配列を含む化合物ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーション条件下で特異的に結合し;抗体は、該抗体が作り出された対象のエピトープを有する抗原にイムノアッセイ条件下で特異的に結合する。特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために、様々なイムノアッセイ形式が使用されうる。例えば、固相ELISAイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性のモノクローナル抗体を選択するために日常作業的に使用される。特異的な免疫反応性を決定するために使用可能なイムノアッセイの形式及び条件の説明については、ハーロー(Harlow)及びレーン(Lane)の文献(「抗体、実験の手引き(Antibodies, A Laboratory Manual)」、米国ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバー・パブリケーションズ(Cold Spring Harbor Publications)、1988年)を参照されたい。
本明細書中で使用されるように、用語「連結」は2つの基の間の接続を指す。その接続は共有結合であっても非共有結合であってもよく、例えば、限定するものではないが、イオン結合、水素結合、及び疎水性/親水性相互作用が挙げられる。
本明細書中で使用されるように、用語「リンカー」は、2つの他の分子を共有結合又は非共有結合によって、例えばイオン結合若しくは水素結合又はファンデルワールス相互作用によって接合する分子であって、例えば5’端で1つの相補的配列に、かつ3’端で別の相補的配列にハイブリダイズし、その結果2つの非相補的配列を接合する核酸分子を指す。
遺伝子の「発現不良(malexpression)」は、疾患又は障害を患う患者の
細胞における遺伝子の発現であって、発現のレベル(無発現を含む)、発現される遺伝子の部分、又は細胞周期に関する遺伝子の発現のタイミングが、該疾患又は障害を患っていない患者の細胞における同じ遺伝子の発現とは異なっているものを意味する。当然ながら、発現不良は、該疾患若しくは障害を引き起こすか又は該疾患若しくは障害に寄与する場合もあれば、該疾患若しくは障害の症状である場合もあれば、両方である場合もある。
細胞における遺伝子の発現であって、発現のレベル(無発現を含む)、発現される遺伝子の部分、又は細胞周期に関する遺伝子の発現のタイミングが、該疾患又は障害を患っていない患者の細胞における同じ遺伝子の発現とは異なっているものを意味する。当然ながら、発現不良は、該疾患若しくは障害を引き起こすか又は該疾患若しくは障害に寄与する場合もあれば、該疾患若しくは障害の症状である場合もあれば、両方である場合もある。
本明細書中で使用されるように、用語「発現のレベルを測定すること」又は「発現のレベルを決定すること」は、任意の測定又はアッセイであって、該アッセイの結果を対象とする遺伝子又はタンパク質の発現のレベルと関連付けるために使用可能なものを指す。そのようなアッセイは、mRNAのレベル、タンパク質レベルなどを測定することを含み、かつ、ノーザン及びウエスタンブロット解析、結合アッセイ、イムノブロット法などのようなアッセイによって実施可能である。発現のレベルは、発現の速度を含むことが可能であり、かつ存在するmRNA又はタンパク質の実際の量に関して測定されることも可能である。そのようなアッセイは、情報を格納及び処理するための、またレベル、信号などの定量化を支援するための、またレベルの比較において使用される情報をデジタル化するための、プロセス又はシステムと併用される。
用語「経鼻投与」は、そのすべての文法形式において、本発明の少なくとも1つの化合物の全身送達のための、鼻粘膜を経由した血流への本発明の少なくとも1つの化合物の投与を指す。送達のための経鼻投与の利点は、シリンジ及び針を使用する注射を必要としないこと、薬物の筋肉内投与に伴う可能性のある壊死を回避すること、並びに、薬物の経粘膜投与は自己投与に高度に適していることである。
用語「核酸」は典型的には大きなポリヌクレオチドを指す。「核酸」が意味するのは、デオキシリボヌクレオシドで構成されるものであれリボヌクレオシドで構成されるものであれ、かつ、ホスホジエステル結合で構成されるものであれ修飾型の連結、例えばホスホトリエステル、ホスホロアミダート、シロキサン、カルボナート、カルボキシメチルエステル、アセトアミダート、カルバマート、チオエーテル、架橋ホスホロアミダート、架橋メチレンホスホナート、架橋ホスホロアミダート、架橋ホスホロアミダート、架橋メチレンホスホナート、ホスホロチオエート、メチルホスホナート、ホスホロジチオアート、架橋ホスホロチオエート又はスルホンの連結、及びそのような連結の組み合わせなどで構成されるものであれ、任意の核酸である。核酸という用語はまた、5つの生体に存在する塩基(アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル)以外の塩基で構成されている核酸も明確に含む。
本明細書中で使用されるように、用語「核酸」はRNA並びに一本鎖及び二本鎖のDNA及びcDNAを包含する。更に、用語「核酸」、「DNA」、「RNA」及び類似用語は、核酸アナログ、すなわちホスホジエステル主鎖以外を有するアナログをも含む。例えば、当分野で周知でありかつ主鎖にホスホジエステル結合ではなくペプチド結合を有するいわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内にあると見なされる。「核酸」が意味するのは、デオキシリボヌクレオシドで構成されるものであれリボヌクレオシドで構成されるものであれ、かつ、ホスホジエステル連結で構成されるものであれ修飾型の連結、例えばホスホトリエステル、ホスホロアミダート、シロキサン、カルボナート、カルボキシメチルエステル、アセトアミダート、カルバマート、チオエーテル、架橋ホスホロアミダート、架橋メチレンホスホナート、架橋ホスホロアミダート、架橋ホスホロアミダート、架橋メチレンホスホナート、ホスホロチオエート、メチルホスホナート、ホスホロジチオアート、架橋ホスホロチオエート又はスルホン連結、及びそのような連結の組み合わせなどで構成されるものであれ、任意の核酸である。核酸という用語はまた、5つの生体に存在する塩基(アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル)以外の塩基で構成されている核酸も明確に含む。ポリヌクレオチド配列について記載するために本明細書中では従
来の表記法が使用されている、すなわち:一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側端は5’端であり;二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は5’方向と呼ばれる。生じつつあるRNA転写物への5’→3’のヌクレオチドの付加の方向は転写方向と呼ばれる。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は「コード鎖」と呼ばれ;DNA上の基点に対して5’側に位置するDNA鎖上の配列は「上流配列」と呼ばれ;DNA上の基点に対して3’側にあるDNA鎖上の配列は「下流配列」と呼ばれる。
来の表記法が使用されている、すなわち:一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側端は5’端であり;二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は5’方向と呼ばれる。生じつつあるRNA転写物への5’→3’のヌクレオチドの付加の方向は転写方向と呼ばれる。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は「コード鎖」と呼ばれ;DNA上の基点に対して5’側に位置するDNA鎖上の配列は「上流配列」と呼ばれ;DNA上の基点に対して3’側にあるDNA鎖上の配列は「下流配列」と呼ばれる。
用語「核酸構築物」は、本明細書中で使用されるように、ゲノム法または合成法のいずれによって得られるものであれ、所望の特定の遺伝子又は遺伝子フラグメントをコードするDNA及びRNA配列を包含する。
別段の定めがない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であり、かつ同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及びRNAをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含む場合がある。
用語「オリゴヌクレオチド」は典型的には短いポリヌクレオチド、概して、約50ヌクレオチド以下を指す。当然のことであるが、ヌクレオチド配列がDNA塩基配列(すなわちA、T、G、C)によって表わされる場合、これは「U」が「T」に取って代わるRNA配列(すなわちA、U、G、C)も含む。
本明細書中で使用されるような「卵母細胞」は、いくつかの方法でより明確に分類可能である。「裸の卵母細胞」は、ナース顆粒膜(granulose)細胞の連続シートに囲まれていない雌生殖細胞として定義される。「原始卵母細胞」は、単層の鱗状ナース顆粒膜細胞に囲まれた雌生殖細胞として定義される。「一次卵母細胞」は、単層の立方形ナース顆粒膜(granulose)細胞に囲まれた雌生殖細胞として定義される。「二次卵母細胞」は、二層の立方形顆粒膜(granulose)細胞に囲まれた雌生殖細胞として定義される。「前胞状(preeantral)卵母細胞」は、3層以上の顆粒膜(granulose)細胞に囲まれているが洞を伴わない雌生殖細胞として定義される。「胞状卵母細胞」は、3層以上の顆粒膜細胞に囲まれ、かつ卵胞液空間の形跡を含んでいる雌生殖細胞として定義される。
2つのポリヌクレオチドについて「作動可能なように連結された」として記載することが意味するのは、一本鎖又は二本鎖の核酸部分が該2つのポリヌクレオチドを含んでなり、該2つのポリヌクレオチドは、該2つのポリヌクレオチドのうち少なくとも一方が特徴とする生理学的な影響を他方に対して及ぼすことができるようなかたちで、該核酸部分の内部で配置構成されているということである。例を挙げると、遺伝子のコード領域に作動可能なように連結されたプロモーターは、該コード領域の転写を促進することができる。
本明細書中で使用されるように、医薬組成物の「非経口(parenteral)投与」は、対象者の組織の物理的突破及び該組織内の突破口を通した医薬組成物の投与を特徴とする任意の投与経路を含む。よって非経口投与には、例えば、限定されるものではないが、医薬組成物の投与であって組成物の注射によるもの、外科的切開を通じた組成物の適用によるもの、組織を貫通する非外科的創傷を通じた組成物の適用によるものなどが挙げられる。特に、非経口投与には、例えば、限定されるものではないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内への注射、及び腎臓透析輸液技法が含まれることが企図される。
用語「ペプチド」は典型的には短いポリペプチドを指す。
用語「適用ごとの」は、本明細書中で使用されるように、対象者への薬物又は化合物の投与を指す。
用語「適用ごとの」は、本明細書中で使用されるように、対象者への薬物又は化合物の投与を指す。
用語「医薬組成物」は、少なくとも1つの有効成分を含む組成物を意味するものとし、これにより該組成物は哺乳動物(例えば、限定するものではないがヒト)における一定の効果的な転帰についての調査に適するものとなる。該技法は有効成分が所望の効果的な転帰を有するかどうかを技術者の要求に基づいて判断するのに適切であると当業者は了解かつ認識するであろう。
本明細書中で使用されるように、用語「薬学的に許容可能な担体」とは、化学組成物であって、該化学組成物とともに適切な化合物又は誘導体を組み合わせることが可能であり、かつ、組み合わせた後に、その適切な化合物を対象者に投与するために使用可能であるものを意味する。
本明細書中で使用されるように、用語「生理学的に許容可能な」エステル又は塩とは、医薬組成物の任意の他の成分との適合性を有するエステル又は塩の形態の有効成分であって、該組成物が投与されることになっている対象者に対して有害ではないものを意味する。
「薬学的に許容可能な」とは、ヒトへの適用又は獣医学的適用のいずれについても生理学的に忍容可能であることを意味する。
本明細書中で使用されるように、「医薬組成物」にはヒトでの使用及び獣医学的使用のための調合物が含まれる。
本明細書中で使用されるように、「医薬組成物」にはヒトでの使用及び獣医学的使用のための調合物が含まれる。
「複数」とは少なくとも2つを意味する。
「ポリヌクレオチド」とは一本鎖又は平行鎖及び逆平行鎖の核酸を意味する。よってポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のいずれの核酸であってもよい。
「ポリヌクレオチド」とは一本鎖又は平行鎖及び逆平行鎖の核酸を意味する。よってポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のいずれの核酸であってもよい。
「ポリペプチド」とは、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造バリアント、及び天然に存在しないこれらの合成アナログが、ペプチド結合、関連する天然に存在する構造バリアント、及び天然に存在しないこれらの合成アナログを介して連結したもので構成されているポリマーを指す。
「合成ペプチド又は合成ポリペプチド」とは、天然に存在しないペプチド又はポリペプチドを意味する。合成ペプチド又は合成ポリペプチドは、例えば自動ポリペプチド合成機を使用して合成可能である。様々な固相ペプチド合成方法が当業者に知られている。
「前感作」が意味しているのは、作用薬を用いる抗原投与に先立っての、少なくとも1つの自然免疫系刺激物の前投与である。これは忍容の誘導と呼ばれることもある。
用語「防止(予防)する」は、本明細書中で使用されるように、何かが起きるのを止めること、又は起こり得る何か若しくは起こりそうな何かに対して事前措置をとることを意味する。医学に関しては、「予防」とは一般に、ある疾患又は身体状態になる機会を減少させるために講じられる行為を指す。
用語「防止(予防)する」は、本明細書中で使用されるように、何かが起きるのを止めること、又は起こり得る何か若しくは起こりそうな何かに対して事前措置をとることを意味する。医学に関しては、「予防」とは一般に、ある疾患又は身体状態になる機会を減少させるために講じられる行為を指す。
「防止的」又は「予防的」治療とは、疾患若しくは障害の徴候を示さないか、又は初期徴候だけを示している対象者に施される治療である。予防的又は防止的治療は、疾患又は障害の発症に関連した病変の発症のリスクを減少させる目的で施される。
「プライマー」は、指定のポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリダイズし、かつ相補的ポリヌクレオチドの合成のための開始点を提供することができるポリヌクレオチドを指す。そのような合成は、合成が誘導される条件下に(すなわちヌクレオチド、相補的ポリヌクレオチド鋳型、及びDNAポリメラーゼのような重合のための作用薬の存在下に)ポリヌクレオチドプライマーが置かれたときに生じる。プライマーは典型的には一本鎖で
あるが、二本鎖であってもよい。プライマーは典型的にはデオキシリボ核酸であるが、種々様々な合成プライマー及び天然に存在するプライマーが数多くの適用に有用である。プライマーは、該プライマーがハイブリダイズして合成の開始のための部位としての役割を果たすように設計された鋳型に相補的であるが、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。そのような場合、鋳型へのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、例えば、色原体の、放射性の、又は蛍光性の構成部分を用いて標識可能であり、かつ検出可能な構成部分として使用可能である。
あるが、二本鎖であってもよい。プライマーは典型的にはデオキシリボ核酸であるが、種々様々な合成プライマー及び天然に存在するプライマーが数多くの適用に有用である。プライマーは、該プライマーがハイブリダイズして合成の開始のための部位としての役割を果たすように設計された鋳型に相補的であるが、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。そのような場合、鋳型へのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、例えば、色原体の、放射性の、又は蛍光性の構成部分を用いて標識可能であり、かつ検出可能な構成部分として使用可能である。
本明細書中で使用されるように、用語「プロモーター/調節配列」は、該プロモーター/調節配列に作動可能なように連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。いくつかの実例では、この配列はコアプロモーター配列であってもよく、また他の実例では、この配列はさらにエンハンサー配列及び遺伝子産物の発現に必要な他の調節要素も含みうる。プロモーター/調節配列は、例えば、組織特異的な方式で遺伝子産物を発現するものであってもよい。
「構成的」プロモーターとは、該プロモーターが作動可能なように連結された遺伝子の発現を細胞内で常時駆動するプロモーターである。例を挙げると、細胞のハウスキーピング遺伝子の発現を駆動するプロモーターは構成的プロモーターであると考えられる。
「誘導型」プロモーターとは、遺伝子産物をコード又は指定するポリヌクレオチドと作動可能なように連結された時、該プロモーターに対応する誘導物質が生細胞内に存在する場合にほぼ限ってその細胞の中で遺伝子産物が生産されるようにするヌクレオチド配列である。
「組織特異的」プロモーターとは、遺伝子産物をコード又は指定するポリヌクレオチドと作動可能なように連結された時、生細胞が該プロモーターに対応する組織種の細胞である場合にほぼ限ってその細胞の中で遺伝子産物が生産されるようにするヌクレオチド配列である。
「予防的」治療とは、疾患の徴候を示さないか又は該疾患の初期徴候のみを示す対象者に、該疾患に関連した病変の発症のリスクを減少させる目的で施される治療である。
本明細書中で使用されるように、末端アミノ基に関する「保護基」は、ペプチドの末端アミノ基であって、ペプチド合成において伝統的に使用される様々なアミノ末端基保護基のうち任意のものと結合された末端アミノ基を指す。そのような保護基には、例えば、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニル、及びメトキシスクシニルのようなアシル保護基;ベンジルオキシカルボニルのような芳香族ウレタン保護基;並びに脂肪族ウレタン保護基、例えばターシャリ‐ブトキシカルボニル又はアダマンチルオキシカルボニルが挙げられる。適当な保護基については、グロス(Gross)及びミーンホファー(Mienhofer)編、「ザ・ペプチド(The Peptides)」、米国ニューヨークのアカデミックプレス(Academic Press)、1981年、第3巻、pp.3−88を参照されたい。
本明細書中で使用されるように、末端アミノ基に関する「保護基」は、ペプチドの末端アミノ基であって、ペプチド合成において伝統的に使用される様々なアミノ末端基保護基のうち任意のものと結合された末端アミノ基を指す。そのような保護基には、例えば、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニル、及びメトキシスクシニルのようなアシル保護基;ベンジルオキシカルボニルのような芳香族ウレタン保護基;並びに脂肪族ウレタン保護基、例えばターシャリ‐ブトキシカルボニル又はアダマンチルオキシカルボニルが挙げられる。適当な保護基については、グロス(Gross)及びミーンホファー(Mienhofer)編、「ザ・ペプチド(The Peptides)」、米国ニューヨークのアカデミックプレス(Academic Press)、1981年、第3巻、pp.3−88を参照されたい。
本明細書中で使用されるように、末端カルボキシ基に関する「保護基」は、ペプチドの末端カルボキシル基であって、様々なカルボキシル末端保護基のうち任意のものと結合された末端カルボキシル基を指す。そのような保護基には、例えば、ターシャリ‐ブチル、ベンジル又はエステル結合若しくはエーテル結合によって末端カルボキシル基に連結される他の許容可能な基が挙げられる。
用語「タンパク質」は典型的には大きなポリペプチドを指す。本明細書中ではポリペプ
チド配列を表現するために従来の表記法が使用される、すなわち:ポリペプチド配列の左側端はアミノ末端であり;ポリペプチド配列の右側端はカルボキシル末端である。
チド配列を表現するために従来の表記法が使用される、すなわち:ポリペプチド配列の左側端はアミノ末端であり;ポリペプチド配列の右側端はカルボキシル末端である。
用語「タンパク質調節経路」は、本明細書中で使用されるように、タンパク質を調節する上流の調節経路に加えて、そのタンパク質が調節する下流のイベントの両方を指す。そのような調節には、限定するものではないが、対象とするタンパク質の転写、翻訳、レベル、活性、翻訳後修飾、及び機能、並びに該タンパク質が調節する下流のイベントが挙げられる。
用語「タンパク質経路」及び「タンパク質調節経路」は、本明細書中で互換的に使用される。
「前地帯」又は「前地帯効果」は、「フック効果」とも呼ばれ、凝集反応又は沈降反応において、前地帯又はプレゾーンが、反応の生じない比較的高い抗体濃度の地帯である場合である。例えば、凝集試験では、人の血清(抗体を含有している)が特定の抗原が入った試験管に添加される。人の血清中には多種類の異なる抗体が存在し、また試験管内に存在する抗原に結合することになる1つの特定の抗体があることも考えられる。抗原に結合しない他の種類の抗体も存在する。抗体抗原複合体は凝集体を形成する。場合によっては、特定の抗原に対して特異的な抗体の濃度が他の種類の抗体と比較して過度に低く、そうなった場合、ごく少量の生じた凝集反応は、より大きな結合していない抗体の集合体によって覆い隠されることになり、かつ該混合物は液体のままとなる。生じた凝集反応は非可視であり、これは前地帯と呼ばれる。これは偽陰性の結果をもたらす可能性がある。したがって、各凝集試験では、凝集反応が見られるまで、抗体抗原混合物の希釈があるレベルまで行われるか、そうでなければ該試験は陰性である。前地帯効果は、間接的免疫毒素実験においても見られ、該実験では過剰量の遊離の一次抗体が、1)二次免疫毒素に非結合のままの抗体による細胞表面の受容体の占拠及び飽和、並びに2)受容体(SAS1B)と結合するために細胞表面に到達することのない一次抗体‐免疫毒素複合体の溶液中での形成をもたらす。前地帯効果に注目すると、標的指向型の抗体の生物学的効果(成長停止)は典型的には、一次抗体及び二次免疫毒素の等価な化学量論比に近づくにつれて観察される。
「前地帯」又は「前地帯効果」は、「フック効果」とも呼ばれ、凝集反応又は沈降反応において、前地帯又はプレゾーンが、反応の生じない比較的高い抗体濃度の地帯である場合である。例えば、凝集試験では、人の血清(抗体を含有している)が特定の抗原が入った試験管に添加される。人の血清中には多種類の異なる抗体が存在し、また試験管内に存在する抗原に結合することになる1つの特定の抗体があることも考えられる。抗原に結合しない他の種類の抗体も存在する。抗体抗原複合体は凝集体を形成する。場合によっては、特定の抗原に対して特異的な抗体の濃度が他の種類の抗体と比較して過度に低く、そうなった場合、ごく少量の生じた凝集反応は、より大きな結合していない抗体の集合体によって覆い隠されることになり、かつ該混合物は液体のままとなる。生じた凝集反応は非可視であり、これは前地帯と呼ばれる。これは偽陰性の結果をもたらす可能性がある。したがって、各凝集試験では、凝集反応が見られるまで、抗体抗原混合物の希釈があるレベルまで行われるか、そうでなければ該試験は陰性である。前地帯効果は、間接的免疫毒素実験においても見られ、該実験では過剰量の遊離の一次抗体が、1)二次免疫毒素に非結合のままの抗体による細胞表面の受容体の占拠及び飽和、並びに2)受容体(SAS1B)と結合するために細胞表面に到達することのない一次抗体‐免疫毒素複合体の溶液中での形成をもたらす。前地帯効果に注目すると、標的指向型の抗体の生物学的効果(成長停止)は典型的には、一次抗体及び二次免疫毒素の等価な化学量論比に近づくにつれて観察される。
本明細書中で使用されるように、用語「精製された」及び同様の用語は、分子又は化合物を、天然の環境においてその分子又は化合物に通常関連付けられている他の成分に対して富化することに関する。用語「精製された」は、そのプロセスの間に特定の分子の完全な純度が達成されたことを必ずしも示さない。本明細書中で使用されるような「高度に精製された」化合物は、90%を超える純粋な化合物を指す。特に、精製された精細胞DNAは、その精製された精細胞DNAのPCR増幅及びその後の増幅DNAの分析において検出可能な有意なレベルの非精細胞DNAを生産しないDNAを指す。「検出可能な有意なレベル」とは、提示されるデータにおいて可視的ということになり、かつ法医学的証拠の分析の際には対処/説明がなされる必要があるであろう混入物質(contaminate)の量である。
「組換えポリヌクレオチド」は、天然においては相互に接合されていない配列を有するポリヌクレオチドを指す。増幅又はアセンブリされた組換えポリヌクレオチドは適当なベクターに含められてもよく、該ベクターは適当な宿主細胞を形質転換するために使用可能である。
組換えポリヌクレオチドは非コード機能(例えばプロモーター、複製開始点、リボソーム結合部位など)も同様に果たすことができる。
組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は「組換え宿主細胞」と呼ばれる。組換え宿主細胞において発現される、組換えポリヌクレオチドを含む遺伝子は、「組換えポリペプチ
ド」を生産する。
組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は「組換え宿主細胞」と呼ばれる。組換え宿主細胞において発現される、組換えポリヌクレオチドを含む遺伝子は、「組換えポリペプチ
ド」を生産する。
「組換えポリペプチド」は、組換えポリヌクレオチドの発現で生産されるポリペプチドである。
「受容体」はリガンドに特異的に結合する化合物である。
「受容体」はリガンドに特異的に結合する化合物である。
「リガンド」は標的受容体に特異的に結合する化合物である。
「組換え細胞」は、導入遺伝子を含む細胞である。そのような細胞は真核生物の細胞であってもよいし、原核生物の細胞であってもよい。さらに、トランスジェニック細胞は、限定するものではないが、導入遺伝子を含む胚性幹細胞、導入遺伝子を含むトランスジェニック胚性幹細胞由来のキメラの哺乳動物から得られた細胞、トランスジェニック哺乳動物又はその胎児組織若しくは胎盤組織から得られた細胞、及び導入遺伝子を含む原核細胞、を包含する。
「組換え細胞」は、導入遺伝子を含む細胞である。そのような細胞は真核生物の細胞であってもよいし、原核生物の細胞であってもよい。さらに、トランスジェニック細胞は、限定するものではないが、導入遺伝子を含む胚性幹細胞、導入遺伝子を含むトランスジェニック胚性幹細胞由来のキメラの哺乳動物から得られた細胞、トランスジェニック哺乳動物又はその胎児組織若しくは胎盤組織から得られた細胞、及び導入遺伝子を含む原核細胞、を包含する。
用語「調節する」は、対象とする機能又は活性を、刺激すること又は阻害することのいずれかを指す。
本明細書中で使用されるように、用語「レポーター遺伝子」は、既知の方法を使用してその発現を検出することができる遺伝子を意味する。例を挙げると、大腸菌(Escherichia coli)のlacZ遺伝子は、色素形成基質であるo‐ニトロフェニル‐β‐ガラクトシドを培地に加えることにより既知の方法を使用してlacZ遺伝子の発現を検出可能であることから、培地中のレポーター遺伝子として使用される場合がある(ゲルハルト(Gerhardt)ら編、「一般分子細菌学のための方法(Methods
for General and Molecular Bacteriology)」、米国ワシントンDCの米国微生物学会、1994年、p.574)。
本明細書中で使用されるように、用語「レポーター遺伝子」は、既知の方法を使用してその発現を検出することができる遺伝子を意味する。例を挙げると、大腸菌(Escherichia coli)のlacZ遺伝子は、色素形成基質であるo‐ニトロフェニル‐β‐ガラクトシドを培地に加えることにより既知の方法を使用してlacZ遺伝子の発現を検出可能であることから、培地中のレポーター遺伝子として使用される場合がある(ゲルハルト(Gerhardt)ら編、「一般分子細菌学のための方法(Methods
for General and Molecular Bacteriology)」、米国ワシントンDCの米国微生物学会、1994年、p.574)。
「試料」は、本明細書中で使用されるように、好ましくは、対象者由来の生体試料、例えば、限定するものではないが、正常組織試料、病変組織試料、生検、血液、唾液、糞便、精液、涙液、及び尿を指す。試料はさらに、対象とする細胞、組織、又は体液を含有する、対象者から得られた任意の他の材料供給源であってもよい。試料は細胞又は組織の培養物から得ることも可能である。
本明細書中で使用されるような用語「SAS1B陽性のがん」とは、がんの細胞がSAS1Bを発現するか又は含むがんを指す。「SAS1B陽性のがん」及び「SAS1R陽性のがん」という用語は本明細書中において互換的に使用される。該用語は提示されたような文脈で使用されるべきであり、かつ細胞表面上にSAS1Bを備えた細胞を含みうるとともに、場合よっては、SAS1BのmRNA若しくはタンパク質、又は選択的スプライシングに起因する様々な配列を備えたペプチドを発現する細胞を指す場合もある。
「SLLP1」及びSLLP2」は、それぞれ「C19」及び「C23」とも呼ばれる。
本明細書中で使用されるように、用語「二次抗体」は、別の抗体(一次抗体)の不変領域に結合する抗体を指す。
本明細書中で使用されるように、用語「二次抗体」は、別の抗体(一次抗体)の不変領域に結合する抗体を指す。
用語「シグナル配列」が意味するのは、ポリペプチドが細胞内部で取る進路を指図するペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であり、すなわち該ペプチドは、細胞内でのポリペプチドの細胞内プロセシング、例えば、限定するものではないが、細胞からのポリペプチドの最終的な分泌を指図する。シグナル配列は、小胞体へ向けたポリペプチドの合成を標的とする、典型的には(ただし例外がないわけではないが)ポリペプチドのアミノ末端に見出されるアミノ酸の配列である。いくつかの実例では、シグナルペプチドはタンパク質分解によりポリペプチドから取り除かれ、よって成熟型タンパク質には存在しない
。
。
「低分子干渉RNA(siRNA)」が意味するのは、とりわけ、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方で構成されている単離dsRNA分子である。1つの態様では、低分子干渉RNAは長さが10ヌクレオチドより大きい。siRNAはさらに、標的遺伝子由来のセンス配列及び相補的アンチセンス配列の両方を有する単一の転写物(例えばヘアピン)を指す。siRNAは、任意の形態のdsRNA(より大きなdsRNAのタンパク質分解により開裂された生成物、部分精製されたRNA、ほぼ純粋なRNA、合成RNA、組換え生成されたRNA)のほかに、1つ以上のヌクレオチドの追加、欠失、置換、及び変質のうち少なくともいずれかにより天然に存在するRNAとは異なっている変形RNAをさらに含む。
本明細書中で使用されるように、用語「固体支持体」は、様々な化合物と連結(好ましくは共有結合)を形成することができる、溶媒不溶性の基体に関する。該支持体は、生物学的な性質であるもの、例えば、限定するものではないが、細胞又はバクテリオファージ粒子であってもよいし、合成物、例えば、限定するものではないが、アクリルアミド誘導体、アガロース、セルロース、ナイロン、シリカ、又は磁化粒子であってもよい。
用語「〜に特異的に結合する」が意味するのは、本明細書中で使用されるように、化合物又はリガンドが、多種多様な化合物の試料中における該化合物の存在を決定するような結合反応又はアッセイ条件において機能する時である。
用語「標準(物)」は、本明細書中で使用されるように、比較に使用されるものを指す。例えばそれは、試験化合物を投与する時に結果を比較するために投与及び使用される、既知の標準作用薬又は化合物であってもよいし、パラメータ又は機能に対する作用薬又は化合物の影響を測定する時に対照値を得るために測定される、標準パラメータ又は機能であってもよい。標準はさらに、「内部標準」、例えば、作用薬又は化合物であって試料に既知量で添加され、対象とするマーカーが測定される前に試料が処理されるか又は精製若しくは抽出の手順に供される場合に精製率又は回収率のような状況を決定するのに有用な、作用薬又は化合物を指すこともできる。内部標準は多くの場合、例えば放射性同位体を用いて標識済みであって内因性のマーカーとは区別されることが可能になっている、対象の精製されたマーカーである。
分析、診断、又は治療の「対象者」は動物である。そのような動物には、哺乳動物、好ましくはヒトが挙げられる。
本明細書中で使用されるように、「それを必要とする対象者」とは、本発明の方法から利益を得るであろう患者、動物、哺乳動物、又はヒトである。
本明細書中で使用されるように、「それを必要とする対象者」とは、本発明の方法から利益を得るであろう患者、動物、哺乳動物、又はヒトである。
本明細書中で使用されるように、「ほぼ相同なアミノ酸配列」には、参照抗体鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%の相同性、好ましくは少なくとも約96%の相同性、より好ましくは少なくとも約97%の相同性、さらにより好ましくは少なくとも約98%の相同性、及び最も好ましくは少なくとも約99%以上の相同性を有するアミノ酸配列が含まれる。アミノ酸配列の類似性又は同一性は、BLAST(basic local
alignment search tool)2.0.14アルゴリズムを使用するBLASTP及びTBLASTNプログラムの使用によりコンピュータ計算可能である。これらのプログラムに使用されるデフォルト設定は、本発明の目的でほぼ同様のアミノ酸配列を同定するのに適している。
alignment search tool)2.0.14アルゴリズムを使用するBLASTP及びTBLASTNプログラムの使用によりコンピュータ計算可能である。これらのプログラムに使用されるデフォルト設定は、本発明の目的でほぼ同様のアミノ酸配列を同定するのに適している。
「ほぼ相同な核酸配列」とは、参照核酸配列に対応する核酸配列であって、参照核酸配列によってコードされたペプチドとほぼ同じ構造及び機能を有する(例えば該ペプチドの
機能にあまり影響しないアミノ酸の変化のみは生じる)ペプチドをコードする、対応配列を意味する。好ましくは、ほぼ同一の核酸配列は、参照核酸配列によってコードされたペプチドをコードする。ほぼ同様の核酸配列と参照核酸配列との間の同一性の比率(%)は、少なくとも約50%、65%、75%、85%、95%、99%又はそれ以上である。核酸配列の実質同一性は、2つの配列の配列同一性の比較により、例えば物理的/化学的方法(すなわちハイブリダイゼーション)により、又はコンピュータアルゴリズムによる配列アラインメントにより、決定可能である。ヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列とほぼ同様であるかどうかを決定するための適当な核酸ハイブリダイゼーション条件は:50℃の7%ドデシル硫酸ナトリウムSDS、0.5M NaPO4、1mM EDTAに、50℃の2×標準クエン酸添加生理食塩水(SSC)、0.1% SDS中での洗浄を伴う条件;好ましくは50℃の7%(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTAに、50℃の1×SSC、0.1% SDS中での洗浄を伴う条件;好ましくは50℃の7%SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTAに、50℃の0.5×SSC、0.1%のSDS中での洗浄を伴う条件;及びより好ましくは50℃の7%SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTAに、65℃の0.1×SSC、0.1%のSDS中での洗浄を伴う条件、である。2つの核酸配列の間の実質類似性を決定するための適当なコンピュータアルゴリズムには、GCSプログラムパッケージ(デヴェルー(Devereux)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)、1984年、第12巻、p.387)及びBLASTN又はFASTAプログラム(アルトシュル(Altschul)ら、米国科学アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、1990年、第87巻、第14号、p.5509−13;アルトシュル(Altschul)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.)、1990年、第215巻、第3号、p.403−410;アルトシュル(Altschul)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)、1997年、第25巻、p.3389−3402)、が挙げられる。これらのプログラムと共に提供されるデフォルト設定は、本発明の目的で核酸配列の実質類似性を決定するのに適している。
機能にあまり影響しないアミノ酸の変化のみは生じる)ペプチドをコードする、対応配列を意味する。好ましくは、ほぼ同一の核酸配列は、参照核酸配列によってコードされたペプチドをコードする。ほぼ同様の核酸配列と参照核酸配列との間の同一性の比率(%)は、少なくとも約50%、65%、75%、85%、95%、99%又はそれ以上である。核酸配列の実質同一性は、2つの配列の配列同一性の比較により、例えば物理的/化学的方法(すなわちハイブリダイゼーション)により、又はコンピュータアルゴリズムによる配列アラインメントにより、決定可能である。ヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列とほぼ同様であるかどうかを決定するための適当な核酸ハイブリダイゼーション条件は:50℃の7%ドデシル硫酸ナトリウムSDS、0.5M NaPO4、1mM EDTAに、50℃の2×標準クエン酸添加生理食塩水(SSC)、0.1% SDS中での洗浄を伴う条件;好ましくは50℃の7%(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTAに、50℃の1×SSC、0.1% SDS中での洗浄を伴う条件;好ましくは50℃の7%SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTAに、50℃の0.5×SSC、0.1%のSDS中での洗浄を伴う条件;及びより好ましくは50℃の7%SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTAに、65℃の0.1×SSC、0.1%のSDS中での洗浄を伴う条件、である。2つの核酸配列の間の実質類似性を決定するための適当なコンピュータアルゴリズムには、GCSプログラムパッケージ(デヴェルー(Devereux)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)、1984年、第12巻、p.387)及びBLASTN又はFASTAプログラム(アルトシュル(Altschul)ら、米国科学アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、1990年、第87巻、第14号、p.5509−13;アルトシュル(Altschul)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.)、1990年、第215巻、第3号、p.403−410;アルトシュル(Altschul)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)、1997年、第25巻、p.3389−3402)、が挙げられる。これらのプログラムと共に提供されるデフォルト設定は、本発明の目的で核酸配列の実質類似性を決定するのに適している。
「ほぼ純粋な」という用語は、化合物、例えばタンパク質又はポリペプチドであって、天然において該化合物に伴う成分から分離されたものについて述べている。典型的には、化合物は、試料中の全材料のうち少なくとも10%、より好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも90%、及び最も好ましくは少なくとも99%(体積比、湿重量比若しくは乾燥重量比、又はモル百分率若しくはモル分率)が対象の化合物であるとき、ほぼ純粋である。純度は任意の適切な方法によって、例えばポリペプチドの場合にはカラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、又はHPLC解析によって、測定可能である。化合物、例えばタンパク質は、該化合物が天然において関連している成分を本質的に含まない場合、又は該化合物がその天然状態において該化合物に伴う天然の混在物質から分離されている場合も、ほぼ精製されている。
用語「症状」は、本明細書中で使用されるように、患者によって経験され、かつ疾患を示している、任意の病的現象、又は構造、機能若しくは感覚における正常からの逸脱を指す。対照的に、「徴候」は疾患の客観的証拠である。例えば、鼻血は徴候である。これは患者、医師、看護士及びその他の観察者にとって明らかに認められる。
「治療的」処置とは、病変の徴候を示す対象者に、それらの徴候を縮小又は除去する目的で施される処置である。
「治療上有効な量」の化合物とは、該化合物が投与される対象者に有益な効果を提供するのに十分な化合物の量である。
「治療上有効な量」の化合物とは、該化合物が投与される対象者に有益な効果を提供するのに十分な化合物の量である。
本明細書中で使用されるように、用語「導入遺伝子」とは、アミノ酸配列をコードする核酸に作動可能なように連結されたプロモーター/調節配列をコードする核酸を含む外来の核酸配列であって、トランスジェニック哺乳動物によってコードされる外来の核酸を意味する。
本明細書中で使用されるように、用語「トランスジェニック哺乳動物」とは、その生殖細胞が外来の核酸を含む哺乳動物を意味する。
本明細書中で使用されるように、「トランスジェニック細胞」とは、導入される核酸配列によってコードされた遺伝子の発現を可能にする方式で細胞内に導入された核酸配列を含む、任意の細胞である。
本明細書中で使用されるように、「トランスジェニック細胞」とは、導入される核酸配列によってコードされた遺伝子の発現を可能にする方式で細胞内に導入された核酸配列を含む、任意の細胞である。
用語「治療する(処置する)」とは、本明細書中で使用されるように、患者若しくは対象者によって経験される症状の頻度を低減すること、又は経験される症状の頻度を低減するために作用薬若しくは化合物を投与することを意味する。
「予防的」治療とは、疾患の徴候を示さないか又は該疾患の初期徴候だけを示す対象者に、該疾患に関連した病変を発症するリスクを減少させる目的で施される治療である。
用語「ワクチン」が意味するのは、本明細書中で使用されるように、組成物であって、対象者に接種された時に該対象者の免疫応答を刺激する効果を有し、該免疫応答はある身体状態、疾患又はその症状から対象者を完全又は部分的に防御する役割を果たす、組成物である。1つの態様では、身体状態は受胎である。ワクチンという用語は予防ワクチンのほかに治療ワクチンも包含する。混合ワクチンとは、2以上のワクチン、又は2以上の化合物若しくは作用薬を組み合わせるものである。
用語「ワクチン」が意味するのは、本明細書中で使用されるように、組成物であって、対象者に接種された時に該対象者の免疫応答を刺激する効果を有し、該免疫応答はある身体状態、疾患又はその症状から対象者を完全又は部分的に防御する役割を果たす、組成物である。1つの態様では、身体状態は受胎である。ワクチンという用語は予防ワクチンのほかに治療ワクチンも包含する。混合ワクチンとは、2以上のワクチン、又は2以上の化合物若しくは作用薬を組み合わせるものである。
「ベクター」とは、単離された核酸を含んでなり、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用可能な、材料組成物である。多数のベクターが当分野において知られており、例えば、限定するものではないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性の化合物に関連付けられたポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが挙げられる。よって、用語「ベクター」には自律的に複製するプラスミド又はウイルスが含まれる。該用語は、細胞への核酸の移入又は送達を促進する非プラスミド及び非ウイルスの化合物、例えばポリリジン化合物、リポソームなどを含むとも解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、限定するものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組換えウイルスベクターなどが挙げられる。非ウイルスベクターの例には、限定するものではないが、リポソーム、DNAのポリアミン誘導体などが挙げられる。
「発現ベクター」は、発現されるべきヌクレオチド配列に作動可能なように連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用エレメントを含んでなり;発現のための他の要素は宿主細胞によって供給されてもよいし、in vitro発現系において供給されてもよい。発現ベクターには、例えばコスミド、プラスミド(例えば裸のプラスミド又はリポソームに含まれたプラスミド)及び組換えポリヌクレオチドを組込むウイルスのような、当分野で既知のものすべてが含まれる。
[実施形態]
本発明は、所与のマーカーを有する悪性細胞を有効に殺滅する免疫毒素に関する。免疫毒素とは、細胞毒性薬にコンジュゲートした抗体又はそのフラグメントを含む試薬である。抗体は、選ばれた腫瘍細胞と結合する能力を有することにより、宿主内において免疫毒素の非特異的毒性をほとんどもたらさない。
本発明は、所与のマーカーを有する悪性細胞を有効に殺滅する免疫毒素に関する。免疫毒素とは、細胞毒性薬にコンジュゲートした抗体又はそのフラグメントを含む試薬である。抗体は、選ばれた腫瘍細胞と結合する能力を有することにより、宿主内において免疫毒素の非特異的毒性をほとんどもたらさない。
A. 抗体
抗体とは、分析物(抗原)に特異的に結合しかつこれを認識する、1または複数の免疫グロブリン遺伝子によってほぼコードされたポリペプチド又はそのフラグメントを指す。広く認識されている免疫グロブリン遺伝子には、κ(カッパ)、λ(ラムダ)、α(アルファ)、γ(ガンマ)、δ(デルタ)、ε(イプシロン)及びμ(ミュー)の不変領域遺伝子のほかに、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれている。軽鎖はκ又はλのいずれかとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、又はεとして分類され、ひいては免疫グロブリンのクラスIgG、IgM、IgA、IgD及びIgEをそれぞれ規定する。
抗体とは、分析物(抗原)に特異的に結合しかつこれを認識する、1または複数の免疫グロブリン遺伝子によってほぼコードされたポリペプチド又はそのフラグメントを指す。広く認識されている免疫グロブリン遺伝子には、κ(カッパ)、λ(ラムダ)、α(アルファ)、γ(ガンマ)、δ(デルタ)、ε(イプシロン)及びμ(ミュー)の不変領域遺伝子のほかに、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれている。軽鎖はκ又はλのいずれかとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、又はεとして分類され、ひいては免疫グロブリンのクラスIgG、IgM、IgA、IgD及びIgEをそれぞれ規定する。
典型的な免疫グロブリン(抗体)の構造ユニットは四量体を含む。四量体はそれぞれ、同一の2対のポリペプチド鎖であって、各対が1本の「軽い」鎖(約25kD)及び1本の「重い」鎖(約50〜70kD)を有しているポリペプチド鎖で構成されている。各鎖のN末端は、主として抗原認識を担う約100〜110アミノ酸又はそれ以上の可変領域を規定する。軽鎖可変部(VL)及び重鎖可変部(VH)という用語は、それぞれ上記の軽鎖及び重鎖を指す。
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生産するための様々な方法が当分野で知られている。例えば、ゴーディング(Goding)、「モノクローナル抗体;原理と実践(MONOCLONAL ANTIBODIES; PRINCIPLES AND PRACTICE)」、第2版、アカデミックプレス(Academic Press)、1986年;並びにハーロー(Harlow)及びレーン(Lane)の文献を参照されたい。例えば所望の抗原を発現するヒト細胞に対する、又は同細胞との反応性を有する、モノクローナル抗体は、マウスを免疫化するために免疫原の組み合わせを使用すること及び所望の抗原を発現する細胞に対するハイブリドーマ上清をスクリーニングすることにより、又は、対象とする抗原に対するモノクローナル抗体に特異的であるように設計されたスクリーニングアッセイにより、得られる。本発明の抗体のスクリーニングに有用な細胞株は、容易に利用可能であるか又は容易に得られる。そのような細胞には、バーキットリンパ腫細胞株であるDaudi、及びRajiが挙げられる。
本発明の抗体を合成するために組換えDNAの方法論が使用されてもよい。例えば、ヒトでの使用のための免疫毒素の抗体部分は、ヒトの可変領域フレームワーク及びヒトの不変領域と組み合わされたネズミ科動物の相補性決定領域(CDR)を含有する、細胞抗原に対する「ヒト化」抗体である。
ヒト化(キメラ)抗体はヒト部分及び非ヒト部分を含む免疫グロブリン分子である。より具体的には、ヒト化キメラ抗体の抗原結合領域(又は可変領域)は、ヒト以外の供給源(例えばネズミ科動物)に由来し、該キメラ抗体の不変領域(免疫グロブリンに生物学的エフェクタ機能を与える)は、ヒト供給源に由来する。ヒト化されたキメラ抗体は、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性と、ヒト抗体分子によってもたらされるエフェクタ機能とを有するはずである。キメラ抗体を生成する数多くの方法が当業者に良く知られている(例えば、米国特許第5,502,167号、同第5,500,362号、同第5,491,088号、同第5,482,856号、同第5,472,693号、同第5,354,847号、同第5,292,867号、同第5,231,026号、同第5,204,244号、同第5,202,238号、同第5,169,939号、同第5,081,235号、同第5,075,431号、及び同第4,975,369号明細書を参照されたい)。キメラ(ヒト化)抗体の調製のための詳細な方法は、米国特許第5,482,856号明細書に見出すことができる。
別の実施形態では、本発明は完全なヒト抗体を提供する。ヒト抗体は特徴としてヒトのポリペプチド配列で完全に構成されている。本発明のヒト抗体は種々様々の方法を使用し
て生産可能である(例えばラリック(Larrick)ら、米国特許第5,001,065号明細書を参照されたい)。
て生産可能である(例えばラリック(Larrick)ら、米国特許第5,001,065号明細書を参照されたい)。
本発明の抗体部分は一本鎖抗体であってよい。
本発明のタンパク質、ポリペプチド、又はそれらのペプチドフラグメントに対する抗体は、当分野で良く知られた方法を使用して生成されうる。例えば、米国特許出願第07/481,491号明細書(全体が参照により本願に組込まれる)は、ペプチドに対する抗体を産生させる方法を開示している。抗体の産生のためには、様々な宿主動物、例えば、限定するものではないが、ウサギ、マウス、及びラットが、ポリペプチド又はそのペプチドフラグメントの注射によって免疫化されうる。免疫学的応答を高めるために、宿主動物種に応じて様々なアジュバントが使用可能であり、例えば、限定するものではないがフロイント(完全、不完全)、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リソレシチンのような表面活性物質、pluronic(登録商標)ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール、並びにBCG(カルメット・ゲラン桿菌(bacille Calmette−Guerin))及びコリネバクテリウム・パルヴム(corynebacterium parvum)のような潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。
本発明のタンパク質、ポリペプチド、又はそれらのペプチドフラグメントに対する抗体は、当分野で良く知られた方法を使用して生成されうる。例えば、米国特許出願第07/481,491号明細書(全体が参照により本願に組込まれる)は、ペプチドに対する抗体を産生させる方法を開示している。抗体の産生のためには、様々な宿主動物、例えば、限定するものではないが、ウサギ、マウス、及びラットが、ポリペプチド又はそのペプチドフラグメントの注射によって免疫化されうる。免疫学的応答を高めるために、宿主動物種に応じて様々なアジュバントが使用可能であり、例えば、限定するものではないがフロイント(完全、不完全)、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リソレシチンのような表面活性物質、pluronic(登録商標)ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール、並びにBCG(カルメット・ゲラン桿菌(bacille Calmette−Guerin))及びコリネバクテリウム・パルヴム(corynebacterium parvum)のような潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。
1つの実施形態では、SAS1R又はその相同体若しくはフラグメントに対する抗体、又は抗血清は、SAS1Rが他の分子又は細胞と相互作用する能力を含むSAS1Rの活性を阻止するのに有用である。
SAS1Rのフラグメントが生成されて、該フラグメントに対して抗体が調製されてもよい。アッセイは、SAS1Rに対する抗体、又はそのフラグメントが、SAS1Rを検出し、SAS1R活性を阻害し、又はSAS1R機能を調節する能力を有するかどうか判断するために、本明細書中に提供される。
アッセイは、SAS1RがSLLPタンパク質と結合又は相互作用する能力のほかに、抗体が受精におけるSAS1Rの役割を阻止する能力を測定することを含む。例えば、SAS1Rに対する抗体を使用するin vitroの受精アッセイが本明細書中に記載されており、この種のアッセイは、新たな抗体がSAS1Rの機能を阻止する能力を試験するために使用可能である。これらの同じアッセイは、任意の化合物又は作用薬がSAS1RのSLLPタンパク質との相互作用を妨害するか又は受精を阻害する能力を試験するために使用可能である。SAS1Rプロテアーゼ活性を測定するためのプロテアーゼアッセイも、SAS1Rのフラグメント又は相同体が元のSAS1R分子と同じ活性を維持していることを確認するために必要な場合に利用可能である。
SAS1Rのフラグメントを調製し、SAS1Rに対する抗体を作製する様々な方法が利用可能であり、これらの方法は、抗体による阻害を受けやすいSAS1Rの様々な領域をマッピングするために使用可能である。
例えば、SAS1Rのフラグメントは抗原としての使用のために調製されてもよく、例えばその場合に抗体はSAS1Rバリアント2(配列番号6)のアミノ酸1〜25、26〜50、51〜75、76〜100、101〜125、126〜150、151〜175、176〜200、201〜225、226〜250、251〜275、276〜300、301〜325、326〜350、351〜375、376〜400、及び401〜414を含む多くのフラグメントのうちの1つ(one of more fragments)に結合するか、又は抗体はSAS1Rバリアント1(配列番号19)のアミノ酸1〜25、26〜50、51〜75、76〜100、101〜125、126〜150、151〜175、176〜200、201〜225、226〜250、251〜275、2
76〜300、301〜325、326〜350、351〜375、376〜400、401〜425、及び426〜435を含む1つ以上のフラグメントに結合するか、又は抗体はSAS1Rバリアント1(配列番号23)のアミノ酸1〜25、26〜50、51〜75、76〜100、101〜125、126〜150、151〜175、176〜200、201〜225、226〜250、251〜275、276〜300、301〜325、326〜350、351〜375、376〜400、401〜425、及び426〜431に結合する。本発明は、アミノ酸残基1〜20、21〜40、41〜60などのような20アミノ酸を含むフラグメントをさらに包含する。そのような技法は完全長のタンパク質にも適用可能である。
76〜300、301〜325、326〜350、351〜375、376〜400、401〜425、及び426〜435を含む1つ以上のフラグメントに結合するか、又は抗体はSAS1Rバリアント1(配列番号23)のアミノ酸1〜25、26〜50、51〜75、76〜100、101〜125、126〜150、151〜175、176〜200、201〜225、226〜250、251〜275、276〜300、301〜325、326〜350、351〜375、376〜400、401〜425、及び426〜431に結合する。本発明は、アミノ酸残基1〜20、21〜40、41〜60などのような20アミノ酸を含むフラグメントをさらに包含する。そのような技法は完全長のタンパク質にも適用可能である。
当然ながら、これらのフラグメントは、部分的に重なる配列を生じるように調製されることも可能であり、より長いフラグメント及びより短いフラグメントも調製可能である。例えば、本明細書中に記載されるように、SLLP1とSAS1Rとの間の相互作用実験は、これらが相互作用するときに該2つのタンパク質の間に、異なる機能を有する可能性のある少なくとも2つの結合領域があることを示している。そこで、SAS1Rのより長いN末端領域またはSAS1Rのより長いC末端領域の区域を包含するフラグメントが調製されてもよく、例えばその場合に抗体はアミノ酸の約1〜約121(N末端)に結合するか、又はSAS1R(配列番号6)の約204〜約414(より長いC末端)に結合する抗体若しくは配列番号23(ヒトSAS1R)の類似領域に結合する抗体である。
本発明のタンパク質の抗原フラグメントは、長さが少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、又は最大約200アミノ酸であるペプチド抗原を含みうる。さらに、完全長のプロセシングを受けていないタンパク質及び成熟したプロセシング済みタンパク質も含まれる。これらの様々な長さの抗原フラグメントは、SAS1Rのような選択免疫原の線状アミノ酸配列の直列順に設計されてもよいし、該タンパク質の線状配列内でずれが設けられてもよい。加えて、三次元のエピトープ、すなわち非線状のエピトープに対する抗体も、例えばタンパク質の結晶学的データに基づいて、調製可能である。所望の標的配列を包含する様々な長さのペプチドが宿主に注射されてもよい。その注射から得られた抗体は、SAS1Rの短い抗原について、また成熟型SAS1Rについて、スクリーニングされうる。SAS1Rペプチドに対して調製された抗体は、そのペプチドのほかに完全長SAS1Rタンパク質に対する活性に関して試験されうる。抗体は、SAS1Rペプチド及び完全長SAS1Rタンパク質のうち少なくともいずれかに対して少なくとも約10−6M、10−7M、10−8M、10−9M、10−10M、10−11M、又は10−12Mの親和性を有しうる。
1つの実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物を含む治療用がんワクチンを提供し、前記組成物は、配列番号6、8、10、19、20、及び23で構成されている群から選択されたアミノ酸配列、並びに前記アミノ酸配列のフラグメント及び相同体を含む、1つ以上のタンパク質、又は前記タンパク質のバリアント、相同体、若しくはフラグメントと、任意選択で少なくとも1つの他の卵子タンパク質、又は前記卵子タンパク質のバリアント、フラグメント、若しくは相同体と、を含む。
正常細胞ではSAS1Rの発現は一時的に調節されるので、殺滅される可能性のあるいかなる細胞も初期段階の生殖細胞を含まない。
モノクローナル抗体の調製については、培養物中の連続細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技術が利用されうる。例えば、ケーラー(Kohler)及びミルシテイン(Milstein)によって初めに開発されたハイブリドーマ技法(ネイチャー(Nature)、1975年、第256巻、p.495−497)、トリオーマ技法、ヒト
B細胞ハイブリドーマ技法(コズボール(Kozbor)ら、イムノロジー・トゥデイ(Immunology Today)、1983年、免疫学、第4巻、p.72)、並びにEBVハイブリドーマ技法(コール(Cole)ら、「モノクローナル抗体及びがん治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)」、アランR.リス社(Alan R. Liss, Inc.)、1985年、p.77−96)は、ヒトモノクローナル抗体を生産するために使用されうる。別の実施形態では、モノクローナル抗体は無菌動物で生産される。
モノクローナル抗体の調製については、培養物中の連続細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技術が利用されうる。例えば、ケーラー(Kohler)及びミルシテイン(Milstein)によって初めに開発されたハイブリドーマ技法(ネイチャー(Nature)、1975年、第256巻、p.495−497)、トリオーマ技法、ヒト
B細胞ハイブリドーマ技法(コズボール(Kozbor)ら、イムノロジー・トゥデイ(Immunology Today)、1983年、免疫学、第4巻、p.72)、並びにEBVハイブリドーマ技法(コール(Cole)ら、「モノクローナル抗体及びがん治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)」、アランR.リス社(Alan R. Liss, Inc.)、1985年、p.77−96)は、ヒトモノクローナル抗体を生産するために使用されうる。別の実施形態では、モノクローナル抗体は無菌動物で生産される。
本発明に従って、ヒト抗体は、ヒトハイブリドーマの利用(コート(Cote)ら、米国科学アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)、1983年、第80巻、p.2026−2030)により、又はin vitroでのEBVウイルスを用いたヒトB細胞の形質転換(コール(Cole)ら、「モノクローナル抗体及びがん治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)」、アランR.リス社(Alan R. Liss, Inc.)、1985年、p.77−96)により、使用及び入手されうる。更に、SLLPポリペプチドのエピトープに特異的なマウス抗体分子からの遺伝子を適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に組み継ぎすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技法(モリソン(Morrison)ら、米国科学アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)、1984年、第81巻、p.6851−6855;ニューバーガー(Neuberger)ら、ネイチャー(Nature)、1984年、第312巻、p.604−608;タケダ(Takeda)ら、ネイチャー(Nature)、1985年、第314巻、p.452−454)が使用可能であり;そのような抗体は本発明の範囲内にある。特異的モノクローナル抗体が開発されてしまえば、従来の技法による前記抗体の突然変異体及びバリアントの調製も利用可能である。
1つの実施形態では、一本鎖抗体の生産について記載された技法(米国特許第4,946,778号明細書、参照により全体が本願に組み込まれる)は、タンパク質特異的な一本鎖抗体を生産するようになされている。別の実施形態では、Fab発現ライブラリの構築について記載された技法(ヒュース(Huse)ら、サイエンス(Science)、1989年、第246巻、p.1275−1281)は、本発明の特異的な抗原、タンパク質、誘導体、又はアナログについて所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするために利用される。
抗体分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、既知の技法によって生成可能である。例えば、そのようなフラグメントには、限定するものではないが:抗体分子のペプシン消化によって生産可能なF(ab’)2フラグメント;F(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋の還元により生成可能なFab’フラグメント;抗体分子をパパイン及び還元剤で処理することにより生成可能なFabフラグメント;並びにFvフラグメントが挙げられる。
ポリクローナル抗体の生成は、所望の動物に抗原を接種すること、及び該動物から抗原に特異的に結合する抗体を単離することにより遂行される。
タンパク質又はペプチドの完全長又はペプチドフラグメントに対するモノクローナル抗体は、例えばハーロー(Harlow)らの文献(「抗体、実験の手引き(Antibodies, A Laboratory Manual)」、米国ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、1988年)、及びタスジンスキー(Tuszynski)らの文献(ブラッド(Blood)、1988年、第72巻、p.109−115)に記載されたもののような、任意の良く知られたモノクローナル抗体調製手順を使用して調製されうる。多量の所望ペプチドが化学合成技
術を使用して合成されることも可能である。別例として、所望のペプチドをコードするDNAがクローニングされて、ペプチドの大量生成に適した細胞内で適切なプロモータ配列から発現されてもよい。該ペプチドに対するモノクローナル抗体は、本明細書中で参照されるような標準的手順を使用して該ペプチドで免疫化されたマウスから生成される。
タンパク質又はペプチドの完全長又はペプチドフラグメントに対するモノクローナル抗体は、例えばハーロー(Harlow)らの文献(「抗体、実験の手引き(Antibodies, A Laboratory Manual)」、米国ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、1988年)、及びタスジンスキー(Tuszynski)らの文献(ブラッド(Blood)、1988年、第72巻、p.109−115)に記載されたもののような、任意の良く知られたモノクローナル抗体調製手順を使用して調製されうる。多量の所望ペプチドが化学合成技
術を使用して合成されることも可能である。別例として、所望のペプチドをコードするDNAがクローニングされて、ペプチドの大量生成に適した細胞内で適切なプロモータ配列から発現されてもよい。該ペプチドに対するモノクローナル抗体は、本明細書中で参照されるような標準的手順を使用して該ペプチドで免疫化されたマウスから生成される。
本明細書中に記載された手順を使用して得られたモノクローナル抗体をコードする核酸は、当分野において利用可能であり例えばライト(Wright)らの文献(クリティカル・レビューズ・イン・イムノロジー(Critical Rev. in Immunol.)、1992年、第12巻、第3、4号、p.125−168)及び本明細書中で引用される参照文献に記載された技術を使用して、クローニング及び塩基配列決定がなされうる。さらに、本発明の抗体は、ライト(Wright)らの文献(上述)及び本明細書中で引用される参照文献、並びにグ(Gu)らの文献(トロンボシス・アンド・ヘマトシスト(Thrombosis and Hematocyst)、1997年、第77巻、第4号、p.755−759)に記載された技術を使用して、「ヒト化」されてもよい。
ファージ抗体ライブラリを生成するために、最初に、ファージ表面で発現されるべき所望のタンパク質(例えば所望の抗体)を発現する細胞(例えばハイブリドーマ)から単離されたmRNAからcDNAライブラリが得られる。該mRNAのcDNA複写物は逆転写酵素を使用して生産される。免疫グロブリンフラグメントを指定するcDNAはPCRによって得られ、生じたDNAは適当なバクテリオファージベクターにクローニングされて、免疫グロブリン遺伝子を指定するDNAを含むバクテリオファージDNAライブラリが生成される。異種由来のDNAを含むバクテリオファージライブラリを作製するための手順は当分野において良く知られており、例えば、サムブルック(Sambrook)らの文献(「分子クローニング:実験の手引き(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」、米国ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、1989年)に記載されている。
所望の抗体をコードするバクテリオファージは、タンパク質がその対応する結合タンパク質(例えば抗体が対象とする抗原)への結合に利用可能であるような状態で該タンパク質がバクテリオファージの表面に提示されるように、人為操作されうる。よって、特異的抗体を発現するバクテリオファージが対応する抗原を発現する細胞の存在下でインキュベートされると、該バクテリオファージは該細胞に結合することになる。抗体を発現しないバクテリオファージは細胞に結合しないことになる。そのようなパニング技法は当分野において良く知られている。
上述されたもののようなプロセスは、M13バクテリオファージディスプレイを使用したヒト抗体の生産用に開発されてきた(バートン(Burton)ら、アドバンシズ・イン・イムノロジー(Adv. Immunol.)、1994年、第57巻、p.191−280)。本質的に、cDNAライブラリは抗体産生細胞の集団から得られたmRNAから生成される。該mRNAは再構成された免疫グロブリン遺伝子をコードし、よってcDNAも同じものをコードする。増幅されたcDNAはM13発現ベクターにクローニングされて、表面にヒトFabフラグメントを発現するファージのライブラリを作出する。対象とする抗体をディスプレイするファージは抗原結合によって選択され、可溶性のヒトFab免疫グロブリンを生産するために細菌で増殖せしめられる。このように、従来のモノクローナル抗体の合成とは対照的に、この手順はヒト免疫グロブリンを発現する細胞ではなくヒト免疫グロブリンをコードするDNAを不死化する。
直前に提示した手順は、抗体分子のFab部分をコードするファージの生成について述
べている。しかしながら、本発明は単にFab抗体をコードするファージの生成のみに限定されるように解釈されるべきではない。それどころか、一本鎖抗体をコードするファージ(scFv/ファージ抗体ライブラリ)も本発明に含まれる。Fab分子はIg軽鎖全体を含む、すなわち、軽鎖の可変領域及び不変領域の両方を含むが、重鎖については可変領域及び第1の不変領域ドメイン(CH1)のみを備えている。一本鎖抗体分子は、IgのFvフラグメントを含む一本鎖タンパク質を含む。IgのFvフラグメントは抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のみを備え、該フラグメント内に不変領域を含有していない。scFv DNAを含むファージライブラリは、マークス(Marks)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.)、1991年、第222巻、p.581−597に記載された手順に従って生成されうる。そのように生成されたファージの、所望の抗体を単離するためのパニングは、FabDNAを含むファージライブラリについて記載された方式に類似の方式で行われる。
べている。しかしながら、本発明は単にFab抗体をコードするファージの生成のみに限定されるように解釈されるべきではない。それどころか、一本鎖抗体をコードするファージ(scFv/ファージ抗体ライブラリ)も本発明に含まれる。Fab分子はIg軽鎖全体を含む、すなわち、軽鎖の可変領域及び不変領域の両方を含むが、重鎖については可変領域及び第1の不変領域ドメイン(CH1)のみを備えている。一本鎖抗体分子は、IgのFvフラグメントを含む一本鎖タンパク質を含む。IgのFvフラグメントは抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のみを備え、該フラグメント内に不変領域を含有していない。scFv DNAを含むファージライブラリは、マークス(Marks)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.)、1991年、第222巻、p.581−597に記載された手順に従って生成されうる。そのように生成されたファージの、所望の抗体を単離するためのパニングは、FabDNAを含むファージライブラリについて記載された方式に類似の方式で行われる。
本発明はまた、重鎖及び軽鎖の可変領域がほぼあらゆる特異性を備えるように合成されうる合成ファージディスプレイライブラリを含むとも解釈されるべきである(バーバス(Barbas)、ネイチャー・メディスン(Nature Medicine)、1995年、第1巻、p.837−839;デ・クルイフ(de Kruif)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.)、1995年、第248巻、p.97−105)。
抗体の生産において、所望の抗体のスクリーニングは、当分野において既知の技法、例えばELISA(酵素結合免疫吸着定量法)によって遂行可能である。本発明に従って生成される抗体には、例えば、限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ(すなわち、「ヒト化」)抗体、及び一本鎖(組換え)抗体、Fabフラグメント、並びにFab発現ライブラリによって生産されるフラグメントが挙げられる。
本発明のペプチドは、標準的な十分確立した技法、例えばスチュアート(Stewart)らによって「固相ペプチド合成(Solid Phase Peptide Synthesis)」、第二版、米国イリノイ州ロックフォードのピアス・ケミカル・カンパニー(Pierce Chemical Company)、1984年に記載されているような、並びにボダンツキー(Bodanszky)及びボダンツキー(Bodanszky)によって「ペプチド合成の実践(The Practice of Peptide Synthesis)」、米国ニューヨークのシュプリンガー‐フェアラーク(Springer−Verlag)、1984年に記載されているような、固相ペプチド合成(SPPS)によって容易に調製されうる。最初に、適当に保護されたアミノ酸残基が、そのカルボキシル基を介して、誘導体化された不溶性ポリマー支持体、例えば架橋ポリスチレン又はポリアミド樹脂などに取り付けられる。「適当に保護された」とは、アミノ酸のαアミノ基上、及び任意の側鎖官能基上の両方に保護基が存在することを指す。側鎖の保護基は、合成の全体にわたって使用される溶媒、試薬及び反応条件について概ね安定であり、最終ペプチド生成物に影響しない条件下で除去可能である。オリゴペプチドの段階的合成は、最初のアミノ酸からのN保護基の除去、及びそこへの、所望のペプチドの配列において次のアミノ酸のカルボキシル末端の結合によって実行される。このアミノ酸も適当に保護される。入って来るアミノ酸のカルボキシルは、反応性基の形成、例えばカルボジイミド、対称酸無水物又は「活性エステル」基、例えばヒドロキシベンゾトリアゾール若しくはペンタフルオロフェンリー(pentafluorophenly)エステルの形成などによって支持体に結合したアミノ酸のN末端と反応するように、活性化されることができる。
固相ペプチド合成法の例には、αアミノ保護基としてターシャリ‐ブチルオクスカルボ
ニル(butyloxcarbonyl)を利用したBOC法、及びアミノ酸残基のαアミノを保護するために9‐フルオレニルメチルオクスカルボニル(fluorenylmethyloxcarbonyl)を利用するFMOC法が挙げられるが、いずれの方法も当業者に良く知られている。
ニル(butyloxcarbonyl)を利用したBOC法、及びアミノ酸残基のαアミノを保護するために9‐フルオレニルメチルオクスカルボニル(fluorenylmethyloxcarbonyl)を利用するFMOC法が挙げられるが、いずれの方法も当業者に良く知られている。
化学的又は生物学的いずれかの合成技法から得られたタンパク質又はペプチドが所望のペプチドであることを確実にするために、ペプチド組成の分析が行なわれるべきである。そのようなアミノ酸組成分析は、ペプチドの分子量を決定するための高分解能質量分析を使用して行なわれうる。別例として、又は追加として、ペプチドのアミノ酸含有量は、酸性水溶液中でペプチドを加水分解し、HPLC又はアミノ酸分析計を使用して混合物の成分を分離、同定及び定量することにより、確認可能である。連続的にペプチドを分解して順番にアミノ酸を同定するタンパク質配列決定装置が、ペプチドの配列を明確に決定するために使用されてもよい。
ペプチドは、その使用に先立って混入物質を除去するために精製されることが可能である。この点では、当然ながらペプチドは適切な規制機関により設定された規格に合致するように精製されることになろう。いくつかの従来の精製手順のうち任意のもの、例えば、C4‐、C8‐又はC18‐シリカのようなアルキル化されたシリカカラムを使用する逆相高速液体クロマトグラフィ(HPLC)が、必要とされる純度レベルに到達するために使用されうる。有機含有量を高めるグラジエント移動相、例えば、通常は少量のトリフルオロ酢酸を含有している水性緩衝液中のアセトニトリルが、精製を達成するために一般に使用される。イオン交換クロマトグラフィも、ペプチドをその電荷に基づいて分離するために使用可能である。
本明細書中に記載されるようにして得られたほぼ純粋なペプチドは、次の既知のタンパク質精製手順によって精製であり、該手順において、手順の各段階で精製をモニタリングするために免疫学的アッセイ、酵素アッセイ、又は他のアッセイが使用される。タンパク質精製方法は当分野において良く知られており、例えばドイッチャー(Deutscher)ら(編、「タンパク質精製のガイド(Guide to Protein Purification)」、米国サンディエゴのハーコート・ブレイス・ジョバノビッチ(Harcourt Brace Jovanovich)、1990年)に記載されている。
その高い選択性にもかかわらず、mAbはすべての悪性細胞の殺滅を仲介することはできないことが多い。実際、示差的な表面マーカーの発現及び可変的な細胞表面の表現型が、同じ種類の血液新生物を有する患者において観察可能である。多様な細胞上の数種の抗原に結合するポリクローナル抗体には、免疫療法の際に新生物クローンのエスケープを防止するという大きな長所がある。したがって、本発明は、mAbのみならずポリクローナル抗体の使用をも包含する(ポライト(Polito)ら、トキシンズ(Toxins)、2011年、第3巻、p.697−720)。
B. 細胞毒性薬
細胞毒性薬は、細胞に送達されることが可能であり、かつ細胞死又は細胞阻害を引き起こすことができる、任意の作用薬であってよい。そのような作用薬の一例はリボソーム不活性化タンパク質である。リボソーム不活性化タンパク質はリボソームで作用するタンパク合成阻害剤である。いくつかの細菌及び植物の毒素は、真核細胞におけるタンパク質合成を阻害することにより作用する。志賀(Shiga)及びリシンファミリーの毒素は、28S rRNAの糖‐リン酸主鎖から特定のアデニン塩基を放出するN‐グリコシド切断によって、60Sリボソームサブユニットを不活性化する。該ファミリーに属するものには、志賀及び志賀様(shiga0like)毒素並びにI型(例えばトリコサンチン
及びルフィン)及びII型(例えばリシン、アグルチニン及びアブリン)リボソーム不活性化タンパク質(RIP)が挙げられる。これらの毒素はすべて構造的に関連づけられる。
細胞毒性薬は、細胞に送達されることが可能であり、かつ細胞死又は細胞阻害を引き起こすことができる、任意の作用薬であってよい。そのような作用薬の一例はリボソーム不活性化タンパク質である。リボソーム不活性化タンパク質はリボソームで作用するタンパク合成阻害剤である。いくつかの細菌及び植物の毒素は、真核細胞におけるタンパク質合成を阻害することにより作用する。志賀(Shiga)及びリシンファミリーの毒素は、28S rRNAの糖‐リン酸主鎖から特定のアデニン塩基を放出するN‐グリコシド切断によって、60Sリボソームサブユニットを不活性化する。該ファミリーに属するものには、志賀及び志賀様(shiga0like)毒素並びにI型(例えばトリコサンチン
及びルフィン)及びII型(例えばリシン、アグルチニン及びアブリン)リボソーム不活性化タンパク質(RIP)が挙げられる。これらの毒素はすべて構造的に関連づけられる。
サポリン:サポリンは、サポナリア・オフィチナーリス(Saponaria officinalis)(一般名はサボンソウ(soapwart))の種子由来の、毒性の高い、N‐グリコシダーゼ活性を備えたリボソーム不活性化タンパク質(30kDa)である。サポリンは、60Sリボソームサブユニット内の28SリボソームRNAの4324位から単一のアデニン塩基を除去することにより作用する。この塩基の除去は、リボソームがタンパク質合成に参加する能力を阻害する。サポリンは、変性及びタンパク質分解に抵抗するその能力ゆえに並外れた安定性を示す。サポリンは、他のそのような分子よりはるかに毒性が低いためにこれを使って作業するには比較的安全であるが、これはサポリンが細胞内に自身を挿入するためのドメインを欠いているからである。しかしながら、仮に細胞内へ入り込む手段を与えられれば、サポリンは非常に毒性が高い。よって、本発明はサポリンにコンジュゲートした抗体を含む。サポリン(GenBank:CAA41948.1;embl登録X59255.1)は次の配列:
MKIYVVATIAWILLQFSAWTTTDAVTSITLDLVNPTAGQYSSFVDKIRNNVKDPNLKYGGTDIAVIGPPSKDKFLRINFQSSRGTVSLGLKRDNLYVVAYLAMDNTNVNRAYYFKSEITSAELTALFPEATTANQKALEYTEDYQSIEKNAQITQGDKSRKELGLGIDLLLTFMEAVNKKARVVKNEARFLLIAIQMTAEVARFRYIQNLVTKNFPNKFDSDNKVIQFEVSWRKISTAIYGDAKNGVFNKDYDFGFGKVRQVKDLQMGLLMYLGKPKSSNEANSTAYATTVL
を有している。
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用語「リシン」は、リシナス・コムニス(Ricinus communis)(ヒマの実)由来のレクチンRCA60を指している。該用語はさらにその毒性バリアントも指している。米国特許第5,079,163号及び同第4,689,401号明細書を参照されたい。リシナス・コムニス・アグルチニン(RCA)は、それぞれその分子量がおよそ65,000及び120,000のRCA60及びRCA120と呼ばれる2つの形態で生じる。ニコルソン(Nicholson)及びブラウシュタイン(Blaustein)、バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ(J. Biochim. Biophys. Acta)、1972年、第266巻、p.543。RCAII’、リシンD又はRCL IIIとも呼ばれるRCA60は極めて毒性が強く、タンパク質合成を阻害し、N‐アセチル‐D‐ガラクトサミンへの親和性を有する。該毒素は、ジスルフィド結合で接合されたA鎖(30,000Da)及びB鎖(33,000Da)の二量体である。A鎖はタンパク質合成の不活性化及び細胞の殺滅を担っている。B鎖はリシンを細胞表面のガラクトース残基に結合させ、細胞質ゾル内へのA鎖の輸送を促進する(オルスネス(Olsnes)ら、ネイチャー(Nature)、1974年、第249巻、p.627−631)。米国特許第3,060,165号明細書を参照されたい。
用語「アブリン」は、アブルス・プレカトリウス(Abrus precatorius)由来の有毒レクチンを指している。毒性成分であるアブリンa、b、c及びdは、約63,000〜67,000Daの分子量を有し、2つのジスルフィドで連結されたポリペプチド鎖A及びBでできている。A鎖はタンパク質合成を阻害し;B鎖(アブリン‐b)はD‐ガラクトース残基に結合する。フナツ(Funatsu)ら、「アブリン‐aのA鎖のアミノ酸配列及びリシンAgr.との比較(The amino acid sequence of the A−chain of abrin−a and comparison with ricin, Agr.)」、バイオロジカル・ケミストリ
ー(Biol. Chem.)、1988年、第52巻、p.1095を参照されたい。さらに、オルスネス(Olsnes)、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods Enzymol.)、1978年、第50巻、p.330−335も参照されたい。
ー(Biol. Chem.)、1988年、第52巻、p.1095を参照されたい。さらに、オルスネス(Olsnes)、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods Enzymol.)、1978年、第50巻、p.330−335も参照されたい。
C. 免疫毒素
リシン、ジフテリア毒素及びシュードモナス毒素のような植物及び細菌由来の毒性酵素は、細胞タイプ特異的殺滅試薬を生成するために抗体又は受容体結合リガンドに結合されてきた(ユール(Youle)ら、米国アカデミー紀要(Proc. Natl Acad. Sci. USA)、1980年、第77巻、p.5483;ギリーランド(Gilliland)ら、米国アカデミー紀要(Proc. Natl Acad. Sci. USA)、1980年、第77巻、p.4539;クロリック(Krolick)ら、米国アカデミー紀要(Proc. Natl Acad. Sci. USA)、1980年、第77巻、p.5419)。細胞認識部分が必ずしも抗体であるとは限らないという事実にかかわらず、これらの指向性毒素は一般に免疫毒素として知られている。これらのハイブリッドタンパク質は、該分子の抗体部分又はリガンド部分が認識する受容体又は細胞表面マーカーを発現する細胞を殺滅する。
リシン、ジフテリア毒素及びシュードモナス毒素のような植物及び細菌由来の毒性酵素は、細胞タイプ特異的殺滅試薬を生成するために抗体又は受容体結合リガンドに結合されてきた(ユール(Youle)ら、米国アカデミー紀要(Proc. Natl Acad. Sci. USA)、1980年、第77巻、p.5483;ギリーランド(Gilliland)ら、米国アカデミー紀要(Proc. Natl Acad. Sci. USA)、1980年、第77巻、p.4539;クロリック(Krolick)ら、米国アカデミー紀要(Proc. Natl Acad. Sci. USA)、1980年、第77巻、p.5419)。細胞認識部分が必ずしも抗体であるとは限らないという事実にかかわらず、これらの指向性毒素は一般に免疫毒素として知られている。これらのハイブリッドタンパク質は、該分子の抗体部分又はリガンド部分が認識する受容体又は細胞表面マーカーを発現する細胞を殺滅する。
適切な条件の下では、特定の受容体又は細胞マーカーに依存して、毒素は細胞質ゾルに入り込み、タンパク質合成機構を不活性化し、標的細胞の死を引き起こす。細胞培養及び動物モデルにおいて成長しているがん細胞に対して細胞毒性が高いことが示された免疫毒素は、この試薬が、播種性ゆえに従来の外科技法では治療不可能な血液及びリンパ伝播性の悪性腫瘍、並びに腹腔のような限定されたコンパートメント内の固形腫瘍を治療する潜在能力を実証している(総説はグリフィン(Griffin)ら、「免疫毒素(IMMUNOTOXINS)」、ボストン/ドルドレヒト/ランカスターの、クルーワー・アカデミック・パブリッシャー(Kluwer Academic Publishers)、1988年、p.433;ヴィテッタ(Vitetta)ら、サイエンス(Science)、1987年、第238巻、p.1098;フィッツジェラルド(Fitzgerald)ら、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート(J.
Natl Cancer Inst.)、1989年、第81巻、p.1455に記載されている)。従来の化学療法は、いくつかのがん性状態の治療に有効である一方、化学療法化合物の全身毒性に起因する望ましからぬ副作用を示す。
Natl Cancer Inst.)、1989年、第81巻、p.1455に記載されている)。従来の化学療法は、いくつかのがん性状態の治療に有効である一方、化学療法化合物の全身毒性に起因する望ましからぬ副作用を示す。
毒性部分と抗体とは、化学的手段又は組換え手段によってコンジュゲートされうる(ルイバク(Rybak)ら、テューモア・ターゲティング(Tumor Targeting)、1995年、第1巻、p.141を参照されたい)。化学的修飾には、例えば、タンパク質化学の分野において良く知られた方法による、直接、又は連結化合物(例えば、二官能性リンカーなどのリンカーは細胞毒性薬をmAbに連結する化学小分子であり;例えばジメチルヒドラジド、酸に不安定なヒドラジンリンカー、ジスルフィドリンカー、グルクロニド糖リンカーなど)を介して構成部分を互いに連結する目的の、誘導体化が挙げられる。例えば、毒性部分と認識部分とを連結する手段は、2つの部分の間の分子間ジスルフィド結合の形成に根本的に寄与するヘテロ二官能性カップリング試薬を含む。本発明に関してこの能力において有用な他の種類のカップリング試薬は、例えば、米国特許第4,545,985号明細書に記載されている。別例として、分子間ジスルフィドは、天然に存在するか又は遺伝子工学によって挿入された、各構成部分の中のシステインの間で好都合に形成される場合もある。構成部分を連結する手段はさらに、ヘテロ二官能性の架橋試薬の間のチオエーテル結合、又は特異的な低pHで切断可能な架橋剤、又は特異的なプロテアーゼで切断可能なリンカー、又はその他の切断可能若しくは切断可能でない化学結合を使用する場合もある。免疫毒素の構成部分を連結する手段はさらに、標準的なペプチド合成化学又は組換え手段によって別々に合成された構成部分の間で形成されるペプチジ
ル結合を含むこともできる。
ル結合を含むこともできる。
毒素を含む各種化合物の取り付けのための数多くの手順及びリンカー分子が知られている。例えば、欧州特許出願第188,256号明細書;米国特許第4,671,958号、同第4,659,839号、同第4,414,148号、同第4,699,784号;同第4,680,338号;同第4,569,789号;同第4,589,071号明細書;及びボーリングハウス(Borlinghaus)ら、キャンサー・リサーチ(Cancer Res.)、1987年、第47巻、p.4071−4075(これらの文献は参照により本願に組込まれる)を参照されたい。特に、様々な免疫毒素コンジュゲートの生産は当分野において良く知られており、例えば、「モノクローナル抗体‐毒素コンジュゲート:特効薬を目指して(Monoclonal Antibody−Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet)」の、ソープ(Thorpe)ら、「臨床医学におけるモノクローナル抗体(Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine)」、アカデミックプレス(Academic Press)、1982年、p.168−190、バルトマン(Waldmann)、サイエンス(Science)、1991年、第252巻、p.1657、米国特許第4,545,985号及び同第4,894,443号(参照により本願に組込まれる)に見出すことができる。さらに、例えばバーチ(Birch)及びレノックス(Lennox)、「モノクローナル抗体:原理と応用(Monoclonal Antibodies: Principles and Applications)」、第4章、米国ニューヨーク州ニューヨークのワイリー‐リス(Wiley−Liss)、1995年;米国特許第5,218,112号及び同第5,090,914号明細書;ハーマンソン(Hermanson)、「バイオコンジュゲート技法(Bioconjugate Techniques)」、米国カリフォルニア州サンディエゴのアカデミックプレス(Academic Press)、1996年も参照されたい。好ましい実施形態では、リンカー分子は、例えばユール(Youle)及びネヴェル(Nevelle)、米国アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci.)、1980年、第77巻、第9号、p.5483−5486に記載されるような免疫毒素コンジュゲートを調製するために使用可能なm‐マルイミドベンゾイル(Malimidobenzoyl)‐N‐ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)である。
ある状況では、免疫毒性コンジュゲートがその標的部位に到達したときに抗体から毒素を解放することが望ましい。したがって、標的部位の近辺又は内部で切断可能な連結を含む免疫毒性コンジュゲートが、毒素が標的部位で放出されることになっている場合に使用されうる。リガンドから作用薬を放出するための連結の切断は、酵素活性、又は標的細胞の内部若しくは標的部位の近辺のいずれかにおいて免疫コンジュゲートがさらされる条件によって、誘発されうる。多くの異なる切断可能なリンカーが当業者に知られている。米国特許第4,618,492号;同第4,542,225号、及び同第4,625,014号明細書を参照されたい。SPDPは、アミンを含む分子をスルフヒドリルにコンジュゲートするために使用される、可逆的なNHSエステル、ピリジルジスルフィド架橋剤である。別の化学的修飾試薬は、アミンと反応してスルフヒドリルをもたらす2‐イミノチオランである。水溶性のSPDPアナログ、例えばスルホ‐LC‐SPDP(米国イリノイ州ロックフォードのピアス(Pierce)なども利用可能である。SMPTは、抗原標的に到達する前のin vivoでの切断を回避するために開発された、可逆的なNHSエステル、ピリジルジスルフィド架橋剤である。加えて、SMPTのNHSエステルは水溶液中で比較的安定である。
本発明のタンパク質部分の可能な化学的修飾には、良く知られた方法による、循環系における滞在時間を延長し、かつ免疫原性を低減するためのポリエチレングリコール(PEG)又は他のポリマー(デキストランなど)を用いた誘導体化も挙げられる(例えば、リ
ージ(Lisi)ら、アプライド・バイオケム(Applied Biochem.)、1982年、第4巻、p.19;ボーシャン(Beauchamp)ら、アナリティカル・バイオケミストリー(Anal Biochem.)、1982年、第131巻、p.25;及びグッドソン(Goodson)ら、バイオ/テクノロジー(Bio/Technology)、1990年、第8巻、p.343を参照されたい)。
ージ(Lisi)ら、アプライド・バイオケム(Applied Biochem.)、1982年、第4巻、p.19;ボーシャン(Beauchamp)ら、アナリティカル・バイオケミストリー(Anal Biochem.)、1982年、第131巻、p.25;及びグッドソン(Goodson)ら、バイオ/テクノロジー(Bio/Technology)、1990年、第8巻、p.343を参照されたい)。
免疫毒素のタンパク質の可能な遺伝子工学的修飾には、各々の関連する機能ドメインを組み合わせて、組換えDNA技術によって得られた単一遺伝子から発現される一本鎖の多機能の生合成タンパク質とすることが挙げられる。(例えば、PCT出願国際公開第88/09344号を参照されたい)。更に、組換えDNA技術は該組換えタンパク質と抗体とを連結するために使用可能である。従って、免疫毒素は、一端において該タンパク質で始まり、かつ抗体で終わる融合タンパク質を含むことができる。
組換え融合タンパク質を生産する方法は当業者に良く知られている。このように例えば、チャウダリー(Chaudhary)ら、ネイチャー(Nature)、1989年、第339巻、p.394;バトラ(Batra)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)、1990年、第265巻、p.15198;バトラ(Batra)ら、米国アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、1989年、第86巻、p.8545;チャウダリー(Chaudhary)ら、米国アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、1990年、第87巻、p.1066(いずれも参照により援用される)は、様々な一本鎖の抗体‐毒素融合タンパク質の調製について記載している。
一般に、免疫毒素融合タンパク質の生産は、Fvの軽鎖及び重鎖、並びに使用される1つのタンパク質をコードするDNAを別々に調製することを要する。2つの配列は、特定の所望の融合タンパク質をコードする構築物を形成するために、プラスミド又は他のベクターの中で組み合わされる。より単純な手法は、所望の1つのタンパク質を既にコードしている構築物に、特定のFv領域をコードするDNAを挿入することを伴う。
本発明は、本明細書中に記載された新規なタンパク質をコードする核酸構築物を含む。核酸構築物とは、適切なベクターに組み込まれた時に宿主の中で複製することができるものである。該構築物は、プロモータ及びエンハンサーのような、該構築物の発現に影響を与えることができる他の配列に連結されてもよい。
1つの実施形態では、Fab‐ZAPマウス(アドバンスト・ターゲティング・システムズ(Advanced Targeting Systems)カタログ#IT‐48)が使用される。それは、ヤギ抗マウス一価抗体とリボソーム不活性化タンパク質サポリンとの化学的コンジュゲートである。第2の免疫毒素はサポリンへの二次抗体のコンジュゲートである。Fab‐ZAPは、マウスモノクローナルIgG一次抗体を使用して、該一次抗体を認識する細胞を標的として除去する。Fab‐ZAPが取り込まれてしまえば、サポリンは標的化作用薬から離脱してリボソームを不活性化し、そのことがタンパク質阻害、及び最終的には細胞死を引き起こす。Fab‐ZAPは一価の二次抗体を用いて作製され、キャップ形成の可能性を排除すると同時に有効なin vitro診断ツールを作る品質をすべて維持している。さらに、細胞毒性アッセイにおいてMab‐ZAPと直接比較されると、改善されたED50も有している。この試薬は、マウスIgG抗体について、取り込み及び強力な免疫毒素を作製するためのその適性のうち少なくともいずれかに関してスクリーニングするために、利用可能である。
D. ワクチン及び免疫原
1つの実施形態では、本発明は、SAS1R並びにそのフラグメント及び相同体のよう
な本発明の抗原化合物を用いて、そのような特異性抗原に対する特異的な細胞性及び体液性免疫応答を誘発するために、対象者を免疫化及び治療するための方法及び試薬に関する。本発明は、新鮮なリポソーム又は凍結乾燥リポソームの中で特異的に調製された免疫原、該免疫原の適正な投与経路、該免疫原の適正用量、及び1つの投与経路におけるDNAプライミングとその後の異なる経路におけるリポソームを介在するタンパク質抗原ブーストとを含む特異的組み合わせの異種免疫化を使用する方法であって、細胞性免疫応答の増強、サイトカイン分泌、体液性免疫応答、特にTヘルパー応答のTh1への偏り又はバランスのとれたTh1及びTh2タイプという点に関して免疫応答を条件に合うように適合させるための方法を提供する。より詳しくは、クラインフェルター(Klinefelter)の文献(国際特許出願PCT/US2005/026102号の優先権を主張する米国特許出願第11/572,453号明細書)を参照されたい。
1つの実施形態では、本発明は、SAS1R並びにそのフラグメント及び相同体のよう
な本発明の抗原化合物を用いて、そのような特異性抗原に対する特異的な細胞性及び体液性免疫応答を誘発するために、対象者を免疫化及び治療するための方法及び試薬に関する。本発明は、新鮮なリポソーム又は凍結乾燥リポソームの中で特異的に調製された免疫原、該免疫原の適正な投与経路、該免疫原の適正用量、及び1つの投与経路におけるDNAプライミングとその後の異なる経路におけるリポソームを介在するタンパク質抗原ブーストとを含む特異的組み合わせの異種免疫化を使用する方法であって、細胞性免疫応答の増強、サイトカイン分泌、体液性免疫応答、特にTヘルパー応答のTh1への偏り又はバランスのとれたTh1及びTh2タイプという点に関して免疫応答を条件に合うように適合させるための方法を提供する。より詳しくは、クラインフェルター(Klinefelter)の文献(国際特許出願PCT/US2005/026102号の優先権を主張する米国特許出願第11/572,453号明細書)を参照されたい。
本明細書中の相同体は、上述の天然に存在するSAS1Rポリペプチドとの、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する免疫原性ポリペプチドを含むものと了解され、かつ少なくとも該ポリペプチドによって得られる免疫応答を誘発する能力をなおも有している。相同体又はアナログは、本明細書中において、安定性、溶解性、及び免疫原性を高めるために、置換、挿入、欠失、N末端又はC末端のアミノ酸付加、及び炭水化物のような追加の化学構成部分を含むことができる。
本発明の1つの実施形態では、本明細書中で定義されるような本発明の免疫原性ポリペプチドは、グリコシル化されている。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、本明細書中では、これらのポリペプチドのグリコシル化によってその免疫原性が高まり得るという仮説がたてられる。したがって、1つの実施形態では、本明細書中で先に定義されるような前述の免疫原性ポリペプチドは、グリコシル化されて、糖タンパク質又はグリコシル化ポリペプチドの総重量に基づいて10〜80重量%にわたる様々な炭水化物含量を有している。より好ましくは、前記炭水化物含量は、15〜70重量%、さらにより好ましくは20〜60重量%の範囲である。別の実施形態では、前記グリコシル化免疫原性ポリペプチドは、治療を受けるヒトの対応する透明帯糖タンパク質(又はそのフラグメント)のグリコシル化パターンに類似したグリコシル化パターンを含む。これが前記ポリペプチドの免疫原性をさらに高めるという仮説が立てられている。よって、免疫原性ポリペプチドは対応するSAS1R糖タンパク質のグリコシル化パターンに類似したグリコシル化パターンを含むことが好ましい。
1つの実施形態では、ポリペプチドの供給源は、SAS1Rタンパク質、並びに免疫学的に活性なその相同体及びそのフラグメントから選択された有効な量の免疫原性ポリペプチド、又は前記免疫原性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
1つの実施形態では、本発明の免疫化方法は、免疫原として活性なポリペプチドフラグメントの供給源の投与を含んでなり、前記ポリペプチドフラグメントは、本明細書中で先に定義されたようなSAS1Rタンパク質フラグメント及びその相同体のうち少なくともいずれかから選択され、前記ポリペプチドフラグメントは優性なCTLエピトープ及びHTLエピトープのうち少なくともいずれかを含んでなり、かつそのフラグメントは長さ18〜45アミノ酸である。18〜45アミノ酸の長さを有するペプチドは、国際公開第02/070006号に記載されているように優れた免疫原性を提供することが観察されている。
好都合にもペプチドは化学合成可能であり、かつ任意選択で(部分的に)重なり合ってもよく、かつ/又はさらに他の分子、ペプチド、若しくはタンパク質に繋ぎ合わされても
よい。ペプチドは、ウェルターズ(Welters)らの文献(ワクチン(Vaccine)、2004年12月2日、第23巻、第3号、p.305−11)のように、融合せしめられて合成タンパク質を形成してもよい。ペプチドの安定性の増大及び生分解性の減少のうち少なくともいずれかのために、ペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に化学的構成部分又は追加の(修飾型若しくはD型の)アミノ酸を付加することも有利であるかもしれない。免疫原性を改善するために、免疫刺激性の構成部分が例えば脂質化又はグリコシル化によって取り付けられてもよい。ペプチドの溶解性を増強するために、荷電アミノ酸又は極性アミノ酸の付加が、溶解性を増強しかつin vivoでの安定性を高めるために使用されてもよい。
よい。ペプチドは、ウェルターズ(Welters)らの文献(ワクチン(Vaccine)、2004年12月2日、第23巻、第3号、p.305−11)のように、融合せしめられて合成タンパク質を形成してもよい。ペプチドの安定性の増大及び生分解性の減少のうち少なくともいずれかのために、ペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に化学的構成部分又は追加の(修飾型若しくはD型の)アミノ酸を付加することも有利であるかもしれない。免疫原性を改善するために、免疫刺激性の構成部分が例えば脂質化又はグリコシル化によって取り付けられてもよい。ペプチドの溶解性を増強するために、荷電アミノ酸又は極性アミノ酸の付加が、溶解性を増強しかつin vivoでの安定性を高めるために使用されてもよい。
免疫化の目的のため、本発明の前述の免疫原性ポリペプチドは、タンパク質、例えば、限定されるものではないが、テタヌストキシン/トキソイド、ジフテリアトキシン/トキソイド又は他の担体分子と融合せしめられてもよい。本発明によるポリペプチドは、(参照文献:ラープ(Rapp)UKおよびカウフマン(Kaufmann)SH、インターナショナル・イムノロジー(Int Immunol.)、2004年4月、第16巻、第4号、p.597−605;ツューゲル(Zugel)U、インフェクション・アンド・イミュニティ(Infect Immun.)、2001年6月、第69巻、第6号、p.4164−7)に記載されるように、免疫優勢ペプチドの担体として組換えの内在性(ネズミ科動物)gp96(GRP94)のような熱ショックタンパク質に好都合に融合せしめられてもよいし、Hsp70との融合タンパク質であってもよい(トリーベル(Triebel)ら、国際公開第9954464号)。
本発明のこの免疫原性(ポリ)ペプチドの個々のアミノ酸残基は、ペプチド結合又はペプチド結合ミメティックによってペプチドに組み込まれることができる。本発明のペプチド結合ミメティックには当業者に良く知られたペプチド主鎖の修飾が挙げられる。そのような修飾には、アミド窒素、α炭素、アミドカルボニルの修飾、アミド結合の完全置換、延長、欠失、又は主鎖架橋が含まれる。一般に、スパトーラ(Spatola)、「アミノ酸、ペプチド及びタンパク質の化学及び生化学(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins)」(ウェインステイン(Weinstein)編)、1983年、第VII巻を参照されたい。いくつかのペプチド主鎖修飾が知られており、本発明の実行において使用可能である。
アミノ酸ミメティックもポリペプチドに組み込まれうる。「アミノ酸ミメティック」とは、本明細書中で使用されるように、本発明のポリペプチド中のアミノ酸の代替物として立体配座的かつ機能的役割を果たす、天然に存在するアミノ酸以外の構成部分である。そのような構成部分は、ペプチドが天然のSAS1R T細胞エピトープに対する免疫応答を誘発する能力を妨害しない場合に、アミノ酸残基の代替物としての役割を果たす。アミノ酸ミメティックには非タンパク性アミノ酸が挙げられる。多くの適当なアミノ酸ミメティックが当業者に知られており、シクロヘキシルアラニン、3‐シクロヘキシルプロピオン酸、L‐アダマンチルアラニン、アダマンチル酢酸などが含まれる。本発明のペプチドに適したペプチドミメティックは、モーガン(Morgan)及びゲイノール(Gainor)、アニュアル・レポーツ・イン・メディシナル・ケミストリー(Ann. Repts. Med. Chem.)、1989年、第24巻、p.243−252によって議論されている。
1つの実施形態では、本方法は、本明細書において上記に定義されるような1つ以上の本発明の免疫原性ポリペプチドと、少なくとも1つの賦形剤とを含む組成物の投与を含む。賦形剤は薬学分野において良く知られており、例えば「レミングトンの薬剤学(Remingtons pharmaceutical sciences)」、マック・パブ
リシング(Mack Publishing)、1995年のような教科書に見出されうる。
リシング(Mack Publishing)、1995年のような教科書に見出されうる。
免疫化のための本方法は、少なくとも1つのアジュバントの投与、及び1つの態様では同時投与をさらに含むことができる。アジュバントは、ワクチン接種の分野で既知の任意のアジュバントを含むことが可能であり、「カレント・プロトコールズ・イン・イムノロジー(Current Protocols in Immunology)」、ワイリー・インターサイエンス(Wiley Interscience)、2004年のような教科書を使用して選択されてもよい。
アジュバントは、本明細書中では、ヒト又は動物を免疫化するために抗原と組み合わせて使用された時に、免疫系を刺激し、その結果として、好ましくはアジュバント自体への特異的免疫反応を生じることなく、該抗原に対する免疫応答を起こさせ、増強し、又は促進する、任意の物質又は化合物を含むように意図される。1つの態様では、アジュバントは、所与の抗原に対する免疫応答を、同じ条件下であるがアジュバントのない状態で該抗原に対して生成された免疫応答と比較して、少なくとも1.5、2、2.5、5、10、又は20倍に増強することができる。一群の動物又はヒトにおいてアジュバントによって生じるような所与の抗原に対する免疫応答の、対応する対照群と比較した統計的な平均の増強を決定するための試験は、当分野において利用可能である。アジュバントは、好ましくは、少なくとも2つの異なる抗原に対する免疫応答を増強することができる。本発明のアジュバントは通常はヒトにとって異質の化合物となり、よってヒトに内在する免疫刺激性化合物、例えばインターロイキン、インターフェロン、及びその他のホルモンは除外される。
多くのアジュバントが当業者に良く知られている。適当なアジュバントには、例えば、不完全フロイントアジュバント、アラム、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、N‐アセチル‐ムラミル‐L‐トレオニル‐D‐イソグルタミン(thr‐MDP)、N‐アセチル‐ノル‐ムラミル‐L‐アラニル‐D‐イソグルタミン(CGP11637、ノル‐MDPとも呼ばれる)、N‐アセチルムラミル‐L‐アラニル‐D‐イソグルタミニル‐L‐アラニン‐2‐(1’‐2’‐ジプ‐アルミトイル(dip−almitoyl)‐sn‐グリセロ‐3‐ヒドロキシ‐ホスホリルオキシ)‐エチルアミン(CGP19385A、MTP‐PEとも呼ばれる)、DDA(2ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド)、ポリIC、ポリAポリU、RIBI(商標)、GERBU(商標)、Pam3(商標)、Carbopol(商標)、Specol(商標)、Titermax(商標)、テタヌストキソイド、ジフテリアトキソイド、髄膜炎菌外膜タンパク質、ジフテリアタンパク質CRM197が挙げられる。好ましいアジュバントは、抗原提示細胞に存在するトール様受容体(TLR)によって認識されるリガンドを含む。TLRによって認識される様々なリガンドが当分野で知られており、例えば、リポペプチド(例えば国際公開第04/110486号を参照)、リポ多糖類、ペプチドグリカン、リオプテイコ酸(liopteichoic acid)、リポアラビノマンナン、リポタンパク質(マイコプラズマ又はスピロヘータ由来)、二本鎖RNA(ポリI:C)、非メチル化DNA、フラジェリン、CpG含有DNA、及びイミダゾキノリン、並びにこれらリガンドの化学的修飾を有している誘導体が挙げられる。
本願の免疫化の方法は、CTL応答を増強し、かつその結果として本発明の方法及び組成物の治療効果を増強するために、CD40結合分子の投与(同時投与を含む)をさらに包含する。CD40結合分子の使用については、参照により本願に組込まれる国際公開第99/61065号に記載されている。CD40結合分子は、好ましくは抗体若しくはそのフラグメント、又はCD40リガンド若しくはそのバリアントであり、別々に加えられてもよいし、本発明による組成物内に含められてもよい。そのような有効用量は、患者の
身体状態及び全身状態を含む様々な要因に依存することになろう。よって、投与計画は、最適な治療効果又は予防効果を提供するために熟練した医療関係者によって決定及び調整可能である。
身体状態及び全身状態を含む様々な要因に依存することになろう。よって、投与計画は、最適な治療効果又は予防効果を提供するために熟練した医療関係者によって決定及び調整可能である。
本方法では、1つ以上の免疫原性ポリペプチドは、典型的には少なくとも一回に患者の体重1kgあたり約1ug以上の用量で投与される。多くの場合、用量は10ug/kgより多い。本発明によれば、用量は好ましくは1ug/kg〜1mg/kgの範囲にある。
1つの実施形態では、典型的な投与計画は、1〜1000ug/kg、より好ましくは10〜500ug/kg、さらにより好ましくは10〜150ug/kgの用量を、1週、2週、3週、4週又は5週間にわたって1週間に1回、2回、又は3回投与することを含む。1つの実施形態によれば、1週間又は2週間の期間に10〜100ug/kgが週に1回投与される。
本方法は、1つの態様では、本発明の免疫原性ポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組成物の、注射経路、経皮的経路、又は経口経路を介した投与を含む。本発明の別の実施形態では、本方法は、本発明の免疫原性ポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組成物の膣内投与を含む。
本発明の別の態様は、有効成分として本明細書中で先に定義されたような本発明のポリペプチド供給源を含む医薬品製剤に関する。より具体的には、医薬品製剤は、有効成分として、SAS1タンパク質、その相同体並びに前記SAS1Rタンパク質のフラグメント及びその相同体の群から選択された前述の免疫原性ポリペプチドのうち1つ以上、又は、別例として、本明細書中上記に定義されるような遺伝子治療ベクターを含む。
本発明は、本発明の免疫原性ポリペプチドのうち1つ以上を含む医薬品製剤をさらに提供する。該医薬組成物中の前記ポリペプチドの濃度は広く様々であって良い、すなわち、重量比で約0.1%未満から、通常は重量比で少なくとも約1%であって、重量比で20%と同程度又はそれ以上であってもよい。
組成物は有効成分に加えて薬学的に許容可能な担体を含むことができる。製薬用の担体は、患者に免疫原性ポリペプチド又は遺伝子治療ベクターを送達するのに適した、任意の適合性のある無毒の物質であってよい。ポリペプチドについては、滅菌水、アルコール、脂肪、ワックス、及び不活性固体が担体として使用されうる。薬学的に許容可能なアジュバント、緩衝薬、分散剤なども、医薬組成物中に組み込まれうる。
1つの実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書中で先により詳細に定義されたように、アジュバントを含む。本組成物中に組み込むのに有用なアジュバントは、好ましくは、抗原提示細胞に存在するトール様受容体(TLR)によって認識されるリガンド、例えばリポペプチド、リポ多糖類、ペプチドグリカン、リオプテイコ酸(liopteichoic acid)、リポアラビノマンナン、リポタンパク質(マイコプラズマ又はスピロヘータ由来)、二本鎖RNA(ポリI:C)、非メチル化DNA、フラジェリン、CpG含有DNA、及びイミダゾキノリン、並びにこれらリガンドの化学的修飾を有している誘導体、を含む群から選択される。日常的に作業している者であれば、本医薬品製剤を十分に免疫原性にするために本医薬品製剤に組み込まれるべき上記アジュバントのいずれについての正確な量も決定することができるであろう。別の好ましい実施形態によれば、本医薬品製剤は、本明細書中で先に説明されたようなCTL免疫を増強するために使用される1つ以上の追加の成分を含むこともできる。特に好ましい実施形態によれば、本医薬品製剤はCD40結合分子を含む。
ポリペプチドを含む医薬組成物を生産する方法は、米国特許第5,789,543号及び同第6,207,718号明細書に記載されている。好ましい形態は、意図される投与方式及び治療適用に応じて様々である。
1つの実施形態では、本発明の免疫原性タンパク質又はポリペプチドは注射によって投与される。ポリペプチドの投与のための非経口経路は、周知の方法に従い、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、皮下、又は病巣内の経路による注射又は注入である。該タンパク質又はポリペプチドは、注入又はボーラス注射によって連続的に投与されうる。静脈内注入用の典型的な組成物は、任意選択で20%アルブミン溶液が補われた10〜50mlの無菌の0.9%NaCl又は5%グルコースと、10ug〜50mg、好ましくは50ug〜10mgのポリペプチドとを含有するように作製されることが考えられる。筋肉内注射用の典型的な医薬組成物は、例えば、1〜10mlの無菌の緩衝水溶液と、10ug〜50mg、好ましくは50ug〜10mgの本発明のポリペプチドとを含有するように作製されることになろう。非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は当分野において良く知られており、例えば、「レミングトンの薬剤学(Remingtons Pharmaceutical Science)」(第15版、米国ペンシルバニア州イーストンのマック・パブリシング(Mack Publishing)、1980年)(すべての目的についてその全体が援用される)を含む様々な情報源により詳細に記載されている。
便宜上、免疫応答は多くの場合、本発明において「一次」又は「二次」の免疫応答であるとして記載される。「保護的」免疫応答とも記載される一次免疫応答は、特定の抗原への何らかの初期曝露(例えば初期の「免疫化」)の結果として個体の中で生じる免疫応答を指す。そのような免疫化は、例えば、抗原への何らかの自然曝露(例えば該抗原を示すか又は提示する何らかの病原体による初感染に由来するもの)の結果として生じる可能性がある。別例として、免疫化は、抗原を含有するワクチンを用いた個体のワクチン接種によって生じる可能性がある。例えば、ワクチンは、SAS1Rの1つ以上の抗原性のエピトープ又はフラグメントを含むワクチンであってよい。
ワクチンは、IL2のような他の免疫賦活物質、及びとりわけ共刺激分子を発現するように改変されることも可能である。
抗原に対する抗体と組み合わせることが可能な別のタイプのワクチンは、対象とする細胞溶解物から調製されたワクチンであって免疫アジュバントと併用するもの、又は対象とする細胞からの溶解物にDETOX(商標)免疫アジュバントを加えた混合物から調製されたワクチンである。ワクチン治療は、追加の化学療法上の処置の有無に関わらず、抗原に対する抗体を用いてブースティングされることが可能である。
抗原に対する抗体と組み合わせることが可能な別のタイプのワクチンは、対象とする細胞溶解物から調製されたワクチンであって免疫アジュバントと併用するもの、又は対象とする細胞からの溶解物にDETOX(商標)免疫アジュバントを加えた混合物から調製されたワクチンである。ワクチン治療は、追加の化学療法上の処置の有無に関わらず、抗原に対する抗体を用いてブースティングされることが可能である。
治療のためにin vivoで使用される時、本発明の抗体は、治療上有効な量(すなわち所望の治療効果を有する量)で対象者に投与される。該抗体は通常は非経口的に投与されることになろう。用量及び投与計画は、感染の程度、使用される特定の抗体又は免疫毒素の特性、例えばその治療指数、患者、及び患者の病歴に応じて様々となろう。有利には、抗体又は免疫毒素は、1〜2週間にわたって連続的に投与される。任意選択で、投与は、抗微生物治療のような補助療法の間に、又は腫瘍壊死因子、インターフェロン若しくは他の細胞保護剤若しくは免疫調節剤の投与の間に行われる。
非経口投与については、抗体は薬学的に許容可能な非経口用ビヒクルを伴って単位用量の注射剤型(溶液、懸濁物、エマルジョン)に製剤化されることになろう。そのようなビヒクルは本質的に無毒であり、治療用ではない。そのようなビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び5%ヒト血清アルブミンである。固定油及
びオレイン酸エチルのような非水性のビヒクルも使用可能である。リポソームは担体として使用可能である。ビヒクルは、等張性及び化学的安定性を増強する物質、例えば緩衝剤及び保存剤のような、少量の添加剤を含有することが可能である。抗体は、典型的にはそのようなビヒクル中で約1.0mg/ml〜約10mg/mlの濃度で製剤化されることになろう。
びオレイン酸エチルのような非水性のビヒクルも使用可能である。リポソームは担体として使用可能である。ビヒクルは、等張性及び化学的安定性を増強する物質、例えば緩衝剤及び保存剤のような、少量の添加剤を含有することが可能である。抗体は、典型的にはそのようなビヒクル中で約1.0mg/ml〜約10mg/mlの濃度で製剤化されることになろう。
IgM抗体の使用はある種の適用に関して好ましい可能性があるが;より小さくなっているIgG分子は、ある種の感染細胞に局在化するためにIgM分子より有能となりうる。
in vivoでの補体活性化は、様々な生物学的作用、例えば炎症反応の誘導及びマクロファージの活性化をもたらすということが証明されている(ウナヌー(Unanue)及びベネセラフ(Benecerraf)、「免疫学教科書(Textbook of
Immunology)」、第二版、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンズ(Williams and Wilkins)、1984年、p.218)。炎症に伴う血管拡張の増大は、様々な作用薬が局在化する能力を高める可能性がある。したがって、本発明によって指定された種類の抗原‐抗体の組み合わせは、多くの方法において使用可能である。加えて、ヒト患者において活発な免疫応答を誘導するために、そのような抗原に関係する精製抗原(ハコモリ(Hakomori)、アニュアル・レヴューズ・オブ・イムノロジー(Ann. Rev. Immunol.)、1984年、第2巻、p.103)又は抗イディオタイプ抗体(ネポム(Nepom)ら、米国アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、1985年、第81巻、p.2864;コプロウスキー(Koprowski)ら、米国アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、1984年、第81巻、p.216)を使用することも考えられる。
Immunology)」、第二版、ウィリアムズ・アンド・ウィルキンズ(Williams and Wilkins)、1984年、p.218)。炎症に伴う血管拡張の増大は、様々な作用薬が局在化する能力を高める可能性がある。したがって、本発明によって指定された種類の抗原‐抗体の組み合わせは、多くの方法において使用可能である。加えて、ヒト患者において活発な免疫応答を誘導するために、そのような抗原に関係する精製抗原(ハコモリ(Hakomori)、アニュアル・レヴューズ・オブ・イムノロジー(Ann. Rev. Immunol.)、1984年、第2巻、p.103)又は抗イディオタイプ抗体(ネポム(Nepom)ら、米国アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、1985年、第81巻、p.2864;コプロウスキー(Koprowski)ら、米国アカデミー紀要(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、1984年、第81巻、p.216)を使用することも考えられる。
使用される抗体組成物は製剤化され、かつ用量が、治療される身体状態又は障害、個々の患者の身体状態、組成物の送達部位、投与の方法、及び医師に知られたその他の要因を考慮に入れて、良好な医療にふさわしい方法で確立される。抗体組成物は、投与のためのポリペプチドの調製の説明に従って、投与のために調製される(以下)。
当分野では十分理解されているように、生体特異的な捕捉試薬には、抗体、転移細胞上の活性化されたインテグリン受容体に結合する抗体の結合性フラグメントが含まれる(例えば、一本鎖抗体、Fab’フラグメント、F(ab)’2フラグメント、及びscFvタンパク質並びにアフィボディ(Affibody(登録商標)、スウェーデン国ストックホルムSE‐10044、テクニクリンゲン(Teknikringen)30、6階、ボックス700 04;参照により全体がすべての目的について本願に組み込まれる米国特許第5,831,012号明細書を参照されたい)。用途によっては、別の生体分子に特異的に結合する受容体及び他のタンパク質も含まれうる。
ハイブリッド抗体及びハイブリッド抗体フラグメントには、完全長の重鎖及び軽鎖を有する完全抗体分子、又はその任意のフラグメント、例えばFab、Fab’、F(ab’)2、Fd、scFv、抗体軽鎖及び抗体重鎖などが含まれる。さらに、本明細書中に記載されるような可変領域と様々な生物種由来の不変領域とを有するキメラ抗体も適している。例えば、米国特許出願第20030022244号明細書を参照されたい。
最初に、抗体が作り出されうる所定の標的対象物が選ばれる。標的対象物に対するモノクローナル抗体を生成するための技法は当業者に良く知られている。そのような技法の例には、限定するものではないが、ディスプレイライブラリ、ゼノマウス又はヒューマブマウス、ハイブリドーマなどを伴うものが挙げられる。標的対象物には、抗原性を示すこと
ができる任意の物質が含まれ、通常はタンパク質またはタンパク多糖体である。例としては、受容体、酵素、ホルモン、生長因子、ペプチドなどが挙げられる。当然のことであるが、本開示による使用に適しているのは天然に存在する抗体だけでなく、所定の対象物に対する人為改変抗体及び抗体フラグメントも適している。
ができる任意の物質が含まれ、通常はタンパク質またはタンパク多糖体である。例としては、受容体、酵素、ホルモン、生長因子、ペプチドなどが挙げられる。当然のことであるが、本開示による使用に適しているのは天然に存在する抗体だけでなく、所定の対象物に対する人為改変抗体及び抗体フラグメントも適している。
本願は、本明細書中に記載されたタンパク質を阻害するための組成物及び方法を開示し、かつ開示されていないが当分野において既知のものも本発明に包含される。例えば、様々なモジュレータ/エフェクタ、例えば抗体、生物学的活性を有する核酸、例えばアンチセンス分子、RNAi分子、若しくはリボザイム、アプタマー、前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドを認識するペプチド又は低分子量有機化合物、並びにタンパク質自体及びそのフラグメント、が知られている。
本発明は、治療用抗体の抗原として使用するためのSAS1Rの使用についての機能性フラグメントの同定に加えて、免疫原及び抗がんワクチンとしてのその使用をさらに包含する。
1つの実施形態では、完全長SAS1Rのミモトープ分析は、配列を例えば各ペプチドが3アミノ酸だけ重なり合っている一続きの15アミノ酸ペプチドに細分することにより、実施可能である。ペプチドはすべてビオチン化され、96ウェルプレートのストレプトアビジンコーティングされたウェルに結合できるようになされうる。様々な抗血清の反応性が酵素結合免疫吸着定量法(ELISA)によって検出可能である。非特異的結合のブロッキングの後、SAS1R抗体が順次添加され(すなわち、アフィニティ精製された抗SAS1R又はアフィニティ精製された抗完全長組換えSAS1Rのいずれか)、その後ペルオキシダーゼがコンジュゲートした二次抗体、及びペルオキシダーゼ基質が順次添加されるとよい。
各ウェルの光学密度が450nmで読み取られ、2連のウェルが平均されるとよい。対照の血清(すなわち免疫前血清)を使用した同様のELISAから得られた平均値が、試験Igの値から差し引かれ、得られた値がプロットされていずれの直線状エピトープがIgによって認識されるかを判定することが可能である。
SAS1Rの機能性フラグメントを同定する戦略における第2及び第3の要素は、ミモトープ分析によって予測されたエピトープ(ペプチド)に対応する非ビオチン化ペプチドの合成に依存する。ミモトープ分析によって認識されたエピトープのうちいずれが卵子上に露出しているかを決定するために、各ペプチドを伴わない場合及び伴う場合における、Igを用いる免疫細胞科学的染色が実施可能である。
E. 医薬組成物
本発明はさらに、薬学的に許容可能な担体中に本発明の免疫毒素を含む医薬組成物にも関する。治療適用では、組成物は、疾患に罹患している患者に、該疾患及びその合併症を治癒させるか又は少なくとも部分的に進行を止めるのに十分な量で投与される。これを遂行するのに適した量は治療上有効な量として定義される。この使用法に有効な量は、該疾患の重症度および患者の健康の全体的状態に依存することになろう。
本発明はさらに、薬学的に許容可能な担体中に本発明の免疫毒素を含む医薬組成物にも関する。治療適用では、組成物は、疾患に罹患している患者に、該疾患及びその合併症を治癒させるか又は少なくとも部分的に進行を止めるのに十分な量で投与される。これを遂行するのに適した量は治療上有効な量として定義される。この使用法に有効な量は、該疾患の重症度および患者の健康の全体的状態に依存することになろう。
有利には、医薬組成物は非経口適用に適している。本発明の免疫毒素は、他の免疫毒素に関して当分野で既知の方法に従って、例えば様々な身体各部の腫瘍を治療するために、種々の目的について適切な様々な手段によって投与されうる。(例えば、W.B.サーンダーズ(Saunders)、「米国の免疫学及びアレルギークリニック(IMMUNOLOGY AND ALLERGY CLINICS OF AMERICA)」、1990年の中のルイバク(Rybak)ら、「ヒトのがん免疫学(Human Cance
r Immunology)」、並びに同文献中で引用された参照文献を参照されたい)。従って、本発明はさらに、本発明の免疫毒素と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物であって、特に上記の投与手段に適している組成物に関する。
r Immunology)」、並びに同文献中で引用された参照文献を参照されたい)。従って、本発明はさらに、本発明の免疫毒素と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物であって、特に上記の投与手段に適している組成物に関する。
組成物の単回投与又は複数回投与は、必要かつ患者に忍容される量及び頻度に応じて投与されうる。いかなる場合も、組成物は、患者を有効に治療するために十分な量の本発明のタンパク質を提供するべきである。
投与のための組成物は、薬学的に許容可能な担体、好ましくは水性担体に溶解された一本鎖抗体及び毒素を含む融合タンパク質の溶液を一般に含むことになろう。様々な水性担体、例えば、緩衝生理食塩水などが使用可能である。これらの溶液は無菌であり、概して望ましからぬ物質を含まない。これらの組成物は従来の良く知られた滅菌技法によって滅菌されうる。組成物は、生理学的条件に近い条件に必要とされるような薬学的に許容可能な補助物質、例えばpH調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤などであって、例を挙げると酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど、を含有しうる。これらの処方物における融合タンパク質の濃度は広く様々であって良く、かつ、選択された特定の投与方式及び患者のニーズに従って主として流体の体積、粘性、体重などに基づいて選択されることになろう。
本発明の免疫毒素は、注射によって静脈内などに全身投与されうるが、同時に筋肉内、皮下、骨腔内、腹腔内、血管腔内、又は関節の中(例えば関節内注射)にも投与されうる。用量は、十分に医師の技能の範囲内にあるように、使用される免疫毒素の性質、例えば、その活性及び生物学的半減期、処方物中の該免疫毒素の濃度、投与部位及び投与速度、その患者の臨床的忍容性、患者が罹患しているがんの進行度などに依存することになろう。
投与はさらに鼻腔内投与であってもよいし、その他の非経口でない(nonparenteral)経路によってもよい。免疫毒素は、血液を含むある種の組織に配されたミクロスフェア、リポソーム又は他の微粒子送達システムを介して投与されてもよい。
本発明の免疫毒素は溶液状態で投与されうる。該溶液のpHは、pH5〜9.5、例えばpH6.5〜7.5の範囲にあってよい。免疫毒素又はその誘導体は、適当な薬学的に許容可能な緩衝剤、例えばリン酸塩、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン‐HCl又はクエン酸塩などを有する溶液中にあってよい。緩衝剤濃度は1〜100mMの範囲にあるべきである。免疫グロブリンの溶液はさらに、50〜150mMの濃度で塩化ナトリウム又は塩化カリウムのような塩を含有することもできる。アルブミン、グロブリン、界面活性剤、ゼラチン、プロタミン又はプロタミンの塩のような有効な量の安定化剤が含まれることも可能であり、免疫毒素を含有する溶液又は該溶液が調製される元の組成物に添加されうる。免疫毒素は、該免疫毒素の生物学的半減期を延長し、その結果として活性の期間をより長くするために使用可能な、ポリマー(ポリエチレングリコール(PEG)又はデキストランなど)を用いて処方されてもよい。免疫毒素の全身投与は、ヒト化型又はヒト型の抗体が使用される場合は2〜3日ごと又は週に一度行われることが可能である。別例として、毎日の投与が有用である。
よって、静脈内投与用の典型的な医薬組成物は、1日当たり患者1人につき約0.01〜100mgとなるであろう。1日当たり患者1人につき0.1〜約1000mgまでの投与量は、特に薬物が血流ではなく隔離部位へ、例えば腫瘍又は腫瘍が存在する臓器の中などに投与されるときに使用されうる。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は既知すなわち当業者には明白であり、より詳細には「レミングトンの薬剤学(REMINGTONS PHARMACEUTICAL SCIENCE)」、第15版
、米国ペンシルバニア州イーストンのマック・パブリシング・コーポレイション(Mack Publishing Co.)、1980年のような出版物に記載されている。
、米国ペンシルバニア州イーストンのマック・パブリシング・コーポレイション(Mack Publishing Co.)、1980年のような出版物に記載されている。
さらに、本発明は、選択的に細胞を殺滅する方法であって、殺滅されるべき細胞の表面上の標的又は細胞内標的に特異的な抗体を有する本発明の選択的免疫毒素を、抗体の結合を可能にする条件下で使用する方法に関する。細胞上又は細胞内の表面又は細胞内のマーカーへの抗体の結合は、試薬の毒素部分による細胞の選択的殺滅を引き起こす。
本発明はさらに、本発明の化合物を含む医薬組成物にも関する。より具体的には、そのような化合物は、当業者に既知の標準的な薬学的に許容可能な担体、増量剤、可溶化剤及び安定化剤を使用して医薬組成物として処方されることが可能である。
本発明はさらに、本発明の化合物を対象者に投与する方法にも関する。1つの実施形態では、本発明は、本発明の記載の方法を使用して同定された化合物の投与により対象者を治療する方法を提供する。本化合物を含む医薬組成物は、該医薬組成物を必要とする対象者に、様々な経路、例えば、限定するものではないが、局所、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、骨腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、又は経直腸の手段により投与される。
1つの実施形態によれば、そのような治療を必要とする対象者を治療する方法が提供される。該方法は、本発明の少なくとも1つの化合物を含む医薬組成物を、該医薬組成物を必要とする対象者に投与することを含む。本発明の方法によって同定された化合物は、同様に既知の化合物又は他の薬剤とともに投与可能である。
本発明はさらに、本発明の方法を実行するための、適切な化合物、及びその相同体、フラグメント、アナログ、又は誘導体の医薬組成物の使用を包含し、該組成物は、少なくとも1つの適切な化合物、及びその相同体、フラグメント、アナログ、又は誘導体と、薬学的に許容可能な担体とを含む。
本発明を実行するのに有用な医薬組成物は、1ng/kg/日〜100mg/kg/日の用量を送達するように投与されうる。
本発明は、有効成分として本明細書中に開示された疾患の治療に有用な化合物を含む医薬組成物の調製及び使用を包含する。そのような医薬組成物は、対象者への投与に適した形態で、有効成分単独で構成されてもよいし、該医薬組成物は有効成分と、1つ以上の薬学的に許容可能な担体、1つ以上の追加の成分、又はこれらの何らかの組み合わせとを含む場合もある。有効成分は、当分野において良く知られているように、生理学的に許容可能なエステル又は塩の形態で、例えば生理学的に許容可能な陽イオン又は陰イオンと組み合わせて、医薬組成物中に存在しうる。
本発明は、有効成分として本明細書中に開示された疾患の治療に有用な化合物を含む医薬組成物の調製及び使用を包含する。そのような医薬組成物は、対象者への投与に適した形態で、有効成分単独で構成されてもよいし、該医薬組成物は有効成分と、1つ以上の薬学的に許容可能な担体、1つ以上の追加の成分、又はこれらの何らかの組み合わせとを含む場合もある。有効成分は、当分野において良く知られているように、生理学的に許容可能なエステル又は塩の形態で、例えば生理学的に許容可能な陽イオン又は陰イオンと組み合わせて、医薬組成物中に存在しうる。
本明細書中で使用されるように、用語「生理学的に許容可能な」エステル又は塩とは、医薬組成物の任意の他の成分との適合性を有する有効成分のエステル形態又は塩形態であって、該組成物が投与されることになっている対象者に対して有害でないものを意味する。
本明細書中に記載された医薬組成物の処方物は、薬理学の分野において既知であるか又は今後開発される任意の方法によって調製されうる。概して、そのような調製方法は、有効成分を担体又は1つ以上の他の副成分と関連付けるステップ、次いで必要であるか又は望ましい場合には、該生成物を成形又は包装して所望の単回又は複数回投与量単位とするステップを含む。
そのような医薬組成物があらゆる種類の動物への投与に概ね適していることは当業者には理解されるであろう。本発明の医薬組成物の投与が企図される対象者には、限定するものではないが、ヒト及びその他の霊長類、商業関連の哺乳動物などの哺乳動物、例えば畜牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ及びイヌなど、商業関連の鳥を含む鳥、例えば鶏、アヒル、ガチョウ及びシチメンチョウなどが挙げられる。本発明は、げっ歯動物のような害獣の避妊における使用についても企図される。
本発明の医薬組成物は、単回単位用量として、又は複数の単回単位用量として、調製、包装、又はバルク販売がなされうる。本明細書中で使用されるように、「単位用量」とは、所定量の有効成分を含む個別量の医薬組成物である。有効成分の量は、対象者に投与される有効成分の投与量、又はそのような投与量の好都合な一部分、例えばそのような投与量の二分の1又は三分の一などに概ね等しい。
本発明の医薬組成物中の有効成分、薬学的に許容可能な担体、及び任意の追加成分の相対量は、治療を受ける対象者が誰であるか、該対象者の体格、及び身体状態に応じて、かつさらには組成物が投与されることになっている経路に応じて、変化することになる。例を挙げると、組成物は、0.1%〜100%(w/w)の有効成分を含むことができる。
有効成分に加えて、本発明の医薬組成物は、1つ以上の追加の薬学的活性作用薬をさらに含むことができる。特に企図される追加の作用薬には、鎮吐薬、並びにシアン化物及びシアン酸のスカベンジャのようなスカベンジャが挙げられる。
本発明の医薬組成物の制御放出性又は徐放性の処方物は従来技術を使用して作製されうる。
本明細書中で使用されるように、「追加成分」には、限定するものではないが、下記すなわち:賦形剤;表面活性剤;分散剤;不活性希釈剤;造粒剤及び崩壊剤;結合剤;平滑剤;甘味料;香味料;着色料;保存剤;ゼラチンのような生理学的に分解性の組成物;水性のビヒクル及び溶媒;油性のビヒクル及び溶媒;懸濁化剤;分散剤又は湿潤剤;乳化剤、粘滑剤;緩衝剤;塩類;粘稠化剤;増量剤;乳化剤;酸化防止剤;抗生物質;抗真菌剤;安定化剤;並びに薬学的に許容可能なポリマー材料又は疎水性材料、のうち1つ以上が挙げられる。本発明の医薬組成物中に含まれうるその他の「追加成分」は当分野において知られており、かつ例えば、ゲネロ(Genaro)編、「レミングトンの薬剤学(Remingtons Pharmaceutical Sciences)」、米国ペンシルバニア州イーストンのマック・パブリシング・コーポレイション(Mack Publishing Co.)、1985年に記載されており、同文献は参照により本願に組込まれる。
本明細書中で使用されるように、「追加成分」には、限定するものではないが、下記すなわち:賦形剤;表面活性剤;分散剤;不活性希釈剤;造粒剤及び崩壊剤;結合剤;平滑剤;甘味料;香味料;着色料;保存剤;ゼラチンのような生理学的に分解性の組成物;水性のビヒクル及び溶媒;油性のビヒクル及び溶媒;懸濁化剤;分散剤又は湿潤剤;乳化剤、粘滑剤;緩衝剤;塩類;粘稠化剤;増量剤;乳化剤;酸化防止剤;抗生物質;抗真菌剤;安定化剤;並びに薬学的に許容可能なポリマー材料又は疎水性材料、のうち1つ以上が挙げられる。本発明の医薬組成物中に含まれうるその他の「追加成分」は当分野において知られており、かつ例えば、ゲネロ(Genaro)編、「レミングトンの薬剤学(Remingtons Pharmaceutical Sciences)」、米国ペンシルバニア州イーストンのマック・パブリシング・コーポレイション(Mack Publishing Co.)、1985年に記載されており、同文献は参照により本願に組込まれる。
典型的には、動物、好ましくはヒトに投与されうる本発明の化合物の用量は、その動物の体重1キログラム当たり1μg〜約100gの量で変動する。同時に、投与される正確な用量は、様々な要因、例えば、限定するものではないが、治療される動物の種類及び病状の種類、動物の年齢並びに投与経路に応じて変化することになろう。好ましくは、化合物の用量は、動物の体重1キログラム当たり約1mg〜約10gで変動することになろう。より好ましくは、用量は、動物の体重1キログラム当たり約10mg〜約1gで変動することになろう。
化合物は、動物に1日数回の頻度で投与されてもよいし、より低頻度で、例えば1日に1回、週に1回、2週ごとに1回、月に1回、又はさらにより低頻度で、例えば数か月に1回若しくは1年に1回若しくはより低頻度で投与されてもよい。投与の頻度は、当業者には容易に明白となろうし、かつ、様々な要因、例えば、限定するものではないが、治療される身体状態又は疾患の種類及び重症度、動物の種類及び年齢などに応じて変わること
になろう。
になろう。
ワクチン剤の適当な調製物には、溶液又は懸濁物のいずれかとしての注射剤が含まれるが、しかしながら、注射の前に液体中に溶解、液体中に懸濁するのに適した固体形態も調製されうる。該調製物は乳化されてもよいし、ポリペプチドがリポソーム中にカプセル封入されてもよい。活性な免疫原成分は多くの場合、薬学的に許容可能でありかつ有効成分との適合性を有する賦形剤と混合せしめられる。適当な賦形剤は、例えば、水生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びこれらの組み合わせである。加えて、望ましい場合には、ワクチン調製物はさらに、少量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝薬、及びワクチンの有効性を増強するアジュバントのうち少なくともいずれかも含みうる。
本発明は、対象者に本発明の化合物を投与する方法にも関する。1つの実施形態では、本発明は、本発明の方法を使用して同定された化合物の投与により対象者を治療する方法を提供する。本化合物を含む医薬組成物は、該化合物を必要とする個体に、様々な経路、例えば、限定するものではないが、局所、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、骨腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、又は経直腸の手段によって投与される。
1つの実施形態によれば、そのような治療を必要とする対象者に治療及びワクチン接種を行う方法が提供される。該方法は、本発明の少なくとも1つの化合物を含む医薬組成物を、該組成物を必要とする対象者に投与することを含む。本発明の方法によって同定された化合物は、既知の化合物又は他の薬剤とともに同様に投与可能である。
経口投与については、有効成分は、カプセル剤、錠剤、及び散剤のような固体投与形態、又はエリキシル剤、シロップ剤、及び懸濁剤のような液体投与形態で投与可能である。活性構成成分は、非活性成分及び粉末担体、例えばグルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロース又はセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石、炭酸マグネシウムなどと共にゼラチンカプセル中にカプセル封入されることが可能である。望ましい色、味、安定性、緩衝能、分散度又はその他の既知の望ましい特徴を提供するために添加されうる追加の非活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インキなどである。同様の希釈剤は圧縮錠剤を作製するために使用可能である。錠剤及びカプセル剤のいずれも、数時間にわたる薬剤の連続的放出を提供する徐放性製剤として製造可能である。圧縮錠剤は、何らかの不快な味を覆い隠し、かつ大気から錠剤を保護するために、糖コーティング又はフィルムコーティングされることも可能であるし、胃腸管内での選択的崩壊のために腸溶コーティングされることも可能である。経口投与用の液体投与形態は、患者の受容を高めるために着色料及び香味料を含有することが可能である。
様々な経腟薬物送達系が当分野において知られている。適当な系には、クリーム剤、泡沫剤、錠剤、ゲル剤、液体投与形態、坐剤、及びペッサリーが挙げられる。水に接して膨潤して粘膜の表面上に広がることが可能な弱い架橋ポリマーを含む、粘膜付着性のゲル剤及びヒドロゲルは、かつて、膣内経路を通したペプチド及びタンパク質を用いるワクチン接種に使用されていた。本発明は、ペプチド薬及びタンパク薬物の経腟送達のためのミクロスフェアの使用をさらに提供する。賦形剤を含んでいる経膣投与される投与形態、及び前記投与形態を調製する実際の方法の、より詳細な仕様は、当業者に既知であるか、又は当業者には明白となろう。例えば、「レミングトンの薬剤学(Remingtons Pharmaceutical Sciences)」(第15版、米国ペンシルバニア州イーストンのマック・パブリシング(Mack Publishing)、1980年)が参照される。
本発明はさらに、本発明の組成物と、哺乳動物の細胞又は組織への該組成物の経外膜的(adventitially)投与について説明する使用説明資料とを含むキットも含む。別の実施形態では、このキットは化合物を哺乳動物に投与する前に本発明の組成物を溶解又は懸濁するのに適した(好ましくは無菌の)溶媒を含む。
本明細書中で使用されるように、「使用説明資料」には、本明細書中に列挙された各種疾患又は障害の緩和の達成のためのキット中の本発明のペプチドの有用性を伝えるために使用可能な、出版物、録音物、図表、又は任意の他の表現媒体が含まれる。任意選択で、又は別例として、使用説明資料は、哺乳動物の細胞又は組織における疾患又は障害を緩和する1つ以上の方法について説明してもよい。本発明のキットの使用説明資料は、例えば、本発明のペプチドを収容するコンテナに添付されてもよいし、該ペプチドを収容するコンテナとともに出荷されてもよい。別例として、使用説明資料は、使用説明資料及び化合物が受取人によって協働的に使用されるという意図をもって、コンテナとは別々に出荷されてもよい。
当分野で既知の他の技法が本発明の実行において使用されてもよく、例えば、参照によりその全体が本願に組込まれる国際特許出願の国際公開第2006/091535号(PCT/US2006/005970)に記載されたものが挙げられる。
ペプチドの修飾及び調製
当然ながら、本発明のタンパク質又はペプチドは活性に影響を及ぼすことなく修飾されたアミノ酸残基を組込む場合もあるということは認識されるであろう。例えば、末端は、ブロック基、すなわち「望ましからぬ分解」からのN末端及びC末端の保護及び安定化のうち少なくともいずれかをなすのに適した化学置換基を含むように誘導体化されてもよく、「望ましからぬ分解」とは、化合物の機能に影響しやすい、該化合物の末端における任意の種類の酵素的、化学的又は生化学的破壊、すなわち該化合物の末端部における連続的分解を包含することを意味する用語である。
当然ながら、本発明のタンパク質又はペプチドは活性に影響を及ぼすことなく修飾されたアミノ酸残基を組込む場合もあるということは認識されるであろう。例えば、末端は、ブロック基、すなわち「望ましからぬ分解」からのN末端及びC末端の保護及び安定化のうち少なくともいずれかをなすのに適した化学置換基を含むように誘導体化されてもよく、「望ましからぬ分解」とは、化合物の機能に影響しやすい、該化合物の末端における任意の種類の酵素的、化学的又は生化学的破壊、すなわち該化合物の末端部における連続的分解を包含することを意味する用語である。
ブロック基には、ペプチドのin vivoでの活性に悪影響を及ぼさないであろう、ペプチド化学の分野で従来使用されている保護基が含まれる。例えば、適当なN末端ブロック基は、N末端のアルキル化又はアシル化により導入可能である。適当なN末端ブロック基の例には、C1‐C5の分岐又は非分岐のアルキル基、ホルミル基及びアセチル基のようなアシル基、並びにこれらの置換型、例えばアセトアミドメチル(Acm)基が挙げられる。アミノ酸のデスアミノアナログも有用なN末端ブロック基であり、ペプチドのN末端に結合されることも、又はN末端の残基(reside)の代わりに使用されることも可能である。適当なC末端ブロック基には、C末端のカルボキシル基が該ブロック基に組込まれる場合も組込まれない場合もあるが、エステル、ケトン又はアミドが挙げられる。エステル又はケトンを形成するアルキル基、特にメチル、エチル及びプロピルのような低級アルキル基、並びにアミドを形成するアミノ基、例えば第一級アミン(‐NH2)、並びにモノ‐、及びジ‐アルキルアミノ基、例えばメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノなどは、C末端ブロック基の例である。アグマチンのようなデスカルボキシルアミノ酸アナログも有用なC末端ブロック基であり、ペプチドのC末端残基に結合せしめられることも、又は該残基の代わりに使用されることも可能である。さらに、ペプチドから末端の遊離のアミノ基及びカルボキシル基が全部取り除かれて、該ペプチドのデスアミノ及びデスカルボキシル形態をペプチド活性に影響することなく生じることができることは、認識されるであろう。
本発明の酸付加塩も機能的等価物として企図される。よって、本発明によるペプチドが、該ペプチドの水溶性の塩を提供するために、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、
硝酸、リン酸など、又は有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、タタリック(tataric)、クエン酸、安息香酸、シナミー(cinnamie)、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p‐トルエンスルホン酸、サリサイクリック(salicyclic)などで処理されたものは、本発明で使用するのに適している。
硝酸、リン酸など、又は有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、タタリック(tataric)、クエン酸、安息香酸、シナミー(cinnamie)、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p‐トルエンスルホン酸、サリサイクリック(salicyclic)などで処理されたものは、本発明で使用するのに適している。
修飾(通常は一次配列を変更しない)には、in vivo、又はin vitroにおけるポリペプチドの化学誘導体化、例えばアセチル化、又はカルボキシル化が挙げられる。さらに挙げられるのは、グリコシル化の修飾、例えばポリペプチドの合成及びプロセシングの間、又はその後のプロセシングステップにおいて該ポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することにより;例えばグリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば哺乳類のグリコシル化酵素又は脱グリコシル化酵素にポリペプチドを曝露することにより、なされる修飾である。さらに包含されるのは、リン酸化したアミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、又はホスホトレオニンを有する配列である。
さらに挙げられるのは、タンパク質分解に対するポリペプチドの抵抗性を改善するか、又は溶解特性を最適化するか、又はポリペプチドを治療薬としてより適当なものとするための、通常の分子生物学的技法を使用して修飾されたポリペプチドである。そのようなポリペプチドのアナログには、天然に存在するL‐アミノ酸以外の残基、例えばD‐アミノ酸又は天然に存在しないすなわち非標準型の合成アミノ酸を含有するアナログが含まれる。本発明のペプチドは、本明細書中に列挙された特定の例示のプロセスのうちいずれの生成物にも限定されない。
本発明は、構造:
を有するベータ‐アラニン(β‐アラニン、β‐Ala、bA、及びβAとも呼ばれる)の使用を含む。
記号「βA」を使用する配列が本明細書中に提供されているが、本願に添えて提出される配列表においては「βA」は「Xaa」として提示され、配列表のテキスト中の参照説明はXaaがベータアラニンであることを示している。
記号「βA」を使用する配列が本明細書中に提供されているが、本願に添えて提出される配列表においては「βA」は「Xaa」として提示され、配列表のテキスト中の参照説明はXaaがベータアラニンであることを示している。
本発明において有用なペプチド、例えば標準物、又は分析用の修飾物などは、標準的な確立した技法、例えばスチュアート(Stewart)ら、「固相ペプチド合成(Solid Phase Peptide Synthesis)」、第二版、米国イリノイ州ロックフォードのピアス・ケミカル・カンパニー(Pierce Chemical Company)、1984年に記載されているような;並びにボダンツキー(Bodanszky)及びボダンツキー(Bodanszky)、「ペプチド合成の実践(The Practice of Peptide Synthesis)」、米国ニューヨークのスプリンガー‐フェアラーク(Springer−Verlag)、1984年に記載されているような、固相ペプチド合成(SPPS)などによって容易に調製されうる。最初に、適当に保護されたアミノ酸残基がそのカルボキシル基によって、架橋ポリスチレン又はポリアミド樹脂のような誘導体化された不溶性ポリマー支持体に取り付けられる。「
適当に保護された」とは、アミノ酸のα‐アミノ基上、及び任意の側鎖官能基上の両方に保護基が存在することを指す。側鎖保護基は、合成期間全体にわたって使用される溶媒、試薬及び反応条件に対して一般に安定であり、かつ最終的なペプチド生成物に影響を及ぼさない条件下で除去可能である。オリゴペプチドの段階的合成は、最初のアミノ酸からのN‐保護基の除去、及び該アミノ酸に、所望のペプチドの配列において次のアミノ酸のカルボキシル末端を結合すること(couple)によって行なわれる。このアミノ酸も適当に保護される。入って来るアミノ酸のカルボキシルは、反応性基の形成、例えばカルボジイミド、対称な酸無水物又は「活性エステル」基、例えばヒドロキシベンゾトリアゾール若しくはペンタフルオロフェンリー(pentafluorophenly)エステルの形成によって、支持体に結合したアミノ酸のN末端と反応するように活性化されることが可能である。
適当に保護された」とは、アミノ酸のα‐アミノ基上、及び任意の側鎖官能基上の両方に保護基が存在することを指す。側鎖保護基は、合成期間全体にわたって使用される溶媒、試薬及び反応条件に対して一般に安定であり、かつ最終的なペプチド生成物に影響を及ぼさない条件下で除去可能である。オリゴペプチドの段階的合成は、最初のアミノ酸からのN‐保護基の除去、及び該アミノ酸に、所望のペプチドの配列において次のアミノ酸のカルボキシル末端を結合すること(couple)によって行なわれる。このアミノ酸も適当に保護される。入って来るアミノ酸のカルボキシルは、反応性基の形成、例えばカルボジイミド、対称な酸無水物又は「活性エステル」基、例えばヒドロキシベンゾトリアゾール若しくはペンタフルオロフェンリー(pentafluorophenly)エステルの形成によって、支持体に結合したアミノ酸のN末端と反応するように活性化されることが可能である。
固相ペプチド合成法の例には、αアミノ保護基としてターシャリ‐ブチルオクスカルボニル(butyloxcarbonyl)を利用したBOC法、及びアミノ酸残基のαアミノを保護するために9‐フルオレニルメチルオクスカルボニル(fluorenylmethyloxcarbonyl)を利用するFMOC法が挙げられるが、いずれの方法も当業者に良く知られている。
N‐ブロック基及びC‐ブロック基のうち少なくともいずれかの組込みも、固相ペプチド合成法に対して従来のプロトコールを使用して達成可能である。C末端ブロック基の組込みについては、例えば、所望のペプチドの合成は典型的には、固相として、支持体樹脂であって該樹脂からの切断により所望のC末端ブロック基を有するペプチドが生じるように化学修飾済みのものを使用して実施される。C末端が第一級アミノブロック基を有するペプチドを提供するためには、例えば、p‐メチルベンズヒドリルアミン(MBHA)樹脂を使用し、その結果、ペプチド合成が完了したときにフッ化水素酸を用いた処理で所望のC末端アミド化ペプチドが放出されるように、合成が実施される。同様に、C末端におけるN‐メチルアミンブロック基の組込みは、HF処理でN‐メチルアミド化されたC末端を有するペプチドを放出する、N‐メチルアミノエチル誘導体化DVB(樹脂)を使用して達成される。エステル化によるC末端のブロックも従来の手順を使用して達成可能である。これは、樹脂からの側鎖ペプチドの放出を可能として、その後の所望のアルコールとの反応を可能にし、エステル基を形成するような、樹脂/ブロック基の組み合わせの使用を要する。FMOC保護基は、メトキシアルコキシベンジルアルコール又は等価なリンカーを用いて誘導体化されたDVB樹脂との組み合わせで、この目的に使用することが可能であり、ジコロロメタン(dicholoromethane)中のTFAによって果たされる該支持体からの切断を伴う。例えばDCCを用いる、適当に活性化されたカルボキシル基のエステル化は、その後、所望のアルコールの添加によって進行した後、エステル化されたペプチド生成物の脱保護及び単離がなされてもよい。
N末端ブロック基の組込みは、合成されたペプチドがまだ樹脂に取り付けられている間に、例えば適当な無水物及びニトリルを用いた処理によって達成可能である。N末端にアセチルブロック基を組込むためには、例えば、樹脂に結合したペプチドがアセトニトリル中の20%無水酢酸で処理されるとよい。N‐ブロックがなされたペプチド生成物はその後樹脂から切断され、脱保護され、続いて単離されることが可能である。
化学的又は生物学的な合成技法から得られたペプチドが所望のペプチドであることを確認するために、ペプチド組成の分析が行なわれるべきである。そのようなアミノ酸組成分析は、ペプチドの分子量を決定するための高分解能質量分析を使用して行なわれうる。別例として、又は追加として、ペプチドのアミノ酸含有量は、酸性水溶液中でペプチドを加水分解し、かつHPLC、又はアミノ酸分析計を使用して該混合物の構成成分を分離、同定及び定量することにより、確認することが可能である。ペプチドを連続的に分解して順
番にアミノ酸を同定するタンパク質配列決定装置も、ペプチドの配列を明確に決定するために使用されうる。
番にアミノ酸を同定するタンパク質配列決定装置も、ペプチドの配列を明確に決定するために使用されうる。
ペプチドは、その使用に先立ち、混入物質を除去するために精製されてもよい。この点では、当然ながらペプチドは適切な規制機関により設定された規格に合致するように精製されることになろう。いくつかの従来の精製手順のうち任意のもの、例えば、C4‐、C8‐又はC18‐シリカのようなアルキル化されたシリカカラムを使用する逆相高速液体クロマトグラフィ(HPLC)が、必要とされる純度レベルに到達するために使用されうる。有機含有量を高めるグラジエント移動相、例えば、通常は少量のトリフルオロ酢酸を含有している水性緩衝液中のアセトニトリルが、精製を達成するために一般に使用される。イオン交換クロマトグラフィも、ペプチドをその電荷に基づいて分離するために使用可能である。
本明細書中に記載されるようにして得られたほぼ純粋なタンパク質は、次の既知のタンパク質精製手順であって、該手順の各段階で精製をモニタリングするために免疫学的アッセイ、酵素アッセイ、又は他のアッセイが使用される手順によって精製されうる。タンパク質精製方法は当分野において良く知られており、例えばドイッチャー(Deutscher)ら(編、「タンパク質精製のガイド(Guide to Protein Purification)」、米国サンディエゴのハーコート・ブレイス・ジョバノビッチ(Harcourt Brace Jovanovich)、1990年)に記載されている。
議論されるように、本発明のペプチドリガンドの修飾又は最適化は本願の範囲内にある。修飾又は最適化されたペプチドは、ペプチド結合性リガンドの定義に含まれる。具体的には、同定されたペプチド配列はその効力、薬物動態学的挙動、安定性、並びにその他の生物学的、物理的及び化学的性質のうち少なくともいずれかを最適化するために修飾可能である。
アミノ酸置換
ある実施形態では、開示された方法及び組成物は1つ以上の置換されたアミノ酸残基を備えたペプチドを調製することを伴う場合がある。
ある実施形態では、開示された方法及び組成物は1つ以上の置換されたアミノ酸残基を備えたペプチドを調製することを伴う場合がある。
様々な実施形態において、ペプチド配列の構造的、物理的、及び治療的のうち少なくともいずれかの特性は、1つ以上のアミノ酸残基を置き換えることにより最適化されうる。
その他の修飾も活性に悪影響を及ぼすことなく組込むことが可能であり、これらには、限定するものではないが、1つ以上の天然のL‐異性体のアミノ酸を、D‐異性体のアミノ酸で置換することが挙げられる。よって、ペプチドは1つ以上のD‐アミノ酸残基(resides)を含んでもよいし、すべてD型であるアミノ酸を含むこともできる。本発明によるペプチドのレトロインバルソ型、例えば、全てのアミノ酸がD型アミノ酸に置換されている逆向きペプチドも企図される。
その他の修飾も活性に悪影響を及ぼすことなく組込むことが可能であり、これらには、限定するものではないが、1つ以上の天然のL‐異性体のアミノ酸を、D‐異性体のアミノ酸で置換することが挙げられる。よって、ペプチドは1つ以上のD‐アミノ酸残基(resides)を含んでもよいし、すべてD型であるアミノ酸を含むこともできる。本発明によるペプチドのレトロインバルソ型、例えば、全てのアミノ酸がD型アミノ酸に置換されている逆向きペプチドも企図される。
当業者であれば、一般に、ペプチド中のアミノ酸置換は典型的には比較的類似した特性の別のアミノ酸によるアミノ酸の置き換え(すなわち保存的なアミノ酸置換)を要することを承知しているであろう。様々なアミノ酸の特性並びにタンパク質の構造及び機能に対するアミノ酸置換の効果は、当分野における広範囲な研究及び知見の対象であった。
例えば、生じるポリペプチドは上述の特性の類似又は改善されたプロファイルを有することになろうという見込みで、元のポリペプチド配列中に、以下のイソステリック及び保存的のうち少なくともいずれかのアミノ酸変更がなされることが可能である。
アルキル置換型疎水性アミノ酸の置換:例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、S‐2‐アミノ酪酸、S‐シクロヘキシルアラニン、又は他の単純なαアミノ酸が分岐鎖、環状鎖及び直鎖のアルキル、アルケニル又はアルキニル置換を含む炭素数C1‐10の脂肪族側鎖によって置換されたもの。
芳香族置換型疎水性アミノ酸の置換:例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ビフェニルアラニン、1‐ナフチルアラニン、2‐ナフチルアラニン、2‐ベンゾチエニルアラニン、3‐ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジン、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化(フルオロ、クロロ、ブロモ、若しくはヨード)又はアルコキシで置換されたかたちの先述の芳香族アミノ酸であって、実例となる例は:2‐、3‐又は4‐アミノフェニルアラニン、2‐、3‐又は4‐クロロフェニルアラニン、2‐、3‐又は4‐メチルフェニルアラニン、2‐、3‐又は4‐メトキシフェニルアラニン、5‐アミノ‐、5‐クロロ‐、5‐メチル‐又は5‐メトキシトリプトファン、2’‐、3’‐、又は4’‐アミノ‐、2’‐、3’‐、又は4’‐クロロ‐、2、3、又は4‐ビフェニルアラニン、2’、‐3’、‐又は4’‐メチル‐2,3又は4‐ビフェニルアラニン、及び2‐又は3‐ピリジルアラニンである。
塩基性官能基を含有するアミノ酸の置換:例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、2,3‐ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニン、アルキル、アルケニル又はアリールで置換された先述のアミノ酸の(C1‐C10の分岐鎖、直鎖、又は環状の)誘導体であって、置換基はヘテロ原子上(例えばα窒素、又は末端の1若しくは複数の窒素)にあるか、又はα炭素上に、例えばプロ‐Rの位置にあるかにかかわらない。実例となる例としての役割を果たす化合物には:N‐ε‐イソプロピルリジン、3‐(4‐テトラヒドロピリジル)グリシン、3‐(4‐テトラヒドロピリジル)アラニン、N,N‐γ,γ’‐ジエチルホモアルギニンが挙げられる。さらに含まれるのは、αメチルアルギニン、αメチル2,3‐ジアミノプロピオン酸、αメチルヒスチジン、αメチルオルニチンのような、アルキル基がα炭素のプロ‐Rの位置を占める化合物である。同じく含まれるのは、アルキル、芳香族、ヘテロ芳香族(ここでヘテロ芳香族基は1つ以上の窒素、酸素、又は硫黄原子を単独又は組み合わせとして有する)カルボン酸、又は数多くの良く知られた活性化誘導体のいずれか、例えば酸塩化物、活性エステル、活性アゾリド及び関連誘導体)及びリジン、オルニチン又は2,3‐ジアミノプロピオン酸から形成されたアミドである。
酸性アミノ酸の置換:例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、チロシン、2,4‐ジアミノプリオピオン酸(2,4−diaminopriopionic acid)、オルニチン又はリジンのアルキル、アリール、アリールアルキル及びヘテロアリールスルホンアミド、並びにテトラゾール置換されたアルキルアミノ酸。
側鎖アミド残基の置換:例えば、アスパラギン、グルタミン、及びアスパラギン又はグルタミンのアルキル又は芳香族置換誘導体。
ヒドロキシル含有アミノ酸の置換:例えば、セリン、トレオニン、ホモセリン、2,3‐ジアミノプロピオン酸、及びセリン又はトレオニンのアルキル又は芳香族置換誘導体。同じく当然ながら、上記に列挙された分類群それぞれの中のアミノ酸が同じ群の別のものの代わりになりうる。
ヒドロキシル含有アミノ酸の置換:例えば、セリン、トレオニン、ホモセリン、2,3‐ジアミノプロピオン酸、及びセリン又はトレオニンのアルキル又は芳香族置換誘導体。同じく当然ながら、上記に列挙された分類群それぞれの中のアミノ酸が同じ群の別のものの代わりになりうる。
例えば、アミノ酸のハイドロパシーインデックスが考慮される場合がある(カイト(Kyte)及びドゥーリトル(Doolittle)、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.)、1982年、第157巻、p.105−132)。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、ひいては該タンパク質の他の分子との相互作用を規定する。各アミノ酸には、そ
の疎水性及び電荷特性に基づいてハイドロパシーインデックスが割り当てられており(カイト(Kyte)及びドゥーリトル(Doolittle)、1982年)、これらは:イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システイン/シスチン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(−0.4);トレオニン(−0.7);セリン(−0.8);トリプトファン(−0.9);チロシン(−1.3);プロリン(−1.6);ヒスチジン(−3.2);グルタメート(−3.5);グルタミン(−3.5);アスパルテート(−3.5);アスパラギン(−3.5);リジン(−3.9);及びアルギニン(−4.5)である。保存的置換を行う際には、ハイドロパシーインデックスが±2以内であるアミノ酸の使用が好ましく、±1以内がより好ましく、±0.5以内はさらにより好ましい。
の疎水性及び電荷特性に基づいてハイドロパシーインデックスが割り当てられており(カイト(Kyte)及びドゥーリトル(Doolittle)、1982年)、これらは:イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システイン/シスチン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(−0.4);トレオニン(−0.7);セリン(−0.8);トリプトファン(−0.9);チロシン(−1.3);プロリン(−1.6);ヒスチジン(−3.2);グルタメート(−3.5);グルタミン(−3.5);アスパルテート(−3.5);アスパラギン(−3.5);リジン(−3.9);及びアルギニン(−4.5)である。保存的置換を行う際には、ハイドロパシーインデックスが±2以内であるアミノ酸の使用が好ましく、±1以内がより好ましく、±0.5以内はさらにより好ましい。
アミノ酸置換はさらに、アミノ酸残基の親水性を考慮に入れる場合もある(例えば米国特許第4,554,101号明細書)。親水性の値はアミノ酸残基に割り当てられており:アルギニン(+3.0);リジン(+3.0);アスパルテート(+3.0);グルタメート(+3.0);セリン(+0.3);アスパラギン(+0.2);グルタミン(+0.2);グリシン(0);トレオニン(−0.4);プロリン(0.5.+−0.1);アラニン(−0.5);ヒスチジン(−0.5);システイン(−1.0);メチオニン(−1.3);バリン(−1.5);ロイシン(−1.8);イソロイシン(−1.8);チロシン(−2.3);フェニルアラニン(−2.5);トリプトファン(−3.4)、である。アミノ酸を、同様の親水性の他のものを用いて置き替えることが好ましい。
他に考慮されるものには、アミノ酸側鎖の大きさが挙げられる。例えば、小型の側鎖を備えたアミノ酸、例えばグリシン又はセリンを、嵩高い側鎖を備えたアミノ酸、例えばトリプトファン又はチロシンに置き替えることは一般に好ましくないであろう。タンパク質二次構造に対する様々なアミノ酸残基の効果も、考慮の対象である。実証研究によって、タンパク質ドメインがαヘリックス、βシート又はリバースターン二次構造をとりやすい傾向に対する様々なアミノ酸残基の効果が決定されており、当分野において知られている(例えば、シュウ(Chou)及びファスマン(Fasman)、バイオケミストリー(Biochemistry)、1974年、第13巻、p.222−245;アニュアル・レヴュー・オブ・バイオケミストリー(Ann. Rev. Biochem.)、1978年、第47巻、p.251−276;バイオフィジカル・ジャーナル(Biophys. J.)、1979年、第26巻、p.367−384を参照されたい)。
そのような考慮及び広範囲な実証研究に基づいて、保存的アミノ酸置換の表が構築されており、当分野で知られている。例えば:アルギニンとリジン;グルタメートとアスパルテート;セリンとトレオニン;グルタミンとアスパラギン;並びにバリン、ロイシン及びイソロイシンである。別例としては:Ala(A)leu、ile、val;Arg(R)gln、asn、lys;Asn(N)his、asp、lys、arg、gln;Asp(D)asn、glu;Cys(C)ala、ser;Gln(Q)glu、asn;Glu(E)gln、asp;Gly(G)ala;His(H)asn、gln、lys、arg;Ile(I)val、met、ala、phe、leu;Leu(L)val、met、ala、phe、ile;Lys(K)gln、asn、arg;Met(M)phe、ile、leu;Phe(F)leu、val、ile、ala、tyr;Pro(P)ala;Ser(S)、thr;Thr(T)ser;Trp(W)phe、tyr;Tyr(Y)trp、phe、thr、ser;Val(V)ile、leu、met、phe、alaである。
アミノ酸置換についてのその他の考慮には、残基がタンパク質の内部に位置するか否か、又は溶媒に曝露されているか否かが挙げられる。内部の残基については、保存的置換に
は以下が含まれることになろう:AspとAsn;SerとThr;SerとAla;ThrとAla;AlaとGly;IleとVal;ValとLeu;LeuとIle;LeuとMet;PheとTyr;TyrとTrp。(例えばロックフェラー大学のウェブサイトPROWLを参照されたい)。溶媒に曝露された残基については、保存的置換には以下が含まれることになろう:AspとAsn;AspとGlu;GluとGln;GluとAla;GlyとAsn;AlaとPro;AlaとGly;AlaとSer;AlaとLys;SerとThr;LysとArg;ValとLeu;LeuとIle;IleとVal;PheとTyr。(同上)。アミノ酸置換の選択を支援するために、様々なマトリックス、例えばPAM250スコアリングマトリックス、デイホフ(Dayhoff)マトリックス、グランサム(Grantham)マトリックス、マクラクラン(McLachlan)マトリックス、ドゥーリトル(Doolittle)マトリックス、ヘニコフ(Henikoff)マトリックス、ミヤタ(Miyata)マトリックス、フィッチ(Fitch)マトリックス、ジョーンズ(Jones)マトリックス、ラオ(Rao)マトリックス、レビン(Levin)マトリックス及びリスレ(Risler)マトリックスが構築されている(同上)。
は以下が含まれることになろう:AspとAsn;SerとThr;SerとAla;ThrとAla;AlaとGly;IleとVal;ValとLeu;LeuとIle;LeuとMet;PheとTyr;TyrとTrp。(例えばロックフェラー大学のウェブサイトPROWLを参照されたい)。溶媒に曝露された残基については、保存的置換には以下が含まれることになろう:AspとAsn;AspとGlu;GluとGln;GluとAla;GlyとAsn;AlaとPro;AlaとGly;AlaとSer;AlaとLys;SerとThr;LysとArg;ValとLeu;LeuとIle;IleとVal;PheとTyr。(同上)。アミノ酸置換の選択を支援するために、様々なマトリックス、例えばPAM250スコアリングマトリックス、デイホフ(Dayhoff)マトリックス、グランサム(Grantham)マトリックス、マクラクラン(McLachlan)マトリックス、ドゥーリトル(Doolittle)マトリックス、ヘニコフ(Henikoff)マトリックス、ミヤタ(Miyata)マトリックス、フィッチ(Fitch)マトリックス、ジョーンズ(Jones)マトリックス、ラオ(Rao)マトリックス、レビン(Levin)マトリックス及びリスレ(Risler)マトリックスが構築されている(同上)。
アミノ酸置換を決定する際には、分子間又は分子内の結合の存在、例えば正に荷電した残基(例えばHis、Arg、Lys)と負に荷電した残基(例えばAsp、Glu)との間のイオン結合(塩橋)、又は近隣のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成についても考慮する場合がある。
コードされたペプチド配列中で任意のアミノ酸を他のアミノ酸の代わりに用いる方法は良く知られており、当業者には日常的な実験作業の事柄であるが、これは例えば部位特異的変異誘発の技法によるもの、又はアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドの合成及びアセンブリ並びに発現ベクター構築物内へのスプライシングによるものである。
リンカー
加えて、本発明によって包含される修飾には、結合性の構成部分又は結合性ポリペプチドの標的化配列と、検出可能な標識又は治療薬との間のリンカー又はスペーサーの導入が含まれる。例えば、そのようなリンカー/スペーサーの使用は、該結合性ペプチドの重要な特性を改善する(例えば、血清安定性を高めるなど)可能性がある。これらのリンカーには、限定するものではないが、当分野で一般的な、置換若しくは非置換のアルキル鎖、ポリエチレングリコール誘導体、アミノ酸スペーサー、糖類、又は脂肪族若しくは芳香族スペーサーが挙げられる。
加えて、本発明によって包含される修飾には、結合性の構成部分又は結合性ポリペプチドの標的化配列と、検出可能な標識又は治療薬との間のリンカー又はスペーサーの導入が含まれる。例えば、そのようなリンカー/スペーサーの使用は、該結合性ペプチドの重要な特性を改善する(例えば、血清安定性を高めるなど)可能性がある。これらのリンカーには、限定するものではないが、当分野で一般的な、置換若しくは非置換のアルキル鎖、ポリエチレングリコール誘導体、アミノ酸スペーサー、糖類、又は脂肪族若しくは芳香族スペーサーが挙げられる。
例えば、適当なリンカーにはホモ二官能性及びヘテロ二官能性の架橋分子が含まれる。ホモ二官能性の分子は少なくとも2つの反応性官能基を有し、該官能基は同一である。ホモ二官能性の分子の反応性官能基には、例えば、アルデヒド基及び活性エステル基が挙げられる。アルデヒド基を有するホモ二官能性の分子には、例えば、グルタルアルデヒド及びスバルアルデヒド(subaraldehyde)が含まれる。
少なくとも2つの活性エステルユニットを有するホモ二官能性リンカー分子は、ジカルボン酸及びN−ヒドロキシスクシンイミドのエステルを備えている。そのようなN‐スクシンイミジルエステルのいくつかの例には、スベリン酸ジスクシンイミジル及びジチオ‐ビス‐(プロピオン酸スクシンイミジル)、並びにこれらの可溶性のビススルホン酸及びビススルナート塩、例えばそれらのナトリウム塩及びカリウム塩が挙げられる。
ヘテロ二官能性のリンカー分子は少なくとも2つの異なる反応性基を有する。反応性のジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能性試薬のいくつかの例には、N‐スクシンイミジル3‐(2‐ピリジル‐ジチオ)プロピオナート(カールソン(Carlsson)ら
、バイオケミカル・ジャーナル(Biochem. J.)、1978年、第173巻、p.723−737)、ナトリウムS‐4‐スクシンイミジルオキシカルボニル‐α‐メチルベンジルチオスルファート、及び4‐スクシンイミジルオキシカルボニル‐α‐メチル‐(2‐ピリジルジチオ)トルエンが挙げられる。N‐スクシンイミジル3‐(2‐ピリジルジチオ)プロピオナートが好ましい。チオール基と反応する二重結合を有する反応性基を含むヘテロ二官能性試薬のいくつかの例には、スクシンイミジル4‐(N‐マレイミドメチル)シクロヘキサへ(cyclohexahe)‐1‐カルボキシラート及びスクシンイミジルm‐マレイミドベンゾアートが挙げられる。他のヘテロ二官能性分子には、スクシンイミジル3‐(マレイミド)プロピオナート、スルホスクシンイミジル4‐(p‐マレイミド‐フェニル)ブチラート、スルホスクシンイミジル4‐(N‐マレイミドメチル‐シクロヘキサン)‐1‐カルボキシラート、マレイミドベンゾイル‐5N‐ヒドロキシ‐スクシンイミドエステルが挙げられる。
、バイオケミカル・ジャーナル(Biochem. J.)、1978年、第173巻、p.723−737)、ナトリウムS‐4‐スクシンイミジルオキシカルボニル‐α‐メチルベンジルチオスルファート、及び4‐スクシンイミジルオキシカルボニル‐α‐メチル‐(2‐ピリジルジチオ)トルエンが挙げられる。N‐スクシンイミジル3‐(2‐ピリジルジチオ)プロピオナートが好ましい。チオール基と反応する二重結合を有する反応性基を含むヘテロ二官能性試薬のいくつかの例には、スクシンイミジル4‐(N‐マレイミドメチル)シクロヘキサへ(cyclohexahe)‐1‐カルボキシラート及びスクシンイミジルm‐マレイミドベンゾアートが挙げられる。他のヘテロ二官能性分子には、スクシンイミジル3‐(マレイミド)プロピオナート、スルホスクシンイミジル4‐(p‐マレイミド‐フェニル)ブチラート、スルホスクシンイミジル4‐(N‐マレイミドメチル‐シクロヘキサン)‐1‐カルボキシラート、マレイミドベンゾイル‐5N‐ヒドロキシ‐スクシンイミドエステルが挙げられる。
更に、上述の分子及び構成部分のうち少なくともいずれかの組み合わせであるリンカーも、ペプチドの特性に格別な利点を与えるために使用可能である。リンカーを備えた脂質分子が、超音波気泡、リポソーム又はその他の集合系の構築物の処方を可能にするために取り付けられてもよい。そのような構築物は、診断用リポーター、治療薬(例えば治療用の化学「弾頭」)、又はこれらの組み合わせの標的化及び送達のための作用薬として使用されることも考えられる。
本発明の1つ以上のペプチドリガンドの二量体、多量体、又はポリマーを使用する構築物も企図される。実際、効力の低いペプチド又は小分子の結合は二量体及び多量体の形成によって大幅に高めることが可能であるという多くの文献証拠がある。よって、二量体構築物及び多重体構築物(同種及び異種混合のいずれも)は本発明の範囲内にある。二量体構築物におけるポリペプチド配列は、そのN末端若しくはC末端、又は適当に配されたリジン部分(又は、ペンダントオキシアミノ基若しくは他の求核基のような選択的に誘導体化可能な基を担持する別の官能基)のN‐ε窒素において取り付けられてもよいし、適切な連結化学構造を使用する1つ以上のリンカー(例えば本明細書中で議論されたもの)を介してともに接合されてもよい。このカップリング化学構造には、アミド、尿素、チオ尿素、オキシム、又はアミノアセチルアミド(クロロ‐又はブロモアセトアミド誘導体由来、ただしそのように限定はされない)が挙げられる。リンカーは、キレート剤への取り付けにも使用可能である。
治療薬
他の実施形態では、治療薬、例えば、限定するものではないが、細胞毒性薬、抗血管形成剤、アポトーシス促進性作用薬、抗生物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素又は他の作用薬は、本明細書中に記載された抗体/ペプチドリガンド複合体を使用する場合、補助療法として使用されうる。本発明において有用な薬物は、例えば、抗有糸分裂薬、抗キナーゼ薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗生物質、アルカロイド、抗血管形成剤、アポトーシス促進性作用薬及びこれらの組み合わせで構成されている群から選択された薬剤学的性質を有しうる。
他の実施形態では、治療薬、例えば、限定するものではないが、細胞毒性薬、抗血管形成剤、アポトーシス促進性作用薬、抗生物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素又は他の作用薬は、本明細書中に記載された抗体/ペプチドリガンド複合体を使用する場合、補助療法として使用されうる。本発明において有用な薬物は、例えば、抗有糸分裂薬、抗キナーゼ薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗生物質、アルカロイド、抗血管形成剤、アポトーシス促進性作用薬及びこれらの組み合わせで構成されている群から選択された薬剤学的性質を有しうる。
別の態様では、本発明は、SAS1Rに対して選択的親和性を有するがん細胞結合パートナーを同定する方法を提供する。該方法は、多様な結合性分子集団を固体支持体に選択的に固定化すること、固体支持体上に固定化された多様な集団を1つ以上のSAS1Rペプチド又はSAS1Rを発現している細胞と接触させる(例えば、同時に接触させる)こと、及び、バクテリオファージによって発現されたものを含むSAS1Rペプチドリガンドのうち1つ以上に選択的に結合する少なくとも1つの結合性分子を決定することを含む。さらに本明細書中に記載されるのは、対象とする1つ以上のSAS1R結合性分子に対する選択的親和性を示す結合性分子の同定のための迅速かつ効率的な方法である。該方法
は、多数の結合性分子の同時スクリーニングを可能にするという点で有利である。さらに、本発明において使用される結合性分子又はリガンドのいずれの同一性又は機能に関しても情報はほとんど必要ない。例えば、結合性分子の多様な集団は、所望の結合特異性を示す多数の分子を迅速に同定するためにペプチドリガンドの多様な集団に対して同時にスクリーニング可能である。したがって、本明細書中に記載された方法は、ヒトの疾患の診断及び治療のための、ペプチドリガンド及びバイオマーカーのような特異試薬の発見のために有利に適用可能である。
は、多数の結合性分子の同時スクリーニングを可能にするという点で有利である。さらに、本発明において使用される結合性分子又はリガンドのいずれの同一性又は機能に関しても情報はほとんど必要ない。例えば、結合性分子の多様な集団は、所望の結合特異性を示す多数の分子を迅速に同定するためにペプチドリガンドの多様な集団に対して同時にスクリーニング可能である。したがって、本明細書中に記載された方法は、ヒトの疾患の診断及び治療のための、ペプチドリガンド及びバイオマーカーのような特異試薬の発見のために有利に適用可能である。
本発明において有用な核酸には、例として、ただし限定ではなく、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、例えばアンチセンスDNA及びRNAのうち少なくともいずれかなど;リボザイム;遺伝子治療用のDNA;ウイルスのDNA及びRNAのうち少なくともいずれかを含むウイルスフラグメント;DNA及びRNAのうち少なくともいずれかのキメラ;mRNA;プラスミド;コスミド;ゲノムDNA;cDNA;遺伝子断片;様々な構造的形態のDNA、例えば一本鎖DNA、二本鎖DNA、超コイルDNA及び3重らせんDNAのうち少なくともいずれか;Z‐DNA;などが挙げられる。核酸は、大量の核酸を調製するために典型的に使用される任意の従来の手段によって調製されうる。例えば、DNA及びRNAは、市販の試薬及び合成装置を使用して、当分野でよく知られた方法によって化学合成されうる(例えば、ゲイト(Gait)、「オリゴヌクレオチド合成:実践的アプローチ(OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH)」、英国オクスフォードのIRLプレス(IRL
Press)、1985年を参照されたい)。RNAは、SP65(米国ウィスコンシン州マディソンのプロメガ・コーポレイション(Promega Corporation))のようなプラスミドを使用したin vitro転写によって高収率で生産されうる。
Press)、1985年を参照されたい)。RNAは、SP65(米国ウィスコンシン州マディソンのプロメガ・コーポレイション(Promega Corporation))のようなプラスミドを使用したin vitro転写によって高収率で生産されうる。
本発明についてここでは以降の実施例及び実施形態に関連して説明する。それ以上の説明はなされなくとも、当業者であれば、先の説明及び以降の実例となる例を使用して、本発明を作製かつ利用し、特許請求の範囲に記載された方法を実行することが可能であると考えられる。したがって以降の実施例は、例示のみを目的として提供されかつ本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘するものであり、本開示の残りの部分をどのようにも限定するように解釈されるものではない。したがって、該実施例は、本明細書中に提供される教示の結果として明白になるあらゆる変形形態を包含するように解釈されるべきである。
F. がんの診断
SAS1R陽性のがんの検出及び診断は、対象者から試料を得て該試料がSAS1Rについて陽性かどうかを決定することにより実施可能であり、組成物及び方法はSAS1R陽性細胞のin vivo画像診断用にも提供される。
SAS1R陽性のがんの検出及び診断は、対象者から試料を得て該試料がSAS1Rについて陽性かどうかを決定することにより実施可能であり、組成物及び方法はSAS1R陽性細胞のin vivo画像診断用にも提供される。
1つの実施形態では、SAS1Rを発現する腫瘍は診断のために直接標的とされることが可能である。これは、例えば、in vivo画像診断に有用な造影剤にコンジュゲート済みの、SAS1Rに対する抗体又はそのフラグメントを使用して行うことが可能である。
1つの実施形態では、対象者から得られた組織試料及び他の試料がSAS1Rを検出するために使用されてもよい。組織試料には、腫瘍生検標本及び他の組織であって死んだがん細胞から流出したSAS1Rを含むがん細胞由来のSAS1Rが存在するものが挙げられる。腫瘍生検標本以外の試料には、限定するものではないが、組織試料、血液、血漿、腹膜水、腹水、卵胞液、尿、糞便、唾液、粘液、痰、喀痰、涙液、脳脊髄液、肺滲出液のような滲出液、洗浄液、及びPapスミア標本が挙げられる。
抗体及び他のペプチドは、in vivoで画像化可能でありかつex vivoの試験及びアッセイ例えば免疫蛍光検査法、ELISAなどにおける画像化/検出に使用可能ないくつかの作用薬に、コンジュゲートされることが可能である。1つの実施形態では、抗体は、酵素免疫測定法、ウエスタンブロット法、ラテラルフロー式メンブレン試験、ラテックス凝集法、及び他の形式の少なくとも1つの抗体を利用する免疫クロマトグラフィ又はイムノアッセイ、のうち少なくとも1つを使用して検出される。1つの実施形態では、SAS1Rタンパク質はELISAを使用して検出される。
タンパク質及びペプチドを測定するための多数の技法が当分野において知られ、又は本明細書中に記載されており、本発明の実行において使用可能である。これらには、限定するものではないが、例えば:
電気化学発光イムノアッセイ;
生物発光イムノアッセイ(例えばアポエクオリン及びオエレンテラジン(oelenterazine)を使用するもの);
発光酸素チャネリングイムノアッセイ(Luminescent oxygen channeling immunoassay ;LOCI);
Erenna(登録商標)イムノアッセイシステム(単一分子の計数を伴う微粒子を利用した改変型サンドイッチイムノアッセイ);
ナノ粒子イムノアッセイ:固相としてナノ粒子、球体、又はチューブ
― 反ストークスシフトを用いてリン光体ナノ粒子をアップコンバートする
― 量子ドットイムノアッセイ(ナノメートルサイズ(10nm未満)の半導体量子ドットが標識として使用される不均一系イムノアッセイ。量子ドットは、CdSe、CdS、ZnSe、InP、若しくはInAs、又は例えばCdSeコア上のZnS若しくはCdSの層でできた、強い蛍光を発するナノ結晶である);
蛍光励起転移イムノアッセイ;
イムノPCRイムノアッセイ;
固相の光散乱イムノアッセイ:抗原への抗体結合を測定するためにインジウム球体がガラス上にコーティングされる。抗原への抗体の結合により誘電体層が厚さを増し、これにより抗原のみが結合しているエリアよりも大きな散乱度が生じる。定量は密度計測によって達成される;並びに
表面効果(Surface Effect)イムノアッセイ:導波路(石英、ガラス、若しくはプラスチックのスライド、又は金若しくは銀でコーティングされたプリズム)の表面上に固定化された抗体を用い、抗原の結合は全内部反射蛍光、表面プラズモン共鳴、又は減衰全反射によって直接測定される;が挙げられる。
電気化学発光イムノアッセイ;
生物発光イムノアッセイ(例えばアポエクオリン及びオエレンテラジン(oelenterazine)を使用するもの);
発光酸素チャネリングイムノアッセイ(Luminescent oxygen channeling immunoassay ;LOCI);
Erenna(登録商標)イムノアッセイシステム(単一分子の計数を伴う微粒子を利用した改変型サンドイッチイムノアッセイ);
ナノ粒子イムノアッセイ:固相としてナノ粒子、球体、又はチューブ
― 反ストークスシフトを用いてリン光体ナノ粒子をアップコンバートする
― 量子ドットイムノアッセイ(ナノメートルサイズ(10nm未満)の半導体量子ドットが標識として使用される不均一系イムノアッセイ。量子ドットは、CdSe、CdS、ZnSe、InP、若しくはInAs、又は例えばCdSeコア上のZnS若しくはCdSの層でできた、強い蛍光を発するナノ結晶である);
蛍光励起転移イムノアッセイ;
イムノPCRイムノアッセイ;
固相の光散乱イムノアッセイ:抗原への抗体結合を測定するためにインジウム球体がガラス上にコーティングされる。抗原への抗体の結合により誘電体層が厚さを増し、これにより抗原のみが結合しているエリアよりも大きな散乱度が生じる。定量は密度計測によって達成される;並びに
表面効果(Surface Effect)イムノアッセイ:導波路(石英、ガラス、若しくはプラスチックのスライド、又は金若しくは銀でコーティングされたプリズム)の表面上に固定化された抗体を用い、抗原の結合は全内部反射蛍光、表面プラズモン共鳴、又は減衰全反射によって直接測定される;が挙げられる。
1つの態様では、本発明の抗体又はそのフラグメント若しくは相同体は、造影剤にコンジュゲートされることも可能である。1つの実施形態では、抗体複合体は、放射性核種、放射性造影剤、常磁性イオン、金属、生物学的タグ、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤及び光活性作用薬で構成されている群から選択された造影剤を含む。1つの態様では、造影剤は放射性核種である。1つの態様では、放射性核種は、110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154‐158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr、及びその他のγ‐、β‐、若しくは陽電子放出核で構成されている群から選択される。1つの態様では、放射性核種は111Inである。
本発明は、薬物送達及び診断のための本明細書中に記載されたモノクローナル抗体の使用をさらに提供する。例えば、本明細書中に記載されるような様々な作用薬は抗体にコンジュゲートされることが可能である。カリケアミシンのような薬物、D(KLAKLAK
)2のようなペプチド、並びにβ90Y、γ131I及び陽電子124I放出核のような放射性核種は、ヒトSAS1Rに対するモノクローナル抗体にコンジュゲートされて、肺腫瘍を画像化するため、治療用の放射線治療薬及び化学療法薬として、用いられることが可能である。
)2のようなペプチド、並びにβ90Y、γ131I及び陽電子124I放出核のような放射性核種は、ヒトSAS1Rに対するモノクローナル抗体にコンジュゲートされて、肺腫瘍を画像化するため、治療用の放射線治療薬及び化学療法薬として、用いられることが可能である。
本発明は、がん細胞がSAS1R又はその相同体若しくはフラグメントを発現又は提示する、がんの検出、がんの診断、がんの進行のモニタリング、又はがんの治療モニタリングのための方法をさらに提供する。該方法は、試験対象者に、造影剤を含むペプチドリガンド複合体を含む医薬組成物を投与することと、その後、該造影剤を検出すること並びに試験対象者における該造影剤のレベル及び場所を決定することとを含む。該レベルは、MRI、PET、SPECT/CT、CATスキャン、X線、超音波などいずれであれ、特定の種類の画像診断のためのシステム、コンピュータ、及びプログラムを使用して決定される。その後、該レベルの最終処理から得られた値が比較に使用される。試験対象者におけるレベルおよび場所の比較は、非罹患者からの他の点では同一の場所由来の造影剤のレベル及び場所との間、又は試験対象者の非罹患エリアとの間で行われる。非罹患者由来又は試験対象者の非罹患エリア由来の前記試料中の造影剤のレベル又は場所と比較して、試験対象者における造影剤が高レベルであるか又は場所が異なることにより、該試験対象者がSAS1R又はその相同体若しくはフラグメントを発現又は提示しているがんを有することが示される。検出された造影剤のレベル又は場所は、バイオマーカーSAS1Rの場所及び量の指標である。
1つの実施形態では、がんは、肺がん、MMMT、膀胱がん、卵巣がん、子宮がん、子宮内膜がん、乳がん、頭頸部がん、肝臓がん、膵臓がん、食道がん、胃がん、子宮頚がん、前立腺がん、副腎がん、リンパ腫、白血病、唾液腺がん、骨がん、脳腫瘍、小脳腫瘍、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、口腔鼻咽頭がん、NPC、腎臓がん、皮膚がん、黒色腫、基底細胞癌、硬口蓋癌、舌扁平上皮細胞癌、髄膜腫、多形腺腫、星細胞腫、軟骨肉腫、皮質腺腫、肝細胞癌、膵臓がん、扁平上皮細胞癌、及び腺癌で構成されている群から選択される。
1つの態様では、がんは転移がんである。
本発明はさらに、がんが良性か悪性かを判断する助けとなるように、画像化されているSAS1Rのレベルを、検出された造影剤のレベル(SAS1R量の測定値)に基づいて比較するのにも有用である。
本発明はさらに、がんが良性か悪性かを判断する助けとなるように、画像化されているSAS1Rのレベルを、検出された造影剤のレベル(SAS1R量の測定値)に基づいて比較するのにも有用である。
本発明はさらに、がんの発がん段階を判定し、かつ初期段階から後期段階のがんへのがんの進行をモニタリングするのにも有用である。この方法は使用する治療法の種類及び量を決定するのに有用である。
任意選択で、治療薬は画像化複合体を含む医薬組成物に取り付けられてもよいし、該組成物中に含められてもよい。
本明細書中で使用されるような臨床関連のPET/SPECTトレーサーは、小さな腫瘍および転移の検出を可能にする。
本明細書中で使用されるような臨床関連のPET/SPECTトレーサーは、小さな腫瘍および転移の検出を可能にする。
1つの態様では、造影剤又は検出可能な構成部分には、限定するものではないが、放射性核種、放射性造影剤、常磁性イオン、金属、生物学的タグ、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤及び光活性作用薬が挙げられる。
本発明の、抗体又はその相同体若しくはフラグメントの画像化複合体は、がんがSAS1R陽性のがんである限り、本明細書中に開示されたもの以外のがんの検出、診断、及び場所特定を包含する。本発明は、SAS1Rのレベルを定量することをさらに提供し、よ
って正常、良性、及び悪性の組織を識別する能力を包含する。
って正常、良性、及び悪性の組織を識別する能力を包含する。
本発明は、血液試料中のSAS1RマイクロRNAの、バイオマーカーとしての検出を含む。miRNAは長さ22ヌクレオチド以下のRNA分子である。これらの分子は、いくつかの種類のがんの病理に強く関与することが見出されている。miRNA分子はEDTA処理後に血清及びその構成成分とともにある時は安定であることが概ね見出されているが、PCRによるmiRNAへのロックト核酸(LNA)の導入は、miRNAの安定性をさらに増大させる。LNAは、リボース環の2’‐O原子及び4’‐C原子を接続するメチレン架橋によってリボース環が「ロックされている」部類の核酸アナログであり、該分子の他の分子への親和性を高める。
本発明は、本発明の少なくとも1つの抗体リガンド複合体、使用説明資料を含むキットをさらに提供し、かつ任意選択で少なくとも1つの造影剤及び任意選択で少なくとも1つの治療薬を備えている。
本発明は、SAS1RのmRNA及びタンパク質の発現及びレベルを測定するための多数の技法、例えば、限定するものではないが、PCR、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法、免疫組織化学法、及び免疫蛍光検査法などを提供する。
がんの治療
本発明はSAS1Rを発現するがんを治療するための組成物及び方法を提供する。1つの態様では、発現されるSAS1Rはタンパク質である。1つの態様では、本発明は、がん細胞の表面上のSAS1Rに特異的に結合することができる抗体の使用を包含する。1つの態様では、抗体は本明細書中に記載されたエピトープのうちの1つに結合することができる。1つの態様では、抗体は本明細書中に開示された配列及びフラグメントのうちの1つに結合することができる。前記抗体は、例えば、一本鎖抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、合成抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、又はこれらの活性なフラグメント若しくは相同体であってよい。1つの態様では、治療薬が抗体に結合される。
本発明はSAS1Rを発現するがんを治療するための組成物及び方法を提供する。1つの態様では、発現されるSAS1Rはタンパク質である。1つの態様では、本発明は、がん細胞の表面上のSAS1Rに特異的に結合することができる抗体の使用を包含する。1つの態様では、抗体は本明細書中に記載されたエピトープのうちの1つに結合することができる。1つの態様では、抗体は本明細書中に開示された配列及びフラグメントのうちの1つに結合することができる。前記抗体は、例えば、一本鎖抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、合成抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、又はこれらの活性なフラグメント若しくは相同体であってよい。1つの態様では、治療薬が抗体に結合される。
1つの実施形態では、本発明は、がんを診断及び治療するのに有用な抗体であって、SAS1Rに結合する抗体を提供する。1つの実施形態では、本発明は、がんを診断及び治療するのに有用な抗体であって、SAS1Rのエピトープに結合する抗体を提供する。1つの態様では、本発明は、本発明の抗体を含む医薬組成物を提供する。
SAS1Rに対する抗体にコンジュゲートせしめられ、かつ該抗体と組み合わせて使用されることが可能な、数多くの治療薬が利用可能である。例えば、SAS1Rに取り付けることが可能な分子には、限定するものではないが、プロドラッグ、薬物、毒素、タンパク質毒素、リポソーム、封入リポソーム、放射性同位体、及び酵素が挙げられる。「抗体指向性酵素プロドラッグ療法(antibody−directed enzyme prodrug therapy)」(ADEPT)と名付けられた、プロドラッグを部位特異的に活性化して強力な細胞毒性化学種とするための腫瘍関連抗原を対象とした抗体‐酵素コンジュゲートの使用である。1つの態様では、SAS1Rを対象とする抗体は、抗体を介した補体依存性の細胞死によってがんを治療するのに有用である。
SAS1Rの段階特異的発現ゆえに、仮にがん患者における治療法を目標とすれば、卵巣の原始卵胞及び一次卵胞の中に含まれる卵母細胞の予備は保存されることになろう。それは、SAS1Rが卵母細胞に特異的であるだけでなく、卵母細胞内で時間的かつ空間的に正確に発現されるからである。例えば、SAS1Rの発現は、卵胞の成熟の間の卵母細胞の発生の特定の段階に特異的である(データは示されない)。SAS1Rタンパク質は
、卵巣内で、卵胞の成熟の二次卵胞段階に達した卵母細胞においてのみ出現する。SAS1Rはその後、続く前胞状及び胞状の卵胞の段階における卵母細胞にのみ残存する。SAS1Rが出現する最初の段階である二次卵胞は、顆粒膜細胞の2以上の層で包まれた卵母細胞として定義される。この知見は、薬物標的、ワクチン、又は遺伝子若しくは薬物の送達用の表面標的としてSAS1Rを使用することにより、成熟している卵母細胞の集合のみを対象とし、かつ原始及び一次卵胞の中に含まれる卵母細胞は対象としない選択的な攻撃が可能となるであろうということを示している。換言すれば、これは、SAS1Rを標的とすることにより、卵巣の未熟な卵母細胞の予備は救われるであろうという決定的な実証である。
、卵巣内で、卵胞の成熟の二次卵胞段階に達した卵母細胞においてのみ出現する。SAS1Rはその後、続く前胞状及び胞状の卵胞の段階における卵母細胞にのみ残存する。SAS1Rが出現する最初の段階である二次卵胞は、顆粒膜細胞の2以上の層で包まれた卵母細胞として定義される。この知見は、薬物標的、ワクチン、又は遺伝子若しくは薬物の送達用の表面標的としてSAS1Rを使用することにより、成熟している卵母細胞の集合のみを対象とし、かつ原始及び一次卵胞の中に含まれる卵母細胞は対象としない選択的な攻撃が可能となるであろうということを示している。換言すれば、これは、SAS1Rを標的とすることにより、卵巣の未熟な卵母細胞の予備は救われるであろうという決定的な実証である。
成体組織の中ではSAS1Rは卵母細胞及び本明細書中で開示されるように腫瘍においてのみ発現されるので、SAS1Rを標的とすることになる本発明の方法は、薬物標的又はワクチンとしてのその使用によりSAS1Rを発現する細胞及び組織の選択的標的化を可能にするということを意味している。
加えて、SAS1Rは活性酵素であることが知られており、よってがん治療のための新薬開発につながりうる(drugable)標的である。
本明細書中に開示されたもののような制がん剤標的は、がん標的療法のためだけでなく、該標的を発現しない正常な細胞に害を及ぼさないための本質的な基準を満たしている。
本明細書中に開示されたもののような制がん剤標的は、がん標的療法のためだけでなく、該標的を発現しない正常な細胞に害を及ぼさないための本質的な基準を満たしている。
本発明はSAS1Rの他のタンパク質との相互作用を阻害するのに有用な組成物及び方法を提供する。本願はさらに、がんを検出及び治療するためのSAS1Rを対象とする抗体の使用も提供する。1つの態様では、抗体の種類には、限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、及び合成抗体が挙げられる。1つの態様では、抗体はモノクローナル抗体である。本発明は、本発明のモノクローナル抗体を含むハイブリドーマをさらに提供する。本発明は、本発明の抗体の配列及びフラグメントをさらに提供する。
SAS1Rの阻害剤には、SLLP1のような精子タンパク質若しくは任意の他のタンパク質とのSAS1Rの相互作用若しくは結合、プロテアーゼとしてのSAS1Rの活性を阻害するか、又はがん細胞におけるその役割などのSAS1Rシグナル伝達経路に含まれる下流の活性のSAS1Rによる調節を阻害するものが挙げられる。1つの態様では、阻害剤は、SAS1R、又はSLLP1に結合するSAS1Rのフラグメント若しくは相同体である。1つの態様では、SAS1Rフラグメントは該タンパク質のN末端部分である。1つの態様では、N末端は、成熟SAS1Rのアミノ末端の約121アミノ酸残基を含む。別の態様では、SLLP1と結合しかつSLLP1の卵子との相互作用を阻害するSAS1Rフラグメントは、SAS1RのC末端部分である。1つの態様では、SAS1RのC末端はSAS1Rのカルボキシ末端の約210アミノ酸残基を含む。当業者には当然のことであるが、本明細書中に記載されるようなSAS1Rのレベル、機能、若しくは活性を阻害する任意の種類の化合物、又は未知の化合物が、本発明に包含される。
SAS1Rの阻害剤は、例えばSAS1Rの機能、活性、発現、及びタンパク質レベルを阻害する任意の種類の分子であってよい。1つの態様では、SAS1Rは該タンパク質のN末端部分において阻害される。1つの態様では、該N末端は、成熟型SAS1Rのアミノ末端の約121アミノ酸残基を含む。別の態様では、SAS1Rは該タンパク質のC末端部分において阻害される。1つの態様では、該タンパク質のC末端はSAS1Rのカルボキシ末端の約210アミノ酸残基を含む。1つの態様では、阻害剤はSAS1Rを対象とする抗体である。別の態様では、阻害剤は薬物又は他の化合物である。1つの態様では、阻害剤はSAS1Rのプロテアーゼ活性を阻害する。別の態様では、阻害剤は、SLLP1又は任意の他のタンパク質とのSAS1Rの相互作用を阻害する。1つの態様では
、該相互作用は結合である。
、該相互作用は結合である。
本発明者らは、驚くべきことに、免疫療法的な戦略に適した抗原にはタンパク質SAS1Rが含まれることを見出した。本願は、正常な細胞の卵子に由来する免疫原であって本明細書中で開示されるように例えば肺、子宮及び卵巣のがんにおいても発現される免疫原を含む免疫原性組成物を開示する。その抗原はSAS1Rタンパク質、並びに該タンパク質の抗原性のフラグメント及び相同体である。本願は、そのような戦略を使用して、SAS1Rを発現する細胞を殺滅可能であることを実証する。
本発明は、がん、例えば腎臓がんを検出及び診断するために、かつ腎臓がんのようながんを治療するために、有用な組成物及び方法を提供する。
1つの態様では、SAS1R、又は完全長SAS1Rの免疫原活性を維持しているそのフラグメント若しくは相同体は、SAS1Rに対する免疫応答を誘発するために対象者に投与されることが可能である。1つの態様では、免疫応答を誘発するSAS1R並びにそのフラグメント及び相同体の投与は、ワクチンとして有用である。1つの態様では、それはがんに対するワクチンである。1つの態様では、がんは肺、子宮がん又は卵巣がんである。1つの態様では、がんは悪性混合ミュラー腫瘍である。1つの態様では、卵巣がんは漿液性卵巣がんである。
1つの態様では、SAS1R、又は完全長SAS1Rの免疫原活性を維持しているそのフラグメント若しくは相同体は、SAS1Rに対する免疫応答を誘発するために対象者に投与されることが可能である。1つの態様では、免疫応答を誘発するSAS1R並びにそのフラグメント及び相同体の投与は、ワクチンとして有用である。1つの態様では、それはがんに対するワクチンである。1つの態様では、がんは肺、子宮がん又は卵巣がんである。1つの態様では、がんは悪性混合ミュラー腫瘍である。1つの態様では、卵巣がんは漿液性卵巣がんである。
SAS1Rアイソフォームは、卵母細胞及び形質導入細胞においては細胞表面上に、加えて本明細書中に記載されるようにがん細胞においても見出される。したがって、表面上にSAS1Rを発現しているがん細胞では、SAS1Rは腫瘍選択的な表面標的である。1つの態様では、がん細胞はSAS1Rを対象とする抗体を用いて標的化されることが可能である。1つの態様では、抗体はヒト化抗体である。1つの態様では、抗体にはがん細胞に送達するための毒素又は薬物が連結されている。
1つの実施形態では、本発明の組成物及び方法は哺乳動物において有用である。1つの態様では、哺乳動物はヒトである。
SAS1R酵素は、二次及びその後の卵胞の卵母細胞、例えば前胞状及び胞状の卵胞において発生段階特異的な発現を示し(データは示されない)、よって裸の卵母細胞、原始卵母細胞及び一次卵母細胞には害を及ぼさず、かつ卵巣の生殖細胞の予備を保存するであろうがん治療のための、又はワクチンとしての、適当な標的となる。したがって、本発明は、SAS1Rを阻害する化合物を同定するための組成物及び方法をさらに包含する。
SAS1R酵素は、二次及びその後の卵胞の卵母細胞、例えば前胞状及び胞状の卵胞において発生段階特異的な発現を示し(データは示されない)、よって裸の卵母細胞、原始卵母細胞及び一次卵母細胞には害を及ぼさず、かつ卵巣の生殖細胞の予備を保存するであろうがん治療のための、又はワクチンとしての、適当な標的となる。したがって、本発明は、SAS1Rを阻害する化合物を同定するための組成物及び方法をさらに包含する。
本発明は、がんを治療する方法をさらに提供する。1つの態様では、本発明はSAS1Rを発現しているがん細胞を治療するための組成物及び方法を提供する。1つの態様では、SAS1Rは細胞表面タンパク質である。SAS1Rを発現しているがん細胞を治療する方法には、本明細書中に記載された方法、並びにSAS1R及びその活性を標的とすることができる他の既知の方法が含まれる。
診断バイオマーカーを特異療法へと結びつけることにより、特異治療に応答するであろう疾患を有する対象者の同定によるがんの「知的」治療がもたらされることになろう。これは「個別化(individualized)療法」又は「テーラーメイド(personalized)医療」と呼ばれることも多い。例えば、卵巣がん又は子宮がんのバイオマーカーは、より小規模の、よりコスト効率の良い治験のためのより均質な患者集団の選択を可能にすることにより、薬物開発に関連するコストを大幅に縮小するであろう。有用なバイオマーカーはさらに、臨床開発の初期段階でどの作用薬を追求するべきかに関する決定を促進することにより、薬物開発を加速することも可能である。良好な診断試験又はスクリーニング試験、及び治療薬又はワクチンの標的いずれにもなりうる標的を重視することによって、特別な進歩が可能であるかもしれない。
本発明は、SAS1Rの識別特性を同定するために対象者の腫瘍を表現型で表す手段を提供する。この対象者は恐らく、SAS1R標的療法から利益を得ることになろう。そのような治療法は、非選択的な作用機序が原因で衰弱、毛髪脱落、下痢及び貧血を引き起こす、より伝統的な化学療法剤の前に使用される、第1又は「最先端の」治療法となりうる。
本発明は、がん細胞におけるアクチン分布の変更及び細胞の外観の変更であって、前記細胞をSAS1Rに対する抗体と接触させることを含んでなり、前記抗体はSAS1Rと結合し、細胞のアクチン分布が変更され、かつ細胞の外観が変更される、変更をさらに提供する。
本発明は、SAS1Rに対する免疫応答を誘発するために、SAS1R、並びにそのフラグメント及び相同体を利用する組成物及び方法をさらに提供する。1つの態様では、SAS1R又はその抗原性のフラグメント若しくは相同体の投与はSAS1Rの阻害をもたらす。1つの態様では、そのような免疫原性の応答及び生じるSAS1R機能の阻害。
多数の研究から、診断時に、がん患者が自身の血流内に流血中がん細胞を既に有していることが実証されている。血液1ミリリットル中に5個又は10個のがん細胞が見つかることも珍しくない。これは、診断時において数千個のがん細胞が潜在的な転移として事実上すべての臓器に存在することが珍しくないことを意味している。これらの細胞のごく一部分でも生残ると転移の発生がもたらされ、患者の生存を縮小することになる。
本発明は、SAS1Rを検出するための本明細書中で実証された技法を包含し、当業者であれば他の技法も同様に使用可能であることを認識するであろう。タンパク質の検出及び測定は数多くの方法で行われることが可能である。例えば、有用な方法には、例えば、LC‐MS/MS分析の実施であり、これは、サーモフィニガン(ThermoFinnigan)のSurveyor HPLCポンプ及びマイクロエレクトロスプレー供給源を装備し、かつサーモフィニガンのXcaliburバージョン1.2システムコントロール及びデータ解析ソフトウェアを用いて操作される、サーモフィニガンLCQ DecaイオントラップMS機器で実施可能である。試料の分析は、アセトニトリルグラジエント、並びにMoniterC18(カラム・エンジニアリング(Column Engineering))がパックされた100μmのID、360μmのOD及び5−15μmのチップ開口部を備えたチップを用いて、実施可能である。HPLCポンプからの流送物は分割されて、パックされたチップからは500nL〜1μlの流量とすることができる。分析されている試料の複雑さに応じて、2つのグラジエント「高速」及び「正常」が使用可能である。
タンパク質はタンデム質量分光分析に供されて、ペプチド配列を得ることが可能である。
1つの実施形態では、本発明は、薬学的に許容可能な担体及びSAS1R又はその相同体、フラグメント若しくは誘導体を含む医薬組成物であって、前記タンパク質は対象者において免疫応答を引き起こすことができる医薬組成物を提供する。1つの態様では、該方法はワクチンとして、又は治療として有用である。1つの態様では、本発明は、医薬組成物であって、前記卵子タンパク質又はペプチドは配列番号6、8、10、19、20、21、及び23、並びにこれらのフラグメント及び相同体で構成されている群から選択されたアミノ酸配列を含む、医薬組成物を提供する。
1つの実施形態では、本発明は、薬学的に許容可能な担体及びSAS1R又はその相同体、フラグメント若しくは誘導体を含む医薬組成物であって、前記タンパク質は対象者において免疫応答を引き起こすことができる医薬組成物を提供する。1つの態様では、該方法はワクチンとして、又は治療として有用である。1つの態様では、本発明は、医薬組成物であって、前記卵子タンパク質又はペプチドは配列番号6、8、10、19、20、21、及び23、並びにこれらのフラグメント及び相同体で構成されている群から選択されたアミノ酸配列を含む、医薬組成物を提供する。
1つの実施形態では、卵子タンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの単離核酸が投与される。1つの態様では、卵子タンパク質は、配列番号6、8、10、19
、20、21、及び23、並びにこれらのフラグメント及び相同体で構成されている群から選択された配列を含む。
、20、21、及び23、並びにこれらのフラグメント及び相同体で構成されている群から選択された配列を含む。
投与されたタンパク質、又はタンパク質をコードする配列を含む投与された単離核酸によって発現されたタンパク質は、SLLP1及びSAS1Rの相互作用又は結合を阻害するように作用することができる。
本発明はさらに、SAS1Rを検出するためにSAS1Rと結合又は相互作用することができる少なくとも1つのSLLP1タンパク質又はその生物学的に活性な相同体及びフラグメントを投与することも提供する。1つの態様では、SLLP1タンパク質は標識される。
当然ながら、本発明のタンパク質又はペプチドが活性に影響を及ぼすことなく修飾されたアミノ酸残基を組込みうることは認識されるであろう。例えば、末端は、ブロック基、すなわち「望ましからぬ分解」からのN末端及びC末端の保護及び安定化のうち少なくともいずれかをなすのに適した化学置換基を含むように誘導体化されてもよく、「望ましからぬ分解」とは、化合物の機能に影響しやすい、該化合物の末端における任意の種類の酵素的、化学的又は生化学的破壊、すなわち該化合物の末端部における連続的分解を包含することを意味する用語である。
ブロック基には、ペプチドのin vivoでの活性に悪影響を及ぼさないであろう、ペプチド化学の分野で従来使用される保護基が含まれる。例えば、適当なN末端ブロック基は、N末端のアルキル化又はアシル化により導入可能である。適当なN末端ブロック基の例には、C1‐C5の分岐又は非分岐のアルキル基、ホルミル基及びアセチル基のようなアシル基、並びにそれらの置換型、例えばアセトアミドメチル(Acm)基が挙げられる。アミノ酸のデスアミノアナログも有用なN末端ブロック基であり、ペプチドのN末端に結合されるか、又はN末端の残基(reside)の代わりに使用されることが可能である。適当なC末端ブロック基には、C末端のカルボキシル基が該ブロック基に組込まれる場合も組込まれない場合もあるが、エステル、ケトン又はアミドが挙げられる。エステル又はケトンを形成するアルキル基、特にメチル、エチル及びプロピルのような低級アルキル基、並びにアミドを形成するアミノ基、例えば第一級アミン(‐NH2)、並びにモノ‐及びジ‐アルキルアミノ基、例えばメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノなどは、C末端ブロック基の例である。アグマチンのようなデスカルボキシルアミノ酸アナログも有用なC末端ブロック基であり、ペプチドのC末端残基に結合せしめられるか、又は該残基の代わりに使用されることが可能である。さらに、ペプチドから末端の遊離のアミノ基及びカルボキシル基が全部取り除かれて、該ペプチドのデスアミノ及びデスカルボキシル形態をペプチド活性に影響することなく生じることができることは、認識されるであろう。
その他の修飾も活性に悪影響を及ぼすことなく組込むことが可能であり、これらには、限定するものではないが、1つ以上の天然のL‐異性体のアミノ酸を、D‐異性体のアミノ酸で置換することが挙げられる。よって、ペプチドは1つ以上のD‐アミノ酸残基(resides)を含んでもよいし、すべてD型であるアミノ酸を含むこともできる。本発明によるペプチドのレトロインバルソ型、例えば、全てのアミノ酸がD型アミノ酸に置換されている逆向きペプチドも企図される。
本発明の酸付加塩も機能的等価物として企図される。よって、本発明によるペプチドが、該ペプチドの水溶性の塩を提供するために、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など、又は有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、タタリック(ta
taric)、クエン酸、安息香酸、シナミー(cinnamie)、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p‐トルエンスルホン酸、サリサイクリック(salicyclic)などで処理されたものは、本発明で使用するのに適している。
taric)、クエン酸、安息香酸、シナミー(cinnamie)、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p‐トルエンスルホン酸、サリサイクリック(salicyclic)などで処理されたものは、本発明で使用するのに適している。
修飾(通常は一次配列を変更しない)には、in vivo、又はin vitroにおけるポリペプチドの化学的誘導体化、例えばアセチル化、又はカルボキシル化が挙げられる。さらに挙げられるのは、グリコシル化の修飾、例えばポリペプチドの合成及びプロセシングの間、又はその後のプロセシングステップにおいて該ポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することにより;例えばグリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば哺乳類のグリコシル化酵素又は脱グリコシル化酵素にポリペプチドを曝露することにより、なされる修飾である。さらに包含されるのは、リン酸化されたアミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、又はホスホトレオニンを有する配列である。
さらに挙げられるのは、タンパク質分解に対するポリペプチドの抵抗性を改善するか、又は溶解特性を最適化するか、又はポリペプチドを治療薬としてより適当なものとするために、通常の分子生物学的技法を使用して修飾されたポリペプチドである。そのようなポリペプチドのアナログには、天然に存在するL‐アミノ酸以外の残基、例えばD‐アミノ酸又は天然に存在しない合成アミノ酸を含有するアナログが含まれる。本発明のペプチドは、本明細書中に列挙された特定の例示のプロセスのうちいずれの生成物にも限定されない。
本発明において有用な核酸には、例として、ただし限定ではなく、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、例えばアンチセンスDNA及びRNAのうち少なくともいずれかなど;リボザイム;遺伝子治療用のDNA;ウイルスのDNA及びRNAのうち少なくともいずれかを含むウイルスフラグメント;DNA及びRNAのうち少なくともいずれかのキメラ;mRNA;プラスミド;コスミド;ゲノムDNA;cDNA;遺伝子フラグメント;様々な構造的形態のDNA、例えば一本鎖DNA、二本鎖DNA、超コイルDNA及び3重らせんDNAのうち少なくともいずれか;Z‐DNA;などが挙げられる。核酸は、大量の核酸を調製するために典型的に使用される任意の従来の手段によって調製されうる。例えば、DNA及びRNAは、市販の試薬及び合成装置を使用して、当分野でよく知られた方法によって化学合成されうる(例えば、ゲイト(Gait)、「オリゴヌクレオチド合成:実践的アプローチ(OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS:
A PRACTICAL APPROACH)」、英国オクスフォードのIRLプレス(IRL Press)、1985年を参照されたい)。RNAは、SP65(米国ウィスコンシン州マディソンのプロメガ・コーポレイション(Promega Corporation))のようなプラスミドを使用したin vitro転写によって高収率で生産されうる。
A PRACTICAL APPROACH)」、英国オクスフォードのIRLプレス(IRL Press)、1985年を参照されたい)。RNAは、SP65(米国ウィスコンシン州マディソンのプロメガ・コーポレイション(Promega Corporation))のようなプラスミドを使用したin vitro転写によって高収率で生産されうる。
実施例
〔SAS1Bはin vitroで子宮がん細胞内に取り込まれ、エンドサイトーシス経路のタンパク質とともに共局在化する。〕 図1は、SAS1Bに対する抗体とともに4℃でインキュベートされ、37℃に15分間暖められ、次いでSAS1B抗体の場所について染色されたMMMT538細胞を示す。小さなSAS1B抗体陽性の小胞は細胞膜直下の細胞周辺部に観察された。図2は、同様の処理、ただし37℃で60分間のインキュベーション後のMMMT539細胞を示す。SAS1B抗体陽性の小胞は、より大きくなり、かつ細胞質内でより深く内部に取り込まれていることが見出された。これらの結果は、SAS1BがMMMT細胞の中に取り込まれることを示している。SAS1B陽性の小胞は、エンドサイトーシス経路の初期及び後期アームの構成成分とともに共局在化した。図3は、例えば、緑色のSAS1B陽性の小胞がエンドサイトーシス経路の初期アームのマーカーであるEEA1について染色している赤色の小胞とともに共局在化した場所で
ある黄色の小胞(矢印)を示している。同様の結果は、エンドサイトーシス経路の後期アームのマーカーであるLAMP1を用いても示された。
〔SAS1Bはin vitroで子宮がん細胞内に取り込まれ、エンドサイトーシス経路のタンパク質とともに共局在化する。〕 図1は、SAS1Bに対する抗体とともに4℃でインキュベートされ、37℃に15分間暖められ、次いでSAS1B抗体の場所について染色されたMMMT538細胞を示す。小さなSAS1B抗体陽性の小胞は細胞膜直下の細胞周辺部に観察された。図2は、同様の処理、ただし37℃で60分間のインキュベーション後のMMMT539細胞を示す。SAS1B抗体陽性の小胞は、より大きくなり、かつ細胞質内でより深く内部に取り込まれていることが見出された。これらの結果は、SAS1BがMMMT細胞の中に取り込まれることを示している。SAS1B陽性の小胞は、エンドサイトーシス経路の初期及び後期アームの構成成分とともに共局在化した。図3は、例えば、緑色のSAS1B陽性の小胞がエンドサイトーシス経路の初期アームのマーカーであるEEA1について染色している赤色の小胞とともに共局在化した場所で
ある黄色の小胞(矢印)を示している。同様の結果は、エンドサイトーシス経路の後期アームのマーカーであるLAMP1を用いても示された。
〔SAS1Bを備えた細胞株及びSAS1Bのない細胞株。〕 図4は、310bpのc末端SAS1BアンプリマーがMMMT539細胞中にはあるがウイルスで形質転換された子宮間質細胞株MAD10には無いことを示し、MMMT539細胞はSAS1Bを発現するがMAD10細胞は発現しないことを実証している。
〔免疫毒素は、SAS1Bを有する細胞の成長を停止するがSAS1Bを欠く細胞の成長は停止しない。〕 SAS1Bは正常組織の中では卵母細胞にのみ見出されるので、SAS1Bが腫瘍において発現されている場合、その存在は腫瘍選択的な化学療法薬の作用機構を達成する機会を供している。シスプラチン又はカルボタキソールのような数多くの現在のがん治療薬は、種々様々の臓器系に存在する主要な全般的経路に関わるタンパク質を標的とする。これらには、細胞複製;シグナル伝達、有糸分裂及び細胞移動に関与するタンパク質が挙げられる。その結果、数多くの現代の化学療法薬は、悪心、毛髪脱落、下痢、皮膚病変を引き起こし、かつ生殖細胞を激減させて、多くの患者にとってこれらの薬物の持続を困難とし、また不妊症を克服するための配偶子の低温保存を必要としている。本明細書中で議論された手法は、腫瘍及び費消可能な成熟卵母細胞集団のみを標的とする選択的な薬物作用機構を提供する。SAS1Bを標的とするための戦略は、卵巣の、原始卵胞内の予備を構成する卵母細胞には害を及ぼさず、現代の化学療法薬において一般的な不妊症という副作用を防ぐことを目指している。卵母細胞の予備にはSAS1Bが存在せず、SAS1Bは正常組織の中では成長している卵母細胞に限られること、及び腫瘍におけるSAS1Bの細胞表面での発現は、独自の腫瘍選択的な生物学的薬物を作出する新規な機会を提供している。これは、化学療法薬の標的としてのSAS1Bの使用を伴う新規な手法である。
これは抗体‐薬物コンジュゲートを使用して実行可能である。例えば、ポリクローン系及びモノクローン系のいずれの免疫試薬と組み合わされた免疫毒素薬物も使用可能である。ネズミ科動物のモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンの骨組み上に移植して非免疫原性の組換えヒト化抗体を作出することにより、ヒト化されてもよい。この抗体はその後、「裸の」ヒト抗体治療薬として使用されてもよいし、毒素、ペプチド、小分子薬物又は放射性核種とコンジュゲートせしめられてもよい。
Fabサポリンサイトキシティ(Cytoxicity)アッセイのプロトコール
第1日
材料:MMMT539子宮細胞株;トリプシン処理のためのTrypLE(商標)Select;96ウェル組織培養プレート;一次抗体:hSAS1Bに対するウサギ(Rb)血清(免疫及び免疫前);アドバンスト・ターゲティング・システムズ(Advanced Targeting Systems)のウサギFab‐ZAP;M539細胞用の熱処理済みFBSを含むRPMI培地。
第1日
材料:MMMT539子宮細胞株;トリプシン処理のためのTrypLE(商標)Select;96ウェル組織培養プレート;一次抗体:hSAS1Bに対するウサギ(Rb)血清(免疫及び免疫前);アドバンスト・ターゲティング・システムズ(Advanced Targeting Systems)のウサギFab‐ZAP;M539細胞用の熱処理済みFBSを含むRPMI培地。
SRB(スルホローダミンB)処理試薬:DPBS(カルシウム又はマグネシウムを含まない);50%トリクロロ酢酸(TCA)(4℃保存);1%酢酸中で作製された0.05%スルホローダミンB(SRB)(シグマ(Sigma)カタログ#S‐1402);及び10mMトリス(緩衝化せず)。
全てのステップ(終点の処理まで)が滅菌/無菌条件下で行なわれた。
細胞の調製:抗原の完全性の維持を助けるためにTrypLEを用いて細胞をトリプシン処理する;2mlのTrypsinLEを加えて内容物を旋回混合し、細胞が浮遊するまで吸引及び新鮮な2〜3mlのトリプシンへの交換を行う;全ての細胞をばらばらにす
るために側面を穏やかにタッピングする;5mlの新鮮な暖かい培地を加えてトリプシンの作用を停止させ、かつ細胞に同じ培地を数回吹き掛ける(squirt);15〜50mlのコニカルチューブに集める;3000rpmで5分間遠心分離処理する;上清を捨て、細胞ペレットに1mlの新鮮培地を加える;全細胞の計数を行う。
細胞の調製:抗原の完全性の維持を助けるためにTrypLEを用いて細胞をトリプシン処理する;2mlのTrypsinLEを加えて内容物を旋回混合し、細胞が浮遊するまで吸引及び新鮮な2〜3mlのトリプシンへの交換を行う;全ての細胞をばらばらにす
るために側面を穏やかにタッピングする;5mlの新鮮な暖かい培地を加えてトリプシンの作用を停止させ、かつ細胞に同じ培地を数回吹き掛ける(squirt);15〜50mlのコニカルチューブに集める;3000rpmで5分間遠心分離処理する;上清を捨て、細胞ペレットに1mlの新鮮培地を加える;全細胞の計数を行う。
細胞の計数及び再プレーティング:血球計又は任意の細胞計数盤で細胞を計数する;最終細胞数として培地200ulあたり細胞4000個となるように細胞数を調整する(利用される予定のウェルの数についてこの数とする;三連);96ウェルプレート中で培地200ul/ウェルとして細胞をプレーティングする;37℃、5%CO2で一晩インキュベートする。 注:密度は細胞の大きさ及び倍加時間に応じて変化する。5日後、対照のウェルはコンフルエントであるべきではなく、SRB処理は540でのODが直線範囲で2.0未満であるべきである。
Fabサポリンサイトキシティ(Cytoxicity)アッセイのプロトコール
第2日
一次抗体の希釈物(PAD):1.ウサギIgG、免疫[IM](21‐10‐11)4mg/ml、PAD‐IM;2.ウサギIgG、免疫前[PIM](21‐10‐11)1.2mg/ml、PAD‐PIM。
第2日
一次抗体の希釈物(PAD):1.ウサギIgG、免疫[IM](21‐10‐11)4mg/ml、PAD‐IM;2.ウサギIgG、免疫前[PIM](21‐10‐11)1.2mg/ml、PAD‐PIM。
Rb IgG ZAP:これはサポリンで直接タグ付けされた市販のRb IgGであり、対照として使用される。これを1ul+RPMIを9ul。ここから、3ulが60ulの培地と混合され、1ウェルあたり20ulが加えられた(10nΜ)。
T×100陽性対照:1ulのT×100(シグマ(SIGMA))+99ulの培地。よく混合する。1ウェル当たり20ulを加える。
二次コンジュゲート溶液(SCS):45ng/10ul又は90ng/20ulがアッセイ用に1ウェルあたりに使用される。二次コンジュゲートについては、製造業者により提供されるこのコンジュゲートの濃度は2.3mg/mlである。このコンジュゲート1ulが培地499ul中に必要である。5秒間渦流混合する。
二次コンジュゲート溶液(SCS):45ng/10ul又は90ng/20ulがアッセイ用に1ウェルあたりに使用される。二次コンジュゲートについては、製造業者により提供されるこのコンジュゲートの濃度は2.3mg/mlである。このコンジュゲート1ulが培地499ul中に必要である。5秒間渦流混合する。
コンジュゲーション:PIM及びIMについて、各チューブはそれぞれ先の濃度の一次抗体の1:10希釈物を有する。
PIM1:10ulのPAD‐PIM+63ulのSCS。5秒間よく混合する。(1uM)
PIM2:7.5ulのPIM1溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。(0.1uM)
PIM3:7.5ulのPIM2溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。(0.01uM)
PIM4:7.5ulのPIM3溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。(1nM)
PIM5:7.5ulのPIM4溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。(0.1nM)
PIM6:7.5ulのPIM5溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。(0.01nM)
PIM7:7.5ulのPIM6溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。(1pM)
PIM8:7.5ulのPIM7溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。(0.1pM)
IM1:3ulのPAD‐IM+72ulのSCS。5秒間よく混合する。
PIM1:10ulのPAD‐PIM+63ulのSCS。5秒間よく混合する。(1uM)
PIM2:7.5ulのPIM1溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。(0.1uM)
PIM3:7.5ulのPIM2溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。(0.01uM)
PIM4:7.5ulのPIM3溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。(1nM)
PIM5:7.5ulのPIM4溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。(0.1nM)
PIM6:7.5ulのPIM5溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。(0.01nM)
PIM7:7.5ulのPIM6溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。(1pM)
PIM8:7.5ulのPIM7溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。(0.1pM)
IM1:3ulのPAD‐IM+72ulのSCS。5秒間よく混合する。
IM2:7.5ulのIM1溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。
IM3:7.5ulのIM2溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。
IM4:7.5ulのIM3溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。
IM3:7.5ulのIM2溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。
IM4:7.5ulのIM3溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。
IM5:7.5ulのIM4溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。
IM6:7.5ulのIM5溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。
IM7:7.5ulのIM6溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。
IM6:7.5ulのIM5溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。
IM7:7.5ulのIM6溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。
IM8:7.5ulのIM7溶液+67.5ulのSCS。5秒間よく混合する。
これらの希釈物はすべて、フード内で室温にて45分間インキュベートしておいてよい。
これらの希釈物はすべて、フード内で室温にて45分間インキュベートしておいてよい。
Fabサポリンサイトキシティ(Cytoxicity)アッセイのプロトコール
第3日
スルホローダミンB染色:
1. 所望の時点に達したら、培地は取り出されて保存された;2. 1ウェル当たり200ulの冷却DPBSが添加された;3. これに50ulの冷えた50%TCAが1ウェル当たりに加えられた;4. その後、4Cで1時間インキュベートされた;5.
1ウェル当たり300ulのTAP水で約4〜5回洗浄し、軽くたたいて水気をとる;6. 1時間又は乾燥するまで風乾する(プレートはこのステップで無期限に保管可能である);7. 1%酢酸中で作製された100ulの1×作業用スルホローダミン試薬を加え、RTで30分間インキュベートする;8. 1ウェルにつき1%酢酸300ulで5〜6回、又は洗浄液からピンク色が消えるまで、洗浄する;9. 軽くたたいて水気をとり、完全に風乾する(これは次のステップまでこの段階で保管可能である);10. 1ウェル当たり200ulの緩衝化されていないトリスベース試薬で可溶化し、振とう機で、又はピペットチップを用いて、完全に混合する。5〜10分間振とうする;11. 490nmで読み取りを行いグラフ上にプロットする。
第3日
スルホローダミンB染色:
1. 所望の時点に達したら、培地は取り出されて保存された;2. 1ウェル当たり200ulの冷却DPBSが添加された;3. これに50ulの冷えた50%TCAが1ウェル当たりに加えられた;4. その後、4Cで1時間インキュベートされた;5.
1ウェル当たり300ulのTAP水で約4〜5回洗浄し、軽くたたいて水気をとる;6. 1時間又は乾燥するまで風乾する(プレートはこのステップで無期限に保管可能である);7. 1%酢酸中で作製された100ulの1×作業用スルホローダミン試薬を加え、RTで30分間インキュベートする;8. 1ウェルにつき1%酢酸300ulで5〜6回、又は洗浄液からピンク色が消えるまで、洗浄する;9. 軽くたたいて水気をとり、完全に風乾する(これは次のステップまでこの段階で保管可能である);10. 1ウェル当たり200ulの緩衝化されていないトリスベース試薬で可溶化し、振とう機で、又はピペットチップを用いて、完全に混合する。5〜10分間振とうする;11. 490nmで読み取りを行いグラフ上にプロットする。
SAS1B経路は毒性の積荷の細胞内送達に使用することが可能であるという仮説を試験するために、細胞の密度及び成長停止を定量化するためのスルホローダミンBスクリーニング方法を使用する間接的サポリンアッセイが、MMMT539及びMAD10細胞を用いて実施された(図5)。該アッセイは、一次抗体として組換えヒトSAS1Bに対するウサギのポリクローナル抗血清から精製されたIgG、及びアドバンスト・ターゲティング・システムズのサポリンを含有する抗ウサギFab‐Zap二次試薬を使用した。細胞殺滅は、抗SAS1B一次IgG抗体でのみ観察され(IMZAPとラベルされた赤色のバー)、陰性対照、例えば免疫IgGとして同一の濃度で使用された免疫前のIgG(PIZAPとラベルされた黄色のバー)、サポリンで標識された非特異的な精製ウサギIgG(RbIgG)、又はFab‐ZAPサポリン二次試薬のみ(SCS FABZAP
ctl)では観察されなかった。細胞殺滅のレベルは濃度依存的であり該アッセイはプロゾーン(フック)効果を示した。高濃度の一次抗体では、Fab‐ZAP毒素は、細胞表面に結合した一次抗体ではなく溶液中の一次抗体と複合体を形成した。しかしながら、一次抗体及び二次ZAP試薬の化学量論比が、Fab‐ZAP免疫複合体が細胞表面に到達するのを可能にするように最適化された時、完全な成長停止が観察された。この停止は、非イオン性界面活性剤を用いる処理期の初めにおいて溶解された腫瘍細胞で見られたレベル(緑色のバー、Triton(登録商標)X陽性対照)と同じレベルであった。
ctl)では観察されなかった。細胞殺滅のレベルは濃度依存的であり該アッセイはプロゾーン(フック)効果を示した。高濃度の一次抗体では、Fab‐ZAP毒素は、細胞表面に結合した一次抗体ではなく溶液中の一次抗体と複合体を形成した。しかしながら、一次抗体及び二次ZAP試薬の化学量論比が、Fab‐ZAP免疫複合体が細胞表面に到達するのを可能にするように最適化された時、完全な成長停止が観察された。この停止は、非イオン性界面活性剤を用いる処理期の初めにおいて溶解された腫瘍細胞で見られたレベル(緑色のバー、Triton(登録商標)X陽性対照)と同じレベルであった。
完全な細胞の成長停止は、10nMの抗SAS1B IgG及び5.14nMのFab‐ZAPサポリンで観察された。細胞の成長停止という効果は、SAS1Bを発現しないMAD10細胞ではいずれの試薬でも観察されなかった。これらの研究は、同一の結果を伴って9回繰り返された。この結果は、抗SAS1Bで処理された細胞のみが丸くなり病
的状態になったことを実証した細胞の形態学的観察によって確認された。これらの研究は、SAS1Bがエンドサイトーシス経路に取り込まれ、この経路が毒性の積荷の細胞内送達に使用されうることを実証している。
的状態になったことを実証した細胞の形態学的観察によって確認された。これらの研究は、SAS1Bがエンドサイトーシス経路に取り込まれ、この経路が毒性の積荷の細胞内送達に使用されうることを実証している。
よって、二次抗体(Gt抗ウサギ)上に便乗したサポリンは、エンドサイトーシスによってM539子宮キャンス(cance)細胞の細胞質内へとサポリンを標的化するのに有効であった。濃度0.01uMのIM IgGが有効であることが見出された。対照の子宮細胞(MAD10)では効果は見られなかった(図6〜8を参照)。処理されたM539細胞は、他の細胞との接触の損失、構造の損失及び細胞形状の変化、並びに細胞の細胞質内における泡/細孔/液胞の存在を示す。M539細胞の培養上清はLDH活性について検査され、0.01uMのIM濃度ではLDHレベルの著しい増大が示された。
SAS1Bは腎腫瘍において発現されている
Oncomine(登録商標)(ゲノム規模での発現解析からの発見の促進を目指したがんのマイクロアレイデータベース及びウェブ基盤のデータマイニングプラットホーム)からのデータ取得により、SAS1B(ASTL)が淡明細胞型腎細胞癌において上昇していることが実証されている(図9)。よって、SAS1Bは腎腫瘍を有する患者の大集団についてスクリーニングするための診断マーカーとして使用可能である。毎年およそ65,000人の新たな腎腫瘍症例があり、毎年約14,000人が死亡する。該症例の90%は腎臓癌であり、そのうち症例の約70%は淡明細胞癌であり、症例の約10%は乳頭状癌である。SAS1Bは腎腫瘍において膜に結合している(membrane associate)。患者からの淡明細胞型腎腫瘍由来のcDNAは、c末端SAS1Bプライマーを用いるPCRアッセイに使用され(パネルA)、またRNAの完全性を保証するために、パネルBに見られるようにGAPDHプライマーが使用された。M539子宮がん細胞株はレーン9で見られるように陽性対照として使用された。正常な腎臓cDNAは11において組織対照としての役割を果たし、SAS1Bを発現していない(図10)。Blastnプログラムで遺伝子配列を使用することにより、ASTLアスタシン様メタロエンドペプチダーゼ(M12ファミリー)(遺伝子ID:431705)への99%の同一性が得られた。
Oncomine(登録商標)(ゲノム規模での発現解析からの発見の促進を目指したがんのマイクロアレイデータベース及びウェブ基盤のデータマイニングプラットホーム)からのデータ取得により、SAS1B(ASTL)が淡明細胞型腎細胞癌において上昇していることが実証されている(図9)。よって、SAS1Bは腎腫瘍を有する患者の大集団についてスクリーニングするための診断マーカーとして使用可能である。毎年およそ65,000人の新たな腎腫瘍症例があり、毎年約14,000人が死亡する。該症例の90%は腎臓癌であり、そのうち症例の約70%は淡明細胞癌であり、症例の約10%は乳頭状癌である。SAS1Bは腎腫瘍において膜に結合している(membrane associate)。患者からの淡明細胞型腎腫瘍由来のcDNAは、c末端SAS1Bプライマーを用いるPCRアッセイに使用され(パネルA)、またRNAの完全性を保証するために、パネルBに見られるようにGAPDHプライマーが使用された。M539子宮がん細胞株はレーン9で見られるように陽性対照として使用された。正常な腎臓cDNAは11において組織対照としての役割を果たし、SAS1Bを発現していない(図10)。Blastnプログラムで遺伝子配列を使用することにより、ASTLアスタシン様メタロエンドペプチダーゼ(M12ファミリー)(遺伝子ID:431705)への99%の同一性が得られた。
SAS1Bは頭頸部扁平上皮細胞癌において発現されている
頭頸部扁平上皮細胞癌(HNSCC)は、世界で5番目の主要ながん診断であり、かつ8番目の主要ながん死亡原因である。頭頸部がんの90%超が扁平上皮細胞癌である。この種のがんは、上気道消化管の湿った表面を裏打ちしている扁平上皮細胞において発症する。
頭頸部扁平上皮細胞癌(HNSCC)は、世界で5番目の主要ながん診断であり、かつ8番目の主要ながん死亡原因である。頭頸部がんの90%超が扁平上皮細胞癌である。この種のがんは、上気道消化管の湿った表面を裏打ちしている扁平上皮細胞において発症する。
SAS1BのmRNA及びタンパク質はHNSCC細胞株の100%において観察される(図11)。簡潔に述べると、全RNAが8つのHNSCC細胞株から抽出されて(キアゲン(Qiagen)キット)、cDNAに変換された。PCRアンプリケーション(amplication)はC末端hSAS1Bプライマーを使用して実施された。8/8のHNSCC株がSAS1B転写物について陽性であった。腫瘍は1〜8の番号が付された;N=陰性のテンプレート対照(水)。hGAPDHは装荷量対照として使用された。
調査されたHNSCCヒト腫瘍の100%がSAS1Bについて陽性であった(図12)。図12はHNSCCヒト腫瘍標本からのSAS1B mRNAの増幅に関するPCR結果を代表している。全RNAが腫瘍組織から抽出され(キアゲン)、cDNAへと逆転写された。PCR増幅はC末端hSAS1Bプライマーを使用して実施された。レーンは左から右に順に:マーカー、HNSCC腫瘍標本、N=陰性テンプレート、H2O対照である。合計24例の腫瘍標本が試験され;24/24がSAS1B mRNAについて陽
性であり、そのうち16がここに示されている。hGAPDHは装荷量対照として使用された。
性であり、そのうち16がここに示されている。hGAPDHは装荷量対照として使用された。
SAS1Bは膵臓がんにおいて発現されている
膵臓がんは米国におけるがん死の4番目の主要原因である。膵臓がんの場所である腹膜後腔(胃の後方)は、診断及び治療を複雑にする。膵臓がんの65%は膵頭に位置する一方、15%は膵体に、10%は尾膵に位置し、10%は多巣性である。膵臓がんの90%超は膵臓起源の腺癌である。一般に、これらのがんは無秩序な導管の分布を有し、核の大小不同(>4:1、核の大きさの変動)及びグランデュラ(grandular)有糸核分裂像が存在する。
膵臓がんは米国におけるがん死の4番目の主要原因である。膵臓がんの場所である腹膜後腔(胃の後方)は、診断及び治療を複雑にする。膵臓がんの65%は膵頭に位置する一方、15%は膵体に、10%は尾膵に位置し、10%は多巣性である。膵臓がんの90%超は膵臓起源の腺癌である。一般に、これらのがんは無秩序な導管の分布を有し、核の大小不同(>4:1、核の大きさの変動)及びグランデュラ(grandular)有糸核分裂像が存在する。
SAS1B転写物は膵臓がん細胞株において同定された(図13)。簡潔に述べると、全RNAが5つの膵臓がん細胞株から抽出され(キアゲンのキット)、cDNAに変換された。PCR増幅はC末端hSAS1Bプライマーを使用して実施された。4/5の膵臓がん株がSAS1B転写物について陽性であった。示されている対照反応物は:陽性対照としてM539細胞(悪性混合ミュラー腫瘍)におけるSAS1Bの発現及びM539についてのGAPDH装荷量対照;テンプレートなし(水)の対照、である。hGAPDHは装荷量対照として使用された。
SAS1Bは男性及び女性のいずれの膵臓腫瘍においても同定された(図14)。マウスに同所性異種移植されてその後継代された15例のヒト膵臓組織から全RNAが抽出された(キアゲンのキット)。検査された標本はほぼ5世代の異種移植片であった。RNAはcDNAへと逆転写された。PCR増幅はC末端hSAS1Bプライマーを使用して実施された。9/15の膵臓がん株がSAS1B転写物について陽性であった。hGAPDHは装荷量対照として使用された。
図15は膵臓のPCR対照を提示している。全RNAは3例のヒト正常膵臓組織から抽出された(キアゲンのキット)。RNAはcDNAへと逆転写された。上図:PCR増幅は正常な膵臓においてC末端hSAS1Bプライマーを使用して実施された。3例の正常な膵臓はすべてSAS1B転写物について陰性であった。hGAPDHは装荷量対照として使用された。下図:PCR増幅はhSAS1BのC末端プライマーを使用して実施された。膵臓腫瘍についての単一プライマーの対照反応。M539(MMMT株)は陽性対照として使用された。
参考文献
本明細書中で引用された全ての特許、特許出願、及び出版物の開示内容は、参照によりその全体が本願に組込まれる。
見出しは、参考のため、及びある特定のセクションを捜し出す助けとするために、本明細書中に含まれている。これらの見出しは、該見出しのもとに記載された概念の範囲を限定するようには意図されず、これらの概念は明細書全体にわたって他のセクションにおいても適用可能性を有しうる。
見出しは、参考のため、及びある特定のセクションを捜し出す助けとするために、本明細書中に含まれている。これらの見出しは、該見出しのもとに記載された概念の範囲を限定するようには意図されず、これらの概念は明細書全体にわたって他のセクションにおいても適用可能性を有しうる。
本発明について特定の実施形態を参照して開示してきたが、本発明の他の実施形態及び変形形態が、他の当業者によって本発明の真の思想及び範囲から逸脱することなく考案されうることは明白である。
Claims (28)
- 細胞毒性薬にコンジュゲートせしめられたSAS1R抗原に特異的な抗体又は前記抗体の結合性フラグメントを含む、免疫毒素分子。
- 細胞毒性薬はI型リボソーム不活性化タンパク質である、請求項1に記載の免疫毒素分子。
- I型リボソーム不活性化タンパク質はサポリンである、請求項2に記載の分子の免疫毒素。
- 抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である、請求項1に記載の免疫毒素分子。
- 抗体の結合性フラグメントはF(ab’)2、F(ab)2、Fab’、又はFabである、請求項1に記載の免疫毒素分子。
- 請求項1に記載の免疫毒素と、生理学的に許容可能な担体とを含む組成物。
- がん細胞を殺滅し、阻害し、又は脱落させる方法であって、それを必要とする対象者に、請求項1に記載の少なくとも1つの免疫毒素分子を投与することを含む方法。
- がんは、癌腫(例えば頭頸部扁平上皮細胞癌)、肉腫、子宮がん、卵巣がん、肺がん、腺癌、肺の腺癌、扁平上皮癌、肺の扁平上皮癌、悪性混合ミュラー腫瘍、白血病、リンパ腫、神経芽腫、黒色腫、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、膀胱及び類内膜癌からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- がんを治療する方法であって、それを必要とする対象者に治療上有効な用量の免疫毒素コンジュゲートを投与することを含み、
前記免疫毒素コンジュゲートは、細胞毒性薬にコンジュゲートせしめられた抗体又は前記抗体の結合性フラグメントを含み、前記免疫毒素コンジュゲートの前記抗体はがん細胞上のSAS1Rに結合し、かつ細胞上のSAS1R分子への前記免疫毒素分子の結合により、SAS1Rを発現している細胞の殺滅、脱落、又は増殖阻害がもたらされる、方法。 - 細胞毒性薬はI型リボソーム不活性化タンパク質である、請求項9に記載の方法。
- I型リボソーム不活性化タンパク質はサポリンである、請求項10に記載の方法。
- 抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である、請求項9に記載の方法。
- 抗体の結合性フラグメントはF(ab’)2、F(ab)2、Fab’、又はFabである、請求項9に記載の方法。
- がんは、癌腫(例えば頭頸部扁平上皮細胞癌)、肉腫、子宮がん、卵巣がん、肺がん、腺癌、肺の腺癌、扁平上皮癌、肺の扁平上皮癌、悪性混合ミュラー腫瘍、白血病、リンパ腫、神経芽腫、黒色腫、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、膀胱及び類内膜癌で構成されている群から選択される、請求項9に記載の方法。
- がんを治療する方法であって、治療上有効な用量の、がん細胞上のSAS1Rに結合す
る第1の抗体又は前記抗体のフラグメント、及び第1の抗体に結合する第2の抗体であって細胞毒性薬にコンジュゲートせしめられた第2の抗体を、投与することを含む、方法。 - 抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である、請求項15に記載の方法。
- 抗体の結合性フラグメントはF(ab’)2、F(ab)2、Fab’、又はFabである、請求項15に記載の方法。
- 細胞毒性薬はI型リボソーム不活性化タンパク質である、請求項15に記載の方法。
- I型リボソーム不活性化タンパク質はサポリンである、請求項18に記載の方法。
- 卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん又は頭頸部扁平上皮細胞癌(HNSCC)を診断する方法であって、対象者の卵巣、子宮、膀胱、腎臓、膵臓又は頭頸部からの生体試料中のSAS1Bを測定すること、及び、前記対象者の卵巣、子宮、膀胱、腎臓、膵臓又は頭頸部からの生体試料中のSAS1Bの存在に基づいて前記対象者における卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん又は頭頸部扁平上皮細胞癌(HNSCC)を診断することを含む方法。
- 対象者は哺乳動物である、請求項20に記載の方法。
- SAS1BはSAS1Bのタンパク質、miRNA又はmRNAである、請求項20に記載の方法。
- 検出は分析デバイス及び分析プログラムを用いて結果を分析することを含む、請求項20に記載の方法。
- 分析デバイスはコンピュータを含む、請求項23に記載の方法。
- 分析デバイスは配列分析装置を含む、請求項24に記載の方法。
- SAS1Bのタンパク質、miRNA又はmRNAのレベルは分析デバイス及び分析プログラムで定量化される、請求項23に記載の方法。
- 前記SAS1Bのタンパク質、miRNA又はmRNAは、ELISA、イムノアッセイ、免疫蛍光検査法、免疫組織化学法、免疫沈降、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法、PCR法、質量分析、及び表面プラズモン共鳴からなる群から選択された方法を使用して検出される、請求項20に記載の方法。
- 試料は組織生検である、請求項20に記載の方法。
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