JP6951702B2 - トレハンジェリンの製造法 - Google Patents

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Description

クロスリファレンス
本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。また、本願は２０１６年３月４日に出願された日本国特許出願第２０１６−０４２０４５号からの優先権を主張する。本願が優先権を主張するこれらの出願に記載の内容は全て参照によりそのまま本願に組み込まれる。
本発明はトレハンジェリン合成の分野に関する。
ラン科の植物の根より分離された放線菌Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒａ ｒｕｂｒａ Ｋ０７−０５１０株の二次代謝産物よりトレハンジェリンＡ、トレハンジェリンＢ及びトレハンジェリンＣが発見された。トレハンジェリンは、トレハロース１分子にアンジェリカ酸２分子が縮合した化合物であり、光により惹起されたフェオフォルバイドａによる細胞障害を抑える作用、すなわち、細胞保護作用を有している。また、トレハンジェリンＡ及びトレハンジェリンＢは、動物細胞（特には、ヒト細胞）に対して毒性を示さないため、安全な物質である。さらに、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌及び真菌に対して抗菌活性を示さないため、人体に使用しても常在菌に対して悪影響を及ぼさないと考えられる（特許文献１）。
このように、トレハンジェリンは安全で有用な物質であり、光線過敏症治療薬等の医薬品や化粧品への応用が期待され、トレハンジェリンの安価な製造方法が確立されれば、医学的に多大な恩恵があると考えられる。トレハロースの任意の水酸基にアンジェリカ酸を縮合させることは有機合成的に困難であり、酵素反応を利用しなければなければトレハンジェリンの合成は難しい。しかしながら、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒａ ｒｕｂｒａ Ｋ０７−０５１０株に存在すると考えられるトレハンジェリンの合成系は未だ同定されていない。
特開２０１５−０２４９８５号公報
本発明の目的は、光過敏症の治療薬や化粧品として有望なトレハンジェリンの生合成に関与する酵素群及びそれをコードするＤＮＡ配列を提供し、さらに当該酵素群及び当該配列を有するＤＮＡで組換えた微生物を利用したトレハンジェリンの製造方法を提供することにある。
本発明者等は、放線菌Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒａ ｒｕｂｒａ Ｋ０７−０５１０株のトレハンジェリン合成に関与する酵素をコードするＤＮＡ、即ち３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子、３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子、エノイル−ＣｏＡハイドラターゼをコードする遺伝子及びアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の取得を試み、当該４種の遺伝子をクローニングした形質転換体によりトレハンジェリンの生産が可能であるか否かを検討し、当該酵素をコードする遺伝子を有する形質転換体での酵素発現及び機能解析により、本発明を達成するに至った。すなわち、本発明者らは、放線菌Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒａ ｒｕｂｒａ Ｋ０７−０５１０株よりトレハンジェリンの生合成に関与する新規酵素群を見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、下記の何れかを有するＤＮＡ：
（１） 以下の（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される少なくとも１つの塩基配列を有する核酸分子：
（ｉ）配列番号２に記載の塩基配列、配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、あるいは、
配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列であって、当該塩基配列によりコードされるタンパク質がエノイル−ＣｏＡハイドラターゼとしての活性を有する塩基配列；
（ｉｉ）配列番号４に記載の塩基配列、配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、あるいは、
配列番号５に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列であって、当該塩基配列によりコードされるタンパク質が３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼとしての活性を有する塩基配列；
（ｉｉｉ）配列番号６に記載の塩基配列、配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、あるいは、
配列番号７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号６に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列であって、当該塩基配列によりコードされるタンパク質がアシルトランスフェラーゼとしての活性を有する塩基配列；及び
（ｉｖ）配列番号８に記載の塩基配列、配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、あるいは、
配列番号９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号８に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列であって、当該塩基配列によりコードされるタンパク質が３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼとしての活性を有する塩基配列。
（２） （１）における（ｉ）〜（ｉｖ）の全ての塩基配列を有する、（１）に記載の核酸分子。
（３） 配列番号１に記載の塩基配列、配列番号１に記載の塩基配列がコードするアミノ酸において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は、配列番号１に記載の塩基配列と９０％の同一性を有する塩基配列を有する核酸分子である、（２）に記載の核酸分子。
（４） 配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸分子、配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸分子、あるいは、配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号２に記載の塩基配列と９０％の同一性を有する塩基配列を有し、かつ、当該塩基配列によりコードされるタンパク質がエノイル−ＣｏＡハイドラターゼとしての活性を有する核酸分子である、（１）に記載の核酸分子。
（５） 配列番号４に記載の塩基配列を有する核酸分子、配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸分子、あるいは、配列番号５に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列と９０％の同一性を有する塩基配列を有し、かつ、当該塩基配列によりコードされるタンパク質が３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼとしての活性を有する核酸分子である、（１）に記載の核酸分子。
（６） 配列番号６に記載の塩基配列を有する核酸分子、配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸分子、あるいは、配列番号７に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号６に記載の塩基配列と９０％の同一性を有する塩基配列を有し、かつ、当該塩基配列によりコードされるタンパク質がアシルトランスフェラーゼとしての活性を有する核酸分子である、（１）に記載の核酸分子。
（７） 配列番号８に記載の塩基配列を有する核酸分子、配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸分子、あるいは、配列番号９に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号８に記載の塩基配列と９０％の同一性を有する塩基配列を有し、かつ、当該塩基配列によりコードされるタンパク質が３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼとしての活性を有する核酸分子である、（１）に記載の核酸分子。
（８） 配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは、配列番号３において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列、又は配列番号３のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、エノイル−ＣｏＡハイドラターゼ活性を有するタンパク質。
（９） 配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは、配列番号５において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列、又は配列番号５のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ活性を有するタンパク質。
（１０） 配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは、配列番号７において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列、又は配列番号７のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（１１） 配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは、配列番号９において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列、又は配列番号９のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有するタンパク質。
（１２） （１）〜（７）のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
（１３） （１２）に記載のベクターを含有する形質転換体。
（１４） 大腸菌である、（１３）に記載の形質転換体。
（１５） （１３）又は（１４）に記載の形質転換体を培養してトレハンジェリンを生成させることを含む、トレハンジェリンの製造方法。
（１６） 少なくとも、（８）〜（１１）のいずれか１項に記載のタンパク質を基質と作用させることを含む、トレハンジェリンの製造方法。
（１７） （８）〜（１１）に記載の全てのタンパク質を基質と作用させることを含む、（１６）に記載のトレハンジェリンの製造方法。
一態様において、本発明はトレハンジェリン合成に関与する酵素群及び当該酵素群をコードする核酸分子に関する。本明細書において、「トレハンジェリン」とは、下記一般式で表される化合物を意味する：
Figure 0006951702
 ［式中、Ｒ１〜Ｒ３のいずれか一つは２−メチルブタ−２−エノイル基であり、残りの二つは水素原子を示し、かつ、Ｒ４〜Ｒ６のいずれか一つは２−メチルブタ−２−エノイル基であり、残りの二つは水素原子を示す。］
本明細書におけるトレハンジェリンとしては、例えば、トレハンジェリンＡ、トレハンジェリンＢ、及びトレハンジェリンＣを挙げることができる。トレハンジェリンＡは下記式Ｉで表される化合物である。
Figure 0006951702
本明細書において、トレハンジェリンＢとは、下記式ＩＩで表される化合物である。
Figure 0006951702
本明細書において、トレハンジェリンＣとは、下記式ＩＩＩで表される化合物である。
Figure 0006951702
本明細書において「トレハンジェリン合成」とは、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択される少なくとも１つの工程を意味する。すなわち、トレハンジェリン合成は、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択される１種類、又は２種類以上の工程（２種類、３種類又は全て）を含む：
（ａ）アセチル−ＣｏＡとメチルマロニル−ＣｏＡが反応して、２−メチルアセトアセチル−ＣｏＡが生成する工程；
（ｂ）２−メチルアセトアセチル−ＣｏＡが３−ヒドロキシ−２−メチルブチリル−ＣｏＡに変換される工程；
（ｃ）３−ヒドロキシ−２−メチルブチリル−ＣｏＡがアンジェリル−ＣｏＡに変換される工程；及び
（ｄ）アンジェリル−ＣｏＡとトレハロースが反応して、トレハンジェリンに変換される工程。
よって、本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択される１種類、又は２種類以上の方法（２種類、３種類又は全て）を含む
（ａ）アセチル−ＣｏＡとメチルマロニル−ＣｏＡとを反応させて、２−メチルアセトアセチル−ＣｏＡを製造する方法；
（ｂ）２−メチルアセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−２−メチルブチリル−ＣｏＡに変換する方法；
（ｃ）３−ヒドロキシ−２−メチルブチリル−ＣｏＡをアンジェリル−ＣｏＡに変換する方法；及び
（ｄ）アンジェリル−ＣｏＡとトレハロースとを反応させて、トレハンジェリンに変換させる方法。
本発明における「トレハンジェリン合成に関与する酵素群」とは、前記（ａ）〜（ｄ）の工程を触媒する酵素のことであり、具体的には、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（前記（ａ）の工程を触媒）、３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（前記（ｂ）の工程を触媒）、エノイル−ＣｏＡハイドラターゼ（前記（ｃ）の工程を触媒）、及びアシルトランスフェラーゼ（前記（ｄ）の工程を触媒）を意味する。
本明細書において、トレハンジェリン合成に関与する酵素群は、代表的には、それぞれ、配列番号５（３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ）、配列番号９（３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ）、配列番号３（エノイル−ＣｏＡハイドラターゼ）及び配列番号７（アシルトランスフェラーゼ）に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本明細書においては、これらの酵素群は、配列番号５（３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ）、配列番号９（３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ）、配列番号３（エノイル−ＣｏＡハイドラターゼ）及び配列番号７（アシルトランスフェラーゼ）に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。本明細書において「１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入された」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されていることを意味する。また、本明細書においては、これらの酵素群は、それぞれ、配列番号５（３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ）、配列番号９（３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ）、配列番号３（エノイル−ＣｏＡハイドラターゼ）及び配列番号７（アシルトランスフェラーゼ）に記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性又は同一性を有し、あるいは、例えば、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。アミノ酸配列の相同性又は同一性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）等、当業者に良く知られたツールを用いて調べることができる。
本明細書において、「１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質」及び「６０％以上等の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質」は、元となるアミノ酸配列を有するタンパク質が有する生物学的活性、すなわち酵素活性を有する。これらのタンパク質が有する生物学的活性は、元となるアミノ酸配列を有するタンパク質と同じ性質の活性であればよく、活性の強さとして同程度の活性を有する必要はない。具体的には、配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質、及び、配列番号５に記載のアミノ酸配列と６０％以上等の相同性又は同一性を有するタンパク質は、前記（ａ）の反応を触媒する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ活性を有する。配列番号９に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質、及び、配列番号９に記載のアミノ酸配列と６０％以上等の相同性又は同一性を有するタンパク質は、前記（ｂ）の反応を触媒する３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有する。配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質、及び、配列番号３に記載のアミノ酸配列と６０％以上等の相同性又は同一性を有するタンパク質は、前記（ｃ）の反応を触媒するエノイル−ＣｏＡハイドラターゼ活性を有する。配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質、及び、配列番号７に記載のアミノ酸配列と６０％以上等の相同性又は同一性を有するタンパク質は、前記（ｄ）の反応を触媒するアシルトランスフェラーゼ活性を有する。本明細書全体に亘って、あるタンパク質が、目的の酵素活性を有するか否かは、元となるオリジナルのタンパク質が触媒可能な条件下で、各タンパク質を対応する基質と反応させ、期待される産物が得られるか否かを検出することにより確認することができる。期待される産物が少しでも含まれている場合には、当該タンパク質は前記酵素活性を有すると判定することができる。
別の態様において、本発明は、前記酵素群をコードする塩基配列を有する核酸分子に関する。具体例として、本発明の核酸分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８に記載の塩基配列のうち、少なくとも１種類の塩基配列を有する核酸分子である。本発明の核酸分子は、更に、配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列、配列番号４に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列、配列番号６に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列、及び配列番号８に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む。同一性は、９０％以上であればより高いものでもよく、例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい。核酸配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）等、当業者に良く知られたツールを用いて調べることができる。
本明細書において、「９０％以上等の同一性を有する塩基配列を有する核酸分子」によりコードされたタンパク質は、元となる核酸分子によりコードされたタンパク質が有する生物学的活性、すなわち酵素活性を有する。よって、例えば、配列番号４に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によりコードされるタンパク質は、前記（ａ）の反応を触媒する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ活性を有する。同様に、配列番号８に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によりコードされるタンパク質は、前記（ｂ）の反応を触媒する３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有する。配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によりコードされるタンパク質は、前記（ｃ）の反応を触媒するエノイル−ＣｏＡハイドラターゼ活性を有する。配列番号６に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によりコードされるタンパク質は、前記（ｄ）の反応を触媒するアシルトランスフェラーゼ活性を有する。
本発明の核酸分子は、前記酵素群のうち、少なくとも１種類の酵素をコードする塩基配列を有していれば良いが、２種類以上（例えば、２種類、３種類、又は全て）の酵素をコードする塩基配列を有していてもよい。本発明の核酸分子が２種類以上の酵素をコードする塩基配列を有している場合、各酵素をコードする塩基配列は開始コドンを含まない任意のノンコーディング領域を介して結合していても良い。あるいは、本発明の核酸分子が２種類以上の酵素をコードする塩基配列を有している場合、各酵素をコードする塩基配列の一部が重複していてもよい。例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８に記載の塩基配列の全てを有する配列番号１に記載の塩基配列においては、１〜８２８番目が配列番号２の塩基配列、８７５〜１９００番目が配列番号４の塩基配列、１９０５〜２６８４番目が配列番号６の塩基配列、２６８１〜３４７５番目が配列番号８の塩基配列と同一であり、配列番号２と配列番号４、及び、配列番号４と配列番号６の間にはノンコーディング領域がある他、配列番号６と配列番号８は一部の核酸配列を共有しており、配列番号１の中で重複したコーディング領域が存在する。
本明細書において、「核酸分子」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡの混合物を意味する。核酸分子は、目的のタンパク質を発現可能である限り、修飾等されたものであっても良い。また、本発明は、前記酵素群のうち、少なくとも１種類の酵素をコードする塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸分子も包含する。
本発明のさらに別の側面によれば、前記酵素群をコードする塩基配列を有するＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むベクターが提供される。本発明のベクターは、微生物において当該ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを発現可能なベクターであれば特に限定されるものではないが、宿主である大腸菌又は放線菌において自立複製又は染色体中への組込みが可能であることが好ましい。また、本発明のベクターは、前記ＤＮＡ及び／又はＲＮＡに加えて、転写終結配列、プロモーター領域、リボソーム結合配列、及び／又はプロモーターを制御する配列を含んでいてもよい。本発明のベクターは好ましくはプロモーター領域を含み、この場合、前記ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの発現を制御可能な位置にプロモーターを含有していることが好ましいが含まれていてもよい。ファージベクターとプラスミドベクターのいずれであっても良く、好ましくは、大腸菌又は放線菌で発現するベクターである。本発明のベクターとしては、例えば、ＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ〔ストラタジーン社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＳＫ（＋）〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）〕、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１〔ＤＮａＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）〕、λＴｒｉｐｌＥｘ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ（ファルマシア社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２〔Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）〕、ｐＭＷ２１８（和光純薬社製）、ＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＱＥ−３０（キアゲン社製）、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＱＥ−３０（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８， ６６９ （１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ−（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭＢＰ−５４０７）、ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭＢＰ−５４０８）、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴ−３（ノヴァジェン社製）、ｐＥＴ−１５ｂ（ノヴァジェン社製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＣｏｌｄＩ（宝酒造社製）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７２， ２３９２（１９９０）〕等を例示することができる。
プロモーターとしては、宿主である放線菌細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｒｐｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌｅｔＩプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、宿主である放線菌細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したベクターを用いることが好ましい。
本発明の別の側面によれば、上記ベクターを有する形質転換体又は宿主細胞が提供される。例えば、形質転換体又は宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、ＰＳＥｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、ＲｈｏｄｏｐＳＥｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｎ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｙｎｎｅｃｏｃｃｕｓ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属等に属する微生物をあげることができ、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、ＰＳＥｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、ＲｈｏｄｏｐＳＥｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｎ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｙｎｎｅｃｏｃｃｕｓ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属に属する微生物等をあげることができる。放線菌としては、例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｘｆｏｌｉａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｒｇｅｎｔｅｏｒｕｓを挙げることができる。本発明の形質転換体は、酵素タンパク質を効率的に発現できる能力を有する宿主細胞であればどのような細胞でも構わないが、大腸菌、パン酵母、及び放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）が好ましく、大腸菌及び放線菌がより好ましく、大腸菌が最も好ましい。
図１は、ｏｒｆＡ、ｏｒｆＢ、ｏｒｆＣ、ｏｒｆＤを導入した放線菌からトレハンジェリンの生産を、ＬＣ／ＭＳを用いて検出した結果を示す。 図２は、ｏｒｆＢ、ｏｒｆＤ及びｏｒｆＡの反応生成物を、ＬＣ／ＭＳを用いて検出した結果を示す。
（１）核酸分子の取得
本発明の核酸分子はＰＣＲ法により取得することができる。例えば、ＰＣＲ法により配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８に記載の塩基配列を有する核酸分子（例えば、ＤＮＡ）は、放線菌Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒａ ｒｕｂｒａ Ｋ０７−０５１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として使用し、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に記載の塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用して、ＥｘｐａｎｄＴＭ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ・ライフサイエンス社製）等を用い、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）にてＰＣＲを行うことにより得ることができる。なお、後のクローニング操作を容易にするために、プライマーには適当な制限酵素部位を付加させておくことが好ましい。
ＰＣＲの反応条件として、９４℃で３０秒間（変性）、６０℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で１分〜３分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件を挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。クローニングは、常法、例えば、モレキュラークローニング第２版、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３８， Ｊｈｏｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ （１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮａＣｌｏｎｉｎｇ １： ＣｏｒｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９５）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐＴＰｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ライフ・テクノロジーズ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）を用いて行なうことができる。
クローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自律複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる、大腸菌の発現用ベクターをクローニングベクターとして用いてもよい。具体的には、上述の本発明のベクターを使用することができる。
得られた形質転換株より、目的とするＤＮＡを含有したプラスミドを常法、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮａＣｌｏｎｉｎｇ １： ＣｏｒｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法により取得することができる。上記方法により、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８に記載の塩基配列を有する核酸分子（例えば、ＤＮＡ）を取得することができる。
また、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入されている塩基配列であって、特定の活性を有する酵素タンパク質をコードする塩基配列を有する核酸分子は、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８に記載の塩基配列を有する放線菌由来のＤＮＡ断片の塩基配列を利用し、他の微生物等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。あるいは、上記したような変異ＤＮＡは、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。具体的には、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８に記載の塩基配列を有するＤＮＡに人工的に変異を導入することにより変異ＤＮＡを取得することができる。
例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異源となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法を用いて行う方法がある。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発方法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，９４４１（１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５ 、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，８７４９（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｇｅｎｅ，１０２，６７（１９９１）等に記載の方法に準じて行うことができる。
（２）ベクター、形質転換体、及び酵素の取得
本発明のベクターは、上記ＤＮＡを常法の遺伝子組み換え技術を用いてベクターに組み込むことにより得ることができる。また、本発明の形質転換体は、当業者周知の方法を用いて前記ベクターを宿主細胞に導入することにより得ることができる。更に本発明のタンパク質（酵素）は、上記ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のトレハンジェリン合成に関与する酵素タンパク質を生成させることにより得ることができる。
トレハンジェリン合成に関与する酵素群（３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、エノイル−ＣｏＡハイドラターゼ、及びアシルトランスフェラーゼ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を宿主細胞中で発現させるため、当該遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素あるいはＤＮＡ分解酵素で該遺伝子を含む適当な長さのＤＮＡ断片として得た後、発現ベクター中においてプロモーターの下流に挿入し、得られた発現ベクターを、当該発現ベクターに適合した宿主胞中に導入することにより得ることができる。
本発明で使用する宿主細胞は、酵素タンパク質を効率的に発現できる能力を有する宿主細胞であれば限定されるものではなく、上述の本発明の宿主細胞を用いることができる。また、発現ベクターとしては、上述の本発明のベクターを用いることができる。
組換えベクターの導入方法としては、例えば、宿主である放線菌細胞へＤＮＡを導入する方法であればいかなる方法を用いてもよく、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２号公報）、又はＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ＆ＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
上記ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中に、本発明の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、エノイル−ＣｏＡハイドラターゼ、アシルトランスフェラーゼを生成させることができる。
本発明のトレハンジェリン合成に関与する酵素群を組み込んだ形質転換体の培養は、採用した宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。本発明の形質転換体が大腸菌、放線菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。例えば、放線菌を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、宿主微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等が用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン、チオストレプトン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した放線菌を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した放線菌を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した放線菌を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
以上により得られた酵素タンパク質は菌体内生産の場合は宿主細胞を破壊し塩析、透析、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、有機溶剤処理、加熱処理等公知のタンパク質精製方法の組み合わせにより、必要な精製度まで精製する。また、反応や反応産物に支障がなければ菌体そのものや菌体を破壊した溶液、破壊溶液の可溶性画分でも良い。
酵素タンパク質の精製・活性発現の容易性の面から、目的の酵素タンパク質は水溶性であることが好ましいが、水不溶性であっても当業者周知の方法、例えば界面活性剤添加等により可溶化しても良い。また、目的のタンパク質は他のタンパク質（例えば、ＧＳＴ、ＴＡＧ等）との融合タンパク質として発現させて取得することもできるが、好ましくは、融合タンパク質ではない。
（３）トレハンジェリンの製造方法
トレハンジェリンは、本発明のトレハンジェリン合成に関与する酵素群を組み込んだ形質転換体の培養物中にトレハンジェリンを生成蓄積さることにより、製造することができる。例えば、放線菌を宿主として用いた場合、放線菌はトレハロース合成経路を有しているが、培養中必要に応じて培養液にトレハロースを添加してもよい。培養は、上述の酵素群の取得方法において記載された方法に準じて行うことができる。
あるいは、トレハンジェリンは、精製された本発明のトレハンジェリン合成に関与する酵素群を用いて製造することもできる。即ち、本発明は、少なくとも、配列番号７のアミノ酸配列（又はそれと６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列又は配列番号７において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び若しくは挿入されたアミノ酸配列）を有する酵素タンパク質（ｏｒｆＣ）の存在下で、アンジェリル−ＣｏＡとトレハロースを反応させることを含むトレハンジェリンの合成方法も含む。本発明のトレハンジェリンの合成方法は、更に、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される１種類〜３種類のステップを含んでいても良い：（ｉ）配列番号５のアミノ酸配列（又はそれと６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列又は配列番号５において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び若しくは挿入されたアミノ酸配列）を有する酵素タンパク質（ｏｒｆＢ）の存在下で、アセチル−ＣｏＡとメチルマロニル−ＣｏＡを反応させて２−メチルアセトアセチル−ＣｏＡを得ること；（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列（又はそれと６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列又は配列番号９において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び若しくは挿入されたアミノ酸配列）を有する酵素タンパク質（ｏｒｆＤ）の存在下で、２−メチルアセトアセチル−ＣｏＡとＮＡＤＰＨを反応させて、３−ヒドロキシ−２−メチルブチリル−ＣｏＡを得ること；及び、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列（又はそれと６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列又は配列番号３において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び若しくは挿入されたアミノ酸配列）を有する酵素タンパク質（ｏｒｆＡ）の存在下で、３−ヒドロキシ−２−メチルブチリル−ＣｏＡをアンジェリル−ＣｏＡに変換すること。酵素を用いた反応は、以下のタンパク質の酵素活性の測定方法記載の方法に準じて行うことができる。
本発明の形質転換体の培養物からのトレハンジェリンの単離精製は、特開２０１５−０２４９８５に記載された方法、すなわち菌体分離、抽出、蒸留、クロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより行うことが出来る。
（４）タンパク質の酵素活性の測定方法
得られたタンパク質の酵素活性は、通常の酵素の活性測定法に準じて測定することができる。活性測定の反応液に用いる緩衝液のｐＨは、目的とする酵素の活性を阻害しないｐＨ範囲であればよく、最適ｐＨを含む範囲のｐＨが好ましい。
緩衝液としては、酵素活性を阻害せず、上記ｐＨを達成できるものであればいずれの緩衝液も用いることができる。該緩衝液として、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液、硼酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、炭酸水素緩衝液などを用いることができる。緩衝液の濃度は酵素活性に阻害を及ぼさない限りどのような濃度でも用いることができるが、好適には１ｍＭから１Ｍである。
反応液には、目的とする酵素の基質を添加する。具体的には、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ活性測定においては、アセチルＣｏＡとメチルマロニル−ＣｏＡを添加する。３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ活性測定には、２−メチルアセトアセチル−ＣｏＡを添加する。エノイル−ＣｏＡハイドラターゼ活性測定には、３−ヒドロキシ−２−メチルブチリル−ＣｏＡを添加する。アシルトランスフェラーゼ活性測定には、アンジェリル−ＣｏＡを添加する。基質の濃度は反応に支障のない限りどのような濃度でも用いることができるが、好適には反応液中の濃度は０．０１ｍＭ〜０．２Ｍである。反応に用いる酵素濃度に特に制限はないが、通常０．００１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で反応を行う。用いる酵素は必ずしも単一にまで精製されている必要はなく、反応を妨害しない限り、他の侠雑蛋白質が混入した標品であってもよい。
反応温度は、目的とする酵素の活性を阻害しない温度範囲であればよく、最適温度を含む範囲の温度が好ましい。即ち、反応温度は、１０℃から６０℃、より好ましくは２７℃から４０℃である。
活性の検出は、反応に伴う基質の減少、あるいは反応生成物の増加の変化を測定できる方法を用いて行うことができる。該方法として、例えば、必要に応じて薄相クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）等により目的物質を分離定量する方法をあげることができる。反応産物の同定には、薄相クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等により目的物質を分離した後、標品と保持時間を比較する方法、核磁気共鳴吸収装置や質量分析計を用いる方法を用いることができる。
（５）アンジェリル−ＣｏＡの製造方法
更に本発明は、本発明の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、及び／又は、エノイル−ＣｏＡハイドラターゼを用いることによる、アンジェリル−ＣｏＡの製造方法に関する。本製造方法においては、溶液中に３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、及び／又は、エノイル−ＣｏＡハイドラターゼ、並びに、アセチル−ＣｏＡ、メチルマロニル−ＣｏＡ、及び／又は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の３種類の基質を適宜添加して、適宜反応させることによりアンジェリル−ＣｏＡを製造することができる。より具体的には、本発明のアンジェリル−ＣｏＡの製造方法は、上述のトレハンジェリンの合成方法において記載された（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される１種類〜全てのステップを含むことができる。アンジェリカ酸エステルは解熱鎮痛剤、筋弛緩剤、鎮静剤等としての利用が考えられる。
以下に実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが，これは本発明の範囲を限定するものではない。なお，本願明細書全体を通じて引用する文献は，参照によりその全体が本願明細書に組み込まれる。
（分析方法）
以下の実施例において、ＬＣ／ＭＳによる分析は次の条件で行なった。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−４（ＧＬセイエンス社製）、サイズ直径３．０ｍＭ×長さ２５０ｍＭ、４０℃
移動層：２ｍＭ 酢酸アンモニウム水溶液（Ａ）、２ｍＭ 酢酸アンモニウム含有メタノール溶液（Ｂ）、０−５分 ５％Ｂ、５−３５分 ５−１００％Ｂ、３５−４０分 １００％Ｂ、流速０．５ｍｌ／分
検出：ＱＳＴＡＲ Ｅｌｉｔｅ ＥＳＩ ｑｕａｄｒｕｐｌｅ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ（Ｑ−ＴＯＦ）ＭＳ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）
〔実施例１〕配列番号１のＤＮＡをクローニングした放線菌によるトレハンジェリンの生産
Ｋ０７−０５１０株を、酵母エキス１％、グルコース１％より成るＹＤ培地で適当な温度（例えば２７℃）で数日間培養した。培養後、得られた培養液より遠心分離により菌体を取得し、菌体より常法（モレキュラー・クローニング第２版）に従い染色体ＤＮＡを単離精製した。
配列番号１の４つのオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）を便宜上、塩基配列番号の少ない方から、ｏｒｆＡ、ｏｒｆＢ、ｏｒｆＣ、ｏｒｆＤと命名した。ｏｒｆＡ〜Ｄの配列番号１における位置と機能は以下の通りである。
ｏｒｆＡ（配列番号２：配列番号１の塩基番号１−８２８、エノイル−ＣｏＡハイドラターゼをコード）
ｏｒｆＢ（配列番号４：配列番号１の塩基番号８７５−１９００、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコード）
ｏｒｆＣ（配列番号６：配列番号１の塩基番号１９０５−２６８４、アシルトランスフェラーゼをコード）
ｏｒｆＤ（配列番号８：配列番号１の塩基番号２６８１−３４７５、３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼをコード）
上記４つの遺伝子を十分発現させるような組換え体プラスミドをＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０ （１９８５）〕を用いて下記方法により構築した。
放線菌Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒａ ｒｕｂｒａ Ｋ０７−０５１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１０に示した５’末端にＰｓｔＩ制限酵素サイト及びリボソーム結合配列を有するセンスプライマー、配列番号１１に示した５’末端にＳｔｕＩ制限酵素サイトを有するアンチセンスプライマー及びＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロシュ・ライフサイエンス社製）を用い、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）でＰＣＲを行うことによりｏｒｆＡ、ｏｒｆＢ、ｏｒｆＣ及びｏｒｆＤ（以下、「ｏｒｆＡＢＣＤ」という）を発現させるＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で４分間からなる反応工程を１サイクルと３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製し、制限酵素ＰｓｔＩとＳｔｕＩとで消化することで、ＰｓｔＩとＳｔｕＩ処理ｏｒｆＡＢＣＤを発現させるＤＮＡを含有するＤＮＡ断片（以下、「ｏｒｆＡＢＣＤ含有ＤＮＡ断片」という）を取得した。
ｐＯＳＶ５５６ｔ〔Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．，３，３３８，（２０１１）〕を制限酵素ＰｓｔＩとＳｔｕＩで消化し、ＰｓｔＩとＳｔｕＩ処理ｐＯＳＶ５５６ｔ断片を取得した。上記で取得されたＰｓｔＩとＳｔｕＩ処理ｏｒｆＡＢＣＤ含有ＤＮＡ断片をＰｓｔＩとＳｔｕＩ処理ｐＯＳＶ５５６ｔ断片と混合した後、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。該形質転換体より定法に従って組換えＤＮＡを含むプラスミドを単離した。該組換え体ＤＮＡがｏｒｆＡＢＣＤであることをＤＮＡ配列を決定することによって確認し、このプラスミドをｐＯＳＶ５５６−ｏｒｆＡＢＣＤと命名した。
ｐＯＳＶ５５６−ｏｒｆＡＢＣＤを常法によりＥ．ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２株〔Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （２０００）〕に導入し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌ、アンピシリン１００μｇ／ｍｌに耐性を示すＥ． ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／ｐＯＳＶ５５６−ｏｒｆＡＢＣＤ株を得た。さらに、ｐＯＳＶ５５６−ｏｒｆＡＢＣＤを常法によりＥ． ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２株から放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ Ｊ１０７４株に接合伝達させることによりハイグロマイシン５０μｇ／ｍｌに耐性を示すＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ／ｐＯＳＶ５５６−ｏｒｆＡＢＣＤを得た。
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ／ｐＯＳＶ５５６−ｏｒｆＡＢＣＤを酵母エキス１％、グルコース１％からなる液体培地１０ｍｌ中、２７℃で１日間震盪培養し、２０％トレハロース水溶液１ｍｌを添加した後、さらに２７℃で４日間震盪培養した。得られた培養液にエタノール１０ｍｌを加えて１時間撹拌した。次にその抽出液中のエタノールを減圧留去し、得られた水溶液に５ｍｌの酢酸エチルを加えよく撹拌後、酢酸エチル層を回収した。濃縮乾固し、メタノール１００μｌに溶解させ、ＬＣ／ＭＳで分析を行なうことでトレハンジェリンの生産を確認した（図１）。
〔実施例２〕配列番号４の塩基配列によりコードされた酵素タンパク質（ｏｒｆＢ）の機能確認
３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子（ｏｒｆＢ）を十分発現させるような組換え体プラスミドをＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０（１９８５）〕を用いて下記方法により構築した。
放線菌Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒａ ｒｕｂｒａ Ｋ０７−０５１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１２に示した５’末端にＮｄｅＩ制限酵素サイトを有するセンスプライマー、配列番号１３に示した５’末端にＸｈｏＩ制限酵素サイトを有するアンチセンスプライマー及びＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロシュ・ライフサイエンス社製）を用い、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）でＰＣＲを行うことによりｏｒｆＢを増幅した。ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる反応工程を１サイクルと３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製し、制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩとで消化することで、ＮｄｅＩとＸｈｏＩ処理ｏｒｆＢ含有ＤＮＡ断片を取得した。
ｐＥＴ−１５ｂ（ノヴァジェン社製）を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、ＮｄｅＩとＸｈｏＩ処理ｐＥＴ１５−ｂ断片を取得した。上記で取得されたＮｄｅＩとＸｈｏＩ処理ｏｒｆＢ含有ＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＸｈｏＩ処理ｐＥＴ−１５ｂ断片と混合した後、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。該形質転換体より定法に従って組換えＤＮＡを含むプラスミドを単離した。ＤＮＡ配列を決定することにより、配列番号４に記載の塩基配列が得られたことから、ＤＮＡ該組換え体ＤＮＡがｏｒｆＢであることを確認し、このプラスミドをｐＥＴ−１５ｂ−ｏｒｆＢと命名した。
ｐＥＴ１５−ｂ−ｏｒｆＢを常法によりＤＥ３を有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノヴァジェン社製）に導入し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌに耐性を示すＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ１５−ｂ−ｏｒｆＢ株を得た。ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ１５−ｂ−ｏｒｆＢ株をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地２００ｍｌ中、３７℃で培養し、６００ｎｍの濁度が０．５に達した時点で、培養液を２時間冷蔵した後、イソプロピルチオガラクトシドを終濃度０．５ｍＭになるように添加した。さらに１８℃で１６時間培養した後、遠心分離（９０００ｒｐｍ、２分間）によって培養上清を除いた。この菌体を洗浄緩衝液〔２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール〕１０ｍｌに懸濁し、９０ｍｇ／ｍｌフェニルメチルフルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を１０μｌ添加し、超音波破砕機（和研薬社製）を用いて氷冷しつつ破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）にかけ、上清を回収した。この細胞抽出液遠心上清をＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｒｅｓｉｎ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に通し、２０ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄した。ついで溶出緩衝液〔２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール〕５ｍｌを通塔し、溶出させた。溶出液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ（メルク社製）を用いて濃縮した。
次に、得られた組換え酵素タンパク質（ＯｒｆＢ）がアセチル−ＣｏＡとメチルマロニル−ＣｏＡから２−メチルアセトアセチル−ＣｏＡの生成を触媒するかどうか以下の反応条件で調べた。１００ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２５０μＭアセチル−ＣｏＡ、２５０μＭメチルマロニル−ＣｏＡ、２．５μｇｏｒｆＢを含む反応液１００μｌを調製し、２７℃で１６時間反応させた。メタノール１００μｌを添加して反応を停止させた後、ＬＣ／ＭＳで分析を行なった。
その結果、２−メチルアセトアセチル−ＣｏＡの生産が確認された（図２）。この結果は、ＯｒｆＢが、アセチル−ＣｏＡとメチルマロニル−ＣｏＡから２−メチルアセトアセチル−ＣｏＡの生成を触媒することを示しており、本酵素タンパク質が、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼであることが確認された。
〔実施例３〕配列番号８の塩基配列によりコードされた酵素タンパク質（ｏｒｆＤ）の機能確認
３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子（ｏｒｆＤ）を十分発現させるような組換え体プラスミドをＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０（１９８５）〕を用いて以下の方法により構築した。放線菌Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒａ ｒｕｂｒａ Ｋ０７−０５１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１４に示した５’末端にＮｄｅＩ制限酵素サイトを有するセンスプライマー、配列番号１５に示した５’末端にＸｈｏＩ制限酵素サイトを有するアンチセンスプライマー及びＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロシュ・ライフサイエンス社製）を用い、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）でＰＣＲを行うことによりｏｒｆＤを増幅した。ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる反応工程を１サイクルと３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製し、制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩとで消化することで、ＮｄｅＩとＸｈｏＩ処理ｏｒｆＤ含有ＤＮＡ断片を取得した。
ｐＥＴ−１５ｂ（ノヴァジェン社製）を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、ＮｄｅＩとＸｈｏＩ処理ｐＥＴ１５−ｂ断片を取得した。上記で取得されたＮｄｅＩとＸｈｏＩ処理ｏｒｆＤ含有ＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＸｈｏＩ処理ｐＥＴ−１５ｂ断片と混合した後、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。該形質転換体より定法に従って組換えＤＮＡを含むプラスミドを単離した。ＤＮＡ配列を決定することにより、配列番号８に記載の塩基配列が得られたことから、該組換え体ＤＮＡがｏｒｆＤであることを確認し、このプラスミドをｐＥＴ１５−ｂ−ｏｒｆＤと命名した。
ｐＥＴ１５−ｂ−ｏｒｆＤを常法によりＤＥ３を有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノヴァジェン社製）に導入し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌに耐性を示すＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ１５−ｂ−ｏｒｆＤ株を得た。ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ１５−ｂ−ｏｒｆＤ株をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地２００ｍｌ中、３７℃で培養し、６００ｎｍの濁度が０．５に達した時点で、培養液を２時間冷蔵した後、イソプロピルチオガラクトシドを終濃度０．５ｍＭになるように添加した。さらに１８℃で１６時間培養した後、遠心分離（９０００ｒｐｍ、２分間）によって培養上清を除いた。この菌体を洗浄緩衝液〔２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール〕１０ｍｌに懸濁し、９０ｍｇ／ｍｌ ＰＭＳＦを１０μｌ添加し、超音波破砕機（和研薬社製）を用いて氷冷しつつ破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）にかけ、上清を回収した。この細胞抽出液遠心上清をＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｒｅｓｉｎ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に通し、２０ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄した。ついで溶出緩衝液〔２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール〕５ｍｌを通塔し、溶出させた。溶出液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ（メルク社製）を用いて濃縮した。
次に、得られた組換え酵素タンパク質（ＯｒｆＤ）が２−メチルアセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシ−２−メチルブチリル−ＣｏＡの生成を触媒するかどうか以下の反応条件で調べた。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２５０μＭアセチル−ＣｏＡ、２５０μＭメチルマロニル−ＣｏＡ、５００μＭ ＮＡＤＰＨ、２．５μｇ ｏｒｆＢ（実施例２で取得）、０．８μｇ ｏｒｆＤを含む反応液１００μｌを調製し、２７℃で１６時間反応させた。メタノール１００μｌを添加して反応を停止させた後、ＬＣ／ＭＳで分析を行なった。
その結果、３−ヒドロキシ−２−メチルブチリル−ＣｏＡの生産が確認された（図２）。この結果は、ＯｒｆＢが、２−メチルアセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシ−２−メチルブチリル−ＣｏＡの生成を触媒することを示しており、本酵素タンパク質が、３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼであることが確認された。
〔実施例４〕配列番号２の塩基配列によりコードされた酵素タンパク質（ｏｒｆＡ）の機能確認
エノイル−ＣｏＡハイドラターゼをコードする遺伝子（ｏｒｆＡ）を十分発現させるような組換え体プラスミドをＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０（１９８５）〕を用いて以下の方法により構築した。放線菌Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒａ ｒｕｂｒａ Ｋ０７−０５１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１６に示した５’末端にＮｄｅＩ制限酵素サイトを有するセンスプライマー、配列番号１７に示した５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素サイトを有するアンチセンスプライマー及びＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロシュ・ライフサイエンス社製）を用い、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）でＰＣＲを行うことによりｏｒｆＡを増幅した。ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる反応工程を１サイクルと３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製し、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩとで消化することで、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩ処理ｏｒｆＡ含有ＤＮＡ断片を取得した。
ｐＥＴ１５−ｂ（ノヴァジェン社製）を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化し、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩ処理ｐＥＴ１５−ｂ断片を取得した。上記で取得されたＮｄｅＩとＢａｍＨＩ処理ｏｒｆＡ含有ＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＢａｍＨＩ処理ｐＥＴ１５−ｂ断片と混合した後、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。該形質転換体より定法に従って組換えＤＮＡを含むプラスミドを単離した。ＤＮＡ配列を決定することによって、配列番号２に記載の塩基配列が得られたことから、該組換え体ＤＮＡがｏｒｆＡであることを確認し、このプラスミドをｐＥＴ１５−ｂ−ｏｒｆＡと命名した。
ｐＥＴ１５−ｂ−ｏｒｆＡを常法によりＤＥ３を有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノヴァジェン社製）に導入し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌに耐性を示すＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ１５−ｂ−ｏｒｆＡ株を得た。ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ１５−ｂ−ｏｒｆＡ株をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地２００ｍｌ中、３７℃で培養し、６００ｎｍの濁度が０．５に達した時点で、培養液を２時間冷蔵した後、イソプロピルチオガラクトシドを終濃度０．５ｍＭになるように添加した。さらに１８℃で１６時間培養した後、遠心分離（９０００ｒｐｍ、２分間）によって培養上清を除いた。この菌体を洗浄緩衝液〔２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール〕１０ｍｌに懸濁し、９０ｍｇ／ｍｌ ＰＭＳＦを１０μｌ添加し、超音波破砕機（和研薬社製）を用いて氷冷しつつ破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）にかけ、上清を回収した。この細胞抽出液遠心上清をＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｒｅｓｉｎ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に通し、２０ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄した。ついで溶出緩衝液〔２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ イミダゾール、１０％グリセロール〕５ｍｌを通塔し、溶出させた。溶出液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ（メルク社製）を用いて濃縮した。
次に、得られた組換え酵素タンパク質（ＯｒｆＡ）が３−ヒドロキシ−２−メチルブチリル−ＣｏＡからアンジェリル−ＣｏＡの生成を触媒するかどうか以下の反応条件で調べた。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２５０μＭアセチル−ＣｏＡ、２５０μＭメチルマロニル−ＣｏＡ、５００μＭ ＮＡＤＰＨ、２．５μｇ ｏｒｆＢ（実施例２で取得）、０．８μｇ ｏｒｆＤ（実施例３で取得）、１５．８μｇ ｏｒｆＡを含む反応液１００μｌを調製し、２７℃で１６時間反応させた。メタノール１００μｌを添加して反応を停止させた後、ＬＣ／ＭＳで分析を行なった。
その結果、アンジェリル−ＣｏＡの生産を確認した（図２）。この結果は、ＯｒｆＡが、３−ヒドロキシ−２−メチルブチリル−ＣｏＡからアンジェリル−ＣｏＡの生成を触媒することを示しており、本酵素タンパク質が、エノイル−ＣｏＡハイドラターゼであることが確認された。
以上により、実施例１において、ＯｒｆＡ、ＯｒｆＢ、ＯｒｆＣ、及びＯｒｆＤを組み合わせて発現させることにより、トレハンジェリンが生成することが確認された。また、実施例２〜４により、ＯｒｆＢがアセチル−ＣｏＡとメチルマロニル−ＣｏＡを反応させて、２−メチルアセトアセチル−ＣｏＡを生成させること、ＯｒｆＤが２−メチルアセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−２−メチルブチリル−ＣｏＡに変換させること、及び、ＯｒｆＡが３−ヒドロキシ−２−メチルブチリル−ＣｏＡをアンジェリル−ＣｏＡに変換させることが確認された。よって、実施例１の試験系においてＯｒｆＣは、アンジェリル−ＣｏＡとトレハロースを反応させてトレハンジェリンを生成させている、すなわち、アシルトランスフェラーゼ活性を有することが示された。
〔実施例５〕コリネバクテリウムを用いたトレハンジェリンの産生
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を用いて、トレハンジェリンを産生した。
（１）分析方法
カラム：ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＯＤＳ−ＡＱ ２５０×４．６ｍｍ Ｓ−５ｍｍ，１２ｎｍ、３０℃
移動相：０．１％ギ酸（Ａ）、アセトニトリル（Ｂ）、１５％Ｂ、３０分、０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：Ａｇｉｌｅｎｔ ６２２４ ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳ（アジレントテクノロジー社）
（２）コリネバクテリウム・グルタミカムへのトレハンジェリン生合成酵素遺伝子の導入
ｏｒｆＡＢ及びｏｒｆＣＤをコリネバクテリウムにコドン最適化した配列として、それぞれ、配列番号１８及び配列番号１９の核酸配列を設計した。設計された核酸配列を基に、ｏｒｆＡＢ及びｏｒｆＣＤをコードする核酸分子を人工合成により得た。次いで、ｏｒｆＡＢＣＤを連結し、ベクターに挿入した。
具体的には、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、９８℃ １ｍｉｎ反応後、９８℃ １０ｓｅｃ、６８℃ ３０ｓｅｃを１サイクルとして３０サイクルで、ｏｒｆＡＢ及びｏｒｆＣＤをそれぞれのプライマーを用いてそれぞれＰＣＲ増幅した。ｏｒｆＡＢプライマー及びｏｒｆＣＤプライマーとして、以下のプライマーを用いた：
ｏｒｆＡＢプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ）：ＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＴＣＣＧＴＴＴＣＣＣＧＣＧＴＴＧ（配列番号２０）
ｏｒｆＡＢプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ）：ＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＣＡＴＣＡＣＴＴＴＡＧＣＧＡＡＣＧＣＡＧＴＴＧ（配列番号２１）
ｏｒｆＣＤプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ）：ＡＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＴＣＴＧ（配列番号２２）
ｏｒｆＣＤプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ）：ＣＣＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＧＴＡＧＣＣ（配列番号２３）。
得られたＰＣＲ断片をＧｅｌ／ＰＣＲ エクストラクションキット（日本）を用いてＤＮＡ精製した。精製したＰＣＲ断片をＳａｃＩ消化したベクターと混合し、Ｉｎ−Ｆｕｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて二つの遺伝子断片を連結し、同時にベクターに挿入した。ベクターとしては、ｇａｐＡ遺伝子プロモーターを有するｐＹＴＫＡ９−ＰｇａｐＡを用いた。ｐＹＴＫＡ９−ＰｇａｐＡは、ｐＨＳＧ２９８ベクター（タカラバイオ株式会社）にコリネの代表的なｏｒｉであるｐＢＬ１ ｏｒｉ（Ｓａｎｔａｍａｒｉａ， Ｒ．， Ｇｉｌ， Ｊ．Ａ．， Ｍｅｓａｓｅ， Ｊ．Ｍ． ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ， Ｊ．Ｆ．． （１９８４） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３０， ２２３７−２２４６．）を人工合成し、ｇａｐＡ遺伝子プロモーター（Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． （２０１２） ７８（３）：８６５−７５）と共に導入することにより得た。得られたｏｒｆＡＢ及びｏｒｆＣＤをコードする核酸分子を有するベクターは、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ培地中の大腸菌ＨＳＴ０２株に形質転換した。更に、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株にエレクトロポレーション法を用いて形質転換し、トレハンジェリン生合成酵素遺伝子を有するコリネバクテリウム・グルタミカムを得た。
（３）コリネバクテリウム・グルタミカムの前培養
１０００ｍＬの純水中にＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎを３７ｇ含有するＢＨＩ培地５ｍＬに、上記で作製したトレハンジェリン生合成酵素遺伝子を有する、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株のグリセロールストックを添加した。３０℃、１８０ｒｐｍで２４時間、これらのコリネバクテリウム・グルタミカムを振盪培養して、前培養液を得た。
（４）コリネバクテリウム・グルタミカムの本培養
３％量の前培養液を、坂口フラスコ中の５０ｍＬのＢＨＩ培地に添加した。培養開始時にグルコースの初期濃度が２０ｇ／Ｌとなるように、ＢＨＩ培地へ４００ｇ／Ｌのグルコース溶液を２．５ｍＬ添加した。また、培養開始から２４及び４８時間後にも同グルコース溶液を２．５ｍＬずつ追加した。また、１００ｇ／Ｌのトレハロース溶液を、培養開始時に１ｍＬ添加し、培養開始から２４及び４８時間後に０．２５ｍＬずつ添加した。ｐＨ調整のため、２０％炭酸カルシウム溶液１．２５ｍＬを、培養開始後４及び２４時間後にそれぞれ添加した。培養は、３０℃、１８０ｒｐｍで７２時間、振盪培養することにより行った。
（５）培養液上清の分析
本培養開始後７２時間の培養液上清をＬＣ／ＭＳで分析することで標品と同じ保持時間にトレハンジェリンのピークを検出した。

Claims (17)

  1. 以下の（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される少なくとも１つの塩基配列を有する核酸分子：
    （ｉ）配列番号２に記載の塩基配列、配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、あるいは、
    配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から５個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列であって、当該塩基配列によりコードされるタンパク質がエノイル−ＣｏＡハイドラターゼとしての活性を有する塩基配列；
    （ｉｉ）配列番号４に記載の塩基配列、配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、あるいは、
    配列番号５に記載のアミノ酸配列において１から５個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列であって、当該塩基配列によりコードされるタンパク質が３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼとしての活性を有する塩基配列；
    （ｉｉｉ）配列番号６に記載の塩基配列、配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、あるいは、
    配列番号７に記載のアミノ酸配列において１から５個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号７に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号６に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列であって、当該塩基配列によりコードされるタンパク質がアシルトランスフェラーゼとしての活性を有する塩基配列；及び
    （ｉｖ）配列番号８に記載の塩基配列、配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、あるいは、
    配列番号９に記載のアミノ酸配列において１から５個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号８に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列であって、当該塩基配列によりコードされるタンパク質が３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼとしての活性を有する塩基配列。
  2. 請求項１における（ｉ）〜（ｉｖ）の全ての塩基配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 配列番号１に記載の塩基配列、配列番号１に記載の塩基配列がコードするアミノ酸において１から５個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は、配列番号１に記載の塩基配列と９０％の同一性を有する塩基配列を有する核酸分子である、請求項２に記載の核酸分子。
  4. 配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸分子、配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸分子、あるいは、配列番号３に記載のアミノ酸配列において１から５個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号２に記載の塩基配列と９０％の同一性を有する塩基配列を有し、かつ、当該塩基配列によりコードされるタンパク質がエノイル−ＣｏＡハイドラターゼとしての活性を有する核酸分子である、請求項１に記載の核酸分子。
  5. 配列番号４に記載の塩基配列を有する核酸分子、配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸分子、あるいは、配列番号５に記載のアミノ酸配列において１から５個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列と９０％の同一性を有する塩基配列を有し、かつ、当該塩基配列によりコードされるタンパク質が３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼとしての活性を有する核酸分子である、請求項１に記載の核酸分子。
  6. 配列番号６に記載の塩基配列を有する核酸分子、配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸分子、あるいは、配列番号７に記載のアミノ酸配列において１から５個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号７に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号６に記載の塩基配列と９０％の同一性を有する塩基配列を有し、かつ、当該塩基配列によりコードされるタンパク質がアシルトランスフェラーゼとしての活性を有する核酸分子である、請求項１に記載の核酸分子。
  7. 配列番号８に記載の塩基配列を有する核酸分子、配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸分子、あるいは、配列番号９に記載のアミノ酸配列において１から５個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号８に記載の塩基配列と９０％の同一性を有する塩基配列を有し、かつ、当該塩基配列によりコードされるタンパク質が３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼとしての活性を有する核酸分子である、請求項１に記載の核酸分子。
  8. 配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは、配列番号３において１から５個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列、又は配列番号３のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、エノイル−ＣｏＡハイドラターゼ活性を有するタンパク質。
  9. 配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは、配列番号５において１から５個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列、又は配列番号５のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ活性を有するタンパク質。
  10. 配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは、配列番号７において１から５個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列、又は配列番号７のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
  11. 配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは、配列番号９において１から５個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列、又は配列番号９のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有するタンパク質。
  12. 請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
  13. 請求項１２に記載のベクターを含有する形質転換体。
  14. 大腸菌である、請求項１３に記載の形質転換体。
  15. 請求項１３又は請求項１４に記載の形質転換体を培養してトレハンジェリンを生成させることを含む、トレハンジェリンの製造方法。
  16. 少なくとも、請求項８〜請求項１１のいずれか１項に記載のタンパク質を基質と作用させることを含む、トレハンジェリンの製造方法。
  17. 請求項８〜請求項１１に記載の全てのタンパク質を基質と作用させることを含む、請求項１６に記載のトレハンジェリンの製造方法。
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