KR102416352B1

KR102416352B1 - 아밀로수크라아제를 발현하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주, 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102416352B1
Application number: KR1020200065071A
Authority: KR
Inventors: 서동호; 박천석; 진영욱; 신희순; 남영도
Original assignee: 한국식품연구원; 전북대학교 산학협력단
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2020-05-29
Publication date: 2022-07-06
Also published as: KR20210147607A

Abstract

본 발명은 아밀로수크라아제가 발현되도록 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 에 관한 것으로, 대장균으로부터 발현된 아밀로수크라아제는 단백질 2차 구조가 상이하고, 더 높은 당전이 효율을 가짐으로써, 수크로오스와 루테올린을 기질로 하였을 때 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside)을 더 많이 생산할 수 있다.

Description

아밀로수크라아제를 발현하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주, 및 이의 제조방법{Recombinat Corynebacterium glutamincum for the production of amylosucrase and method for manufacturing thereof}

본 발명은 아밀로수크라아제가 발현되도록 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum), 이의 제조방법 및 이로부터 얻은 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside) 생산능이 증가된 아밀로수크라아제에 관한 것이다.

아밀로수크라아제(Amylosucrase; ASase, EX 2. 4. 1. 4)는 수크로오스를 유일한 기질로 하여 α-1,4-글루칸으로 당전이(transglucosylate)시키는 글루칸수크라아제(glucansucrase) 중 하나이다. ASase는 설탕을 구성하는 글루코오스(glucose)과 프룩토오스(fructose)을 가수분해하고, 이때 형성된 포도당을 수용체(acceptor)로 사용하여 글루코오스를 다시 전이하며, 이를 통해 다양한 α-1,4 글루칸이 형성된다.

게다가 아밀로수크라아제는 수용체로 글루코오스, 살리신, 알부틴과 같은 당계통의 물질뿐만 아니라 비배당체(aglycone)인 카테킨, 하이드로퀴논, 루테올린 등에 글루코오스를 전이시키는 능력이 우수한 것으로 알려졌다.

상기 아밀로수크라아제 중에서도 디에노코커스 지오써말리스(Deinococcus geothermalis)유래 아밀로수크라아제가 가장 높은 열안정성과 높은 활성을 가지며, 다른 ASase와 달리 루테올린(luteolin)에 대한 가장 높은 당전이(transglucosylation) 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다.

루테올린(Luteolin)은 전형적인 플라보노이드로서 과일, 야채 등의 많은 식물에 포함되어 있으며 항암, 항알러지, 항염증 등의 다양한 생리학적 효능을 나타낸다고 보고되어 있다. 루테올린은 기능성 물질로서 높은 잠재력을 가지고 있음에도 불구하고, 루테올린의 낮은 수용해도 및 안정성으로 인해 식품이나 제약에서의 사용이 제한적이다. 게다가 현재까지 루테올린은 식물로부터 루테올린을 단리시킬 수 있거나 다단계 합성에 의해서만 제조되어 왔다.

이에 루테올린의 용해성과 안정성을 향상시키기 위해 대장균에서 데이노코커스 제오써르말리스로부터 유래한 아밀로수크라아제(Deionococcus geothermalis ASase, DGAS)를 발현시켜, 루테올린을 당화(glycosylation)하는데 성공하였으나, 여전히 효율이 낮고, 숙주세포로 대장균을 사용하고 있다는 점에서 안정성에 문제점을 가지고 있다. 게다가 대장균에 의해 생성된 내독소 인자는 제거가 어려워서 이를 위한 비용 상승 등이 발생하기 때문에 식품과 제약 분야에서 산업화하는데 어려움이 있다.

특허문헌 1. 대한민국 등록특허공보 제10-1731263호

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 아밀로수크라아제(DGAS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside) 생산능이 증가된 아밀로수크라아제의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주로부터 분리된 아밀로수크라아제를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside)의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명은 상기 과제를 달성하기 위하여, 아밀로수크라아제(DGAS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 아밀로수크라아제는 데이노코커스 제오써르말리스로부터 유래한 아밀로수크라아제일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 데이노코커스 제오써르말리스로부터 유래한 아밀로수크라아제(DGAS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 8로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 균주는 pXDGAS 재조합 벡터로 형질전환한 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주는 CD 스펙트럼으로 측정결과 α-Helix 구조 46 내지 47%, β-Streand 구조 5 내지 10%, Turn 구조 16 내지 17%의 단백질 2차 구조를 포함하는 데이노코커스 제오써르말리스로부터 유래한 아밀로수크라아제(DGAS)를 생산하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주는 기탁번호 KCCM12714P인 균주일 수 있다.

본 발명은 상기 다른 과제를 달성하기 위하여, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주를 배양하여 아밀로수크라아제를 생산하는 단계;를 포함하는 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside) 생산능이 증가된 아밀로수크라아제의 생산방법을 제공한다.

본 발명은 상기 다른 과제를 달성하기 위하여, CD 스펙트럼으로 측정결과 α-Helix 구조 46 내지 47%이고, β-Streand 구조 5 내지 10%, Turn 구조 16 내지 17%의 단백질 2차 구조를 포함하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주로부터 분리된 아밀로수크라아제를 제공한다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주로부터 분리된 아밀로수크라아제는 CD 스펙트럼 측정결과 α-Helix 구조 46.3%, β-Streand 구조 8.2%, Turn 구조 16.3%의 단백질 2차 구조를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 아밀로수크라아제는 수크로오즈를 기질로 하면, 14.4±0.5 중량 평균 중합도 및 12.1±0.2 수평균 중합도의 수용성 말토올리고당을 생산하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 아밀로수크라아제는 pH 4.0 내지 10.0, 25 내지 60 ℃에서 최적 활성을 나타내는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 다른 과제를 달성하기 위하여, 수크로오스 및 루테올린(luteolin)을 기질로 포함하는 반응액에 상기 아밀로수크라아제를 첨가하여 효소 반응시키는 것을 특징으로 하는 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside)의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주는 대장균으로부터 발현된 아밀로수크라아제(DGAS)과는 단백질 2차 구조가 상이하고, 더 높은 당전이 효율을 갖는 아밀로수크라아제를 생산함으로써, 수크로오스와 루테올린을 기질로 하였을 때 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside)을 더 많이 생산할 수 있다.

게다가 본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주는 종래 대장균를 숙주세포로 하였을 때보다 안전하게 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside)을 생산할 수 있으므로, 이를 식품 조성물, 건강기능식품, 사료 조성물, 약학 조성물 등에 다양하게 활용 및 산업화할 수 있다.

도 1은 실시예 1로부터 제조된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamincum) 균주를 한천배지에 도말하고, Lugol 용액으로 염색한 결과이다.
도 2는 His-tag(히스-태그)가 결합된 실시예 2로부터 제조된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamincum) 균주에서 발현된 cDGAS을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 3a는 실시예 1의 cDGAS 및 비교예 1의 eDGAS에 대한 온도에 따른 효소활성(%)을 나타낸 결과이다.
도 3b는 실시예 1의 cDGAS에 대한 녹음 곡선(melting curve)을 나타낸 결과이다.
도 4는 실시예 1의 cDGAS 및 비교예 1의 eDGAS에 대한 pH에 따른 효소활성(%)을 나타낸 결과이다.
도 4b는 pH별 실시예 1의 cDGAS에 대한 흡광도를 550 nm에서 측정하여 나타낸 결과이다.
도 5는 실시예 1의 cDAGS로부터 생성된 효소 반응액의 가용성 말토올리고당을 HPAEC(high performance anion exchange chromatography)로 분석한 결과이다.
도 6은 실시예 1의 cDGAS를 사용하여 루테올린의 생물전환 반응물을 HPLC로 분석한 결과이다.
도 7은 반응시간에 따른 실시예 1의 cDGAS와 비교예 1의 eDGAS에 대한 루테올린의 생물전환율(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 1의 cDGAS에 대한 CD(Circular dichroism) 분석 결과이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 아밀로수크라아제(DGAS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주에 관한 것이다.

본 발명자들은 대장균을 이용해 데이노코커스 제오써르말리스로부터 유래한 아밀로수크라아제(DGAS)을 생산하는 방법을 특허받은 바 있다, 그러나 이를 식품 조성물, 건강기능식품, 사료 조성물, 약학 조성물 등에 다양하게 활용 및 산업화하기 위해서는, 대장균이 갖고 있는 여러가지 안전상의 문제가 있다. 게다가 대장균에서 발현된 아밀로수크라아제(DGAS)는 루테올린의 당전이 활성이 낮다는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 아밀로수크라아제(ASaes)를 이종 발현(Heterologous expression)하여, 안전상 문제가 없으면서도, 루테올린(luteolin) 글루코사이드(glucoside) 생성이 증대된 신규효소를 발굴하고자 노력한 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주를 숙주세포로 할 경우 루테올린 당전이(transglucosylation) 활성이 효과적으로 높아짐을 확인하였다.

본 발명에서 선정한 숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주는 GRAS(generally recognized as safe)에서 인정하고 있는 안전한 균주로, 실제 산업에서 아미노산, 핵산의 생산을 위해 널리 사용되고 왔다. 즉 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주로부터 생산된 아밀로수크라아제와 이로부터 생성된 루테올린 글루코사이드는 식품 조성물, 건강기능식품, 사료 조성물, 약학 조성물 등에 안전하고 다양하게 활용될 수 있다.

상기 아밀로수크라아제(ASase)는 디에노코커스 지오써말리스(Deinococcus geothermalis)로부터 유래된 아밀로수크라아제(DGAS)일 수 있다.

상기 데이노코커스 제오써르말리스로부터 유래한 아밀로수크라아제(DGAS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 dgas 유전자인 것이 바람직하고, 데이노코커스 제오써르말리스(Deinococcus geothermalis)에서 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트로 PCR을 이용하여 얻은 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 8로 표시되는 것일 수 있다. 상기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있는데, 상기 서열번호 8과 각각 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함할 수 있다.

상기 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 체한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션할 수 있다.

상기 벡터는 일반적인 코리네박테리움 발현벡터를 사용할 수 있고, 특별히 이에 제한되지 않는다. 예를 들어 상기 벡터는 pEKEx1, pXMJ19, pCES208, pCRA1, pCRA429, pDXW-8, pBKGEXm2, pZ8-1, pVWEx1, pSK360, pEC901, pEC-XK99E, pTRCmob, pAPE12, pXK99E, pHM1519, pAM330 및 이들을 개량한 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 pXMJ19일 수 있다.

상기 벡터의 제한효소 부위는 PstI 부위를 포함하는 것일 수 있다. 이에 상기 데이노코커스 제오써르말리스로부터 유래한 아밀로수크라아제(DGAS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 제한효소 부위인 PstI 사이에 위치하는 것일 수 있다.

본 발명에서 "발현"은 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주가 자체적으로 발현시킬 수 없는 데이노코커스 제오써르말리스(Deinococcus geothermalis)에서 유래한 아밀로수크라제(DGAS)를 인위적으로 발현시키기 위해, 외부 유래의 유전자를 균주 내로 도입하여 발현시키는 것을 의미한다.

상기 재조합 발현벡터는 숙주세포에 형질전환하여 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제조하는데, 이때 상기 형질전환 방법은 공지된 기술이라면 특별히 이에 제한되지 않고 사용할 수 있다. 예를 들면 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982)을 형질전환에 사용할 수 있다.

상기 숙주세포는 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주이면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC 13032 균주일 수 있다.

상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주는 아밀로수크라아제, 바람직하게는 데이노코커스 제오써르말리스로부터 유래한 아밀로수크라아제(DGAS)를 생성하는데, 이는 대장균으로부터 발현된 데이노코커스 제오써르말리스로부터 유래한 아밀로수크라아제(eDGAS)와 단백질 2차 구조가 상이함을 확인하였고, 이로 인해 효소 활성과 최적 온도에 분명한 차이가 있음을 확인하였다. 이에 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주를 2020년 5월 1일 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM12714P으로 기탁하였다.

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM12714P

수탁일자 : 2020512

본 발명은 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주를 배양하여 아밀로수크라아제를 생산하는 단계;를 포함하는 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside) 생산능이 증가된 아밀로수크라아제의 생산방법에 관한 것이다.

상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주의 배양 조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 15 내지 55 ℃의 온도, 배양 시간 0.5 내지 72 시간일 수 있고, 바람직하게는 30 내지 40 ℃의 온도, 배양 시간 10 내지 15 시간일 수 있다.

상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주를 배양한 후, 이로부터 아밀로수크라아제를 분리, 정제 및 회수하기 위해서는 공지의 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면 균체를 원심분리를 통해 제거한 후, 염석, 에탄올 침쩐, 한외여과막, 겔 여과 크로마토그래피, 이온교환 칼럼 크로마토그래피 등의 공지된 적절한 방법이나 이들을 조합하여 분리 정제할 수 있다.

본 발명은 대장균 재조합 균주로부터 발현 및 분비된 단백질의 정제 및 회수와 달리 특별히 숙주세포나 변형된 단백질 등 오염원을 제거하기 위한 과정을 거치지 않고, 간단한 방법을 통해 아밀로수크라아제를 생산할 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주를 활용한 아밀로수크라아제의 생산은 실험실 규모에서 뿐만 아니라, 대규모 생산에도 적합하므로 상업적 활용에 용이하다.

상기 아밀로수크라아제는 데이노코커스 제오써르말리스로부터 유래한 아밀로수크라아제(DGAS)일 수 있다.

본 발명은 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주로부터 제조된 아밀로수크라아제에 관한 것이다.

상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주로부터 제조된 아밀로수크라아제는 CD 스펙트럼으로 측정결과 α-Helix 구조 46 내지 47%이고, β-Streand 구조 5 내지 10%, Turn 구조 16 내지 17%의 단백질 2차 구조를 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 α-Helix 구조 46.3%이고, β-Streand 구조 8.2%, Turn 구조 16.3%의 단백질 2차 구조를 포함하고 있음을 확인하였다. 이는 대장균에서 발현된 아밀로수크라아제 보다 낮은 β-Strand/α-Helix 비율을 가지는 것으로써, 실질적 단백질 3차 구조에서 분명한 차이가 있음을 알 수 있다.

상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주로부터 제조된 아밀로수크라아제는 수크로오즈를 기질로 하였을 때 14.4±0.5 중량 평균 중합도 및 12.1±0.2 수평균 중합도의 수용성 말토올리고당을 생산하는 것을 확인하였고, 이는 대장균에서 발현된 아밀로수크라아제에 비해 더 짧은 중합도를 갖는 수용성 말토올리고당을 생산하는 것을 확인하였다.

상기 아밀로수크라아제는 pH 4.0 내지 10.0, 25 내지 60 ℃에서 최적 활성을 나타내는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 pH 7.0 내지 9.0, 35 내지 45 ℃에서 최고 활성을 나타내는 것일 수 있다.

상기 아밀로수크라아제는 수크로오스 및 루테올린(luteolin)을 기질로 포함하는 반응액에 첨가할 경우, 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside)을 생성하고, 이는 대장균에서 발현된 아밀로수크라아제에 비해 10% 더 높은 활성을 나타냄을 확인하였다.

상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주로부터 제조된 아밀로수크라아제는 수크로오스 및 루테올린(luteolin)을 기질로 포함하는 반응액에 첨가하여 효소 반응시켜, 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside)을 생산할 수 있다.

상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주로부터 생산된 아밀로수크라아제를 통해 제조된 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside)은, 이를 유효성분으로 함유하는 식품 조성물, 기능성건강식품, 약학 조성물 및 사료 첨가제 조성물 등으로 활용될 수 있다.

상기 식품 조성물은, 식품 제조에 통상적으로 사용되는 식품의 기준 및 규격('식품공전')에 기재된 식품으로 사용가능한 식품 원료, 식품첨가물 공전에 기재된 식품첨가물을 포함한다. 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물은 단당류, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 이당류, 예를 들어 말토스, 설탕, 유당 등; 올리고당 또는 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 물엿, 사이클로덱스트린 등; 당알코올, 예를 들어 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등을 사용할 수 있다. 상기 향미제는 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

상기 식품 조성물에서 유효성분은 섭취자의 상태, 체중, 질병의 유무나 정도 및 기간에 따라 다르지만, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예들 들어 1일 투여량을 기준으로 1 내지 5,000 mg, 바람직하게는 5 내지 2,000 mg, 더욱 바람직하게는 10 내지 1,000 mg, 더더욱 바람직하게는 20 내지 800 mg, 가장 바람직하게는 50 내지 500 mg일 수 있고, 투여 횟수는 특별히 한정할 필요는 없으나 1일 3회 내지 1주일에 1회의 범위 내에서 통상의 기술자가 조절할 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.

상기 식품 조성물은 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 엑스제, 젤리 제형, 티백 제형 또는 음료 제형일 수 있다.

또한 일반 식품에 항암, 항알러지, 항염증 등의 기능성을 부여하기 위하여 상기 상기 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside)을 첨가할 수 있으며, 첨가가 가능한 식품은, 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 식품위생법 제7조에 따른 식품의 기준 및 규격('식품공전')에 예시된 과자류, 빵 또는 떡류, 코코아가공품류 또는 초콜릿류, 식육 또는 알가공품, 어육가공품, 두부류 또는 묵류, 면류, 다류, 커피, 음료류, 특수용도식품, 장류, 조미식품, 드레싱류, 김치류, 젓갈류, 절임식품, 조림식품, 주류, 건포류, 기타 식품류 등에 첨가될 수 있다. 또한 축산물위생관리법 제4조에 따른 축산물의 가공기준 및 성분규격('축산물공전')에 예시된 유가공품, 식육가공품 및 포장육, 알가공품에 첨가될 수 있다.

상기 약학 조성물은 항암, 항알러지, 항염증 등의 용도로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명의 유효성분과 혼합된 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이며, 예컨대, 정맥 내 주입, 국소 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.

또한, 건강기능식품은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 법적 기준에 따라 제조(가공을 포함)한 식품(건강기능식품에 관한 법률 제3조 제1호)을 말한다. 상기 '건강기능식품'은 국가마다 용어나 범위에 차이가 있을 수 있으나, 미국의 '식이 보충제(Dietary Supplement)', 유럽의 '식품 보충제(Food Supplemnet)', 일본의 '보건기능식품' 또는 '특정보건용식품(Food for Special Health Use, FoSHU)', 중국의 '보건식품' 등에 해당할 수 있다. 상기 식품 조성물 또는 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 '식품첨가물공전'의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 따른다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰( Corynebacterium glutamincum ) 균주로부터 발현된 데이노코커스 제오써르말리스(Deinococcus geothermalis)에서 유래한 아밀로수크라제(cDGAS) 제조

1) 데이노코커스 제오써르말리스(Deinococcus geothermalis)에서 유래한 아밀로수크라제(DGAS) 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 DNA(pHCDGAS) 제조

본 발명의 효소인 야생형 데이노코커스 제오써르말리스 유래 아밀로수크라아제를 코딩하는 뉴클레오티드는 데이노코커스 제오써르말리스의 염색체 유전자로부터 분리하여 사용하였다. 그 방법은 다음과 같다.

먼저, 디에노코커스 지오써르말리스(Deinococcus geothermalis) 유래, 아밀로수크라아제를 코딩하는 유전자 dgas(서열번호 8), 데이노코커스 제오써르말리스(Deinococcus geothermalis) DSM 11300의 염색체 DNA를 주형 DNA로 이용하고 표 1과 같은 서열로 정방향 프라이머 pHCDGAS1 및 역방향 프라이머 pHCDGAS2을 설계한 후, 표 2에 기재된 방법으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다.

명칭	유전자서열(5'->3')	비고
F_pHCDGAS1	CATATGCTGAAAGACGTGCTCACT	서열번호 6
R_pHCDGAS2	CTCGAGTGCTGGAGCCTCCCCGGCGGT	서열번호 7

변성 (denatruration)	사전 변성(pre-denaturation)	95/5 min
증폭 (amplification)	변성(denaturation)	95/1 min	30 회
	결합(annealing)	60/1 min
	확장(extension)	72/2 min
최종 확장 (final extension)	최종 확장(final extension)	72/ 5 min

상기 PCR을 수행한 결과, 벡터 전체를 포함하는 약 1.9 kb의 PCR 산물을 수득하였다. 상기 수득한 PCR 산물을 제한효소 NdeI과 XhoI로 처리된 pGEM-T Easy 벡터와 함께 접합(ligation)하여 pGEM-T-DGAS를 제조하였다. 이후, 상기 pGEM-T-DGAS를 제한효소 NdeI과 XhoI로 처리하고, 약 1.9 kbp 길이의 조각을 아가로스 전기영동을 통해 분리하여, 동일한 제한 효소로 처리한 pHCEXHD 발현벡터(His tag 포함 벡터)와 함께 라이게이션함으로써 pHCDGAS를 제조하였다.

2) 재조합 E. coil TOP10(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 균주 제조

상기 제조된 플라스미드 DNA인 pHCDGAS를 생성 및 증식시키기 위해 E. coil TOP10(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)(F-,mcrA △(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ△M15 △lacX74 recA1 araD139 △(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR)endA1 nupG) 균주를 사용하였다.

구체적으로 형질전환하고자 하는 재조합 벡터 pHCDGAS가 첨가된 라이게이션 액 1 ㎕를 첨가하여 잘 섞은 다음, 전기충격 큐벳(cuvette)으로 옮긴 후, 전기충격기(Hybaid CelljecT Uno, Hybaid Ltd, UK)로 전기적충격을 주어 형질전환을 수행하였다. 상기 형질전환을 수행한 반응액에 950 ㎕의 LB 액체배지를 첨가하고 37℃에서, 약 40분간 항온배양기에서 배양하였다. 배양 후, 앰피실린(100 ㎍/㎖)이 포함된 LB 한천 배지에 평판 도말하여 내성을 보이는 균주를 1차 선별하였다. 1차 선별된 균주를 앰피실린이 포함된 LB 액체 배지 5 ㎖에 접종하여 37℃에서 12시간 배양하고, 원심분리하여 균체를 수득하였다. 이후, 회수된 균체로부터 플라스미드 분리 키트를 통해 플라스미드를 분리하였다.

3) 셔틀 벡터(pXDGAS, pXDGAS-his) 제조

상기 2) 단계에서 회수된 pHCDGAS에서 pXDGAS와 pXDGAS-his, dgas를 제작하기 위해, Eggeling L, Bott M. Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC press2005에 따라 중합 효소 연쇄반응(PCR)를 수행하여 올리고 뉴클레오티드(F_PstI-dgas /R_PstI-dgas)를 조립하고, His-tag(히스-태그)가 결합된 올리고 뉴클레오티드(F_PstI-dgas/R_PstI-dgas-his)도 조립하였다(표 3).

상기 PCR 산물을 PstI로 분해한 다음 동일한 제한 효소로 절단한 pXMJ19(Jakoby M, Ngouoto-Nkili CE, Burkovski A. Construction and application of new Corynebacterium glutamicum vectors. Biotechnol Techniques 1999;13:437-41. https://doi.org/10.1023/A:1008968419217.)(ChlR;C. glutamicum/E. coli shuttle vector for regulated gene expression(Ptac,lacIq,pBL1, oriVC.g., oriVE.c.))벡터에 라이게이션하여 pXDGAS(pXMJ19+dgas)(실시예 1)와 His-tag(히스-태그)가 결합된 pXDGAS-his(pXMJ19+dgas+poly(His)6tag(N-terminal)(실시예 2)를 각각 제조하였다. 상기 두가지 벡터는 소화(PstI) 및 올리고 뉴클레오타이드 쌍(F_seq 및 R_seq)으로 재조합 영역을 시퀀싱함으로써 검증되었다.

명칭	유전자서열	비고
F_PstI_DGAS	AAGCTTGCATGCCTGCAG AAGGAGATATACAATGCTGAAAGACGTGCTCACTTC	서열번호 1
R_PstI_DGAS	GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGTTACTCGAGTGCTGGAGCCTCC	서열번호 2
R_PstI_DGAS-his	GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGTTAATGGTGATGGTGATGGTGCTC	서열번호 3
F_seq	CTGAAATGAGCTGTTGACAA	서열번호 4
R_seq	CAGACCGCTTCTGCGTTCTG	서열번호 5

상기 표 3에서 밑줄과 이탤릭체로 표시한 시퀀스는 특정 제한효소의 인식 사이트를 나타내며, 굵게 표시한 시퀀스는 RBS와 스페이서를 의미한다.

4) 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C orynebacterium glutamincum ) 균주

C. geutmalis 균주에서 아밀로수크라아제(amylosucrase)를 발현시키기 위해 C. glutamicum ATCC 13032(한국 농업 문화 회관, 한국 완주) 균주를 숙주 미생물(host)로 사용하였다. C. glutamicum ATCC 13032 균주 50 ㎕를 약 30분 정도 얼음에서 녹인 후, 형질전환하고자 하는 재조합 벡터 pXDGAS(실시예 1) 또는 pXDGAS-his(실시예 2)가 첨가된 라이게이션액 1 ㎕를 첨가하여 잘 섞은 다음, 전기충격 큐벳(cuvette)으로 옮긴 후, 전기충격기(Hybaid CelljecT Uno, Hybaid Ltd, UK)로 전기적충격을 주어 pXDGAS가 형질전환된 코리네박테이룸 글루타미쿰 균주(실시예 1)와 pXDGAS-his가 형질전환된 코리네박테이룸 글루타미쿰 균주(실시예 2)를 각각 얻었다.

상기 형질전환된 코리네박테이룸 글루타미쿰 균주를 950 ㎕의 BHI 액체배지를 첨가하고 37℃에서, 약 40분간 항온배양기에서 배양하였다. 배양 후, BHI 한천 배지에 평판 도말하여 내성을 보이는 균주를 1차 선별하였다.

1차 선별된 균주를 34 μg/ml chloramphenicol이 첨가된 Brain Heart Infusion(BHI) 액체배지 5 ㎖에 접종하여 37℃에서 12시간 배양하고, 원심분리하여 균체를 수득하였다. 이후, 회수된 각각의 균체로부터 플라스미드 분리 키트를 통해 플라스미드를 분리하고 PstI 제한효소로 절단하여, 두 쌍의 아밀로수크라아제를 암호화하는 뉴클레오티드(서열번호 4, 5)가 포함되어 있음을 확인한 균주를 선별하였다. 수크로오스(sucrose)는 Duchefa Bioch로부터 구입하여 사용하였다.

5) 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰( Corynebacterium glutamincum ) 균주로부터 발현된 데이노코커스 제오써르말리스(Deinococcus geothermalis)에서 유래한 아밀로수크라제(cDGAS)의 분리, 정제

상기에서 선별한 실시예 1 및 실시예 2 재조합 코리네박테이룸 글루타미쿰 균주를 각각 34 μg/ml chloramphenicol이 첨가된 Brain Heart Infusion(BHI) 액체배지 500 ㎖에서, Epoch 분광 광도계(BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 측정할 때 광학 밀도가 0.7~1.0에 가까워질 때까지 180 rpm, 37 ℃ 조건으로 배양하였다. 이후, isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside를 최종농도가 300 mM이 되도록 첨가하고, 세포를 24 시간 배양하여 dgas 발현을 유도하였다.

상기 세포를 원심분리(4,000 rpm, 4 ℃에서 10 분간)하여 수확하고, 결합 완충액[25 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride, and 20 mM imidazole (pH 8.0)]로 세척하고 다시 원심분리(7,000 rpm에서 20 분 동안 4 ℃)하였다. 상등액을 제거하고 펠렛을 회수하여, 결합 완충액에 재현탁시킨 후, 얼음물에서 초음파 처리를 통해 파쇄하여, 실시예 1 및 2의 균주로부터 crude cDGAS를 각각 회수하였다.

crude cDGAS는 Ni-NTA 칼럼(Ni-NTA superflow, Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 정제 하였다. 조효소(crude enzyme)를 컬럼에 넣고 결합 완충액으로 세척하였다. 다음 정제 효소를 용출 완충액[25 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride, and 250 mM imidazole (pH 8.0)]로 용출시켰다. 정제된 모든 효소를 용리시키기 위해 조효소를 첨가하기 전에 용해 완충액(lysis buffer)[25 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride, and 10 mM imidazole (pH 8.0)] 로 컬럼을 반복적으로 세척하였다. 모든 분획물을 회수하고, 10% 아크릴아미드 겔(Mini-PROTEIN TGX Stain free gels, Bio Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 확인하였다. 정제된 cDGAS는 Amicon Ultra Centrifugal Filter(30 kDa, Merck Millipore, MA, USA)를 사용하여 한외여과를 통해 농축시켰다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 사용하여 결정하였다.

정제된 재조합 아밀로수크라아제(cDGAS)의 분자량이 이론값과 일치하는 약 75kDa의 분자량을 나타내는 것으로 확인되었다. 즉 재조합 아밀로수크라아제 효소가 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamincum) 균주에서 성공적으로 발현됨을 확인할 수 있었으며, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 과정을 통하여 효율적으로 정제된다는 것을 알 수 있다.

<비교예 1> 재조합 E. coil TOP10(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 균주에서 발현된 데이노코커스 제오써르말리스(Deinococcus geothermalis)에서 유래한 아밀로수크라제(eDGAS) 제조

상기 실시예 1의 1) 및 2) 단계로부터 제조된 데이노코커스 제오써르말리스(Deinococcus geothermalis)에서 유래한 아밀로수크라제(DGAS) 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 E. coil TOP10(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 균주 제조하고, 이로부터 균체를 선별하고, 플라스미드를 분리하여 NdeI과 XhoI 제한 효소로 절단하여, 약 1.9 kb의 아밀로수크라아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함되어 있음을 확인한 1종의 균주를 선별하였다.

3) 재조합 E. coil TOP10(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 균주로부터 발현된 아밀로수크라아제(eDGAS)의 분리, 정제

상기에서 선별한 형질전환주를 37℃에서 15시간 배양하였다. 배양한 후, 4℃ 및 4,000 rpm의 조건으로 30분 동안 원심분리를 수행하여 균체를 회수하고, 라이시스 버퍼(Lysis buffer) [50mM NaH2PO4, pH 7.0, 300mM NaCl, 10mM imidazole, pH 7.0]에 현탁한 후, 초음파 분쇄하였다. 상기 초음파를 이용하여 분쇄한 분쇄액을 4℃ 및 12,000 rpm의 조건으로 10분간 원심분리를 수행한 후, 상등액을 수득하였다. 상기 상등액을 Ni-NTA 친화 크로마토그래피에 주입하여, 재조합 아밀로수크라아제를 정제하였다.

<시험예 1> cDGAS의 발현 및 정제

재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamincum) 균주로부터 데이노코커스 제오써르말리스(Deinococcus geothermalis)에서 유래한 아밀로수크라제(cDGAS)가 성공적으로 발현되는지를 확인하고자 하였다.

우선, 34 μg/ml chloramphenicol와 5%(w/v) sucrose가 함유된 BHI 한천배지에 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamincum) 균주(실시예 1)를 도말(streak-plated)하였다. 상기 플레이트를 고정 배양기에서 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 콜로니가 확인되면, 0.33%(w/v) 요오드가 함유된 Lugol 용액을 플레이트에 도포하였다. 상기 플레이트에 있는 콜로니의 색이 청색-흑색으로 변하였고, 이를 촬영하여 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamincum) 균주(실시예 1)는 Asase에 의해 amylose-like polymer(α-1,4 glucans)가 합성되므로, 요오드에 의해 청색으로 염색됨을 확인하였다. 이를 통해 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamincum) 균주에서 dgas 유전자가 발현됨을 알 수 있다.

도 2는 His-tag(히스-태그)가 결합된 실시예 2로부터 제조된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamincum) 균주에서 분리 및 정제한 cDGAS을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. lane 1은 마커(M)이고, lane 2는 pXDGAS-his로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamincum) 균주의 crude cell extrat이고, lane 3은 Ni-NTA 컬럼으로 정제한 cDGAS이다.

도 2에 나타난 바와 같이 본 발명의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamincum) 균주로부터 정제한 cDGAS는 73 kDa인 것을 확인하였다(lane 3). Dgas는 이론적으로 분자량이 73,296 Da인 651 개의 아미노산을 코딩하는 1,953 개의 뉴클레오티드로 이루어진 것으로 알려져 있다. 이는 본 발명에서 확인된 약 73 kDa의 cDGAS 분자량과 유사하므로, cDGAS의 이종발현이 성공적으로 이뤄졌음을 알 수 있다.

<시험예 2> cDGAS의 효소 특성-온도

본 발명에서 제조된 cDGAS과 비교예 1의 eDGAS과 효소 특성을 비교하고자 하였다.

우선, 200 mM 수크로오스가 용해된 용액 10 μL, 증류수 30 μL 및 50 mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 8.0) 50 μL를 포함하는 혼합액을 1.5 mL 미세튜브에서 제조하였다. 실시예 2로부터 회수한 cDGAS 10 μL 및 비교예 1로부터 회수한 eDGAS를 각각의 혼합액에 첨가하면 즉시 반응이 시작되었다. 상기 반응액을 5℃ 간격으로 25℃에서 40℃까지 20분 동안 마이크로 튜브 배양기에서 배양하였다. 반응이 완료된 후, 뜨거운 마이크로 플레이트상에서 5 분 동안 끓여서 효소 활성을 불활성화시켰다. 모든 반응은 3회 수행하였고 EPOCH 분광 광도계(BioTek)를 사용하여 각 반응액의 흡광도를 550 nm에서 측정하였다.

실시예 1의 cDGAS에 대한 녹음 곡선(melting curve)을 측정하기 위하여 DSF(differential scanning fluorimetry)를 사용하여 다음과 같이 수행하였다(도 3b). 희석된 SYPRO orange 용액(20X) 10 μL에 실시예 1의 정제된 cDGAS(0.5 mg/ml) 또는 정제된 DGAS(0.5 mg/mL)를 혼합하여 시료를 준비하였다. 상기 시료를 7500 Fast RT-PCR 시스템(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)을 사용하여 실시간 PCR(RT-PCR)을 통해 분석하여 도 3b에 나타내었다.

도 3a는 실시예 1의 cDGAS 및 비교예 1의 eDGAS에 대한 온도에 따른 효소활성(%)을 나타낸 것이고, 도 3b는 실시예 1의 cDGAS에 대한 녹음 곡선(melting curve)를 나타낸 것이다.

도 3a에 따르면 실시예 1의 cDGAS는 25-60 ℃였고, 최적 온도는 40 ℃였다. 이는 비교예 1의 eDGAS보다 5 ℃ 낮은 온도에서 최적화됨을 확인할 수 있다. 그러나 전반적으로 실시예 1의 cDGAS이 비교예 1의 eDGAS보다 더 높은 활성을 나타냄을 알 수 있다. 또한, 실시예 1의 cDGAS가 비교예 1의 eDGAS보다 더 낮은 온도에서 더 높은 활성을 가지고 있다.

도 3b에 따르면 실시예 1의 cDGAS가 녹는 온도는 65.19 ± 0.1 ℃인 것으로 확인되었다. 이는 비교예 1의 eDGAS까 65.21 ± 0.0 ℃인 것과 비교하여 유사함을 알 수 있다. 즉 실시예 1의 cDGAS는 열적안정성이 비교예 1의 eDGAS와 유사한 것을 알 수 있다.

종합하면, 동일한 유전자라 하더라도 호스트 세포에 따라 단백질 구조가 달라질 수 있으므로, 본 발명에서와 같이 동일한 유전자가 대장균과 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamincum) 균주에서 발현되더라도, 효소의 활성이나 발현 양상 및 단백질 크기 등 각각의 DGAS 특성이 다르게 나타난 것임을 알 수 있다.

<시험예 3> cDGAS의 효소 특성-pH

우선, 200 mM 수크로오스 10 ㎕, 증류수 30 ㎕를 포함하는 혼합액을 1.5 mL 미세튜브에 담았다. 상기 혼합액의 pH 범위를 다양하게 하기 위해 pH 3.0 내지 pH 10.0에 속하는 각각의 완충액 50 ㎕를 더 첨가하였다. pH 4.0 내지 5.0의 완충액은 소듐 아세테이트(sodium acetate)를 사용하여 제조하였고, pH 5.0 내지 6.0의 완충액은 소듐 시트레이트(sodium citrate)를 사용하여 제조하였으며, pH 6.0 내지 8.0의 완충액은 소듐 포스페이트(sodium phosphate)를 사용하여 제조하였으며, pH 8.0 내지 9.0의 완충액은 트리스-HCl을 사용하였고, pH 9.0 내지 10.0의 완충액은 글리신 -NaOH를 사용하여 제조하였다.

각각의 pH를 갖는 혼합물에 실시예 1로부터 제조된 정제된 cDGAS 10 μL를 각각 넣으면, 반응이 시작되고 이를 마이크로 튜브 배양기에서 40 ℃에서 20 분 동안 배양하였다. 각각의 반응액에 대해 효소 활성을 측정하고, 뜨거운 마이크로 플레이트상에서 5 분간 끓여 효소를 불활성화시켰다. 모든 반응은 3 회 반복 수행하였고, EPOCH 분광 광도계(BioTek)를 사용하여 550 nm에서 각 반응 혼합물의 흡광도를 측정하였다.

도 4는 실시예 1의 cDGAS와 비교예 1의 eDGAS의 pH에 따른 효소활성(%)을 나타낸 것이고, pH별 실시예 1의 cDGAS에 대한 흡광도를 550 nm에서 측정하여 도 4b에 나타내었다.

도 4a, b에 나타난 바와 같이 실시예 1의 cDGAS의 활성을 pH 4.0 내지 10.0 범위에서 측정한 결과, pH 8.0이 최적 범주임을 알 수 있다. 구체적으로 실시예 1의 cDGAS의 pH 프로파일과 비교예 1의 eDGAS의 pH 프로파일 결과가 전체적으로 유사한 경향을 나타내는 것으로 확인되었다.

<시험예 4> cDGAS에 의한 α-1,4 글루칸의 합성

본 발명에서 발현시키고자 했던 데이노코커스 제오써르말리스로부터 유래한 아밀로수크라아제(DGAS)는 수용성 및 불용성 글루칸을 포함하는 α-1,4-glucan을 생성하는 것으로 알려져있다. 이를 비롯한 실시예 1의 cDGAS에 의해 합성된 말토올리고당(Maltooligosaccharides)은 HPAEC(high-formance anion-exchange chromatography)로 분석하였다.

우선, 200 mM 수크로오스가 용해된 10 μL 증류수, 증류수 30 μL 및 50 mM 소듐 포스페이트(pH 8.0) 50 μL를 포함하는 혼합액을 1.5 mL 미세튜브에서 제조하였다. 실시예 1로부터 회수한 cDGAS 10 μL를 혼합액에 첨가하고, 이를 pH 8.0, 40℃에서 20분 동안 마이크로 튜브 배양기에서 배양하여, 효소 반응액을 얻었다.

상기 효소 반응액을 10 분 동안 끓여 효소를 불활성화시킨 후, 10,000xg, 25 ℃에서 10 분동안 원심분리하고, 멤브레인 필터 키트(0.2μm 공극 직경, Whatman)를 사용하여 여과하였다. 말토올리고당(Maltooligosaccharide) 분석은 CarboPacTM PA-200 컬럼(0.4 x 25 cm, Dionex, Sunnyvale, CA, USA)과 유속 0.5 ml/min의 전기 화학 검출기(ED50, Dionex)를 사용하여 수행하였다. 상기 여과액은 100% 완충액 A(150mM NaOH 수용액)에서 60% 완충액 B(완충액 A에 600mM 아세트산 나트륨 혼합)까지 선형 구배를 주어 70 분 이상 분리하였다.

상기 말토올리고당 중에서 불용성 글루칸의 경우, 긴 DP(degree of polymerization; 중합도)를 갖는 아밀로오스 유사 고분자이고, 효소 촉매 작용동안 백색 분말로 침전되는데, 실시예 1로부터 얻은 cDGAS의 효소 반응액과 비교예 1로부터 얻은 eDGAS의 효소 반응액은 동일한 양의 백색 분말이 형성되었음을 확인한 바 있다(데이터 미도시).

상기 실시예 1의 cDGAS와 비교예 1의 eDGAS로부터 말토올리고당 중에서 수용성 말토올리고당에 대한 구체적인 성분을 비교하고자 HPAEC로 분석하였고, 그 결과를 하기 표 4, 도 5에 나타내었다. 도 5는 실시예 1의 cDAGS로부터 생성된 효소 반응액의 수용성 말토올리고당을 HPAEC(high performance anion exchange chromatography)로 분석한 결과이다.

시료	DP_W ^a	DP_N ^b
실시예 1의 cDGAS	14.4 ± 0.5	12.1 ± 0.2
비교예 1의 eDGAS	15.6 ± 0.5*	12.9 ± 0.3

상기 표 4에서, ^a는 중량 평균 중합도(weight-average degree of polymerization; DP_W), ^b는 수평균 중합도(number-average degree of polymerization; DP_N)을 의미한다.

*는 t-test를 통해 얻은 유의미한 수치를 표기한 것이다(p<0.05)

표 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 cDGAS는 수크로오스를 단독기질로 하여 다양한 말토올리고당(maltooligosaccharides)을 생성함을 알 수 있다. 실시예 1의 cDGAS과 비교예 1의 eDGAS로부터 생성된 말토올리고당은 수평균 중합도에 큰 차이가 없었으나, 실시예 1의 cDGAS로부터 생성된 수용성 말토올리고당(중량 평균 중합도, DPw)이 비교예 1의 eDGAS 가용성 말토올리고당 보다 큰 것을 확인하였다.

아밀로수크라아제(ASase)는 수용체 물질로 수용성 말토올리고당을 사용하여 높은 중합도를 갖는 불용성 글루칸을 생성한다. 따라서 수용성 말토올리고당이 다량 존재한다는 것은, 불용성 글루칸으로 중합이 완료되지 않았음을 암시하는 것이므로, 본 발명의 실시예 1의 cDGAS가 비교예 1의 eDGAS보다 중합도가 높은 α-1,4-글루칸을 덜 생성하고 있음을 나타낸다. 실시예 1의 cDGAS가 비교예 1의 eDGAS보다 중합활성이 낮음을 알 수 있다.

<시험예 5> 루테올린에서 루테올린-4'- O- α-D-글루코피라노사이드의 생물전환능

실시예 1로부터 정제된 cDGAS의 루테올린(luteolin) 생물전환율(bioconversion yield, %)을 분석하고자 하였다. 이때, 비교예 1로부터 정제된 eDGAS의 당전이(transglucosylation) 반응의 최적 조건을 참고하여 반응을 수행하였다.

실시예 1의 cDGAS와 비교예 1의 eDGAS는 DNS 방법(Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem 1959;31:426-8)의 활성분석을 활용하여, 효소단위 10 U/ml로 동등하게 준비하였다.

우선, 200 mM 수크로오스 10 ㎕, 증류수 30 ㎕를 포함하는 혼합액을 1.5 mL 미세튜브에 담고, 100 mM 소듐 포스페이트 완충액(sodium phosphate, pH 8.0) 50 ㎕를 첨가하였다. 여기에 실시예 1의 cDGAS 또는 비교예 1의 eDGAS 10 μL를 각각 첨가하고, 40 ℃의 조건하에서 다양한 시간별(24 시간, 48 시간 및 72 시간)로 반응시켰다. 상기 효소 반응액을 5 분간 끓여서 효소 활성을 비활성화시킨 후, -20 ℃에 보관하였다가, 해동하여 고성능 액체 크로마토 그래피(HPLC)로 분석하였다.

상기 HPLC는 UV 반응기(Thermo Fisher Scientific)를 사용하는 Dionex ultimate 3000 HPLC 시스템(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하였다.

상기 루테올린의 생물전환율(bioconversion yield, %)은 다음 식 1로 계산하였다.

[식 1]

생물전환율(%) = { ([luteolin]_C-[luteolin]_R) / [luteolin]_C } × 100

식 1에서, 상기 [luteolin]_C는 초기 루테올린의 농도이고, 상기 [luteolin]_R은 효소 반응액에 남아있는 루테올린의 농도이다.

원래 바실러스 서브틸러스(B. subtilis)에서 발현된 DGAS는 기능적 수용체 물질에 대하여 당전이(transglycosylation) 활성을 나타내었고, 구체적으로 다이드제인(daidzein)을 다이드제인 배당체(daidzein diglucoside 및 daidzein triglucoside)로 전환하는 활성을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 그러나 이를 대장균에서 발현한 비교예 1의 eDGAS은 다양한 플라본(flavone) 화합물을 수용체 물질로 사용하여 루테올린 당전이(luteolin transglucosylation) 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서 DGAS를 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 발현할 경우, 어떤 활성을 나타내는지 비교 및 분석하고자 하였다.

도 6은 실시예 1의 cDGAS를 사용하여 루테올린의 생물전환 반응물을 HPLC로 분석한 것으로, Blank(검정선)는 실시예 1 cDGAS가 없는 반응액(대조군)을 사용하였고, 적색선은 실시예 1 cDGAS를 포함하는 반응액(실험군)이다. *는 t-test를 통해 얻어진 유의미한 범위의 수치임을 나타내는 것이다(p<0.05).

도 6에 나타난 바와 같이 실시예 1의 cDGAS는 루테올린 피크가 현저하게 감소하고 새로운 피크가 생성되었고, 이는 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside)를 나타내는 피크인 것으로 확인되었다. 즉 실시예 1의 cDGAS는 수용체 물질로 루테올린, 도너 물질로 수크로오스를 사용하여, 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside, L-4'αG)을 생성함을 알 수 있다.

도 7은 반응시간에 따른 실시예 1의 cDGAS와 비교예 1의 eDGAS에 대한 루테올린의 생물전환율(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다. 이에 따르면 실시예 1의cDGAS와 비교예 1의 eDGAS에 대한 생물전환율(%)은 반응 시간에 따라 증가함을 알 수 있다. 게다가 실시예 1로부터 제조된 cDGAS가 비교예 1로부터 제조된 eDGAS보다 10% 이상 높은 생물전환율(%)을 갖고 있음을 확인하였다.

<시험예 6> CD(circular dichroism) 분석

실시예 1의 cDGAS와 비교예 1의 eDGAS 효소에 대한 2 차 구조를 비교하기 위하여 BCA 단백질 분석 키트(Pierce Biotechnology)를 사용하여 농도를 0.5 mg/mL로 동일하게 제조하였다.

CD(circular dichroism) 분광기(spectroscopy)는 고성능 UV-Vis-IR 애벌런치 광 다이오드 형광 단색 검출기(a high-performance UV-Vis-IR avalanche photo-diode fluorescence monochromatic detector)가 있 Chirascan plus Circular Dichroism Detector (Applied Photophysics, Leatherhead, UK)를 사용하였다.

실시예 1의 cDGAS와 비교예 1의 eDGAS를 190-260 nm에서 원자외선 이원성 스펙트럼(Far-UV Circular dichroism spectra)을 측정하였다. 이때 셀은 0.1cm 길이의 직사각형 석영 셀을 사용하였다. CD(Circular dichroism)는 기준선을 0.2 mdeg/h로 안정화시킨 후 사용되었다. 모든 CD 스펙트럼은 SELCON3(Self Consistent Method for CD Analysis, ver 3)를 사용하여 protein Circular Dichroism spectra(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml)을 통해 온라인으로 α-helices, β-strands과 같은 2 차 구조를 분석하여 도 8 및 표 5에 나타내었다.

효소	실시예 1의 cDGAS	비교예 1의 eDGAS
방법	SELCON(%)	DSSP(%)	SELCON(%)
α-Helix	46.3	45.5	45.5
β-Strand	8.2	15.1	15.1
Turn	16.3	11.2	18.0
Others	29.3	28.2	21.4

비교예 1의 eDGAS(pdb : 3ucq)는 3차원 구조가 이전에 보고된 바 있고, 비교예 1의 eDGAS과 실시예 1의 cDGAS는 100% 상동성을 보임을 확인하였다.

표 5에 따르면, 비교예 1의 eDGAS은 단백질의 2 차 구조 정의(DSSP) 알고리즘에 따라 분석한 바, 45.5%의 α-Helix와 15.1%의 β-Strands로 구성됨을 확인하였다. 이에 반해 실시예 1의 cDGAS는 46.3%의 α-Helix와 8.2%의 β-Strands로 구성됨을 확인하였다.

CD(Circular dichroism)는 단백질의 이차구조, 접힘 및 결합 특성을 빠르게 확인할 수 있는 분석방법으로, 동일한 단백질이라도, 이의 이차구조가 숙주세포에 따라 달라짐을 본 실험을 통해 확인할 수 있다. 즉 실시예 1의 cDGAS이 비교예 1의 eDGAS보다 β-Strands가 더 적게 구성되어 있음을 알 수 있다. 이러한 단백질의 이차구조 변화는 잠재적으로 효소 활동에 영향을 미치게 됨을 앞선 실험을 통해 확인하였다.

결론적으로, dgas 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주에서도 효율적으로 형질전환되어 cDGAS 효소를 발현함을 확인하였다. 동일한 유전자지만 대장균에서 발현된 DGAS 효소와 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주에서 발현시킨 DGAS 효소는 구조와 활성면에서 차이를 가지고 있음을 상술한 실험을 통해 확인하였다. 구체적으로 cDGAS(실시예 1)의 pH 프로파일은 비교예 1의 eDGAS와 일치하나, 온도 프로파일은 비교예 1의 eDGAS보다 전체적으로 낮았다. 게다가 루테올린(luteolin)의 중합활성에 있어서 실시예 1의 cDGAS는 비교예 1의 eDGAS보다 낮고, 당전이(transglucosylation) 활성이 높아 루테올린 글루코사이드(Luteolin glucoside)를 더 많이 생성할 수 있음을 확인하였다. 특히 CD 분석을 통해 실시예 1의 cDGAS은 비교예 1의 eDGAS보다 낮은 β-Strand/α-Helix 비율을 가짐을 확인함으로써, 단백질 상동성은 100%이나 실질적 단백질 구조에 분명한 차이가 있고 이로 인해 효소활성도 상이함을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Recombinat Corynebacterium glutamincum for the production of amylosucrase and method for manufacturing thereof <130> HPC9174 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence (F_PstI_DGAS) <400> 1 aagcttgcat gcctgcagaa ggagatatac aatgctgaaa gacgtgctca cttc 54 <210> 2 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence (R_PstI_DGAS) <400> 2 ggatcctcta gagtcgacct gcagttactc gagtgctgga gcctcc 46 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence (R_PstI_DGAS-his) <400> 3 ggatcctcta gagtcgacct gcagttaatg gtgatggtga tggtgctc 48 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence (F_seq) <400> 4 ctgaaatgag ctgttgacaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence (R_seq) <400> 5 cagaccgctt ctgcgttctg 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence (F_pHCDGAS1) <400> 6 catatgctga aagacgtgct cact 24 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence (R_pHCDGAS2) <400> 7 ctcgagtgct ggagcctccc cggcggt 27 <210> 8 <211> 1950 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Deionococcus geothermalis ASase, DGAS <400> 8 atgctgaaag acgtgctcac ttctgaactg gcggcgcagg tacgagacgc cttcgatgat 60 gaccgtgacg ccgagacgtt cctgctgcgg ctggaacgct acggcgagga cctctgggag 120 agcctgcgcg cggtgtatgg cgaccaggtg agggccttgc cagggcgact gctggaagtc 180 atgctccacg cctatcacgc ccgccccgcg gagctgcggc gtttggacga ggcccggctg 240 ctgcggcccg actggctgca acgtcccgag atggtgggct acgtcgccta caccgaccgt 300 tttgccggaa cgctgaaggg ggtagaggag cgcttggact acctggaggg cctgggtgtg 360 aagtacctgc acctgatgcc ccttctcagg ccgcgcgagg gcgaaaatga cggtggctac 420 gcggtgcagg attaccgagc ggtgcgtccc gacctgggca cgatggatga cctctcggcc 480 ctcgcgcggg cgctgcgggg ccgcggcatc agcctggtgc tggatctcgt gctgaaccac 540 gtggcgcgcg aacatgcgtg ggcccagaag gcgcgggcgg gtgatcccaa gtaccgggcc 600 tactttcatc tcttccccga ccgcaggggg ccggacgctt ttgaagccac ccttcctgag 660 atctttcccg acttcgcgcc gggcaacttc tcgtgggacg aggagatcgg tgaaggcgag 720 gggggctggg tctggaccac cttcaacagc taccagtggg acctgaactg ggccaacccc 780 gacgtgtttc tggagtttgt ggacatcatc ctctacctcg ccaaccgggg cgtggaggtg 840 ttccggctgg atgcgatcgc cttcatctgg aagcggctgg gaaccgactg ccaaaaccag 900 ccggaagttc accacctcac gcgggcgctg cgggcagccg cgcgcatcgt cgcgcccgca 960 gtcgccttta aggccgaggc gatcgtggcg cccgccgacc tgatccacta cctgggcacc 1020 cgtgcgcacc acggcaaggt gagcgacatg gcctaccaca acagcctgat ggtgcagctg 1080 tggagtagcc tcgccagccg gaatacccgt ctctttgagg aggcactgcg ggcgtttccc 1140 cccaagccca cgagcacgac ctgggggctg tacgtccgct gtcacgacga catcggctgg 1200 gccatcagcg acgaggacgc ggcccgggcc ggattgaacg gcgcggcgca ccggcacttt 1260 ctctcggact tctacagcgg tcagtttccc ggctcctttg cgcgggggct ggtgtttcag 1320 tacaacccgg tgaacggcga ccggcgcatc agtggctcgg cggccagcct cgctgggctg 1380 gaggcagcgc tggaaaccgg ggacccgggc cgcatcgagg acgcggtgcg tcgcctgctg 1440 ctcctccaca cggtcattct cggcttcggc ggggtgccgc tgctgtacat gggcgacgaa 1500 ctcgccctgc tgaatgacta cgccttcgag gacgtgcccg aacacgcgcc ggacaaccgc 1560 tgggtgcatc gcccgcagat ggattgggcc ctcgcggagc gggtgcggca ggagccttcc 1620 tcgcccgccg gacgggtgaa cacgggcctg cgccacctcc tgcgggtgcg ccgcgatacc 1680 ccgcagctgc acgccagcat cgagagccag gtgctgccca gccccgattc gcgtgcgctt 1740 ctgctgcgcc gcgaccatcc cctcggcggg atggtgcagg tgtacaactt cagcgaggag 1800 acggtgatgc tgcccagcca tgttctgcgg gacgtgctgg gggaccacgt ccaggaccgg 1860 ctgagcggga gtgcctttcg cctagatcgg cccaccgttc gcctggaggg ctaccgggca 1920 ctgtggctga ccgccgggga ggctccagca 1950

Claims

데이노코커스 제오써르말리스로부터 유래한 아밀로수크라아제(DGAS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) KCCM12714P로,
상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) KCCM12714P균주는 CD 스펙트럼으로 측정결과 α-Helix 구조 46 내지 47%, β-Streand 구조 5 내지 10%, Turn 구조 16 내지 17%의 단백질 2차 구조를 포함하는 데이노코커스 제오써르말리스로부터 유래한 아밀로수크라아제(DGAS)를 생산하는 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주.
삭제
제1항에 있어서,
상기 데이노코커스 제오써르말리스로부터 유래한 아밀로수크라아제(DGAS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 8로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주.
삭제
삭제
데이노코커스 제오써르말리스로부터 유래한 아밀로수크라아제(DGAS)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주를 배양하여 아밀로수크라아제를 생산하는 단계;를 포함하는 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside) 생산능이 증가된 아밀로수크라아제의 생산방법.
제6항에 있어서,
상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주는 CD 스펙트럼으로 측정결과 α-Helix 구조 46 내지 47%, β-Streand 구조 5 내지 10%, Turn 구조 16 내지 17%의 단백질 2차 구조를 포함하는 데이노코커스 제오써르말리스로부터 유래한 아밀로수크라아제(DGAS)를 생산하며,
상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주는 기탁번호 KCCM12714P인 것을 특징으로 하는 아밀로수크라아제의 생산방법.
제6항으로부터 제조된, 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside) 생산능이 증가된 아밀로수크라아제로,
상기 아밀로수크라아제는 CD 스펙트럼으로 측정결과 α-Helix 구조 46 내지 47%, β-Streand 구조 5 내지 10%, Turn 구조 16 내지 17%의 단백질 2차 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside) 생산능이 증가된 아밀로수크라아제.
제8항에 있어서,
상기 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside) 생산능이 증가된 아밀로수크라아제는 CD 스펙트럼 측정결과 α-Helix 구조 46.3%, β-Streand 구조 8.2%, Turn 구조 16.3%의 단백질 2차 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 아밀로수크라아제.
제8항에 있어서,
상기 아밀로수크라아제는 수크로오즈를 기질로 하였을 때, 14.4±0.5 중량 평균 중합도 및 12.1±0.2 수평균 중합도의 수용성 말토올리고당을 생산하는 것을 특징으로 하는 아밀로수크라아제.
제8항에 있어서,
상기 아밀로수크라아제는 pH 4.0 내지 10.0, 25 내지 60 ℃에서 최적 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 아밀로수크라아제.
수크로오스 및 루테올린(luteolin)을 기질로 포함하는 반응액에 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 아밀로수크라아제를 첨가하여 효소 반응시키는 것을 특징으로 하는 루테올린-4'-O-α-D-글루코피라노사이드(luteolin-4'-O-α-D-glucopyranoside)의 생산방법.