CN101365787B

CN101365787B - 用于生产莫纳甜的立体异构体和其前体的多肽和生物合成途径

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Publication number: CN101365787B
Application number: CN200680022628.5A
Authority: CN
Inventors: B·J·布雷泽尔; E·伯克; M·德索萨; S·J·格特; P·M·西克斯; S·R·科勒曼; P·卢金伯尔; S·C·麦克法兰; T·里查德森; F·A·桑切斯-里埃拉; C·索尔海德; D·韦纳; 赵利山
Original assignee: Cargill Inc
Current assignee: Cargill Inc
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2006-04-26
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2026-04-26
Also published as: CN101365787A; EP2361976A3; WO2007133184A2; EP1883697A2; CA2638896C; EP1883697A4; EP3168299A2; AU2006341528A1; CA2638896A1; JP5336182B2; WO2007133184A3; BRPI0609876A2; JP2008538932A; EP3168299A3; ES2587572T3; EP2361976A2; EP2361976B1; AU2006341528A8

Abstract

用多肽和生物合成途径生产莫纳甜和莫纳甜的某些立体异构体如R，R莫纳甜和S，R莫纳甜及其盐。这些多肽和生物合成途径也可用于生产R-2-羟基-2-(吲哚基-3-基甲基)-4-酮戊二酸，它是某些莫纳甜合成途径，包括一些生物合成途径中形成的中间体。

Description

用于生产莫纳甜的立体异构体和其前体的多肽和生物合成途径

发明背景

发明领域

本发明提供了可用于生产D-色氨酸、吲哚-3-丙酮酸、R-2-羟基-2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(R-MP)和莫纳甜的某些立体异构体如R，R和S，R莫纳甜，以及它们的盐的多肽和生物合成途径。

背景技术

莫纳甜是具有以下化学式的高强度甜味剂：

莫纳甜包括两个手性中心，产生四种可能的立体异构构型。R，R构型(“R，R立体异构体”或“R，R莫纳甜”)；S，S构型(“S，S立体异构体”或“S，S莫纳甜”)；R，S构型(“R，S立体异构体”或“R，S莫纳甜”)；和S，R构型(“S，R立体异构体”或“S，R莫纳甜”)。除非另有说明，本文所用术语“莫纳甜”指包含莫纳甜的所有四种立体异构体的组合物，包含莫纳甜立体异构体的任何组合的组合物(如仅包含莫纳甜的R，R和S，S立体异构体的组合物)，以及单个异构体形式。

出于本发明目的，如上所述对莫纳甜碳主链进行编号，直接共价连接于醇基的碳定为2位碳，直接共价连接于氨基的碳定为4位碳。因此，本文提到R，R莫纳甜、S，S莫纳甜、R，S莫纳甜和S，R莫纳甜分别指：2R，4R莫纳甜、2S，4S莫纳甜、2R，4S莫纳甜和2S，4R莫纳甜，除非另有说明。

应理解，在文献中，也用其它规则对莫纳甜碳主链编号，将连接于醇基的碳定为4位碳，将连接于氨基的碳定为2位碳。因此，例如，本发明提到的2S，4R莫纳甜与采用该编号规则的文献中的2R，4S莫纳甜相同。

而且，由于存在各种命名规则，莫纳甜可能有许多不同的化学名，包括：2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸；4-氨基-2-羟基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-戊二酸；4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)谷氨酸；和3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-丁-4-基)吲哚。

在南非德兰士瓦地区发现的植物冬青叶硬木朔(Sclerochiton ilicifolius)的根皮中发现了莫纳甜的某些异构体形式。美国专利申请10/422,366(“’366申请”)、10/979,821(“’821申请”)和11/114,922(“’922申请)(纳入本文作参考)公开了体外和体内生产莫纳甜的多肽、途径和微生物等。

发明概述

本发明提供了用于生产D-色氨酸、吲哚-3-丙酮酸、R-2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(也称为R-α酮酸莫纳甜、R-莫纳甜前体、R-MP和莫纳甜的α酮形式)和莫纳甜的某些立体异构体如R，R和S，R莫纳甜以及它们的盐的多肽和生物合成途径等。该方法包括使用一种或多种多肽，具体说是酶如消旋酶(如谷氨酸消旋酶、天冬氨酸消旋酶和丙氨酸消旋酶)、广泛特异性D-转氨酶(也称为D-丙氨酸转氨酶、D-氨基酸转氨酶和D-天冬氨酸转氨酶)、L-转氨酶(包括L-色氨酸-转氨酶、L-芳族氨基酸转氨酶、L-天冬氨酸转氨酶和L-丙氨酸-转氨酶)、醛缩酶(如R-特异性醛缩酶)、D-苯基甘氨酸转氨酶(也称为D-4-羟基苯基甘氨酸转氨酶)、D-甲硫氨酸转氨酶、谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸脱羧酶和天冬氨酸-4-脱羧酶，来生产富含4-R异构体形式的莫纳甜组合物和/或生产R，R莫纳甜不需要将化学计量的D-氨基酸底物用作MP胺化的氨基酸供体。

应理解，为了简明，无论在说明书和权利要求书中的什么地方提到形成的中间体/产物(如莫纳甜或莫纳甜前体)，只要合理均可包含术语“和/或其盐”。换言之，例如，术语“吲哚-3-丙酮酸转变为MP”应理解为“吲哚-3-丙酮酸转变为MP和和/或其盐”。实际上，本领域普通技术人员应理解，在所示的反应条件下，实际上存在或也存在中间体/产物的盐。

按照一些实施方式，该方法产生一种莫纳甜组合物，其中所述组合物的莫纳甜组分仅包含R，R和S，R形式的莫纳甜。用于表示仅形成了某些异构体时，除非另有说明，术语“仅”指如果不发生外消旋作用该途径仅产生所鉴定的异构体。因此，术语“仅”不应指不存在其它异构体，本领域普通技术人员应理解为由于可能发生外消旋作用，可能存在相对少量的其它异构体形式。按照一些实施方式，该方法产生一种莫纳甜组合物，其中所述组合物的莫纳甜组分仅包含R，R形式的莫纳甜(因此其含义是除了可能含有发生外消旋作用产生的其它异构体形式)。

本文所用术语“莫纳甜组合物”指含有一种或多种莫纳甜异构体的组合物；该术语也可指仅包含一种莫纳甜异构体形式的组合物，这取决于具体的文章内容。

在本发明的一些实施方式中，提供了生产莫纳甜组合物的方法，其包括由L-色氨酸产生吲哚-3-丙酮酸，由吲哚-3-丙酮酸产生2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(“莫纳甜前体”或“MP”)和由MP产生莫纳甜。对L-色氨酸作为底物的特异性、活性或二者均高于R-MP、R，R莫纳甜或其二者的酶能促进L-色氨酸至吲哚-3-丙酮酸的反应。按照某些实施方式，具有R-特异性醛缩酶活性的酶能促进吲哚-3-丙酮酸的反应，从而产生R-MP。按照某些实施方式，提供了可能促进氨基酸的差向异构的消旋酶，这些氨基酸是由一种异构体形式向另一种异构体形式的L-色氨酸转氨反应的副产物(或由作为色氨酸反应副产物的另一种氨基酸形成)。

在本发明的一些实施方式中，提供了生产莫纳甜组合物的方法，其包括由L-色氨酸产生吲哚-3-丙酮酸，由吲哚-3-丙酮酸产生2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(“莫纳甜前体”或“MP”)和由MP产生莫纳甜。对L-色氨酸作为底物的特异性、活性或二者均高于R-MP、R，R莫纳甜或其二者的酶能促进L-色氨酸至吲哚-3-丙酮酸的反应，对R-MP有立体选择性的酶能促进MP形成莫纳甜的反应。

应理解，提到一系列反应时，如上一自然段，本发明不需要严格进行每一步骤；大概进行这些步骤就足够了。换言之，例如，可通过混合L-色氨酸与酶并设定使所述反应可以发生条件来进行生产莫纳甜组合物的方法，其包括由L-色氨酸产生吲哚-3-丙酮酸、由吲哚-3-丙酮酸产生2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(“莫纳甜前体”或“MP”)和由MP产生莫纳甜，其中各反应由合适的酶促进。在这种情况下，L-色氨酸可以反应产生吲哚-3-丙酮酸，由L-色氨酸反应产生的吲哚-3-丙酮酸可反应形成MP，由吲哚-3-丙酮酸反应产生的MP反应形成莫纳甜。也可通过(例如)提供在适合L-色氨酸生产的条件下可产生L-色氨酸的化合物，并将该化合物与能够在适合这些反应进行的条件下促进所列一系列反应的酶混合，来进行该方法。又例如，可通过提供经遗传改造能按照所述途径产生莫纳甜的微生物，并提供适合进行发酵过程的条件，来进行该方法。例如，可以对天然产生大量L-色氨酸(或D-色氨酸)的微生物进行遗传改造，以生产或过量生产促进至莫纳甜途径的反应中所用的酶，可提供合适条件，以使该微生物产生莫纳甜。

在本发明的其它实施方式中，提供了生产莫纳甜组合物的方法，其中L-色氨酸转变为吲哚-3-丙酮酸时α-酮酸底物形成L-氨基酸、吲哚-3-丙酮酸反应形成MP(可包含R-MP和S-MP，但优选仅仅或主要包含R-MP)，R-MP转变为R，R莫纳甜时L-氨基酸反应再生(也称为“循环再生”)α-酮酸底物。立体反转性转氨酶如D-甲硫氨酸转氨酶(EC 2.6.1.41)或衍生自D-苯基甘氨酸转氨酶的酶能促进R-MP形成R，R莫纳甜的反应。

在本发明的其它实施方式中，提供了生产莫纳甜组合物的方法，其包括由L-色氨酸产生D-色氨酸，由D-色氨酸产生吲哚-3-丙酮酸，由吲哚-3-丙酮酸产生R-MP，和由R-MP产生R，R莫纳甜。色氨酸消旋酶和其功能等同物能促进由L-色氨酸产生D-色氨酸。在其它实施方式中，同一酶能促进D-色氨酸形成吲哚-3-丙酮酸的反应和MP形成莫纳甜的反应。在其它实施方式中，具有R-特异性醛缩酶活性的酶能促进吲哚-3-丙酮酸的反应，从而形成R-MP，同一酶能促进D-色氨酸形成吲哚-3-丙酮酸的反应和R-MP形成R，R莫纳甜的反应。

在本发明的其它实施方式中，本文公开了生产R，R-莫纳甜或其盐的方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：(a)利用色氨酸消旋酶由L-色氨酸产生D-色氨酸(消旋酶对莫纳甜的活性有限或无活性)，(b)由D-色氨酸产生吲哚-3-丙酮酸，(c)由吲哚-3-丙酮酸产生R-莫纳甜前体，和(d)由R-莫纳甜前体产生R，R-莫纳甜。

虽然公开了多种实施方式，但本领域技术人员从本说明书中能够了解本发明的其它实施方式。通过本说明书应该意识到，能够对本发明的各个方面进行修饰，但不背离本发明的构思和范围。因此，附图和详细说明应被理解为说明性而非限制性。

附图简要说明

图1是流程图，显示了按照本发明由L-色氨酸生产R，R莫纳甜的酶学方法的例子。在这个例子中，该方法包括将在对L-色氨酸作为底物的特异性和/或选择性高于R-MP的L-转氨酶(例如包括L-色氨酸转氨酶、L-芳族氨基酸转氨酶、L-天冬氨酸转氨酶和L-丙氨酸转氨酶)和/或对R，R莫纳甜作为底物的活性和/或特异性有限的L-氨基酸氧化酶用于L色氨酸反应。

图2是流程图，显示了按照本发明产生R，R莫纳甜的另一种方法的例子。在这个例子中，该方法包括用对R-MP有立体选择性的酶将R-MP转变为莫纳甜。

图3是流程图，显示了按照本发明由L-色氨酸生产R，R莫纳甜的另一种方法的例子。在这个例子中，该方法包括用色氨酸消旋酶将L-色氨酸转变为D-色氨酸和将形成吲哚-3-丙酮酸的反应的偶联反应产生的D-氨基酸产物用作形成R，R莫纳甜的反应的偶联反应的底物。

图4是流程图，显示了按照本发明由L-色氨酸生产R，R莫纳甜的另一种方法的例子。在这个例子中，该方法包括将L-色氨酸反应的偶联反应中形成的L-氨基酸转变为D-氨基酸；此种D-氨基酸用作R-MP转变为R，R莫纳甜的反应的氨基供体。

图5是流程图，显示了按照本发明由L-色氨酸生产R，R莫纳甜的另一种方法的例子。在这个例子中，该方法包括用立体反转性酶促进R-MP转变为R，R莫纳甜，以使L-色氨酸反应的偶联反应形成的L-氨基酸可用作R-MP至R，R莫纳甜反应的偶联反应的底物。

图6是流程图，显示了按照本发明由L-色氨酸生产R，R莫纳甜的另一种方法的例子。在这个例子中，该方法包括通过一系列转化反应将形成吲哚-3-丙酮酸的反应中产生的L-氨基酸循环(recycle)为在形成R，R莫纳甜的反应中用作R-MP的反应物的D-氨基酸。

图7是流程图，显示了按照本发明由L-色氨酸生产R，R莫纳甜的另一种方法的例子。在这个例子中，该方法包括通过将该反应的L-氨基酸副产物转变为另一种产物促使L-色氨酸反应前进(即驱动该反应向产生吲哚-3-丙酮酸的方向进行)。在这个例子中，用脱羧酶使L-氨基酸L-天冬氨酸副产物不可逆地转变为L-丙氨酸。

图8是流程图，显示了按照本发明生产R，R莫纳甜的另一种方法的例子。在这个例子中，该方法包括通过一系列转化反应将L-色氨酸反应的氨基酸副产物循环(recycle)为R-MP反应的氨基酸反应物。

发明详述

缩写和术语

下面提供了术语和方法的解释，以便更好地描述本发明和指导本领域普通技术人员实施本发明。如本文所用，“含有”指“包括”。无论在何处使用“包括”时，应理解为“包括但不限于”，无论是否明确提到“仅限于”。此外，单数形式“一”或“一个”或“这种”包括复数含义，除非上下文另有明确规定。例如，提到“含有一种蛋白”包括一种或多种这样的蛋白，提高“含有细胞”包括一种或多种细胞和本领域技术人员已知的它的等价物，等等。术语“约”包括发生于任何测定中的实验误差的范围。除非另有说明，假定所有的测定数字前面都有“约”字，即使没有明显地使用“约”字。

保守取代：用一个氨基酸取代多肽中的另一个氨基酸，保守取代对多肽的活性影响小或无影响。是否认为一取代是保守取代与互换的氨基酸在结构上或功能上的相似性无关。例如，理想的是，包含一个或多个保守取代的色氨酸转氨酶多肽保持色氨酸转氨酶活性。可通过采用(例如)标准方法如定位诱变或PCR或本领域已知的其它方法来操作编码该多肽的核苷酸序列，从而产生含有一个或多个保守取代的多肽。

可取代蛋白质中原始氨基酸，并且如果对该多肽的活性影响不大或无影响则被认为是保守取代的氨基酸的非限制性例子包括：用ser或thr取代Ala；用gln、his或lys取代arg；用glu、gln、lys、his、asp取代asn；用asn、glu或gln取代asp；用ser或ala取代cys；用asn、glu、lys、his、asp或arg取代gln；用asn、gln、lys或asp取代glu；用pro取代gly；用asn、lys、gln、arg、tyr取代his；用leu、met、val、phe取代ile；用ile、met、val、phe取代leu；用asn、glu、gln、his、arg取代lys；用ile、leu、val、phe取代met；用trp、tyr、met、ile或leu取代phe；用thr、ala取代ser；用ser或ala取代thr；用phe、tyr取代trp；用his、phe或trp取代tyr；和用met、ile、leu取代val。

关于保守取代的其它信息可参见Ben-Bassat等，J.Bacteriol.169：751-757，(1987)；O′Regan等，Gene 77：237-251，(1989)；Sahin-Toth等，Protein Sci.3：240-247，(1994)；Hochuli等，Bio/Technology 6：1321-1325，(1988)；WO 00/67796(Curd等)和遗传学和分子生物学的标准教科书等。

衍生：出于本发明的说明书和权利要求书的目的，如果发生以下事件则称一种物质“衍生”自生物体或来源：1)该物质存在于该生物体/来源中；2)从天然宿主中取出该物质；或者，3)从天然宿主中取出或者(例如)通过诱变产生该物质。

分离：本文所用术语“分离”指由其天然宿主中取出的任何物质；该物质不一定具有任何特定的纯度。例如，“分离核酸”指不与其起源生物体的天然存在基因组直接毗连(一个在5′端，一个在3′端)的序列直接毗连的天然存在的核酸。例如，分离核酸可以是，但不限于：在天然存在的基因组中通常与该重组DNA分子侧接的一个核酸序列被去除或不存在的任何长度的重组DNA分子。因此，分离核酸包括但不限于：以独立于其它序列的分离分子(如用PCR或限制性内切核酸酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)存在的重组DNA以及掺入载体的重组DNA、自主复制的质粒、病毒(如逆转录病毒载体、腺病毒或疱疹病毒)或者原核生物或真核生物的基因组DNA的重组DNA。此外，分离的核酸可包括作为杂交或融合核酸序列的一部分的重组DNA分子。

当提及核酸时，本文所用术语“分离”也包括任何非天然存在的核酸，因为在自然中未发现非天然存在的核酸序列，且在天然存在的基因组中非天然存在的核酸序列不具有直接毗连的序列。例如，非天然存在的核酸如工程改造的核酸被认为是分离核酸。可用普通的分子克隆技术或化学核酸合成技术来制造工程改造的核酸。分离的非天然存在的核酸可以独立于其它序列，或掺入载体、自主复制的质粒、病毒(如逆转录病毒载体、腺病毒或疱疹病毒)或原核生物或真核生物的基因组DNA。此外，非天然存在的核酸可包括作为杂交或融合核酸序列的一部分的核酸分子。

在(例如)cDNA或基因组文库、或含有基因组DNA限制性消化物的凝胶片中，认为存在于几百至几百万其它核酸分子中的核酸不是分离核酸。

纯化：本文所用术语“纯化”表示从感兴趣的样品中去除了污染物。术语“纯化”不需要完全纯净，而应理解为相对术语，除非上下文中另有说明。因此，例如，纯化的多肽或核酸制剂可以是主题多肽或核酸的浓度高于生物体天然条件下该多肽或核酸的浓度或高于其在取出环境中的浓度的制剂。

立体反转性转氨酶：“立体反转性转氨酶”采用手性相反的底物作为氨基供体时能够优选或选择性产生手性氨基酸产物(如莫纳甜)的多肽。例如，立体反转性转氨酶可以是优选或选择性采用L-谷氨酸作为底物来产生R，R莫纳甜的D-苯基甘氨酸转氨酶(也称为D-4-羟基苯基甘氨酸转氨酶)。立体反转性转氨酶的非限制性例子包括D-甲硫氨酸转氨酶(EC 2.6.1.41)和具有D-苯基甘氨酸转氨酶活性或D-4-羟基苯基甘氨酸转氨酶活性的酶。

互补基因：“互补基因”是表达时使生物体中的突变无效的基因。例如，如果一生物体的细胞合成色氨酸所必需的一个基因产生无效突变，那么互补基因可以是表达时能使该品系在极限培养基(即不含色氨酸)上生长的基因。

立体选择性酶：“立体选择性酶”是与对另一种异构体的特异性和/或活性相比，对一种异构体的特异性更高和/或活性更高的酶。例如，立体选择性酶是对R-MP的特异性和/或活性高于S-MP的酶。在优选实施方式中，相对于一种异构体，立体选择性酶对另一种异构体的活性有限。“有限”活性指按照本文提供的实验测定，活性很小或无法检测到。实施例6(例如)将HEXAspCP9T/R122G鉴定为对S，S莫纳甜活性有限的酶。实施例8将苜蓿根瘤菌(S.meliloti)TatA鉴定为另一种对S-MP活性有限的酶。在实施例18中，与S-MP相比，嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)D-转氨酶对R-MP的选择性更高，导致R，R莫纳甜的立体纯度更高。另外，实施例19表明，与R-MP相比，杂交DAT对S-MP的活性有限。

同源：本文所用术语″同源″表示，用标准方法比对两条序列时，一种蛋白质或核酸与另一种蛋白质或核酸的序列的序列相同性相对较高。例如，如果用标准方法比对两条序列时R-特异性醛缩酶与SEQ ID NO：22醛缩酶的序列相同性至少约为50％，那么R-特异性醛缩酶与SEQ ID NO：22醛缩酶同源。

EC号：生物化学和分子生物学国际单位指定的酶分类号。

产生莫纳甜的R，R和其它立体异构体的生物合成途径

如WO03/091396A2(参见例如，图1-3和11-13)等文献所述，可通过包括生物转化(即用多肽促进底物反应生成产物)的多步途径由色氨酸生产莫纳甜。所述途径包括将色氨酸生物转变为吲哚-3-丙酮酸，将吲哚-3-丙酮酸生物转变为2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(“MP”)，将MP生物转变为莫纳甜。用于生产莫纳甜的本发明生物合成途径可包括以下一个或多个步骤、机制和/或途径或由其组成。下述的步骤、机制和/或途径仅为了示范。

生产莫纳甜或其盐的一种方法包括(a)由L-色氨酸产生吲哚-3-丙酮酸，(b)由吲哚-3-丙酮酸产生莫纳甜前体，和(c)由所述莫纳甜前体产生莫纳甜。

用于将色氨酸转变为吲哚-3-丙酮酸的酶包括酶分类为(″EC″)2.6.1.27、1.4.1.19、1.4.99.1、2.6.1.28、1.4.3.2、1.4.3.3、2.6.1.5、2.6.1.-、2.6.1.1、2.6.1.21和3.5.1.-的成员。这些类别包括以下多肽，例如：将L-色氨酸和α-KG(即α-酮戊二酸，也称为2-酮戊二酸)转变为吲哚-3-丙酮酸和L-谷氨酸的色氨酸转氨酶；将D-色氨酸和2-含氧酸转变为吲哚-3-丙酮酸和氨基酸的D-色氨酸转氨酶；将L-色氨酸和NAD(P)转变为吲哚-3-丙酮酸和NH₃和NAD(P)H的色氨酸脱氢酶；将D-氨基酸和FAD转变为吲哚-3-丙酮酸和NH₃和FADH₂的D-氨基酸脱氢酶；将L-色氨酸和苯基丙酮酸转变为吲哚-3-丙酮酸和L-苯丙氨酸的色氨酸-苯基丙酮酸转氨酶；将L-氨基酸和H₂O和O₂转变为2-含氧酸和NH₃和H₂O₂的L-氨基酸氧化酶；将D-氨基酸和H₂O和O₂转变为 2-含氧酸和NH₃和H₂O₂的D-氨基酸氧化酶；以及将L-色氨酸和H₂O和O₂转变为吲哚-3-丙酮酸和NH₃和H₂O₂的色氨酸氧化酶。这些类别也含有酪氨酸(芳族氨基酸)转氨酶、天冬氨酸转氨酶、D-氨基酸(或D-丙氨酸)转氨酶和具有多种转氨酶活性的广泛(多底物)转氨酶，其中一些酶可将色氨酸和2-含氧酸转变为吲哚-3-丙酮酸和氨基酸。此外，这些类别包括可在水存在下将色氨酸转变为吲哚-3-丙酮酸和铵的苯丙氨酸脱氨酶。

对L-色氨酸作为底物的特异性、活性或二者均高于MP或莫纳甜的一种或多种酶也可促进由L-色氨酸产生吲哚-3-丙酮酸。对L-色氨酸作为底物的活性和/或特异性高于MP或莫纳甜的酶的例子包括但不限于：L-色氨酸转氨酶、L-芳族氨基酸转氨酶、L-天冬氨酸转氨酶和L-氨基酸氧化酶。

用于将吲哚-3-丙酮酸转变为MP的酶包括酶分类为EC 4.1.3.-、4.1.3.16、4.1.3.17和4.1.2.-的成员。这些类别包括碳-碳合酶/裂合酶，如催化两种羧酸底物缩合的醛缩酶。酶类别EC 4.1.3.-是利用含氧酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作为亲电子试剂形成碳-碳键的合酶/裂合酶，而EC 4.1.2.-是利用醛底物(如苯甲醛)作为亲电子试剂形成碳-碳键的合酶/裂合酶。例如，已知KHG醛缩酶(EC 4.1.3.16)和ProA醛缩酶(EC 4.1.3.17)能将吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸转变为MP。虽然可以认为ProA醛缩酶仅鉴定获自睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)的4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶，但本文所用术语ProA醛缩酶指具有4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶活性的任何多肽，除非另有说明。Pro醛缩酶的合适例子包括睾丸酮丛毛单胞菌ProA(SEQ ID NO：1(核酸序列)、SEQ ID NO：2(氨基酸序列))和苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ProA(NCBI登录号：CAC46344)或者显示与睾丸酮丛毛单胞菌ProA(SEQ ID NO：1(核酸序列)、SEQ ID NO：2(氨基酸序列))和/或苜蓿根瘤菌ProA(NCBI登录号：CAC46344)有同源性的酶。例如，合适酶与睾丸酮丛毛单胞菌ProA(SEQ ID NO：2)和/或苜蓿根瘤菌ProA(NCBI登录号：CAC46344)的氨基酸序列相同性可以为至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、和/或99％。也可采用化学反应，如醛醇缩合产生MP。

用于将MP转变为莫纳甜的酶包括以下酶分类(EC)成员：色氨酸转氨酶(2.6.1.27)、色氨酸脱氢酶(1.4.1.19)、D-氨基酸脱氢酶(1.4.99.1)、谷氨酸脱氢酶(1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脱氢酶(1.4.1.20)、色氨酸-苯基丙酮酸转氨酶(2.6.1.28)或转氨酶家族(2.6.1.-)的更普通成员，如天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、酪氨酸(芳族氨基酸)转氨酶(2.6.1.5)、D-色氨酸转氨酶或D-丙氨酸(2.6.1.21)转氨酶(参见WO 03/091396 A2的图2)。也可采用化学反应进行此反应。采用氨水和氰基硼氢化钠通过还原胺化进行酮酸(MP)的胺化。WO 03/091396 A2的图11-13显示了可用于将MP转变为莫纳甜的其它多肽，并提高了由吲哚-3-丙酮酸或色氨酸产生莫纳甜的产率。

可通过控制组合物中莫纳甜的各种立体异构体的相对量来改变莫纳甜组合物的味觉特性。本发明提供了产生含有所需百分数的R，R莫纳甜和/或S，R莫纳甜的莫纳甜组合物的途径和物质。

可通过用于生物转化的pH或多肽改变以(例如)本文所述途径产生的莫纳甜化合物的手性。用生物合成途径形成莫纳甜时，可考虑以下情况。在生物催化反应中，采用将吲哚-3-丙酮酸转变为MP的酶测定莫纳甜碳-2的手性(参见上述化学结构)。多种酶(如来自EC 4.1.2.-、4.1.3.-)可将吲哚-3-丙酮酸转变为MP。因此，可选择形成所需异构体的酶。或者，可采用定向演化改变将吲哚-3-丙酮酸转变为MP的酶的对映异构特异性，或者可对催化抗体进行工程改造以催化所需的反应。一旦产生MP(酶学方法或化学缩合)后，可加入立体特异性氨基。可根据是否采用D-或L-芳族酸转氨酶产生碳-4的R或S构型(参见前述化学结构)。许多转氨酶对L-异构体特异，然而，D-色氨酸转氨酶存在于某些植物中(Kohiba和Mito，《第8届国际维生素B6和羰基催化讨论会会议录》(Proceedings of the 8th International Symposium on Vitamine B₆ andCarbonyl Catalysis)，Osaka，Japan 1990)。此外，鉴定了D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)、D-甲硫氨酸-丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.41)、以及(R)-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶(EC2.6.1.61)、(S)-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶(EC 2.6.1.22)和D-苯基甘氨酸转氨酶。某些转氨酶可能仅接受C2碳上具有特定构型的底物用于此反应。因此，即使向MP的转化不是立体特异性反应，也可通过合适地选择转氨酶来控制最终产物的立体化学。因为反应可逆，可将未反应的MP(不需要的异构体)循环回其组分中，形成MP的外消旋混合物。

现在描述附图，应注意以下情况。流程图介绍了用于生产莫纳甜的途径的例子，但除非另有说明，图中所示的途径以及本发明方法不仅限于实施这些途径的任何具体方法。例如，这些途径可以在体内、体外或联合实施。

而且，利用本文所述的一种或多种途径实施本发明方法不需要所述各成分(如反应物和酶)均由实施者明确提供；而只要所述组分(或组分来源)和反应条件存在于该组合物(或宿主细胞)中、或者可获得，以使该途径得以进行就足够了。换言之，例如，如果附图描述了一种生产莫纳甜组合物的方法，其包括由L-色氨酸产生吲哚-3-丙酮酸、由吲哚-3-丙酮酸产生2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(“莫纳甜前体”或“MP”)和由MP产生莫纳甜，其中用合适酶促进各反应，也考虑了实施该途径包括在不明确提供吲哚-3-丙酮酸或MP也能发生反应的合适条件下将L-色氨酸与α-酮戊二酸和考虑能促进所述反应的酶混合。在这种情况下，L-色氨酸可与α-酮戊二酸反应产生吲哚-3-丙酮酸。根据条件和提供的酶，L-色氨酸反应产生的吲哚-3-丙酮酸可反应形成MP，然后根据条件和提供的酶，吲哚-3-丙酮酸反应产生的MP可反应形成莫纳甜。

也应注意，如果这种材料或酶已经存在或可以获得，或者能够由反应周围已经存在或可以获得的物质合成，那么用本文所述的一种或多种途径实施本发明方法不需要实施者明确提供所述的原材料或酶。换言之，考虑到实施将L-色氨酸确定为原料的任何途径应包括提供可在适合L-色氨酸生产的条件下产生L-色氨酸的化合物，和在适合发生所述一系列反应的条件下将该化合物与能够促进这些反应的酶混合。另一个例子是，也考虑到实施所述途径包括提供经遗传工程改造以按本文所述途径生产莫纳甜的微生物，并提供适合发生发酵过程的条件。例如，可遗传工程改造天然产生大量L-色氨酸或D-色氨酸的一种微生物(参见美国专利号5,728,555)，以生产或过量生产用于促进(催化)生产莫纳甜途径中的反应的一种或多种酶，并且可提供合适的条件以使该微生物生产莫纳甜。

现在转向图1，所示流程图描述了按照本发明制备包含R，R莫纳甜的莫纳甜组合物的方法。如图1所示，全部途径包括色氨酸形成吲哚-3-丙酮酸的反应、吲哚-3-丙酮酸产生MP的反应和MP产生莫纳甜(包含R，R莫纳甜)的反应。

图1还介绍了此途径的具体排列，这种排列设计能消耗S，S、R，S和S，R形式的莫纳甜而提高R，R形式的莫纳甜的产量。具体说，图1介绍了一种实施方式，其中：用于L-色氨酸反应的转氨酶对L-色氨酸反应的活性和/或特异性高于MP和4S莫纳甜的反应，或者氧化酶对L-色氨酸的活性和/或特异性高于4R莫纳甜；促进吲哚-3-丙酮酸反应的酶是R-特异性醛缩酶；和，促进MP反应的酶是广泛特异性D-酶，优选对MP的R异构体的效率更高的酶。

图1也说明了使R，R莫纳甜的生产更经济的具体排列设计。例如，在图1中，L-色氨酸—与D-色氨酸或L-和D-色氨酸的组合相反—被确定为原料。虽然对色氨酸具体形式的选择不影响莫纳甜组合物中最终莫纳甜化合物的手性(因为色氨酸反应形成吲哚-3-丙酮酸，它没有手性)，一些选择可优选利用L-色氨酸作为原料，至少因为与D-色氨酸相比目前L-色氨酸较便宜且更易于获得。

现在将注意力集中到图1所示的第一个反应上，当色氨酸转变为吲哚-3-丙酮酸时，α-酮戊二酸、草酰乙酸和/或丙酮酸中任何一种或多种都能与色氨酸反应形成氨基酸(分别是谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸)和吲哚-3-丙酮酸。图1描述了一种实施方式，其中色氨酸原料是L-色氨酸，α-酮戊二酸、草酰乙酸和/或丙酮酸产生氨基酸的L-形异构体(分别例如L-谷氨酸、L-天冬氨酸和/或L-丙氨酸)。

如图1所示，提高R，R莫纳甜产量的方法包括用对色氨酸的特异性、活性或二者高于MP或莫纳甜的酶促进L-色氨酸的反应，和用D-特异性酶促进MP的反应。如WO03/091396 A2所示，某些酶可促进色氨酸反应形成吲哚-3-丙酮酸，以及MP发生胺化反应形成莫纳甜。在胺化步骤中使用L-转氨酶可在莫纳甜C-4位上产生S手性中心，而使用D-酶则在莫纳甜C-4位上产生D手性中心。因此，在MP反应中L-转氨酶(促进色氨酸反应)也有活性的情况下，可形成R，S和S，S莫纳甜，这取决于存在的MP形式。此外，其它某些酶—L-氨基酸氧化酶—不仅可促进色氨酸反应生成吲哚-3-丙酮酸，还可具有降解R，R莫纳甜的副活性。按照一些实施方式，最大程度减小或消除此种4R副活性。对莫纳甜4S形式的氧化酶副活性会减少或最大程度减少最终产物中它们的存在，根据所需的最终组合物可能需要这种活性。因此，相对于MP或莫纳甜L-酶对色氨酸的特异性和/或活性越高，相对于S，S和R，S莫纳甜R，R和S，R莫纳甜的产量越高。

按照图1所示实施方式，适合色氨酸反应的酶包括：能够促进L-色氨酸反应形成吲哚-3-丙酮酸的L-转氨酶，它对L色氨酸反应的特异性高于R-MP反应，以形成莫纳甜的4S异构体；和能够促进L-色氨酸反应形成吲哚-3-丙酮酸的L-氨基酸氧化酶，它对L色氨酸反应的特异性和/或活性高于莫纳甜4R异构体的反应，以形成MP，以及任何上述酶的功能等同物。更具体说，合适酶的非限制性例子可选自：L-色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)或酪氨酸(芳族氨基酸)转氨酶(EC 2.6.1.5)或L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)，或衍生自具有天冬氨酸转氨酶活性的酶的突变体。

实施例6鉴定了一种特异性酶，它是突变HEXaspC多肽，包含一个Pro 9-Tyr取代和一个Arg 122-Gly取代，用于促进L-色氨酸和α-KG、草酰乙酸、丙酮酸或其组合反应，分别形成L-谷氨酸、L-天冬氨酸和L-丙氨酸以及吲哚-3-丙酮酸。另一种活性“有限”的特异性酶是TatA，它是苜蓿根瘤菌的L-色氨酸转氨酶。按照图1所示的途径的优选实施方式，适用于色氨酸反应的其它酶包括具有以下特征的酶：以实施例6中L-色氨酸速率的1/10或小于该速率使MP转氨基的酶，或与消旋酶一起使用时(如实施例9)产生大于90％莫纳甜4R异构体的酶。

与MP转变为莫纳甜相比，对L-色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸具有高度特异性的酶的例子包括：HEXAspC(实施例6)、硕大利什曼原虫(Leishmania major)广泛特异性转氨酶(WO03/091396 A2)、猪转氨酶(WO 03/091396 A2)和类球红细菌TatA(实施例9)。然而，可通过(例如)诱变衍生出相对于色氨酸、对R-MP和/或R，R莫纳甜活性有限的这些酶。

现在将注意力集中到图1所示的第二个反应上，促进(或催化)吲哚-3-丙酮酸至MP的反应的酶的选择会影响所产生的R，R莫纳甜对S，R莫纳甜的相对量。通常，所产生的R-MP对S-MP的相对量越大，则所产生的R，R莫纳甜对S，R莫纳甜的相对量越大(当D-酶促进MP至莫纳甜的反应时)。这里所用的酶包括大肠杆菌(E.coli)KHG醛缩酶(Genbank登录号AAC74920.1)、芽孢杆菌KHG醛缩酶(Genbank登录号CAB14127.1)或睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶(SEQ ID NO：1(核酸序列)、SEQ IDNO：2(氨基酸序列))中任何一种促进时，所产生的R-MP∶S-MP之比高于吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸的反应产生的R-MP∶S-MP之比的任何酶。因此，如果需要优先产生R-MP，可采用能够相对于S-MP产生更多R-MP的一种或多种酶。需要以R，R形式的莫纳甜作为其仅有的莫纳甜组分的莫纳甜组合物时，应采用相对于S-MP选择性产生R-MP的酶(“R-特异性酶”)。可用于相对于S-MP选择性产生R-MP的R-特异性酶的例子是SEQ ID NO：22的醛缩酶和苜蓿根瘤菌HMG醛缩酶，如实施例3所示。

图1介绍了一种具体实施方式，其中R-特异性醛缩酶能促进吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸反应形成R-MP。然而，也考虑采用优先产生R-MP吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸反应的醛缩酶，以及所产生的R-MP∶S-MP之比高于下列酶中任一种产生的R-MP∶S-MP之比的醛缩酶，这些酶包括大肠杆菌KHG醛缩酶(Genbank登录号AAC74920.1)、芽孢杆菌KHG醛缩酶(Genbank登录号CAB 14127.1)或睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶(SEQ ID NO：1(核酸序列)、SEQ ID NO：2(氨基酸序列))。此外，也考虑到，吲哚-3-丙酮酸可与不同C3来源(如丝氨酸或半胱氨酸)反应，形成R-MP，因此其它酶(如其它裂合酶或合酶)可促进这一反应。也可采用易于转变成丙酮酸的其它底物(如草酰乙酸)。实施例3提供了以下酶中任何一种促进时，可优选或选择性产生R-MP或者所产生的R-MP∶S-MP之比高于吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸反应产生的R-MP∶S-MP之比的醛缩酶来源，这些酶包括大肠杆菌KHG醛缩酶(Genbank登录号AAC74920.1)、芽孢杆菌KHG醛缩酶(Genbank登录号CAB14127.1)或睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶(SEQ ID NO：1(核酸序列)、SEQ ID NO：2(氨基酸序列))，如SEQ ID NO：22的醛缩酶。实施例5也提供了鉴定这种酶的筛选方法。也考虑到，优选或选择性产生R-MP或者所产生的R-MP多于以下酶中任何一种所产生的R-MP的酶可衍生自自然界中已知或发现的醛缩酶，所述酶包括大肠杆菌KHG醛缩酶(Genbank登录号AAC74920.1)、芽孢杆菌KHG醛缩酶(Genbank登录号CAB14127.1)或睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶(SEQ ID NO：1(核酸序列)、SEQ ID NO：2(氨基酸序列))。可采用本领域已知用于衍生酶，例如与野生型酶相比提高所需特性—例如提高酶对底物的活性的任何技术。实施例4、5、6、7、9、10和11提供了衍生酶所用的一些技术。

现在将注意力集中到图1所示的途径的最后一个步骤上，广泛特异性D-转氨酶，如D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21，也称为D-氨基酸转氨酶或D-天冬氨酸转氨酶)或D-氨基酸脱氢酶能促进R-MP形成R，R莫纳甜的反应。如上所述，MP转变为莫纳甜是胺化反应，它在莫纳甜C-4位上产生手性中心。当C-4位上需要R手性形式时，应该采用在氨基酸中产生“R”手性中心的酶。非限制性示范性酶包括：衍生自芽孢杆菌(Bacillus)的D-丙氨酸-转氨酶(实施例15-18)，包括衍生自嗜碱芽孢杆菌(Bacillushalodurans)的D-丙氨酸-转氨酶(实施例18)和立体特异性改变的突变的支链转氨酶(实施例7)。

另一种示范性酶包括杂交D-转氨酶。该杂交D-转氨酶可含有来自两种不同氨基酸转氨酶的结构元件。然后，可进一步衍生杂交D-转氨酶(如通过诱变或重组工程)，以改进将MP转变为莫纳甜的性能。这种杂交D-转氨酶的例子参见实施例19。实施例19所示的杂交D-转氨酶包括来自球形芽孢杆菌的D-转氨酶和嗜热脂肪地芽孢杆菌(G.stearothermophilus)的D-转氨酶的元件。利用此种D-转氨酶产生R，R-莫纳甜(实施例19)。

实施例2也介绍了利用各种D-转氨酶生产R，R莫纳甜。

按照一些实施方式，该D-转氨酶对R-MP作为底物的特异性、活性或二者高于吲哚-3-丙酮酸。在其它一些实施方式中，该D-转氨酶对吲哚-3-丙酮酸作为底物的活性有限。可以从现有酶衍生或突变得到具有这些特性的酶，如实施例6所示。

另外，在一些实施方式中，D-氨基酸脱氢酶可促进R-MP形成R，R莫纳甜的反应。实施例20说明了利用D-氨基酸脱氢酶(D-AADH-101～108，生物催化公司(BioCatalytics))由R-MP生产R，R莫纳甜。还可进一步衍生这些D-氨基酸脱氢酶(例如通过诱变或重组工程)，以改进性能。

图2描述了靶向R，R莫纳甜生产的另一种方案。在图1的实施方式中，吲哚-3-丙酮酸形成R-MP的反应中所用的醛缩酶会影响形成的R，R∶S，R之比，但在图2的实施方式中，促进MP转变为莫纳甜的D-酶会影响形成的R，R∶S，R之比。按照图2的实施方式，可采用非立体特异性酶促进吲哚-3-丙酮酸转变为MP，因此可形成S-MP和R-MP。为了获得所需的R，R莫纳甜∶S，R莫纳甜比值，选择(或衍生出)相对于S-MP对R-MP有合适的离体选择性的D-酶。当需要以R，R形式莫纳甜作为其仅有的莫纳甜组分的莫纳甜组合物时，优选相对于S-MP至莫纳甜、选择性促进R-MP至莫纳甜的反应的酶。例如，嗜碱芽孢杆菌D-转氨酶(实施例18)和来自球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)和嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的结构元件的杂交D-转氨酶(实施例19)可用作选择性促进R-MP至莫纳甜的反应的酶。

图3介绍了产生富集R，R莫纳甜的组合物的另一种途径。图3途径是图1途径的修改形式。在图3所示的途径中，间接而非直接由L-色氨酸产生吲哚-3-丙酮酸。更具体说，将L-色氨酸转变为D-色氨酸，然后将D-色氨酸转变为吲哚-3-丙酮酸。实施例4介绍了用色氨酸消旋酶由L-色氨酸生产R，R莫纳甜。

可采用色氨酸消旋酶或其功能等同物促进L-色氨酸转变为D-色氨酸。实施例4提供了色氨酸消旋酶的可能来源和鉴定这种酶的筛选方法。实施例4描述了能够将L-色氨酸转变为D-色氨酸的色氨酸消旋酶的例子。可以进一步衍生这些色氨酸消旋酶(如通过诱变或重组工程)，以改进性能。

色氨酸消旋酶的非限制性例子包括氨基酸消旋酶(EC 5.1.1.-)的同源物或突变体，如丝氨酸消旋酶，其中所述同源物或突变体能够将L-色氨酸转变为D-色氨酸。产生氨基酸消旋酶的来源的非限制性例子包括微生物如鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、球形芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(嗜碱芽孢杆菌)、嗜热脂肪地芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccaroyces pombe)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermenti)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、嗜火产液菌(Aquifex pyrophilus)、乳杆菌(Lactobacilli)、链球菌(Streptococcus)、鱼腥藻(Anabaena sp.)、沟槽假单胞菌(Pseudomonas striata)、香菇(Lentinus edodes)、Scapharca brouhtonii、硫还原球菌(Desulfurococcus sp.)、热球菌(Thermococcus sp.)和沟槽假单胞菌。产生氨基酸消旋酶的来源的其它非限制性例子包括蚕、大鼠脑或小鼠脑。可衍生这些氨基酸消旋酶(如通过诱变或重组工程)，以改进其将L-色氨酸转变为D-色氨酸的性能。

产生合适色氨酸消旋酶的可能来源的非限制性例子包括：微生物，例如假单胞菌(Pseudomonas)，如绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis，Pseudomonasaurereofaciens，ATCC15926)和Burkholderia pyrrocina(ATCC15958)。产生合适色氨酸消旋酶的可能来源的其它非限制性例子包括：植物，例如烟草植株如烟草(Nicotiana tabacum)、小麦植株如小麦(Triticum aestivum)、甜菜、番茄和冬青叶硬木朔。

图3所示的途径具有某些优点，包括即使R，R莫纳甜是所需产物，也可将与产生莫纳甜作为产物的反应所用酶相同的酶用于产生吲哚-3-丙酮酸的反应。即，在图1所示的途径中，L-转氨酶(或合适的L-酶)能促进产生吲哚-3-丙酮酸的反应，但D-转氨酶能促进产生莫纳甜但反应。相反，在图3所示的途径中，促进产生吲哚-3-丙酮酸的反应的某些D-转氨酶也可促进产生莫纳甜的反应。因此，在图3所示的途径中，需要将与形成莫纳甜的反应所用酶相同的酶用于形成吲哚-3-丙酮酸的反应时，可优选广泛特异性D-转氨酶。相反，在图1、2、4、6、7和8的途径中，选择与R-MP相比，对吲哚-3-丙酮酸的活性和/或特异性有限的D-转氨酶时，莫纳甜的生产可能更有效。

图3所示途径的另一优点是产生吲哚-3-丙酮酸的反应的偶联反应的氨基酸产物现在可用作产生莫纳甜的反应的偶联反应的底物。即，在图1所示的途径中，L-色氨酸反应产生吲哚-3-丙酮酸，同时草酰乙酸、α-酮戊二酸和/或丙酮酸反应产生L-氨基酸。因为R-MP形成莫纳甜的反应与利用D-氨基酸作为底物的反应相偶联，形成吲哚-3-丙酮酸的反应的L-氨基酸在所示条件下不能循环用于R-MP反应的偶联反应。相反，在图3所示的途径中，D-色氨酸形成吲哚-3-丙酮酸的反应偶联于形成D-氨基酸产物的反应，此D-氨基酸可循环用于R-MP反应的偶联反应。这允许将非化学计量量的氨基接受体用于步骤1，在步骤1中产生用于步骤3的氨基供体。

图4和5说明了图1所示途径的其它修饰形式。这些修饰涉及将L-色氨酸转氨反应偶联反应形成的氨基酸产物循环为MP至莫纳甜反应的偶联反应的氨基酸反应物。

转到图4，通过提供可促进L-氨基酸转变为D-氨基酸(反之亦然)的酶进行循环。更具体说，如图4所示，L-色氨酸反应形成吲哚-3-丙酮酸时α-KG反应形成L-谷氨酸，可提供可促进L-谷氨酸转变为D-谷氨酸(反之亦然)的谷氨酸消旋酶(EC 5.1.1.3)或功能等同物。在这种情况下，通过将其转变为D-谷氨酸，接着L-谷氨酸转化形成的D-谷氨酸可用作MP至莫纳甜反应的偶联反应的底物，从而部分去除了随着吲哚-3-丙酮酸的生产作为产物形成的L-谷氨酸。相似地，D-谷氨酸反应中形成的α-KG可用作L-色氨酸至吲哚-3-丙酮酸反应的偶联反应的底物。

可产生谷氨酸消旋酶的可能来源的非限制性例子包括戊糖片球菌、短小芽孢杆菌、发酵乳杆菌、短乳杆菌、大肠杆菌、嗜火产液菌和枯草芽孢杆菌。更具体说(也是非限制性)，可由核酸如戊糖片球菌murI基因(Genbank登录号L22789)或短乳杆菌谷氨酸消旋酶表达谷氨酸消旋酶。

L-色氨酸反应形成吲哚-3-丙酮酸时草酰乙酸反应形成L-天冬氨酸，此时可提供天冬氨酸消旋酶(EC 5.1.1.13)或功能等同物以将L-天冬氨酸转变为D-天冬氨酸。在这种情况下，通过将产生吲哚-3-丙酮酸的同一反应中形成的L-天冬氨酸转变为D-天冬氨酸，从而部分去除L-天冬氨酸，接着D-天冬氨酸可用作MP至莫纳甜反应的偶联反应的底物。相似地，D-天冬氨酸反应中形成的草酰乙酸可用作L-色氨酸至吲哚-3-丙酮酸反应的偶联反应的底物。

具有天冬氨酸消旋酶活性的合适酶的非限制性例子包括ASPR-101(生物催化公司(BioCatalytics，Inc.)，129N.Hill Ave，Suite 103，Pasadena，CA 91106-1955)和能够促进L-天冬氨酸转变为D-天冬氨酸的氨基酸消旋酶(EC 5.1.1.-)的同源物或突变体。

天冬氨酸消旋酶的可能来源的非限制性例子包括：脱硫球菌(Desulfurococcus)、热球菌(Thermococcus)、双壳软体动物Scapharca brouhtonii、不动杆菌(Acinetobacter)、土壤杆菌(Agrobacterium)、古生球菌(Archaeoglobus)、芽孢杆菌(Bacillus)、博德特菌(Bordetella)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、短杆菌(Brevibacterium)、伯克霍尔德菌(Burkholderia)、弯曲杆菌(Campylobacter)、假丝酵母(Candida)、柄杆菌(Caulobacter)、梭菌(Clostridium)、脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium)、Desulfotalea、肠球菌(Enterococcus)、欧文菌(Erwinia)、埃希菌(Escherichia)、铁原体(Ferroplasma)、螺杆菌(Helicobacter)、克雷伯菌(Klebsiella)、乳杆菌(Lactobacillus)、曼海姆菌(Mannheimia)、苜蓿(Medicago)、中生根瘤菌(Mesorhizobium)、甲烷球菌(Methanococcus)、甲烷八叠球菌(Methanosarcina)、海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)、酒球菌(Oenococcus)、片球菌(Pediococcus)、极地杆菌(Polaribacter)、假单胞菌(Pseudomonas)、火球菌(Pyrococcus)、Ralsonia、志贺菌(Shigella)、根瘤菌(Sinorhizobium)、沙门菌(Salmonella)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、链球菌(Streptococcus)、嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter)、弧菌(Vibrio)、沃廉菌(Wolinella)、黄单胞菌(Xanthomonas)、黄杆菌(Xanthobacter)、耶尔森菌(Yersinia)和发酵单胞菌(Zymomonas)。

L-色氨酸反应形成吲哚-3-丙酮酸时丙酮酸反应形成L-丙氨酸，此时可提供丙氨酸消旋酶或功能等同物以将L-丙氨酸转变为D-丙氨酸。在这种情况下，通过转变为D-丙氨酸，接着将L-丙氨酸转变形成的D-丙氨酸用作MP至莫纳甜反应的偶联反应的底物去除在产生吲哚-3-丙酮酸的同一反应中形成的L-丙氨酸。相似地，D-丙氨酸反应中形成的丙酮酸可用作L-色氨酸至吲哚-3-丙酮酸反应的偶联反应的底物。

合适的丙氨酸消旋酶的非限制性例子包括A8936(西格马公司(Sigma)，PO Box14508，St.Louis，MO，63178)和嗜热脂肪地芽孢杆菌丙氨酸消旋酶，如实施例4所述。

产生丙氨酸消旋酶的可能来源的非限制性例子包括：流产布氏杆菌(Brucellaabortus)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、霍乱弧菌、粟酒裂殖酵母、蜡状芽孢杆菌和香菇。

实施例9和12显示了上述消旋酶的应用，它们对提高所需莫纳甜产物的比例的影响，并提供了消旋酶的可能来源。

转到图5，用立体反转性转氨酶促进R-MP至莫纳甜的反应。虽然一般将R-MP(或S-MP)形成R，R莫纳甜(或S，R莫纳甜)的反应偶联于D-氨基酸的反应，但立体反转性转氨酶可用L-氨基酸促进R-MP(或S-MP)的偶联反应以形成R，R莫纳甜(或S，R莫纳甜)。以此方式，L-色氨酸转氨酶反应的L-氨基酸产物可用作MP至莫纳甜的转氨反应的底物，MP至莫纳甜反应的偶联反应的产物(即草酰乙酸、丙酮酸和/或α-KG)可用作L-色氨酸至吲哚-3-丙酮酸反应的偶联反应的原料。可以采用的立体反转性转氨酶的非限制性例子包括衍生自D-苯基甘氨酸转氨酶(EC 2.6.1.72，也称为D-4-羟基苯基甘氨酸转氨酶)、D-甲硫氨酸转氨酶(EC 2.6.1.41，也称为D-met-转氨酶和D-甲硫氨酸-丙酮酸转氨酶)和其同源物的突变体。产生D-苯基甘氨酸转氨酶的突变体的可能来源的非限制性例子包括假单胞菌，如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)LW-4和斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)ST-201。产生D-甲硫氨酸转氨酶的可能来源的非限制性例子包括花椰菜和花生。

实施例10和11一起提供了立体反转性酶的可能来源和制备这类酶的方法。这些实施例也提供了鉴定这类酶的筛选方法。也考虑到，这类酶可衍生自自然界中已知或发现的立体反转性酶。作为一个非限制性例子，立体反转性转氨酶可以是D-氨基酸转氨酶的同源物或突变体或者氨基酸消旋酶(EC 5.1.1.-)的同源物或突变体。

图6和7也说明了图1途径的修改形式。图6和7所示的途径提供了通过用不可逆反应去除色氨酸反应的副产物并且在一些情况下提供MP反应的底物，来推动反应平衡前进(即向莫纳甜生产方向)的方法。

转向图6，所示途径通过将L氨基酸产物转变为不同的L-氨基酸和CO₂去除了色氨酸反应偶联反应的L-氨基酸产物，然后通过将新形成的L-氨基酸转变为D-氨基酸提供了MP反应的偶联反应的底物。具体说，L-色氨酸能与草酰乙酸并行反应，形成吲哚-3-丙酮酸和L-天冬氨酸。采用天冬氨酸4-脱羧酶(EC 4.1.1.12)或功能等同物促进L-天冬氨酸转变为L-丙氨酸和二氧化碳，采用具有丙氨酸消旋酶活性的酶促进L-丙氨酸转变为D-丙氨酸，该D-丙氨酸可用作R-MP转变为莫纳甜的氨基供体。

转向图7，所示途径说明了去除色氨酸反应的偶联反应的L-氨基酸产物的其它方法。图中所示的实施方式产生不可用于逆向反应，例如由于挥发性(如二氧化碳)或自发转变为不反应的终产物的副产物。这类方法的例子包括α-KG与L-色氨酸并行反应产生L-谷氨酸的实施方式，如果需要，可提供谷氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.15)或功能等同物以促进L-谷氨酸转变为4-氨基丁酸(二氧化碳为副产物)。产生L-谷氨酸脱羧酶的潜在来源的非限制性例子包括：产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、韦氏梭菌(C.welchii)或大肠杆菌。

推动色氨酸反应前进(产生莫纳甜的方向)的这类方法的另一个例子包括在利用L-色氨酸的反应中将草酰乙酸用作共同底物和草酰乙酸转变为L-天冬氨酸的反应；如果需要，可提供天冬氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.11)或功能等同物以促进L-天冬氨酸转变为β-丙氨酸(以二氧化碳作为副产物)。

转向图8，所示途径介绍了将色氨酸反应偶联反应的L-氨基酸产物转变为MP反应偶联反应的底物的其它方法。具体说，将α-KG用于与L-色氨酸相同的反应中时，其中可提供α-KG形成L-谷氨酸、具有L-丙氨酸转氨酶活性的酶和丙酮酸，其中L-丙氨酸转氨酶能促进丙酮酸和L-谷氨酸反应形成L-丙氨酸。也可提供丙氨酸消旋酶或功能等同物以促进L-丙氨酸转变为D-丙氨酸，该D-丙氨酸可与MP一起用作底物，形成莫纳甜和丙酮酸。参见实施例12。

上述生物合成途径和下述实施例的反应中暗示出含有产生莫纳甜，包括R，R莫纳甜或莫纳甜前体(包括R莫纳甜前体)的生物合成途径中需要的一种或多种化合物和/或酶的混合物。

在体外生产中，本文所述的任何或全部生物合成途径或者本文所述途径的单个步骤可在体外溶液或体内宿主细胞中连续或平行进行。当本发明方法利用体外进行的一种或多种反应时，可通过混合于水性反应介质或溶液中合并反应的所需成分，从而进行体外进行的生物合成反应。使如此形成的反应混合物保持一段时间，以便合成足够的所需产物。

此外，可通过在一种或多种酶的纯化中连续使用辅因子提高一种或多种酶的活性。例如，纯化球形芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶时包含吡哆醛-5’-磷酸导致活性提高(实施例14)。

当本发明途径中的一个或多个反应需要在体外进行时，用于本文所述生物合成途径中的任何或所有酶可任选地固定在固体支持物上。这类固体支持物的例子包括含有环氧物、醛、螯合物或伯胺基团的支持物。合适固体支持物的具体例子包括但不限于：EupergitC(罗门哈斯公司(Rohm and Haas Company)，Philadelphia，PA)树脂珠和SEPABEADS

EC-EP(Resindion)。实施例21说明了将球形芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶固定于Eupergit

C树脂珠上。实施例22说明了将苜蓿根瘤菌ProA醛缩酶固定于Eupergit

C树脂珠上。实施例23显示了利用这些固定酶生产R，R莫纳甜。

可用一种酶或同时作用的多种酶的混合物促进(催化)本文所述生物合成途径中所示的单个反应。

可采用本发明方法制备含有所需百分数的R，R-莫纳甜或最小所需百分数的R，R-莫纳甜的莫纳甜组合物。除上述反应步骤外，可用一种以上酶，例如酶混合物催化具体反应步骤，以使得到的组合物或制剂含有所需百分数的R，R-莫纳甜，包括例如，最小所需百分数的R，R-莫纳甜，或最大所需百分数的R，R-莫纳甜。或者，可混合本发明方法中两种不同的工程途径制备的莫纳甜，以产生含有所需百分数的R，R-莫纳甜的组合物或制剂。

当指定类别的酶用作例子时，预计具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％同源性的酶也可用于该反应。例如，与SEQ ID NO：22的醛缩酶的同源性为至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的R-特异性醛缩酶可用于任何上述途径，以产生R，R莫纳甜。

此外，当指定类别的酶用作例子时，预计具有相同活性的该酶的片段也可用于该反应。例如，也用作醛缩酶的SEQ ID NO：22的醛缩酶的片段可用于任何上述途径，以产生R，R莫纳甜。

利用本文所述的一种或多种多肽或生物合成途径产生的莫纳甜通常含有至少约0.5-30％R，R-莫纳甜(以产生的总莫纳甜重量计)。在其它实施方式中，利用本文所述的一种或多种多肽或生物合成途径产生的莫纳甜中含有大于30％R，R-莫纳甜(以产生的总莫纳甜重量计)；例如，R，R-莫纳甜占所产生的总莫纳甜的40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。或者，可合并不同量的两种或多种莫纳甜制剂，以得到含有所需百分数的R，R-莫纳甜的制剂。例如，含30％R，R-莫纳甜的莫纳甜制剂可与含90％R，R-莫纳甜的莫纳甜制剂混合；如果混合相同量的30％和90％R，R-莫纳甜制剂，得到的莫纳甜制剂含60％R，R-莫纳甜。

可由反应成分中纯化利用本文所述的一种或多种多肽或生物合成途径产生的莫纳甜或中间体(包括莫纳甜前体)。在一个实施方式中，可仅通过去除需要从合成它的酶制剂中纯化的物质，来纯化莫纳甜或中间体如莫纳甜前体。

在其它实施方式中，由合成它的制剂纯化所述中间体、莫纳甜前体或莫纳甜，以使得到的″纯化″组合物或制剂含有至少约5-60％莫纳甜(以有机物总重计)。在另一实施方式中，以有机物总重计，可将所述莫纳甜或中间体如莫纳甜前体纯化至至少约70％、80％、90％、95％或99％的纯度。

可用本领域普通技术人员已知的任何方法由反应组分中纯化利用本文所述的一种或多种多肽或生物合成途径产生的莫纳甜或中间体(包括莫纳甜前体)。在一个实施方式中，可如实施例13所述纯化莫纳甜或中间体。最好，可重复再结晶纯化的莫纳甜或中间体，直到达到所需纯度。

实施例

实施例1

检测莫纳甜、色氨酸、丙氨酸和谷氨酸

本实施例描述了用于检测莫纳甜、色氨酸和谷氨酸的存在的方法。也描述了用于分离和检测莫纳甜的四种立体异构体的方法。

莫纳甜和色氨酸的LC/MS/MS多反应监测(″MRM″)分析

利用Waters/Micromass液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)设备分析获自体外或体内生化反应的莫纳甜和色氨酸，这套设备包括装有连续布置于色谱和MicromassQuattro Ultima三重四极质谱仪之间的Waters 996光电二极管阵列(PDA)吸光度监测器的Waters 2795液相色谱。利用Xterra MS C₈反相色谱柱2.1mm×250mm于40℃进行LC分离。LC流动相由A)含有0.05％(v/v)三氟乙酸的水和B)含有0.05％(v/v)三氟乙酸的甲醇组成。

梯度洗脱在5％B-35％B、0-4分钟呈线性，在35％B-60％B、4-6.5分钟呈线性，在60％B-90％B、6.5-7分钟呈线性，在90％B、7-11分钟等强度(isocratic)，在90％B-95％B、11-12分钟呈线性，在95％B-5％B、12-13分钟呈线性，每次运行之间有2分钟重平衡期。流速为0.25mL/分钟，在200nm-400nm监测PDA吸光度。根据感兴趣分析物的质子化分子离子([M+H]⁺)的生成和特征性片段离子的产生对 ESI-MS所有参数进行优化和选择。使用下列设备参数对莫纳甜和色氨酸进行LC/MS/MS多反应监测(MRM)分析：毛细管电压：3.5kV；锥电压：40V；Hex 1：20V；孔电压(Aperture)：0V；Hex 2：0V；源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；锥气体：50L/h；低质量分辨(Q1)：12.0；高质量分辨(Q1)：12.0；离子能量：0.2；入口电压：-5V；碰撞能量：8；出口电压：1V；低质量分辨(Q2)：15；高质量分辨(Q2)：15；离子能量(Q2)：3.5；倍增器：650。用五种莫纳甜特异性母-子MRM转变特异性检测体外和体内反应中的莫纳甜。所监测的转变为：293.1-158.3、293.1-168.2、293.1-211.2、293.1-230.2和293.1-257.2。用MRM转变204.7-146.4来监测色氨酸。在莫纳甜和色氨酸的内标定量中，分析了含有四种不同比例的各分析物与d5-色氨酸和d5-莫纳甜的四种校正标准品。对这些数据进行线性最小平方法分析，以形成莫纳甜和色氨酸的校正曲线。向各样品中加入固定量的d5-色氨酸和d5-莫纳甜(按照WO03/091396 A2的方法由d5-色氨酸合成d5-莫纳甜)，将应答比率(莫纳甜/d5-莫纳甜；色氨酸/d5-色氨酸)与上述校正曲线联合使用，以计算混合物中各分析物的含量。

准确测定莫纳甜的质量。

用应用生物系统公司(Applied Biosystems)-Perkin Elmer Q-Star杂合四极/飞行时间质谱仪进行高分辨率MS分析。使用色氨酸作为内部质量校准标准，测量质子化莫纳甜的质量。在C₁₄H₁₇N₂O₅元素组成的基础上，质子化莫纳甜的计算质量是293.1137。用实施例2和3描述的生物催化法制得的莫纳甜的测量质量为293.1144。此质量测量误差小于每百万分二(2ppm)，确证了酶法生成莫纳甜的元素组成。

莫纳甜的手性LC/MS/MS(″MRM″)测定

通过用1-氟-2-4-二硝基苯基-5-L-丙氨酸酰胺(″FDAA″)衍生，然后进行反相LC/MS/MS MRM测量来测定莫纳甜在体外和体内反应中的立体异构体分布。

用FDAA衍生莫纳甜

向50μL样品或标准品中加入200μL 1％FDAA的丙酮溶液。加入40μL 1.0M碳酸氢钠，40℃培育该混合物1小时，其间偶然混合。取出该样品并冷却，用20μL2.0M HCl中和(可能需要更多HCl以中和缓冲的生物混合物)。脱气完成后，样品即可用于LC/MS/MS分析。

LC/MS/MS多反应监测，以测定莫纳甜在体外和体内反应中的立体异构体分布。

用上述LC/MS/MS设备进行分析。用Phenomenex Luna 2.0×250mm(3μm)C18 反相色谱柱于40℃进行能够分离莫纳甜的所有四种立体异构体(特别是FDAA-莫纳甜)的LC分离。LC流动相由A)含有0.05％(质量/体积)醋酸铵的水和B)乙腈组成。洗脱在13％B、0-2分钟等强度，在13％B-30％B、2-15分钟呈线性，在30％B-80％B、15-16分钟呈线性，在80％B 16-21分钟等强度，在80％B-13％B、21-22分钟呈线性，每次运行之间有8分钟重平衡期。流速为0.23mL/分钟，在200nm-400nm监测PDA吸光度。根据FDAA-莫纳甜的去质子化分子离子([M-H]⁺)的生成和特征性片段离子的产生对ESI-MS所有参数进行优化和选择。

使用下列设备参数以阴离子ESI/MS模式对莫纳甜进行LC/MS分析：毛细管电压：2.0kV；锥电压：25V；Hex 1：10V；孔电压：0V；Hex 2：0V；源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；锥气体：50L/h；低质量分辨(Q1)：12.0；高质量分辨(Q1)：12.0；离子能量：0.2；入口电压：-5V；碰撞能量：20；出口电压：1V；低质量分辨(Q2)：12；高质量分辨(Q2)：12；离子能量(Q2)：3.0；倍增器：650。用三种FDAA-莫纳甜特异性母-子转变特异性检测体外和体内反应中的FDAA-莫纳甜。转变为：543.6-268.2、543.6-499.2和543.6-525.2。根据相对于纯化的合成莫纳甜立体异构体的色谱保留时间和质谱数据鉴定FDAA-莫纳甜立体异构体。

氨基酸，包括谷氨酸和丙氨酸的液相色谱-柱后荧光检测

在Waters 2690LC系统或与Waters 474扫描荧光检测器联用的等同物和Waters柱后反应模块上进行液相色谱-柱后荧光检测，以测定体外和体内反应中的谷氨酸。用相互作用-钠加载离子交换柱于60℃进行LC分离。流动相A是Pickering Na 328缓冲液(皮克实验室公司(Pickering Laboratories，Inc.)；Mountain View，CA)。流动相B是Pickering Na 740缓冲液。梯度洗脱为0％B-100％B、0-20分钟，100％B、20-36分钟等强度，在100％B-0％B、36-37分钟呈线性，每次运行之间至少有8分钟重平衡期，这取决于样品基质。流动相的流速是0.5mL/分钟。OPA柱后衍生溶液的流速是0.5mL/分钟。荧光检测器设定为EX 338nm和Em 425nm。正亮氨酸用作分析内标。根据纯化标准品的色谱保留时间数据鉴定氨基酸。

用LC/MS/MS检测L-和D-氨基酸

含有来自生化反应实验的L-和D-氨基酸如色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的混合物的样品首先用甲酸处理，以使蛋白质变性。然后离心样品，通过0.45μm尼龙注射器滤器过滤，然后进行LC/MS/MS分析。根据保留时间和质量选择检测鉴定L-和D-氨基酸。用Waters 2690液相色谱系统和柱温设定为45℃的ASTEC 2.1mm×250mm Chirobiotic TAG色谱柱进行LC分离。LC流动相A和B分别是0.25％乙酸和0.25％乙酸的甲醇溶液。分离谷氨酸时，用60％流动相A和40％B进行等强度洗脱，流速为0.25ml/分钟；而分离天冬氨酸和色氨酸使，用30％流动相A和70％B洗脱，流速为0.3ml/分钟。

分析L-和D-氨基酸的检测系统包括Waters 996光电二极管阵列(PDA)检测器和Micromass Quattro Ultima三重四极质谱仪。将扫描195-350nm的PDA连续安置在色谱系统和质谱仪之间。以正电喷雾离子化模式(+ESI)运行的Micromass Quattro Ultima三重四极质谱仪的参数设定如下：毛细管电压：3.0kV；锥电压：20V；Hex 1：15V；孔电压：1V；Hex 2：0V；源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：530L/h；锥气体：30L/h；低质量Q1分辨：12.5；高质量Q1分辨：12.5；离子能量1：0.2；入口电压：-5；碰撞能量：8；出口1：10；低质量Q2分辨：12.5；高质量Q2分辨：12.5；离子能量2：0.5；倍增器：650V。建立带有多反应监测(MRM)模式的MS/MS实验，以选择性监测以下反应转变：204.70-146.50、147.8-84.2、147.8-102.1、134.00-74.30和134.00-88.2。色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的定量分别基于m/z＝146.5、m/z＝102.1和m/z＝88.2的信号应答。

生产用作标准品和用于测定的莫纳甜和莫纳甜前体(″MP″)

生产莫纳甜

如美国专利号5,128,482所述用合成方法生产R，R和S，S莫纳甜的外消旋混合物。

通过衍生和水解步骤分离R，R和S，S莫纳甜。简言之，酯化莫纳甜外消旋混合物，用Cbz封闭游离氨基，形成内酯，用固定的蛋白酶选择性水解S，S内酯。也可如Bassoli，A.等，Eur.J.Org.Chem.，8：1652-1658(2005)所述分离莫纳甜。

MP生产

采用0.1M磷酸钾缓冲液中的AT-103广泛D-转氨酶(生物催化公司(BioCatalytics))、以丙酮酸钠作为氨基接受体对R，R莫纳甜进行转氨反应，从而产生R-MP。采用0.1M磷酸钾缓冲液中的AT-102L-转氨酶(生物催化公司)、以丙酮酸钠作为氨基接受体对S，S莫纳甜进行转氨反应，从而产生S-MP。这两个反应都在30℃、pH约8.0-8.3的条件下进行约20小时。用装有罗门哈斯公司(Rohm and Haas，Philadelphia，PA)疏水性树脂(XAD^TM1600)、以水洗脱的制备级HPLC纯化这两种化合物。收集含有纯度大于90％的莫纳甜前体的样品并冻干。

实施例2

由吲哚-3-丙酮酸生产莫纳甜

AT-103转氨酶为购自生物催化公司(BioCatalytics)(Pasadena，CA)的转氨酶库的一部分，在使用来自睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶的偶联反应中测试AT-103转氨酶用于莫纳甜的生产。如WO 03/091396 A2所述制备醛缩酶。AT-103为来自需要D-氨基酸(如D-谷氨酸、D-天冬氨酸或D-丙氨酸)作为氨基酸供体的芽孢杆菌的广泛特异性D-转氨酶(EC 2.6.1.21)。直接将酶和其它成/底物加入试剂盒所提供的反应缓冲液中，反应缓冲液包含100mM磷酸钾缓冲液pH 7.5、100mM氨基供体和0.1mM吡哆醛-5’-磷酸盐(“PLP”)。在1mL反应缓冲液中加入：4mg吲哚-3-丙酮酸、20mg丙酮酸、约50μg提供在细胞提取物中的ProA、1μL 2M MgCl₂和2mg转氨酶。一式两份的进行酶反应。反应于30℃温和振荡培育过夜(100rpm)。过滤样品并如实施例一中所述进行反向LC/MS/MS分析。结果显示利用AT-103酶产生约370μg/mL莫纳。以色谱分离中所解析的两个立体异构体库的峰面积为基础，进一步分析结果以检测S，R/R，S与R，R/S，S莫纳甜的比例。在AT-103生产的总莫纳甜中，与混合的异构体相比，69％为R，R/S，S莫纳甜。该酶与WO 03/091396 A2所述对D-氨基酸具有广泛特异性的枯草芽孢杆菌DA酶同源。利用实施例1中所述FDAA方法学进行手性分析，验证如预期一样，D-转氨酶主要产生R，R莫纳甜和一些S，R莫纳甜。进一步利用S，S莫纳甜或R，R莫纳甜和α-酮戊二酸作为底物的转氨作用实验验证生物催化公司的酶如期望一样对碳4位的D-构型具有高度选择性。在这些实验中，在以S，S莫纳甜和α-酮戊二酸作为底物的反应中未检测到谷氨酸。

在AT-103(广泛D-转氨酶)和ProA醛缩酶的偶联反应中，为减少所产生副产物S，S莫纳甜或R，S莫纳甜的量，按照制造商操作方法(Novagen，威斯康星州麦迪逊)利用His-Bind亲和柱(cartridge)纯化醛缩酶。纯化的酶优选不应包含可出现于细胞提取物中(如天然大肠杆菌AspC或TyrB活性)的野生型L-转氨酶活性。用PD-10柱(G25Sephadex，安法玛西亚生物技术公司(Amersham-Pharmacia))使His-Bind洗脱液脱盐以去除咪唑，并用50mM Tris-Cl，pH 7洗脱。以一式两份1ml体积进行实验，含有100mM pH 7.8 Tris-Cl缓冲液、50μg ProA醛缩酶、4mg吲哚-3-丙酮酸、1或2mgD-转氨酶、200mM丙酮酸钠、2mM MgCl₂、3mM磷酸钾、0.1mM PLP和14.7mgD-谷氨酸。将试管于30℃温和振荡培育。取两小时时间点的样品并立即冷冻于-20℃。两小时时，用NaOH将pH由5调至7-8，将实验培育过夜。过滤样品，并按实施例1中所述分析莫纳甜。也许因为pH过低，两小时样品未包含可探测量的莫纳甜。当使用1mg D-转氨酶时，过夜样品包含约190ng/mL莫纳甜，其中约84％为R，R莫纳甜，16％为S，R莫纳甜。当使用2mg D-转氨酶时，产生约540ng/mL莫纳甜，其中约71％为R，R莫纳甜，16％为S，R莫纳甜。

类似实验可采用生物催化公司(Biocatalytics)的转氨酶缓冲液进行，该缓冲液含100mM磷酸钾pH 7.5、0.1mM PLP和100mM D-谷氨酸，如上所述加入固体吲哚-3-丙酮酸和D-转氨酶。加入来自储存液的ProA醛缩酶(50μg)、MgCl₂和50mM丙酮酸。如上述方法进行实验，但无需调整pH值。阴性对照为不含莫纳甜的生物催化公司提供的酶和缓冲液。结果如表1所示。

表1：磷酸盐缓冲液中来自吲哚-3-丙酮酸的莫纳甜产量

Mg D-转氨酶	时间(小时)	总莫纳甜(ng/mL)	R，R百分数
				0	2	0	n/a
1	2	6780	未检测
				2	2	13170	55％
0	16	0	n/a
				1	16	15000	未检测
2	16	28930	51％

磷酸盐缓冲液中莫纳甜的产量明显高于Tris缓冲液中的产量。

进行进一步试验，以比较来自WO 03/091396 A2中克隆的枯草芽孢杆菌DAT的活性与生物催化公司的酶(AT-103)的活性。枯草芽孢杆菌dat基因也被亚克隆入pET30a以去除His-6标签。如WO 03/091396 A2所述在BL21(DE3)中生产未标记和标记的酶。如前所述制备细胞提取物并采用总蛋白测定以评估蛋白浓度。进行一式两份的1ml反应，其中含有500μg D-转氨酶、50μg ProA醛缩酶、100mM磷酸钾pH 7.5、3mM MgCl₂、4mg吲哚-3-丙酮酸、200mM丙酮酸钠、7.35mg(50mM)D-谷氨酸和0.1mM PLP。样品于30℃培育1小时、2小时和过夜，过滤后用于LC/MS/MS分析。如实施例1所述用FDAA衍生方法测定，样品中仅含S，R和R，R莫纳甜立体异构体。结果总结于下表2。用反相色谱分离的峰面积测定％RR。

表2：D-转氨酶的比较

酶	时间(小时)	莫纳甜(ppb)	RR莫纳甜百分数
				枯草芽孢杆菌DAT-HIS	1	512	未测定
未标记的枯草芽孢杆菌DAT	1	1056	未测定
				生物催化公司AT-103	1	2353	未测定
枯草芽孢杆菌DAT-HIS	2	894	～80-90％
				未标记的枯草芽孢杆菌DAT	2	1913	～80％
生物催化公司AT-103	2	6887	92.5％
				枯草芽孢杆菌DAT-HIS	16	3014	31
未标记的枯草芽孢杆菌DAT	16	5612	33
				生物催化公司AT-103	16	16131	66

去除HIS-6标签似乎提高了枯草芽孢杆菌D-转氨酶的活性；然而，生物催化公司的D-转氨酶同系物明显具有最高的活性。它也显示出对R-莫纳甜前体的底物偏好性更高。增加培育时间似乎减少了产生的对映异构体过量的R，R莫纳甜。

因为芽孢杆菌D-转氨酶优选用丙酮酸作为氨基接受体而用D-丙氨酸作为氨基供体，所以预计可利用D-丙氨酸作为氨基供体将MP转变为莫纳甜，得到类似或者更好的结果。进行一式两份的1ml反应，其中包含500μg D-转氨酶、50μg纯化ProA醛缩酶、100mM磷酸钾pH 7.5、3mM MgCl₂、4mg吲哚-3-丙酮酸、100mM丙酮酸钠、25mM D-谷氨酸或D-丙氨酸和0.1mM PLP。培育样品2小时，如上所述进行处理，然后进行分析。当D-丙氨酸作为氨基供体时，不出所料，产生稍高水平的莫纳甜(23:21ppm)。此外，预计高浓度的丙酮酸能够抑制转氨步骤，因此逐渐加入更少量的丙酮酸可提高莫纳甜生产的总速率。由上述数据可知，尽管在这种情况下只使用上表中一半量的丙酮酸，但产生的莫纳甜明显更多。尽管文献报道ProA醛缩酶主要产生醇醛缩合产物的S-对映异构体，但本研究中使用的ProA醛缩酶明显生产高百分数的R-MP，在偶联实验中产生高达92％的R，R莫纳甜。高百分数的R，R莫纳甜并非由于D-转氨酶的选择性产生，如实施例19所示。

实施例3

由D-色氨酸生产R，R莫纳甜

在每1mL反应混合物中加入：约60μg睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶(如WO03/091396 A2所述，在细胞提取物中提供)、4mM MgCl₂、50mM D-色氨酸、0.5mg生物催化公司的D-转氨酶(AT-103)、100mM丙酮酸钠、100mM磷酸钾缓冲液pH 7.5或100mM乙酸钠缓冲液pH 8、0.05mM PLP、3mM磷酸钾(仅对醋酸反应)和10mMα-酮戊二酸。一式两份进行实验，以未加醛缩酶的反应作为阴性对照。样品于30℃温和振荡培育过夜(20小时)。乙酸钠样品的实际pH约为5，磷酸盐缓冲液的最终pH约为7。pH5时，无醛缩酶显示出显著活性；包含ProA醛缩酶的样品略高于阴性对照但可能不高于实验误差。磷酸钾中，ProA醛缩酶产生73.4ppm莫纳甜，其中R，R∶S，R为1.7∶1(～63％R，R来自D-色氨酸)。

因为芽孢杆菌D-转氨酶优选用丙酮酸作为氨基接受体和用D-丙氨酸作为氨基供体，预计由D-色氨酸生产R，R或S，R莫纳甜时无需加入α-酮戊二酸。利用纯化ProA醛缩酶(50-60μg)并培育2.5小时重复上述实验(在100mM磷酸钾缓冲液中)。一式两份进行含有或不含α-酮戊二酸的实验。加入10mMα-酮戊二酸时，用D-色氨酸作为底物形成56.1ppm莫纳甜(79.5％R，R，20.5％S，R)。省去α-酮戊二酸时，形成102.5ppm莫纳甜(79％R，R，21％S，R)。

比较来自苜蓿根瘤菌、睾丸酮丛毛单胞菌的HMG醛缩酶和SEQ ID NO：22的醛缩酶的总莫纳甜产量及异构体分布。

AT-103转氨酶(广泛特异性D-转氨酶)购自生物催化公司(Pasadena，CA)，该酶或实施例18中生产的球形芽孢杆菌重组酶用于与HMG醛缩酶偶联反应由D-色氨酸和丙酮酸产生莫纳甜，如U.S.公开申请号2005282260所述。

根据美国公开号20040063175和WO 03091396 A2所述从睾丸酮丛毛单胞菌(ProA)和苜蓿根瘤菌制备并纯化HMG醛缩酶。为生产可检测量的SEQ ID NO：22醛缩酶，在含氨苄青霉素(100μg/mL)的Luria-Bertani(″LB″)培养基中培养50毫升培养物，至OD₆₀₀约为0.5。用200μg/mL脱水四环素诱导含有SEQ ID NO：21构建物的菌株。诱导后，细胞生长5小时，根据生产商方法制备细胞提取物(诺华基公司，Bugbuster试剂)。加入Benzonuclease和蛋白酶抑制剂。利用伯乐实验室公司(BioRadLaboratories)Experion自动化电泳工作站分离细胞提取物中可溶性蛋白，并利用Experion软件1.1.98.0版本分析表达百分数。醛缩酶SEQ ID NO：22作为粗酶(未纯化)用于下列反应。

每1毫升反应混合物中加入：约50μg醛缩酶、4mM MgCl₂、50mM D-色氨酸、0.5mg纯化球形芽孢杆菌D-转氨酶、200mM丙酮酸钠、100mM磷酸钾缓冲液pH 7.5和0.05mM PLP。一式两份进行实验，以未加入醛缩酶的反应作为阴性对照。样品于30℃温和振荡培育1小时和过夜(18小时)。过夜反应中没有醛缩酶时产生少量莫纳甜(＜0.5ppm)，因为镁和磷酸盐能催化无酶反应。从下列数字中减去这些数值，显示平均值。用该方法生产莫纳甜时检测到的仅有的立体异构体为R，R和S，R。通过反向LC峰面积检测的R，R百分数显示如下：

表3：由D-色氨酸产生的总莫纳甜和R，R百分数

酶(时间点)	总莫纳甜(ppm)	R，R莫纳甜百分数
			睾丸酮丛毛单胞菌ProA(1小时)	16.63	86.45
睾丸酮丛毛单胞菌ProA(18小时)	86.86	63.1
			苜蓿根瘤菌HMG(1小时)	20.5	96.7
苜蓿根瘤菌HMG(18小时)	88.3	89.9
			SEQ ID NO：22(1小时)	14.70	100
SEQ ID NO：22(18小时)	95.14	97.35

同样用实施例1中所列FDAA衍生方法分析SEQ ID NO：22醛缩酶的18小时样品中立体异构体分布，结果为94.9％R，R和5.1％S，R莫纳甜。与睾丸酮丛毛单胞菌和苜蓿根瘤菌HMG醛缩酶相比，SEQ ID NO：22醛缩酶对生产R-MP具有更高的对映异构体特异性。

用L-色氨酸作为起始底物并将醛缩酶与按美国公开申请号2005282260所述生产和纯化的HexAspC广泛特异性L-转氨酶偶联，进行同样的平行实验。该反应主要产生S，S莫纳甜和R，S莫纳甜。该反应中同样补充10mMα-酮戊二酸作为L-色氨酸转氨作用的氨基接受体。求一式两份的结果的平均值，得到总莫纳甜(减去无醛缩酶存在时的背景水平)，基于反相LC峰面积得到S，S莫纳甜百分数。某些情况下，因为醛缩酶的R特异性相当高并产生少量总莫纳甜，所以利用反向估算立体异构体分布不够准确，因为某些色氨酸峰拖尾(tailing)会与S，S/R，R莫纳甜峰共同洗脱出来。在比较醛缩酶的R-特异性时，趋势仍能提供信息。利用FDAA衍生方法对几个样品进一步分析所得的结果显示于圆括号中并且更加准确。总莫纳甜数值在约400ppm以上，高于用于定量结果的标准品比例的线性范围，因此为定性结果。如美国公开申请号2005282260所描述，睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶通常生产95-100％S，S莫纳甜。

表4：由L-色氨酸产生的总莫纳甜和S，S百分数

酶(时间点)	总莫纳甜(ppm)	％S，S莫纳甜
			睾丸酮丛毛单胞菌ProA(1小时)	440.35	92.5
睾丸酮丛毛单胞菌ProA(18小时)	958.3	92.2
			苜蓿根瘤菌HMG(1小时)	45.9	66.3
苜蓿根瘤菌HMG(18小时)	108.1	61.4
			SEQ ID NO：22(1小时)	17.85	55.1(18.9)
SEQ ID NO：22(18小时)	135.5	27.3(19.1)

可看出SEQ ID NO：22醛缩酶的R-特异性远高于基准ProA酶。该R-特异性还可通过产生的低S，S莫纳甜百分数反应，尽管在该反应中HexAspC转氨酶对S-MP具有高度特异性。根据所产生的S，S莫纳甜水平，苜蓿根瘤菌HMG醛缩酶的R-特异性再次位于睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶和SEQ ID NO：22醛缩酶之间。当比较S，S莫纳甜和R，R莫纳甜的产量时，总莫纳甜数值不表示醛缩酶活性。D-转氨酶比HexAspC的MP转氨反应活性弱，尤其是MP为该反应中的浓度时。

为了进一步比较SEQ ID NO：22醛缩酶和来自睾丸酮丛毛单胞菌的ProA酶，将不同比例的D-转氨酶：醛缩酶用于D-色氨酸启动的反应中(该实验中无一式两份样品)。如上所述进行反应。对于醛缩酶浓度恒定的反应，使用约50μg醛缩酶。对于 D-转氨酶量保持恒定的反应，使用0.5mgD-转氨酶。D-转氨酶为2和10mg/mL浓度时，使用冻干酶。在两个最高D-转氨酶浓度中，一式两份进行实验。

表5：D-转氨酶浓度对于R，R莫纳甜生产的影响

醛缩酶	D-转氨酶的浓度	时间	总莫纳甜 (约ppm)	％R，R莫纳甜
					SEQ ID NO：22	0.25mg/mL	1小时	2	100
SEQ ID NO：22	0.25mg/mL	过夜	141	97.1
					SEQ ID NO：22	0.5mg/mL	1小时	8	100
SEQ ID NO：22	0.5mg/mL	过夜	273	96.5
					SEQ ID NO：22	1mg/mL	1小时	34	100
SEQ ID NO：22	1mg/mL	过夜	638	96.5
					SEQ ID NO：22	2mg/mL	1小时	979	100
SEQ ID NO：22	2mg/mL	过夜	1910	97.3
					SEQ ID NO：22	10mg/mL	1小时	2930	99.1
SEQ ID NO：22	10mg/mL	过夜	2950	96.5
					睾丸酮丛毛单胞菌ProA	0.25mg/mL	1小时	4	78.7
睾丸酮丛毛单胞菌ProA	0.25mg/mL	过夜	257	61.1
					睾丸酮丛毛单胞菌ProA	0.5mg/mL	1小时	25	79.0
睾丸酮丛毛单胞菌ProA	0.5mg/mL	过夜	480	62.5
					睾丸酮丛毛单胞菌ProA	1mg/mL	1小时	74	73.8
睾丸酮丛毛单胞菌ProA	1mg/mL	过夜	810	68.1
					睾丸酮丛毛单胞菌ProA	2mg/mL	1小时	325	73.1
睾丸酮丛毛单胞菌ProA	2mg/mL	过夜	2220	71.9
					睾丸酮丛毛单胞菌ProA	10mg/mL	1小时	2910	59.7
睾丸酮丛毛单胞菌ProA	10mg/mL	过夜	2450	67.5

莫纳甜水平高于400ppm时，结果不处于标准曲线的线性范围，仅为近似值。适当稀释时，所产生R，R莫纳甜的最大值约为1100ppm。采用FDAA立体异构体分析10mg/mL D-转氨酶样品中的SEQ ID NO：22醛缩酶。两小时时，样品含有98.5％R，R莫纳甜。17小时时，样品含有95.9％R，R莫纳甜。经过长时间的培育和采用大量的转氨酶，SEQ ID NO：22醛缩酶产生高百分数的R，R莫纳甜。若供应充足的D-转氨酶，SEQ ID NO：22醛缩酶产生的总莫纳甜与睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶相同，表明两者的特异性活性相似。

表6：醛缩酶浓度对R，R莫纳甜生产的影响

醛缩酶	醛缩酶浓度	时间	总莫纳甜 (ppm)	R，R莫纳甜百分数
					SEQ ID NO：22	25μg/mL	1小时	7.0	100
SEQ ID NO：22	25μg/mL	过夜	275	97.4
					SEQ ID NO：22	50μg/mL	1小时	9.0	97.3
SEQ ID NO：22	50μg/mL	过夜	334	95.7
					SEQ ID NO：22	100μg/mL	过夜	297	93.3
睾丸酮丛毛单胞菌ProA	25μg/mL	1小时	16	78.2
					睾丸酮丛毛单胞菌ProA	25μg/mL	过夜	491	73.2
睾丸酮丛毛单胞菌ProA	50μg/mL	1小时	18	64.1
					睾丸酮丛毛单胞菌ProA	50μg/mL	过夜	437	63.0
睾丸酮丛毛单胞菌ProA	100μg/mL	1小时	26	62.5
					睾丸酮丛毛单胞菌ProA	100μg/mL	过夜	513	61.5

当醛缩酶浓度改变时，总莫纳甜量未见明显增加。R，R百分数随着时间和醛缩酶浓度减少而减少，尤其当-转氨酶有限时。

为进一步检测受试醛缩酶的R-特异性，采用L-色氨酸和美国公开申请号2005282260所述方法生产和纯化的HexAspC转氨酶开始实验。相对于R-MP，HexAspC对S-MP转氨作用显示出强烈的选择性，因此50％以上的R，S莫纳甜百分数表明它是高度立体特异性的醛缩酶。提供10mMα-酮戊二酸作为氨基接受体；然而，在高浓度时，L-转氨酶也使用丙酮酸。这些反应中，通常仅有生产的S，S和R，S莫纳甜在FDAA衍生方法的检测限内。

表7：L-转氨酶浓度对S，S莫纳甜生产的影响

醛缩酶	L-转氨酶浓度	时间	总莫纳甜 (约ppm)	S，S莫纳甜百分数
					SEQ ID NO：22	0.25mg/mL	1小时	13	33.8
SEQ ID NO：22	0.25mg/mL	过夜	127	34.2
					SEQ ID NO：22	0.5mg/mL	1小时	31	30.9
SEQ ID NO：22	0.5mg/mL	过夜	272	26.8
					SEQ ID NO：22	1mg/mL	1小时	34	20.3
SEQ ID NO：22	1mg/mL	过夜	385	23.5
					睾丸酮丛毛单胞菌ProA	0.25mg/mL	1小时	523	94.2
睾丸酮丛毛单胞菌ProA	0.25mg/mL	过夜	1817	93.7
					睾丸酮丛毛单胞菌ProA	0.5mg/mL	1小时	602	91.8
睾丸酮丛毛单胞菌ProA	0.5mg/mL	过夜	2122	89.9
					睾丸酮丛毛单胞菌ProA	1mg/mL	1小时	873	90.2
睾丸酮丛毛单胞菌ProA	1mg/mL	过夜	1237	82.6

表8：醛缩酶浓度对S，S莫纳甜生产的影响

醛缩酶	醛缩酶浓度	时间	总莫纳甜 (ppm)	S，S莫纳甜百分数
					SEQ ID NO：22	25μg/mL	1小时	11	25.1
SEQ ID NO：22	25μg/mL	过夜	112	20.0
					SEQ ID NO：22	50μg/mL	1小时	18	31.8
SEQ ID NO：22	50μg/mL	过夜	160	27.0
					SEQ ID NO：22	100μg/mL	1小时	33	33.2
SEQ ID NO：22	100μg/mL	过夜	238	41.4
					睾丸酮丛毛单胞菌ProA	25μg/mL	1小时	305	86.4
睾丸酮丛毛单胞菌ProA	25μg/mL	过夜	1094	87.5
					睾丸酮丛毛单胞菌ProA	50μg/mL	1小时	575	90.9
睾丸酮丛毛单胞菌ProA	50μg/mL	过夜	1449	89.5
					睾丸酮丛毛单胞菌ProA	100μg/mL	1小时	817	93.6
睾丸酮丛毛单胞菌ProA	100μg/mL	过夜	1360	89.7

对于具有高R-特异性的醛缩酶，如SEQ ID NO：22，生产少量的总莫纳甜，并且提高醛缩酶的用量能够增加总莫纳甜产量(以及S，S百分数)。这些醛缩酶产生少量的S-MP底物，S-MP底物是所用L-转氨酶的优选底物。对于具有低R-特异性的酶，如ProA，增加醛缩酶用量不能显著提高总莫纳甜产量或S，S莫纳甜百分数。提高L-转氨酶的加入量能降低所产生的S，S莫纳甜的百分数。

进一步在两种缓冲体系-100mM磷酸钾(如上所述)和100mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(″MOPS″)(含有3mM磷酸钾)中研究SEQ ID NO：22醛缩酶的活性和特异性。如上所述使用1mg/ml AT-103 D-转氨酶和50mM D-色氨酸进行实验。实验一式两份进行4.5小时。SEQ ID NO：22醛缩酶在磷酸钾中生产116ppm莫纳甜和99.1％R，R莫纳甜(FDAA衍生方法)。在MOPS中，SEQ ID NO：22醛缩酶生产75.5ppm莫纳甜和96.2％R，R莫纳甜。在没有SEQ ID NO：22醛缩酶时，在MOPS中产生的莫纳甜背景水平明显更高，并且即便是在对照组中，MOPS中R，R百分数更低。MOPS的存在有可能影响D-转氨酶的选择性和活性。

SEQ ID NO：21的亚克隆

SEQ ID NO：21的醛缩酶基因获自戴沃公司(Diversa Corp)。SEQ ID NO：21是戴沃公司(Diversa Corp)筛选醛缩酶基因的环境文库的一部分。然而，可采用本领域普通技术人员已知的任何方法重建SEQ ID NO：21的醛缩酶基因。例如，可用组装PCR法(如实施例10、18和19所述)重建SEQ ID NO：21的醛缩酶基因。

用以下引物PCR扩增醛缩酶基因(SEQ ID NO：21)：

5’-gaggagctcgagtcagacgtatttcagtcctttttc-3’(SEQ ID NO：23)和5’-agaagacatatgatttatcagccggggac-3’(SEQ ID NO：24)。用XhoI和NdeI消化得到的PCR产物，以在工程改造到引物中的位点上切割。凝胶纯化该片段(QIAquick凝胶提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，Velencia，CA))，并与经XhoI和NdeI消化和凝胶纯化的pET28b连接(采用T4DNA连接酶)。将连接物转化到TOP10F’化学感受态细胞中。筛选平板上生长的集落的插入物，对含有插入物的几个分离物进行DNA序列分析(阿吉科特公司(Agencourt)，Beverly，MA)。

SEQ ID NO：22的醛缩酶的纯化

将验证的醛缩酶克隆转化到BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS中。将合适抗生素培养的过夜培养物稀释至新鲜培养基中(一般1∶100)，并于37℃通气培养至OD₆₀₀～0.6。然后用1mM异丙基硫代半乳糖苷(″IPTG″)诱导培养物，并转移至30℃(通气)，基序培育过夜。离心收获细胞。一般对细胞团进行一次冻融周期，以帮助细胞裂解。用BugBuster和Benzoase(诺华基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)裂解细胞团块(按照生产商方案)。离心去除细胞碎片。将按照生产商方案制备的粗蛋白提取物施加于HisBind柱(诺华基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)。按照生产商的方案洗涤该柱并洗脱蛋白。用PD-10柱(GE保健GE Healthcare)，新泽西州皮斯卡塔韦)对纯化蛋白进行脱盐。用于交换的缓冲液是50mM磷酸钾pH 7.5，100mM NaCl，4mMMgCl₂。用Amicon离心浓缩器(密理博公司(Millipore)，Billerica，MA)浓缩纯化蛋白。

实施例4

(1)色氨酸消旋酶

当D-色氨酸用作原料时，用D-转氨酶和醛缩酶产生R，R-莫纳甜(实施例3)。尽管如此，出于几项理由L-色氨酸可以是优选原料。例如，L-色氨酸可能比D-色氨酸便宜且更易于获得。本发明描述了获得活性色氨酸消旋酶的几种方法。采用R-特异性醛缩酶，即优选或选择性产生R-MP的醛缩酶能提高R，R莫纳甜产率。图1和2说明了采用色氨酸消旋酶、D-转氨酶和R-特异性醛缩酶由L-色氨酸产生立体异构体富集的R，R莫纳甜的方法。

通过构建其生长需要活性消旋酶的菌株选择色氨酸消旋酶。色氨酸营养缺陷型在极限培养基上生长时需要L-色氨酸来源。用D-色氨酸补充该培养基是选择能将D-色氨酸转变为L-色氨酸的消旋酶的一种方式。检测了色氨酸营养缺陷型在补充有D-色氨酸的极限培养基上生长情况。来自大肠菌遗传原料中心(Coli Genetic Stock Center)的CAG18455和CAG18579菌株以及NRRL12264菌株(也是lipA^-，λDE3溶原化，并清除了质粒)在补充D-色氨酸时不生长，但在补充L-色氨酸时生长。大肠杆菌可用作宿主生物体，但也可采用其它宿主生物体，如酵母、其它细菌或其它真核生物。用D-转氨酶转化时，色氨酸营养缺陷型(特别是NRRL12264(也是lipA^-，λDE3溶原化，并清除了质粒))能在D-色氨酸上生长。这验证了大肠杆菌将D-色氨酸运输到细胞内的能力。

Salcher和Lingens描述了Pseudomonas aurereofaciens(ATCC15926)中存在色氨酸消旋酶。Salcher，O.和Lingens，F.，J.Gen.Microbiol.121：465-471(1980)。也在几种植物中描述了色氨酸消旋酶，包括烟草、甜菜、番茄和小麦，渗透压应激或干燥的条件能诱导该酶。色氨酸消旋酶可能在冬青叶硬木朔的天然莫纳甜生产途径中起到作用。为了分离这种消旋酶活性，由ATCC15926(或具有色氨酸消旋酶活性的另一种生物体)构建了表达文库，将该文库转化到色氨酸营养缺陷型中。选择能利用D-色氨酸作为色氨酸来源而生长的菌株。也采用类似方法筛选含有已知消旋酶的许多菌株，以找寻对D-色氨酸有活性的消旋酶。可能对D-色氨酸有活性的消旋酶的例子包括丙氨酸、丝氨酸和谷氨酸消旋酶。Yoshimura T.和Esaki，N.，“氨基酸消旋酶：功能和机制”(Amino Acid Racemases：Functions and Mechanism)，Journal of Bioscienceand Bioengineering 96，103-109，(2003)。

丙氨酸消旋酶为PLP依赖性，已经由鼠伤寒沙门菌克隆(dadB基因)。丙氨酸消旋酶的其它来源是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、霍乱弧菌、粟酒裂殖酵母和蜡状芽孢杆菌。担子菌类蘑菇、香菇也含有广泛活性的丙氨酸消旋酶。

丝氨酸消旋酶也是PLP依赖性，发现于真核动物(如蚕、大鼠脑、小鼠脑cDNA)以及细菌(鹑鸡肠球菌)。

谷氨酸消旋酶为PLP-非依赖性，已经由戊糖片球菌、短小芽孢杆菌、发酵乳杆菌、短乳杆菌、大肠杆菌、嗜火产液菌和枯草芽孢杆菌克隆。一些谷氨酸消旋酶的特异性非常高，因此即使是结构相似的氨基酸天冬氨酸、天冬酰胺和谷胺酰胺也可能无法成为该酶的底物。

也存在天冬氨酸消旋酶，它是PLP非依赖性。天冬氨酸消旋酶发现于乳杆菌、链球菌菌株和一些古细菌、如脱硫球菌和热球菌菌株。双壳软体动物Scapharcabrouhtonii也含有天冬氨酸消旋酶。

文献中发现的其它消旋酶包括来自项圈藻(Anabaena sp.)和沟槽假单胞菌的氨基酸消旋酶(EC 5.1.1.10)、脯氨酸消旋酶和多功能苯丙氨酸消旋酶。也检测了相关的差向异构酶或消旋酶。检测了可能的消旋酶，以保证它们不是D-色氨酸转氨酶。通过序列分析和/或酶实验筛选可能的消旋酶。选择色氨酸消旋酶的这种筛选方法也可用于描述过色氨酸消旋酶的其它细菌或古细菌，以及以能够使其表达的方式构建的真核cDNA文库。

筛选通过该检测作为色氨酸消旋酶的酶对莫纳甜的活性，如实施例8所述。理想的是，获得的酶对色氨酸特异性非常高，但对莫纳甜的消旋酶活性很小或无此活性。

也可由现有的消旋酶、转氨酶或差向异构酶衍生和/或改进(通过诱变或重组工程)色氨酸消旋酶。此外，由于丙氨酸转氨酶(和其它转氨酶)的晶体结构已知，它们可用作基于结构的合理诱变的基础。上述方法用于初步选择色氨酸消旋酶活性和筛选改进的活性。

(2)色氨酸消旋酶文库

构建文库：

Burkholderia pyrrocina(ATCC15958)和绿针假单胞菌(ATCC15926)获自美国典型培养物保藏中心。在ATCC推荐的条件下培养它们，按照Mekalanos，J.J.，″Duplication and amplification of toxin genes in Vibrio cholerae(霍乱弧菌的毒素基因的倍增和扩增)″Cell 35：253-263，(1983)所述的方法制备基因组DNA。用Sau3AI限制性酶部分消化基因组DNA。用凯杰QIAquick凝胶提取试剂盒(Valencia，CA)凝胶纯化1-3Kbp片段。将纯化DNA连接到用BamHI消化和如上所述纯化的pTrc99a(安玛西亚公司(Amersham)，新泽西州皮斯卡塔韦)中。用摩尔比为3∶1的插入物∶载体室温培育过夜，以完成连接。将连接的文库转化到TOP10F’化学感受态细胞(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)中，接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。将转化平板培育过夜后，从平板上刮下菌落，用液体LB培养基洗涤，用凯杰(Qiagen)QIAquick小抽试剂盒(Valencia，CA)少量制备合适大小的细胞团块。收集约30,000个菌落进行小抽。

将收集的质粒转化到CAG18455(trpC83::Tn10，rph-1)或CAG18579(trpC::Tn10kan，rph-1)中。这两个菌株都是色氨酸营养缺陷型，因此它们在M9极限培养基(蒂福科公司(Difco))上无法生长，除非培养基含有色氨酸。将转化子接种到补充有D-色氨酸的M9极限培养基上。这能选择可将D-色氨酸转变为L-色氨酸的菌株。

转化文库之前，检测菌株在含有L-或D-色氨酸的极限培养基上的生长。检测菌株在补充有D-色氨酸的极限培养基上的生长，没有观察到生长。这两个菌株能够在补充有L-色氨酸而非D-色氨酸的同一种培养基上生长。此外，用来自枯草芽孢杆菌的D-特异性转氨酶转化NRRL12264(除其它染色体编码突变(serB、ΔtrpED、tnaA2、aroP)外，所用菌株已清除了色氨酸操纵子质粒，用λDE3溶原化，并缺失lipA)的衍生物(WO 03/091396)。NRRL12264菌株无法在补充D-色氨酸的极限培养基上生长，但能在补充有L-色氨酸而非D-色氨酸的极限培养基上生长。T7启动子驱动D-转氨酶的表达。转化菌株能够在补充D-色氨酸的M9极限培养基上生长。

筛选在D-色氨酸培养基上生长的菌落。分离质粒，并再次转化到亲本菌株(CAG18455或CAG18579)中，以验证在D-色氨酸培养基上的生长依赖该质粒，而不依赖宿主突变。分析补充色氨酸营养缺陷的质粒的核苷酸序列。进一步分析经测定含有色氨酸消旋酶基因的菌落。

以相似的方式分离来自其它阻滞来源的色氨酸消旋酶。有文献报道烟草组织培养细胞(烟草Wisconsin 38变体)(Miura，G.A.和Mills，S.E.，″The conversion ofD-tryptophan to L-tryptophan in cell cultures of tobacco″(在烟草细胞培养中将D-色氨酸转变为L-色氨酸)，Plant Physiol.47：483-487，(1974))和小麦(Triticum aestivum)的粗蛋白提取物(Rekoslavskaya，N.I.等，″Synthesis and physiological function ofD-tryptophan during wheat germination″(小麦发芽期间D-色氨酸的合成和生理功能)，Russian J.Plant Physiol.44：196-203，(1997))中的色氨酸消旋酶活性。从组织制备cDNA表达文库，如文献所述，用该表达文库转化色氨酸营养缺陷型，如上所述。

我们预计，如果采用相同菌株，并且复制与上述文献所述相同的生长条件，可分离具有色氨酸消旋酶活性的酶，或者可以分离mRNA，可制备含有具有色氨酸消旋酶活性的酶的编码序列的cDNA表达文库。例如，可能需要某些生长阶段或某些培养基组分来诱导细胞产生具有色氨酸消旋酶活性的酶。

(3)色氨酸消旋酶实验

将确定为可能含有色氨酸消旋酶的克隆转化到通常用于表达重组蛋白如BL21的大肠杆菌菌株中。用LB肉汤培养细胞，至600nm的光密度为0.4-0.6。用IPTG(0.1mM终浓度)诱导驱动消旋酶表达的启动子。诱导后，使该细胞于37℃(通气)表达蛋白1-3小时。收获细胞，用French压力、超声或化学方式(如BugBuster(诺华基公司(Novagen))裂解。离心裂解细胞，以去除细胞碎片。澄清后的提取物直接用于测定。

将不同量的提取物加入溶液中，使其终浓度为50mM磷酸钾(pH 7.0)和2mM L-色氨酸。加入吡哆醛-5’-磷酸使其终浓度为10μM。培育该样品，然后用LC/MS分析。仅用L-色氨酸作为底物时存在D-色氨酸峰表明是阳性结果。D-色氨酸浓度应随时间而增加，直到达到平衡，反应速率也应随蛋白浓度增加，直到酶浓度足够高，以致于无法再用底物饱和。也可如上所述将D-色氨酸转变为L-色氨酸。

互补基因可编码D-转氨酶。此种转氨反应需要α-酮酸如α-酮戊二酸、草酰乙酸或丙酮酸作为氨基接受体。这些化合物可能存在于细胞提取物中，通常以少量存在。可用PD-10脱盐柱去除这些化合物，仍可对粗提物进行该实验。同样地，互补基因也可编码D-氨基酸氧化酶或D-氨基酸脱氢酶。这些酶也需要可用PD-10脱盐柱去除的辅因子和共同底物。用常规的柱色谱纯化色氨酸消旋酶活性。最终，将鉴定为可能是色氨酸消旋酶的开放阅读框克隆入带有亲和标记物的表达载体。然后用亲和色谱纯化可能的色氨酸消旋酶。在这些情况下，将纯化蛋白用于酶测定，基本如上所述。

(4)色氨酸消旋酶的反向遗传工程

可采用常规的蛋白质纯化技术，包括硫酸铵分级和常规柱色谱纯化植物或微生物来源的色氨酸消旋酶。纯化蛋白以便2-D凝胶上分离斑点后，进行肽微测序技术或常规的Edman型氨基酸测序(参见因特网上″golgi.harvard.edu/microchem/″对一般用于此类工作的方法和设备的描述)。然而在一些情况下，生物体的基因组序列无法用作蛋白纯化的蛋白质来源，因为这些序列尚未测定。在这种情况下，可根据获自蛋白来源的最接近已知亲缘生物的序列设计第一组简并引物。然后按照建立的方案进行简并PCR和基因组步查，以分离色氨酸消旋酶编码序列。

(5)克隆嗜热脂肪地芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶

克隆嗜热脂肪地芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶(SEQ ID NO：41)。嗜热脂肪地芽孢杆菌(ATCC12980D)的基因组DNA购自ATCC(Manassas，VA)。采用以下引物扩增嗜热脂肪地芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶基因：5’-atggacgagtttcaccgcga-3’(SEQ ID NO：25)和5’-ttatgcatcgcttcatccgc-3’(SEQ ID NO：26)。用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)将PCR产物连接于pCR-Blunt-TOPO。通过测序验证正确克隆(阿吉科特公司，Beverly，MA)。将正确的克隆用作后续PCR反应的模板。

采用以下引物扩增丙氨酸消旋酶：5’-ataataggatcctcatccgcggccaacggcg-3’(SEQID NO：27)和5’-gggaaaggtaccgaggaataataaatggacgagtttcaccgcg-3’(SEQ ID NO：28)。用限制性酶KpnI和BamHI消化PCR产物。这些酶在工程改造到引物中的位点上切割。凝胶纯化消化的PCR产物，并连接于经过KpnI和BamHI消化、随后被凝胶纯化的pTrc99a。将该连接物转化到TOP10F’化学感受态细胞中，并接种于补充有50 μg/ml卡那霉素的LB平板上。筛选分离物中的插入物，经序列分析(阿吉科特公司，Beverly，MA)验证，含有插入物的几种分离物含有正确序列(SEQ ID NO：40)。

用司查塔基公司(Stratagene)(加利福尼亚州拉霍亚)Quick-Change多位点定位诱变试剂盒对pTrc99a/丙氨酸消旋酶构建物进行定位诱变(″SDM″)。诱变引物如下：

5’-gccggacgacacgcacattnnkgcggtcgtgaaggcgaacgcc-3’(SEQ ID NO：29)，

5’-gtgaaggcgaacgcctatggannkggggatgtgcaggtggcaagg-3’(SEQ ID NO：30)，

5’-cctcccgcctggcggttgccnnkttggatgaggcgctcgctttaa-3’(SEQ ID NO：31)，

5’-caaccaggcgaaaaggtgagcnnkggtgcgacgtacactgcgcag-3’(SEQ ID NO：32)，

5’-gatcgggacgattccgatcggcnnkgcggacggctggctccgccg-3’(SEQ ID NO：33)，

5’-gccatttggaaacgatcaacnnkgaagtgccttgcacgatcag-3’(SEQ ID NO：34)

(n＝任何核苷酸，k＝g或t)。

通过分析嗜热脂肪地芽孢杆菌丙氨酸消旋酶的现有晶体结构选择用于诱变的残基。选择与活性位点相距5-10

的大氨基酸残基。

所有六种引物均用于SDM反应，如生产商方案所示。按照生产商方案将SDM反应转化到XL-10Gold中。将转化反应物接种到补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上。向平板中加入LB肉汤，从平板上刮下菌落。使重悬细胞于37℃生长数小时，用were allowed to grow at 37℃ for several小时，用QIAquick小抽试剂盒少量制备质粒。然后，将得到的诱变文库用于转化色氨酸营养缺陷型CAG18455。将转化物接种于补充有葡萄糖、痕量元素、维生素、100μg/ml氨苄青霉素、100μM IPTG和3mM D-色氨酸的M9极限培养基中。37℃培育数天后，菌落生长。将这些菌落划线接种于LB(100μg/ml氨苄青霉素)上。分离这些分离物中的质粒，并再次转化到CAG18455中。将再次转化的细胞接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB。形成分离菌落后，如上所述将它们划线接种于M9 D-色氨酸培养基上。看上去所有菌落均再次生长，这表明生长是因为诱变的消旋酶。没有观察到对照细胞生长。

测定了几种分离物的体外活性。细胞生长至OD₆₀₀约为0.6，用100μM IPTG诱导。再于37℃培育细胞2小时，离心收获细胞。将细胞团块储存于-80℃，直到下一天使用。将细胞团块放置在冰上融化。用BugBuster(无伯胺)细胞裂解试剂和Benzoase(诺华基公司(Novagen))破坏细胞。离心(4℃、～10,000xg离心30分钟)去除细胞碎片。将上清液储存为细胞粗提物。

试验缓冲液含有50mM磷酸钾(pH 8.0)、10μM吡哆醛磷酸、0.01％β-巯基乙醇和50mM D-或L-色氨酸。每毫升试验缓冲液中加入200μL提取物。在时间0点、 30分钟和过夜时间点冷冻样品。离心、过滤样品，将样品转移至SRC进行分析。

表9：从L-色氨酸开始的试验的结果

时间(分钟)	L-色氨酸(ppm)	D-色氨酸(ppm)
			0	1240	3.6
30	1193	24.5
			过夜	1192	583.2

表10：从D-色氨酸开始的试验的结果

时间(分钟)	L-色氨酸(ppm)	D-色氨酸(ppm)
			0	0.5	7506
30	0.5	7519
			过夜	14.9	7463

测定此分离物中消旋酶基因的DNA序列(SEQ ID NO：42)，发现该分离物含有三个突变。相应的蛋白质分离物中的突变如下：M35C、F66E和Y354A(SEQ ID NO：43)。在此突变体中发现了其它突变(P197L)。这是一个自发性突变，不是定位诱变的一部分。

将诱变的消旋酶克隆到pET30中进行表达和纯化。将以下引物用于从pTrc99a构建物PCR扩增消旋酶基因：5’-gggaaaggtaccgaggaataataaatggacgagtttcaccgcg-3(SEQID NO：35)和5’-gcggcgccatggacgagtttcaccgcg-3’(SEQ ID NO：36)。用NcoI和BamHI消化PCR产物，凝胶纯化，并连接于经过NcoI和BamHI消化、随后凝胶纯化的pET30。将连接物转化到TOP10化学感受态细胞(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)中。筛选来自转化的分离物中的插入物。对含有插入物的质粒进行测序(阿吉科特公司，Beverly，MA)。将含有正确序列的分离物转化到BL21λDE3或BL21λDE3 pLysS中进行表达和纯化。新构建物称为pET30Trp消旋酶。

(6)色氨酸消旋酶的纯化

将pET30Trp消旋酶构建物的过夜培养物亚克隆到含有合适抗生素(50μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素)的新鲜LB培养基中，生长至OD₆₀₀～0.6(37℃，通气)。用100μM IPTG诱导表达，继续于37℃通气培育2小时。离心收获细胞，并储存于-80℃待用。在冰上融化细胞团块，用BugBuster无伯胺细胞裂解试剂和Benzoase核酸酶(诺华基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)裂解细胞。离心去除细胞碎片，将上清液用作蛋白质粗提物。用0.45μm注射器滤器过滤该蛋白质粗提物，并施加于按照生产商说明书预平衡的HisBind柱(诺华基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)。洗涤该柱，如生产商方案所述洗脱蛋白质。用PD-10柱(GE保健(GE Healthcare)，新泽西州皮斯卡塔韦)对纯化蛋白脱盐，将50mM磷酸钾pH 8.0，10μM吡哆醛-5’-磷酸(″PLP″)用作洗脱剂。用Amicon离心浓缩器(密理博公司(Millipore)，Billerica，MA)浓缩脱盐后的蛋白。如上所述纯化野生型丙氨酸消旋酶。

(7)测定色氨酸消旋酶

用几项试验检测纯化的消旋酶。在一项试验中，D-氨基酸氧化酶产生过氧化氢被用作检测系统。通过如本实施例所述分离的消旋酶由L-色氨酸产生氧化酶的D-色氨酸底物。该试验包括每次试验0、1、10、25、50、100、200μg酶，50mM磷酸钾pH 8.0，10μM PLP，50mM L-色氨酸。37℃培育该试验1小时。培育后，将100mg/ml D-氨基酸氧化酶(AOD-101生物催化公司(BioCatalytics)，Pasadena，CA)和0.5mM FAD加入反应混合物。用Amplex Red试剂盒(分子探针公司(Molecular Probes)，Eugene，OR)和Perkin Elmer HTS 7000 Plus生物测定荧光阅读器(Wellesley，MA)测定产生的过氧化氢。下表11和12小结了试验数据：

表11：标准曲线

H₂O₂浓度(μM)	荧光读数
		0	485
1	8691
		2	16958
3	24719
		4	31692
5	38083

表12：试验结果

蛋白质浓度 (μg/试验)	野生型消旋酶 (荧光读数)	突变(Trp)消旋酶 (荧光读数)
			0	5226	5192
1	4272	6215
			10	4149	10543
25	4239	21177
			50	3141	30465
100	3160	39068
			200	2370	35163

试验结果表明，产生过氧化氢需要突变的消旋酶。突变的消旋酶加入量增加时，过氧化氢的产量增加。

分析了消旋酶(野生型和突变型)对丙氨酸的活性。该反应缓冲液含有：100mM磷酸钾pH 8.0，10μM PLP，50mM L-丙氨酸，12μg/mL野生型消旋酶或94μg/ml突变消旋酶。用1体积的0.5M甲酸终止该反应，用Chirobiotic柱通过LC/MS/MS进行分析，如实施例1所述。

下表13小结了试验数据。

表13

时间(分钟)	野生型消旋酶 (所产生的D-丙氨酸的ppm)	突变消旋酶 (所产生的D-丙氨酸的ppm)
			0	65	87
5	334	2430
			10	1161	3257
20	1670	4003
			30	3075	4621
40	3177	4931
			60	3986	5328

突变的消旋酶似乎能保持对原来底物丙氨酸的活性。

用L-色氨酸、D-色氨酸、L-丙氨酸和D-丙氨酸之一作为底物检测突变消旋酶的活性。该反应缓冲液含有：100mM磷酸钾pH 8.0，10μM PLP，50mM底物，94μg/ml突变消旋酶。用1体积的0.5M甲酸终止该反应，如实施例1所述进行分析。室温(～22℃)下培育以丙氨酸作为底物的试验，于37℃培育以色氨酸作为底物的试验。下表14小结了结果。

表14

时间 (分钟)	由L-trp产生的 D-trp的ppm	由D-trp产生的 L-trp的ppm	由L-ala产生的 D-ala的ppm	由D-ala产生的 L-ala的ppm
					0	未检测到	0.8	420.5	565.9
5	未检测到	1	1268	1874
					10	未检测到	1.4	1448	1968
20	未检测到	2.2	1590	1505
					30	0.3	2.8	1840	1923
40	3.1	2.8	1779	1960
					60	9	3.7	1295	1070
1080	57.4	66.7	1611	2932

该消旋酶在两个方向中都有活性，保持了野生型活性。

检测该突变消旋酶对几种底物的活性。如前所述纯化该试验所用的酶。试验条件如下：50mM磷酸钾pH 8.0，10μM PLP，25mM底物，40μg/ml突变消旋酶。用1体积的2M甲酸终止该反应，如实施例1所述进行分析。于37℃培育该试验。结果(由L-异构体产生的D-异构体的ppm)见下表15(nd＝未检测到)。

表15

时间 (分钟)	Lys	Ala	Glu	Met	Tyr	Leu	Trp	Phe
									0	12	156	86	104	nd	nd	nd	nd
3	2310	2180	607	1200	nd	37	nd	nd
									5	2450	1310	1110	1290	nd	80	nd	14
10	6630	2850	1950	2260	11	139	nd	14
									20	9550	1970	4660	2090	30	280	nd	47
30	15500	2090	4860	1750	63	320	nd	22
									60	10200	2540	4490	2150	136	710	nd	54
120	18000	2430	6340	1940	224	1050	nd	188
									240	13200	1830	6560	1990	515	1170	15	490

除了这里测试的氨基酸，这种消旋酶还可能外消旋其它氨基酸。

虽然突变消旋酶似乎对各种氨基酸有活性，但它们对莫纳甜没有任何活性。如前所述该试验所用的酶。试验条件如下：100mM磷酸钾pH 8.0，10μM PLP，50mM莫纳甜，1mg/ml突变消旋酶。于37℃培育该试验。如实施例1所述用FDAA衍生法分析该试验。该试验的结果见下表16。

表16

时间(小时)	S，S莫纳甜起始底物	R，R莫纳甜起始底物
			0	100％SS	100％RR
1	100％SS	100％RR
			18	100％SS	100％RR

即使在18小时后，用突变消旋酶仍然没有将S，S莫纳甜明显转化为S，R莫纳甜或者将R，R莫纳甜明显转化为R，S莫纳甜。

理想的酶对色氨酸有活性，但对其它氨基酸或氨基酸样化合物，尤其是莫纳甜活性很小或无活性。如果该酶对莫纳甜有显著活性，可诱变该酶以降低它对莫纳甜和/或谷氨酸的活性，同时保持其色氨酸活性不变或使该酶的活性水平足以用于莫纳甜生产。可用于诱变的技术包括但不限于：易错PCR、定位诱变、建立鉴定定位诱变靶点(可能参与底物结合的位点)的模型、诱变菌株传代和DNA改组。

(8)色氨酸消旋酶产生莫纳甜

每1mL反应混合物中加入以下物质：约50μg SEQ ID NO：22的醛缩酶，16mg/mL纯化的色氨酸消旋酶，4mM MgCl₂，50mM L-色氨酸，0.5mg D-转氨酶(由球形芽孢杆菌纯化，如实施例14所述)，100mM丙酮酸钠，100mM磷酸钾缓冲液pH7.5和0.05mM PLP。因为丙酮酸是广泛特异性D-转氨酶的可接受的氨基接受体，所以不采用α-酮戊二酸。所包括的对照是D-色氨酸作为起始底物并且不添加消旋酶。于30℃、温和振荡的条件下培育该样品2小时或过夜(20小时)。如实施例1所述分析样品。试验结果见下表17(nd＝未检测到)。

表17

时间 (小时)	起始底物	总莫纳甜的ppm	RR/SS％ RPLC	RS/SR％ RPLC	％RR FDAA	％SR FDAA
							2	L-trp	nd	0	0
18	L-trp	7.4	100	0	96.5	3.5
							2	D-trp	12	99.17	0.83
18	D-trp	170	98.65	1.35	97.5	2.5

表17显示了用色氨酸消旋酶将L-色氨酸底物转变为D-色氨酸，从而生产R，R莫纳甜。不采用色氨酸消旋酶，由D-色氨酸产生R，R莫纳甜的情况用作对照。产生的R，R莫纳甜百分数与L-或D-色氨酸作为原料时基本相同。此结果表明，不能检测到消旋酶催化R，R莫纳甜的消旋的活性。

(9)分离关键氨基酸改变

产生了诱变丙氨酸消旋酶的几种回复体。如前所述用QuikChange多位点定位诱变试剂盒(司查塔基公司，加利福尼亚州拉霍亚)通过定位诱变制备所述回复体，所用引物如下：

5’-gccatttggaaacgatcaactatgaagtgccttgcacgatcag-3’(SEQ ID NO：37)

5’-ctcccgcctggcggttgccttcttggatgaggcgctcgctttaag-3’(SEQ ID NO：38)

5’gccggacgacacgcacattatggcggtcgtgaaggcgaacgcc-3’(SEQ ID NO：39)

这些引物单独和合并使用，以制备三种突变在位置35、66和354(根据ATCC12980产生的氨基酸序列编号)中的六种可能组合。产生几种突变组合并检测其色氨酸消旋酶活性。试验条件如下：50mM磷酸钾pH 8.0，10μM PLP，30mM L-色氨酸，100μg/ml酶。该试验于37℃培育一段具体时间。如实施例1所述分析该样品。

试验结果见下表18(nd＝未检测到)。

表18

时间(分钟)	MF1	MF2	MY1	突变消旋酶
					0	nd	nd	nd	nd
5	nd	nd	nd	nd
					10	nd	nd	nd	nd
20	nd	nd	nd	nd
					30	nd	nd	nd	nd
40	nd	nd	nd	nd
					60	9.8	nd	nd	12.5
1080	54.8	90.8	nd	92.4

突变列表：

MF1：N41S(自发性突变)、P197L、Y354A

MF2：F66E、P197L、Y354A

MY1：M35C、F66E、P197L

诱变的消旋酶：M35C、F66E、P197L、Y354A

结果表明，对色氨酸的活性需要Y354A突变。不存在此突变时，就无法检测到对色氨酸的活性。

丙氨酸消旋酶还可通过随机方法如诱变PCR、诱变菌株传代或本领域技术人员已知的其它方法转变为更广泛特异性的消旋酶。更令人关注的丙氨酸消旋酶的演化可能集中在活性位点残基上，包括Lys129、Met134和Gly283-Trp288(包含性)之间的残基(由嗜热脂肪地芽孢杆菌编号)。

实施例5

在重组大肠杆菌中筛选丙酮酸醛缩酶的选择方法

实施例4(5)、9和10(3)以及图1-8所示的许多方法与优选由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸产生R-MP的醛缩酶一起使用时发挥最佳作用。因此，描述了分离和检测含有编码优选产生R-MP的醛缩酶的核酸的克隆的方法。以前描述了在以核糖作为碳源的M9极限培养基上生长时需要补充丙酮酸的大肠杆菌菌株。Ponce，E.等，″Cloningof the two pyruvate kinase isoenzymes structural genes from Escherich ia coli.：Therelative roles of these enzymes in pyruvate biosynthesis″(由大肠杆菌克隆两种丙酮酸激酶同工酶结构基因：这些酶在丙酮酸生物合成中的相对作用)J.Bacteriol.177：5719-5722，(1995)。该菌株的相关基因型是：ΔpykA ΔpykF。采用Datsenko和Wanner，Proceed.Natl.Acad.Sci.USA97：6640-6645，(2000)的方法产生双敲除。这些菌株可形成产生丙酮酸的醛缩酶筛选的基础，用于筛选对莫纳甜的特定立体异构体、莫纳甜前体的特定立体异构体或者莫纳甜或莫纳甜前体的类似物活性更高的醛缩酶。莫纳甜前体类似物包括被鉴定为ProA醛缩酶或KHG醛缩酶底物的化合物，如4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸、4-羧基-4-羟基-2-酮己二酸、4-羟基-4-甲基-2-酮己二酸、或能在醇醛反应中转变为丙酮酸的其它富含羧基的化合物。可以采用的莫纳甜类似物的例子是4-羟基-4-甲基谷氨酸，在测试细胞中天然转氨酶不难将其转氨化成4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸(ProA的底物)。

克隆

用以下引物产生pykA敲除：

5’-ATGTCCAGAAGGCTTCGCAGAACAAAAATCGTTACCACGTTAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO：3)和

5’-CTCTACCGTTAAAATACGCGTGGTATTAGTAGAACCCACGGTACCATATGAATATCCTCCTTAG-3’(SEQ ID NO：4)。

用以下引物产生pykF敲除：

5’-AGGACGTGAACAGATGCGGTGTTAGTAGTGCCGCTCGGTACCAGCATATGAATATCCTCCTTAG-3’(SEQ ID NO：5)和

5’-ATGAAAAAGACCAAAATTGTTTGCACCATCGGACCGAAAACCGGTGTA GGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO：6)。

用pKD3或pKD4作为模板以标准方法进行PCR反应。将PCR产物电穿孔到表达λ红同源重组系统的大肠杆菌菌株中。该PCR产物与pykA或pykF有同源性，将其重组到染色体的这些位点中。发生双交叉时，得到的后代携带缺失的pykA或pykF基因和抗生素抗性标记物。用标准的P1转导技术将含有抗生素抗性标记物的缺失基因转导到大肠杆菌菌株(MG1655)中。

菌株分析

检测双敲除在补充有Balch维生素溶液、Balch改良的痕量元素溶液(Balch，W.E.等，″Methanogens：reevaluation of a unique biological group″(产甲烷菌：再评价独特的生物类群)，Microbiol.Rev.43：260-296，(1979))和0.4％D-核糖极限培养基(M9盐)(Difco)上的生长。没有观察到双突变体生长，除非培养基中含有5mM丙酮酸。无论存在或不存在丙酮酸，野生型MG1655都能在上述培养基上生长。检测双敲除在补充有0.4％葡萄糖而非核糖的上述极限培养基上的生长。在此培养基上的生长情况类似于用野生型菌株观察到的情况。用此培养基，可通过ptsI基因产物(由磷酸烯丙醇丙酮酸产生丙酮酸并将磷酸转移至葡萄糖的磷酸转移酶系统的糖)由葡萄糖产生丙酮酸。也用补充有0.4％L-阿拉伯糖或0.4％D-木糖而非核糖的上述培养基检测双敲除菌株的生长情况。在这些含有5-碳(非-PTS)的底物上生长不会产生丙酮酸。在这些条件下双敲除菌株不会生长，除非补充5mM丙酮酸，但野生型菌株在存在或不存在丙酮酸的情况下均能正常生长。

用pBAD TOPO TA表达试剂盒(英杰公司)将来自WO 03/091396 A2的实施例2所述的睾丸酮丛毛单胞菌的proA醛缩酶基因(克隆到pET30 Xa/LIC中)和WO03/091396 A2的实施例3所述的aspC/proA基因操纵子(克隆到pET30 Xa/LIC和pET32中)亚克隆到pBAD-TOPO中。

在这些构建物中表达基因受诱导性araBAD启动子的调节。在阿拉伯糖(如0.4％)和IPTG的存在下，表达基因。除非补充丙酮酸或丙酮酸来源，否则该菌株无法在极限培养基上生长。该培养基可补充有莫纳甜、莫纳甜前体或者莫纳甜或莫纳甜前体的类似物。文献中所用的底物范围一般是0.5-5mM。ProA醛缩酶可以(例如)将莫纳甜前体转变为丙酮酸和吲哚-3-丙酮酸，以向菌株提供丙酮酸来源，并使其在含有0.4％阿拉伯糖的极限培养基上生长。表达proA和aspC基因的构建物可将莫纳甜转变为莫纳甜前体，并将莫纳甜前体转变为丙酮酸和吲哚-3-丙酮酸。此外，转氨酶可将吲哚-3-丙酮酸转变为L-色氨酸并补充色氨酸营养缺陷。用此系统筛选醛缩酶和筛选对莫纳甜的特定立体异构体、莫纳甜前体的特定立体异构体或者莫纳甜或莫纳甜前体的类似物的活性更高的醛缩酶。例如，如果对WO 03/091396 A2的实施例2所述的任何醛缩酶进行定向演化，采用利用含有R或S莫纳甜前体的培养基进行的平板试验比较得到的突变酶的对映异构特异性。如果在含有R-莫纳甜前体的平板上发生生长但在含有S-莫纳甜前体的平板上生长很少或不生长，那么该醛缩酶对反应位点上含有R-手性的底物有特异性。

制备含有1x Balch维生素溶液和Balch改良的痕量元素溶液的M9极限培养基平板。Balch，W.E.，等，″Methanogens：reevaluation of a unique biological group″(产甲烷菌：再评价独特的生物类群)，Microbiol.Rev.43：260-296(1979)。其中含有葡萄糖或阿拉伯糖作为碳源(0.4％w/v)，平板中补充有溶解于20mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)的5mM莫纳甜(R，R；S，S外消旋混合物)或等体积的磷酸钾缓冲液(无莫纳甜)。生长情况见下表20。

表20

	葡萄糖	葡萄糖莫纳甜	阿拉伯糖	阿拉伯糖莫纳甜
					MG1655	++++	++++	++++	++++
MG1655ΔpykA ΔpykF	++++	++++	+	+
					MG1655ΔpykA ΔpykF+ aspCproA/pBAD-topO	++++	++++	+	++

我们预计，可通过控制ProA和AspC的水平、增加莫纳甜摄取、用莫纳甜前体代替莫纳甜(在这种情况下不需要存在转氨酶)、或采用疏水性较低的莫纳甜类似物(如上所述)优化筛选。增加莫纳甜摄取的方法包括加入氨基酸混合物，加入特定氨基酸和采用去污剂、抗生素、抗生素类似物或帮助通透细胞壁的酶，加入少量丙酮酸以便在醛缩酶无法提供足以支持生长的丙酮酸的情况下生长。多粘菌素B九肽(Dixon and Chopra，Antimicrobial Agents and Chemotherapy 29：781-788(1986))和微囊藻毒素RR(Dixon等，FEMS Microbiology Letters 230：167-170(2004))被鉴定为通透大肠杆菌外膜的物质。

我们预计，其它启动子系统/质粒可用于此筛选系统，得到相等结果。例子包括T7启动子系统和IPTG诱导性启动子如tac和lac。

将aspC和proA基因克隆入pTrc99a表达载体(安玛西亚公司(Amersham)，新泽西州皮斯卡塔韦)中。将得到的载体转化到色氨酸营养缺陷型CAG18455或CAG18579中(参见实施例4中的菌株描述)。将转化子接种于含有0.1mM IPTG和5mM莫纳甜的M9极限培养基。37℃3天后，含有操纵子质粒的菌株形成菌落，而母体菌株似乎不生长。此外，生长取决于IPTG的存在，这表明生长需要操纵子的表达。在此补充研究中，aspC/proA操纵子由莫纳甜形成MP，并由MP形成吲哚-3-丙酮酸。然后，可将吲哚-3-丙酮酸转变为L-色氨酸，以使色氨酸营养缺陷型在M9极限培养基上生长。

几种可能的生物体可能含有R-特异性醛缩酶，并可如上所述进行检测。已经检测到谷氨酸棒杆菌的培养上清液中存在R，R-莫纳甜。这表明存在能够制备R-莫纳甜前体的酶。此外，用反相色谱检测苜蓿根瘤菌的无细胞提取物中的多种莫纳甜异构体，再次表明可能存在能够制备莫纳甜前体的R立体异构体的醛缩酶或转氨酶。

稻草假单胞菌(Pseudomonas straminea、Pseudomonas ochraceae NGJI)、苜蓿根瘤菌、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)LB126、Arthrobacter keyseri 12B、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)菌株CO92、大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)菌株USDA110、少动鞘胺醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)(假单胞菌)、鼠疫耶尔森菌KIM、Ralstonia metallidurans CH34、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)IP32953、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)蚕豆(viciae)生物变种rhiz23g02-p1k_1009_341(Sanger Institute)、溶芳烃新鞘氨醇单胞菌(Novosphingobiumaromaticivorans)DSM 12444、恶臭假单胞菌KT2440、趋磁螺菌(Magnetospirillummagnetotacticum)MS-1、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA009、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)ATCC-33913、地毯草黄单胞菌(Xanthomonasaxonopodis)柑桔变种306和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)MA-4680含有采用proA(睾丸酮丛毛单胞菌)作为模板的BLAST分析发现的同源物。参见美国申请号20050282260。这些生物体可用作DNA来源，并可在上述筛选中检测。

能够在棓酸、丁香酸、原儿茶酸、邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸和芴上生长的有机体可能含有可以制备莫纳甜的醛缩酶，并可能用于上述筛选。以下生物体通过4，5-加双氧酶途径代谢原儿茶酸，并且可能含有可利用的醛缩酶：支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)RB50、副百日咳博德特菌(Bordetella parapertussis)12822、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)MGH78578、趋磁螺菌MS-1、沼泽红假单胞菌CGA009、溶芳烃鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)F199、地毯草黄单胞菌柑桔变种306、油菜黄单胞菌ATCC 33913。

以下生物体能通过3，4加双氧酶途径降解原儿茶酸，并且含有可利用的醛缩酶：醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)ADP1、不动杆菌(Acinetobacter)ATCC33305、ADP1、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58、棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)AvOP、大豆根瘤菌菌株USDA 110、大豆根瘤菌菌株USDA438、流产布氏杆菌、马耳他布鲁菌(Brucella melitensis)16M、马耳他布鲁菌菌株1330、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)J2315、真菌伯克霍尔德菌(Burkholderia fungorum)LB400、假鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei)K96243、Corynebacterium efficiens YS-314、谷氨酸棒杆菌ATCC-13032、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium loti)MAFF303099、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)副结核亚种菌株k10、铜绿假单胞菌PAO1、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)Pf0-1、荧光假单胞菌SBW25、恶臭假单胞菌KT2440、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)番茄致病型菌株DC3000、茄科雷尔菌(Ralstoniasolanacearum)、红球菌(Rhodococcus)菌株I24(IG-15)、苜蓿根瘤菌1021、阿维链霉菌MA-4680、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)、地毯草黄单胞菌柑桔变种306、野油菜黄单胞菌ATCC-33913。

实施例6

HEXAspC的定位诱变

实验概述

与生产S，S莫纳甜的AspC相比，发现大肠杆菌AspC的六突变体(HEXaspC)活性更高，如WO 03/091396 A2的实施例6所述。HEX(登录号：/AHFA gi：127190)含有来自AspC的以下突变(大肠杆菌编号)：V35L、K37Y、T43I、N64L、T104S和N285S。根据结构分析和文献报道(Rothman，S.，和Kirsch，J.，J.Mol.Biol.327：593-608，(2003)；Rothman，S.，等，Protein Science 13：763-772，(2004))，建立预计能提高产生用于莫纳甜生产途径的底物(L-色氨酸、S-MP或二者)的动力学活性的另外五种突变体。两种突变体提高了色氨酸和S，S莫纳甜的转氨速率。两种突变体形成S，S莫纳甜的立体选择性提高，而另外一种立体选择性较低。据此，我们预计含有相似突变的来自芽孢杆菌的广泛特异性D-转氨酶可用作图3所示和实施例4(4)所述的R，R莫纳甜途径中的D-转氨酶。一种突变体(HEXaspCP9T/R122G)的L色氨酸转氨活性升高，但在S，S莫纳甜生产或S，S莫纳甜转氨中的活性显著降低。因此，我们预计该酶可用于图1、2、4、5、6、7和8所示和实施例9和10(3)所述的R，R莫纳甜生产途径的第一个步骤。通常，活性类似于AspC对L-色氨酸的活性、并且对R-MP和S-MP活性有限的转氨酶可用于图1、2、4、5、6、7和8所示的方法。

方法和材料

克隆到pUC19中的HEX基因由J.F.Kirsch教授(分子和细胞生物学系，加州大学伯克利分校，Berkeley，CA 94720-3206)提供，并用作将该基因克隆到pET23a中的模板。参见Onuffer，J.J.，和Kirsch，J.F.，″Redesign of the substrate specificity ofEscherichia coli aspartate aminotransferase to that of Escherichia coli tyrosineaminotransferase by homology modeling and site-directed mutagenesis″(通过同源性建模和定位诱变将大肠杆菌天冬氨酸转氨酶的底物特异性重新设计为大肠杆菌酪氨酸转氨酶的底物特异性)，Protein Science 4：1750-1757(1995)。也参见NCBI登录号1AHF_A GI：1127190(HEX氨基酸序列)。设计以下引物，用于将HEX基因克隆到pET23a载体(诺华基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)中：

HEXaspC引物：

N端：5’-GCGGAACATATGTTTGAGAACATTACCGCC-3’(SEQ ID NO：7)；

C端：5’-ATAACCGGATCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3’(SEQ ID NO：8)。

用以下PCR方案进行基因扩增：在100μL反应中，加入50ng DNA模板，1.0μM各引物，0.2mM各dNTP，1U Pfu Turbo聚合酶(司查塔基公司；加利福尼亚州拉霍亚)和1X克隆Pfu缓冲液。热循环程序采用94℃热启动5分钟；接着是25个下述步骤的循环：94℃的变性步骤(30秒)、55℃的退火步骤(1分钟)、72℃的延伸步骤(2分钟)，最后是72℃的结束步骤(7分钟)。用BamHI和NdeI(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs))限制性酶消化纯化PCR产物。采用罗氏(Roche)快速DNA连接试剂盒将该PCR产物连接到也经过NdeI和BamHI消化的pET23a中。采用伯乐公司(Bio-Rad)基因脉冲II系统按照生产商方案将脱盐的连接物电穿孔到大肠杆菌DH10B细胞中。用凯杰(Qiagen)离心小抽试剂盒制备小抽DNA，用作诱变反应的模板。按照生产商方案(诺华基公司(Novagen))将质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。

根据蛋白质建模观察，认为位置130上的色氨酸残基对与吡哆酸环发生堆积作用很重要，而且似乎是与S-莫纳甜前体(″S-MP″)底物发生位阻的来源。因此，用具有较小疏水侧链的氨基酸(苯丙氨酸)取代色氨酸。其余突变基于文献中的动力学数据，但产生了所需突变的新组合。除W130F以外，对HEXaspC的所有突变都是用司查塔基公司Multi-Change试剂盒按照生产商说明书制备的。用司查塔基公司QuikChange试剂盒按照生产商说明书制备W130F突变，唯一的例外是PCR反应的延伸温度降低至66℃。用<www.stratagene.com>上的QuikChange多试剂盒引物设计工具设计用于Multi-Change试剂盒的引物，除了W130F单独突变引物。

下表21列出了引物序列：

表21

引物	序列(5’-3’)
		aspCW130F_反向 aspCW130F_正向 R122G-1^a P9T_4^a I68V-1^a T156A^a	CGCTCTTATGGTTCGGTTTGCTTGGGTTGCTCACCC (SEQ ID NO：9) GGGTGAGCAACCCAAGCTTTCCGAACCATAAGAGCG (SEQ ID NO：10) CAAAAAATACCAGCGTTAAGGGAGTGTGGGTGAGCAACC (SEQ ID NO：11) CATTACCGCCGCTACTGCCGACCCGATTC (SEQ ID NO：12) CACCAAAAATTACCTCGGCGTAGACGGCATCCCTGAATT (SEQ ID NO：13) TGATGCGGAAAATCACGCTCTTGACTTCGATGCAC (SEQ ID NO：14)

^a指通过5’磷酸化修饰的引物

表达HEXaspC突变基因和分析酶活性

由新鲜平板或下述菌株的冷冻甘油储液接种Novagen Overnight Express^TM自身诱导系统2(目录号71366-3；溶液1-6)的液体培养物(5mL)：

大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCpET23a

大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCW130FpET23a

大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCT156ApET23a

大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCP9T/T156ApET23a

大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCP9T/R122GpET23a

大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCR122G/T156ApET23a

37℃、230rpm培育该培养物6-8小时。测定各培养物的OD₆₀₀，计算在25mL体系中使OD₆₀₀达到0.03-0.05所需的培养物体积。将计算好体积的各液体培养物转移到含有25mL相同培养基的烧瓶中。Overnight Express^TM自身诱导系统2是通过采用乳糖作为诱导剂并且不需要监测细胞生长的IPTG诱导性表达系统高水平表达的化学成分确定的完全培养基。30℃、230rpm振荡培育该Overnight Express培养物18小时。离心收获细胞，用冷50mM MOPS，pH 7.0洗涤一次。然后，按照诺华基公司(Novagen)推荐方案用含有1μL/mL Benzonase核酸酶(诺华基公司(Novagen)目录号70746-3)、5μL/mL蛋白酶抑制剂混合组II(诺华基公司(Novagen)目录号539132)和0.33μL/10mL r-溶菌酶(诺华基公司(Novagen)目录号71110-3)的Bugbuster^TM(无伯胺)提取试剂(诺华基公司(Novagen)目录号70923-3)裂解细胞。在温和振荡下25℃培育15分钟后，通过21,000g、4℃离心15分钟收集各悬液中的细胞碎片。小心地倾析上清液，作为无细胞提取物进行分析。通过以下步骤包含体组分：将细胞碎片组分悬浮于30％Bugbuster^TM(无伯胺)提取试剂中，21,000xg离心10分钟；将离心的沉淀悬浮于10％Bugbuster^TM(无伯胺)提取试剂，再次离心以分离洗涤过的沉淀。

用SDS-PAGE在4-15％梯度凝胶(伯乐公司#161-1104)上分析无细胞提取物和包含体组分中的蛋白质表达情况。在细胞提取物样品中，各凝胶泳道中加入20微克可溶性蛋白(与1X蛋白加样缓冲液预混并于95℃加热5分钟)。将包含体组分溶解于1X蛋白加样缓冲液(0.2mL)，于95℃加热10分钟，每条凝胶泳道加载5μL各溶液。与加入各条泳道的总可溶蛋白质相比，用Labworks生物成像1D-凝胶工具(UVP公司，Upland，CA)通过条带强度分析计算各HEX突变体的量，见下表22：

表22

样品	HEXaspC蛋白/总可溶蛋白质
		大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCP9T/T156ApET23a CFE	0.310
大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCP9T/R122ApET23a CFE	0.145
		大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCpET23a CFE	0.172
大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCR122A/T156ApET23a CFE	0.174
		大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCW130FpET23a CFE	0.114
大肠杆菌BL21(DE3)::HEXaspCT156ApET23a CFE	0.120

凝胶分析显示，HEXaspCR122A/T156A突变体是发现在包含体中大量表达的唯一蛋白质。HEXaspCP9T/T156A蛋白的表达水平最高，比HEXaspC蛋白高约90％。相反，W130F、T156A和P9T/R122G蛋白的表达水平低于HEXaspC。

用以下反应条件检测HEXaspC突变蛋白产生S，S-莫纳甜的活性：每1mL反应含有50mM TAPS，pH 8.2，4mM MgCl₂，3mM磷酸钠，pH 8.0，200mM丙酮酸钠(pH调节至8)，5mMα-酮戊二酸(pH调节至8)，50mM色氨酸，0.05mM吡哆醛-3-磷酸，50μg/mL ProA醛缩酶(作为无细胞提取物加入)和不同浓度(约50和500μg/mL)的转氨酶(作为无细胞提取物加入)。用脱气的水制备储液，并将反应混合物的体积调节至1.0mL。在加入所述酶之前加入吡哆醛磷酸。30℃、温和振荡培育反应试管4小时。加入酶1、2和4小时后取出样品(0.01mL)，过滤，并用LC/MS/MS分析，如实施例1所述。根据反应中存在的转氨酶量标准化莫纳甜产量。

在这些测定条件下，HEXaspC和HEXaspCT156A每毫克转氨酶产生了最多的总莫纳甜，而P9T/R122G蛋白产生的最少，其次是HEXaspCW130F。HEXaspCW130F和P9T/R122G酶显示出对S-MP的立体选择性最高(大于98％S，S-莫纳甜)，即使采用高浓度的酶(大于300μg/mL)。在含有高浓度的P9T/T156A酶的酶反应中S，S-莫纳甜产物的百分数降低至90％以下。其它突变体的产物立体选择性与原来的HEXaspC突变体非常相似(约95％S，S-莫纳甜)。实施例1所述的用FDAA衍生试剂分析含有HEXaspC酶的反应产物显示出，形成的第二种立体异构体是R，S-莫纳甜。

测定色氨酸和莫纳甜转氨酶活性

检测突变体用S，S莫纳甜和L-色氨酸作为底物的转氨活性。在形成反应副产物谷氨酸后，用HPLC OPA-柱后衍生法测定转氨酶活性(如实施例1所述)。1.0mL反应混合物含有100mM HEPPS缓冲液，pH 8.0，20mMα-酮戊二酸，0.08mM吡哆醛磷酸，25mM色氨酸或S，S莫纳甜和酶(以2.5mg细胞提取物蛋白质的形式提供)。除酶以外的所有组分混合在一起。加入酶以启动该反应，30℃(温和振荡)培育该反应溶液90分钟。一式两份地进行反应，阴性对照中不加酶。通过加入10％甲酸(终浓度)终止该反应，21,000rpm离心该混合物，小心去除上清液并过滤。根据谷氨酸背景水平和加入酸沉淀蛋白质时的稀释度校正数据，然后用突变转氨酶的加入量标准化。色氨酸用作底物时，每毫克HEXaspC转氨酶每小时产生13.0mM谷氨酸。突变体的相对活性(表示为百分数)如下：HEXaspCW130F(156％)、HEXaspCT156A(151％)、HEXaspCP9T/T156A(63.7％)、HEXaspCP9T/R122G(116％)和HEXaspCR122G/T156A(107％)。S，S莫纳甜用作底物时，每毫克HEXaspC转氨酶每小时产生7.43mM谷氨酸。突变体的相对活性(表示为百分数)如下：HEXaspCW130F(113％)、HEXaspCT156A(87.7％)、HEXaspCP9T/T156A(67.3％)、HEXaspCP9T/R122G(11.2％)和HEXaspCR122G/T156A(114％)。

HEXaspCP9T/R122G突变体使色氨酸转变为吲哚-3-丙酮酸的活性提高，但对S，S 莫纳甜转氨的活性降低。该突变体对色氨酸的活性与对莫纳甜的活性之比为18.2，而HEXaspC的该项比值为1.75，这使其成为采用需要L-转氨酶的途径(如实施例9和10(2)所述)产生R，R莫纳甜的良好候选物。同样，HEXaspCP9T/R122G是对S，S莫纳甜以及MP的活性有限的转氨酶的例子。

大多数突变体提高了L-色氨酸活性，但仅有两种突变体提高了L-色氨酸和S，S莫纳甜的活性(HEXaspCW130F和HEXaspCR122G/T156A)。因为这些试验中采用25mM底物，酶最可能被饱和，活性反应了该酶的k_cat。然而，在进行产生S，S莫纳甜的试验的条件下，S-MP浓度不可能足够饱和该酶，因此由于K_m的增加抵消了k_cat 的增加，所以S，S莫纳甜产量总体上没有增加。已报道，对于相似底物，一些突变体不仅能提高k_cat，而且提高氨基酸底物的表观K_m。如果采用浓度增加的底物，预计与HEXaspC相比这两种突变体都对S，S莫纳甜的生产速率有利。在产生S，S莫纳甜的上述条件下，HEXaspCT156A突变似乎提高了色氨酸转氨速率，但对MP转氨速率无显著影响。

通过比较HEXaspC和一种芽孢杆菌D-转氨酶的结构(参见例如，Sugio，S，等，Biochemistry 34：9661-9669，(1995))，可将AspC的W130F、R122G、T156A和HEX突变与D-转氨酶结构中的相应残基作图。预计广泛特异性D-转氨酶中的相似突变会提高R，R莫纳甜的总产量，如实施例3所述。例如，the functionality providedby色氨酸130in AspC is replaced in芽孢杆菌D-转氨酶by氢键ing be吐温the侧链of丝氨酸179-181和谷氨酸166(YM-1编号方案)。为了降低位阻，可将谷氨酸突变为天冬氨酸残基。一些D-转氨酶在位置179上含有苏氨酸残基，这会提高位阻，应该避免。球形芽孢杆菌酶的位置181上用丙氨酸取代了丝氨酸，这也可能降低位阻。

来自天冬氨酸转氨酶研究的其它信息也可应用于D-转氨酶。虽然AspC酶在与二羧酸底物的侧链相互作用的活性位点中含有精氨酸，但D-转氨酶含有Ser240-Ser243的环。Ser240、Thr242和Ser243侧链面对相同方向并与Ser180的羟基形成口袋，它提供了非极性和极性底物可相互作用的表面。Ser180参与了PLP结合；然而，为了提高D-转氨酶对R-MP的活性，可修饰Ser240、Thr242或Ser243残基，以接受较大的底物或有利于带负电的底物。例如，可将Thr242突变为Ser以缩短侧链长度。可将一个残基突变为赖氨酸或精氨酸如Ser243。残基(YM-1编号)Val30-Val36位于跨D-转氨酶活性位点的β链，对活性也很重要。认为Tyr31、Val33、Glu32和Lys35面对活性位点。Tyr31、Glu32和Val33在所有芽孢杆菌同源物中不变。Ro等，FEBS Lett 398：141-145，(1996))将Val33诱变为Ala，并发现对α- 酮戊二酸转氨的催化效率略有增加，对较大底物(位阻较小)的催化效率显著提高。在一些同源物中，用Arg取代Lys35，但如果考虑位阻，可能优选Lys残基。缬氨酸34和36也优于保守取代如异亮氨酸，同样也是由于对大分子如MP的位阻较小。因为实施例15和16所述的新型D-转氨酶(“4978”)的活性高于实施例19所述的球形芽孢杆菌酶和杂交DAT，所以它是进行进一步诱变反应的当然选择。根据YM-1D-转氨酶的晶体结构分析，上述构思可应用于来自ATCC菌株4978的D-转氨酶。上述编号比4978蛋白序列中的相应氨基酸少一个氨基酸。

实施例7

利用支链转氨酶(″BCAT″)生产莫纳甜

AT-102和AT-104是购自生物催化公司(Pasadena，CA)的支链L-转氨酶(EC2.6.1.42)。用化学方法生产的S，S和R，R莫纳甜底物检测该酶的转氨活性。在总体积0.5mL中一式两份地进行反应。该试验含有50mM Tris pH 7.8、0.08mM PLP、10mMα-酮戊二酸(″α-KG″)、5mM莫纳甜和1mg/mL转氨酶。阴性对照不含外源性转氨酶。30℃、100rpm振荡下培育该样品2小时。过滤该样品，如实施例1所述进行LC/MS/MS分析以确定谷氨酸水平。谷氨酸水平在化学计量上应与MP产量相关联。R，R用作反应底物时，阴性对照中存在非常低水平的谷氨酸。AT-104产生的谷氨酸略高于阴性对照，这表明对R，R莫纳甜底物(D-氨基酸)的活性水平低。两种支链L-转氨酶都对S，S莫纳甜有活性。AT-102产生102μg/mL谷氨酸，AT-104产生64μg/mL谷氨酸。为了对比，广泛特异性转氨酶(AT-101，也来自生物催化公司)在这些条件下产生75μg/mL。对支链转氨酶的活性高有些出乎意料，因为莫纳甜与通常用作广泛特异性或天冬氨酸转氨酶的底物的二羧基氨基酸和芳族氨基酸的结构很相似。然而，由于莫纳甜的谷氨酸主链，可将谷氨酸用作氨基供体的许多转氨酶也可能对莫纳甜有活性。

用BCAT由吲哚-3-丙酮酸产生莫纳甜

检测在采用睾丸酮丛毛单胞菌的ProA醛缩酶(如WO 03091396 A2所述产生)的偶联反应中AT-102和AT-104产生的莫纳甜。将酶和其它组分/底物直接加入试剂盒提供的反应缓冲液中，所述缓冲液中含有100mM磷酸钾缓冲液pH 7.5、100mM L-谷氨酸和0.1mM PLP。向1mL反应缓冲液中加入：4mg吲哚-3-丙酮酸、20mg丙酮酸、约50μg ProA(在细胞提取物中提供)、1μL 2M MgCl₂和2mg待测转氨酶。一式两份地进行所有反应，在不加入额外转氨酶的情况下进行阴性对照反应。用阳性对照(AT-101)进行比较；此酶是广泛特异性L-转氨酶。莫纳甜的背景生产是由于重组ProA酶的细胞提取物中存在天然大肠杆菌转氨酶。30℃、温和振荡(100rpm)下培育该反应过夜。过滤该样品，如实施例1所述进行反向LC/MS/MS分析。结果见下表23。

表23

酶	产生的莫纳甜(g/mL)
		AT-101	173.05
AT-102	122.05
		AT-104	133.05
阴性	73.25

AT-102和AT-104转氨酶产生的莫纳甜的确比阴性对照多，约为阳性对照活性的50-60％。

充分研究了大肠杆菌的支链转氨酶，详细分析了晶体结构。Okada，K.等(1997)J.Biochem(东京)121：637-641，(1997)。该酶与如实施例2、3和6所述的芽孢杆菌D-转氨酶有相似的总体折叠和显著的序列同源性。此外，芽孢杆菌的BCAT酶和D-转氨酶是仅有的两种类型的PLP-依赖性转氨酶，显示出将氢加入PLP的立体特异性。Yoshimura，T.，等，J.Am.Chem.Soc.115：3897-3900，(1993)。认为BCAT是唯一一种α-氨基酸底物结合于与磷酸基团位于同一侧的羧基的酶，使该酶与D-转氨酶具有相似的折叠和机制，同时仍保持对L-氨基酸的特异性。Peisach，D.等，Biochemistry37：4958-4967，(1998)。认为BCAT的L特异性源于确定底物α-羧基的位置的D-转氨酶的极性氨基酸侧链被BCAT中的非极性残基取代。我们预计，如果全部或一部分残基突变为芽孢杆菌D-转氨酶的相应氨基酸，可将BCAT转变为D-特异性转氨酶。可对大肠杆菌BCAT产生以下突变(根据登录号gi：14719463编号)：Phe37至Tyr、Val110至His、Met108至Arg。也可在这些位点上产生其它极性氨基酸取代，以修饰该酶的活性位点，以接受大的二羧酸底物，如实施例6所述。可能需要将Tyr165转变为Leu，以反应PLP与D-转氨酶的相互作用；也可能需要突变Tyr96(至Phe)、Arg41和Arg98，以防止α羧基以不正确的取向结合于BCAT酶。也可将Trp127突变为Tyr，以降低疏水性侧链以pro-S构型结合的概率；Tyr32和Tyr130可与BCAT活性位点上的L-谷氨酸相互作用，并可突变为带负电的氨基酸，以最大程度减轻这种相互作用。Goto，M.等，Biochemistry 42：3725-3733，(2003)；Okada，K.，Biochemistry 40：7453-7463，(2001)。

因为D-转氨酶和支链转氨酶具有产生莫纳甜的活性，预计可将BCAT转变为在R，R莫纳甜生产中有活性的D-转氨酶，同时提供另一种可能的D-转氨酶，以用于许多实施例所述的反应方案。根据上述结果，AT-104酶可能已经显示出对D-氨基构型的莫纳甜有一些活性。

芽孢杆菌支链转氨酶克隆和诱变

地衣芽孢杆菌含有推定的支链转氨酶，与大肠杆菌支链转氨酶相比，它与D-转氨酶的相关性更高。检测了它的D-转氨活性，根据上述大肠杆菌BCAT中预测的活性位点残基诱变。

菌株

在营养琼脂上、30℃培养地衣芽孢杆菌(ATCC编号14580)过夜。将菌落群加入100μL无菌水中，95℃加热10分钟，以破坏细胞。将3μL用于后续的聚合酶链反应(PCR)扩增。

聚合酶链反应方案

设计地衣芽孢杆菌基因(915bp)的引物，以用NcoI和SalI位点将其克隆到pET28b和pET 30a载体(诺华基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)以及pTRC99a(GE保健生命科学(GE Healthcare Life Sciences))中。pET30构建物含有N-末端His-标签和S-标签，而pET 28构建物未标记。

地衣芽孢杆菌bcat引物：

N端：5’-GGTTAAGGCCATGGGGGACCAGAAAGACCA-3′(SEQ ID NO：44)；和

C端：5’-GGCCTTCCGTCGACTCAGCTGACACTTAAGCT-3’(SEQ ID NO：45)

用以下PCR方案扩增编码区。在50μL反应中，采用3μL模板、1μM各引物、0.4mM各dNTP、3.5U Expand高保真聚合酶和含有Mg的1X Expand^TM缓冲液(罗氏公司(Roche)，Indianapolis，IN)。所用热循环程序包括96℃热启动5分钟，接着是30个以下步骤的循环：94℃30秒，50℃1分钟45秒，72℃2分钟15秒。30个循环后，将样品维持在72℃7分钟，然后储存于4℃。获得大小正确(约900bp)的洁净PCR产物。

克隆

纯化PCR产物，并用SalI和NcoI在SalI缓冲液(新英格兰生物实验室公司，Ipswich，MA)中消化。用凯杰QIAquick凝胶抽提试剂盒纯化消化的载体(pET28、pET30和pTRC99a)和插入物。用罗氏快速DNA连接试剂盒(罗氏公司(Roche))完成连接并纯化。如伯乐电穿孔手册所述，用0.2cm试管和伯乐基因脉冲II系统将连接物转化到大肠杆菌DH10B中。使细胞在900μL SOC培养基中37℃、225rpm恢复30分钟。将细胞接种于含有卡那霉素(25μg/mL)的LB-琼脂平板。用凯杰离心小抽试剂盒纯化质粒DNA，并通过SalI和NcoI限制性消化筛选正确的插入物。由阿吉科特生物科学公司(Agencour Biosciences Corporation，Beverly，MA)用双脱氧链终止DNA测序法验证看起来含有正确插入物的质粒序列。测序验证了NCBI登录号CP000002 GI 56160984 2851268..2850354中发现的编码序列，该编码序列能产生含有如登录号AAU24468 GI：52004526所列的氨基酸序列的蛋白质。

基因表达和测定

以pET载体构建物的形式将质粒DNA(pET载体)转化到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(诺华基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)中。培养该培养物，用凯杰小抽试剂盒分离质粒，通过限制性消化分析以确认其身份。一般在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中进行诱导。于37℃将细胞培养至OD₆₀₀为0.4-0.8，用0.1mMIPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导，诱导后3-4小时取样。按照Novagen BugBuster^TM 试剂(加入Benzonase核酸酶和罗氏(Roche)完全蛋白酶抑制剂混合物)所附的说明书制备细胞提取物。经过SDS-PAGE检测，在预测分子量处获得高水平可溶性蛋白。用SDS-PAGE分离细胞提取物中的可溶性蛋白。

用以下方案分析细胞提取物中由丙酮酸产生丙氨酸(或由α-酮戊二酸产生谷氨酸)后的D-转氨酶活性和D-色氨酸。一般在100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)，50μM吡哆醛磷酸、25mM丙酮酸钠和50mM D-色氨酸中进行两份1mL反应。通过加入无细胞提取物或纯化酶启动该反应，30℃培育15分钟过夜(温和振荡)。在各试验中加入浓度大约相同的D-转氨酶(一般约0.5mg)以进行比较，AT-103(生物催化公司)常常用作基准酶。加入甲酸，使终浓度为2％，以终止该反应，离心去除沉淀的蛋白质。也进行未加入蛋白质的对照反应。时间零点也用作阴性对照。用实施例1所述的OPA衍生法检测丙氨酸和谷氨酸。与AT-103和球形芽孢杆菌酶相比，支链转氨酶的D-转氨酶活性水平低。

也检测了支链转氨酶由D-色氨酸产生莫纳甜的能力(如实施例3)，但在测试条件下似乎没有活性。

将pTRC99a构建物转化到电感受态大肠杆菌CAG18455细胞中，该菌株是色氨酸生产的营养缺陷型。用含有Balch维生素和100mg/L L-色氨酸、0.4％葡萄糖和氯化钙的M9极限培养基培养细胞。细胞不能在没有L-色氨酸的条件下生长。OD600为0.4时，以10、100和1000μM IPTG检测诱导4.5小时。可以在SDS-PAGE上观察到MW正确的条带。用QuikChange多位点定位诱变试剂盒(司查塔基公司)诱变质粒。如生产商所述设计下表24中的引物。

表24

氨基酸突变 (大肠杆菌编号)	核苷酸突变(地衣芽孢杆菌(B.lich)编号)	引物序列
			Y32F	tac96-->ttc	ATCACGGATTTTTATTCGGGGACGGCGTG(SEQ ID NO：46)
Y32D	tac96-->gac	ATCACGGATTTTTAGACGGGGACGGCGTG(SEQ ID NO：47)
			F37Y	ttt111-->tat	GGACGGCGTGTATGAAGGGATCAGGG(SEQ ID NO：48)
R41K	agg123-->aag	TGTTTGAAGGGATCAAGGTATACGACGGCAAC(SEQ ID NO： 49)
			F37Y+R41K		GACGGCGTGTATGAAGGGATCAAGGTATACGACG(SEQ ID NO：50)
Y96F	tac276-->ttc	GCTGAAAGACGCTTTCATCCGCTTGGTCG(SEQ ID NO：51)
			Y96H	tac276-->cac	GCTGAAAGACGCTCACATCCGCTTGGTC(SEQ ID NO：52)
R98Y	cgc282-->tac	CTGAAAGACGCTTACATCTACTTGGTCGTTTCAAGAGG(SEQ ID NO：53)
			Y96F+R98Y		GGCTGAAAGACGCTTTCATCTACTTGGTCGTTTCAAGAGG (SEQ ID NO：54)
Y96H+R98Y		GCTGAAAGACGCTCACATCTACTTGGTCGTTTCAAGAGG(SEQ ID NO：55)
			L108R	ctc312-->cgc	GCAGGTGACCGCGGACTCGATCCAAAC(SEQ ID NO：56)
L110H	ctc318-->cac	GCAGGTGACCTCGGACACGATCCAAAC(SEQ ID NO：57)
			L108R+L110H		GCAGGTGACCGCGGACACGATCCAAACAATTG(SEQ ID NO： 58)
L127Y	ttg369-->tac	GTCATCATAATTGTCGAACCATACGCAATATTCCCGAAAC (SEQ ID NO：59)
			L127K	ttg369-->aag	GTCATCATAATTGTCGAACCAAAGGCAATATTCCCGAAAC (SEQ ID NO：60)
I130E	ata375-->gaa	GTCATCATAATTGTCGAACCATTGGCAGAATTCCCGAAAC (SEQ ID NO：61)
			L127Y+I130E		CGAGTGTCATCATAATTGTCGAACCATACGCAGAATTCCCGAA AC(SEQ ID NO：62)
L127K+I130E		CCGAGTGTCATCATAATTGTCGAACCAAAGGCAGAATTCCCG AAAC(SEQ ID NO：63)
			Y165L	tac477-->ttg	AATCGCTGAACTTGTTAAACAATATTCTTGTCCGGATCGAGG (SEQ ID NO：64)

氨基酸突变是基于大肠杆菌BCAT的晶体结构，上表中的编号是针对大肠杆菌蛋白。DNA突变的编号基于地衣芽孢杆菌bcat基因。

将引物稀释至0.1mg/mL，一般将约100ng各寡核苷酸引物用于50μL诱变反应，较大引物的应用浓度按比例升高。主要竞争退火至相同模板区的寡核苷酸引物，有时共计100ng用于该区域的整个引物库。将200纳克模板(pTRC99a中的地衣芽孢杆菌bcat)用于该反应，混合5μL 10X QuikChange缓冲液、2μL dNTP和2μL酶。用DpnI限制性核酸内切酶(司查塔基公司)(2μL)37℃处理扩增产物2小时，转移到1.5mL厚壁试管中用乙醇沉淀。将重悬(浓缩)的反应混合物(2.5μL)转化到QuikChange试剂盒中所含的XL10-Gold Ultracomp细胞中。小抽几个菌落并进行测序，以保证突变是随机突变并评估实现的诱变水平。从平板中重悬菌落，进行大量小抽操作。然后将小抽DNA转化到色氨酸营养缺陷型菌株中，并接种于上述极限培养基(含有IPTG)或采用含有D-色氨酸作为唯一氮源的极限培养基中。用似乎无法良好地整合到上述轮次中的引物对大量小抽物进行第二和第三轮诱变。在各阶段，保留在极限培养基上快速生长的菌落(较大菌落)进行进一步分析。下表25所示的突变体分离自选择平板。在一些情况下，这些相同的突变体在选择培养基上出现一次以上。

表25

克隆	突变
		4	F37Y、Y96F
6	Y96F
		28	F37Y、Y165L
32	Y96F、L127K
		5-1	F37Y、Y96F、R98Y、L108R、L110H、L127Y
5-2	F37Y、R41K、Y96F、R98Y、L108R、L110H、L127Y

诱导突变的构建物，以在LB培养基中制备重组蛋白，如上所述制备细胞提取物。在伯乐实验室Experion自动电泳台上上分离细胞提取物中的可溶性蛋白，并用Experion软件1.1.98.0版分析浓度和表达百分数。观察到可溶性重组蛋白的水平非常低；因此不可能定量感兴趣的条带。如上所述用50-250μL细胞提取物进行试验以检测D-色氨酸转氨。用α-酮戊二酸和丙酮酸作为氨基接受体检测菌落4、6、28和32，培育2小时，30℃培育过夜。减去细胞提取物中丙氨酸/谷氨酸的背景水平。用5-1和5-2进行的试验中，经Experion软件评估，BCAT的蛋白浓度为：野生型酶275.1ng/μl，BCAT 5-1为409.3ng/μl，BCAT 5-2为148.2ng/μl。试验结果见下表26-28。

表26

BCAT	谷氨酸(mM) 2小时	谷氨酸(mM) 过夜
			野生型(100μL)	0.0912	0.2304
野生型(250μL)	0.251	0.521
			4(100μL)	0.0642	0.1202
4(250μL)	0.154	0.295
			6(100μL)	0.053	0.112
6(250μL)	0.141	0.289
			28(100μL)	0.0586	0.1402
28(250μL)	0.155	0.367
			32(100μL)	0.0616	0.1236
32(250μL)	0.167	0.339

表27

BCAT	丙氨酸(mM) 2小时	丙氨酸(mM) 过夜
			野生型(250μL)	0.199	0.438
4(250μL)	0.093	0.249
			6(250μL)	0.097	0.249
28(250μL)	0.117	0.325
			32(250μL)	0.102	0.285

表28

BCAT	谷氨酸(mM) 1小时	谷氨酸(mM) 过夜
			野生型(50μL)	0.018	0.075
野生型(100μL)	0.037	0.152
			5-1(50μL)	0.005	0.017
5-1(100μL)	0.01	0.045
			5-2(50μL)	0.001	0.011
5-2(100μL)	0.003	0.031

很显然，就像大多数L-转氨酶那样，与丙酮酸相比，该酶优选α-酮戊二酸作为氨基接受体。所有突变体都具有D-转氨酶活性，正如其野生型亲本那样。尚不明了，野生型酶的D-转氨酶活性是较高还是较低，因为不可能由细胞提取物准确定量BCAT蛋白。然而，预计突变酶的L-转氨酶活性低于野生型；因此提高了D-与L-转氨速率之比。继续诱变可提供产生莫纳甜的途径中的另一种酶。

实施例8

谷氨酸和天冬氨酸消旋酶的克隆、表达和检测

本实施例秒后速了用于克隆和检测氨基酸消旋酶的方法，该方法可用于在L-谷氨酸和D-谷氨酸(或者L-和D-天冬氨酸或L-和D-丙氨酸)之间互相转变。当该途径的一个步骤产生L-氨基酸(如L-谷氨酸、L-天冬氨酸或L-丙氨酸)和该途径的另一步骤消耗D-氨基酸(如D-谷氨酸、D-天冬氨酸或D-丙氨酸)时，谷氨酸、天冬氨酸或丙氨酸消旋酶可用于产生R，R莫纳甜的生物合成途径。图4说明了采用L-色氨酸-特异性转氨酶、R-特异性醛缩酶、D-转氨酶和谷氨酸(或天冬氨酸或丙氨酸)消旋酶由L-色氨酸生产R，R莫纳甜的生物合成途径。

将基因克隆入pET28和pET30载体中，产生未标记蛋白和带有可切割N末端HIS₆-标签/T7-标签的融合蛋白。用固定的金属亲和色谱纯化得到的蛋白质。

实验概述

克隆短乳杆菌的谷氨酸消旋酶(EC 5.1.1.3)的编码基因(Genbank登录号D29627，核酸序列)和戊糖片球菌的谷氨酸消旋酶的编码基因(murI基因)(Genbank登录号L22789)，并在大肠杆菌中表达。检测该提取物将L-谷氨酸转变为D-谷氨酸和将D-谷氨酸转变为L-谷氨酸的活性。也检测了生物催化公司(BioCatalytics)天冬氨酸消旋酶(EC 5.1.1.13)使L-和D-天冬氨酸相互转变的能力。

分离用于克隆的基因组DNA

短乳杆菌基因组DNA(ATCC 8287D)获自美国典型培养物保藏中心。用乳杆菌MRS肉汤37℃培养戊糖片球菌(ATCC 25745)，取2ml以Mekalanos，J.J.，″Duplicationand amplification of toxin genes in Vibrio cholerae(霍乱弧菌的毒素基因的倍增和扩增)″Cell 35：253-263，(1983)所述的方法分离基因组DNA。

聚合酶链反应方案

设计含有5’限制性位点和突出端的引物，以克隆到pET28和pET30载体(诺华基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)中。

短乳杆菌谷氨酸消旋酶引物：

N端：5′-GCGGCGCCATGGAAAATGATCCGATTGGTCTAATG-3’(SEQ ID NO：15)，和

C端：5′-GCGGCGGTCGACGCAATTACAATTGTGTTTGTC-3’(SEQ ID NO：16)。

戊糖片球菌谷氨酸消旋酶引物：

N端：5′-GCGGCGCCATGGATGTATGTATAATTTTATTTAG-3’(SEQ IDNO：17)，和

C端：5′-GCGGCGGTCGACAAATTTCATTATTCATTCTAATTT-3’(SEQ IDNO：18)。

用以下PCR方案扩增衍生自短乳杆菌的基因。在50μL反应中，采用0.150μg模板、1.6μM各引物、0.4mM各dNTP、2.8U Expand高保真^TM聚合酶(罗氏公司(Roche)，Indianapolis，IN)、0.5U Pfu聚合酶(司查塔基公司，加利福尼亚州拉霍亚)和含有Mg的1X Expand^TM缓冲液。所用的热循环程序包括96℃热启动3分钟，8个下述步骤的循环：94℃30秒，52℃45秒，72℃2分钟；然后是22个下述步骤的循环：94℃30秒，60℃45秒，72℃2分钟。22个循环后，将样品维持于72℃7分钟，然后储存于4℃。经过与DNA大小标记物比较，这种PCR方案产生～830bp的产物。

用以下PCR方案扩增衍生自戊糖片球菌的基因。在50μL反应中，采用0.15μg 模板、1.6μM各引物、0.4mM各dNTP、2.8U Expand高保真^TM聚合酶、0.5U Pfu聚合酶和含有Mg的1X Expand^TM缓冲液。所用的热循环程序包括96℃热启动3分钟，然后是8个下述步骤的循环：94℃30秒，37℃45秒，72℃2分钟；然后是8个下述步骤的循环：94℃30秒，45℃45秒，72℃2分钟，然后是14个下述步骤的循环：94℃30秒，55℃45秒，72℃2分钟。14个循环后，将样品维持于72℃7分钟，然后储存于4℃。经过与DNA大小标记物比较，这种PCR方案产生～840bp的产物。

克隆

用凯杰凝胶提取试剂盒(Valencia，CA)由0.8％TAE-琼脂糖凝胶凝胶纯化PCR产物。PCR产物用SmartSpec 3000^TM分光光度计定量。按照生产商(新英格兰生物实验室公司，Beverly，MA)推荐方案用限制性酶NcoI和SalI消化，用凯杰凝胶提取试剂盒由0.8％TAE-琼脂糖凝胶中凝胶纯化。通过限制性酶NcoI和SalI消化制备载体pET28和pET30，然后用虾碱性磷酸酶处理，用凯杰凝胶提取试剂盒由0.8％TAE-琼脂糖凝胶中纯化。

用Rapid^TM DNA连接试剂盒(罗氏公司(Roche)，Indianapolis，IN)连接消化的载体和插入物。约50ng处理的插入物、100ng处理的载体(插入物∶载体的摩尔比为3∶1)、5U T4 DNA连接酶(Rapid^TM DNA连接试剂盒中包含)和1X连接缓冲液室温下培育5分钟。用高纯度PCR产物纯化试剂盒(罗氏公司)纯化连接反应，并用于转化大肠杆菌DH10B电感受态细胞(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)。将10μL各连接反应加入40μL DH10B细胞中，用伯乐基因脉冲器II在以下条件下电穿孔以进行转化：0.2cm试管中2.5kV，25μF，200ohm。使细胞在1mL室温SOC中37℃、225rpm振荡恢复1小时。将该细胞接种于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上。

用凯杰离心小抽试剂盒由得到的转化子纯化质粒DNA，并用NcoI和SalI的限制性消化筛选正确插入物。通过双脱氧链终止DNA测序法验证似乎含有正确插入物的质粒序列。

基因表达和试验

将经过序列分析验证的质粒DNA亚克隆到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(诺华基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)中。培养该培养物，用凯杰小抽试剂盒分离质粒，并用限制性消化分析以确定其身份。

最初用pET28(未标记)和pET30(组氨酸标记)载体中的短乳杆菌和戊糖片球菌谷氨酸消旋酶在BL21(DE3)中进行诱导。通过使培养物在含有卡那霉素(50mg/L)的250 mL LB上生长至OD₆₀₀0.5-0.6进行时程研究，用100mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导，诱导3后0小时和3小时取样。将600μL(0小时)和275μL(3小时)的细胞重悬于含有2-巯基乙醇的40μL十二烷基硫酸钠缓冲液中，95℃加热10分钟，然后冷却。采用4-15％梯度凝胶的SDS-PAGE分析这些细胞总蛋白样品的等份。

由3小时培养物制备细胞提取物，具体为将来自5mL培养物的细胞团块悬浮于含有0.625μL Benzonase核酸酶和3μL蛋白酶抑制剂混合物组#3(卡巴凯-诺巴凯公司(Calbiochem-Novabiochem Corp.)，加州圣地亚哥)的0.625mL Novagen BugBuster^TM 试剂中，室温下温和振荡20分钟，16,000xg离心以去除细胞碎片。将上清液(细胞提取物)加到4-15％梯度凝胶上，以分析细胞可溶蛋白。

来自克隆的短乳杆菌谷氨酸消旋酶和戊糖片球菌谷氨酸消旋酶的3小时样品显示出对应于正确大小(约31kDa)的总可溶性蛋白。短乳杆菌pET30(组氨酸-标记)基因产物过表达，其表达水平和溶解性(＞可溶性蛋白的20％)均高于短乳杆菌pET28(未标记)基因产物以及两种载体中的戊糖片球菌基因产物。戊糖片球菌基因产物在pET28和pET30载体中的过度表达和溶解性相等，显著小于短乳杆菌pET30基因产物中观察到的结果。

离心来自诱导培养物(250mL)的细胞，用0.85％NaCl洗涤一次。将细胞团块重悬于含有5μL/mL蛋白酶抑制剂混合物组#3(卡巴凯-诺巴凯公司(Calbiochem-Novabiochem Corp.)，加州圣地亚哥)和1μL/mL Benzonase核酸酶的5mL BugBuster^TM(诺华基公司(Novagen))/g湿细胞重的试剂。在旋转振荡器上室温培育样品20分钟。16,000Xg、4℃离心20分钟以去除不溶性细胞碎片。

用以下方案检测细胞提取物的谷氨酸消旋酶活性。在10mM磷酸钾(pH 8.0)、0.2mM二硫苏糖醇(″DTT″)和10mM L-谷氨酸或D-谷氨酸中进行400-μL反应。通过加入20-100μL无细胞提取物启动该反应，室温培育。在1分钟、5分钟、10分钟、20分钟和1小时的时间点上取出样品等份(零分钟样品用作对照反应)。将2M甲酸(25μL)加入各40-μL样品等份中，以终止该反应，离心去除沉淀的蛋白质。去除上清液，冷冻于-80℃，直到用LC/MS/MS进行分析。

来自100mM IPTG诱导(3小时)的pET30的细胞提取物的试验结果显示：短乳杆菌(Genbank登录号BAA06106.1 GI：468450)和戊糖片球菌(Genbank登录号AAA16761.1 GI：349029)酶对谷氨酸异构体有显著的消旋酶活性。从任一底物开始，戊糖片球菌消旋酶(20μL细胞提取物)能在10-20分钟内达到L-和D-谷氨酸之间的平衡。短乳杆菌酶(20μL细胞提取物)也在约20分钟内达到平衡。

用类似于上述方案的方案检测购自生物催化公司(Pasadena，CA)的部分纯化的天冬氨酸消旋酶(目录号ASPR-101)对L-天冬氨酸和D-天冬氨酸的活性。市售酶对两种异构体都有消旋酶活性。采用0.5-1mg酶，在20-60分钟内达到平衡。

也用以下方案检测了所有三种消旋酶(短乳杆菌谷氨酸消旋酶、戊糖片球菌谷氨酸消旋酶和生物催化公司(BioCatalytics)天冬氨酸消旋酶)对S，S莫纳甜的活性。在10mM磷酸钾(pH 8.0)、0.2mM DTT和10mM S，S莫纳甜中进行400-μL反应。通过加入无细胞提取物(短乳杆菌和戊糖片球菌)或纯化酶(生物催化公司天冬氨酸消旋酶)启动该反应，室温培育。在1分钟、5分钟、10分钟、20分钟和1小时的时间点上取出样品等份(零分钟样品以及无酶样品用作对照反应)。将2M甲酸(25μL)加入各40-μL样品等份中，以终止该反应，离心去除沉淀的蛋白质。去除上清液，冷冻于-80℃，直到用LC/MS/MS进行分析(实施例1)。没有观察到S，S莫纳甜浓度随时间降低，S，R莫纳甜也没有任何增加(即使是无酶对照，最初也有＜5％污染性副产物)。因此，所测定的消旋酶都没有显示出对莫纳甜的活性。

实施例9

用丙氨酸、谷氨酸或天冬氨酸消旋酶由L-色氨酸产生R，R莫纳甜

本实施例描述了用L-色氨酸(L-酪氨酸或芳族氨基酸)转氨酶，ProA醛缩酶，丙氨酸、谷氨酸或天冬氨酸消旋酶和广泛特异性D-氨基酸转氨酶由L-色氨酸生产立体异构体富集的R，R莫纳甜的方法。图5是说明该途径的示意图。这种生产立体异构体富集的R，R莫纳甜的方法需要步骤1的酶由莫纳甜前体(MP)产生莫纳甜的活性低。根据早期结果，我们采用来自WO 03/091396 A2实施例1所述的苜蓿根瘤菌和类球红细菌tatA基因产物。

材料和方法

如实施例8所述，在大肠杆菌中生产来自短乳杆菌和戊糖片球菌的谷氨酸消旋酶。在一些情况下，用His-Bind 900柱按照生产商方案(诺华基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)纯化His₆标记的这些酶，用PD-10柱(G25 Sephadex，安法玛西亚公司(Amersham-Pharmacia))脱盐去除咪唑。用25mM磷酸钾pH 8.0洗脱这些酶。天冬氨酸消旋酶(ASPR-101)和D-转氨酶(AT-103)购自生物催化公司(BioCatalytics，Inc.)，丙氨酸消旋酶购自西格马公司(Sigma)(St.Louis，MO)(目录号A8936)。如WO03/091396 A2的实施例1所述制备苜蓿根瘤菌和球形红细菌(R.sphaeroides)酪氨酸(芳族氨基酸)转氨酶。如WO 03/091396 A2的实施例4所述制备睾丸酮丛毛单胞菌 ProA醛缩酶。用伯乐蛋白测定试剂盒按照生产商方案(Hercules，CA)进行总蛋白测定。

用消旋酶产生的S，S莫纳甜产量减少

反应混合物(1mL体积，一式两份)含有100mM磷酸钾缓冲液(pH 8)、2mMMgCl₂、0.05mM吡哆醛5′-磷酸(″PLP″)、200mM丙酮酸钠、5mMα-酮戊二酸钠或草酰乙酸钠、细胞提取物中提供的约280μg/mL苜蓿根瘤菌TatA、1mg/mL生物催化公司D-转氨酶(AT-103)、100μL/mL谷氨酸消旋酶细胞提取物或1mg/mL天冬氨酸消旋酶和作为细胞提取物提供的约100μg/mL ProA醛缩酶。加入固体色氨酸，使其浓度为10.2mg/ml。阴性对照不含消旋酶。30℃(250rpm振荡)培育样品1小时、2小时或过夜。离心样品以去除沉淀，用注射器过滤，储存于-80℃，然后用实施例1所述的LC/MS/MS法分析莫纳甜。

大多数样品含有＞95％的S，S莫纳甜，由于细胞提取物中存在的天然L-转氨酶的量。然而，由于消旋酶使L-谷氨酸不大可能用于MP的转氨作用，所以含有消旋酶的样品的总莫纳甜的含量降低。没有消旋酶时，在时程中产生1545-2355ppm莫纳甜(主要是S，S)。存在消旋酶时，仅产生340-879ppm(短乳杆菌酶)、444-531ppm(戊糖片球菌酶)和506-1460ppm莫纳甜(天冬氨酸消旋酶)。这些数据表明，消旋酶在产生莫纳甜所必需的反应条件下有活性。为了最大程度减少由细胞提取物酶如天冬氨酸转氨酶形成S，S莫纳甜，用纯化酶和较高比值的D-转氨酶∶L-转氨酶进行进一步试验。

将L-色氨酸转变为含4-R的莫纳甜异构体

用大约54μg纯化L-转氨酶(苜蓿根瘤菌或球形红细菌TatA)、1mg天冬氨酸转氨酶(生物催化公司)、1mg D-转氨酶、5mM作为氨基接受体的草酰乙酸和75μg纯化的醛缩酶重复上述反应。用2小时取样时间和过夜培育时间的样品一式两份地进行该反应。用不含消旋酶的苜蓿根瘤菌L-转氨酶进行阴性对照。除根据反相色谱对R，R/S，S和S，R/R，S莫纳甜峰值定量外，用FDAA实施例1所述的衍生技术确定各立体异构体的百分数。结果见下表29。

表29

L-转氨酶	培育时间	总莫纳甜(ppm)	％S，S	％R，R	％R，S	％S，R
							苜蓿根瘤菌TatA	2h	17.1	10.2	58.1	0.8	31.0
苜蓿根瘤菌TatA	2h	15.8	13.3	55.3	1.0	30.4
							苜蓿根瘤菌TatA	过夜	77.7	25.8	40.0	1.3	32.9
苜蓿根瘤菌TatA	过夜	67.9	29.4	37.3	1.5	31.8
							球形红细菌TatA	2h	241.2	96.3	2.3	0.8	0.6
球形红细菌TatA	2h	223.2	95.7	2.7	1.0	0.6
							球形红细菌TatA	过夜	600.4	96.6	1.8	0.5	1.1
球形红细菌TatA	过夜	618.5	96.1	2.1	0.5	1.3
							无消旋酶对照	2h	7.1	92.0	1.4	6.6	0.0
无消旋酶对照	2h	5.7	94.0	1.2	4.8	0.0
							无消旋酶对照	过夜	44.6	93.5	1.3	4.7	0.5
无消旋酶对照	过夜	37.5	95.4	0.9	3.7	0.0

很明显，苜蓿根瘤菌TatA用作L-色氨酸转氨所用酶时消旋酶的存在能增加莫纳甜的总产量。在2小时试验中，莫纳甜水平平均从6.4提高至16.5ppm，在过夜试验中动41提高至73ppm。此外，利用消旋酶使形成R，R的百分数从约1％提高至高达58％。莫纳甜的S，R立体异构体是另一种有效的甜味剂，它是另一种主要组分，从阴性对照中的接近0增加到31％。球形红细菌TatA对S-MP的活性明显高于苜蓿根瘤菌L-转氨酶，这表明莫纳甜的4-R异构体是所需产物时，含有与MP相比对L-色氨酸具有高度底物特异性的酶的重要性。在2小时时间点约10％总莫纳甜是4S时，可认为苜蓿根瘤菌TatA对MP的活性有限。

用纯化的苜蓿根瘤菌TatA(54μg)和短乳杆菌谷氨酸消旋酶重复该实验。采用纯化的谷氨酸消旋酶时，每1mL反应采用约64μg。也检测含有谷氨酸消旋酶的细胞提取物，并采用1.4mg可溶性蛋白。再次采用无消旋酶的阴性对照，所有样品一式两份地进行试验。结果见下表30。

表30

谷氨酸消旋酶	培育时间	总莫纳甜(ppm)	％S，S	％R，R	％R，S	％S，R
							短乳杆菌(纯化)	2h	3.3	49.1	34.2	3.7	13.0
短乳杆菌(纯化)	2h	3.6	47.9	35.2	3.5	13.4
							短乳杆菌(纯化)	过夜	29.3	58.9	24.7	3.2	13.2
短乳杆菌(纯化)	过夜	40.2	55.1	25.0	4.7	15.3
							短乳杆菌(细胞提取物)	2h	10.5	45.8	35.9	1.1	17.2
短乳杆菌(细胞提取物)	2h	10.5	47.4	33.9	1.1	17.6
							短乳杆菌(细胞提取物)	过夜	79.4	70.3	17.9	1.3	10.5
短乳杆菌(细胞提取物)	过夜	80.1	69.1	19.1	1.1	10.7
							无	2h	2.7	84.1	7.1	6.3	2.4
无	2h	3.2	84.9	6.0	6.8	2.2
							无	过夜	36.5	92.3	2.3	4.2	1.2
无	过夜	30.5	92.7	2.0	4.1	1.3

再一次，显然加入消旋酶能增加由L-色氨酸产生的总莫纳甜，并能相对于S，S莫纳甜增加含4R的莫纳甜异构体的相对量。采用纯化的醛缩酶、消旋酶和L-转氨酶大大提高了控制所需立体异构体形成的能力。L与D转氨酶的比值也是操纵最终产物的立体化学的方式。

将实施例2的表1和表2所示结果与类似于上述条件的反应条件的结果时，可以观察到由吲哚-3-丙酮酸形成约7-29ppm莫纳甜，形成的R，R莫纳甜百分数约为51-90％。采用天冬氨酸消旋酶能将莫纳甜总产量提高至16-78ppm莫纳甜，其中％R，R约为40-58％。此外，利用了更稳定和较便宜的原料(L-色氨酸)。在实施例3中，由D-色氨酸产生约73ppm莫纳甜，R，R∶S，R比值约为1.7∶1。4R异构体总量为＞80％总莫纳甜。因为R，R-莫纳甜和R，S-莫纳甜都是有效的甜味剂(比蔗糖甜＞1000倍)，在不需要昂贵的D-氨基酸底物的情况下富集这些异构体的能力很重要。

我们预计，非特异性或R-特异性醛缩酶的可用性会提高反应速率，并提高所形成的R，R莫纳甜的百分数。参见实施例5。虽然据报道用于这些试验的睾丸酮丛毛单胞菌的ProA醛缩酶主要针对裂变反应的S-构型底物，但此种Pro A醛缩酶明显不产生R-MP。因此，更优选产生R构型的MP的醛缩酶可帮助产生更高百分数的R，R莫纳甜。此外，我们预计，发现对产生莫纳甜活性较低的L-色氨酸转氨酶也能降低形成的S，S和R，S莫纳甜的量。最后，可对D-转氨酶进行改进，或者可采用相对于S-MP对R-MP的底物特异性提高的另一种D-转氨酶。如果需要，这也会增加R，R产物的形成。

重复天冬氨酸消旋酶实验，以比较SEQ ID NO：22的R-选择性醛缩酶的活性与睾丸酮丛毛单胞菌的ProA醛缩酶的活性。约50μg纯化L-转氨酶(苜蓿根瘤菌TatA)、1mg天冬氨酸消旋酶(生物催化公司)、1mg D-转氨酶(AT-103，生物催化公司)、5mM作为氨基接受体的草酰乙酸和50μg合适的纯化醛缩酶。一式两份地进行该反应，30℃培育过夜。用实施例1所述的FDAA衍生技术测定各立体异构体的百分数。结果见下表31。

表31

醛缩酶	总莫纳甜(ppm)	％S，S	％R，R	％R，S	％S，R
						SEQ ID NO：22	211	72.7	27.3
睾丸酮丛毛单胞菌	422	30.2	38.5		31.3

异构体的睾丸酮丛毛单胞菌ProA分布与上述早期实验一致，而采用SEQ IDNO：22的R-选择性醛缩酶时，R，R百分数高得多，无法检测到形成的S，S的量，S，R莫纳甜的量更低。

如实施例2和3所述，D-丙氨酸可用作MP转氨形成莫纳甜的氨基供体。许多L-转氨酶能够在一定程度上利用丙酮酸作为氨基接受体产生L-丙氨酸。因为上述反应采用高浓度的丙酮酸，所以可能将一些丙酮酸转变为L-丙氨酸。例如，在L-色氨酸转氨过程中，发现如果不存在α-酮戊二酸，实施例6所述的HexAspC酶能在2小时内将10-18％丙酮酸(50-200mM初始浓度)转变为L-丙氨酸。两种氨基接受体以高浓度(＞50mM)存在时，该酶对α-酮戊二酸优选10倍。AspC(WO 03/091396 A2所述)也由丙酮酸产生一些L-丙氨酸。因此，预计可以不向上述反应中加入α-酮戊二酸或草酰乙酸，并利用丙氨酸消旋酶(EC 5.1.1.1)替代谷氨酸或天冬氨酸消旋酶。

首先在流产布氏杆菌和粪链球菌中鉴定了丙氨酸消旋酶。Marr，AG.，和Wilson，P.W.，Arch.Biochem.Biophys.，49：424-433，(1954)；Wood，W.A.，和Gunsalus，I.C.，J.Biol.Chem.190：403-416，(1951)。鼠伤寒沙门菌的dadB基因被确定为丙氨酸消旋酶活性来源，在基因组数据库中发现了几百种同源物。丙氨酸消旋酶活性的其它已知来源是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、霍乱弧菌、粟酒裂殖酵母和蜡状芽孢杆菌。担子菌类蘑菇香菇也含有广泛活性的丙氨酸消旋酶。嗜热脂肪地芽孢杆菌的热稳定性同源物可购自西格马-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(目录号A8936)，已被固定用于商业应用。Inagaki，K.，Biochemistry 25：3268(1986)。

用丙氨酸消旋酶生产莫纳甜

用睾丸酮丛毛单胞菌的ProA醛缩酶检测莫纳甜生产。约50μg纯化L-转氨酶(苜蓿根瘤菌TatA)、1mg D-转氨酶(AT-103，生物催化公司)、作为氨基接受体的丙酮酸、50μg纯化醛缩酶和70μg购自西格马(Sigma，St.Louis，MO)的丙氨酸消旋酶(目录号A8936)。一式两份地进行反应，培育过夜。用实施例1所述的FDAA衍生技术测定各立体异构体的百分数。包括无消旋酶的对照。结果见下表32。

表32

条件	总莫纳甜	％SS	％RS	％RR	％SR
						Ala消旋酶(1小时)	4	66	21	12	1
无Ala消旋酶(1小时)	2.7	69	26	5	0
						Ala消旋酶(24小时)	82.9	90	5	4	2
无Ala消旋酶(24小时)	170.3	89	5	4	2

丙氨酸消旋酶存在时一小时时间点上的R，R莫纳甜比无丙氨酸消旋酶的样品多3倍。此结果显示，可能用丙氨酸消旋酶产生R，R莫纳甜。可用选择性产生R-莫纳甜前体的醛缩酶、对R-莫纳甜前体没有作用或活性有限的L-转氨酶和对吲哚-3-丙酮酸没有作用或活性有限的D-转氨酶提高产生的R，R莫纳甜的百分数。

实施例10

D-苯基甘氨酸转氨酶(D-4-羟基苯基甘氨酸转氨酶)

如图3所示，立体反转性转氨酶可用于生产莫纳甜的生物合成途径。例如，D-苯基甘氨酸转氨酶或其突变体可以L-谷氨酸作为氨基供体由R-MP产生R，R莫纳甜。

(1)用寡核苷酸引物PCR合成斯氏假单胞菌4D-羟基苯基甘氨酸转氨酶

本实施例描述了用于合成4D-羟基苯基甘氨酸转氨酶的方法，此酶是可用于以L-谷氨酸作为氨基供体将R莫纳甜前体转变为R，R莫纳甜的立体反转性酶。

引物设计

斯氏假单胞菌4D-羟基苯基甘氨酸转氨酶(4D-HPG AT)的公开序列(Genbank登录号AY319935，核酸序列；Genbank登录号AAQ8290，蛋白序列)用作PCR引物设计模板。或者，将恶臭假单胞菌的4-D-羟基苯基甘氨酸转氨酶(CAD42450(蛋白质)，AX467211(核苷酸))用作序列模板。共设计了34种正向引物和35种反向引物；正向和反向引物共享20个重叠碱基对的40-mers。此外，设计了2种外部引物，它们含有5’限制性位点突出端，用于克隆到pET 28和pET30载体(诺华基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)中。

斯氏假单胞菌4D-HPG AT外部引物：

N端(含有NdeI位点)：

5′-GGCCGGCATATGTCGATCCTTAACGACTACAAACGT-3’(SEQ ID NO：19)和

C端(含有XhoI位点)：

5′-GGAAGGCTCGAGTCATGATTGGTTTCCAGACAAATT-3’(SEQ ID NO：20)。

聚合酶链反应方案

用以下方案扩增斯氏假单胞菌的基因序列。最初100μL PCR反应包含内部69引物各0.05μM、0.4mM各dNTP、10U rTth聚合酶XL(罗氏公司(Roche)，Indianapolis，IN)、0.625U Pfu聚合酶(司查塔基公司，加利福尼亚州拉霍亚)、1X XL缓冲液和1mMMg(OAc)₂。所用的热循环程序包括94℃热启动3分钟，15个下述步骤的循环：94℃30秒，42℃30秒和68℃15秒，接着是10个下述步骤的循环：94℃30秒，52℃30秒和68℃30秒，接着是10个下述步骤的循环：94℃30秒，60℃30秒和68℃1分和15秒。最后10个循环后，将样品维持于68℃7分钟，然后储存于4℃。此PCR方案在0.8％TAE-琼脂糖凝胶上产生～0.5kb的成片产物条带。

用第一轮PCR反应作为模板建立第二轮PCR反应。第二轮100μL PCR反应包含2.5μL的第一轮PCR反应、2种外部引物(含有NdeI和XhoI限制性位点)各0.5μM、0.4mM各dNTP、10U rTth聚合酶XL、0.625U Pfu聚合酶、1X XL缓冲液和1mMMg(OAc)₂。所用的热循环程序包括94℃热启动3分钟，10个下述步骤的循环：94℃30秒，52℃30秒和68℃1分30秒，接着是15个下述步骤的循环：94℃30秒，60℃30秒和68℃1分30秒。这15个循环后，将样品维持于68℃7分钟，然后储存于4℃。此PCR方案在0.8％TAE-琼脂糖凝胶上产生～1.4kb的独特产物条带。

用凯杰凝胶提取试剂盒(Valencia，CA)从0.8％TAE-琼脂糖凝胶中凝胶纯化PCR产物。按照生产商(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)方案TOPO克隆该产物并转化到TOP 10细胞。用凯杰离心小抽试剂盒从得到的转化子中纯化质粒DNA，并用NdeI和XhoI的限制性消化筛选正确插入物。通过双脱氧链终止DNA测序法用通用M13正向和M13反向引物验证似乎含有正确插入物的质粒序列。在测序的10个克隆中，与所需序列相比都含有至少一个突变。最佳克隆含有导致氨基酸改变的一个碱基对突变。用QuickChange诱变方案按照生产上推荐方法(司查塔基公司，加利福尼亚州拉霍亚)校正此克隆的序列。

按照生产商推荐方法(新英格兰生物实验室公司，Beverly，MA)用限制性酶NdeI和XhoI消化校正过的TOPO克隆，用凯杰凝胶提取试剂盒从0.8％TAE-琼脂糖凝胶中凝胶纯化。载体pET 28和pET 30的制备方法如下：用限制性酶Ndel和Xhol消化、然后用虾碱性磷酸酶处理、并用凯杰凝胶提取试剂盒从0.8％TAE-琼脂糖凝胶中纯化。

用NEB快速连接试剂盒(Beverly，MA)连接消化的载体和插入物。约50ng处理的插入物、100ng处理的载体(插入物与载体的摩尔比为3∶1)、5U T4DNA连接酶和1X连接缓冲液室温培育5分钟。将连接混合物转化到TOP10F’化学感受态细胞(英杰公司)中。使细胞在0.25mL室温SOC中37℃、225rpm振荡恢复1小时。将该细胞接种于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上。用凯杰离心小抽试剂盒由得到的转化子纯化质粒DNA，并通过NdeI和XhoI的限制性消化筛选正确的插入物。

基因表达和试验

将质粒DNA转化到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(诺华基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)中。培养该培养物，用凯杰小抽试剂盒分离质粒，并用限制性消化分析以确定其身份。

用pET 28(组氨酸-标记)和pET 30(未标记)载体中的斯氏假单胞菌D-4-羟基苯基甘氨酸转氨酶在BL21(DE3)中进行诱导。通过使培养物在含有卡那霉素(50mg/L)的250mL LB上生长至OD₆₀₀ 0.5-0.6进行时程研究，用100mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，诱导3后0小时和3小时取样。将合适体积的0小时和3小时的细胞重悬于含有2-巯基乙醇的40μL十二烷基硫酸钠缓冲液中，95℃加热10分钟，然后冷却。采用4-15％梯度凝胶的SDS-PAGE分析这些细胞总蛋白样品的等份。

也由3小时培养物制备细胞提取物，具体为将来自5mL培养物的细胞团块悬浮于含有0.625μL Benzonase核酸酶和3μL蛋白酶抑制剂混合物组#3(卡巴凯-诺巴凯公司(Calbiochem-Novabiochem Corp.)，加州圣地亚哥)的0.625mL Novagen BugBuster^TM 试剂中，室温下温和振荡20分钟，16,000xg离心以去除细胞碎片。将上清液(细胞提取物)加到4-15％梯度凝胶上，以分析细胞可溶蛋白。需要注意，用His-Bind 900柱按照生产商方案(诺华基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)纯化蛋白质，用PD-10柱(G25 Sephadex，安法玛西亚公司(Amersham-Pharmacia))脱盐去除咪唑。

(2)分离含有D-苯基甘氨酸转氨酶(″DPGAT″)的生物体

用以下方式分离含有立体反转性D-苯基甘氨酸转氨酶(也称为D-4-羟基苯基甘氨酸转氨酶)的假单胞菌属和类似属的生物体。在含有下述培养基的陪替氏平皿(petriplate)上培育土壤样品：(每升培养基)15g琼脂、3.4g KH₂PO₄、3.55g Na₂HPO₄、0.2g MgSO₄·7H₂O、8mg CaCl₂·2H₂O、10mg酵母提取物、1ml 1000x痕量元素溶液(Balch，W.E.，等，″Methanogens：reevaluation of a unique biological group″(产甲烷菌：独特生物类群的再评价)Microbiol.Rev.43：260-296，(1979))，和1g D-苯基甘氨酸(D-4-羟基苯基甘氨酸)。

通过PCR检测分离物中是否存在立体反转性转氨酶(由已知的D-苯基甘氨酸转氨酶设计引物)或如下所述进一步富集立体反转性转氨酶：可以在不含琼脂的上述液体培养基中30℃振荡培养该平板上的分离物，至OD₆₀₀约为1.0。离心收获细胞，用0.85％NaCl洗涤两次。将10mg(湿重)样品悬浮于1ml磷酸钾缓冲液(pH 7.0)和5mMD-苯基甘氨酸或D-4-羟基苯基甘氨酸中。将中和的15mM(氨氧基)乙酸加入如上所述一式两份制备的样品中。用HPLC测定D-苯基甘氨酸(或D-4-羟基甘氨酸)的消耗。

选择能够降解D-苯基甘氨酸(或D-4-羟基苯基甘氨酸)、但在(氨氧基)乙酸存在下降解速率较低的分离物进一步分析。用PCR检测分离物中是否存在立体反转性转氨酶(由已知的D-苯基甘氨酸转氨酶设计引物)。

通过在上述液体培养基中培养培养物、收获细胞并制备无细胞粗提物(″CFE″)以及检测D-苯基甘氨酸转氨酶或D-4-羟基苯基甘氨酸转氨酶活性，来验证立体反转性转氨酶的存在。将CFE加入反应混合物中，终浓度如下：0.1M 3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(″CAPS″)(pH 9.5)、60mM L-谷氨酸(钠盐)、5mM苯甲酰甲酸或4-羟基苯甲酸和50μM PLP。

通过将CFE加入反应混合物测定逆反应，浓度如下：50mM磷酸钾(pH 7.0)、60mM D-苯基甘氨酸或D-4-羟基苯基甘氨酸、5mMα-酮戊二酸和50μM PLP。35℃培育该反应，在不同时间点上取等份，通过煮沸2分钟终止反应。通过Gil-Av，E.等，″Resolution of underivatized amino acids by反相chromatography(通过反相色谱分析未衍生的氨基酸)″J.Am.Chem.Soc.，102：5115-5117，(1980)的HPLC法，或实施例1所述涉及测定谷氨酸形成的方法定量该产物。

作为基于PCR的方法的替代方法，用常规的蛋白质纯化技术由分离的细菌纯化立体反转性D-苯基甘氨酸转氨酶，所述技术包括硫酸铵分级和常规柱色谱。将蛋白质纯化到合理程度后，则利用肽显微测序技术或常规的Edman型氨基酸测序法(参见 http：//golgi.harvard.edu/microchem/中关于此种类型工作所用的方案和设备的描述)。根据获自蛋白来源的最接近已知亲缘生物的序列设计简并引物。然后按照建立的方案进行简并PCR和基因组步查，以分离立体反转性D-苯基甘氨酸转氨酶编码序列。

(3)DPGAT莫纳甜生产

将如上述(1)和(2)所述的D-羟基苯基甘氨酸转氨酶用于无细胞蛋白粗提物，或者如上述(1)所述进行纯化。如WO 03/091396 A2的实施例1所述制备苜蓿根瘤菌和球形红细菌酪氨酸(芳族氨基酸)转氨酶。如WO 03/091396 A2的实施例4所述制备睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶。利用伯乐蛋白质测定试剂盒按照生产商方案(Hercules，CA)进行总蛋白测定。

反应混合物(1mL体积，一式两份)含有100mM磷酸钾缓冲液(pH 8)、2mMMgCl₂、0.05mM吡哆醛5′-磷酸(″PLP″)、200mM丙酮酸钠、5mMα-酮戊二酸钠、细胞提取物中提供的约280μg/mL苜蓿根瘤菌TatA、100μL/mL D-羟基苯基甘氨酸转氨酶细胞提取物或1mg/mL纯化D-羟基苯基甘氨酸转氨酶和作为细胞提取物提供的约100μg/mL ProA醛缩酶。加入固体色氨酸，使其浓度为10.2mg/ml。阴性对照不含D-羟基苯基甘氨酸转氨酶。30℃温和振荡培育该样品～1小时或过夜。离心该样品以去除沉淀，用注射器过滤，储存于-80℃，然后用实施例1所述的LC/MS/MS法分析莫纳甜。

用本领域已知的诱变技术制备产生莫纳甜的活性提高的D-羟基苯基甘氨酸转氨酶，这些技术包括：诱变PCR、诱变菌株传代、定位诱变、易错PCR或诸如DNA改组或其它定向衍生技术的方法。通过在以R，R-莫纳甜作为氮源的极限培养基上生长选择改进的D-羟基苯基甘氨酸转氨酶。最初，选择是基于生长，但随着选择了改进的转氨酶，筛选则基于生长速率来进行。即，含有突变基因的细胞在以R，R-莫纳甜作为氮源的极限培养基中生长丙表达该基因。将含有突变基因的细胞的生长速率与未突变基因作比较。选择生长速率较快的细胞，进一步分析转氨酶。可进一步诱变D-羟基苯基甘氨酸转氨酶，直到获得所需活性。

(4)DPGAT试验

如上述(1)所述表达未用His标记的DPGAT，提取物用于测定。建立的测定中包含100mM磷酸钾pH 7.0、60mM D-苯基甘氨酸、5mMα-酮戊二酸和50μM吡哆醛-5’-磷酸。通过在每毫升测定体积中加入如上所述制备的100μL提取物启动该试验。在几个时间点(0、1、2、5、10、30、60和120分钟)上取样，用等体积2M甲酸终止反应。也在过夜(～1200分钟)培育后取样。用实施例1所述的OPA法分析该样品中产生的谷氨酸。结果见下表33。

表33

条件	时间(分钟)	μmole/mL L-谷氨酸
			无底物	0	0.033
	1	0.033
				2	0.033
	5	0.035
				10	0.034
	30	0.036
				60	0.044
	120	0.038
				～1200	0.058
D-苯基甘氨酸	0	0.055
				1	0.112
	2	0.169
				5	0.315
	10	0.387
				30	0.892
	60	1.304
				120	1.514
	～1200	1.056

该酶显然对D-苯基甘氨酸有一些活性。也检测了对R，R莫纳甜的酶活性。如上所述建立该试验，所含的R，R莫纳甜浓度为60mM。结果见下表34。

表34

条件	时间(分钟)	μmole/mL L-谷氨酸
			R，R莫纳甜	0	0.041
	1	0.040
				2	0.041
	5	0.041
				10	0.041
	30	0.042
				60	0.041
	120	0.040
				～1200	0.045

似乎检测不到任何对R，R莫纳甜的活性。然而，我们预计，本实施例的此部分(3)所述的随机或SDM法可用于提高对R，R莫纳甜或R-MP的转氨活性。例如，已经进行了斯氏假单胞菌酶的结晶和初步分析。Kongsaeree，P.等，Acta Cryst.D59：953-954，(2003)。结构公开后，可用软件如Accelrys进行停靠实验，以确定位阻或离子排斥可抑制R，R莫纳甜结合于D-羟基苯基甘氨酸底物结合位点。D-羟基苯基甘氨酸是有些大的氨基酸，如同R，R莫纳甜。这两种化合物都含有疏水性区域和羟基。可如实施例6所述对结合口袋进行修饰，以使该酶更服从二羧酸底物。例如，第二个羧基附近的残基可修饰成诸如精氨酸等基团。此外，如部分(1)所述的恶臭假单胞菌基因和可以如(2)所述分离的其它基因可用作基因改组的模板。此外，此实施例中组装的斯氏假单胞菌基因可用寡核苷酸改组或其它随机诱变法诱变，并可如(3)所述进行筛选。

实施例11

D-甲硫氨酸转氨酶基因的发现

背景

虽然罕见，但认为D-甲硫氨酸—丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.41)是立体反转性转氨酶的另一个例子。此酶催化D-甲硫氨酸和丙酮酸可逆地转变为L-丙氨酸和4-甲硫基-2-氧代丁酸。草酰乙酸、苯基丙酮酸、2-氧代丁酸、2-氧代戊酸、2-氧代庚酸、乙醛酸和酮戊二酸也可用作氨基接受体。

认为D或L甲硫氨酸的转氨是高等植物(花椰菜、番茄、苹果、豌豆茎、香蕉、花生)以及土壤微生物(大肠杆菌、豌豆假单胞菌(Pseudomonas pisi)、铜绿假单胞菌、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、醋酸钙不动杆菌、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)B12E、三叶草根瘤菌(Rhizobium trifolii)N2P7、指状青霉(Penicilliumdigitatum)、酿酒酵母、棒杆菌(Corynebacterium)D7F)中乙烯生产途径的一部分。Billington，D.C.，等，Biochem J.182：827-836，(1978)。在细菌中，L-甲硫氨酸一般用作乙烯生产研究的底物，认为来自大肠杆菌的广泛特异性酶如TyrB或AspC负责转氨作用。然而，Primrose，S.B.，J.Gen.Microbiol.95：159-65，(1976)和Primrose，S.B.，J.Gen.Microbiol.98：519-528，(1977)证明，批量培养时大肠杆菌菌株SPA O(Warwick大学培养物保藏中心)由D-甲硫氨酸生产的乙烯与由L-甲硫氨酸生产的乙烯几乎同样多。因为在大肠杆菌中尚未鉴定到广泛特异性D-转氨酶，一种可能的解释可能是，大肠杆菌D-氨基酸脱氢酶(dadA基因编码)将D-甲硫氨酸转变为4-甲硫基-2-氧代丁酸。大肠杆菌中也可能有甲硫氨酸消旋酶；然而，文献中没有报道过这种酶。

与大肠杆菌相反，在花椰菜小花(线粒体提取物制剂)和发芽的花生种子中，与L-甲硫氨酸和丙酮酸相比，将D-甲硫氨酸和丙酮酸提供给酶提取物时乙烯产量较高。Mapson，L.W.，等，Biochem J.115：653-661，(1969)；Durham，J.I.，等，Phytochemistry12：2123-2126，(1973)。因此，组合甲硫氨酸消旋酶和L-转氨酶的可能性得不到数据支持。通过透析花椰菜的细胞提取物消除了脱氢酶活性；测定混合物中没有NAD。因为没有观察到氧气消耗和不需要FAD，所以排除了氧化酶活性。纯化花生组织中的D-甲硫氨酸转氨酶，证明它依赖PLP，但不依赖L-甲硫氨酸转氨酶活性。可能这些D-甲硫氨酸—丙酮酸转氨酶真地以副产物的形式产生D-丙氨酸(类似于实施例2和3所述的芽孢杆菌酶)并且该细胞含有丙氨酸消旋酶以使D-丙氨酸循环回L-丙氨酸(或类似的氨基供体)。在这两种情况下，发现来自高等植物的广泛特异性D-转氨酶有利于开发生产R，R莫纳甜或S，R莫纳甜的方法。

实验概述

用标准的色谱法和Pharmacia AKTA Explorer系统由花椰菜小花和发芽的花生胚部分纯化D-甲硫氨酸转氨酶。用LC/MS/MS指纹技术确定同源性蛋白的蛋白序列，用Harvard Microchemistry设备进行数据库搜索。用标准的PCR方法由cDNA文库克隆植物基因的编码区，或者如实施例10(1)所述合成该基因。

或者，由D-甲硫氨酸存在下培养(生产乙烯)的花椰菜组织或花生种子构建cDNA表达文库(司查塔基公司，加利福尼亚州拉霍亚)。将该文库转化到大肠杆菌遗传保藏中心(耶鲁大学)的大肠杆菌甲硫氨酸营养缺陷型如菌株RC519或AB1931中。能够在含有D-甲硫氨酸的极限培养基上生长的菌株的质粒含有感兴趣的编码区(参见实施例4(1)，类似的筛选技术)。

一旦获得感兴趣的编码区并在标准的大肠杆菌实验室菌株中表达后，得到的基因产物可用于产生R，R莫纳甜的试验(如实施例10(3)所述)，以代替D-羟基苯基甘氨酸转氨酶，例外是pH为7.5(该转氨酶的最优pH)。如果D-甲硫氨酸转氨酶对D-氨基酸供体底物要求严格，那么可以如实施例2和3所述采用该酶制备R，R莫纳甜。可以如实施例10(3)所述诱变该基因并筛选活性增加的基因。

方法

由花椰菜分离

在混合器中交替进行浸泡和混合，用400mL 4℃蔗糖/缓冲液溶液(0.4M蔗糖和0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.4)提取400克新鲜挑选的花椰菜小花。用干酪包布过滤以去除细胞碎片，40,000xg、4℃离心得到的溶液30分钟。将固体物质(含有线粒体细胞器)重悬于20mL 10mM磷酸钠缓冲液pH 7.4中，用200mL冰冷(-30℃)丙酮提取酶。再次离心该悬液，用Savant Speed Vac使沉淀干燥。将固体物质溶解于10mM磷酸钠缓冲液pH 7.4中，用PD-10柱去除残留丙酮。

通过用0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.4中配制的5mM D-甲硫氨酸、1mM丙酮酸、0.05mM PLP和2mM EDTA培育酶制剂测定转氨酶活性。试验于25℃进行16小时。采用LC/MS(m/z of 328)和实施例1所述的类似方法，通过2，4-二硝基苯基腙衍生物的形成检测4-甲硫基-2-氧代丁酸。用2M硫酸配制0.4％(w/v)2，4-二硝基苯基肼溶液，培育后将一半体积加入试验混合物中。该混合物于30℃温和振荡混合30分钟，离心收集沉淀，并用LC/MS分析。以类似方式测定用标准色谱技术分离的蛋白质组分的活性，但用实施例1所述的OPA柱后衍生技术检测副产物丙氨酸。

由花生(Arachia hypogea L.栽培变种Starr)分离

按照Durham，J.I.等，Phytochemistry 12：2123-2126(1973)所述的方法纯化发芽的花生胚匀浆物(减去子叶)中的D-甲硫氨酸转氨酶。在粗提物制备过程中采用还原剂以使该酶稳定，33,000xg离心去除细胞碎片。通过低温培育和去除沉淀中的蛋白质进一步纯化35-50％硫酸铵组分。上清液用丙酮进一步分级。然后，用凝胶过滤层析(Sephadex 200，GE保健，新泽西州皮斯卡塔韦)进一步纯化活性物质。

由于蛋白质组分中富含转氨酶蛋白，所以用2D-凝胶电泳分离感兴趣的酶进行显微测序。阐明NCBI保藏的植物序列中的同源性编码区后，用标准的分子生物学技术在大肠杆菌中重组生产D-转氨酶蛋白。我们预计，来自花椰菜小花或花生种子的细胞提取物或重组生产的同源酶可用于生产R，R莫纳甜，如实施例10(3)所述(如果是立体反转性转氨酶)或实施例2和3所述(如果是广泛特异性D-转氨酶)。

实施例12

L-丙氨酸转氨酶/丙氨酸消旋酶/D-丙氨酸转氨酶

图8说明了用L-氨基酸转氨酶(如L-芳族氨基酸转氨酶、L-丙氨酸-转氨酶和/或L-色氨酸-转氨酶)、R-特异性醛缩酶、丙氨酸消旋酶和D-丙氨酸转氨酶由L-色氨酸生产立体异构体富集的R，R莫纳甜的生物合成途径。

实施例6描述了色氨酸-特异性转氨酶。或者，如WO 03/091396 A2的实施例1所述制备苜蓿根瘤菌和球形红细菌酪氨酸(芳族氨基酸)转氨酶。如WO 03/091396 A2的实施例4所述制备睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶。用伯乐蛋白测定试剂盒按照生产商方案(Hercules，CA)进行总蛋白测定。丙氨酸消旋酶购自西格马公司(St.Louis，MO)(目录号A8936)。D-丙氨酸转氨酶购自生物催化公司(Pasadena，CA)(目录号AT-103)。

L-丙氨酸转氨酶广泛分布于真核生物、细菌和古细菌中。已经鉴定到(根据序列同源性)以下生物体含有L-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.2)：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、棕色固氮菌、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、白假丝酵母(Candida albicans)、光滑假丝酵母 (Candida glabrata)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、汉氏德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、智人(Homo sapiens)、大麦(Hordeum vulgare)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、梨孢菌(Magnaporthegrisea)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、小鼠(Mus musculus)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、水稻(Oryza sativa)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、火炬松(Pinus taeda)、恶臭假单胞菌、阿比西火球菌(Pyrococcus abyssi)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、极端嗜热火球菌(Pyrococcus horikoshii)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、红鳍多纪鲀(Takifugu rubripes)、枯氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、霍乱弧菌、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyicus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和玉蜀黍(Zea mays)。此外，许多转氨酶具有低水平的丙氨酸转氨酶，如果有高水平的L-谷氨酸和丙酮酸可将其转变为L-丙氨酸和α-酮戊二酸。用标准诱变技术如易错PCR和诱变菌株传代，或者通过定向演化技术来改进具有低活性的酶。L-丙氨酸转氨酶的基因的克隆方法如下：采用公知序列设计引物，并采用标准技术扩增、克隆、表达和纯化该基因/酶。

反应混合物(1mL体积，一式两份)含有100mM磷酸钾缓冲液(pH 8)、2mMMgCl₂、0.05mM吡哆醛5′-磷酸(″PLP″)、200mM丙酮酸钠、5mMα-酮戊二酸钠、细胞提取物中提供的约280μg/mL苜蓿根瘤菌TatA(或其它L-色氨酸特异性转氨酶)(如实施例4第(5)部分所述)、100μg L-丙氨酸转氨酶、100μL/mL丙氨酸消旋酶细胞提取物或1mg/mL纯化的丙氨酸消旋酶(西格马公司)、细胞提取物中提供的约280μg/mL广泛特异性D-丙氨酸转氨酶(实施例15和18中包括可用于此反应的D-转氨酶的例子)和作为细胞提取物提供的约100μg/mL ProA醛缩酶。加入固体色氨酸，使其浓度为10.2mg/ml。阴性对照不含丙氨酸消旋酶。30℃温和振荡培育该样品～1小时或过夜。离心该样品以去除沉淀，用注射器过滤，储存于-80℃，然后用实施例1所述的LC/MS/MS法分析莫纳甜。

实施例13

由酶反应混合物纯化R，R-莫纳甜

由以下反应混合物纯化产物R，R-莫纳甜。在500mL玻璃瓶中，室温混合0.33升的50mM碳酸氢氨、pH 8.2、4mM MgCl₂、0.05mM吡哆醛磷酸(″PLP″)、200mM丙酮酸钠和50mM D-色氨酸，直到色氨酸溶解。用氮气冲洗该液体数分钟，然后加入3.0mg/mL生物催化公司(Pasadena，CA)的广泛D-转氨酶(目录号AT-103)和0.1 mg/mL纯化的SEQ ID NO：22醛缩酶。室温下温和搅拌该反应混合物。如实施例3所述纯化该醛缩酶。在初次制备该混合物后15小时和22小时，加入额外等份的50mM固体D-色氨酸。每次加入后，用氮气冲洗液面上空间。所有加入的色氨酸未溶解，但浓度维持在约50mM。40小时后，过滤掉剩余的固体色氨酸。用柱后荧光检测液相色谱分析该反应混合物(参见实施例1)，结果显示，溶液中但色氨酸浓度为49mM，莫纳甜浓度为3.9mM。

用两个离子交换色谱步骤纯化产物莫纳甜。首先将过滤的反应溶液加到伯乐AG50W-X8树脂柱(140mL；结合容量1.7meq/mL)上。用2×150mL H₂O洗涤该柱，然后用1M NH₄OH洗脱(1×450mL，接着3×150mL)。合并NH₄OH组分，用HCl中和，通过沃特曼(Whatman，Maidstone，England)玻璃微纤维滤器和杰尔曼科学公司(Gelman Sciences)(Ann Arbor，MI)0.45μm滤器连续过滤。然后用装有YM100(MWCO 100kDa)的Amicon(密理博公司(Millipore)；Billerica，MA)超滤搅拌室(型号8200)超滤澄清后的溶液。用旋转蒸发器以温热水浴将超滤滤出液蒸发至约160mL。通过玻璃微纤维滤器过滤，以再次澄清该液体。

将得到的溶液施加到1L快流DEAE琼脂糖(安玛西亚生物科学公司(AmershamBiosciences))柱上，该柱之前用0.5L 1M NaOH、H₂O和1.0M碳酸氢氨(pH 8.3)洗涤，接着再用H₂O洗涤，以将其转变为碳酸氢盐形式。加入该溶液的速率＜2mL/分钟，用水以3-4mL/分钟洗涤该柱，直到280nm吸光度＜1。用50mM碳酸氢氨，pH 8.3(2.5L)洗脱R，R-莫纳甜。用旋转蒸发器以温热水浴蒸发该组分。得到的浆液于4℃培育数天，直到形成结晶。收集结晶，用冰冷的100％乙醇洗涤，在真空干燥器中干燥(0.38g)。

用FDAA衍生法、然后是LC/MS/MS多反应监测(参见实施例1)分析固体产物的异构体纯度，结果表明该样品含有96.3％R，R莫纳甜和3.7％S，R-莫纳甜。

也用总莫纳甜法(参见实施例1)分析该样品中其它有机物的纯度。用光电二极管阵列检测器在200-500nm范围扫描UV吸光度。根据积分的峰面积，莫纳甜(包括R，R和S，R峰)占该面积的96.1％。

用柱后荧光检测液相色谱分析样品显示，该样品的氨基酸组成为98.8％莫纳甜以及痕量的色氨酸(1.2％)和丙氨酸(0.02％)。

在中西部显微实验室公司(Midwest Microlab，LLC)(Indianapolis，IN)进行元素分析。此分析表明，样品含有1重量％不可燃烧的(无机)物质，以及铵盐和碳酸氢盐残留物。

实施例14

在纯化期间增加D-转氨酶活性的保留

纯化球形芽孢杆菌HIS₆-D-丙氨酸转氨酶的标准方法

从BL21(DE3)::球形芽孢杆菌dat pET30a的新鲜培养物平板(含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂)(实施例18)开始，在5mL含有50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani肉汤(″LB″)中，以37℃、225rpm培养细胞3-5小时。然后，将0.25％(v/v)该培养物转移到含有Novagen Overnight Express System II溶液1-6(EMD生物科学公司(EMDBiosciences)，威斯康星州麦迪逊)和50μg/mL卡那霉素的烧瓶中。以37℃、225rpm培养细胞过夜(16-18小时)。OD₆₀₀约为8.0时，用装有JS-16.25转头的贝克曼(Beckman，Fullerton，CA)J25II离心机以10,000rpm离心10分钟，以收获细胞。用冰冷的50mM EPPS缓冲液(pH 8.2)洗涤细胞沉淀一次，再次离心细胞。收获洗涤的细胞沉淀，立即使用或冻存于-80℃直到用于纯化。

为了制备含有球形芽孢杆菌HIS₆-D-丙氨酸转氨酶(HIS₆-BsphDAT)蛋白的无细胞提取物，将细胞悬浮于3-4体积的50mM EPPS，pH 8.2中，然后用微流体公司(Microfluidics，Newton，MA)匀浆器(以20,000psi通过3次)破坏细胞，将悬浮液温度维持在15℃以下。所有后续纯化步骤均在4℃进行。15,000x g离心细胞提取物15分钟，以去除细胞碎片。倾析上清液，立即使用或冻存于-80℃。将无细胞提取物等份施加于之前用含有200mM氯化钠的50mM EPPS(pH 8.2)平衡过的NovagenHIS-Bind柱(目录号70971-4)或GE保健(GE Healthcare)(新泽西州皮斯卡塔韦)Chelating Sepharose^TM快流树脂柱(镍(II)形式)(速率为1.2-1.5v/v)上。加样后，用3-5体积平衡缓冲液、3-5体积含有25mM咪唑的平衡缓冲液、3-5体积含有100mM咪唑的平衡缓冲液和3-5体积含有500mM咪唑的平衡缓冲液连续洗涤/洗脱该柱。在最后一次洗涤中洗脱HIS₆-BsphDAT蛋白。用Amicon(Billerica，MA)Centricon-70或Ultra-15离心过滤机(MWCO 10kDa)将500mM咪唑洗液浓缩2-10倍。通过之前用含有50μM PLP的50mM EPPS(pH 8.2)平衡过的GE保健(GE Healthcare)的一次性PD10脱盐柱，以去除咪唑和氯化钠。

用Pierce BCA测定试剂盒(Rockford，IL)监测脱盐溶液的蛋白质浓度。用伯乐公司(Hercules，CA)Experion Pro260微毛细管芯片系统或4-15％梯度凝胶的SDS-PAGE测定各组分的纯度和无细胞提取物组分中的表达水平。一般地，这种方法生产的酶大于300mg(由600mL Overnight Express II培养物生产)，经过Experion软件判定，该酶的纯度约为90％。纯化酶等份(1-5mL)储存于-80℃待用。

改进方法

如上所述制备无细胞提取物。用类似方法纯化His₆-BsphDAT蛋白，改变在于：用于破坏细胞和纯化蛋白质的所有缓冲液均含有100mM磷酸钾，pH 7.8，还有50μMPLP。仅用GE保健(GE Healthcare)Chelating Sepharose^TM快流树脂(镍(II)形式)纯化蛋白。

活性测定

用这两种纯化方法制备的酶测定由色氨酸和丙酮酸形成吲哚-3-丙酮酸和丙氨酸。反应混合物含有100mM磷酸钾(pH 7.8)、0.05mM吡哆醛磷酸、100mM丙酮酸钠、40mM D-色氨酸和0.03-0.1mg/mL纯化酶。加入固体形式的色氨酸。将除酶以外的所有组分混合在一起，30℃培育直到色氨酸溶解。然后加入该酶，室温培育该反应溶液。在预定的时间点，从该反应中取样，样品立即置于冰上，稀释后用实施例1所述的柱后荧光检测液相色谱法进行丙氨酸分析。下表34列出了该酶制剂的特异性活性，用每毫克酶每分钟形成的丙氨酸浓度表示。

表34：改进的纯化方法对酶活性的影响

酶制剂	特异性活性(μmole丙氨酸(mg)^-1(min)^-1)
		不用50μM PLP 纯化的HIS₆-BsphDAT	2.9
用50μM PLP 纯化的HIS₆-BsphDAT	14.2

表34所示结果表明，在纯化过程中采用吡哆醛磷酸导致活性增加。

实施例15

两种新型芽孢杆菌D-氨基酸转氨酶的克隆

用重组方法生产几种芽孢杆菌D-氨基酸转氨酶(EC 2.6.1.21，也称为D-丙氨酸转氨酶或D-天冬氨酸转氨酶)，用于生产R，R莫纳甜的偶联试验，如实施例18所述。这些酶与以前所述用于生产莫纳甜的D-转氨酶(美国公开号20040063175和美国公开号2005282260)同源。用于选择可以成为含有新型D-氨基酸转氨酶(″DAAT″)的候选菌株的菌株的方法是检查ATCC保藏的球形芽孢杆菌菌株列表，并分析以前以不同种名保藏的一些菌株。以下生物体是从ATCC订购的：ATCC 4978-最初以瓶累芽孢杆菌(Bacillus rotans)保藏的球形芽孢杆菌和ATCC 7063-最初以血清芽孢杆菌(Bacillus serositidis)保藏的球形芽孢杆菌和ATCC 21538-最初以环状芽胞杆菌 (Bacillus circulans)的球形芽孢杆菌。比对来自球形芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的已知DAAT蛋白序列，以获得在各种DAAT蛋白中保守的序列区。设计蛋白质序列保守区的引物，用于以聚合酶链反应(″PCR″)由上述ATCC菌株扩增DAAT基因序列。

根据公开的芽孢杆菌DAAT序列的比对中的保守区，设计五种PCR引物。

聚合酶链反应方案

如上所述根据DAAT比对中的保守区设计引物。寡核苷酸引物序列如下：5’GAAGACCGTGGTTATCAATTT 3’(SEQ ID NO：65)(正向引物)，5’GATGGTATTTACGAAGTAATC 3’(SEQ ID NO：66)(正向引物)，5’AGATTTAATATCACAACGTAAC 3’(SEQ ID NO：67)(反向引物)，5’GCCAAGTAAAATTTAAGATTTA 3’(SEQ ID NO：68)(反向引物)，5’ATTTGCTGGGTGCGTATAAAG 3’(SEQ ID NO：69)(反向引物)。根据引物组合与已知DAAT比对，PCR片段的预计大小为：SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：67-约380bp，SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：68-约395bp，SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：69-约534bp，SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67-约336bp，SEQ ID NO：66和SEQID NO：68-约346bp，SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：69-约510bp。

将上述引物的组合用于由以下ATCC菌株进行菌落PCR：ATCC 4978-最初以瓶累芽孢杆菌保藏的球形芽孢杆菌；ATCC 7063-最初以血清芽孢杆菌保藏的球形芽孢杆菌；和ATCC 21538-最初以环状芽胞杆菌的球形芽孢杆菌。

上述三种菌株在营养琼脂中30℃培养。从平板上刮下一个菌落，重悬于25μL无菌蒸馏水中。96℃裂解细胞10分钟。如下所述进行PCR：每50μL反应中，加入5μL裂解细胞、0.8μL各引物、2μL dNTP、0.8μL Expand高保真聚合酶(罗氏公司，Indianapolis，IN)和1X Expand^TM缓冲液。94℃热启动3分钟，接着是15个下述步骤的循环：94℃30秒、40℃45秒和72℃2分钟。用提高的退火温度45℃再进行15个循环。最后，于72℃进行7分钟链延伸步骤。几种引物组合由上述菌株产生预计的PCR产物大小。用Zero Blunt

Figure DEST_PATH_GAB00000000000171464000031

克隆试剂盒按照生产商说明书(英杰公司)克隆PCR产物，由阿吉科特生物科学公司(Beverly，MA)通过双脱氧链终止DNA测序法测序。将DNA和氨基酸水平的序列与球形芽孢杆菌DAAT序列作比对。有效的DAAT/DAT序列获自以下三种菌株：ATCC 4978、ATCC 7063和ATCC 21538。两种特异性菌株ATCC 4978和ATCC 7063产生的PCR产物在翻译时，产生的蛋白序列与球形芽孢杆菌D-转氨酶序列相比含有独特的氨基酸残基改变。

进行基因组步查，以获得ATCC 4978和ATCC 7063菌株的完整基因序列。用营养肉汤于30℃培养菌株ATCC 4978。在营养琼脂上培养菌株ATCC 7063。用Gentra试剂盒(金卓系统公司(Gentra Systems)，Minneapolis，MN)按照生产商说明书从各菌株制备基因组DNA。按照生产商说明书(BD Genome Walker^TM通用试剂盒，Clontech， www.Clontech.com)为各菌株构建四个文库。考虑到几百个同源碱基对与原始产物重叠，按照Genome Walker^TM生产商方案，根据用保守引物组合(见上)获得的序列设计基因-特异性引物。这些基因特异性引物随后与Genome Walker^TM衔接子引物一起用于上游和下游序列的PCR，以得到完整DAT ORFS。

所述基因特异性寡核苷酸引物序列如下所示：

4978 DAT GSP1上游5’GACATGCTCCTCCGCTGTAAATAATTCACC 3’(SEQID NO：70)

4978 DAT GSP1下游5’CCCTGGTGATGAAGTGAAGCCAGTATTAAC 3’(SEQ ID NO：71)

4978 DAT GSP2上游5’ATCGCCAAATTGATAACCACGGTCTTC 3’(SEQ IDNO：72)

4978 DAT GSP2下游5’ACGTCCCGTAGCAAACTTTGAAAAAGGTGT 3’(SEQ ID NO：73)

7063 DAT GSP1上游5’TGCATAGAATCGGTCGATATGTTCAGTAGC 3’(SEQID NO：74)

7063 DAT GSP1下游5’GCGGAGAAACGATTACAGAAGGTTCTTCAA 3’(SEQ ID NO：75)

7063 DAT GSP2上游5’GTCACCAAATTGATAACCACGGTCTTC 3’(SEQ IDNO：76)

7063 DAT GSP2下游5’GGTGTACTTTATACGCACCCAGCAAAT 3’(SEQ IDNO：77)

衔接子寡核苷酸引物序列：

AP1 5’GTAATACGACTCACTATAGGGC 3’(SEQ ID NO：78)

AP2 5’ACTATAGGGCACGCGTGGT 3’(SEQ ID NO：79)

如下所述进行第一轮Genome Walker^TM PCR：每50μL反应中，加入2.5μLDNA文库、2μL各引物(AP1(SEQ ID NO：78)和合适的GSP1)、1.5μL dNTP、1X XL PCR缓冲液、1mM乙酸镁和1μL RT^TH聚合酶(罗氏公司，Indianapolis，IN)。94℃热启动3分钟，接着是10个下述步骤的循环：94℃30秒、55℃30秒和68℃1分钟。用降低的退火温度48℃再进行20个循环。最后，于68℃进行7分钟链延伸步骤。如下所述进行第二轮Genome Walker^TM PCR：每50μL反应中，加入1.0μL(1∶50稀释)第一轮PCR反应、2μL各引物(AP2(SEQ ID NO：79)和合适的GSP2)、1.5μLdNTP、1X XL PCR缓冲液、1mM乙酸镁和1μL RT^TH聚合酶。94℃热启动3分钟，接着是10个下述步骤的循环：94℃30秒、55℃30秒和68℃1分钟。用降低的退火温度48℃再进行15个循环。最后，于68℃进行7分钟链延伸步骤。

七种文库所产生的PCR产物的大小范围是～200bp至～1.5Kb。TOPO克隆(如上所述)PCR产物，由阿吉科特生物科学公司(Beverly，MA)通过双脱氧链终止DNA测序法测序；将这些新序列与用保守引物组合获得的初始序列作比对，鉴定启动和终止密码子。以这种方式获得DAAT完整ORF。根据特定的完整DAAT序列设计新引物对(含有用于克隆的限制性位点)，以由单独的ATCC菌株4978和7063 PCR整个DAAT基因。

寡核苷酸引物序列如下：

ATCC4978DAATNde1F

5’GGCCTTGGCATATGAGTTATAGCTTATGGAATGACC 3’(SEQ ID NO：80)

ATCC4978DAATBamH1R

5’GGCCTTAAGGATCCTTATGCGCGAATACCTTTTGGG 3’(SEQ ID NO：81)

ATCC7063DAATNde1F

5’GGCCTTGGCATATGAGCTACACTTTATGGAATGA 3’(SEQ ID NO：82)

ATCC7063DAATBamH1R2a

5’GGCCAAGGATCCGCTACCCACTAATCATTAGA 3’(SEQ ID NO：83)

用以下PCR方案扩增ATCC 4978和ATCC 7063 DAAT基因的编码区。在50μL反应中，加入3μL基因组DNA、0.8μL各引物、2μL dNTP、0.8μL Expand高保真聚合酶(罗氏公司，Indianapolis，IN)、含有Mg的1X Expand^TM缓冲液和0.2μL Pfu聚合酶(司查塔基公司，加利福尼亚州拉霍亚)。所用热循环程序包括94℃热启动3分钟，接着是8个下述步骤的循环：94℃30秒、50℃30秒和72℃90秒。用退火温度58℃再进行22个循环。最后，于72℃进行7分钟链延伸步骤。由两种菌株获得正确大小(约850bp)的洁净PCR产物。

用凯杰QIAquick PCR纯化试剂盒(Valencia，CA)纯化ATCC 4978和ATCC 7063DAAT基因的PCR产物，并用NdeI和BamHI在BamHI缓冲液(新英格兰生物实验室公司，Ipswich，MA)中消化。用凯杰QIAquick凝胶提取试剂盒纯化NdeI和BamHI消化的载体(pET28和pET30)和插入物。用罗氏快速DNA连接试剂盒(罗氏公司)完成连接，并用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。如伯乐电穿孔手册所述，用0.2cm试管和伯乐基因脉冲II系统将连接物转化到大肠杆菌DH10B中。使细胞在900μL SOC培养基中，于37℃、225rpm恢复30分钟。将该细胞接种于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB琼脂平板上。用凯杰离心小抽试剂盒纯化质粒DNA，通过PCR以及NdeI和BamHI的限制性消化筛选正确插入物。由阿吉科特生物科学公司(Beverly，MA)通过双脱氧链终止DNA测序法验证似乎含有正确插入物的质粒序列。序列分析验证了来自ATCC 4978和ATCC 7063的DAAT基因的编码序列，它们产生的DNA序列是SEQ ID NO：84(ATCC 4978DAAT DNA序列)和SEQ ID NO：85(ATCC 7063DAAT DNA序列)，产生的氨基酸序列是SEQ ID NO：86(ATCC 4978DAAT氨基酸序列)和SEQ ID NO：87(ATCC 7063DAAT氨基酸序列)。

我们由菌株ATCC 4978和ATCC 7063获得新D-转氨酶，与球形芽孢杆菌D-转氨酶相比，该转氨酶的蛋白序列含有独特的氨基酸残基改变。来自ATCC 4978和ATCC 7063的DAAT与来自球形芽孢杆菌(ATCC 10208)的DAAT仅有72％和67％相同。虽然这两种菌株目前在ATCC中列为球形芽孢杆菌，但它们是以瓶累芽孢杆菌和血清芽孢杆菌保藏的。根据序列比对和这两种新DAAT与球形芽孢杆菌的DAAT之间突出显示的差异，鉴定了许多候选残基，可以评价这些和其它DAAT序列中这些候选残基(单独或组合)对提高DAAT对R，R莫纳甜生物合成的活性的作用。

实施例16

ATCC 4978和ATCC 7063DAAT蛋白的基因表达和测定

如实施例15所述，将ATCC 4987和ATCC 7063的新型DAAT(在pET载体中)转化入大肠杆菌表达载体BL21(DE3)(诺华基公司，威斯康星州麦迪逊)中。利用上述方法培养培养物，采用凯杰公司小抽试剂盒分离质粒并如上述进行限制性酶切分析以确认质粒身份。

通常在含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中进行DAAT基因诱导。细胞于37℃生长至OD₆₀₀为0.4-0.8，使用0.1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导并于诱导后3-4小时取样。根据诺华基公司Novagen BugBuster^TM试剂方法制备细胞提取物(含Benzonase核酸酶并加入罗氏(Roche)完全蛋白酶抑制剂混合物)。利用SDS-PAGE判断，根据预测分子量大小获得pET载体中ATCC 4978和ATCC 7063基因产物的可溶性蛋白。用无His标签的构建物(pET 30)观察到较高水平的可溶性蛋白。利用伯乐实验室(BioRad Laboratories)Experion自动化电泳工作站(Hercules，CA)分离细胞提取物中的可溶性蛋白，并利用Experion软件1.1.98.0版分析浓度和表达百分数。

利用下列方法由丙酮酸和D-色氨酸(或R，R莫纳甜)生产丙氨酸，并以此分析未标记(pET30)构建物的细胞提取物的D-转氨酶活性。除非另有说明，一式两份500μL反应在100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)、80μM磷酸吡哆醛、25mM丙酮酸钠和50mMD-色氨酸或R，R莫纳甜中进行。加入无细胞提取物(4978或7063)或纯酶(球形芽孢杆菌)启动反应，于30℃温和振荡培育15分钟-2小时。出于比较的目的，除非另有说明，在每个实验中加入大约相同水平的总蛋白(1.0mg)。纯球形芽孢杆菌(ATCC编号10208)转氨酶作为基准酶。加入终浓度为2％的甲酸终止反应，离心去除沉淀的蛋白。没有加入蛋白的反应作为对照。利用实施例1所述的OPA衍生检测丙氨酸。下表35和36显示了一式两份反应结果的平均值

表35：ATCC 4978和ATCC 7063D-转氨酶的转氨活性(15分钟)

D-转氨酶	丙氨酸(mM) D-色氨酸为底物	丙氨酸(mM)R，R莫纳甜为底物
			ATCC 4978	7.78	0.32
ATCC 7063	0.28	0.025
			球形芽孢杆菌(未标记)	11.93	3.57

表36：ATCC 4978和ATCC 7063D-转氨酶的转氨活性(2小时)

D-转氨酶	丙氨酸(mM) 以D-色氨酸为底物	丙氨酸(mM)以R，R莫纳甜为底物
			ATCC 4978	16.46	2.33
ATCC 7063	2.51	0.21
			球形芽孢杆菌(未标记)	13.73	12.23

因此，我们证明了来自ATCC 4978和ATCC 7063的D-氨基酸转氨酶的确具有D-转氨酶活性和制造R，R莫纳甜的能力。ATCC 4978DAAT活性高于所观察到的ATCC 7063DAAT的活性。因为4978未纯化，故无法进行4978和球形芽孢杆菌间的定量比较。

实施例17

用来自ATCC 4978的DAAT生产R，R莫纳甜

也检测来自ATCC 4978的转氨酶由D-色氨酸生产莫纳甜的能力(如实施例3)。每1毫升反应混合物中加入：约50μg醛缩酶(睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶或SEQID NO：22醛缩酶，纯化的)、4mM MgCl₂、50mM D-色氨酸(以固体形式提供)、1.0mg D-转氨酶、100mM丙酮酸钠、100mM磷酸钾缓冲液pH 7.5和0.05mM PLP。以一式两份进行实验，不加入转氨酶的反应作为阴性对照。样品于30℃温和振荡培育不同时间。使用该方法生产莫纳甜时检测到的仅有的立体异构体为R，R和S，R。如实施例1所述检测总莫纳甜和R，R莫纳甜百分数，并列于下表37-39中。表37-39中各表所示的结果均为一式两份反应的平均值。

表37：采用约50μg睾丸酮丛毛单胞菌ProA时球形芽孢杆菌和

ATCC 4978D-转氨酶生产莫纳甜的比较

D-转氨酶	总莫纳甜(每克DAT 蛋白的毫克数) 15分钟	总莫纳甜(每克DAT 蛋白的毫克数) 30分钟	总莫纳甜(每克DAT 蛋白的毫克数) 1小时	总莫纳甜(每克DAT 蛋白的毫克数) 2小时
					ATCC 4978	419.3	598	1017	1348
球形芽孢杆菌(标记)	46.5	128	232	241

表38：采用约50μg睾丸酮丛毛单胞菌ProA时球形芽孢杆菌和

ATCC 4978D-转氨酶生产莫纳甜的比较

D-转氨酶	R，R莫纳甜百分数15分钟	R，R莫纳甜百分数30分钟	R，R莫纳甜百分数1小时	R，R莫纳甜百分数2小时
					ATCC 4978	48.9	38.4	34.4	33.25
球形芽孢杆菌(标记)	72.3	63.4	56.1	53.5

表39：采用约50μg SEQ ID NO：22醛缩酶时球形芽孢杆菌和

ATCC 4978D-转氨酶生产莫纳甜的比较

D-转氨酶	总莫纳甜(每克DAT 蛋白的毫克数) 2小时	R，R莫纳甜百分数2小时
			ATCC 4978	501	92.1
球形芽孢杆菌(标记)	201	95.6

因此，我们证明来自ATCC 4978的D-氨基酸转氨酶能够生产R，R莫纳甜。根据每克蛋白产生的莫纳甜毫克数比较总莫纳甜产量时，ATCC 4978 DAAT活性高于所观察到的球形芽孢杆菌DAAT活性。使用SEQ ID NO：22R-特异性醛缩酶明显提高了R，R莫纳甜占所生产的总莫纳甜的百分数。

实施例18

公开的芽孢杆菌D-氨基酸转氨酶的克隆

重组生产的数种芽孢杆菌D-氨基酸转氨酶(EC 2.6.1.21，也称为D-丙氨酸转氨酶或D-天冬氨酸转氨酶)用于偶联实验以生产R，R莫纳甜。这类酶与前述用于生产莫纳甜的D-转氨酶同源(美国公开号20040063175和美国公开号2005282260)。

菌株

在营养琼脂中30℃培养球形芽孢杆菌(ATCC编号10208)和地衣芽孢杆菌(ATCC10716)过夜。将菌落组置于100μL无菌水中95℃加热5分钟破坏细胞。用3μL进行后续聚合酶链反应(″PCR″)扩增。订购嗜碱芽孢杆菌(ATCC编号BAA-125D)的基因组DNA，重悬于水，使其浓度为100ng/μL。同样订购蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)基因组DNA(ATCC编号1-987D和14579D)，也用于克隆。

聚合酶链反应方法

用NcoI和BamHI位点设计球形芽孢杆菌dat基因引物，以将其克隆入pET 28b和pET 30a载体(诺华基公司，威斯康星州麦迪逊)。pET30构建物包含一个N-末端His-标签和S-标签，但pET 28构建物未标记。

球形芽孢杆菌dat引物：

N端：5′-GATATACCATGGCATACTCATTATGGAATG-3′(SEQ ID NO：88)和

C端：5′-GTTATCGGATCCTTAGGCATTAATTGAAATTG-3′(SEQ ID NO：89)。

利用NdeI和BamHI位点设计地衣芽孢杆菌引物和嗜碱芽孢杆菌引物，以克隆入pET 28b和pET 30a载体。此例中pET30构建物未标记，但pET 28构建物含有一个小的N-末端his-标签。

地衣芽孢杆菌dat引物：

N端：5’-GGCCGGTTCATATGAAAGTTCTTTTTAACGGC(SEQ ID NO：90)和

C端：5’-CCTTCCGGATCCTTAAACCGTTTTGGCTGTCT-3’(SEQ ID NO：91)

嗜碱芽孢杆菌引物：

N端：5’-GATATACATATGGATTATTGCCTTTACCAA-3’(SEQ ID NO：92)和

C端：5’-GAATCCGGATCCTCACTGCTTCATCGCTGTTTG-3’(SEQ ID NO：93)

设计蜡状芽孢杆菌编码序列的引物。一组引物产生NCBI登录号AE016877gi：29899096 5138634...5139506所列的序列(873bp)。一组引物产生的产物包含另外12bp的上游序列，与苏芸金杆菌(B.thuringiensis)预测dat相似，NCBI登录号 AE017355 gi：49328240 4965653...4966537(885bp)。这两组引物的设计中N-末端区含有NdeI，C-末端区含有BamHI限制性位点。设计引物以克隆入pBAD-TOPO TA克隆。

蜡状芽孢杆菌引物：

N端：5’-TAAGAGGAATAACATATGGCATACGAAAGATTT-3’(SEQ ID NO：94)和

C端：5’-GAATTCGGATCCTTAAGAAGATGACATATTGG-3’(较短的PCR产物)(SEQ ID NO：95)

N端：5-TAAGAGGAATAACATATGGGATCGAAATTGGCA-3’(较长的PCR产物)(SEQ ID NO：96)

利用如下PCR方法扩增球形芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌dat基因的编码区。在50μL反应中，使用3μL模板(基因组DNA为2μL)、1.6μM各引物、0.25mM各dNTP、3.5U Expand高保真聚合酶(罗氏，Indianapolis，IN)和1X Expand^TM 含镁缓冲液。所使用热循环程序包括94℃热启动3分钟，接着重复如下步骤8次：94℃30秒、52℃30秒和72℃2分钟。再进行22个退火温度为58℃的循环。30个循环后，将样品维持在72℃7分钟，然后保存于4℃。获得大小正确的洁净PCR产物(对于dat基因约为850bp)。

利用组装PCR技术构建编码蛋白登录号AAA22252(gi：142542)的嗜热脂肪地芽孢杆菌dat(登录号J04460 gi：142541)。该基因/蛋白质的来源常被描述为芽孢杆菌、热稳定型芽孢杆菌或芽孢杆菌YM-1。组装过程如下：根据上述基因序列和其互补DNA序列从IDT订购43种寡核苷酸(40mers)，有义链和反义链之间有20个碱基对重叠。用水将引物稀释为250μM，将每种引物各5μL混合于微量离心管中。按照如下方法进行PCR：每100μL反应中加入1.5μL引物混合物(pool)、4μL dNTP、1X XLPCR缓冲液、1mM醋酸镁、2μL rTth聚合酶(罗氏、Indianapolis、IN)和0.25μL Pfu聚合酶(司查塔基公司，加利福尼亚州拉霍亚)。94℃热启动3分钟，接着是15个下述步骤的循环：94℃30秒、40℃30秒和68℃15秒。用升高的退火温度44℃和延伸时间30秒(68℃)再进行10个循环。用升高的退火温度48℃和延伸时间75秒再进行10个循环。最后，于68℃进行7分钟链延伸步骤。使用为用NdeI(N端)和BamHI(C端)克隆设计的以下引物进行第二轮PCR：

N-端-5’-GGCCTTGGCATATGGGATACACTTTATGGAATGACC-3’(SEQ ID NO：97)

和C-端-5’-TTGGAACCGGATCCTTATATATGAAGCGGTTTTGG-3’(SEQ ID NO：98)

每100μL PCR体系包含2.5μL第一轮反应物、各引物0.4μL、3μL dNTP、1X XL PCR缓冲液、1mM醋酸镁、2μL rTth聚合酶和0.25μL Pfu聚合酶。94℃热启动3分钟，接着是10个下述步骤的循环：94℃30秒、42℃30秒和68℃90秒。将退火温度升至48℃再进行15个循环，最后，于68℃进行7分钟链延伸步骤。利用与第二轮PCR反应相同的模板和条件进行第三轮PCR反应。在琼脂糖凝胶上可以观察到约900bp的产物。

克隆

利用凯杰QIAquick PCR纯化试剂盒(Valencia，CA)纯化球形芽孢杆菌DAT的PCR产物，在BamHI缓冲液中用BamHI和NcoI消化(新英格兰生物实验室公司，Ipswich，MA)。利用凯杰QIAquick凝胶提取试剂盒纯化消化的载体(pET28和pET30)和插入物。利用罗氏快速DNA连接试剂盒(罗氏公司)进行连接，并用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。按照伯乐电穿孔手册所述，利用0.2cm试管和伯乐脉冲II系统将连接物转化到大肠杆菌DH10B中。使细胞在900μL SOC培养基中37℃、225rpm恢复30分钟。将细胞接种于含有卡那霉素(25μg/mL)的LB-琼脂平板。利用凯杰离心小抽试剂盒纯化质粒DNA，并用BamHI和NcoI限制性消化筛选正确的插入物。由阿吉科特生物科学公司(Beverly，MA)通过双脱氧链终止DNA测序法验证似乎含有正确插入物的质粒序列。测序验证了NCBI登录号为AF081278区：134..985(gi：3513754)的编码序列，该序列产生蛋白的氨基酸序列列于登录号AAC33964(gi：3513755)。

凝胶纯化地衣芽孢杆菌DAT(～850bp)和嗜热脂肪地芽孢杆菌的PCR产物，按照生产商方法(英杰公司)利用Zero Blunt TOPO

克隆试剂盒进行克隆。将质粒转化到TOP10化学感受态细胞进行初筛。利用限制性消化筛选质粒DNA，序列经验证与NCBI中的编码序列相匹配。对于地衣芽孢杆菌，序列与登录号U26947区247..1098(gi：857560)相匹配，其产生的蛋白的氨基酸序列列于登录号P54692(gi：1706292)，例外是含有一个429位点的A-G沉默突变。对于嗜热脂肪地芽孢杆菌，序列与上述登录号相匹配。通过限制性消化(NdeI/BamHI)亚克隆该编码区，连接入pET载体并转化到电感受态DH10B细胞中进行扩增。

凝胶纯化嗜碱芽孢杆菌DAT的PCR产物，用NdeI和BamHI消化，连接到上述pET 28和pET 30载体中。在DH10B细胞中扩增载体。用PCR筛选小抽DNA并验证序列。基因序列可参见编码含有登录号NP_243677(gi：15615374)所列氨基酸序列的蛋白质的登录号NC_002570(gi：57596592)2934903..2935754。

用典型的PCR方法扩增蜡状芽孢杆菌编码序列，并按照生产商方案(英杰公司) 进行克隆。

基因表达和测定

以pET载体构建物的形式将质粒DNA亚克隆到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(诺华基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)中。培养该培养物，用凯杰小抽试剂盒分离质粒，通过限制性消化分析以确认其身份。一般在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中进行诱导。于37℃将细胞培养至OD₆₀₀为0.4-0.8，用0.1mMIPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导，诱导后3-4小时取样。按照Novagen BugBuster^TM 试剂(加入Benzonase核酸酶和罗氏(Roche)完全蛋白酶抑制剂混合物)所附的说明书制备细胞提取物。经过SDS-PAGE检测，在两种嗜碱芽孢杆菌基因产物、两种球形芽孢杆菌基因产物、两种嗜热脂肪地芽孢杆菌基因产物和未标记的地衣芽孢杆菌基因产物的预测分子量处获得高水平可溶性蛋白。在采用纯化蛋白的反应中，按照制造商操作方法(诺华基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)用His-Bind柱纯化His标记的基因产物。用PD-10(安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences)，新泽西州皮斯卡塔韦)柱对洗脱组分进行脱盐，用25-100mM磷酸钾缓冲液，pH 7.5洗脱。用Pierce BCA试剂盒进行总蛋白测定，用SDS-PAGE评估表达百分数。或者，用伯乐实验室公司Experion自动化电泳工作站分离细胞提取物中的可溶性蛋白，用Experion软件1.1.98.0版分析浓度和表达百分数。如英杰公司所推荐地表达含有蜡状芽孢杆菌基因的pBAD-TOPO构建物，但DAAT表达水平应使SDS-PAGE分析期间无法区分重组蛋白与其它蛋白。

用以下方案由丙酮酸和D-色氨酸(或R，R莫纳甜)产生丙氨酸后，分析细胞提取物的D-转氨酶活性。一般在100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)、50μM吡哆醛磷酸、25mM丙酮酸钠和50mM D-色氨酸或R，R莫纳甜中进行一式两份的1ml反应。通过加入无细胞提取物或纯化酶启动该反应，30℃温和振荡培育15分钟-过夜。出于比较目的，在各试验中加入大约相同水平的D-转氨酶(一般约0.5mg)。AT-103(生物催化公司)用作阳性对照(或基准)。加入甲酸，使其终浓度为2％，以终止该反应，离心去除沉淀蛋白。也进行不加入蛋白质的对照反应。零时间点也用作阴性对照。用实施例1所述的OPA衍生法检测丙氨酸。

也检测转氨酶由D-色氨酸生产莫纳甜的能力(如实施例3)。每1mL反应混合物中加入：约50-100μg醛缩酶(一般是睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶，纯化的)、4mMMgCl₂、50mM D-色氨酸(以固体形式提供)、0.5-2mg D-转氨酶、200mM丙酮酸钠、100mM磷酸钾缓冲液pH 7.5和0.05mM PLP。一式两份地进行实验，阴性对照中不加转氨酶。于30℃温和振荡培育该样品1小时、2小时和过夜(17-20小时)。使用这些方法生产莫纳甜时检测到的仅有的立体异构体为R，R和S，R。R，R百分数见下，用反相LC峰面积测定。1小时后球形芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和嗜碱芽孢杆菌D-转氨酶的转氨活性的结果见下表40。将数据标准化至0.5毫克D-转氨酶/毫升。

表40：球形芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和嗜碱芽孢杆菌D-转氨酶的转氨活性

D-转氨酶	丙氨酸(mM) D-色氨酸作底物	丙氨酸(mM)R，R莫纳甜作底物
			嗜碱芽孢杆菌(标记)	15.5	1.3
嗜碱芽孢杆菌(未标记)	17.5	1.4
			地衣芽孢杆菌(未标记)	28.4	0.21
球形芽孢杆菌(未标记)	29.0	22.5
			球形芽孢杆菌(标记)	17.1	12.0

用球形芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和嗜碱芽孢杆菌D-转氨酶生产莫纳甜的产量见下表41。各反应含有约90μg睾丸酮丛毛单胞菌ProA。将所产生的总莫纳甜的数据标准化至采用0.5mg D-转氨酶。

表41：比较球形芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和嗜碱芽孢杆菌D-转氨酶的莫纳甜产量

D-转氨酶	总莫纳甜(ppm) 3小时	总莫纳甜(ppm) 过夜	％R，R 3小时	％R，R 过夜
					嗜碱芽孢杆菌(标记)	3.2	13.7	100	99.3
嗜碱芽孢杆菌(未标记)	4	15.5	100	99.3
					地衣芽孢杆菌(未标记)	0.6	8.1	100	29.3
球形芽孢杆菌(未标记)	279.6	577.6	61.55	65.7
					球形芽孢杆菌(标记)	111.2	246	61.0	63.1

球形芽孢杆菌D-转氨酶(未标记)由D-色氨酸生产莫纳甜的活性最高，但与其它酶相比，嗜碱芽孢杆菌酶对R-MP的选择性比S-MP高得多，这导致R，R莫纳甜的立体纯度较高。在测试条件下，蜡状芽孢杆菌细胞提取物没有可检测的活性，但该基因可能不在所选宿主中表达。

如上所述检测嗜热脂肪地芽孢杆菌DAT(未标记，表达得更好)，与纯化的球形芽孢杆菌DAT和AT-103(生物催化公司)作比较。结果见下表42和43。用0.5mg D-转氨酶/mL检测嗜热脂肪地芽孢杆菌、AT-103和球形芽孢杆菌D-转氨酶的转氨活性(表42)。

表42：嗜热脂肪地芽孢杆菌、AT-103和球形芽孢杆菌(纯化)D-转氨酶的转氨活性

D-转氨酶	丙氨酸(mM)-15分钟以D-色氨酸作底物	丙氨酸(mM)-15分钟以R，R莫纳甜作底物	丙氨酸(mM)-2小时以D-色氨酸作底物	丙氨酸(mM)-2小时以R，R莫纳甜作底物
					AT-103	8.91	1.21	9.47	6.13
球形芽孢杆菌 (标记)	8.91	1.65	9.53	7.17
					嗜热脂肪地芽孢杆菌(未标记)	2.05	0.053	8.10	0.78

表43：比较嗜热脂肪地芽孢杆菌、AT-103和球形芽孢杆菌(纯化)的总莫纳甜产量

D-转氨酶	总莫纳甜(ppm) 2小时	总莫纳甜(ppm) 过夜	％R，R 2小时	％R，R 过夜
					AT-103	450	645	65.5	60.6
球形芽孢杆菌(标记)	110	175	64	54
					嗜热脂肪地芽孢杆菌(未标记)	nd	10	n/a	27

与AT-103和球形芽孢杆菌酶相比，天然嗜热脂肪地芽孢杆菌酶的莫纳甜转氨活性显然较低。

实施例19

产生杂交D-转氨酶

实施例18和15中描述了几种芽孢杆菌D-氨基酸转氨酶。虽然嗜热脂肪地芽孢杆菌酶对莫纳甜的转氨活性低，使得由D-色氨酸产生的总莫纳甜较少，但它仍有感兴趣的结构元件，并且是热稳定性酶。因此，在活性较高的酶(球形芽孢杆菌)和地芽孢杆菌酶之间产生杂交蛋白。

杂交DAT编码序列的组装

设计的靶蛋白序列是SEQ ID NO：99。根据大肠杆菌密码子使用设计对应于SEQ ID NO：99的编码序列SEQ ID NO：100。

用组装PCR技术构建杂交DAT。组装方法如下：根据上述基因序列和其互补DNA序列从IDT订购43种寡核苷酸(40mers)，有义链和反义链之间有20个碱基对重叠。用水将引物稀释为250μM，将每种引物各5μL混合于微量离心管中。按照如下方法进行PCR：每100μL反应中加入1.5μL引物混合物、4μL dNTP、1X XL PCR缓冲液、1mM醋酸镁、2μL rTth聚合酶(罗氏，Indianapolis，IN)和0.25μL Pfu聚合酶(司查塔基公司，加利福尼亚州拉霍亚)。94℃热启动3分钟，接着是15个下述步骤的循环：94℃30秒、40℃15秒和68℃30秒。用升高的退火温度44℃和延长的退火时间30秒再进行10个循环。用退火温度48℃和延伸时间75秒再进行10个循环。最后，于68℃进行7分钟链延伸步骤。使用为用NdeI(N端)和BamHI(C端)克隆设计的以下引物进行第二轮PCR：

N-端-5’-GGCCTTGGCATATGGGATACACTTTATGGAATGACCA-3’(SEQ ID NO：101)和C-端-5’-TTGGAACCGGATCCTTAGCTGTTAAGGCTCAGTGGAA-3’(SEQ IDNO：102)

每100μL PCR体系包含2.5μL第一轮反应物、3μL dNTP、1X XL PCR缓冲液、1mM醋酸镁、2μL rTth和0.25μL Pfu聚合酶。94℃热启动3分钟，接着是10个下述步骤的循环：94℃30秒、42℃30秒和68℃75秒。将退火温度升至48℃再进行15个循环，最后，于68℃进行7分钟链延伸步骤。在琼脂糖凝胶上可以观察到约850bp的产物。

克隆

利用凯杰QIAquick凝胶提取试剂盒(Valencia，CA)凝胶纯化PCR产物，用ZeroBlunt TOPO

克隆试剂盒按照生产商方案(英杰公司)进行克隆。将质粒转化到TOP10化学感受态细胞用PCR进行初筛。利用限制性消化筛选质粒DNA，验证DNA序列。

用BamHI和NdeI(新英格兰生物实验室公司，Ipswich，MA)消化小抽的质粒。用罗氏快速DNA连接试剂盒(罗氏公司)连接消化的载体(pET28和pET30)和插入物，用罗氏高纯度PCR产物纯化试剂盒进行纯化。按照伯乐电穿孔手册所述，利用0.2cm试管和伯乐脉冲II系统将连接物转化到大肠杆菌DH10B中。使细胞在900μL SOC培养基中37℃、225rpm恢复30分钟。将细胞接种于含有卡那霉素(25μg/mL)的LB-琼脂平板。利用凯杰离心小抽试剂盒纯化质粒DNA，并用BamHI和NcoI限制性消化筛选正确的插入物。

基因表达和测定

按照生产商方案(诺华基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)将质粒DNA转化到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中。培养该培养物，用凯杰小抽试剂盒分离质粒，通过PCR分析确认其身份。一般在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中进行诱导。于37℃将细胞培养至OD₆₀₀为0.5，用0.1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导，诱导后3小时取样。按照Novagen BugBuster^TM试剂(加入Benzonase核酸酶和罗氏(Roche)完全蛋白酶抑制剂混合物)所附的说明书制备细胞提取物。经过SDS-PAGE检测，在两种基因产物的预测分子量处获得高水平的总蛋白。然而，可溶性蛋白质水平较低。未标记的基因产物表达得较好，并作为细胞提取物进行测定。利用伯乐实验室Experion自动化电泳工作站(Hercules，CA)分离细胞提取物中的可溶性蛋白，并利用 Experion软件1.1.98.0版分析浓度和表达百分数，以标准化对比试验中D-转氨酶的用量。

用以下方案由丙酮酸和D-色氨酸(或R，R莫纳甜)产生丙氨酸后，分析细胞提取物的D-转氨酶活性。一般在100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)、50μM吡哆醛磷酸、25mM丙酮酸钠和50mM D-色氨酸或R，R莫纳甜中进行一式两份的1ml反应(除非另有说明)。通过加入无细胞提取物或纯化酶启动该反应，30℃温和振荡培育15分钟-过夜。出于比较目的，在各试验中加入大约相同水平的D-转氨酶(0.5mg)(除非另有说明)。AT-103(生物催化公司)或球形芽孢杆菌D-转氨酶(实施例18)用作基准酶。加入甲酸，使其终浓度为2％，以终止该反应，离心去除沉淀蛋白。也进行不加入蛋白质的对照反应。零时间点也用作阴性对照。用实施例1所述的OPA柱后衍生法检测丙氨酸。每1mL反应体积采用0.5mg D-转氨酶的反应结果见下表44。

表44：球形芽孢杆菌(纯化)、嗜热脂肪地芽孢杆菌和杂交D-转氨酶的转氨活性

D-转氨酶	丙氨酸(mM)-15分钟以D-色氨酸作底物	丙氨酸(mM)-15分钟以R，R莫纳甜作底物	丙氨酸(mM)-2小时以D-色氨酸作底物	丙氨酸(mM)-2小时以R，R莫纳甜作底物
					杂交DAT(未标记)	13.5	0.084	14.2	0.54
球形芽孢杆菌(标记)	13.6	4.60	13.9	10.6
					嗜热脂肪地芽孢杆菌 (未标记)	6.6	0.18	13.5	2.2

也检测转氨酶由D-色氨酸生产莫纳甜的能力(如实施例3)。每1mL反应混合物中加入：约50-100μg纯化的睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶、4mM MgCl₂、50mMD-色氨酸(以固体形式提供)、0.5-2mg D-转氨酶、200mM丙酮酸钠、100mM磷酸钾缓冲液pH 7.5和0.05mM PLP。一式两份地进行实验，阴性对照中不加转氨酶。于30℃温和振荡培育该样品1小时、2小时和过夜(17-20小时)。使用这些方法生产莫纳甜时检测到的仅有的立体异构体为R，R和S，R。R，R百分数见下表45，用反相LC峰面积确定。莫纳甜浓度低时，R，R百分数不如RPLC峰面积判定的准确。因此，用实施例1所述的FDAA衍生法进一步分析一些样品。该表的括号中显示了这些结果的数值。

表45：比较嗜热脂肪地芽孢杆菌、杂交DAT和球形芽孢杆菌(纯化)的总莫纳甜产量

D-转氨酶	总莫纳甜(ppm) 2小时	总莫纳甜(ppm) 过夜	％R，R 2小时	％R，R 过夜
					杂交DAT(未标记)	9.5	42.5	84.1(79.8)	81.1(69.6)
球形芽孢杆菌(标记)	68.5	182.5	62.7(53.8)	55.1(53.5)
					嗜热脂肪地芽孢杆菌 (未标记)	4.5	15.0	34.1(20.7)	32.1(21.7)

杂交DAT产生的莫纳甜多于嗜热脂肪地芽孢杆菌酶，但杂交DAT的莫纳甜转氨速率较低。可能在莫纳甜生产条件(MP浓度低)下，该杂交体性能更好可能是由于K_m较低。另外，杂交DAT产生的R，R百分数高于任一种母体酶。与母体酶相比，此酶似乎对R-MP具有较高的对映异构体选择性。用实施例3所述的中华根瘤菌(Sinorhizobium)醛缩酶与杂交DAT完成相同试验(4小时培育时间)。杂交DAT产生莫纳甜的产量与上述产量相似，但采用另选醛缩酶产生95％R，R(按照FDAA衍生法)，与采用睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶产生80％R，R不同。

也检测了杂交DAT相对于S-MP对R-MP的转氨活性(如实施例1所述生产)。用10mM R-MP或S-MP、50mM D-丙氨酸、100mM磷酸钾pH 7.5、0.5mg/mL D-转氨酶和50μM PLP于30℃进行2小时和过夜试验。一式两份地进行实验，减去来自MP样品的莫纳甜背景水平。这两种D-转氨酶由各底物产生莫纳甜的比率见下表46。对(生产的)丙酮酸比率作图时，观察到相似趋势。很明显与似乎没有选择性的AT-103D-转氨酶相比，杂交DAT对R-MP的选择性更高。

表46：比较杂交DAT和AT-103的S-MP和R-MP转氨作用

D-转氨酶	R-活性/S-活性 2小时	R-活性/S-活性过夜
			杂交DAT(未标记)	8.6	2.2
AT-103	0.68	1.68

在努力进一步提高杂交DAT活性的过程中，进行定位诱变。如QuikChange多位点定位诱变试剂盒(司查塔基公司)所述设计引物。产生了两种不同的突变体：杂交DAT 2和杂交DAT 3。杂交DAT 2在氨基酸位置153上包含丙氨酸至精氨酸的突变，并缺失丝氨酸181。设计丙氨酸至精氨酸突变，以帮助排列莫纳甜前体底物中的第二个羧基，就像已证明在AspC L-转氨酶中存在的那样。缺失丝氨酸的目的是尝试去除一些位阻，以使较大的莫纳甜前体分子可以更容易地接近活性位点。杂交DAT 3含有丝氨酸180-182缺失，被一个精氨酸取代。产生了另外两种突变体，它们各自只含153ala至arg突变或丝氨酸缺失。含有缺失的所有三种突变体都不产生可溶性蛋白，但它们以非常高的浓度过度表达。很明显，在此区域不去除氨基酸在结构上很重要。ala153arg突变体在测试条件(如上所述)下不产生莫纳甜。在153位附近有相当大的位阻，在180-182区域中不产生缺失会使得更加难以适应莫纳甜前体底物。我们预计，将丝氨酸突变为较小的氨基酸如甘氨酸或丙氨酸会提高对莫纳甜前体的活性，尤其是与ala153arg突变结合时。

实施例20

使用市售D-氨基酸脱氢酶

D-氨基酸脱氢酶是购自生物催化公司(Pasadena，CA)的文库的一部分。

MP和莫纳甜之间相互转变

可用转氨酶或需要还原性辅因子如NADH或NADPH的脱氢酶催化MP胺化形成莫纳甜。这些反应可逆，并可在任一方向上测定。采用脱氢酶时，反应方向主要由铵盐浓度控制。

用市售脱氢酶将莫纳甜转变为MP(莫纳甜前体)

通过跟踪340nm吸光度随NAD⁺转变为更多发色性NADH升高后，监测莫纳甜的氧化脱氨。

0.2mL测定混合物含有100mM碳酸氢钠，pH 9，10mMNAD⁺，20mg/mL D-氨基酸脱氢酶(D-AADH-101-108，生物催化公司)和50mM R，R莫纳甜(一钾盐)。在UV-透过性微量滴定板中一式两份地进行试验，30℃培育。用Molecular DevicesSpectraMax Plus平板阅读器测定终点吸光度。阴性对照不加酶。过夜反应的吸光度改变如下：无酶对照，0.05；D-AADH-101，0.865；D-AADH-102，1.075；D-AADH-103，0.94；D-AADH-104，0.335；D-AADH-105，0.78；D-AADH-106，0.745；D-AADH-107，0.925；D-AADH-108，1.06。

用脱氢酶由MP生产莫纳甜

采用磷酸钾缓冲液中的AT-103广泛性D-转氨酶(生物催化公司)、以丙酮酸作为氨基接受体对R，R莫纳甜进行转氨反应，从而生产用作本试验底物的R-MP。采用磷酸钾缓冲液中的AT-102L-转氨酶(生物催化公司)、以2-酮戊二酸作为氨基接受体对S，S莫纳甜进行转氨反应，从而生产S-MP。用制备级HPLC纯化这两种化合物。

0.25mL测定混合物含有200mM甲酸铵、50mM磷酸钾pH 7.5、5mM NADH、20mg/mL D-氨基酸脱氢酶(D-AADH-101-108，生物催化公司)和10mM MP(钾盐)。向一半测定混合物中加入2mg/mL甲酸脱氢酶(″FDH″)(FDH-101，生物催化公司，4.8U/mg)。30℃培育该样品16小时。用LC/MS/MS分析该样品中的莫纳甜，用实施例1所述的FDAA法测定异构体分布。减去无D-氨基酸脱氢酶对照的背景水平，以说明MP中存在的莫纳甜污染。

由R-MP生产R，R莫纳甜的过程中，酶活性如下：D-AADH-103＞D-AADH-101＞D-AADH-107＞D-AADH 106＞D-AADH-108＞D-AADH-105。由D-AADH 102产生莫纳甜的产量相当低，D-AADH-104似乎无法由R-MP产生莫纳甜。在没有甲酸脱氢酶的反应中，D-AADH-103生成约43ppm的R，R莫纳甜。加入FDH能提高所有有活性酶的莫纳甜产量。这种提高的范围是莫纳甜高2.4倍至莫纳甜高10.1倍(D-AADH-103)。D-AADH-103生成约434ppm的R，R莫纳甜。

S-MP用作反应底物、随后产生S，R莫纳甜时，酶活性如下：D-AADH-106＞D-AADH-107＞D-AADH-105＞D-AADH-101＞D-AADH-102＞D-AADH-103＞D-AADH-108。在测定中，D-AADH-104似乎不产生S，R莫纳甜。D-AADH-106产生约15ppm S，R莫纳甜，还采用FDH酶时产生26ppm。

由吲哚-3-丙酮酸产生莫纳甜

在以下条件下测定采用偶联于SEQ ID NO：22醛缩酶的生物催化公司氨基酸脱氢酶由吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸产生莫纳甜：1mg/mL脱氢酶、10mM NADH、500μg/mL醛缩酶(纯化)、50mM磷酸钾缓冲液pH 7.5、4mM MgCl₂、20mg/mL吲哚-3-丙酮酸、200mM甲酸铵和200mM丙酮酸30℃、100rpm培育20小时。阴性对照不含氨基酸脱氢酶。一式两份地进行实验。与阴性对照相比，似乎脱氢酶由吲哚丙酮酸和丙酮酸产生莫纳甜的产量都无法定量得到(用LC/MS/MS测定，如实施例1所述)。然而，产生了大量丙氨酸和色氨酸。预计提高醛缩酶与脱氢酶的比率会提高莫纳甜产量。也预计，可采用定向衍生方法提高对MP与丙酮酸和吲哚-3-丙酮酸的还原性胺化活性的比值。

实施例21

固定球形芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶

如实施例14所述，将球形芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶纯化为HIS₆-标记蛋白。

按照Mateo，C.等，Biotechnology Progress 18：629-634(2002)的方法将该酶固定在Eupergit

C树脂珠上。用Pierce Slide-A-Lyzer透析盒(7K MWCO；目录号66370；Rockford，IL)，在0.4L 0.5M磷酸钾(pH 7.8)中室温下透析该纯化酶(4mL，6.0mg/mL)1小时。改变缓冲液，继续透析1小时。加入吡哆醛磷酸(″PLP″)，使终浓度为0.05mM，将得到的溶液与0.2g购自西格马-奥德里奇公司的Eupergit

C树脂(Fluka目录号46115；St.Louis，MO)混合。室温下温和振荡培育酶-树脂悬液过夜。4000xg离心5分钟，从酶溶液中分离树脂珠。去除上清液，用3×3mL含有0.05mMPLP的100mM磷酸钾(pH 7.8)洗涤树脂。在每次洗涤之间，以3000xg离心该混合物5分钟。通过测定各上清液中的蛋白量并用固定的原始蛋白量减去该量之和确定结合于树脂的蛋白量。用Pierce BCA^TM蛋白质测定试剂盒测定蛋白浓度，其中以牛血清白蛋白作为标准品(目录号23225；Rockford，IL)。最后，将洗涤过的固定有酶的珠悬浮于4mL含有0.05mM PLP的100mM磷酸钾(pH 7.8)。用1.9M丙氨酸室温下温和振荡培育，以封闭固定有酶的珠上未反应的环氧基团。24小时后，如上所述洗涤该珠，以去除过量丙氨酸，最后重悬于含有0.05mM PLP的100mM磷酸钾(pH7.8)中。固定酶的终浓度为每克树脂珠118毫克蛋白。

实施例22

固定苜蓿根瘤菌ProA醛缩酶

用类似于实施例14所述用于HIS₆-标记的球形芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶的方法将苜蓿根瘤菌HMG醛缩酶(“proA”)纯化为HIS₆-标记蛋白)。

从BL21(DE3)::苜蓿根瘤菌proA pET30(Xa/LIC)的新鲜培养物平板(含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂)开始，在5ml含有50μg/ml卡那霉素的Luria-Bertani肉汤(″LB″)中37℃、225rpm培养细胞过夜。然后，以0.5-0.6％(v/v)将培养物转移到含有800mL LB肉汤(含50μg/ml卡那霉素)的烧瓶中。37℃、225rpm培养细胞，直到OD₆₀₀到达0.6-0.7。通过加入0.2mM IPTG诱导基因表达。继续于30℃、225rpm培育培养物4小时，然后用装有JS-16.25转头的Beckman(Fullerton，CA)J25II离心机以10,000rpm离心收获10分钟。用冰冷的50mM EPPS缓冲液(pH 8.2)洗涤细胞沉淀一次，再次离心细胞。收获洗涤的细胞沉淀并立即使用。为了制备含有苜蓿根瘤菌HIS₆-proA醛缩酶(HIS₆-SmelproA)蛋白的无细胞提取物，将该细胞悬浮于3-4体积的含有100mM NaCl的50mM EPPS(pH 8.2)中，然后用微流体公司(Newton，MA)匀浆器破坏细胞(以20,000psi通过3次)，将悬浮液温度维持在15℃以下。所有后续纯化步骤均在4℃进行。15,000x g离心细胞提取物15分钟，以去除细胞碎片。将各自含有15-20mg可溶性蛋白的无细胞提取物等份施加于以前用Novagen结合缓冲液平衡的Novagen HIS-Bind柱(目录号70971-4)。用2×10mL Novagen结合缓冲液和1×10mL结合缓冲液1∶1稀释的Novagen洗涤缓冲液洗涤该柱。用5mL Novagen洗脱缓冲液由各柱洗脱HIS₆-SmelproA。合并各柱的洗脱组分，用Amicon(Billerica，MA)Ultra-15离心过滤设备浓缩2倍(MWCO 10kDa)。通过以前用含有100mM NaCl的50mM EPPS(pH 8.2)平衡的一次性GE保健(GE Healthcare)PD10脱盐柱(目录号17-0851-01)，以交换缓冲液。

用Pierce BCA^TM蛋白测定试剂盒(目录号23225；Rockford，IL)测定脱盐溶液的蛋白浓度。用伯乐Protean II小凝胶系统(Hercules，CA)和4-15％梯度凝胶以SDS-PAGE测定各组分的纯度和无细胞提取物组分的表达水平。一般地，此方法由 3200mL LB培养物产生约60-70mg酶，纯度约为90％。将纯化酶等份(1-5mL)储存于-80℃待用。

按照Mateo，C.等(2002)Biotechnology Progress 18：629-634，(2002)所述的方法如实施例21所述用于球形芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶的方法将酶固定于Eupergit

C树脂珠上，除了在固定过程中缓冲液中用4mM氯化镁代替了0.05mM PLP。用甘氨酸封闭后，将洗涤的固定酶悬浮于含有4mM氯化镁的100mM磷酸钾(pH 7.8)中。苜蓿根瘤菌proA醛缩酶的终浓度为每克树脂珠52mg蛋白质。

实施例23

用固定酶生产R，R-莫纳甜

如实施例21和22所述纯化和固定球形芽孢杆菌HIS₆-标记的D-丙氨酸转氨酶和苜蓿根瘤菌(R.meliloti)HIS₆-标记的proA醛缩酶。

在装有螺帽的15-mL聚丙烯管中制备50mM丙酮酸钠、40mM D-色氨酸、4mMMgCl₂和50μM PLP在100mM磷酸钾(pH 7.8)中的溶液。向各溶液中加入这两种固定酶，使终体积为4mL。室温下温和振荡培育得到的悬液长达24小时。用HPLC和/或LC-MS分析检测D-色氨酸、D-丙氨酸、R，R-莫纳甜和丙酮酸，从而跟踪各反应的进程。用手性LC/MS/MS测定产物莫纳甜的异构体纯度。所有分析方法参见实施例1。用固定酶进行实验的典型结果见下表47。分析反应过程中形成的莫纳甜异构体纯度显示，酶反应产物为74-80％R，R。

表47：用固定酶生产R，R-莫纳甜

proA醛缩酶浓度 (μg/mL)	D-丙氨酸转氨酶浓度 (μg/mL)	莫纳甜浓度(mM) (4小时时间点)	色氨酸浓度(mM) (4小时时间点)	丙氨酸浓度(mM) (4小时时间点)
					50	500	0.06	17.75	20.51
50	1000	0.29	15.03	24.71
					100	1000	0.33	15.17	24.73
100	2000	0.54	14.40	29.45