DE10201540A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen - Google Patents
Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren SalzenInfo
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Abstract
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und deren Salze oder deren Salzen oder diese enthaltende Futtermitteladditive durch Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere solchen, die bereits D-Pantothensäure produzieren, bei dem man mindestens eine der für das yccJ-ORF, ptgA-Gen und yeaA-ORF kodierende(n) Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert unter Bedingungen, die für die Verstärkung oder Überexpression der intrazellulären Aktivitäten des entsprechenden Proteins (Enzyms) geeignet sind.
Description
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen oder diese enthaltende Mischungen unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen eines oder mehrere der Gene oder offenen Leserahmen (ORF) ausgewählt aus der Gruppe yccJ, ptgA und yeaA verstärkt wird.
- Stand der Technik
- Pantothensäure wird weltweit in einer Größenordnung von mehreren tausend Tonnen pro Jahr produziert. Es wird unter anderem in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie und in der Lebensmittelindustrie verwendet. Ein großer Teil der produzierten Pantothensäure wird für die Ernährung von Nutztieren wie Geflügel und Schweine verwendet. Der Bedarf steigt.
- Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Bei der chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine wichtige Vorstufe. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt, in weiteren Verfahrensschritten das racemische Gemisch aufgetrennt, das D-Pantolacton mit β-Alanin kondensiert und so D-Pantothensäure erhalten.
- Die typische Handelsform ist das Calcium-Salz der D- Pantothensäure. Das Calcium-Salz des racemischen Gemisches der D,L-Pantothensäure ist ebenfalls gebräuchlich.
- Der Vorteil der fermentativen Herstellung durch Mikroorganismen liegt in der direkten Bildung der gewünschten stereoisomeren Form, nämlich der D-Form, die frei von L-Pantothensäure ist.
- Verschiedene Arten von Bakterien, wie z. B. Escherichia coli (E. coli), Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen, wie z. B. Debaromyces castellii können wie in EP-A 0 493 060 gezeigt, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β-Alanin enthält, D-Pantothensäure produzieren. EP-A 0 493 060 zeigt weiterhin, dass bei E. coli durch Amplifikation von Pantothensäure-Biosynthesegenen aus E. coli, die auf den Plasmiden pFV3 und pFV5 enthalten sind, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β- Alanin enthält, die Bildung von D-Pantothensäure verbessert wird.
- EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 beschreiben von E. coli Stamm IFO3547 abgeleitete Mutanten, wie FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 und FV5069, die Resistenzen gegen verschiedene Antimetabolite wie Salizylsäure, α- Ketobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure, O-Methylthreonin und α-Ketoisovaleriansäure tragen. Sie produzieren in einer Nährlösung, die Glucose enthält, Pantoinsäure, und in einer Glucose- und β-Alanin-haltigen Nährlösung D-Pantothensäure. In EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 wird weiterhin angegeben, dass nach Amplifikation der Pantothensäure- Biosynthesegene panB, panC und panD, die auf dem Plasmid pFV31 enthalten sein sollen, in den oben genannten Stämmen in Glucose-haltigen Nährlösungen, die Produktion von D- Pantoinsäure und in einer Nährlösung, die Glucose und β- Alanin enthält, die Produktion von D-Pantothensäure verbessert wird.
- Weiterhin wird in der WO 97/10340 über die förderliche Wirkung der Verstärkung des ilvGM-Operons auf die Produktion von D-Pantothensäure berichtet. In der EP-A-1001027 wird schließlich über die Wirkung der Verstärkung des panE-Gens auf die Bildung der D-Pantothensäure berichtet.
- Nach dem Stand der Technik wird die D-Pantothensäure oder das entsprechende Salz aus der Fermentationsbrühe isoliert und gereinigt (EP-A-0590857 und WO 96/33283) und dementsprechend in gereinigter Form verwendet oder die D- Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe wird insgesamt getrocknet (EP-A-1050219) und insbesondere als Futtermitteladditiv verwendet.
- Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von D- Pantothensäure und/oder deren Salzen bzw. diese enthaltende Tierfuttermittel-Additive bereitzustellen.
- Beschreibung der Erfindung
- Wenn im Folgenden D-Pantothensäure oder Pantothensäure oder Pantothenat erwähnt werden, sind damit nicht nur die freien Säuren, sondern auch die Salze der D-Pantothensäure wie z. B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz gemeint.
- Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und deren Salzen oder deren Salzen oder diese enthaltende Futtermitteladditive durch Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere solchen, die bereits D-Pantothensäure produzieren, bei dem man
- a) mindestens eine der für die (ORF) yccJ, ptgA-Gen, yeaA-ORF kodierende(n) Nukleotidsequenzen oder deren Allele verstärkt, insbesondere überexprimiert, unter Bedingungen, die für die Verstärkung oder Überexpression der intrazellulären Aktivität der entsprechenden Proteine (Enzyme) geeignet sind, gegebenenfalls in Kombination mit der Abschwächung oder Verstärkung weiterer Gene, und
- b) gegebenenfalls in Gegenwart von Erdalkaliverbindungen, wobei diese in vorzugsweise stöchiometrischen Mengen kontinuierlich oder diskontinuierlich hinzugefügt werden, fermentiert,
- c) D-Pantothensäure bzw. das entsprechende Salz im Medium bzw. der Fermentationsbrühe oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae anreichert und
- d) die gewünschten Produkte nach Abschluss der Fermentation isoliert, wobei man die Biomasse und/oder weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe in einer Menge von ≥ 0 bis 100% abtrennt.
- Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren, bei dem nach Abschluss der Fermentation die Biomasse teilweise oder insgesamt in der Fermentationsbrühe verbleibt, und die so erhaltene Brühe gegebenenfalls nach dem Aufkonzentrieren zu einer festen D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Mischung, die bevorzugt weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält, verarbeitet wird.
- Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang insbesondere die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene, des ORFs bzw. der ORFs erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel oder ORF verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
- Als offener Leserahmen (ORF, open reading frame) wird ein Abschnitt einer Nukleotidsequenz bezeichnet, der für ein Protein beziehungsweise Polypeptid oder Ribonukleinsäure kodiert oder kodieren kann, dem (der) nach dem Stand der Technik keine Funktion zugeordnet werden kann. Nach Zuordnung einer Funktion zu dem betreffenden Abschnitt der Nukleotidsequenz wird im allgemeinen von einem Gen gesprochen.
- Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp- Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
- Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können D-Pantothensäure aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Enterobacteriaceae, insbesondere der Gattung Escherichia. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli zu nennen. Innerhalb der Art Escherichia coli sind die sogenannten K-12-Stämme, wie z. B. die Stämme MG1655 oder W3110 (Neidhard et al.: Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington D. C.)) oder der Escherichia coli Wildtypstamm IFO3547 (Institut für Fermentation, Osaka, Japan) und davon abgeleitete Mutanten geeignet, die die Fähigkeit besitzen D-Pantothensäure zu produzieren.
- Geeignete D-Pantothensäure produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind beispielsweise
Escherichia coli FV5069/pFV31
Escherichia coli FV5069/pFV202
Escherichia coli FE6/pFE80 und
Escherichia coli KE3 - Es wurde gefunden, dass Enterobacteriaceae nach Verstärkung, insbesondere Überexpression eines oder mehrerer der Gene oder offenen Leserahmen (ORF), ausgewählt aus der Gruppe yccJ, ptgA und yeaA in verbesserter Weise D- Pantothensäure produzieren.
- Die Nukleotidsequenzen der Gene oder offenen Leserahmen (ORF) von Escherichia coli gehören zum Stand der Technik und können ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli entnommen werden. yccJ-Gen Bezeichnung: offener Leserahmen unbekannter Funktion
Referenz: Blattner et al., Science 277 (5331), 1453-1474 (1997)
Accession No.: AE000202 ptgA-Gen Bezeichnung: Glucose-spezifische IIA Komponente des PTS- Systems alternativer Genname: crr, gsr, iex, tgs, treD
Referenz: Reizer et al., Protein Science 3: 440-450 (1994)
Accession No.: AE000329.1 yeaA-Gen Bezeichnung: offener Leserahmen unbekannter Funktion
Referenz: Blattner et al., Science 277 (5331), 1453-1474 (1997)
Accession No.: AE000272 - Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen Gene oder offenen Leserahmen können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele der Gene oder offene Leserahmen verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen (sense mutations) ergeben, wobei die Aktivität des Proteins im wesentlichen nicht verändert wird.
- Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen D-Pantothensäure-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
- Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Chang und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), bei Hartley und Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), bei Amann und Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), bei de Broer et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), bei LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993)), in PCT/US97/13359, bei Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), bei Quandt und Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), bei Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
- In Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren wie z. B. von pACYC184 abgeleitete Kloniervektoren (Bartolome et al.; Gene 102, 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) oder pSC101-Derivate (Vocke und Bastia, Proceedings of the National Academy of Science USA 80 (21): 6557-6561 (1983)) können verwendet werden. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzen, wobei der Plasmidvektor mindestens die für das serC-Gen kodierende Nucleotidsequenz trägt.
- Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein zusätzlich zur Verstärkung eines oder mehrerer der Gene oder offenen Leserahmen (ORF), ausgewählt aus der Gruppe yccJ, ptgA und yeaA, ein oder mehrere der insbesondere endogenen Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- - das für die Acetohydroxysäure-Synthase II kodierende ilvGM-Operon (WO 97/10340)
- - das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen (US-A-5,518,906),
- - das für die Ketopantoat-Reduktase kodierende panE-Gen (EP-A-1001027)
- - das für die Aspartat-Decarboxylase kodierende panD-Gen (US-A-5,518,906)
- - das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen (US-A-5,518,906),
- - das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen (Plamann et al (Nucleic Acids Research 11(7): 2065-2075(1983))),
- - die für das Glycin-Spaltungssystem (glycine-cleavage system) kodierenden Gene gcvT, gcvH und gcvP (Okamura- Ikeda et al., European Journal of Biochemistry 216, 539-548 (1993)), einzeln oder gemeinsam und
- - das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende serC- Gen (Duncan und Coggins, Biochemical Journal 234: 49-57 (1986))
- Schließlich kann es für die Produktion von D-Pantothensäure mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung eines oder mehrerer der Gene oder offenen Leserahmen (ORF), ausgewählt aus der Gruppe yccJ, ptgA und yeaA eines oder mehrere der insbesondere endogenen Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- - das für die Transaminase C kodierende avtA-Gen (EP-A-1001027)
- - das für die Pyruvat Oxidase kodierende poxB-Gen (Grabau und Cronan, Nucleic Acids Research. 14 (13), 5449-5460 (1986))
- - das für die PEP-Carboxykinase kodierende pckA-Gen (Medina et al., Journal of Bacteriology 172, 7151-7156 (1990))
- Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) oder Ribonukleinsäure in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) oder eine entsprechende Ribonukleinsäure mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) oder Ribonukleinsäure inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
- Durch die Maßnahmen der Abschwächung einschließlich der Verringerung der Expression wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.
- Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure vorteilhaft sein neben der Überexpression eines oder mehrere der Gene oder offenen Leserahmen (ORF), ausgewählt aus der Gruppe yccJ, ptgA und yeaA unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982). In dem erfindungsgemäßen Verfahren können Bakterien eingesetzt werden in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung des D-Pantothensäures verringern.
- Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch - Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch (Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch - Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
- Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
- Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
- Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies Vorstufen der D- Pantothensäure wie Aspartat, β-Alanin, Ketoisovalerat, Ketopantoinsäure oder Pantoinsäure und gegebenenfalls deren Salze zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
- Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt.
- Es ist gleichfalls möglich, zur Darstellung der Erdalkalisalze der Pantothensäure, insbesondere des Calciumsalzes, während der Fermentation die Suspension oder Lösung einer Erdalkali-haltigen anorganischen Verbindung wie beispielsweise Calciumhydroxid oder einer organischen Verbindung wie dem Erdalkalisalz einer organischen Säure beispielsweise Calciumacetat, kontinuierlich oder diskontinuierlich zu versetzen. Auf diese Weise wird das zur Darstellung des gewünschten Erdalkalisalzes der D- Pantothensäure nötige Kation direkt in der gewünschten Menge, bevorzugt in stöchiometrischen Mengen, in die Fermentationsbrühe eingetragen.
- Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an D- Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
- Die in der Fermentationsbrühe enthaltene D-Pantothensäure bzw. die entsprechenden Salze der D-Pantothensäure können anschließend nach dem Stand der Technik isoliert und gereinigt werden.
- Es ist ebenso möglich, die D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Fermentationsbrühen vorzugsweise zunächst durch bekannte Separationsmethoden wie zum Beispiel der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder einer Kombination hieraus vollständig oder zum Teil von der Biomasse zu befreien. Es ist jedoch auch möglich, die Biomasse gänzlich in der Fermentationsbrühe zu belassen. Im allgemeinen wird die Suspension oder Lösung vorzugsweise aufkonzentriert und beispielsweise mit Hilfe eines Sprühtrockners oder einer Gefriertrocknungsanlage zu einem Pulver aufgearbeitet. Anschließend wird dieses Pulver im allgemeinen durch geeignete Kompaktier- oder Granulier- Verfahren z. B. auch Aufbaugranulation in ein gröberkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt mit einer Korngrößenverteilung von bevorzugt 20 bis 2000 µm, insbesondere 100 bis 1400 µm überführt. Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikaten oder Stearaten.
- Alternativ kann das Fermentationsprodukt mit oder ohne weitere der üblichen Fermentationsbestandteile auf einen in der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken Zucker oder andere aufgezogen, zu einem Produkt mit der gewünschten Korngrößenverteilung verarbeitet werden, und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.
- Gegebenenfalls wird in einer geeigneten Verfahrensstufe D-Pantothensäure und/oder das gewünschte Salz der D-Pantothensäure oder eine diese Verbindungen enthaltende Zubereitung dem Produkt hinzugefügt, um den gewünschten Gehalt an Pantothensäure oder dem gewünschten Salz zu erzielen bzw. einzustellen.
- Der gewünschte Gehalt an den genannten Verbindungen liegt im allgemeinen im Bereich von 20 bis 80 Gew.-% (Trockenmasse).
- Die Konzentration an Pantothensäure kann mit bekannten chemischen (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)) oder mikrobiologischen Verfahren wie z. B. dem Lactobacillus plantarum Test (DIFCO MANUAL, 10th Edition, S. 1100-1102; Michigan, USA) bestimmt werden.
Claims (16)
1. Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und
deren Salzen oder deren Salzen oder diese enthaltende
Futtermitteladditive durch Fermentation von
Mikroorganismen der Familie Enterbacteriaceae,
insbesondere solchen, die bereits D-Pantothensäure
produzieren, bei dem man mindestens eine der für das
yccJ-ORF, ptgA-Gen und yeaA-ORF kodierende(n)
Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere
überexprimiert, unter Bedingungen, die für die
Verstärkung oder Überexpression der intrazellulären
Aktivität der entsprechenden Proteine (Enzyme) geeignet
sind.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem man
a) die D-Pantothensäure und/oder deren Salze im Medium
oder in den Zellen der Mikroorganismen anreichert,
und,
b) die gewünschten Produkte nach Abschluss der
Fermentation isoliert, wobei man die Biomasse
und/oder weitere Bestandteile der
Fermentationsbrühe in einer Menge von ≥ 0 bis 100%
abtrennt
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem man weitere Gene
verstärkt und/oder abschwächt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Fermentation in Gegenwart von
Erdalkalisalzen durchführt, wobei diese kontinuierlich
oder diskontinuierlich in der gewünschten Menge
zugeführt werden, und ein Erdalkalisalz der D-
Pantothensäure enthaltendes oder daraus bestehendes
Produkt gewinnt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man Mikroorganismen der Gattung Escherichia
einsetzt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
dass die Mikroorganismen der Gattung Escherichia aus
der Art Escherichia coli stammen.
7. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem man zusätzlich zur
Verstärkung oder Überexpression der genannten
Nukleotidsequenzen eines oder mehrere der Gene,
ausgewählt aus Gruppe:
verstärkt, insbesondere überexprimiert.
1. 7.1 das für die Acetohydroxysäure-Synthase II
kodierende ilvGM-Operon,
2. 7.2 das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase
kodierende panB-Gen,
3. 7.3 das für die Ketopantoat-Reduktase kodierende
panE-Gen,
4. 7.4 das für die Aspartat-Decarboxylase kodierende
panD-Gen,
5. 7.5 das für die Pantothenat-Synthetase kodierende
panC-Gen,
6. 7.6 das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende
sere-Gen,
7. 7.7 die für das Glycin Spaltungssystem kodierenden
Gene gcvT, gcvH und gcvP, einzeln oder gemeinsam
(Okamura-Ikeda et al., European Journal of
Biochemistry 216, 539-548 (1993)), und
8. 7.8 das für die Serinhydroxymethyltransferase
kodierende glyA-Gen
8. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei den man Mikroorganismen
einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest
teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der D-
Pantothensäure verringern.
9. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem man zusätzlich zur
Abschwächung oder Abschaltung der genannten
Nukleotidsequenzen eines oder mehrere der Gene,
ausgewählt aus der Gruppe:
1. 9.1 die Transaminase C kodierende avtA-Gen,
2. 9.2 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen,
und
3. 9.3 das für die PEP-Carboxykinase kodierende pckA-Gen
einzeln oder gemeinsam abschwächt, insbesondere
ausschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert.
10. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem man die Kopienzahl
der Gene erhöht oder Expressionskassetten stromaufwärts
der Gene einbaut.
11. Mikroorganismen der Familie Enterobactericeae,
insbesondere der Gattung Escherichia, in denen
mindestens der intrazellulären Aktivitäten der
Polypeptide erhöht wird, für die das yccJ-ORF, ptgA-gen
oder das yeaA-ORF kodieren.
12. Mikroorganismen der Gattung Escherichia gemäß Anspruch
11, insbesondere der Art Escherichia coli, in denen die
beschriebenen Aktivitäten erhöht sind.
13. Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und
deren Salzen oder deren Salzen durch Fermentation von
Mikroorganismen gemäß den Ansprüchen 11 oder 12.
14. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem
a) aus einer durch Fermentation gewonnenen D-
Pantothensäure und deren Salzen oder deren Salze
enthaltenden Fermentationsbrühe, die Biomasse
und/oder gegebenenfalls die Inhaltsstoffe der
Fermentationsbrühe in einer Menge von ≥ 0 bis 100%
abtrennt,
b) gegebenenfalls Wasser aus der Fermentationsbrühe
entfernt (Aufkonzentration),
c) das die Pantothensäure und/oder das Pantothenat
enthaltende Gemisch durch geeignete Maßnahmen
insbesondere Sprühtrocknung, gegebenenfalls in
Gegenwart bekannter anorganischer Hilfsstoffe in
eine feinteilige rieselfähige Form überführt, und
d) daraus ein rieselfähiges Tierfuttermittel-Additiv
mit einer Korngrößenverteilung von 20 bis 2000 µm,
insbesondere 100 bis 1400 µm herstellt.
15. Verfahren zur Herstellung von Futtermittel-Additiven
gemäß Anspruch 2 mit einem Gehalt an D-Pantothensäure
und/oder deren Salzen, ausgewählt aus der Gruppe
Magnesium- oder Calziumsalz, bei dem man
a) gegebenenfalls Wasser aus der Fermentationsbrühe
(Aufkonzentration) entfernt,
b) die während der Fermentation gebildete Biomasse in
einer Menge von ≥ 0 bis 100 abtrennt,
c) gegebenenfalls eine oder mehrere der genannten
Verbindungen zu den gemäß a) und b) behandelten
Fermentationsbrühen zusetzt, wobei die Menge der
zugesetzten Verbindungen so bemessen ist, dass
deren Gesamtkonzentration im Tierfuttermittel-
Additiv im Bereich von etwa 20 bis 80 Gew.-%
(Trockenmasse) liegt, und
d) das Tierfuttermittel-Additiv in der gewünschten
Pulver- oder bevorzugt Granulatform mit einer
Korngrößenverteilung von 20 bis 2000 µm,
insbesondere 100 bis 1400 µm herstellt.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet,
dass man aus der Fermentationsbrühe gegebenenfalls nach
Zusatz von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen und
gegebenenfalls nach Zusatz von bekannten organischen
oder anorganischen Hilfsstoffen durch
ein Tierfuttermittel-Additiv in der genannten Pulver- oder
Granulatform und den genannten Konzentrationen der
Additivbestandteile gewinnt.
a) Trocknen und Kompaktieren, oder
b) Sprühtrocknen, oder
c) Sprühtrocknen und Granulieren, oder
d) Sprühtrocknen und Aufbaugranulieren,
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DE10201540A DE10201540A1 (de) | 2002-01-17 | 2002-01-17 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen |
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Cited By (1)
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