KR101400274B1 - Ｐ450 효소의 촉매활성을 증대시키는 ｃｐｒ 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 이에 의하여 형질전환된 세균 및 이를 이용한 ｐ450 촉매반응 화합물의 제조방법 - Google Patents

Ｐ450 효소의 촉매활성을 증대시키는 ｃｐｒ 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 이에 의하여 형질전환된 세균 및 이를 이용한 ｐ450 촉매반응 화합물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 P450 효소의 촉매활성을 증대시키는 CPR 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터 및 P450 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 세균 및 이를 이용한 P450 촉매반응 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는, P450 효소의 촉매활성을 증대시키는, 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 벼 유래의 NADPH-시토크롬 P450 리덕타제2(NADPH-cytochrome P450 reductase2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함한다. 또한 본 발명에 따른 형질전환 세균은, 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 벼 유래의 NADPH-시토크롬 P450 리덕타제2(NADPH-cytochrome P450 reductase2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터와; 트립타민 5-하이드록시다아제(tryptamine 5-hydroxylase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터 또는 시나메이트 4-하이드록시다아제(cinnamate 4-hydroxylase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 세균을 포함한다.
상기 형질전환된 세균을 통하여 세로토닌 또는 쿠마르산을 안정적으로 다량 생산할 수 있다.

Description

Ｐ450 효소의 촉매활성을 증대시키는 ＣＰＲ 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 이에 의하여 형질전환된 세균 및 이를 이용한 Ｐ450 촉매반응 화합물의 제조방법 {RECOMBINANT VECTOR COMPRISING CYTOCROME P450 REDUCTASE GENES, MICROORGANISM TRANSFORMED THEREOF AND METHOD FOR PRODUCING P450 ENZYME-DERIVED COMPOUNDS USING THE SAME}
본 발명은 P450 효소의 촉매활성을 증대시키는 CPR 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터 및 P450 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 세균 및 이를 이용한 P450 촉매반응 화합물의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 P450 유전자에 특이적으로 반응하는 CPR 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터와 P450 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 세균 및 이를 이용한 P450 촉매반응 화합물의 제조방법에 대한 것이다.
박테리아, 특히 대장균은 다양한 유용물질을 생산하는 이종 숙주로 널리 이용되고 있으나(Zhang et al., Mol. Phamaceutics 5, 212-225, 2008), 시토크롬 P450효소(Cytochrome P450 Enzyme)를 이용하는 유용한 물질의 생산에는 효과적으로 이용되고 있지 못하고 있다. 이는 대장균에 시토크롬 P450효소의 레독스 파트너(redox parter)인 CPR(NADPH-dependent cytochrome P450 reductase) 유전자가 결핍되어 있기 때문이다.
식물에 있어서 P450 효소는 수많은 1차 및 2차 대사산물 생합성을 촉매하는 효소로 알려져 있다(Mizutani & Ohta., Ann. Rev. Plant Biol. 61, 291-315, 2010; Schuler, Biochim. Biophys. Acta. 1814, 36-45, 2011). 상기 P450 효소의 촉매과정은 CPR 효소에 의해 NADPH 로부터 2개의 전자를 P450 효소에 전달함으로써 성취된다. 식물에서 CPR 유전자는 녹두(mung bean)에서 최초로 클로닝 되었으며(Shet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2890-2894, 1993), 현재까지 54 종 정도의 식물 CPR 유전자가 보고되어 있다(Paquette et al., Phytochem. 70, 1940-1947, 2009; Jensen & Møller, Phytochem. 71, 132-141, 2010). 동물에서는 CPR 유전자는 단일 유전자로 존재하는 반면에, 식물에서는 종에 따라 1개 내지 3개 까지 CPR 유전자가 존재하며, 예를 들어, 포풀러와 벼에는 3 종의 CPR유전자가 존재하는 것으로 알려져 있다. 또한 유전자 서열에서도 동물 CPR 유전자와는 다르게, 식물 CPR 유전자는 아미노 말단에 긴 막횡단서열(membrane spanning domain)이 존재하는 특성이 있다(Jensen & Møller, Phytochem. 71, 132-141, 2010). 식물에서 존재하는 복수의 CPR 유전자의 생리적 생화학적 기능은 알려져 있지 않지만, 수 백종 이상으로 존재하는 P450 효소의 촉매반응에 CPR 유전자 특이적으로 상호작용하여, 효과적으로 P450 효소에 전자를 전달할 수 있는 기작을 발휘할 것으로 생각되고 있지만, 아직까지 특이한 CPR 유전자와 특이적으로 반응하는 P450 효소의 상호작용의 실험적 증거는 없는 상태이다(Urban et al., J. Biol. Chem. 272, 19176-19186, 1997; Jensen & Møller, Phytochem. 71, 132-141, 2010). 예를 들어, 토끼의 P450 효소 반응에 효모, 인간, 및 애기장대의 CPR 을 이용할 경우, 서로 다른 활성을 보여 주는 것으로 보아, P450 효소의 종류에 따라 특이적으로 반응하는 CPR 유전자가 있을 것으로 생각되고 있을 뿐이다(Louerat-Oriou et al., Eur. J. Biochem. 258, 1040-1049, 1998).
식물은 200,000종 이상의 다양한 천연물질을 생합성 하는 것으로 알려져 있으며(WU & Chappell, Curr. Opin. Biotechnol. 19, 145-152, 2008), 이 중에서 많은 물질이 P450 효소에 의해 촉매되고 있다. 이를 증명하듯이 벼에는 329 종의 서로 다른 P450 유전자가 존재하고, 애기장대에서는 245 종이 존재하는 것으로 보고되어 있다(Nelson & Werck-Reichhart, Plant J. 66, 194-211, 2011). 식물에서 생합성되는 P450 효소에 의해 촉매되는 다양한 천연물질을 이종 숙주에서 생산하기 위해서는 주로 CPR 유전자가 1개 존재하는 효모를 사용하지만, P450 촉매활성이 제한적임이 보고되고 있다 (Ro et al., Plant Physiol. 130, 1837-1851, 2002). 따라서, 효모에 비해 CPR 유전자가 부재하는 대장균에서의 P450 촉매반응을 통한 천연물질을 생산하고자 할 경우, 효율이 높은 CPR 유전자의 발현이 요구되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 대장균에서 P450 효소의 촉매반응을 효과적으로 이끌어주는 식물 유래 CPR 유전자를 탐색하여, 상기 식물유래 CPR 유전자 및 P450 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 이에 의하여 형질전환된 세균 및 이를 이용한 P450 촉매반응 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 벼 유래 3 종의 시토크롬 P450리덕타제(NADPH-cytochrome P450 reductase, OsCPR) 유전자를 클로닝하고, 상기 3종의 유전자 중 적어도 어느 하나와 세로토닌을 생합성하는 식물 유래 P450 유전자인 트립타민 5-하이드록시라아제(tryptamine 5-hydroxylase, T5H) 유전자와 공동 발현하는 재조합 벡터를 설계하고, 상기 재조합 벡터를 이용하여 형질전환된 세균을 제조하고, 상기 형질전환 세균으로부터 세로토닌을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 벼 유래 3 종의 시토크롬 P450리덕타제(NADPH-cytochrome P450 reductase, OsCPR) 유전자를 클로닝하고, 상기 3종의 유전자 중 적어도 어느 하나와 쿠마르산(4-coumaric acid)를 생합성하는 식물 유래 P450 유전자인 시나메이트 4-하이드록시라아제(cinnmate 4-hydroxylase, C4H) 유전자와 공동 발현하는 재조합 벡터를 설계하고, 상기 재조합 벡터를 이용하여 형질전환된 세균을 제조하고, 상기 형질전환 세균으로부터 쿠마르산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적은, 본 발명에 따라, P450 효소의 촉매활성을 증대시키는, 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 벼 유래의 NADPH-시토크롬 P450 리덕타제2(NADPH-cytochrome P450 reductase2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공함으로써 달성될 수 있다.
또한 상기 목적은, 본 발명에 따라, P450 효소의 촉매활성을 증대시키는, 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 벼 유래의 NADPH-시토크롬 P450 리덕타제2(NADPH-cytochrome P450 reductase2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터와 트립타민 5-하이드록시다아제(tryptamine 5-hydroxylase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 세균을 제공함으로써 달성될 수 있다.
여기에서, 상기 세균은 대장균을 포함한다.
또한 상기 목적은, 본 발명에 따라, 세로토닌 제조방법에 있어서, 상기 형질전환된 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계와; 상기 배양 단계에서 생산된 세로토닌을 수집하는 단계를 포함하는 세로토닌 제조방법에 의하여 달성될 수 있다.
여기에서, 상기 세균은 대장균을 포함한다.
여기에서, 상기 배양 배지는 YEP 배지를 포함한다.
여기에서, 상기 배양 단계는, 상기 배지에서 배양물의 흡광도(O.D. 600)가 1 내지 2가 될 때까지 35 내지 45℃에서 배양하는 단계를 더 포함한다.
여기에서, 상기 배양 단계는, 트립타민(tryptamine)을 첨가하는 단계와; 25 내지 35℃에서 15시간 내지 30시간 동안 배양하는 단계를 더 포함한다.
또한, 상기 목적은 본 발명에 따라, P450 효소의 촉매활성을 증대시키는, 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 벼 유래의 NADPH-시토크롬 P450 리덕타제2(NADPH-cytochrome P450 reductase2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터와 시나메이트 4-하이드록시다아제(cinnamate 4-hydroxylase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 세균을 제공함으로써 달성될 수 있다.
여기에서, 상기 세균은 대장균을 포함한다.
또한, 상기 목적은 본 발명에 따라, 쿠마르산 제조방법에 있어서, 상기 형질전환된 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계와; 상기 배양 단계에서 생산된 쿠마르산을 수집하는 단계를 포함하는 쿠마르산 제조방법에 의하여 달성될 수 있다.
여기에서, 상기 세균은 대장균을 포함한다.
여기에서, 상기 배양 배지는 YEP 배지를 포함한다.
여기에서, 상기 배양 단계는, 상기 배지에서 배양물의 흡광도(O.D. 600)가 1 내지 2가 될 때까지 35 내지 45℃에서 배양하는 단계를 더 포함한다.
여기에서, 상기 배양 단계는, 시나믹산(cinnamic acid)을 첨가하는 단계와; 25 내지 35℃에서 15시간 내지 30시간 동안 배양하는 단계를 더 포함한다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 대장균에서 P450 효소의 촉매반응을 효과적으로 이끌어주는 식물 유래 CPR 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.
또한, 상기 식물 유래 CPR 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 P450 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 세균 및 이를 이용한 P450 촉매반응 화합물의 제조방법이 제공된다.
특히, 벼 유래 3 종의 시토크롬 P450리덕타제(NADPH-cytochrome P450 reductase, OsCPR) 유전자 중 적어도 어느 하나를 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 상기 재조합 벡터와 세로토닌을 생합성하는 식물 유래 P450 유전자인 트립타민 5-하이드록시라아제(tryptamine 5-hydroxylase, T5H) 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 세균, 및 상기 형질전환 세균으로부터 세로토닌을 제조하는 방법이 제공된다.
또한, 벼 유래 3 종의 시토크롬 P450리덕타제(NADPH-cytochrome P450 reductase, OsCPR) 유전자 중 적어도 어느 하나를 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, 상기 재조합 벡터와 쿠마르산(4-coumaric acid)를 생합성하는 식물 유래 P450 유전자인 시나메이트 4-하이드록시라아제(cinnmate 4-hydroxylase, C4H) 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 세균, 및 상기 형질전환 세균으로부터 쿠마르산을 제조하는 방법이 제공된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 3종의OsCPR각각 과 T5H 유전자가 공동발현되는 재조합 대장균에서의 상기 두 단백질의 발현 여부를 나타내는 도면이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 3종의OsCPR각각 과 T5H 유전자가 공동발현되는 재조합 대장균에서 시간별 배양액에서의 세로토닌 생성량 측정 결과를 도시한 도면이고,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 OsCPR2와 T5H 유전자가 공동발현되는 재조합 대장균에서 배양액 및 대장균 균체침전물에서 세로토닌 함량을 비교한 결과를 도시한 도면이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 다양한 OsCPR2 아미노말단 결손 구조물과 T5H 유전자가 공동발현되는 재조합 대장균에서 상기 두 단백질의 발현여부를 나타내는 도면이고,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 다양한 OsCPR2 아미노말단 결손 구조물과 T5H 유전자가 공동발현되는 재조합 대장균에서 세로토닌 생합성 차이를 나타내는 도면이고,
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 3종의OsCPR각각 과 C4H 유전자가 공동발현되는 재조합 대장균에서 배양액에서의 쿠마르산 생성량 측정 결과를 도시한 도면이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예들에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예들에 한정되지 않는다.
본 발명은 P450 효소의 촉매활성을 증대시키는, 벼 유래의 NADPH-시토크롬 P450 리덕타제(NADPH- dependent cytochrome P450 reductase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제공에 의하여 달성될 수 있다. 또한, 트립타민 5-하이드록시다아제(tryptamine 5-hydroxylase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 제공될 수 있는 것이다. 즉, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 벼 유래의 NADPH-시토크롬 P450 리덕타제(NADPH-cytochrome P450 reductase) 유전자 또는 트립타민 5-하이드록시다아제(tryptamine 5-hydroxylase) 유전자가 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있다.
본 발명에서 용어 “재조합 벡터”는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터로써, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다.
상기 용어 “프로모터”는 구조 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 개시부위에 인접하는, 유전자의 5' 비-코딩 부위에 위치한다.
상기 기재“작동 가능하게 연결된다(operably linked)”는 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 발현 조절 서열과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 상기 발현 조절 서열에 의해 영향을 받는 것을 의미한다. 즉, 발현 조절 서열의 조절 하에 폴리뉴클레오티드의 서열이 발현되어 원하는 폴리펩티드가 형성되도록 정확한 해독프레임을 유지시키는 것을 포함한다. 이와 같이 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드와 발현 조절 서열은 프로모터, 전사 종결부위, 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 벡터 내에 포함될 수 있다.
상기 벼 유래의 NADPH-시토크롬 P450 리덕타제(NADPH-dependent cytochrome P450 reductase, OsCPR) 유전자는 3 종의 OsCPR 유전자를 포함한다. 상기 3 종의 OsCPR 유전자는 서열번호 11의 염기서열을 갖는 OsCPR1(NADPH-dependent cytochrome P450 reductase1), 서열번호 12의 염기서열을 갖는 OsCPR2(NADPH-dependent cytochrome P450 reductase2), 서열번호 13의 염기서열을 갖는 OsCPR3(NADPH-dependent cytochrome P450 reductase3)을 포함한다. 상기 3 종의 OsCPR 유전자는 다음과 같은 방법으로 획득될 수 있다. 상기 벼 유래의 3종의 OsCPR 유전자는, 벼 게놈 서열로부터 추정된 정보(Jensen & Møller, Phytochem. 71, 132-141, 2010) 및 일본 농업생물자원연구소의 부분 OsCPR1(GenBank AK 243608), OsCPR2(GenBank AK 099083)에 기초하여 RT-PCR(역전사 중합효소 연쇄반응, reverse transcription-polymerase chain reaction)을 통하여 전장 유전자길이의 OsCPR1(서열번호 11) 및 OsCPR2(서열번호 12) 유전자를 클로닝하였다. OsCPR3(GenBank AK102060; 서열번호 13) 유전자는 일본 농업생물자원연구소에서 전장 cDNA유전자를 분양받아 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 3종의 OsCPR 유전자 중에서 식물 유래 P450 유전자의 가장 좋은 촉매 반응을 유도하는 OsCPR 유전자를 탐색한다.
상기 트립타민 5-하이드록시다아제(tryptamine 5-hydroxylase, T5H)는 하기와 같이 트립타민으로부터 세로토닌을 합성할 수 있는 식물 유래 P450 효소이다.
Figure 112012033919169-pat00001
상기 트립타민 5-하이드록시다아제 유전자는 기 보고된 GenBank AK071599의 염기서열을 갖는다(Fujiwara et al., J. Biol. Chem. 285, 11308-11313, 2010). 바람직하게는 상기 T5H 유전자는, 벼에서 유래된 T5H (tryptamine 5-hydroxylase)에서 아미노말단의 막횡단서열이 절개된 T5H 유전자에 GST(glutathion s-transferase) 유전자가 부착되어 있는 GST-△37T5H 를 사용할 수 있다(Park et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 89, 1387-1394, 2011).
상기 3 종의 OsCPR 유전자 및 트립타민 5-하이드록시다아제(tryptamine 5-hydroxylase, T5H) 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 하기와 같은 방법으로 제작될 수 있다.
상기 OsCPR1(NADPH-dependent cytochrome P450 reductase1)는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행한 후, 그 생성물을 pTOP Blunt V2(Enzynomics, 대전, 대한민국) TA 클로닝 부위 내로 삽입시켜 pTOP Blunt V2:OsCPR1 벡터를 제작할 수 있다. 이후 pTOP Blunt V2:OsCPR1 벡터를 제한효소 BamHI 및 XhoI로 절단하고, 동일 효소로 절단된 pCOLADuet-1 벡터(Novagen 사, 미국)에 삽입하여 pCOLADuet:OsCPR1 벡터를 제조할 수 있다. 마찬가지로, 상기 OsCPR2(NADPH-dependent cytochrome P450 reductase2)는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 사용하고, 상기 OsCPR3(NADPH-dependent cytochrome P450 reductase3)는 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하고, 그 생성물을 pTOP Blunt V2(Enzynomics, 대전, 대한민국) TA 클로닝 부위 내로 각각 삽입하여 pTOP Blunt V2:OsCPR2, pTOP Blunt V2:OsCPR3의 벡터를 각각 제작할 수 있다. 상기 pTOP Blunt V2:OsCPR2, pTOP Blunt V2:OsCPR3 벡터를 제한효소 BglII 및 KpnI 으로 절단하고, 제한효소 EcoRI 및 KpnI으로 절단된 pCOLADuet-1 벡터(Novagen 사, 미국)에 삽입하여 pCOLADuet:OsCPR2 및 pCOLADuet:OsCPR3 벡터를 제조할 수 있다.
T5H (tryptamine 5-hydroxylase) 유전자로써, 상기 기재한 벼 유래의 GST-△37T5H 유전자는 pGEX6p1-△37T5H 벡터(Park et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 89, 1387-1394, 2011)를 주형으로 하여, 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후, 그 생성물을 제한효소 NcoI 및 EcoRI으로 절단하고, 동일한 제한효소로 절단된 pETDuet-1 벡터(Novagen 사, 미국)에 삽입하여 pETDuet-GST-△37T5H 벡터를 제조할 수 있다.
또한 본 발명은, 상기 기재한 방식으로 제작된 3 종의 OsCPR 유전자가 각각 발현되는 재조합 벡터 및 상기 GST-△37T5H 유전자자가 발현되는 재조합 벡터를 이용하여 상기 유전자들이 동시에 발현될 수 있는, 형질전환된 세균을 제공할 수 있다. 상기 재조합 벡터에 의하여 형질전환되는 숙주세포의 예로서, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)로 이루어진 군에서 선택된 세균을 포함하고, 바람직한 예로는 대장균(Escherichia coli)을 포함할 수 있다.
상기 본 발명에 따른 재조합 벡터는 기 공지된 방법에 따라 상기 숙주세포인 세균에 도입될 수 있다. 상기 도입 방법은, CaCl2 및 열 쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylene glycol)에 의한 침전법 등의 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 세균을 이용하여 세로토닌 제조방법이 제공된다. 상기 세로토닌 제조방법은 상기 형질전환된 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계와; 상기 배양 단계에서 생산된 세로토닌을 수집하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 배양단계에서, 본 발명에 따른 형질전환된 세균은 통상적인 배양방법에 따라 대량으로 배양될 수 있다. 상기 배양단계에서 이용되는 배양배지는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들어 통상적인 암피실린(ampicillin)이 함유된 YEP 배지를 포함할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 형질전환된 세균의 배양은 통상 세균배양 조건 하에서 가능하며, 예를 들어, 5℃ 내지 45℃에서 1시간 내지 40시간 동안 배양할 수 있다. 상기 배양단계는, 상기 배지에서 배양물의 흡광도(O.D. 600)가 1 내지 2가 될 때까지, 바람직하게는 1.3 내지 1.7이 될 때까지, 25 내지 45℃에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 형질전환 세균의 기질로서 트립타민(tryptamine)을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 이 때 상기 기질뿐만 아니라 발현유도인자를 추가적으로 더 첨가할 수 있다. 상기 발현유도인자는 유전자의 발현을 유도할 수 있는 물질로서, 예를 들어 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)를 포함할 수 있다. 또한 상기 배양단계는 상기 기질 첨가 후 25 내지 40℃에서 15시간 내지 30시간 동안 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 배양단계에서 생산된 세로토닌을 수집하는 단계는 다음과 같은 방법으로 가능하다: 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 분리하기 위해 원심분리(centrifugation) 또는 여과(filtration)과정을 수행할 수 있으며 이는 당업자가 필요에 따라 알려진 방법에 따라 수행할 수 있다. 상기 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다. 상기 수득한 균체침전물 또는 배양액에 메탄올을 투여하여 세로토닌 화합물을 분리/수득할 수 있다.
또한, 본 발명은 벼 유래의 NADPH-시토크롬 P450 리덕타제(NADPH-cytochrome P450 reductase2) 유전자 및 시나메이트 4-하이드록시다아제(cinnamate 4-hydroxylase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 벼 유래의 NADPH-시토크롬 P450 리덕타제(NADPH-cytochrome P450 reductase2) 유전자와 관련하여서는 상기 세로토닌 화합물 생성을 위한 재조합 벡터의 제조에서 기재한 바와 동일/유사하므로 여기에서 동일한 설명은 생략하기로 한다.
상기 시나메이트 4-하이드록시다아제(cinnamate 4-hydroxylase, C4H)는 시나믹산(cinnamic acid)으로부터 쿠마르산을 생성할 수 있는 P450 효소 중의 하나로써, 상기 C4H 유전자는 기 공지된 애기장대에서 유래된 C4H(cinnamate 4-hydroxylase) 유전자를 포함한다(GenBank pda03082, X66016; Bell-Lelong et al., Plant Physiol. 113, 729-738, 1997). 상기 애기장대 유래 C4H(cinnamate 4-hydroxylase) cDNA(GenBank pda03082)를 분양받아 주형으로 이용하고, 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후, 그 생성물을 제한효소 BamH 및 HindIII으로 절단하고, 동일한 제한효소로 절단된 pETDuet-1 벡터(Novagen 사, 미국)에 삽입하여 pETDuet-△27C4H 벡터를 제조하였다.
또한 본 발명은, 상기 기재한 방식으로 제작된 3 종의 OsCPR 유전자가 각각 발현되는 재조합 벡터 및 상기 C4H 유전자가 발현되는 재조합 벡터를 이용하여, 상기 유전자들이 동시에 발현될 수 있는 형질전환된 세균을 제공할 수 있다. 상기 세균에 대하여는 상기 기재한 OsCPR 유전자 및 T5H 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 세균 관련 기재에서와 동일, 유사한 방법으로 형질전환되고, 이와 관련하여 동일한 설명은 생략하기로 한다.
또한, 본 발명은 상기 벼 유래의 NADPH-시토크롬 P450 리덕타제2(NADPH-cytochrome P450 reductase2) 유전자 및 시나메이트 4-하이드록시다아제(cinnamate 4-hydroxylase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의하여, 상기 유전자들이 동시에 발현될 수 있는 형질전환된 세균을 이용하여 쿠마르산 제조방법을 제공할 수 있으며, 상기 쿠마르산 제조방법은, 상기 형질전환된 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계와; 상기 배양 단계에서 생산된 쿠마르산을 수집하는 단계를 포함하는 쿠마르산 제조방법에 의하여 달성될 수 있다.
상기 배양단계에서, 본 발명에 따른 형질전환된 세균은 통상적인 배양방법에 따라 대량으로 배양될 수 있다. 상기 배양단계에서 이용되는 배양배지는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들어 통상적인 암피실린(ampicillin) 및/또는 카나마이신이 함유된 YEP 배지를 포함할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 형질전환된 세균의 배양은 통상 세균배양 조건 하에서 가능하며, 예를 들어, 5℃ 내지 45℃에서 1시간 내지 40시간 동안 배양할 수 있다. 상기 배양단계는, 상기 배지에서 배양물의 흡광도(O.D. 600)가 1 내지 2가 될 때까지, 바람직하게는 1.3 내지 1.7이 될 때까지, 25 내지 45℃에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 형질전환 세균의 기질로서 시나믹산(cinnamic acid)을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 이 때 상기 기질뿐만 아니라 발현유도인자를 추가적으로 더 첨가할 수 있다. 상기 발현유도인자는 유전자의 발현을 유도할 수 있는 물질로서, 예를 들어 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)를 포함할 수 있다. 또한 상기 배양단계는 상기 기질 첨가 후 25 내지 40℃에서 15시간 내지 30시간 동안 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 배양단계에서 생산된 쿠마르산을 수집하는 단계는 다음과 같은 방법으로 가능하다: 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 분리하기 위해 원심분리(centrifugation) 또는 여과(filtration)과정을 수행할 수 있으며 이는 당업자가 필요에 따라 알려진 방법에 따라 수행할 수 있다. 상기 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다. 상기 수득한 균체침전물 또는 배양액에 메탄올을 투여하여 쿠마르산 화합물을 분리/수득할 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
실시예 1. 벼 유래 OsCPR 유전자 클로닝
벼 OsCPR 유전자 3 종은 벼 게놈 서열로부터 추정된 정보(Jensen & Møller, Phytochem. 71, 132-141, 2010)와 일본 농업생물자원연구소의 부분 OsCPR1, OsCPR2을 기초로 하여, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)을 통하여 전장 유전자길이의 OsCPR1 및 OsCPR 2 염기서열(GenBank No. AK243608, AK099083)을 클로닝하였다. OsCPR3 염기서열(GenBank No. AK102060)는 일본 농업생물자원연구소로부터 분양받아 사용하였다.
구체적으로 벼의 꽃 및 살리실산(salicylic acid)를 처리한 벼 잎에 각각 TRI 시약(Molecular Research Center, Inc., 미국)을 처리하여 전체 RNA를 추출하였고, 상기 전체 RNA를 주형으로 RT-PCR을 수행하였다. 우선 cDNA를 합성하기 위하여 역전사효소(reverse transcriptase) SuperScript II(Invitrogen Inc., 미국)를 이용하였고, 프라이머는 올리고 dT를 사용하였다. 상기 벼 꽃 에서 나온 역전사효소 반응 산물을 주형으로 하여 OsCPR1 유전자를 PCR 클로닝하였고, 상기 살리실산 처리한 벼 잎으로부터 나온 역전사 효소 반응 산물을 주형으로 하여 OsCPR2 유전자를 클로닝하였다.
OsCPR1 클로닝을 위해 사용한 프라이머는 하기 서열번호 1의 전방향 프라이머 및 하기 서열번호 2의 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
서열번호 1: 5‘-(atggcgctggcgctggagg)-3’
서열번호 2: 5‘-(tcaccatacg tcacggaggtacctgc)-3’
OsCPR2 클로닝을 위해 사용한 프라이머는 하기 서열번호 3의 전방향 프라이머 및 하기 서열번호 4의 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
서열번호 3: 5‘-(atggagtcgtcggcgggg)-3’
서열번호 4: 5‘-(ttaccacacatctctcagatacctaccctcc)-3’
OsCPR3 클로닝을 위해 사용한 프라이머는 하기 서열번호 5의 전방향 프라이머 및 하기 서열번호 6의 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
서열번호 5: 5‘-(agatctatggactccggcggcgg)-3’
서열번호 6: 5‘-(ggtacctcaccagacatctct)-3’
상기 PCR 반응은, 상기 cDNA(OsCPR1및 OsCPR2)및 플라스미드(OsCPR3)를 주형 DNA로 하여 50 ng의 주형 DNA, 2.5 ㎕ 10×PCR buffer, 0.25 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.5 μM의 각 프라이머 쌍 및 1.25 units EXTaq polymerase(Takara, Japan)의 총 25 ㎕의 반응액을 수득한 후, 94℃ 1분, 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초, 35회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 수행하였다. 최종 반응산물은 1.5%(w/v) 아가로즈 겔 전기영동에서 확인하였다. 상기 아가로즈 겔로부터 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, USA)을 이용하여 PCR 산물을 정제하였다.
상기 PCR 반응 수행에 의하여 유전자 생성물 OsCPR1(서열번호 11), OsCPR2(서열번호 12), 및 OsCPR3(서열번호 13)이 생성되었다.
실시예 2. 재조합 벡터의 제조
2-1. 벼 유래 NADPH-시토크롬 P450 리덕타제(NADPH- dependent cytochrome P450 reductase, OsCPR) 유전자를 발현하는 벡터의 제조
상기 실시예 1에서 획득한 OsCPR1(서열번호 11), OsCPR2(서열번호 12), 및 OsCPR3(서열번호 13) 유전자 각각을 pTOP Blunt V2(Enzynomics, 대전, 대한민국)의 TA 클로닝 부위 내로 삽입시켜, OsCPR1(서열번호 11)을 포함하는 pTOP Blunt V2:OsCPR1 벡터, OsCPR2(서열번호 12)을 포함하는 pTOP Blunt V2:OsCPR2, 및 OsCPR3(서열번호 13)을 포함하는 pTOP Blunt V2:OsCPR3 벡터를 제작하였다.
그 후, 상기 pTOP Blunt V2:OsCPR1 벡터를 제한효소 BamHI 및 XhoI으로 절단하고, 동일 효소로 절단된 pCOLADuet-1 벡터(Novagen사, 미국)에 삽입하여 pCOLADuet:OsCPR1 벡터를 제조하였다. 상기 pTOP Blunt V2:OsCPR2 및 pTOP Blunt V2:OsCPR3 벡터를 제한효소 BglII 및 KpnI 으로 절단하고, 제한효소 EcoRI 및 KpnI으로 절단된 pCOLADuet-1 벡터에 삽입하여 pCOLADuet:OsCPR2 및 pCOLADuet:OsCPR3 벡터를 각각 제조하였다.
실시예 2-2. 트립타민 5-하이드록시다아제(tryptamine 5-hydroxylase, T5H) 유전자를 발현하는 벡터의 제조
트립타민 5-하이드록시다아제(tryptamine 5-hydroxylase, T5H) 유전자는 벼에서 유래된 T5H (tryptamine 5-hydroxylase)에서 아미노말단의 막횡단서열이 절개된 T5H 유전자에 GST(glutathion s-transferase) 유전자가 부착되어 있는 GST-△37T5H 를 사용하였다(Park et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 89, 1387-1394, 2011). 상기 GST-△37T5H 를 클로닝하기 위하여, pGEX6p1-△37T5H 벡터(Park et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 89, 1387-1394, 2011)를 주형으로 하여, 하기 서열번호 7의 전방향 프라이머 및 하기 서열번호 8의 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:
서열번호 7: 5‘-(accatgggccatgtcccctatacta)-3’
서열번호 8: 5‘-(agaattcttaaacctcactaagctcctc)-3’
상기 PCR 반응은 상기 실시예 1의 벼 유래 OsCPR 유전자 클로닝에 기재한 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.
상기 PCR 반응 생성물(GST-△37T5H )을 제한효소 NcoI 및 EcoRI으로 절단하고, 동일한 제한효소로 절단된 pETDuet-1 벡터(Novagen사, 미국)에 삽입하여, 트립타민 5-하이드록시다아제(tryptamine 5-hydroxylase, T5H) 유전자를 발현하는 벡터 pETDuet-GST-△37T5H 벡터를 제조하였다.
실시예 2-3. 시나메이트 4-하이드록시다아제(cinnamate 4-hydroxylase) 유전자를 발현하는 벡터의 제조
시나메이트 4-하이드록시다아제(cinnamate 4-hydroxylase) 유전자는 기 공지된 애기장대에서 유래된 C4H(cinnamate 4-hydroxylase) cDNA를 일본농업생물자원연구소에서 분양받아 사용하였다(GenBank pda03082, X66016; Bell-Lelong et al., Plant Physiol. 113, 729-738, 1997). 상기 분양받은 C4H cDNA를 주형으로, 하기 서열번호 9의 전방향 프라이머 및 하기 서열번호 10의 역방향 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다:
서열번호 9: 5‘-(ccaggatcctgggaagaggctccgcctcc)-3’
서열번호 10: 5‘-(tagaagcttctaggcgtcgatgggcttgc)-3’
상기 PCR 반응은 상기 실시예 1의 벼 유래 OsCPR 유전자 클로닝에 기재한 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.
상기 PCR 반응의 생성물을 제한효소 BamH 및 HindIII으로 절단하고, 동일한 제한효소로 절단된 pETDuet-1 벡터(Novagen사, 미국)에 삽입하여, 시나메이트 4-하이드록시다아제(cinnamate 4-hydroxylase) 유전자를 발현하는 벡터 pETDuet-△27C4H 벡터를 제조하였다.
실시예 3. 형질전환 대장균의 제조
실시예 3-1. OsCPR 유전자 및 T5H 유전자 공동 발현용 재조합 대장균의 제조
상기 실시예 2-1에서 제조한 OsCPR1 유전자가 발현된 벡터 pCOLADuet:OsCPR1 벡터 0.1μg DNA 및 상기 실시예 2-2에서 제조한 트립타민 5-하이드록시다아제(tryptamine 5-hydroxylase, T5H) 유전자를 발현하는 벡터 pETDuet-GST-△37T5H 벡터 0.1μg DNA를 상업적으로 구입 가능한 E.coli BL21(DE3)(Novagen사, 미국) 균주 15㎕와 혼합하여, 얼음에 30분 동안 두었다가, 42℃에 40초간 열 쇼크를 가하고, 다시 얼음에 1분 동안 냉각 시킨 후, 60㎕의 SOC 배지(Bacto-trypton 20g, Bacto-yeast extracts 5g, NaCl 0.5 g, 1M KCl 2.5 ml/L)를 첨가한 후 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 후 상기 균주를 암피실린(50 ㎎/ℓ)과 카나마이신(30 ㎎/ℓ)이 함유된 YEP 고체 배지에서 배양하여 pCOLADuet:OsCPR1및 pETDuet-GST-△37T5H 벡터가 동시에 발현되는 재조합 대장균을 제조하였다. 상기 제조된 재조합 대장균은 “pCOLADuet:OsCPR1/pETDuet-GST-△37T5H(BL21(DE3))”라 명명하였다.
상기와 동일한 방법으로, 상기 실시예 2-1에서 제조한 OsCPR2 유전자가 발현된 pCOLADuet:OsCPR2 벡터와 상기 실시예 2-2에서 제조한 T5H 유전자를 발현하는 pETDuet-GST-△37T5H 벡터를 공동으로 발현되는 재조합 대장균 “pCOLADuet:OsCPR2/pETDuet-GST-△37T5H(BL21(DE3))”을 제조하고, 상기 실시예 2-1에서 제조한 OsCPR3 유전자가 발현된 pCOLADuet:OsCPR3 벡터와 상기 실시예 2-2에서 제조한 T5H 유전자를 발현하는 pETDuet-GST-△37T5H 벡터가 공동으로 발현되는 재조합 대장균 “pCOLADuet:OsCPR3/pETDuet-GST-△37T5H(BL21(DE3))”을 제조하였다.
실시예 3-2. OsCPR 유전자 및 C4H 유전자 공동 발현용 재조합 대장균의 제조
상기 실시예 3-1의 기재방법과 동일한 방법으로, 상기 실시예 2-1에서 제조한 OsCPR1 유전자가 발현된 벡터 pCOLADuet:OsCPR1 벡터와 상기 실시예 2-3에서 제조한 C4H 유전자를 발현하는 pETDuet-△27C4H 벡터를 공동으로 발현되는 재조합 대장균 “pCOLADuet:OsCPR1/pETDuet-△27C4H(BL21(DE3))”을 제조하고, 상기 실시예 2-1에서 제조한 OsCPR2 유전자가 발현된 pCOLADuet:OsCPR2 벡터와 상기 실시예 2-3에서 제조한 C4H 유전자를 발현하는 pETDuet-△27C4H 벡터를 공동으로 발현되는 재조합 대장균 “pCOLADuet:OsCPR2/pETDuet-C4H(BL21(DE3))”을 제조하고, 상기 실시예 2-1에서 제조한 OsCPR3 유전자가 발현된 pCOLADuet:OsCPR3 벡터와 상기 실시예 2-3에서 제조한 C4H 유전자를 발현하는 pETDuet-△27C4H 벡터를 공동으로 발현되는 재조합 대장균 “pCOLADuet:OsCPR3/pETDuet-C4H(BL21(DE3))”을 제조하였다.
실시예 4. 세로토닌의 생산
4-1. 재조합 대장균에서의 OsCPR 및 T5H 단백질의 발현여부 확인
상기 실시예 3-1에서 제조된 3가지 대장균: pCOLADuet:OsCPR1/pETDuet-GST-△37T5H(BL21(DE3)), pCOLADuet:OsCPR2/pETDuet-GST-△37T5H(BL21(DE3)), pCOLADuet:OsCPR3/pETDuet-GST-△37T5H(BL21(DE3))을 통상적인 암피실린(ampicillin, 50 ㎎/ℓ) 및 카나마이신(kanamycin, 30 ㎎/ℓ)을 함유하는 YEP 배지에서 배양물의 흡광도(O.D.600)가 1.5에 도달 할 때까지 37℃에서 배양한 후, 발현유도인자(IPTG) 0.1mM 및 트립타민 1mM 농도를 첨가하고, 28℃의 조건에서 24시간 배양하면서, 시간 별로 상기 대장균 배양액을 원심 분리하여 균체침전물과 배양액으로 구분하였다.
상기 배양기간 동안 재조합 대장균에서 OsCPR 및 T5H 단백질이 발현되는지를 확인하기 위하여, 상기 재조합 대장균의 전체 배양액 5㎕를 전기영동으로 분리한 후(SDS-PAGE), 니트로셀루로즈(nitrocellulose) 막에 블롯팅시키고, CPR 및 GST 항체로 면역 반응시켰다(Back et al., Plant Cell Physiol. 42, 475-481, 2001). 상기 반응에 의한 밴드를 검출하기 위하여 웨스턴 블롯팅 키트(Boehringer Manheim 사, 독일)를 이용하였다. 상기 OsCPR 항체는 아미노산 말단부위가 105개 절단된 OsCPR2 단백질을 대장균에서 발현하여, 정제한 후, 쥐에 주사하여 항체를 생산하였다(펩트론, 대전, 대한민국). T5H 단백질의 발현을 보기 위해서 사용한 항체는 GST 항체로서 시그마(한국시그마, 서울, 대한민국)에서 구입하여 이용하였다.
상기 실험 결과는 도 1에서 도시하는 바와 같다. 도 1은 상기 웨스턴 블롯팅 키트를 이용하여 상기 재조합 대장균에서 OsCPR 및 T5H 단백질의 발현여부를 도시하고 있다. 상기 도 1을 참조하면, 상기 재조합 대장균에서 OsCPR 및 T5H 단백질이 안정적으로 발현되고 있음을 확인할 수 있었다.
4-2. 재조합 대장균을 이용한 세로토닌의 생산
상기 실시예 4-1에서 배양된 균체침전물 또는 배양액에 함유된 세로토닌(serotonin)을 정량하기 위하여, 상기 균체침전물을 그램 무게 당 1㎖ 등량의 메탄올로 용해하고, 원심 분리를 수행한 후, 고속액체크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 정량하였다.
상기 고속액체크로마토그라피에서 사용된 컬럼은 Wakosil II 3C18HG(4.6× 150mm)이며, 전개용매로 0.5% TFA가 함유된 35% 메탄올을 사용하였으며 분리된 물질은 320nm에서 측정하였다(Jang et al., Plant Physiol. 135, 346-356, 2004).
상기 측정 결과는 도 2 및 도 3에서 보는 바와 같다. 도 2는 상기 배양액에서 3종의 OsCPR 유전자와 T5H 공동발현 대장균에서 시간별 배양액에서 세로토닌 생성량을 측정한 결과를 그래프로 도식화한 것이다. 도 2를 참조하면, 최고의 세로토닌 함량은 pCOLADuet:OsCPR2/pETDuet-GST-△37T5H(BL21(DE3))세균에서 검출되었으며 상기 세균의 배양액은 18 시간에 250㎎/ℓ의 세로토닌이 생산되었다.
그 다음으로는, pCOLADuet:OsCPR1/pETDuet-GST-△37T5H(BL21(DE3))세균이 세로토닌의 생산량이 좋은 바, 배양시간 18 시간에 170㎎/ℓ세로토닌이 생성되었다.
가장 낮은 세로토닌 함량은 pCOLADuet:OsCPR3/pETDuet-GST-△37T5H(BL21(DE3))세균에서 생산되었으며, 배양시간 18 시간에 26㎎/ℓ이였다.
도 3은 가장 높은 세로토닌 생성량을 보이는 pCOLADuet:OsCPR2/pETDuet-GST-△37T5H(BL21(DE3))세균의 배양액 및 균체침전물에서 세로토닌의 함량을 HPLC를 이용하여 정량화한 결과이다.
도 3을 참조하면, pCOLADuet:OsCPR2/pETDuet-GST-△37T5H(BL21(DE3))세균의 배양액은 18 시간에 250㎎/ℓ의 세로토닌이 생산되었고, 상기 균체침전물에서는 약 20㎎/ℓ의 세로토닌이 생산되어 총 270㎎/ℓ의 세로토닌이 기질 처리 후 18시간 경에 생산되었고, 배양시간 24 시간 동안 매우 안정적으로 세로토닌이 생산되고 있음을 확인 할 수 있었다.
도 2 및 도 3의 결과, CPR 유전자가 없는 대장균(pETDuet-GST-△37T5H, 대조군)에 비해 OsCPR2가 발현되는 대장균에서는 12 배 높은 세로토닌이 생성되었고, OsCPR1의 경우에는 대조군에 비하여 8 배 정도의 높은 세로토닌 생성이 증대됨을 확인할 수 있었다.
본 실험 결과에 따르면, P450 효소인 T5H의 대장균 발현에서 효과적인 T5H 발현을 위해서는 전자공여체인 CPR 유전자의 공동발현이 필수적임을 보여주며, 특히 본 실험에 사용한 OsCPR2 유전자의 발현이 가장 높은 T5H 효소활성을 보여 주고 있으며, 그 다음으로는 OsCPR1 유전자의 발현이 T5H 효소활성에 도움을 주고 있음을 확인할 수 있었다.
4-3. OsCPR2 아미노말단이 세로토닌 생산에 미치는 영향
식물 CPR 유전자는 아미노말단의 길이가 동물에 비해 길고 또한 식물간 아미노말단의 염기서열이 매우 상이한 특징을 가지고 있어(Jensen & Møller, Phytochem. 71, 132-141, 2010), 식물 CPR 유전자의 아미노말단 부위가 특정 P450 단백질과 상호작용하는 인식부위로 작용할 수 있을 것이라 생각되고 있다.
본 실험은 OsCPR2 단백질의 아미노말단 부위가 P450 단백질인 T5H와 상호작용하는지를 알고자 다양한 길이의 아미노말단이 제거된 OsCPR2 유전자와 T5H 유전자를 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 대장균에 공동발현 시켜, 세로토닌 생합성 정도를 비교분석 하였다.
OsCPR2 의 아미노말단이 제거된 다양한 OsCPR2 유전자를 실시예 1과 동일한 PCR방법으로 생성하고, 다양한 크기의 OsCPR2 유전자를 pCOLADuet-1 벡터에 클로닝하여, 최종적으로 OsCPR2 아미노말단이 25개이 제거된 pCOLADuet:△25OsCPR2 벡터, OsCPR2 아미노말단이 49개 제거된 pCOLADuet:△49OsCPR2 벡터, OsCPR2 아미노말단이 105개 제거된 pCOLADuet:△105OsCPR2 벡터, OsCPR2 아미노말단이 151개 제거된 pCOLADuet:△151OsCPR2 벡터, 및 OsCPR2 아미노말단이 181개 제거된 pCOLADuet:△181OsCPR2 벡터를 제작하였다.
이후 상기 실시예 4-1에 기재한 방법에 준하여, 상기의 다양한 길이의 아미노말단 제거 OsCPR2 벡터구조물과 pETDuet-GST-△37T5H 벡터를 E.coli BL21(DE3)(Novagen사, 미국) 균주와 혼합하여 열 쇼크 방법으로 형질전환한 후, 상기 균주를 암피실린(50 mg/L) 과 카나마이신(30 mg/L)이 함유된 YEP 고체 배지에서 배양하여 다양한 길이의 아미노말단 제거 OsCPR2 벡터구조물 과 pETDuet-GST-△37T5H 벡터가 동시에 발현되는 재조합 대장균을 제조하였다.
상기 각 아미노말단이 제거된 OsCPR2 및 T5H 단백질이 각 재조합 대장균에서 안정적으로 발현되는지를 확인하기 위하여 상기 실시예 4-1에서 기재한 방법과 동일한 방법을 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였고, 그 결과는 도 4에서 보는 바와 같다.
도 4는 상기 웨스턴 블롯팅 키트를 이용하여 상기 각 아미노말단이 제거된 OsCPR2 및 T5H 단백질이 상기 각 재조합 대장균에서의 발현여부를 도시하고 있다. 상기 도 4를 참조하면, 상기 재조합 대장균에서 상기 각 아미노말단이 제거된 OsCPR2 및 T5H 단백질이 안정적으로 발현되고 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 각 재조합 대장균의 배양에 의하여 생성된 세로토닌 함량을 측정하기 위하여 상기 실시예 4-2에 기재한 방법과 동일하게 수행하여, 상기 재조합 대장균을 배양하여 12 시간 후 배양액에서 세로토닌 함량을 측정하였으며, 그 결과는 도 5와 같다.
도 5의 FL은 아미노말단이 제거되지 않은 OsCPR2(pCOLADuet:FL-OsCPR2) 대장균을 의미한다. 아미노말단 25개가 제거된 OsCPR2(pCOLADuet:△25OsCPR2)가 발현되는 재조합 대장균에서는 세로토닌 생산이 아미노말단이 제거되지 않은 OsCPR2(pCOLADuet:FL-OsCPR2) 대장균에 비해 22% 감소되었고, 아미노말단이 105개 제거된 △105OsCPR2 대장균에서는 50% 감소되었다.
또한 아미노산이 49개 제거된 대장균(pCOLADuet:△49OsCPR2)에서는 세로토닌이 생산이 100% 감소됨을 보여 CPR 단백질의 효소활성이 상실되었음을 보여주었다. 또한 아미노말단이 151개 및 181개 제거된 대장균에서도(pCOLADuet:△151OsCPR2, pCOLADuet:△181OsCPR2) 세로토닌 생성이 거의 되지 않은 것으로 보아 pCOLADuet:△49OsCPR2 대장균과 같이 CPR 단백질의 효소활성이 상실됨을 보였다.
결론적으로, 본 실험에서는 대장균에서 OsCPR2 유전자의 발현은 아미노말단이 제거되지 않은 전장 유전자발현에서 T5H 효소활성을 증대 시키는 것임을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 쿠마르산의 생산
OsCPR 유전자의 발현이 T5H 유전자 이외의 P450 유전자의 촉매활성도 증대 시키는지 알고자, 시나믹산(cinnamic acid)을 쿠마르산(coumaric acid)로 촉매하는 P450 유전자인 cinnamate 4-hydroxylase(C4H) 유전자와 공동발현시켜 쿠마르산 함량을 측정하였다.
상기 실시예 3-2에서 제조한 3종의 OsCPR 유전자 각각 및 C4H 유전자 공동 발현용 재조합 대장균을 상기 실시예 4-1에 기재한 방법과 동일한 방법으로 배양하였다. 다만, 트립타민 대신 시나믹산을 첨가하는 것만 상이하다. 상기 방법으로 재조합 대장균을 배양한 후, 12시간에 배양액을 채취하여 쿠마르산의 함량을 정량하였고, 상기 쿠마르산 함량의 정량은 상기 실시예 4-2에서 기재한 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 대조군으로 C4H 유전자만 발현되는 재조합 대장균을 이용하였다.
상기 실험 수행의 결과는 도 5에 도시하였다. 도 5를 참조하면, 대조군(pETDuet-△27C4H 벡터 단독으로 발현되는 대장균)에서는 쿠마르산이 0.5㎎/ℓ 생산되었으나, OsCPR 유전자와 공동으로 발현되는 대장균에서는 쿠마르산 생산이 증대됨을 확인할 수 있었다.
그 중에서도 OsCPR2/△27C4H가 공동발현되는 대장균(pCOLADuet:OsCPR2/pETDuet-C4H(BL21(DE3))에서는 6.8㎎/ℓ의 쿠마르산이 생산되었고, OsCPR3와 C4H가 공동발현되는 대장균(pCOLADuet:OsCPR3/pETDuet-C4H(BL21(DE3))) 및 OsCPR1와 C4H가 공동발현되는 대장균(pCOLADuet:OsCPR1/pETDuet-△27C4H(BL21(DE3))) 에서도 쿠마르산 생산이 각각 3.4 배 및 4배 증대됨을 알 수 있었다.
상기 결과는 OsCPR 과 P450 의 대장균 공동발현으로 통해 P450 효소활성을 증대시킬 수 있음을 알 수 있고, 3 종의 OsCPR 유전자중 OsCPR2 유전자의 공동발현에서 가장 높은 P450 촉매활성을 보여줌을 두 가지 서로 다른 P450 효소(T5H, C4H)에서 확인 할 수 있었다.
이로부터 OsCPR2 유전자와 및 P450 유전자를 대장균에 공동 발현함으로써 P450 유전자의 촉매활성을 증대시킴으로, P450 유래 다양한 천연산물을 대장균에서 효과적으로 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
비록 본 발명의 몇몇 실시예들이 도시되고 설명되었지만, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 당업자라면 본 발명의 원칙이나 정신에서 벗어나지 않으면서 본 실시예를 변형할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그 균등물에 의해 정해질 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

  1. P450 효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및
    상기 P450 효소 유전자의 촉매활성을 증대시키는 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 벼 유래의 NADPH-시토크롬 P450 리덕타제2(NADPH-cytochrome P450 reductase2) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어, 상기 P450 효소 유전자와 ADPH-시토크롬 P450 리덕타제2(NADPH-cytochrome P450 reductase2) 유전자가 동시에 발현되는 형질전환된 세균.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 P450 효소 유전자는 트립타민 5-하이드록시다아제(tryptamine 5-hydroxylase)인 것을 특징으로 하는 형질전환된 세균.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세균은 대장균인 것인 형질전환된 세균.
  4. 세로토닌 제조방법에 있어서,
    제2항의 형질전환된 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계와;
    상기 배양 단계에서 생산된 세로토닌을 수집하는 단계를 포함하는 세로토닌 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 세균은 대장균인 것인 세로토닌 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 배양 배지는 YEP 배지를 포함하는 것인 세로토닌 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 배양 단계는,
    상기 배지에서 배양물의 흡광도(O.D. 600)가 1 내지 2가 될 때까지 35 내지 45℃에서 배양하는 단계를 더 포함하는 것인 세로토닌 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 배양 단계는,
    트립타민(tryptamine)을 첨가하는 단계와;
    25 내지 35℃에서 15시간 내지 30시간 동안 배양하는 단계를 더 포함하는 것인 세로토닌 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 P450 효소 유전자는 시나메이트 4-하이드록시다아제(cinnamate 4-hydroxylase) 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환된 세균.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 세균은 대장균인 것인 형질전환된 세균.
  11. 쿠마르산 제조방법에 있어서,
    제9항의 형질전환된 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계와;
    상기 배양 단계에서 생산된 쿠마르산을 수집하는 단계를 포함하는 쿠마르산 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 세균은 대장균인 것인 쿠마르산 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 배양 배지는 YEP 배지를 포함하는 것인 쿠마르산 제조방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 배양 단계는,
    상기 배지에서 배양물의 흡광도(O.D. 600)가 1 내지 2가 될 때까지 35 내지 45℃에서 배양하는 단계를 더 포함하는 것인 쿠마르산 제조방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 배양 단계는,
    시나믹산(cinnamic acid)을 첨가하는 단계와;
    25 내지 35℃에서 15시간 내지 30시간 동안 배양하는 단계를 더 포함하는 것인 쿠마르산 제조방법.
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