CN113416744B - 一种d-泛解酸生产菌、构建方法及应用 - Google Patents

一种d-泛解酸生产菌、构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种D‑泛解酸(PA)生产菌、构建方法及应用。所述D‑泛解酸(PA)生产菌是以E.coli DPAL4为底盘菌，将其基因组中的panC基因敲除，并增强panB基因的表达所得。本发明构建所得PA生产菌在补料发酵过程中，PA产量可达13.66g/L，为后续高产PA工程菌的构建奠定了基础。

Description

一种D-泛解酸生产菌、构建方法及应用
(一)技术领域
本发明属于代谢工程领域，具体涉及一种D-泛解酸(PA)生产菌、构建方法及应用。
(二)背景技术
D-泛解酸(PA)是D-泛酸合成的前体，其本身不稳定，多以泛酸内酯的形式存在。由于泛酸具有广泛的应用前景，作为其合成前体的泛解酸也越来越受人们的关注。目前D-泛解酸和D泛酸内酯的合成方法有(1)利用分解剂进行光分解的方法，此法的分解剂昂贵；(2)微生物分解DL-泛酸内酯中的L-泛酸内酯，得到D-泛酸内酯，此法会丢失一半的DL-泛酸内酯；(3)微生物氧化DL-泛酸内酯中的L-泛酸内酯得到酮泛酸内酯，然后不对称地还原成D-泛酸内酯，此法得到100％纯度的产物比较困难；(4)化学合成酮泛酸内酯，再用微生物不对称地还原成D-泛酸内酯；(5)微生物不对称水解DL-泛酸内酯中的L-构型生成L-泛解酸；(6)微生物选择性不对称水解DL-泛酸内酯中的D-构型成D-泛解酸。同时，这些方法中使用的DL-泛酸内酯多以化学法合成，该合成过程中不可避免使用到异丁醛，甲醛和氰化物。近年来，随着合成生物学和基因工程的发展，人们逐渐将目光转移到利用微生物从头合成PA的方法中来。现阶段，利用微生物从头合成PA的研究较少，所以获得一株PA生产菌，对构建PA高产菌具有重要的意义。
(三)发明内容
本发明的目的是通过代谢工程技术，提供一种D-泛解酸(PA)生产菌、构建方法及应用。
为实现本发明的上述目的，本发明采用的技术方案：
一种D-泛解酸生产菌，由如下方法构建获得：
(1)以E.coli DPAL4为底盘菌，将其基因组中的panC基因敲除，阻断PA的降解，得到重组菌株DPAL4ΔpanC，记为PAL1；
(2)将外源基因panB(Corynebacterium glutamicum)整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A-panB；将质粒pTrc99A-panB导入步骤(1)所述重组菌中，增强panB基因的表达，得到所述D-泛解酸生产菌，记为PAL2。
所述E.coli DPAL4按如下方法构建获得：
(1)以菌株CCTCC NO：M 2018914为底盘菌株，将其基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9 Trc-lpd，记为DPA10；
(2)将DPA9 Trc-lpd基因组中的glk基因敲除，得到DPA9 Trc-lpd/△glk，记为DPA11；
(3)将带有M13启动子的ilvA基因插入到DPA11基因组中，得到菌株DPA11/M13-ilvA，记为DPAL1；
(4)将DPAL1基因组中的pck基因的启动子替换为Trc启动子，得到菌株DPAL1/Trc-pck，记为DPAL2；
(5)将DPAL2基因组中的maeB基因的启动子替换为Trc启动子，得到菌株DPAL2/Trc-maeB，记为DPAL3；
(6)将DPAL3基因组中的ilvBN操纵子启动子替换为Trc启动子，得到菌株DPAL3/Trc-ilvBN，记为DPAL4。
大肠杆菌中PA生物合成途径及本发明涉及的基因工程改造示意图参见图1。首先，在底盘菌DPA11的基础上，插入带M13启动子的ilvA基因，以减弱异亮氨酸代谢途径阻断带来的营养缺陷毒性；然后，通过启动子替换，强化基因pck和maeB的表达，增强PA合成的前体供应；再通过使用Trc启动子替换ilvBN操纵子启动子，增强丙酮酸转化为乙酰乳酸；最后，通过质粒过表达PA合成的关键基因panB(来源于Corynebacterium glutamicum)，增强PA的合成。
本发明还涉及构建所述D-泛解酸生产菌的方法，所述方法如下：
(1)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将底盘菌E.coli DPAL4基因组中的panC基因敲除，得到重组菌株DPAL4ΔpanC，记为PAL1；
(2)将外源基因panB整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A-panB；将质粒pTrc99A-panB导入步骤(1)所述重组菌中，得到所述D-泛解酸生产菌，记为PAL2。
所述底盘菌E.coli DPAL4由如下方法构建获得：
(1)以菌株CCTCC NO：M 2018914(DPA9)为底盘菌株，运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将其基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9 Trc-lpd，记为DPA10；
(2)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将DPA9 Trc-lpd基因组中的glk基因敲除，得到DPA9 Trc-lpd/△glk，记为DPA11；
(3)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将带M13启动子的ilvA基因插入到DPA11基因组中，得到重组菌株DPAL1；
(4)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将DPAL1基因组中pck基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株DPAL2；
(5)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将DPAL2基因组中maeB基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株DPAL3；
(6)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将DPAL3基因组中ilvBN操纵子的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株DPAL4。
本发明还涉及所述D-泛解酸生产菌在微生物发酵制备D-泛解酸中的应用。
具体的，所述应用为：将所述D-泛解酸生产菌接种至发酵培养基中，于28～32℃、200～500rpm条件下进行发酵培养24～48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到D-泛解酸；所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10～30g/L、硫酸铵10～20g/L、酵母浸粉1～5g/L、KH2PO4 1～5g/L、MgSO4 0.1～2.0g/L、微量金属盐溶液0.5～5mL/L，pH 6.5～7.0，溶剂为去离子水；微量金属盐溶液组成为：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/L CuSO4、0.02g/LNiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
优选的，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L，硫酸铵16g/L，酵母粉2g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，盐溶液2mL/L，溶剂为去离子水。
通常，所述基因工程菌株发酵前，先接种至LB培养基中，于温度37℃、转速200rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5～15％接种量接种到发酵培养基中培养。
本发明有益效果主要体现在：本发明通过敲除基因panC阻断PA的降解并增强panB基因的表达，构建所得PA生产菌在发酵过程中，PA产量可达13.66g/L，为后续高产PA工程菌的构建奠定了基础。
(四)附图说明
图1为大肠杆菌中PA生物合成途径及本发明涉及的基因工程改造示意图；
图2为质粒pTrc99A-panB图谱。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下实施例中，所述卡那霉素(kana)的使用终浓度为50ng/μL。所述盐酸壮观霉素(SD)的使用终浓度为50ng/μL。实施例中所用大肠杆菌感受态细胞为商用购买的大肠杆菌DH5α，重组反应所用的一步法定向克隆无缝克隆试剂盒购于诺唯赞公司，但不局限于此公司。
实施例1：底盘菌DPAL4菌株的构建
构建D-泛解酸生产菌株采用的基因编辑方法参照文献(Zhang,B.,et al.,Metabolic engineering of Escherichia coli for D-pantothenic acidproduction.Food Chem,2019.294:p.267-275.)，具体进行方法如下：
DPAL4菌株的构建是以DPA11为底盘菌(DPA11构建方法参见CN111100834A)
(1)pTarget-gRNA质粒突变
设计定点突变引物，将pTarget上20bp同源序列突变成靶基因ilvA插入位置的PAM位点前的20bp序列。以pTarget质粒为模板，ilvA-pT F和ilvA-pT R为引物，PCR扩增pTarget突变质粒，扩增体系如下：
Figure BDA0003102174710000041
PCR扩增结束后，利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后向PCR产物中加入0.5μL的DpnI，37℃消化1h，取消化产物10μL加入到100μL的DH5α感受态细胞中进行转化实验，然后将培养液涂布于LB固体培养基(SD抗性)，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于10mL的LB液体培养基(SD抗性)中，培养18h以上，取菌液送测序并提取突变质粒pTarget-ilvA-g备用。
(2)PCR扩增donor DNA和线性化pTarget-ilvA-g质粒片段
以大肠杆菌基因组为模板，分别以ilvA-P1、ilvA-P2，ilvA-P3、ilvA-P4和ilvA-P5、ilvA-6为引物PCR扩增出靶基因上下游各约500bp序列作为同源臂(donor DNA)。以p T+D CF com、p T+D CR com为引物，pTarget-ilvA-g为模板，PCR扩增pTarget-ilvA-g线性化质粒片段。扩增体系如下：
Figure BDA0003102174710000051
PCR扩增结束后，利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后向线性化pTarget-ilvA-g质粒片段中加入1μL的DpnI，37℃消化1h。然后使用DNA清洁试剂盒对DpnI消化产物和PCR扩增产物donor DNA进行clean up，并检测清洁后产物的DNA浓度，-20℃保存备用。
(3)一步克隆连接线性化pTarget-ilvA-g质粒片段和donor DNA
取(2)中清洁后的产物，根据线性化pTarget-ilvA-g质粒片段和donor DNA的浓度，利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应。取一步克隆产物10μL加入到100μL的DH5α感受态细胞中进行转化实验，然后将培养液涂布于LB固体培养基(SD抗性)，37℃培养过夜。待长出单菌落，挑取单菌落接种10mL的LB液体培养基(SD抗性)，送测序并提取质粒pTarget-illvA-pdg备用。
(4)pTarget-ilvA-pdg的电击转化
制备含pCas质粒的DPA11菌株(CN 111100834 A)的电转感受态。取一只电转感受态，冰浴放置，在超净台中加入2μL pTarget-ilvA-pdg，用移液器轻柔混匀，冰浴1min；用移液器将混匀液转移至预冷的2mm电击杯中(电击杯需提前在超净台风干)，冰浴45S。用纸巾擦干电击杯外侧水雾，置于电转仪中，使用Eco 2档电击。在超净台中向电击杯凹槽加入1mL预冷LB培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2mL无菌EP管中。30℃，180rpm复苏2.5h以上；取200μL涂布于LB固体培养基(SD+kana抗性)，30℃培养过夜。
(5)阳性克隆筛选和验证
在各靶标基因上游同源臂外侧100bp处设计正向验证引物ilvA-VF，下游同源臂外侧100bp处设计反向验证引物ilvA-VR，并以此为正反引物，挑取克隆子作为模板，进行菌落PCR，同时以原基因组为模板作阴性对照。菌落PCR结果条带大于阴性对照，视为阳性。
(6)pTarget-pdg与pCas消除与测序验证
将阳性克隆接种于10mL LB试管(kana抗性)，并加入10μL IPTG母液，30℃，180rpm培养12h。取过夜培养菌液划线于LB固体培养基(kana抗性)，30℃培养过夜。取过夜划线平板，将单菌落编号，并挑取编号的部分单菌落，划线于LB固体培养基(SD抗性)上所对应的区域，37℃培养过夜。在LB固体培养基(SD抗性)所对应的区域不能生长的单菌落为pTarget-ilvA-pdg成功消除的克隆。
将pTarget-ilvA-pdg成功消除的克隆接种于10mL LB试管(无抗性)，37℃，180rpm培养12h。取过夜培养菌液，划线于LB固体培养基(无抗性)，37℃培养过夜。取过夜培养菌液，将单菌落编号，并挑取编号的部分单菌落，划线于LB固体培养基(kana抗性)上所对应的区域，30℃培养过夜。在LB固体培养基(kana抗性)所对应的区域不能生长的单菌落为pCas成功消除的克隆。
(7)阳性克隆测序验证
挑取pTarget-pdg与pCas均成功消除的克隆作为菌落PCR模板，以验证引物进行菌落PCR，菌落PCR产物送测序，验证阳性克隆，得到DPAL1。
(8)在上述菌株的基础上，采用相同的基因编辑方法，依次使用Trc启动子替换基因组中基因pck、maeB和操纵子ilvBN的启动子，得到菌株DPAL4。
实施例2：敲除基因panC阻断PA的降解，构建菌株PAL1
(1)pTarget-gRNA质粒突变
设计定点突变引物，将pTarget上20bp同源序列突变成靶基因panC的PAM位点前的20bp序列。以pTarget为模板，panC-pT F和panC-pT R为引物，PCR扩增pTarget突变质粒，扩增体系如下：
Figure BDA0003102174710000071
PCR扩增结束后，利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后向PCR产物中加入0.5μL的DpnI，37℃消化1h，取消化产物10μL加入到100μL的DH5α感受态细胞中进行转化实验，然后将培养液涂布于LB固体培养基(SD抗性)，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于10mL的LB液体培养基(SD抗性)中，培养18h以上，取菌液送测序并提取突变质粒pTarget-panC-g备用。
(2)PCR扩增donor DNA和线性化pTarget-panC-g质粒片段
以大肠杆菌基因组为模板，分别以panC-P1、panC-P2和panC-P3、panC-P4为引物PCR扩增出靶基因上下游各约500bp序列作为同源臂(donor DNA)。以p T+D CF com、p T+DCR com为引物，pTarget-panC-g为模板，PCR扩增pTarget-panC-g线性化质粒片段。扩增体系如下：
Figure BDA0003102174710000072
Figure BDA0003102174710000081
PCR扩增结束后，利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后向线性化pTarget-panC-g质粒片段中加入1μL的DpnI，37℃消化1h。然后使用DNA清洁试剂盒对DpnI消化产物和PCR扩增产物donor DNA进行clean up，并检测清洁后产物的DNA浓度，-20℃保存备用。
(3)一步克隆连接线性化pTarget-panC-g质粒片段和donor DNA
取(2)中清洁后的产物，根据线性化pTarget-panC-g质粒片段和donor DNA的浓度，利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应。取一步克隆产物10μL加入到100μL的DH5α感受态细胞中进行转化实验，然后将培养液涂布于LB固体培养基(SD抗性)，37℃培养过夜。待长出单菌落，挑取单菌落接种10mL的LB液体培养基(SD抗性)，送测序并提取质粒pTarget-panC-pdg备用。
(4)pTarget-panC-pdg的电击转化
制备含pCas质粒的DPAL4菌株的电转感受态。取一只电转感受态，冰浴放置，在超净台中加入2μL pTarget-panC-pdg，用移液器轻柔混匀，冰浴1min；用移液器将混匀液转移至预冷的2mm电击杯中(电击杯需提前在超净台风干)，冰浴45S。用纸巾擦干电击杯外侧水雾，置于电转仪中，使用Eco 2档电击。在超净台中向电击杯凹槽加入1mL预冷LB培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2mL无菌EP管中。30℃，180rpm复苏2.5h以上；取200μL涂布于LB固体培养基(SD+kana抗性)，30℃培养过夜。
(5)阳性克隆筛选和验证
在各靶标基因上游同源臂外侧100bp处设计正向验证引物panC-VF，下游同源臂外侧100bp处设计反向验证引物panC-VR，并以此为正反引物，挑取克隆子作为模板，进行菌落PCR，同时以原基因组为模板作阴性对照。菌落PCR结果条带小于阴性对照，视为阳性。
(6)pTarget-pdg与pCas消除与测序验证
将阳性克隆接种于10mL LB试管(kan抗性)，并加入10μL IPTG母液，30℃，180rpm培养12h。取过夜培养菌液划线于LB固体培养基(kana抗性)，30℃培养过夜。取过夜划线平板，将单菌落编号，并挑取编号的部分单菌落，划线于LB固体培养基(SD抗性)上所对应的区域，37℃培养过夜。在LB固体培养基(SD抗性)所对应的区域不能生长的单菌落为pTarget-panC-pdg成功消除的克隆。
将pTarget-panC-pdg成功消除的克隆接种于10mL LB试管(无抗性)，37℃，180rpm培养12h。取过夜培养菌液，划线于LB固体培养基(无抗性)，37℃培养过夜。取过夜培养菌液，将单菌落编号，并挑取编号的部分单菌落，划线于LB固体培养基(kana抗性)上所对应的区域，30℃培养过夜。在LB固体培养基(kana抗性)所对应的区域不能生长的单菌落为pCas成功消除的克隆。
(7)阳性克隆测序验证
挑取pTarget-pdg与pCas均成功消除的克隆作为菌落PCR模板，以验证引物进行菌落PCR，菌落PCR产物送测序，验证阳性克隆，得到PAL1。
实施例3：pTrc99A-panB质粒的构建
以pTrc99A质粒(实验室保藏)为模板，pTrc99A-F、pTrc99A-R为引物，PCR扩增线性化质粒片段，同时以panB-F、panB-R为引物，大肠杆菌W3110基因组为模板，扩增panB片段。利用DpnI消化扩增的线性化质粒片段，然后使用clean up试剂盒对消化后的线性化pTrc99A载体片段和panB片段进行清洁，再利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞后，涂布在含有卡那霉素的LB平板上。阳性克隆送测序公司测序，确定连接成功的质粒pTrc99A-panB。将构建的质粒pTrc99A-panB转化PAL1得到菌株PAL2。
表1：菌株基因型
Figure BDA0003102174710000091
Figure BDA0003102174710000101
表2：引物序列表
Figure BDA0003102174710000102
Figure BDA0003102174710000111
Figure BDA0003102174710000121
Figure BDA0003102174710000131
实施例4：工程菌株的摇瓶发酵和发酵罐发酵
菌种活化：取-80℃保藏菌种划线接种于活化培养基(固体LB培养基)中，37℃培养过夜；
种子培养：用接种环挑取活化种子接种于装有10mL种子培养基(LB培养基)的试管中，37℃，200rpm培养过夜；
摇瓶发酵：按5％接种量接种种子液到装有20mL发酵培养基的500mL锥形瓶中，37℃，200rpm/min振荡培养，发酵周期48h；
发酵罐发酵：取种子培养基接种于3瓶含100mL LB培养基的500mL锥形瓶中，37℃，200rpm/min振荡培养12h。按15％的接种量将摇瓶种子液接入含2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵温度控制在30℃，转速500rpm/min，通过40％氨水控制发酵pH为6.8。发酵过程采用pH-star模式控制补料，每4h取样检测生物量、残糖和D-泛解酸的量。
摇瓶发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，硫酸铵16g/L，酵母粉2g/L，KH2PO41g/L，MgSO4 0.2g/L，CaCO3 15g/L，微量金属盐溶液1mL/L。发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，硫酸铵16g/L，酵母粉2g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，盐溶液2mL/L。(盐溶液：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.2g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O)
补料培养基组成如下：葡萄糖500g/L、硫酸铵10g/L、酵母浸粉2g/L、KH2PO414g/L、MgSO4 8g/L、盐溶液1mL/L。
发酵结束后，D-泛解酸的检测采用HPLC方法，方法如下：
色谱柱：J&K C 18-H(250×4.6mm,5μm)
流动相：950mL水，50mL乙腈和950μL混匀后，过滤，超声30min。
柱温：30℃
流速：0.9mL/min
检测波长：200nm
表3：基因工程菌5L发酵罐补料发酵产D-泛解酸
Figure BDA0003102174710000141
结果显示，通过基因工程操作后，基因工程菌PAL2通过摇瓶发酵D-泛解酸产量达1.21g/L，通过5L发酵罐补料发酵，D-泛解酸产量达到13.66g/L。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种D-泛解酸生产菌、构建方法及应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ctgcagaagc ttagatctat taccc 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
tctagagaat tcaaaaaaag caccg 25
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
taatactagt cgacaacgtc atttgtggtt gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
gctctaaaac aaccacaaat gacgttgtcg actagtatta tacctaggac 50
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
cggtgctttt tttgaattct ctagaaagtg tacgaaagcc aggac 45
<210> 6
<211> 115
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
tcaattatat caacgttgtt atctcttgtc aacaccgcca gagataacaa aaaacccctc 60
aagacccgtt tagaggcccc aaggggttat gctagtatta accccccagt ttcga 115
<210> 7
<211> 115
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
tttgttatct ctggcggtgt tgacaagaga taacaacgtt gatataattg agcccttttg 60
gtgcgtcagt cagtttaaac caggaaacag ctttggctga ctcgcaaccc ctgtc 115
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
aggcattctg gaagattttg ccgcgcgggt aggcctgata 40
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 9
tatcaggcct acccgcgcgg caaaatcttc cagaatgcct 40
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 10
gggtaataga tctaagcttc tgcagactta ctactggtga tgcgg 45
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 11
taatactagt ccgtttcgtg acaggaatca gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 12
gctctaaaac tgattcctgt cacgaaacgg actagtatta tacctaggac 50
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 13
cggtgctttt tttgaattct ctagatgcga aggctttgtt gtatc 45
<210> 14
<211> 67
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 14
ccgctcacaa ttccacacat tatacgagcc ggatgattaa ttgtcaattg gtttatatgg 60
cgggaat 67
<210> 15
<211> 65
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 15
atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaccatg cgcgttaaca 60
atggt 65
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 16
gggtaataga tctaagcttc tgcagccacg aagttttcgg agtt 44
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 17
taatactagt atttgtgaac gttacgtgaa gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 18
gctctaaaac ttcacgtaac gttcacaaat actagtatta tacctaggac 50
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 19
tttcacacag gaaacagacc atgtcaggca ttgatgcaaa 40
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 20
tttcacacag gaaacagacc ttaaaaggac tccgcttcgc 40

Claims (7)

1.一种D-泛解酸生产菌，由如下方法构建获得：
（1）以E. coli DPAL4为底盘菌，将其基因组中的panC基因敲除，得到重组菌株DPAL4△panC；
将外源基因panB整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A-panB；将质粒pTrc99A-panB导入步骤（1）所述重组菌中，得到所述D-泛解酸生产菌。
2.如权利要求1所述的D-泛解酸生产菌，其特征在于所述E. coli DPAL4按如下方法构建获得：
（1）以菌株CCTCC NO：M 2018914为底盘菌株，将其基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9 Trc-lpd，记为DPA10；
（2）将DPA9 Trc-lpd基因组中的glk基因敲除，得到DPA9 Trc-lpd/△glk，记为DPA11；
（3）将带有M13启动子的ilvA基因插入到DPA11基因组中，得到菌株DPA11/M13-ilvA，记为DPAL1；
（4）将DPAL1基因组中的pck基因启动子替换为Trc启动子，得到菌株DPAL1/Trc-pck，记为DPAL2；
（5）将DPAL2基因组中的maeB基因启动子替换为Trc启动子，得到菌株DPAL2/Trc-maeB，记为DPAL3；
（6）将DPAL3基因组中的ilvBN操纵子启动子替换为Trc启动子，得到菌株DPAL3/Trc-ilvBN，记为DPAL4。
3.构建权利要求1所述D-泛解酸生产菌的方法，其特征在于所述方法如下：
（1）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将底盘菌E. coli DPAL4基因组中的panC基因敲除，得到重组菌株DPAL4 △panC；
（2）将外源基因panB整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A-panB；将质粒pTrc99A-panB导入步骤（1）所述重组菌中，得到所述D-泛解酸生产菌。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述底盘菌E. coli DPAL4由如下方法构建获得：
（1）以菌株CCTCC NO：M 2018914为底盘菌株，运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将其基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9 Trc-lpd，记为DPA10；
（2）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将DPA9 Trc-lpd基因组中的glk基因敲除，得到DPA9 Trc-lpd/△glk，记为DPA11；
（3）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将带M13启动子的ilvA基因插入到DPA11基因组中，得到重组菌株DPAL1；
（4）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将DPAL1基因组中pck基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株DPAL2；
（5）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将DPAL2基因组中maeB基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株DPAL3；
（6）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将DPAL3基因组中ilvBN操纵子的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株DPAL4。
5.权利要求1所述D-泛解酸生产菌在微生物发酵制备D-泛解酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述D-泛解酸生产菌接种至发酵培养基中，于28~32 ℃、200~500 rpm条件下进行发酵培养24~48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到D-泛解酸；所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10~30g/L、硫酸铵10~20g/L、酵母浸粉1~5g/L、KH2PO4 1~5g/L、MgSO4 0.1~2.0g/L、微量金属盐溶液0.5~5mL/L，pH 6.5~7.0，溶剂为去离子水；微量金属盐溶液组成为：10 g/L CuCl2、10 g/L FeSO4·7H2O、1 g/LZnSO4·7H2O、0.20 g/L CuSO4、0.02 g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20 g/L，硫酸铵16 g/L，酵母粉2 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4 0.5 g/L，盐溶液 2 mL/L，溶剂为去离子水。
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