ES2587572T3 - Polipéptidos y rutas biosintéticas para la producción de estereoisómeros de monatina y sus precursores - Google Patents

Abstract

Procedimiento para producir R,R-monatina o una sal de la misma, que comprende hacer reaccionar un precursor de la monatina y una o más D-aminotransferasas seleccionadas de entre una D-aminotransferasa de Bacillus halodurans que comprende la secuencia de aminoácidos presentada en el número de acceso NP_243677, una Daminotransferasa híbrida que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 99, una D-aminotransferasa de ATCC 4978 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 86, una D-aminotransferasa de ATCC 7063 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 87, y homólogos de las mismas con una homología de secuencia de por lo menos 90% a las mismas.

Description

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se concentró utilizando concentradores centrífugos Amicon (Millipore, Billerica, MA).

Ejemplo 4

(1) Triptófano racemasa

Se produjo R,R-monatina utilizando D-aminotransferasa y una aldolasa utilizando el D-triptófano como el material de partida (Ejemplo 3). Sin embargo, el L-triptófano puede ser un material de partida preferente por varios motivos. Por ejemplo, el L-triptófano puede resultar menos caro y encontrarse más fácilmente disponible que el D-triptófano. La presente exposición describe varios métodos para obtener una triptófano racemasa activa. Los rendimientos de R,Rmonatina mejoran mediante la utilización de una aldolasa específica de R, es decir, una aldolasa que produzca preferente o selectivamente R-PM. Las figuras 1 y 2 ilustran métodos para producir R,R-monatina estereisoméricamente enriquecida a partir de L-triptófano utilizando una triptófano racemasa, una Daminotransferasa y una aldolasa específica de R.

Se creó una selección para una triptófano racemasa mediante la construcción de una cepa que requiere una racemasa activa para el crecimiento. Un auxótrofo para triptófano requiere una fuente de L-triptófano al cultivarlo en medio mínimo. La complementación del medio con D-triptófano es una manera de seleccionar para una racemasa que convierte el D-triptófano en L-triptófano. Se sometieron a ensayo los auxótrofos de triptófano para el crecimiento en medio mínimo complementado con D-triptófano. Las cepas CAG18455 y CAG18579 del Coli Genetic Stock Center y NRRL12264 (también lipA-, λDE3 lisogenizado y curado de su plásmido) no crecieron al complementarlas con D-triptófano pero crecieron al complementarlas con L-triptófano. E. coli puede utilizarse como organismo huésped aunque también pueden utilizarse otros organismos huésped, tales como levaduras, otras bacterias u otros organismos eucarióticos. Un auxótrofo para el triptófano (concretamente NRRL12264 (también lipA-, λDE3 lisogenizado y curado de su plásmido)) crecerá en D-triptófano tras ser transformado con una D-aminotransferasa. Lo anterior confirma la capacidad de E. coli de transportar D-triptófano al interior de la célula.

Salcher y Lingens han descrito la presencia de una triptófano racemasa en Pseudomonas aurereofaciens (ATCC nº 15926). Salcher O. y Lingens F., J. Gen. Microbiol. 121:465-471, 1980. La triptófano racemasa también ha sido descrita en varias plantas, incluyendo el tabaco, la remolacha, el tomate y el trigo, y el enzima aparentemente resulta inducido por condiciones de estrés osmótico o sequía. La triptófano racemasa podría desempeñar un papel en Sclerochiton ilicifolius en la ruta de producción nativa de monatina. Con el fin de aislar dicha actividad de racemasa, se construyó una biblioteca de expresión a partir de ATCC nº 15926 (u otro organismo con actividad de triptófano racemasa) y la biblioteca se transformó en el auxótrofo para el triptófano. Se seleccionó una cepa que crece utilizando D-triptófano como la fuente de triptófano. También puede utilizarse un método similar para cribar muchas cepas con racemasas conocidas para buscar una racemasa con actividad sobre el D-triptófano. Entre los ejemplos de racemasas que podrían presentar actividad sobre el D-triptófano se incluyen las alanina, serina y glutamato racemasas. Yoshimura T. y Esaki N., "Amino Acid Racemases: Functions and Mechanisms", Journal of Bioscience and Bioengineering 96:103-109, 2003.

La alanina racemasa es dependiente de PLP y ha sido clonada a partir de Salmonella typhimurium (gen dadB). Otras fuentes de alanina racemasas son Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Schizosaccharomyces pombe y Bacillus cereus. Un hongo basidiomiceto, Lentinus edodes, también contiene una alanina racemasa de amplia actividad.

La serina racemasa también es dependiente de PLP y se encuentra en eucariotas (por ejemplo en ADNc del gusano de la seda, de cerebro de rata o de cerebro de ratón), así como en bacterias (Enterococcus gallinarum).

La glutamato racemasa es independiente de PLP y ha sido clonada a partir de Pediococcus pentosaceus, Bacillus pumilus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus brevis, E. coli, Aquifex pyrophilus y Bacillus subtilis. Algunas glutamato racemasas son muy específicas y, en consecuencia, incluso los aminoácidos estructuralmente similares aspartato, asparagina y glutamina podrían no ser sustratos para el enzima.

También existen las aspartato racemasas y son independientes de PLP. Las aspartato racemasas se encuentran en Lactobacilli, cepas de Streptococcus y en algunas arqueobacterias, tales como cepas de Desulfurococcus y Thermococcus. El molusco bivalvo Scapharca brouhtonii también contiene una aspartato racemasa.

Entre otras racemasas presentes en la literatura se incluyen la aminoácido racemasa (EC 5.1.1.10) de Anabaena sp. y Pseudomonas striata, la prolina racemasa y la fenilalanina racemasa multifuncional. También se están sometiendo a ensayo las epimerasas o racemasas relacionadas. Se están sometiendo a ensayo racemasas potenciales para corroborar que no son D-triptófano aminotransferasas. El cribado de potenciales racemasas se lleva a cabo mediante análisis de secuencias y/o un ensayo enzimático. Este método de cribado para la selección de una triptófano racemasa también se utiliza para otras bacterias o arqueobacterias para las que ha sido descrita una triptófano racemasa, así como para bibliotecas de ADNc eucariótico que han sido construidas de manera que permitan la expresión.

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También se sometió a ensayo la aminotransferasa de cadena ramificada para la capacidad de producir monatina a partir de D-triptófano (tal como en el Ejemplo 3) pero aparentemente no presentaba actividad bajo las condiciones sometidas a ensayo.

5 Se transformó el constructo pTRC99a en células E. coli CAG18455 electrocompetentes que eran auxotróficas para la producción de triptófano. Las células se cultivaron en medio mínimo M9 con vitaminas de Balch y 100 mg/l de Ltriptófano, glucosa al 0,4% y cloruro de calcio. Las células no eran capaces de crecer sin L-triptófano. Se sometió a ensayo la inducción con 10, 100 y 1.000 µM de IPTG, a una DO600 de 0,4 durante 4,5 horas. Las bandas en el PM

10 corregido eran visibles en el SDS-PAGE. El plásmido se mutagenizó utilizando el kit de mutagénesis dirigida a múltiples sitios QuikChange® (Stratagene). Los cebadores en la Tabla 24 se diseñaron tal como indicaba el fabricante.

Tabla 24 15

Mutación de aminoácido (numeración de E. coli)

Mutación de nucleótido (numeración de B. lich.) Secuencia del cebador

Y32F

tac 96-->ttc ATCACGGATTTTTATTCGGGGACGGCGTG (SEC ID nº 46)

Y32D

tac 96-->gac ATCACGGATTTTTAGACGGGGACGGCGTG (SEC ID nº 47)

F37Y

ttt 111 --> tat GGACGGCGTGTATGAAGGGATCAGGG (SEC ID nº 48)

R41K

agg 123 -->aag TGTTTGAAGGGATCAAGGTATACGACGGCAAC (SEC ID nº 49)

F37Y + R41K

GACGGCGTGTATGAAGGGATCAAGGTATACGACG (SEC ID nº 50)

Y96F

tac276-->ttc GCTGAAAGACGCTTTCATCCGCTTGGTCG (SEC ID nº 51)

Y96H

tac276 -->cac GCTGAAAGACGCTCACATCCGCTTGGTC (SEC ID nº 52)

R98Y

cgc282 -->tac imagen38

Y96F + R98Y

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Y96H + R98Y

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L108R

ctc 312 --> cgc GCAGGTGACCGCGGACTCGATCCAAAC (SEC ID nº 56)

L110H

ctc318 --> cac GCAGGTGACCTCGGACACGATCCAAAC (SEC ID nº 57)

L108R + L110H

GCAGGTGACCGCGGACACGATCCAAACAATTG (SEC ID nº 58)

L127Y

ttg369 --> tac imagen41

L127K

ttg369-->aag imagen42

I130E

ata375-->gaa imagen43

L127Y + I130E

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L127K + I130E

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Y165L

tac477 --> ttg imagen46

Las mutaciones de aminoácidos se basaron en la estructura cristalina de la ATCR de E. coli y la numeración en la tabla anteriormente proporcionada es para la proteína de E. coli. La numeración de las mutaciones de ADN se basa en el gen bcat de B. licheniformis.

20 Los cebadores se diluyeron a 0,1 mg/ml y típicamente se utilizaron 100 ng de cada cebador oligonucleótido en 50 µl de reacción de mutagénesis; se utilizaron concentraciones proporcionalmente superiores para los cebadores de mayor tamaño. Para los cebadores oligonucleótidos que esencialmente competían para la hibridación con la misma región molde, en ocasiones se utilizó una suma de 100 ng para el reservorio completo de cebadores en esa región.

25 Se utilizaron doscientos nanogramos de molde (bcat de B. lich. en pTRC99a) en la reacción, con 5 µl de 10X tampón QuikChange, 2 µl de dNTP y 2 µl de la mezcla de enzimas. Los productos de amplificación se trataron con endonucleasa de restricción DpnI (Stratagene) (2 µl) durante 2 horas a 37ºC y se transfirieron a un tubo de 1,5 ml de paredes gruesas para la precipitación con etanol. La mezcla de reacción resuspendida (concentrada) se transformó (2,5 µl) n células XL10-Gold Ultracomp incluidas en el kit QuikChange. Se realizó una miniprep de varias colonias y

30 se secuenciaron para garantizar que las mutaciones eran aleatorias y para estimar el nivel de mutagénesis alcanzado. Las colonias se resuspendieron de la placa y se llevaron a cabo minipreps globales. El ADN de las

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la alanina racemasa se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO) (número de catálogo A8936). Las tirosina (aromático) aminotransferasas de S. meliloti y de R. sphaeroides se prepararon tal como se indica en el Ejemplo 1 del documento nº WO 03/091396 A2. Se preparó ProA aldolasa de Comamonas testosteroni tal como se indica en el Ejemplo 4 del documento nº WO 03/091396 A2. Se llevaron a cabo ensayos de proteínas totales utilizando el ensayo de proteínas de Bio-Rad siguiendo los protocolos del fabricante (Hercules, CA).

Reducción de la cantidad de S,S-monatina producida utilizando racemasas

Las mezclas de reacción (volumen de 1 ml, ejecutadas por duplicado) contenían tampón de fosfato potásico 100 mM (pH 8), MgCl2 2 mM, piridoxal-5'-fosfato 0,05 mM ("PLP"), piruvato sódico 200 mM, α-cetoglutarato u oxalacetato 5 mM, aproximadamente 280 µg/ml de TatA de S. meliloti suministrado en un extracto celular, 1 mg/ml de Daminotransferasa de BioCatalytics (AT-103), 100 µl/ml de extracto celular de glutamato racemasa o 1 mg/ml de aspartato racemasa, y aproximadamente 100 µg/ml de Pro aldolasa proporcionada en forma de extracto celular. Se añadió triptófano sólido a una concentración de 10,2 mg/ml. Los controles negativos no contenían racemasa. Las muestras se incubaron a 30ºC (agitación a 250 rpm) durante 1 hora, 2 horas o durante la noche. Las muestras se centrifugaron para separar los precipitados, se filtraron a través de jeringa y se almacenaron a -80ºC previamente al análisis para la monatina utilizando el método de CL/EM/EM indicado en el Ejemplo 1.

La mayoría de las muestras contenía >95% de S,S-monatina debido a las cantidades de L-aminotransferasa nativa presente en los extractos celulares. Sin embargo, las muestras que contenían racemasa presentaban una cantidad reducida de monatina total como resultado de que los enzimas racemasas reducían la disponibilidad de L-glutamato para la transaminación del PM. Sin racemasa se produjeron 1.545-2.355 ppm de monatina (predominantemente S,S) durante el curso temporal. Con las racemasas presentes, sólo se produjeron 879 ppm (enzima de L. brevis), 444a 531 ppm (enzima de P. pentosaceus) y 506 a 1.460 ppm de monatina (aspartato racemasa). Estos datos indican que las racemasas son activas bajo las condiciones de reacciones requeridas para producir monatina. Para minimizar la formación de S,S-monatina a partir de los enzimas del extracto celular, tales como las aspartato aminotransferasas, se llevaron a cabo experimento adicionales con enzimas purificados y una proporción más alta de enzima Daminotransferasa a L-aminotransferasa.

Conversión del L-triptófano en isómeros de monatina que contiene 4-R

Se repitieron los experimentos anteriormente indicados utilizando aproximadamente 54 µg de L-aminotransferasa purificad (TatA de S. meliloti o de R. sphaeroides), 1 mg de aspartato aminotransferasa (BioCatalytics), 1 mg de Daminotransferasa, oxalacetato 5 mM como el aceptor de aminos y 75 µg de aldolasa purificada. Las reacciones se llevaron a cabo por duplicado con un tiempo de muestreo de 2 horas y tiempo de incubación de toda la noche. Los controles negativos se prepararon con L-aminotransferasa de S. meliloti, aunque sin racemasas. Además de la cuantificación de los picos de R,R/S,S y S,R/R,S-monatina basándose en cromatografía de fase inversa, se determinó el porcentaje de cada estereoisómero utilizando la técnica de derivatización con FDAA indicada en el Ejemplo 1. Se muestran los resultados en la Tabla 29, a continuación.

Tabla 29

L-aminotransferasa

Tiempo de incubación Monatina total (ppm) % de S,S % de R,R % de R,S % de S,R

TatA de S. meliloti

2h 17,1 10,2 58,1 0,8 31,0

TatA de S. meliloti

2h 15,8 13,3 55,3 1,0 30,4

TatA de S. meliloti

durante la noche 77,7 25,8 40,0 1,3 32,9

TatA de S. meliloti

durante la noche 67,9 29,4 37,3 1,5 31,8

TatA de R. sphaeroides

2h 241,2 96,3 2,3 0,8 0,6

TatA de R. sphaeroides

2h 223,2 95,7 2,7 1,0 0,6

TatA de R. sphaeroides

durante la noche 600,4 96,6 1,8 0,5 1,1

TatA de R. sphaeroides

durante la noche 618,5 96,1 2,1 0,5 1,3

sin racemasa control

2 h 7,1 92,0 1,4 6,6 0,0

sin racemasa control

2h 5,7 94,0 1,2 4,8 0,0

sin racemasa control

durante la noche 44,6 93,5 1,3 4,7 0,5

sin racemasa

durante la 37,5 95,4 0,9 3,7 0,0

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Claramente la presencia de la racemasa incrementó la cantidad total de monatina producida al utilizar TatA de S. meliloti como el enzima para la transaminación del L-triptófano. Los niveles de monatina se incrementaron de una media de 6,4 a 16,5 ppm en el ensayo de dos horas, y de 41 a 73 ppm en el ensayo de durante la noche. Además, el porcentaje de R,R formado se incrementó de aproximadamente 1% hasta incluso 58% mediante la utilización del enzima racemasa. El estereoisómero S,R de la monatina, otro potente edulcorante, fue el otro componente principal, que se incrementó de prácticamente 0 en los controles negativos a 31%. La TatA de R. sphaeroides claramente presentaba mucha más actividad sobre S-PM que la L-transaminasa de S. meliloti, demostrando la importancia de disponer de un enzima que presente elevada especificidad de sustrato para el L-triptófano en comparación con PM en el caso de que los productos deseados sean los isómeros 4-R de la monatina. Siendo 4S aproximadamente 10% de la monatina total en el punto temporal de las dos horas, TatA de S. meliloti puede considerarse que presenta una actividad limitada sobre PM.

Se repitieron los experimentos con la TatA de S. meliloti purificada (54 µg) y la glutamato racemasa de L. brevis. Al utilizar glutamato racemasa purificada, se utilizaron aproximadamente 64 µg por cada 1 ml de reacción. También se sometieron a ensayo extractos celulares que contenían la glutamato racemasa y se utilizaron 1,4 mg de proteína soluble. Se utilizó nuevamente un control negativo de no racemasa y todas las muestras se sometieron a ensayo por duplicado. Se muestran los resultados en la Tabla 30, a continuación.

Tabla 30

L-aminotransferasa

Tiempo de incubación Monatina total (ppm) % de S,S % de R,R % de R,S % de S,R

L. brevis (purificado)

2h 3,3 49,1 34,2 3,7 13,0

L. brevis (purificado)

2h 3,6 47,9 35,2 3,5 13,4

L. brevis (purificado)

durante la noche 29,3 58,9 24,7 3,2 13,2

L. brevis (purificado)

durante la noche 40,2 55,1 25,0 4,7 15,3

L. brevis (extracto celular)

2h 10,5 45,8 35,9 1,1 17,2

L. brevis (extracto celular)

2h 10,5 47,4 33,9 1,1 17,6

L. brevis (extracto celular)

durante la noche 79,4 70,3 17,9 1,3 10,5

L. brevis (extracto celular)

durante la noche 80,1 69,1 19,1 1,1 10,7

ninguna

2 h 2,7 84,1 7,1 6,3 2,4

ninguna

2h 3,2 84,9 6,0 6,8 2,2

ninguna

durante la noche 36,5 92,3 2,3 4,2 1,2

ninguna

durante la noche 30,5 92,7 2,0 4,1 1,3

Nuevamente, resulta evidente que la adición de la racemasa incrementa la monatina total producida a partir de Ltriptófano, así como el incremento de las cantidades relativas de los isómeros que contienen 4R de la monatina en comparación con la S,S-monatina. La utilización de aldolasa, racemasa y L-aminotransferasa purificadas mejora en gran medida la capacidad de control de la formación del estereoisómero deseado. La proporción de L-a Daminotransferasa también es un modo de manipular la estereoquímica del producto final.

Al comparar los resultados mostrados en las Tablas 1 y 2 en el Ejemplo 2 con los resultados obtenidos bajo condiciones de reacción similares a las condiciones anteriormente indicadas, puede observarse la formación de aproximadamente 7 a 29 ppm de monatina a partir de indol-3-piruvato y que los porcentajes de R,R-monatina formada fueron de aproximadamente 51% a 90%. La utilización de la aspartato racemasa incrementó la cantidad total de monatina producida a 16-78 ppm de monatina, con un % de R,R de aproximadamente 40% a 58%. Además, se utilizó una materia prima (L-triptófano) más estable y más económica. En el Ejemplo 3 se produjeron aproximadamente 73 ppm de monatina a partir de D-triptófano a una proporción de R,R:S,R de aproximadamente 1,7:1. La cantidad total de isómeros 4R era >80% de la monatina total. Debido a que tanto la R,R-monatina como la R,S-monatina son potentes edulcorantes (>1.000 veces más dulces que la sacarosa), resulta crucial la capacidad de enriquecer en estos isómeros, sin necesidad de los caros sustratos D-aminoácidos.

Se prevé que la disponibilidad de una aldolasa no específica o específica de R incrementaría la velocidad de

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Claims (1)

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