CN113637618B - 一种d-泛酸生产菌、构建方法及应用 - Google Patents

一种d-泛酸生产菌、构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种D‑泛酸(DPA)生产菌、构建方法及应用。所述D‑泛酸(DPA)生产菌是以E.coli DPA11为底盘菌，将带M13启动子的ilvA基因插入其基因组，利用trc启动子替换内源基因pckA、maeB和ilvBN的原始启动子，增强基因panB、panC、alsS和ilvD的表达，减弱基因gdhA的表达，最后敲除基因poxB和过表达基因cycA，得到所述DPA生产菌。本发明构建所得DPA生产菌在发酵过程中，反应底物β‑丙氨酸是通过外源添加的，该方式能实现发酵过程发酵液中DPA的有效积累，并提高DPA的产量及糖转化率，DPA产量高达66.39g/L，糖酸转化率达30％，具有大规模生产的应用潜力。

Description

一种D-泛酸生产菌、构建方法及应用
(一)技术领域
本发明属于代谢工程领域，具体涉及一种D-泛酸(DPA)生产菌、构建方法及应用。
(二)背景技术
泛酸(pantothenic acid)又称遍多酸、维生素B5，是一种重要的水溶性维生素，其存在D型和L型两种构型。D-泛酸(DPA)是唯一具有生物活性的泛酸构型，因此其在食品、医疗、饲料、美容等领域具有重要的应用价值。目前，DPA的生产多采用化学法和酶法，而DPA的生物合成法起步较晚，还未建立完善的体系。现阶段市场上存在一些DPA的微生物合成法，但普遍产量不高，严重限制了DPA产业的发展。因此，利用合成生物学技术，获得安全、绿色、高产、有效的DPA微生物合成法，并应用于工业生产中具有重要的研究意义和应用价值。
自上世纪90年代，人们就已意识到生物合成DPA的巨大前景，并开始摸索前行。在微生物体内，生物合成DPA途径由两部分组成，即泛解酸途径和β-丙氨酸途径。在泛解酸合成途径中，泛解酸可由糖酵解途径中的丙酮酸出发，经过乙酰乳酸、2,3-二羟基异戊酸、α-酮异戊酸、酮泛解酸生成。在此合成途径中，ilvBN、ilvIH编码的乙酰羟基酸合酶是其中一个关键酶，其受到L-缬氨酸的反馈抑制。panB编码的α-酮异戊酸羟甲基转移酶是另外一个关键酶，且在该反应过程中需要一分子的亚甲基四氢叶酸(CH2-THF)提供甲基供体。随着研究深入，人们又发现panB还具有叶酸裂解的活性；在panB的作用下，α-酮异戊酸和CH2-THF反应，生成以甲基相连的中间体，该中间体进一步水解裂解形成未变化的α-酮异戊酸和双羟甲基中间体，中间体再裂解成甲醛和四氢羟基蝶呤，并回到叶酸代谢中，这可能为我们今后研究泛解酸代谢与一碳单位代谢相互协同提供依据。在β-丙氨酸合成途径中，β-丙氨酸可由糖酵解途径中的丙酮酸出发，经过草酰乙酸、L-天冬氨酸生成。在大肠杆菌β-丙氨酸合成途径中，panD编码的天冬氨酸-1-脱羧酶活性比较低，因此在大肠杆菌合成DPA过程中，往往采用外源添加β-丙氨酸的方式来合成DPA。目前，人们已对DPA的生物合成做了许多研究。Miki Hiroshi等通过诱变筛选，获得了经过72h补料发酵DPA产量达65.4g/L的诱变高产菌株。随着合成生物学的兴起，为弥补传统诱变技术在菌种的稳定性上的缺陷，且不易解析DPA具体合成机制，2018年Zhang等通过合成生物学技术手段，成功构建遗传稳定的DPA产量达28.45g/L的大肠杆菌菌株，并应用于工业生产。
现阶段，虽然已经构建多株能合成DPA的改造菌，但在产量、合成机制等方面仍有较大研究空间。
(三)发明内容
本发明的目的是通过代谢工程技术，提供一种构建DPA生产菌株的新思路，解决在DPA发酵过程中产量不高和糖酸转化率偏低的问题，通过理性设计、定向改造获得一株高产DPA生产菌株。
为实现本发明的上述目的，本发明采用的技术方案：
一种D-泛酸生产菌，由如下方法构建获得：
(1)以菌株CCTCC NO：M 2018914(DPA9)为底盘菌株，将其基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9 Trc-lpd，记为DPA10；
(2)将DPA9 Trc-lpd基因组中的glk基因敲除，得到DPA9 Trc-lpd/△glk，记为DPA11；
(3)将带有M13启动子的ilvA基因插入到DPA11基因组中，得到菌株DPA11/M13-ilvA，记为DPA11A；
(4)将菌株DPA11A基因组中基因pckA、maeB和ilvBN的原始启动子依次替换为Trc启动子，得到菌株ZJUTDPAL3；
(5)将外源基因panB、panC、alsS和内源基因ilvD同时整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A-panB/panC/alsS/ilvD；将该质粒导入菌株ZJUTDPAL3中，得到菌株ZJUTDPAL4；
(6)在菌株ZJUTDPAL4的基因组中，将其基因gdhA起始密码子ATG突变为TTG，得到菌株ZJUTDPAL5；
(7)将菌株ZJUTDPAL5基因组中pta基因敲除得到菌株ZJUTDPAL6。
(8)将菌株ZJUTDPAL6基因组中cycA基因的原始启动子替换成Trc启动子，得到菌株ZJUTDPAL7，即所述D-泛酸生产菌。
图1为大肠杆菌中DPA生物合成途径及本发明涉及的基因工程改造示意图。首先，在底盘菌DPA11的基础上，插入带M13启动子的ilvA基因，以减弱异亮氨酸代谢途径阻断带来的营养缺陷毒性；然后，通过启动子替换，强化基因pckA和maeB的表达，增强DPA合成的前体供应；通过使用Trc启动子替换ilvBN操纵子启动子，增强丙酮酸转化为乙酰乳酸；通过质粒过表达DPA合成的关键基因panB(来源于Corynebacterium glutamicum)、panC(来源于Corynebacterium glutamicum)、alsS(Bacillus subtilis)和ilvD，增强DPA的合成；通过起始密码子突变，敲弱gdhA基因，减少氨基酸类副产物的积累；通过敲除pta基因，阻断乙酸的合成，减少乙酸的积累；最后通过启动子替换，强化基因cycA的表达，增加β-丙氨酸的利用率。最终得到高产DPA的工程菌株。
本发明还涉及构建所述D-泛酸生产菌的方法，所述方法如下：
(1)以菌株CCTCC NO：M 2018914为底盘菌株，运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将其基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9 Trc-lpd，记为DPA10；
(2)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将DPA9 Trc-lpd基因组中的glk基因敲除，得到DPA9 Trc-lpd/Δglk，记为DPA11；
(3)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将带M13启动子的ilvA基因插入到DPA11基因组中，得到重组菌株DPA11A；
(4)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将DPA11A基因组中基因pckA、maeB和ilvBN的原始启动子替换为Trc启动子，得到菌株ZJUTDPAL3；
(5)将外源基因panB、panC、alsS和内源基因ilvD同时整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A-panB/panC/alsS/ilvD；将该质粒导入菌株ZJUTDPAL3中，得到菌株ZJUTDPAL4；
(6)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株ZJUTDPAL4基因组中gdhA基因的起始密码子ATG突变为TTG，得到菌株ZJUTDPAL5；
(7)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株ZJUTDPAL5基因组中pta基因敲除，得到菌株ZJUTDPAL6。
(8)运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株ZJUTDPAL6基因组中的cycA基因的启动子替换成Trc启动子，得到菌株ZJUTDPAL7，即所述D-泛酸生产菌。
本发明还涉及所述D-泛酸生产菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
具体的，所述应用为：将所述D-泛酸生产菌接种至发酵培养基中，于35～40℃、100～300rpm条件下进行发酵培养12～24h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到备D-泛酸；所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10～30g/L、硫酸铵10～20g/L、酵母粉1～5g/L、KH2PO40.1～1.0g/L、MgSO4 0.1～2.0g/L、β-丙氨酸1～5g/L，微量金属盐溶液0.5～5mL/L，pH 6.5～7.0，溶剂为去离子水；微量金属盐溶液组成为：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/LZnSO4·7H2O、0.20g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
优选的，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L，硫酸铵16g/L，酵母粉2g/L，KH2PO4 0.8g/L，MgSO4 0.5g/L，β-丙氨酸2g/L，微量金属盐溶液2mL/L，溶剂为去离子水
通常，所述基因工程菌株发酵前，先接种至LB培养基中，于温度37℃、转速200rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5～15％接种量接种到发酵培养基中培养。
本发明有益效果主要体现在：本发明所构建的DPA生产菌在发酵过程中，反应底物β-丙氨酸是通过外源添加的，该方式能实现发酵过程发酵液中DPA的有效积累，并提高DPA的产量及糖转化率，DPA产量高达66.39g/L，糖酸转化率达30％，具有大规模生产的应用潜力。
(四)附图说明
图1为大肠杆菌中DPA生物合成途径及本发明涉及的基因工程改造示意图；
图2为质粒pTrc99A-panB/panC/alsS/ilvD图谱。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例中，所述卡那霉素(kana)的使用终浓度为50ng/μL。所述盐酸壮观霉素(SD)的使用终浓度为50ng/μL。实施例中所用大肠杆菌感受态细胞为购买的商用大肠杆菌DH5α，重组反应所用的一步法定向克隆无缝克隆试剂盒购于诺唯赞公司，但不局限于此公司。
实施例1：底盘菌DPA11A菌株的构建
构建D-泛酸高产菌株采用的基因编辑方法参照文献(Zhang,B.,et al.,Metabolic engineering of Escherichia coli for D-pantothenic acidproduction.Food Chem,2019.294:p.267-275.),具体进行方法如下：
DPA11A菌株的构建是以DPA11为底盘菌(DPA11构建方法参见CN 111100834A)。
(1)pTarget-gRNA质粒突变
设计定点突变引物，将pTarget上20bp同源序列突变成靶基因ilvA插入位置的PAM位点前的20bp序列。以pTarget为模板，ilvA-pT F和ilvA-pT R为引物，PCR扩增pTarget突变质粒，扩增体系如下：
PCR扩增结束后，利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后向PCR产物中加入0.5μL的DpnI，37℃消化1h，取消化产物10μL加入到100μL的DH5α感受态细胞中进行转化实验，然后将培养液涂布于LB固体培养基(SD抗性)，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于10mL的LB液体培养基(SD抗性)中，培养18h以上，取菌液送测序并提取突变质粒pTarget-ilvA-g备用。
(2)PCR扩增donor DNA和线性化pTarget-ilvA-g质粒片段
以大肠杆菌基因组为模板，分别以ilvA-P1、ilvA-P2和ilvA-P3、ilvA-P4为引物PCR扩增出靶基因上下游各约500bp序列作为同源臂(donor DNA)。以p T+D CF com、p T+DCR com为引物，pTarget-ilvA-g为模板，PCR扩增pTarget-ilvA-g线性化质粒片段。扩增体系如下：
PCR扩增结束后，利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后向线性化pTarget-ilvA-g质粒片段中加入1μL的DpnI，37℃消化1h。然后使用DNA清洁试剂盒对消化产物和PCR扩增的donor DNA进行clean up，并检测清洁后产物的DNA浓度，-20℃保存备用。
(3)一步克隆连接线性化pTarget-ilvA-g质粒片段和donor DNA
取(2)中清洁后的产物，根据线性化pTarget-ilvA-g质粒片段和donor DNA的浓度，利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应。取一步克隆产物10μL加入到100μL的DH5α感受态细胞中进行转化实验，然后将培养液涂布于LB固体培养基(SD抗性)，37℃培养过夜。待长出单菌落，挑取单菌落接种10mL的LB液体培养基(SD抗性)，送测序并提取质粒pTarget-ilvA-pdg备用。
(4)pTarget-ilvA-pdg的电击转化
制备含pCas质粒的DPA11菌株的电转感受态。取一只电转感受态，冰浴放置，在超净台中加入2μL pTarget-ilvA-pdg，用移液器轻柔混匀，冰浴1min；用移液器将混匀液转移至预冷的2mm电击杯中(电击杯需提前在超净台风干)，冰浴45s。用纸巾擦干电击杯外侧水雾，置于电转仪中，使用Eco 2档电击。在超净台中向电击杯凹槽加入1mL预冷LB培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2mL无菌EP管中。30℃，180rpm复苏2.5h以上；取200μL涂布于LB固体培养基(SD+kana抗性)，30℃培养过夜。
(5)阳性克隆筛选和验证
在插入靶标基因上下游同源臂外侧100bp处分别设计正反向验证引物ilvA-VF、ilvA-VR，并以此引物为正反引物，挑取克隆子作为模板，进行菌落PCR，同时以原基因组为模板作阴性对照。菌落PCR有条带，大小正确，且阳性条带大于阴性对照，视为阳性。
(6)pTarget-pdg与pCas消除与测序验证
将阳性克隆接种于10mL LB试管(kana抗性)，并加入10μL IPTG母液，30℃，180rpm培养12h。取过夜培养菌液划线于LB固体培养基(kana抗性)，30℃培养过夜。取过夜划线平板，将单菌落编号，并挑取编号的部分单菌落，划线于LB固体培养基(SD抗性)上所对应的区域，37℃培养过夜。在LB固体培养基(SD抗性)所对应的区域不能生长的单菌落为pTarget-ilvA-pdg成功消除的克隆。
将pTarget-ilvA-pdg成功消除的克隆接种于10mL LB试管(无抗性)，37℃，180rpm培养12h。取过夜培养菌液，划线于LB固体培养基(无抗性)，37℃培养过夜。取过夜培养菌液，将单菌落编号，并挑取编号的部分单菌落，划线于LB固体培养基(kana抗性)上所对应的区域，30℃培养过夜。在LB固体培养基(kana抗性)所对应的区域不能生长的单菌落为pCas成功消除的克隆。
(7)阳性克隆测序验证
挑取pTarget-pdg与pCas均成功消除的克隆作为菌落PCR模板，以验证引物进行菌落PCR，菌落PCR产物送测序，验证阳性克隆，得到菌株DPA11A。
实施例2：Trc启动子替换基因pckA的原始启动子构建菌株ZJUTDPAL1
(1)pTarget-gRNA质粒突变
以pTarget为模板，TpckA-pT F和TpckA-pT R为引物，PCR扩增pTarget突变质粒。PCR产物经消化处理后，转化进入DH5α感受态细胞，经测序验证，得到突变质粒pTarget-pckA-g。
(2)构建质粒pTarget-pckA-pdg
以TpckA-P1、TpckA-P2和TpckA-P3、TpckA-P4为引物PCR扩增靶基因上下游donorDNA。同时以p T+D CF com、p T+D CR com为引物，pTarget-pckA-g为模板，PCR扩增线性化pTarget-pckA-g质粒片段。DpnI消化处理PCR扩增的pTarget-pckA-g线性化质粒片段后，使用DNA清洁试剂盒对消化后的线性化pTarget-pckA-g质粒片段和donor DNA进行clean up，再利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞后，经测序验证后得到质粒pTarget-pckA-pdg。
(3)pTarget-pckA-pdg的电击转化
制备含pCas质粒的DPA11A菌株的电转感受态。取一只电转感受态，在超净台中加入2μL pTarget-pckA-pdg，冰浴1min后转移至预冷的2mm电击杯中，冰浴45s。置于电转仪中进行电击。电击后立即向杯凹槽中加入1mL预冷LB培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2mL无菌EP管中。30℃，180rpm复苏2.5h以上；取200μL涂布于LB固体培养基(SD+kana抗性)，30℃培养过夜。
后续基因编辑、验证及质粒消除同实施例1(4-7)，得到菌株ZJUTDPAL1。
实施例3：Trc启动子替换基因maeB的原始启动子构建菌株ZJUTDPAL2
(1)pTarget-gRNA质粒突变
以pTarget为模板，TmaeB-pT F和TmaeB-pT R为引物，PCR扩增pTarget突变质粒。PCR产物经消化处理后，转化进入DH5α感受态细胞，经测序验证，得到突变质粒pTarget-maeB-g。
(2)构建质粒pTarget-maeB-pdg
以TmaeB-P1、TmaeB-P2和TmaeB-P3、TmaeB-P4为引物PCR扩增靶基因上下游donorDNA。同时以p T+D CF com、p T+D CR com为引物，pTarget-maeB-g为模板，PCR扩增线性化pTarget-maeB-g质粒片段。DpnI消化处理PCR扩增的pTarget-maeB-g线性化质粒片段后，使用DNA清洁试剂盒对消化后的线性化pTarget-maeB-g质粒片段和donor DNA进行clean up，再利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞后，经测序验证后得到质粒pTarget-maeB-pdg。
(3)pTarget-maeB-pdg的电击转化
制备含pCas质粒的ZJUTDPAL1菌株的电转感受态。取一只电转感受态，在超净台中加入2μL pTarget-maeB-pdg，冰浴1min后转移至预冷的2mm电击杯中，冰浴45s。置于电转仪中进行电击。电击后立即向杯凹槽中加入1mL预冷LB培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2mL无菌EP管中。30℃，180rpm复苏2.5h以上；取200μL涂布于LB固体培养基(SD+kana抗性)，30℃培养过夜。
后续基因编辑、验证及质粒消除同实施例1(4-7)，得到菌株ZJUTDPAL2。
实施例4：Trc启动子替换操纵子ilvBN的原始启动子构建菌株ZJUTDPAL3
(1)pTarget-gRNA质粒突变
以pTarget为模板，TilvBN-pT F和TilvBN-pT R为引物，PCR扩增pTarget突变质粒。PCR产物经消化处理后，转化进入DH5α感受态细胞，经测序验证，得到突变质粒pTarget-ilvBN-g。
(2)构建质粒pTarget-ilvBN-pdg
以TilvBN-P1、TilvBN-P2和TilvBN-P3、TilvBN-P4为引物PCR扩增靶基因上下游donor DNA。同时以p T+D CF com、p T+D CR com为引物，pTarget-ilvBN-g为模板，PCR扩增线性化pTarget-ilvBN-g质粒片段。DpnI消化处理PCR扩增的线性化pTarget-ilvBN-g质粒片段后，使用DNA清洁试剂盒对消化后的线性化pTarget-ilvBN-g质粒片段和donor DNA进行clean up，再采用一步克隆法连接线性化pTarget-ilvBN-g质粒片段和donor DNA，经转化和测序验证后得到质粒pTarget-ilvBN-pdg。
(3)pTarget-ilvBN-pdg的电击转化
制备含pCas质粒的ZJUTDPAL2菌株的电转感受态。取一只电转感受态，在超净台中加入2μL pTarget-ilvBN-pdg，冰浴1min后转移至预冷的2mm电击杯中，冰浴45s。置于电转仪中进行电击。电击后立即向杯凹槽中加入1mL预冷LB培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2mL无菌EP管中。30℃，180rpm复苏2.5h以上；取200μL涂布于LB固体培养基(SD+kana抗性)，30℃培养过夜。
后续基因编辑、验证及质粒消除同实施例1(4-7)，得到菌株ZJUTDPAL3。
实施例5：pTrc99A-panB/panC/alsS/ilvD质粒的构建
以pTrc99A-panB/panC/alsS质粒(实验室保藏)为模板，pBCS-F、pBCS-R为引物，PCR扩增线性化质粒片段，同时以ilvD-F、ilvD-R为引物，大肠杆菌W3110基因组为模板，扩增ilvD片段。利用DpnI消化扩增的线性化质粒片段，然后使用clean up试剂盒对消化后的线性化pTrc99A-panB/panC/alsS载体片段和ilvD片段进行清洁，再利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞后，涂布在含有卡那霉素的LB平板上。以pBCSD-VF、pBCSD-VR为引物，菌落PCR验证单克隆，阳性克隆送测序公司测序，确定连接成功的质粒pTrc99A-panB/panC/alsS/ilvD。将构建得质粒pTrc99A-panB/panC/alsS/ilvD转化ZJUTDPAL3得到菌株ZJUTDPAL4。
实施例6：敲弱基因gdhA构建ZJUTDPAL5
(1)pTarget-gRNA质粒突变
以pTarget为模板，rgdhA-pT F和rgdhA-pT R为引物，PCR扩增pTarget突变质粒。PCR产物经消化处理后，转化进入DH5α感受态细胞，经测序验证，得到突变质粒pTarget-gdhA-g。
(2)构建质粒pTarget-gdhA-pdg
以rgdhA-P1、rgdhA-P2和rgdhA-P3、rgdhA-P4为引物PCR扩增靶基因上下游donorDNA。同时以p T+D CF com、p T+D CR com为引物，pTarget-gdhA-g为模板，PCR扩增线性化pTarget-gdhA-g质粒片段。DpnI消化处理PCR扩增的线性化pTarget-gdhA-g质粒片段后，使用DNA清洁试剂盒对消化后的线性化pTarget-gdhA-g质粒片段和donor DNA进行clean up，再采用一步克隆法连接线性化pTarget-gdhA-g质粒片段和donor DNA，经转化和测序验证后得到质粒pTarget-gdhA-pdg。
(3)pTarget-gdhA-pdg的电击转化
制备含pCas质粒的ZJUTDPAL4菌株的电转感受态。取一只电转感受态，在超净台中加入2μL pTarget-gdhA-pdg，冰浴1min后转移至预冷的2mm电击杯中，冰浴45s。置于电转仪中进行电击。电击后立即向杯凹槽中加入1mL预冷LB培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2mL无菌EP管中。30℃，180rpm复苏2.5h以上；取200μL涂布于LB固体培养基(SD+kana抗性)，30℃培养过夜。
后续基因编辑、验证及质粒消除同实施例1(4-7)，得到菌株ZJUTDPAL5。
实施例7：敲除基因pta构建菌株ZJUTDPAL6
(1)pTarget-gRNA质粒突变
以pTarget为模板，Δpta-pT F和Δpta-pT R为引物，PCR扩增pTarget突变质粒。PCR产物经消化处理后，转化进入DH5α感受态细胞，经测序验证，得到突变质粒pTarget-pta-g。
(2)构建质粒pTarget-pta-pdg
以Δpta-P1、Δpta-P2和Δpta-P3、Δpta-P4为引物PCR扩增靶基因上下游donorDNA。同时以p T+D CF com、p T+D CR com为引物，pTarget-pta-g为模板，PCR扩增线性化pTarget-pta-g质粒片段。DpnI消化处理PCR扩增的线性化pTarget-pta-g质粒片段后，使用DNA清洁试剂盒对消化后的线性化pTarget-pta-g质粒片段和donor DNA进行clean up，再采用一步克隆法连接线性化pTarget-pta-g质粒片段和donor DNA，经转化和测序验证后得到质粒pTarget-pta-pdg。
(3)pTarget-pta-pdg的电击转化
制备含pCas质粒的ZJUTDPAL5菌株的电转感受态。取一只电转感受态，在超净台中加入2μL pTarget-pta-pdg，冰浴1min后转移至预冷的2mm电击杯中，冰浴45s。置于电转仪中进行电击。电击后立即向杯凹槽中加入1mL预冷LB培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2mL无菌EP管中。30℃，180rpm复苏2.5h以上；取200μL涂布于LB固体培养基(SD+kana抗性)，30℃培养过夜。
后续基因编辑、验证及质粒消除同实施例1(4-7)，得到菌株ZJUTDPAL6。
实施例8：Trc启动子替换cycA原始启动子构建菌株ZJUTDPAL7
(1)pTarget-gRNA质粒突变
以pTarget为模板，TcycA-pT F和TcycA-pT R为引物，PCR扩增pTarget突变质粒。PCR产物经消化处理后，转化进入DH5α感受态细胞，经测序验证，得到突变质粒pTarget-cycA-g。
(2)构建质粒pTarget-cycA-pdg
以TcycA-P1、TcycA-P2和TcycA-P3、TcycA-P4为引物PCR扩增靶基因上下游donorDNA。同时以p T+D CF com、p T+D CR com为引物，pTarget-cycA-g为模板，PCR扩增线性化pTarget-cycA-g质粒片段。DpnI消化处理PCR扩增的线性化pTarget-cycA-g质粒片段后，使用DNA清洁试剂盒对消化后的线性化pTarget-cycA-g质粒片段和donor DNA进行clear up，再采用一步克隆法连接线性化pTarget-cycA-g质粒片段和donor DNA，经转化和测序验证后得到质粒pTarget-cycA-pdg。
(3)pTarget-cycA-pdg的电击转化
制备含pCas质粒的ZJUTDPAL6菌株的电转感受态。取一只电转感受态，在超净台中加入2μL pTarget-cycA-pdg，冰浴1min后转移至预冷的2mm电击杯中，冰浴45s。置于电转仪中进行电击。电击后立即向杯凹槽中加入1mL预冷LB培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2mL无菌EP管中。30℃，180rpm复苏2.5h以上；取200μL涂布于LB固体培养基(SD+kana抗性)，30℃培养过夜。
后续基因编辑、验证及质粒消除同实施例1(4-7)，得到菌株ZJUTDPAL7。
表1：菌株基因型
表2：引物序列表
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实施例9：工程菌株的摇瓶发酵和发酵罐补料发酵
菌种活化：取-80℃保藏菌种划线接种于活化培养基(固体LB培养基)中，37℃培养过夜；
种子培养：用接种环挑取活化种子接种于装有10mL种子培养基(LB培养基)的试管中，37℃，200rpm培养过夜；
摇瓶发酵：按5％接种量接种种子液到装有20mL发酵培养基的500mL锥形瓶中，37℃，200rpm/min振荡培养，发酵周期48h；
发酵罐补料发酵：取种子培养基接种于3瓶含100mL LB培养基的500mL锥形瓶中，37℃，200rpm/min振荡培养12h。按15％的接种量将摇瓶种子液接入含2L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵温度控制在30℃，转速500rpm/min，通过40％氨水控制发酵pH为6.8。发酵过程采用pH-star模式控制补料，每4h取样检测生物量、残糖和D-泛酸的量。
摇瓶发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，硫酸铵16g/L，酵母粉2g/L，KH2PO41g/L，MgSO4 0.2g/L，CaCO3 15g/L，β-丙氨酸2.0g/L，盐溶液1mL/L，其中CaCO3独立分装灭菌(每份0.3g)。接种时加入CaCO3和4μL IPTG(1M)。
发酵罐发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，硫酸铵16g/L，酵母粉2g/L，KH2PO4 0.8g/L，MgSO4 0.5g/L，β-丙氨酸2g/L，盐溶液2mL/L。(盐溶液：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.2g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O)
补料培养基组成如下：葡萄糖500g/L、硫酸铵10g/L、酵母浸粉2g/L、KH2PO4 14g/L、MgSO4 8g/L、β-丙氨酸40g/L、盐溶液1mL/L。
发酵结束后，D-泛酸的检测采用HPLC方法，方法如下：
色谱柱：J&K C 18-H(250×4.6mm,5μm)
流动相：950mL水，50mL乙腈和950μL混匀后，过滤，超声30min。
柱温：30℃
流速：0.9mL/min
检测波长：200nm
表3：基因工程菌5L发酵罐补料发酵产D-泛酸
通过基因工程操作后，基因工程菌ZJUTDPAL7通过摇瓶发酵D-泛酸产量达5.78g/L，通过5L发酵罐发酵，D-泛酸产量达到66.39g/L，糖酸转化率达30％，且产量稳定。因此，本发明所构建的D-泛酸基因工程菌在发酵过程中能够实现发酵液中D-泛酸的有效积累，降低了生产成本，具有很大的应用潜力。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种D-泛酸生产菌、构建方法及应用
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
taatactagt cgacaacgtc atttgtggtt gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
gctctaaaac aaccacaaat gacgttgtcg actagtatta tacctaggac 50
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
cggtgctttt tttgaattct ctagaaagtg tacgaaagcc aggac 45
<210> 4
<211> 115
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
tcaattatat caacgttgtt atctcttgtc aacaccgcca gagataacaa aaaacccctc 60
aagacccgtt tagaggcccc aaggggttat gctagtatta accccccagt ttcga 115
<210> 5
<211> 115
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
tttgttatct ctggcggtgt tgacaagaga taacaacgtt gatataattg agcccttttg 60
gtgcgtcagt cagtttaaac caggaaacag ctttggctga ctcgcaaccc ctgtc 115
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
aggcattctg gaagattttg ccgcgcgggt aggcctgata 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
tatcaggcct acccgcgcgg caaaatcttc cagaatgcct 40
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
gggtaataga tctaagcttc tgcagactta ctactggtga tgcgg 45
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 9
taatactagt ccgtttcgtg acaggaatca gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 10
gctctaaaac tgattcctgt cacgaaacgg actagtatta tacctaggac 50
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 11
cggtgctttt tttgaattct ctagatgcga aggctttgtt gtatc 45
<210> 12
<211> 67
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 12
ccgctcacaa ttccacacat tatacgagcc ggatgattaa ttgtcaattg gtttatatgg 60
cgggaat 67
<210> 13
<211> 65
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 13
atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaccatg cgcgttaaca 60
atggt 65
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 14
gggtaataga tctaagcttc tgcagccacg aagttttcgg agtt 44
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 15
taatactagt atttgtgaac gttacgtgaa gttttagagc tagaaatagc 50
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 16
gctctaaaac ttcacgtaac gttcacaaat actagtatta tacctaggac 50
<210> 17
<211> 47
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 17
cggtgctttt tttgaattct ctagaaaggt gtgaatagca ccgaatc 47
<210> 18
<211> 68
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 18
ccgctcacaa ttccacacat tatacgagcc ggatgattaa ttgtcaaagt gagtgtcata 60
tcacggtg 68
<210> 19
<211> 69
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 19
atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaccatg gtagatcagg 60
taaaagtcg 69
<210> 20
<211> 47
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 20
gggtaataga tctaagcttc tgcaggacga caatcagcga cacaatg 47
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 21
atcctctaga gtcgacctgc ag 22
<210> 22
<211> 57
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 22
tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acctagagag ctttcgtttt catgagt 57
<210> 23
<211> 52
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 23
gagcggataa caatttcaca caggaaacag accatgccta agtaccgttc cg 52
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 24
ctgcaggtcg actctagagg atttaacccc ccagtttcga t 41

Claims (5)

1.一种D-泛酸生产菌，由如下方法构建获得：
（1）以菌株CCTCC NO：M 2018914为底盘菌株，将其基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9 Trc-lpd，记为DPA10；
（2）将DPA9 Trc-lpd基因组中的glk基因敲除，得到DPA9 Trc-lpd/△glk，记为DPA11；
（3）将带有M13启动子的ilvA基因插入到DPA11基因组中，得到菌株DPA11/M13-ilvA，记为DPA11A；
（4）将菌株DPA11A基因组中内源基因pckA、maeB和ilvBN的原始启动子替换为Trc启动子，得到菌株ZJUTDPAL3；
（5）将外源基因panB、panC、alsS和内源基因ilvD同时整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A-panB/panC/alsS/ilvD，将该质粒导入菌株ZJUTDPAL3中，得到菌株ZJUTDPAL4；所述外源基因panB来源于谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），panC来源于谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），alsS来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；
（6）将菌株ZJUTDPAL4基因组中gdhA基因的起始密码子ATG突变为TTG，得到菌株ZJUTDPAL5；
（7）将菌株ZJUTDPAL5基因组中pta基因敲弱，得到菌株ZJUTDPAL6；
（8）将菌株ZJUTDPAL6基因组中cycA基因的原始启动子替换成Trc启动子，得到菌株ZJUTDPAL7，即所述D-泛酸生产菌。
2.构建权利要求1所述D-泛酸生产菌的方法，其特征在于所述方法如下：
（1）以菌株CCTCC NO：M 2018914为底盘菌株，运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9 Trc-lpd，记为DPA10；
（2）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将DPA9 Trc-lpd基因组中的glk基因敲除，得到DPA9 Trc-lpd/△glk，记为DPA11；
（3）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将带M13启动子的ilvA基因插入到DPA11基因组中，得到重组菌株DPA11A；
（4）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将DPA11A基因组中内源基因pckA、maeB和ilvBN的原始启动子替换为Trc启动子，得到菌株ZJUTDPAL3；
（5）将外源基因panB、panC、alsS和内源基因ilvD同时整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A-panB/panC/alsS/ilvD；将该质粒导入菌株ZJUTDPAL3中，得到菌株ZJUTDPAL4；所述外源基因panB来源于谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），panC来源于谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），alsS来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；
（6）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株ZJUTDPAL4基因组中gdhA基因的起始密码子ATG突变为TTG，得到菌株ZJUTDPAL5；
（7）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株ZJUTDPAL5基因组中pta基因敲除，得到菌株ZJUTDPAL6；
（8）运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将菌株ZJUTDPAL6基因组中cycA基因启动子替换为Trc启动子，得到菌株ZJUTDPAL7，即所述D-泛酸生产菌。
3.权利要求1所述D-泛酸生产菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述D-泛酸生产菌接种至发酵培养基中，于35~40 ℃、100~300 rpm条件下进行发酵培养12~24h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到备D-泛酸；所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10~30g/L、硫酸铵10~20g/L、酵母粉1~5g/L、KH2PO4 0.1~1.0g/L、MgSO4 0.1~2.0g/L、β-丙氨酸1~5g/L，微量金属盐溶液0.5~5mL/L，pH 6.5~7.0，溶剂为去离子水；微量金属盐溶液组成为：10 g/L CuCl2、10 g/LFeSO4·7H2O、1 g/L ZnSO4·7H2O、0.20 g/L CuSO4、0.02 g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L，硫酸铵16g/L，酵母粉2g/L，KH2PO4 0.8g/L，MgSO4 0.5g/L，β-丙氨酸2g/L，微量金属盐溶液 2mL/L，溶剂为去离子水。
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