TW201843304A - 製造化合物1的方法、具有化合物1之結構的化合物、細胞溶解產物、重組細胞、融合多肽、重組核酸分子以及製造化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本文所提供的內容包含例如化合物1之羅漢果苷化合物的製造方法、用於製造羅漢果苷化合物之組成物（例如宿主細胞）、以及藉由本文中所揭露之方法製造的羅漢果苷化合物以及包括羅漢果苷化合物（例如化合物1）之組成物（例如細胞溶解產物）及重組細胞。本文亦提供新穎的葫蘆二烯醇合成酶及其用途。

Description

製造化合物1的方法、具有化合物1之結構的化合物、細胞溶解產物、重組細胞、融合多肽、重組核酸分子以及製造化合物的方法
本發明是關於用於製造甜味化合物之方法、系統及組成物，以及包括所述甜味化合物之組成物。
味覺系統提供關於外部世界之化學組成的感官資訊。味覺轉換為動物化學觸發的感覺中最複雜的形式之一。味覺信號傳導存在於從簡單的後生動物到最複雜的脊椎動物的整個動物界中。咸信哺乳動物具有五種基本味覺模式：甜、苦、酸、鹹以及鮮（麩胺酸單鈉之味道，又名美味（savory taste））。
幾個世紀以來，一直在向包含食物及飲料之可攝入組成物及/或口服藥物組成物中添加各種天然的及非天然的組成物及/或化合物來改善其味道。雖然長久以來已經知道僅存在幾種基本類型的「味覺」，但是對味覺感受之生物及生化基礎不太瞭解，且大部分味覺改善劑或味覺調節劑主要由簡單的試誤法發現。
關於甜味，糖尿病及心血管疾病為全世界都出現的健康問題，但在美國以驚人的速率增長。糖及卡路里為關鍵要素，限制糖及卡路里能對健康呈現積極營養作用。高強度甜味劑能夠以不同的味覺品質提供糖之甜味。因為其比糖甜許多倍，所以極少的甜味劑即可替代糖。
高強度甜味劑具有廣泛範圍的化學上不同的結構且從而具有不同特性，諸如但不限於氣味、風味、口感以及餘味。這些特性，尤其是風味及餘味，熟知會隨著品嘗時間的推移而改變，使得每個時間特徵（temporal profile）皆為甜味劑特定的。
近來在鑑別有用的天然調味劑方面取得了顯著的進展，所述天然調味劑諸如甜味劑，諸如蔗糖、果糖、葡萄糖、赤藻糖醇、異麥芽糖（isomalt）、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、某些已知的天然萜類、類黃酮或蛋白質甜味劑。參見例如晶弘（Kinghom）等人, 「不生齲齒的強烈天然甜味劑（Noncariogenic Intense Natural Sweeteners）」, 醫藥研究評論（Med. Res. Rev.） 18 (5) 347-360 (1998)（論述了所發現的甜味比諸如蔗糖、果糖及其類似物之常見天然甜味劑強得多的天然材料）。類似地，近來在鑑別及商品化新的人工甜味劑方面亦有進展，所述新的人工甜味劑諸如阿斯巴甜（aspartame）、糖精、乙醯磺胺酸鉀、賽克拉美（cyclamate）、蔗糖素及其類似物。參見例如埃傑（Ager）等人, 應用化學國際版（Angew. Chem. Int. Ed.） 37, 1802-1817 (1998)。以上所鑑別之參考文獻之完整內容在此以全文引用之方式併入本文中。
甜味劑，諸如糖精及6-甲基-1,2,3-噁噻嗪-4(3H)-酮-2,2-二氧化物鉀鹽（乙醯磺胺酸鉀），其特徵通常為具有苦味及/或金屬餘味。由2,4-二羥基苯甲酸製備的產品聲稱呈現減少的與甜味劑相關之不良餘味，且在低於可感覺到其自身味道之濃度的濃度下亦如此。此外，據報導，諸如蔗糖素及阿斯巴甜之高強度甜味劑具有甜味遞送問題，亦即，甜味的出現延遲及甜味殘留。參見S.G.維特（S. G. Wiet）等人, 食品科學雜誌（J. Food Sci.）, 58(3):599-602, 666 (1993)。
需要具有改良的味覺及遞送特徵的新的甜味化合物、甜味增強劑以及含有此類化合物及增強劑之組成物。此外，需要含有具有此類所期望特徵之新的甜味化合物及/或甜味增強劑的食品。
本文所提供的內容包含一種製造具有以下結構之化合物1的方法：（1）。
在一些實施例中，方法包括使羅漢果苷IIIE與能夠催化羅漢果苷IIIE產生化合物1之第一酶接觸。在一些實施例中，使羅漢果苷IIIE與第一酶接觸包括使羅漢果苷IIIE與包括編碼第一酶之第一基因的重組宿主細胞接觸。第一基因可以例如與重組宿主細胞異源。
在一些實施例中，羅漢果苷IIIE與包括編碼第一酶之第一多核苷酸的重組宿主細胞中之第一酶接觸。羅漢果苷IIIE可例如提供至重組細胞、存在於重組宿主細胞中、由重組宿主細胞產生、或其任何組合。在一些實施例中，方法包括在培養基中在表現第一酶之條件下培養重組宿主細胞。第一酶可為例如UDP糖基轉移酶、環麥芽糊精葡聚糖轉移酶（cyclomaltodextrin glucanotransferases，CGTase）、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。
在一些實施例中，第一酶為CGTase。在一些實施例中，CGTase包括與SEQ ID NO: 1、3、78-101、148以及154中之任一者之序列具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，CGTase包括SEQ ID NO: 1、3、78-101、148以及154中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，CGTase由SEQ ID NO: 1、3、78-101、148以及154之胺基酸序列組成。
在一些實施例中，第一酶為聚葡萄糖蔗糖酶。舉例而言，聚葡萄糖蔗糖酶可以包括與SEQ ID NO: 2、103、106-110、156、159-162以及896中所闡述之序列中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，聚葡萄糖蔗糖酶由與SEQ ID NO: 104、105、157、158以及895中之任一者具有至少70%序列一致性的核酸序列編碼。
在一些實施例中，第一酶為轉葡萄糖苷酶。舉例而言，轉葡萄糖苷酶可以包括與SEQ ID NO: 163-291以及723中之任一者之序列具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，轉葡萄糖苷酶包括SEQ ID NO: 163-291及723中之任一者的胺基酸序列。
在一些實施例中，第一酶為β-葡萄糖苷酶。舉例而言，β-葡萄糖苷酶可以包括與SEQ ID NO: 102、292、354-374以及678-741中之任一者中所闡述之序列具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，方法包括使羅漢果苷IIA與能夠催化羅漢果苷IIA產生羅漢果苷IIIE之酶接觸。在一些實施例中，使羅漢果苷IIA與酶接觸包括使羅漢果苷IIA與用於產生羅漢果苷IIIE之重組宿主細胞接觸，且其中重組宿主細胞包括編碼能夠催化羅漢果苷IIA產生羅漢果苷IIIE之酶的基因。羅漢果苷IIA可例如提供至重組宿主細胞、由重組宿主細胞產生、存在於重組宿主細胞中、或其任何組合。能夠催化羅漢果苷IIA產生羅漢果苷IIIE之酶可為例如UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。
在一些實施例中，第二酶為尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶（uridine diphosphate-glucosyl transferase，UGT）。舉例而言，UGT可為UGT73C3（SEQ ID NO: 4）、UGT73C6（SEQ ID NO: 5）、UGT 85C2（SEQ ID NO: 6）、UGT73C5（SEQ ID NO: 7）、UGT73E1（SEQ ID NO: 8）、UGT98（SEQ ID NO: 9或407) 、UGT1576（SEQ ID NO:15）、UGT SK98（SEQ ID NO:16）、UGT430（SEQ ID NO:17）、UGT1697（SEQ ID NO:18）、UGT11789（SEQ ID NO:19）。在一些實施例中，UGT包括與SEQ ID NO: 4-9、15-19、125、126、128、129、293-307、407、409、411、413、439、441以及444中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，UGT由與UGT1495（SEQ ID NO:10）、UGT1817（SEQ ID NO: 11）、UGT5914（SEQ ID NO: 12）、UGT8468（SEQ ID NO:13）、UGT10391（SEQ ID NO:14）、SEQ ID NO: 116-124、127、130、408、410、412、414、440、442、443以及445中所闡述之序列中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼。
在一些實施例中，方法包括使羅漢果醇與一或多種能夠催化羅漢果醇產生羅漢果苷IIIE及/或IIE之酶接觸。在一些實施例中，使羅漢果醇與一或多種酶接觸包括使羅漢果醇與用於產生羅漢果苷IIIE及/或羅漢果苷IIE之重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼一或多種能夠催化羅漢果醇產生羅漢果苷IIIE及/或羅漢果苷IIE之酶的一或多個基因。羅漢果醇可例如提供至重組宿主細胞、由重組宿主細胞產生、存在於重組宿主細胞中、或其任何組合。
在一些實施例中，一或多種能夠催化羅漢果醇產生羅漢果苷IIE及/或羅漢果苷IIIE之酶中之至少一者包括與下述者中所闡述之序列中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列或由與下述者中之序列中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列編碼：SEQ ID NO: 315、316、420、422、424、426、430、431、446、871、845-949以及951-1012。在一些實施例中，一或多種能夠催化羅漢果醇產生羅漢果苷IIIE之酶包括UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。在一些實施例中，一或多種酶中之至少一者為尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶（UGT）。舉例而言，UGT可為UGT73C3、UGT73C6、85C2、UGT73C5、UGT73E1、UGT98、UGT1495、UGT1817、UGT5914、UGT8468、UGT10391、UGT1576、UGT SK98、UGT430、UGT1697或UGT11789，或包括與SEQ ID NO: 4-9、15-19、125、126、128、129、293-307、405、406、407、409、411、413、439、441以及444中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，方法包括使羅漢果苷化合物與一或多種能夠催化羅漢果苷化合物產生羅漢果苷IIIE之酶接觸以產生羅漢果苷IIIE，其中羅漢果苷化合物為羅漢果苷IA1、羅漢果苷IE1、羅漢果苷IIA1、羅漢果苷IIE、羅漢果苷IIA、羅漢果苷IIIA1、羅漢果苷IIIA2、羅漢果苷III、羅漢果苷IV、羅漢果苷IVA、羅漢果苷V以及賽門苷（siamenoside）中之一或多者。在一些實施例中，使羅漢果苷化合物與一或多種能夠催化羅漢果苷化合物產生羅漢果苷IIIE之酶接觸包括使羅漢果苷化合物與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼一或多種能夠催化羅漢果苷化合物產生羅漢果苷IIIE之酶的一或多個基因。羅漢果苷化合物可例如提供至重組宿主細胞、由重組宿主細胞產生、存在於重組宿主細胞中、及其任何組合。在一些實施例中，一或多種能夠催化羅漢果苷化合物產生羅漢果苷IIIE之酶包括UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。在一些實施例中，羅漢果苷化合物為羅漢果苷IIE。
在一些實施例中，一或多種能夠催化羅漢果苷化合物產生羅漢果苷IIIE之酶包括與SEQ ID NO: 1、3、78-101、106-109、147、154、163-303、405、411、354-405、447-723、770、776以及782中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，羅漢果苷化合物為羅漢果苷IIA或羅漢果苷IIE。在一些實施例中，與一或多種酶之接觸可產生羅漢果苷IIIA、羅漢果苷IVE以及羅漢果苷V中之一或多者。
在一些實施例中，一或多種酶包括與SEQ ID NO: 304、405、411、872、874、978、880、882、884、886、888、890、892、894以及896中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸。在一些實施例中，一或多種酶由與SEQ ID NO: 305、406、412、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893以及895中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列編碼。
在一些實施例中，方法包括使羅漢果苷IA1與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼UGT98或UGT SK98酶之基因。在一些實施例中，UGT98或UGT SK98酶包括與SEQ ID NO: 9、407、16或306具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，UGT98由SEQ ID NO: 307中所闡述之序列編碼。在一些實施例中，接觸引起在細胞中產生羅漢果苷IIA。
在一些實施例中，方法包括使11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼環氧化物水解酶之基因。在一些實施例中，11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇提供至重組宿主細胞、存在於重組宿主細胞中、由重組宿主細胞產生、及其任何組合。
在一些實施例中，方法包括使11-羥基葫蘆二烯醇與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼細胞色素P450或環氧化物水解酶之基因。11-羥基葫蘆二烯醇可提供至、產自於及/或存在於重組宿主細胞中。
在一些實施例中，方法包括使3,24,25-三羥基葫蘆二烯醇與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼細胞色素P450之基因。在一些實施例中，3,24,25-三羥基葫蘆二烯醇提供至重組宿主細胞、存在於重組宿主細胞中、由重組宿主細胞產生、或其任何組合。在一些實施例中，接觸引起在重組宿主細胞中產生羅漢果醇。在一些實施例中，細胞色素P450包括與SEQ ID NO: 20、49、308、315、430、872、874、876、878、880、882、884、886、888、889以及892中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列；或細胞色素P450由與SEQ ID NO: 31-48、316、431、871、873、875、877、879、881、883、885、887、890以及891中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼。
在一些實施例中，環氧化物水解酶包括與SEQ ID NO: 21-30及309-314中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列；或環氧化物水解酶由與SEQ ID No: 114及115中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼。
在一些實施例中，方法包括使葫蘆二烯醇與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼細胞色素P450之基因。在一些實施例中，接觸引起11-羥基葫蘆二烯醇之產生。在一些實施例中，葫蘆二烯醇提供至、產自於及/或存在於重組宿主細胞中。在一些實施例中，細胞色素P450由與SEQ ID NO: 31-48、316、431、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889以及892中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼。在一些實施例中，細胞色素P450包括與SEQ ID NO: 20、31、49、308、315、430、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890以及891具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，方法更包括使2,3-氧化角鯊烯、二氧化角鯊烯以及二環氧角鯊烯中之一或多者與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼具有葫蘆二烯醇合成酶活性之多肽的基因。
在一些實施例中，方法包括使羅漢果苷中間體與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼具有葫蘆二烯醇合成酶活性之多肽的基因。在一些實施例中，具有葫蘆二烯醇合成酶活性之多肽為包括一或多個與葫蘆二烯醇合成酶融合之融合域的融合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白包括與葫蘆二烯醇合成酶之N端、C端或兩者融合的融合域。在一些實施例中，融合域為約3個至約1000個胺基酸長。在一些實施例中，融合域為約5個至約50個胺基酸長。在一些實施例中，融合域為功能蛋白之實質性部分或完整序列。
在一些實施例中，具有葫蘆二烯醇合成酶活性之融合多肽包括與SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327-333、417、420、422、424、426、446、902、904或906具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶由與SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903以及905具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼。
在一些實施例中，接觸引起葫蘆二烯醇之產生。在一些實施例中，2,3-氧化角鯊烯及二環氧角鯊烯提供至、產自於及/或存在於重組宿主細胞中。在一些實施例中，2,3-氧化角鯊烯及二環氧角鯊烯中之一或多者由一種酶產生，所述酶包括與SEQ ID NO: 898或900具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列。在一些實施例中，2,3-氧化角鯊烯、二環氧角鯊烯以及二環氧角鯊烯中之一或多者的產生涉及由與SEQ ID NO: 897或899具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼的酶。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶包括與SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327、329-333、420、422、424、426、446、902、904以及906中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，包括葫蘆二烯醇合成酶活性之多肽由一種基因編碼，所述基因包括與SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903以及905中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列。
在一些實施例中，11-羥基葫蘆二烯醇提供至、產自於及/或存在於重組宿主細胞中。在一些實施例中，11-羥基葫蘆二烯醇在包括編碼CYP87D18及/或SgCPR蛋白質之基因的細胞（例如重組宿主細胞）中表現。在一些實施例中，CYP87D18或SgCPR蛋白質包括與SEQ ID NO: 872或874具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，CYP87D18或SgCPR蛋白質由與SEQ ID NO: 871或873具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼。
在一些實施例中，方法包括使角鯊烯與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼角鯊烯環氧酶之基因。在一些實施例中，接觸引起2,3-氧化角鯊烯之產生。在一些實施例中，角鯊烯提供至、產自於及/或存在於重組宿主細胞中。在一些實施例中，角鯊烯環氧酶包括與SEQ ID NO: 50-56、60、61、334或335中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，角鯊烯環氧酶由與SEQ ID NO: 335具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼。
在一些實施例中，方法包括使焦磷酸法呢酯（farnesyl pyrophosphate）與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼角鯊烯合成酶之基因。在一些實施例中，接觸引起角鯊烯之產生。在一些實施例中，焦磷酸法呢酯提供至、產自於及/或存在於重組宿主細胞中。在一些實施例中，角鯊烯合成酶包括與SEQ ID NO: 69及336中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，角鯊烯合成酶由一個序列編碼，所述序列包括與SEQ ID NO: 337具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列。
在一些實施例中，方法包括使香葉基-PP與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼法呢基-PP合成酶之基因。在一些實施例中，接觸引起法呢基-PP之產生。在一些實施例中，香葉基-PP提供至、產自於及/或存在於重組宿主細胞中。在一些實施例中，法呢基-PP合成酶包括與SEQ ID NO: 338具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，法呢基-PP合成酶由與SEQ ID NO: 339具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼。
在一些實施例中，編碼下述者之基因中之一或多者可操作地連接於異源啟動子：（1）能夠催化羅漢果苷IIIE產生化合物1之第一酶；（2）能夠催化羅漢果苷IIA產生羅漢果苷IIIE之酶；（3）環氧化物水解酶；（4）細胞色素P450；（5）具有葫蘆二烯醇合成酶活性之多肽；（6）角鯊烯環氧酶；（7）法呢基-PP合成酶。在一些實施例中，異源啟動子為CMV、EF1a、SV40、PGK1、人類β肌動蛋白、CAG、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、CaMV35S、Ubi、T7、T7lac、Sp6、araBAD、trp、lac、Ptac、pL啟動子或其組合。在一些實施例中，啟動子為可誘導型啟動子、可抑制型啟動子或持續性表現型啟動子。在一些實施例中，重組宿主細胞中之丙酮酸鹽、乙醯輔酶A、檸檬酸鹽以及TCA循環中間體中之一或多者的產生已被正調節。在一些實施例中，重組宿主細胞中之胞質定位已被正調節。在一些實施例中，第一基因、第二基因、第三基因、第四基因、第五基因、第六基因、第七基因、第八基因、第九基因以及第十基因中之一或多者包括至少一個編碼2A自裂解肽之序列。
在一些實施例中，重組宿主細胞為植物細胞、雙殼貝類細胞、魚細胞、真菌細胞、細菌細胞或哺乳動物細胞。在一些實施例中，植物由下述者所構成的族群中選出：羅漢果屬（Siraitia）、苦瓜屬（Momordica）、絞股藍屬（Gynostemma）、南瓜屬（Cucurbita）、甜瓜屬（Cucumis）、芥菜屬（Arabidopsis）、蒿屬（Artemisia）、甜菊屬（Stevia）、人參屬（Panax）、睡茄屬（Withania）、大戟屬（Euphorbia）、苜蓿屬（Medicago）、吊蘭屬（Chlorophytum）、五加屬（Eleutherococcus）、楤木屬（Aralia）、桑屬（Morus）、苜蓿屬、樺屬（Betula）、黃耆屬（Astragalus）、麻風樹屬（Jatropha）、山茶屬（Camellia）、柳蕈屬（Hypholoma）、麴菌屬（Aspergillus）、茄屬（Solanum）、石杉屬（Huperzia）、假繁縷屬（Pseudostellaria）、黃麻屬（Corchorus）、常春藤屬（Hedera）、地錢屬（Marchantia）以及桑屬。在一些實施例中，真菌由下述者所構成的族群中選出：髮癬菌屬（Trichophyton ）、桑黃屬（Sanghuangporus ）、台芝屬（Taiwanofungus ）、鏈疫孢屬（Moniliophthora ）、盤二孢屬（Marssonina ）、色二孢黴屬（Diplodia ）、香菇屬（Lentinula ）、法夫酵母屬（Xanthophyllomyces ）、普克尼亞屬（Pochonia ）、刺盤孢屬（Colletotrichum ）、間座殼屬（Diaporthe ）、組織胞漿菌屬（Histoplasma ）、球孢子菌屬（Coccidioides ）、組織胞漿菌屬、桑黃屬、短梗黴屬（Aureobasidium ）、普克尼亞屬、青黴菌屬（Penicillium ）、孢子絲菌屬（Sporothrix ）、黑殭菌屬（Metarhizium ）、麴菌屬、耶氏酵母屬（Yarrowia ）以及油脂酵母屬（Lipomyces ）。在一些實施例中，真菌為小巢狀麴菌（Aspergillus nidulans ）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica ）或圓紅冬孢酵母（Rhodosporin toruloides ）。在一些實施例中，重組宿主細胞為酵母細胞。在一些實施例中，酵母由下述者所構成的族群中選出：念珠菌屬（Candida）、酵母屬（Sacccharaomyces）、酵母亞門（Saccharomycotina）、外囊菌亞門（Taphrinomycotina）、裂殖酵母綱（Schizosaccharomycetes）、駒形氏酵母屬（Komagataella）、擔子菌門（Basidiomycota）、傘菌亞門（Agaricomycotina）、銀耳綱（Tremellomycetes）、柄鏽菌亞門（Pucciniomycotina）、短梗黴屬、錐毛殼屬（Coniochaeta）、紅冬孢酵母屬（ Rhodosporidium）以及微球黑粉菌綱（Microboryomycetes）。在一些實施例中，細菌由下述者所構成的族群中選出：弗蘭克氏菌屬（Frankia）、放線菌門（Actinobacteria）、鏈黴菌屬（Streptomyces）以及腸球菌屬（Enterococcus）。在一些實施例中，重組宿主細胞為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）細胞或解脂耶氏酵母細胞。在一些實施例中，第一基因、第二基因、第三基因、第四基因、第五基因、第六基因、第七基因、第八基因、第九基因以及第十基因中之一或多者為用於在細菌細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、真菌細胞及/或昆蟲細胞中表現的密碼子最佳化基因。在一些實施例中，第一基因、第二基因、第三基因、第四基因、第五基因、第六基因、第七基因、第八基因、第九基因以及第十基因中之一或多者包括功能突變以提高所編碼之酶的活性。在一些實施例中，培養重組宿主細胞包括針對培養條件之pH、溶解氧含量、氮含量或其組合來監測所述培養。
在一些實施例中，方法包括分離化合物1。在一些實施例中，分離化合物1包括溶解重組宿主細胞，及/或從培養基分離化合物1。在一些實施例中，方法包括純化化合物1。在一些實施例中，純化化合物1包括HPLC、固相萃取或其組合。在一些實施例中，純化包括收集重組宿主細胞；保留上清液；以及溶解重組宿主細胞。在一些實施例中，溶解包括使細胞受到剪切力或清潔劑洗滌，從而獲得溶解產物。剪切力可以例如來自音波處理方法、弗氏壓碎細胞（french pressurized cell）或珠粒。在一些實施例中，對溶解產物進行過濾及純化步驟。在一些實施例中，過濾溶解產物且藉由固相萃取來純化。
在一些實施例中，方法更包括在羅漢果苷IIIE與第一酶接觸之前使第一羅漢果苷與一或多種用於產生羅漢果苷IIIE之水解酶接觸。水解酶可為例如β-葡聚糖水解酶。在一些實施例中，水解酶為EXG1或EXG2。在一些實施例中，水解酶包括與SEQ ID NO. 292、366-368、372、376-398、447-520、524-845、1013、1014以及1023中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，第一羅漢果苷為羅漢果苷IV、羅漢果苷V、羅漢果苷VI或其組合。在一些實施例中，第一羅漢果苷為羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA或其組合。
在一些實施例中，使第一羅漢果苷與一或多種水解酶接觸包括使第一羅漢果苷與包括編碼水解酶之基因的宿主細胞接觸。在一些實施例中，第一羅漢果苷接觸宿主細胞中之一或多種水解酶，所述宿主細胞包括編碼水解酶之基因及編碼能夠催化化合物1之產生的酶的基因。宿主細胞可為重組宿主細胞，其包括編碼能夠催化羅漢果苷IIIE產生化合物1之第一酶的第一基因。在一些實施例中，宿主細胞不是包括第一基因之重組宿主細胞，所述第一基因編碼能夠催化羅漢果苷IIIE產生化合物1之第一酶。在一些實施例中，第一羅漢果苷提供至、產自於及/或存在於宿主細胞中。編碼水解酶之基因可與宿主細胞異源或同源。在一些實施例中，編碼水解酶之基因以正常水準在宿主細胞中表現。在一些實施例中，編碼水解酶之基因在宿主細胞中過度表現。
在一些實施例中，重組宿主細胞包括諸如環阿屯醇（cycloartenol）合成酶或β-芸香素合成酶之氧化角鯊烯環化酶或編碼諸如環阿屯醇合成酶或β-芸香素合成酶之氧化角鯊烯環化酶的核酸序列，且其中氧化角鯊烯環化酶、環阿屯醇合成酶或β-芸香素合成酶經修飾以產生葫蘆二烯醇或環氧葫蘆二烯醇。氧化角鯊烯環化酶可以例如包括或組成為與SEQ ID NO: 341, 343以及346-347中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列。
在一些實施例中，重組宿主細胞包括細胞色素P450還原酶或編碼細胞色素P450還原酶之基因。在一些實施例中，細胞色素P450還原酶包括或組成為與SEQ ID NO: 318具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列。
本文中所揭露的內容包含具有化合物1之結構的化合物：（1），其中化合物由本文中所揭露之方法中之任一者產生。
本文中所揭露的內容包含一種細胞溶解產物，其包括具有以下結構之化合物1：（1）。
本文中所揭露的內容亦包含一種重組細胞，其包括：具有以下結構之化合物1：（1），及編碼能夠催化羅漢果苷IIIE產生化合物1之酶的基因。在一些實施例中，基因為重組細胞之異源基因。
本文中所揭露的內容包含一種包括第一基因之重組細胞，所述第一基因編碼能夠催化羅漢果苷IIIE產生具有以下結構之化合物1的第一酶：（1）。第一酶可為例如UDP糖基轉移酶、環麥芽糊精葡聚糖轉移酶（CGTase）、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。在一些實施例中，第一酶為CGTase。舉例而言，CGTase可以包括與SEQ ID NO: 1、3、78-101、148以及154中之任一者之序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，CGTase包括或組成為SEQ ID NO: 1、3、78-101、148以及154中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，第一酶為聚葡萄糖蔗糖酶。舉例而言，聚葡萄糖蔗糖酶可以包括與SEQ ID NO: 2、103、106-110、156以及896中所闡述之序列中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，聚葡萄糖蔗糖酶由與SEQ ID NO: 104、105、157、158以及895中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼。在一些實施例中，第一酶為轉葡萄糖苷酶。轉葡萄糖苷酶可以例如包括與SEQ ID NO: 163-291及723中之任一者之序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，轉葡萄糖苷酶包括或組成為SEQ ID NO: 3、95-102以及163-291以及723中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，第一酶為β-葡萄糖苷酶。在一些實施例中，β-葡萄糖苷酶包括與SEQ ID NO: 102、292、354-376以及678-741中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，細胞更包括編碼尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶（UGT）之第二基因。在一些實施例中，UGT包括與SEQ ID NO: 4-9、15-19、125、126、128、129、293-307、407、409、411、413、439、441以及444中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，UGT由與SEQ ID NO: 116-124、127、130、408、410、412、414、440、442、443以及445中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼。在一些實施例中，UGT由UGT1495（SEQ ID NO: 10）、UGT1817（SEQ ID NO: 11）、UGT5914（SEQ ID NO: 12）、UGT8468（SEQ ID NO: 13）或UGT10391（SEQ ID NO: 14）中所闡述之序列編碼。在一些實施例中，細胞更包括編碼UGT98或UGT SK98之第三基因。在一些實施例中，UGT98或UGT SK98包括與SEQ ID NO: 9、407、16或306具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，UGT98由SEQ ID NO: 307中所闡述之核酸序列編碼。
在一些實施例中，細胞包括編碼環氧化物水解酶之第四基因。在一些實施例中，環氧化物水解酶包括與SEQ ID NO: 21-30及309-314中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列；或由與SEQ ID NO: 114及115中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼。
在一些實施例中，細胞包括編碼P450之第五序列。在一些實施例中，P450包括與SEQ ID NO: 20、49、308、315、430、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890以及891中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列；或由與SEQ ID NO: 31-48、316、431、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889以及892中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼。在一些實施例中，P450由一種基因編碼，所述基因包括或組成為SEQ ID NO: 31-48、316以及318中之任一者中所闡述之序列。
在一些實施例中，細胞包括編碼具有葫蘆二烯醇合成酶活性之多肽的第六序列。在一些實施例中，具有葫蘆二烯醇合成酶活性之多肽為融合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白包括一或多個與葫蘆二烯醇合成酶之N端、C端或兩者融合的融合域。融合域之長度可例如在約3個至約1000個胺基酸長或約5個至約50個胺基酸長之間變化。在一些實施例中，融合域為功能蛋白之實質性部分或完整序列。在一些實施例中，具有葫蘆二烯醇合成酶活性之多肽包括與下述者中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列：SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327-333、417、420、422、424、426、446、902、904、906、906、851、854、856、1024、859、862、865、867、915、920、924、928、932、936、940、944、948、952、956、959、964、967、971、975、979、983、987、991、995、999、1003、1007以及1011。在一些實施例中，具有葫蘆二烯醇合成酶活性之多肽由與SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903以及905中之任一者具有至少70%序列一致性的核酸序列編碼。
在一些實施例中，細胞更包括編碼角鯊烯環氧酶之第七基因。在一些實施例中，角鯊烯環氧酶包括與SEQ ID NO: 50-56、60、61、334以及335中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，角鯊烯環氧酶由與SEQ ID NO: 335具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼。
在一些實施例中，細胞包括編碼角鯊烯合成酶之第八基因。在一些實施例中，角鯊烯合成酶包括與SEQ ID NO: 69或336具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，角鯊烯合成酶由包括或組成為SEQ ID NO: 337中所闡述之核酸序列的序列編碼。
在一些實施例中，細胞更包括編碼法呢基-PP合成酶之第九基因。在一些實施例中，法呢基-PP合成酶包括與SEQ ID NO: 338具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，法呢基-PP合成酶由與SEQ ID NO: 339具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼。
在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞或昆蟲細胞。舉例而言，細胞可為酵母細胞。在一些實施例中，酵母由念珠菌屬、酵母屬、酵母亞門、外囊菌亞門、裂殖酵母綱、駒形氏酵母屬、擔子菌門、傘菌亞門、銀耳綱、柄鏽菌亞門、短梗黴屬、錐毛殼屬以及微球黑粉菌綱中選出。在一些實施例中，植物由下述者所構成的族群中選出：羅漢果屬、苦瓜屬、絞股藍屬、南瓜屬、甜瓜屬、芥菜屬、蒿屬、甜菊屬、人參屬、睡茄屬、大戟屬、苜蓿屬、吊蘭屬、五加屬、楤木屬、桑屬、苜蓿屬、樺屬、黃耆屬、麻風樹屬、山茶屬、柳蕈屬、麴菌屬、茄屬、石杉屬、假繁縷屬、黃麻屬、常春藤屬、地錢屬以及桑屬。在一些實施例中，真菌由下述者選出：髮癬菌屬、桑黃屬、台芝屬、鏈疫孢屬、盤二孢屬、色二孢黴屬、香菇屬、法夫酵母屬、普克尼亞屬、刺盤孢屬、間座殼屬、組織胞漿菌屬、球孢子菌屬、組織胞漿菌屬、桑黃屬、短梗黴屬、普克尼亞屬、青黴菌屬、孢子絲菌屬以及黑殭菌屬。
在一些實施例中，細胞包括編碼至少一種能夠水解羅漢果苷V之水解酶的基因。在一些實施例中，化合物1展示對重組細胞中之水解酶的耐受性，其中水解酶展示將羅漢果苷VI、羅漢果苷V、羅漢果苷IV水解為羅漢果苷IIIE之能力。
在一些實施例中，重組細胞包括諸如環阿屯醇合成酶或β-芸香素合成酶之氧化角鯊烯環化酶或編碼諸如環阿屯醇合成酶或β-芸香素合成酶之氧化角鯊烯環化酶的核酸序列，且其中氧化角鯊烯環化酶、環阿屯醇合成酶或β-芸香素合成酶經修飾以產生葫蘆二烯醇或環氧葫蘆二烯醇。
在一些實施例中，氧化角鯊烯環化酶包括與SEQ ID NO: 341、343以及346-347中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，細胞包括細胞色素P450還原酶或編碼細胞色素P450還原酶之基因。在一些實施例中，細胞色素P450還原酶再生細胞色素P450活性。在一些實施例中，細胞色素P450還原酶包括與SEQ ID NO: 318具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列。
在一些實施例中，細胞包括SEQ ID NO: 897、899、909、911、913、418、421、423、425、427、871、873、901、903以及905中之任一者中所闡述之序列。在一些實施例中，細胞包括一種酶，所述酶包括下述者中之任一個序列中所闡述之序列或由下述者中之任一個序列編碼：SEQ ID NO: 315、316、420、422、424、426、430、431、446、871、845-949以及951-1012。
在一些實施例中，細胞包括編碼能夠水解第一羅漢果苷以產生羅漢果苷IIIE之水解酶的基因。在一些實施例中，水解酶為β-葡聚糖水解酶。在一些實施例中，水解酶為EXG1或EXG2。在一些實施例中，水解酶包括與SEQ ID NO. 292、366-368、372、376-398、447-520、524-845、1013、1014以及1023中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，第一羅漢果苷為羅漢果苷IV、羅漢果苷V、羅漢果苷VI或其組合。在一些實施例中，第一羅漢果苷為羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA或其組合。
編碼水解酶之基因可與重組宿主細胞異源或同源。編碼水解酶之基因在重組宿主細胞中可以正常水準表現或過度表現。在一些實施例中，細胞為酵母細胞。在一些實施例中，細胞為釀酒酵母或解脂耶氏酵母。
本文中所揭露的內容亦包含一種製造具有以下結構之化合物1的方法：（1）。在一些實施例中，方法包括：使第一羅漢果苷與一或多種用於產生羅漢果苷IIIE之水解酶接觸；及使羅漢果苷IIIE與能夠催化羅漢果苷IIIE產生化合物1之酶接觸。
在一些實施例中，水解酶為β-葡聚糖水解酶。在一些實施例中，水解酶為EXG1，例如包括與SEQ ID NO: 1012或1014具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列的EXG1。在一些實施例中，水解酶為EXG2，例如包括與SEQ ID NO: 1023具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列的EXG2。
在一些實施例中，第一羅漢果苷為羅漢果苷IV、羅漢果苷V、羅漢果苷VI或其組合。在一些實施例中，第一羅漢果苷為羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA或其組合。
在一些實施例中，使第一羅漢果苷與一或多種水解酶接觸包括使第一羅漢果苷與重組宿主細胞接觸，所述重組宿主細胞包括編碼水解酶之第一基因及編碼能夠催化化合物1之產生的酶的第二基因。在一些實施例中，第一羅漢果苷接觸重組宿主細胞中之一或多種水解酶，所述重組宿主細胞包括編碼水解酶之第一基因及編碼能夠催化化合物1之產生的酶的第二基因。在一些實施例中，第一羅漢果苷由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，第一基因為重組宿主細胞之天然基因。在一些實施例中，第一基因以正常水準表現。在一些實施例中，第一基因與重組宿主細胞異源。在一些實施例中，第一基因過度表現。在一些實施例中，第二基因與重組宿主細胞異源。在一些實施例中，能夠催化化合物1之產生的酶為UDP糖基轉移酶、環麥芽糊精葡聚糖轉移酶（CGTase）、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。
本文中所揭露的內容包含一種重組細胞，包括：編碼能夠水解第一羅漢果苷以產生羅漢果苷IIIE之水解酶的第一基因；及編碼能夠催化羅漢果苷IIIE產生化合物1之酶的第二基因，其中化合物1具有以下結構：（1）。
在一些實施例中，水解酶為β-葡聚糖水解酶。舉例而言，水解酶可為EXG1或EXG2。在一些實施例中，EXG2蛋白質包括與SEQ ID NO: 1023具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，第一羅漢果苷為羅漢果苷IV、羅漢果苷V、羅漢果苷VI或其組合。在一些實施例中，第一羅漢果苷為羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA或其組合。第一基因可與重組宿主細胞異源或同源。第一基因在宿主細胞中可過度表現或以正常水準表現。細胞可為例如酵母細胞。在一些實施例中，細胞為釀酒酵母或解脂耶氏酵母。
本文中所揭露的內容亦包含一種具有葫蘆二烯醇合成酶活性之融合多肽，其中融合多肽包括與葫蘆二烯醇合成酶融合之融合域。融合域可以與葫蘆二烯醇合成酶之N端、C端或兩者融合。融合域可為例如約3個至約1000個胺基酸長或約5個至約50個胺基酸長。在一些實施例中，融合域包括功能蛋白之實質性部分或完整序列。在一些實施例中，融合域為功能蛋白之實質性部分或完整序列。在一些實施例中，融合域包括酵母蛋白之一部分或完整序列。在一些實施例中，融合域為酵母蛋白之一部分或完整序列。在一些實施例中，融合多肽包括與SEQ ID NO: 851、854、856、1024、859、862、865、867、915、920、924、928、932、936、940、944、948、952、956、959、964、967、971、975、979、983、987、991、995、999、1003、1007以及1011中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合多肽包括或組成為SEQ ID NO: 851、854、856、1024、859、862、865、867、915、920、924、928、932、936、940、944、948、952、956、959、964、967、971、975、979、983、987、991、995、999、1003、1007以及1011中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，融合多肽之融合域包括與SEQ ID NO: 866、870、917、921、925、929、933、937、941、945、949、953、957、961、968、972、976、980、984、988、992、996、1000、1004、1008以及1012中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合多肽之融合域包括或組成為SEQ ID NO: 866、870、917、921、925、929、933、937、941、945、949、953、957、961、968、972、976、980、984、988、992、996、1000、1004、1008以及1012中之任一者中所闡述之序列。
在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶包括與SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327、329-333、420、422、424、426、446、902、904以及906中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶包括或組成為SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327、329-333、420、422、424、426、446、902、904以及906中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶由一種基因編碼，所述基因包括與SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903以及905中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶由一種基因編碼，所述基因包括或組成為SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903以及905中之任一者中所闡述之核酸序列。
本文中所揭露的內容包含一種重組核酸分子，其包括編碼本文中所揭露的且具有葫蘆二烯醇合成酶活性之融合多肽中之任一者的核酸序列。本文中所揭露的內容包含一種重組細胞，其包括本文中所揭露的且具有葫蘆二烯醇合成酶活性之融合多肽中之任一者及/或任何本文中所揭露的編碼具有葫蘆二烯醇合成酶活性之融合多肽的重組核酸分子。本文中所揭露的內容亦包含一種使用本文中所揭露的且具有葫蘆二烯醇合成酶活性之融合多肽中之任一者的方法。方法可以包括使葫蘆二烯醇合成酶之受質與具有葫蘆二烯醇合成酶活性之融合多肽接觸。在一些實施例中，接觸引起葫蘆二烯醇、24,25-環氧葫蘆二烯醇或其組合之產生。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶之受質包括2,3-氧化角鯊烯、二氧化角鯊烯以及二環氧角鯊烯中之一或多者。在一些實施例中，接觸包括使受質與包括編碼融合多肽之核酸序列的重組宿主細胞接觸。重組宿主細胞可以例如表現融合多肽。在一些實施例中，受質提供至、存在於及/或產自於重組宿主細胞。
定義
除非另外規定，否則本文所用之全部技術及科學術語具有與本發明所屬領域的一般技術者通常所理解相同之含義。所有專利、申請案、公開之申請案及其他出版物以全文引用之方式併入。除非另外說明，否則在本文中關於一個術語存在多個定義之情況下，以此部分中之定義為準。
「溶合物」是指由溶劑與本文所描述之化合物或其鹽之相互作用形成的化合物。適合溶合物為生理學上可接受之溶合物，包括水合物。
如本文所用之「甜味劑」、「甜味調味劑」、「甜味實體」、「甜的化合物」或「甜味化合物」是指在個體中引起可偵測之甜味的化合物或生理學上可接受之鹽。
如本文所用之術語「可操作地連接」用於描述調節元件與基因或其編碼區之間的連接。通常，基因表現處於一或多個調節元件之控制下，例如不限於持續性表現或可誘導型啟動子、組織特異性調節元件以及強化子。基因或編碼區稱為「可操作地連接於（operably linked to/operatively linked to）」調節元件或與調節元件「可操作地相關」，意指基因或編碼區受調節元件的控制或影響。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接於編碼序列。
術語「調節元件」及「表現控制元件」可互換使用且是指可影響特定宿主生物體中可操作地連接之編碼序列之表現的核酸分子。這些術語廣泛地使用且涵蓋所有促進或調節轉錄之元件，包含啟動子、強化子序列、反應元件、蛋白質識別位點、可誘導型元件、蛋白質結合序列、5'及3'非轉譯區（untranslated region，UTR）、轉錄起始位點、終止序列、多腺苷酸化序列、內含子、RNA聚合酶與轉錄因子之基本相互作用所需要的核心元件、上游元件、強化子、反應元件（參見例如盧因（Lewin）「基因V（Genes V）」 (牛津的牛津大學出版社（Oxford University Press, Oxford）) 第847-873頁）以及其任何組合。原核生物中之例示性調節元件包含啟動子、操縱子序列以及核糖體結合位點。用於真核細胞中之調節元件可包含但不限於轉錄及轉譯控制序列，諸如啟動子、強化子、剪接信號、多腺苷酸化信號、終止子、蛋白質降解信號、內部核糖體進入元件（internal ribosome-entry element，IRES）、2A序列及其類似物，其提供及/或調節宿主細胞中編碼序列之表現及/或所編碼多肽之產生。在本文中之一些實施例中，本文所述之重組細胞包括可操作地連接於調節元件之基因。
如本文所用之2A序列或元件是指作為兩個蛋白質之間的連接子引入以實現多蛋白之自主核糖體內自加工的小肽（參見例如德菲利佩（de Felipe）. 基因疫苗與療法（Genetic Vaccines and Ther.） 2:13 (2004)；德菲利佩等人. 運輸（Traffic） 5:616-626 (2004)）。這些短肽使得多個蛋白質能夠自單個載體共表現。此項技術中已知許多2A元件。可用於本文中所揭露之方法及系統中之2A序列的實例包含但不限於如美國專利公開案第20070116690號中所述的來自口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F2A）、馬鼻炎A型病毒（equine rhinitis A virus，E2A）、明脈扁刺蛾β四體病毒（Thosea asigna virus，T2A）以及豬鐵士古病毒-1（porcine teschovirus-1，P2A）之2A序列。
如本文所用之術語「啟動子」為允許RNA聚合酶結合且引導基因轉錄之核苷酸序列。通常，啟動子位於基因之5'非編碼區中，鄰近基因之轉錄起始位點。用於起始轉錄之啟動子內的序列元件之特徵常常在於共同核苷酸序列。啟動子之實例包含但不限於來自細菌、酵母、植物、病毒以及哺乳動物(包括人類)之啟動子。啟動子可為誘導型、可抑制型及/或持續性表現型。可誘導型啟動子響應於培養條件之一些改變，諸如溫度之改變，起始在其控制下的水準增加的DNA轉錄。
如本文所用之術語「強化子」是指無論強化子相對於轉錄起始位點之距離或取向如何，均能提高轉錄效率的一種類型的調節元件。
如本文所用之術語「轉殖基因」是指任何藉由人為干預整合於靶細胞之一或多個染色體中之核苷酸或DNA序列。在一些實施例中，轉殖基因包括編碼相關蛋白質之多核苷酸。編碼蛋白質之多核苷酸一般可操作地連接於適用於獲得相關基因之所期望的表現的其他序列，諸如轉錄調節序列。在一些實施例中，轉殖基因可以另外包括用於標記其所併入處之染色體的核酸或其他分子。
關於多核苷酸或多肽序列之「序列一致性百分比（%）」在本文中用作在比對兩個序列之後，候選序列中與另一序列中之鹼基或胺基酸殘基相同的鹼基或胺基酸殘基之百分比。必要時，為了獲得最大的序列一致性百分比，可以在序列比對中引入空位（gap）。保守取代不視為序列一致性之部分。出於測定序列一致性百分比（%）之目的的比對可以所屬領域之技術範圍內的各種方式達成，例如使用公開可用的電腦方法及程式，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、FASTA（可以遺傳計算組（Genetics Computing Group，GCG）套裝軟體自美國威斯康星州的麥迪遜（Madison, Wisconsin, USA）獲得）或Megalign（DNASTAR）。所屬領域中具通常知識者可確定用於量測比對之適當參數，包含用於在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需的任何演算法。
舉例而言，胺基酸序列一致性百分比（%）值可以藉由使用例如奧特查爾（Altschul）等人, 酶學方法（Methods in Enzymology）, 1996, 266:460-480中所述之WU-BLAST-2電腦程式獲得。WU-BLAST-2電腦程式中之許多搜尋參數可由所屬領域中具通常知識者調整。舉例而言，可調整的參數中之一些可以設定為以下值：重疊跨度（overlap span） = 1，重疊分數（overlap fraction） = 0.125，字臨限值（word threshold，T） = 11，以及計分矩陣（scoring matrix） = BLOSUM62。當使用WU-BLAST-2時，胺基酸序列一致性%值藉由（a）如藉由WU-BLAST-2確定之第一相關蛋白質之胺基酸序列與第二相關蛋白質之胺基酸序列之間匹配的相同胺基酸殘基之數目除以（b）第一相關蛋白質之胺基酸殘基之總數來確定。
胺基酸序列一致性百分比亦可使用例如奧特查爾等人, 核酸研究（Nucleic Acids Res.）, 1997, 25:3389-3402中所述之序列比較程式NCBI-BLAST2確定。NCBI-BLAST2序列比較程式可以自http://www.ncbi.nlm.nih.gov下載或另外自馬里蘭州貝塞斯達之美國國立衛生研究院（National Institute of Health, Bethesda, MD）獲得。NCBI-BLAST2使用若干可調整的搜尋參數。那些可調整的搜尋參數中之一些的既定值（default value）為例如未掩蓋（unmask）=是，鏈（strand）=所有，預期出現次數（expected occurrences）= 10，最小低複雜性長度（minimum low complexity length） = 15/5，多遍e值（multi-pass e-value） = 0.01，多遍常數（constant for multi-pass） = 25，最終空位化比對的下降值（drop-off for final gapped alignment） = 25，以及計分矩陣 = BLOSUM62。
在使用NCBI-BLAST2進行胺基酸序列比較之情形下，指定胺基酸序列A相對於、與或針對指定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%（或者可表述為，相對於、與或針對指定胺基酸序列B具有或包括一定胺基酸序列一致性%的指定胺基酸序列A）如下計算： 100 × 分數X/Y 其中X為在A與B之程式比對中藉由序列比對程式NCBI-BLAST2評為相同匹配的胺基酸殘基之數目，且其中Y為B中之胺基酸殘基之總數。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等之情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%與B相對於A之胺基酸序列一致性%將不相等。
如本文所用之「分離」意謂指定化合物已與其天然環境分離，使得在天然狀態下與化合物一起存在的一或多種其他化合物或生物製劑不再存在。
如本文所用之「純化」意謂指定化合物以相對於通常與指定化合物一起發現的其他化合物（例如，在其天然環境中）而言較高的量存在。在一些實施例中，經純化之化合物之相對量增加超過1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、80%、90%、100%、120%、150%、200%、300%、400%或1000%。在一些實施例中，經純化之化合物以相對於與所述化合物組合之其他化合物超過1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或99.5%之重量百分比水準存在。在一些實施例中，由本文中之實施例產生之化合物1在產生之後以相對於與所述化合物組合之其他化合物超過1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或99.5%之重量百分比水準存在。
如本文所述之「純化」可以指用於自細胞溶解產物及/或上清液萃取化合物1之方法，其中細胞分泌化合物1之產物。如本文所述之「溶解產物」包括在破壞細胞壁及細胞膜後之細胞之細胞內含物且可包含例如蛋白質、糖以及羅漢果苷。純化可包括用於移除蛋白質之硫酸銨沈澱、用於移除蛋白質之鹽析、疏水性分離（HPLC）以及使用親和管柱。鑒於由本文中之方法產生之產物，涵蓋親和介質以用吸附樹脂移除特定羅漢果苷。
如本文所述之「HPLC」為可用於分離溶解於溶液中之化合物的一種形式之液相層析。HPLC儀器可以包括但不限於移動相之儲集器、泵、注射器、分離管柱以及偵測器。化合物於是可藉由將樣品混合物注入至管柱上來分離。混合物中之不同組分因為其在移動液相與固定相之間的分配特性的差異，所以可以不同速率通過管柱。存在若干可使用的管柱。管柱可為但不限於正相管柱、逆相管柱、尺寸排阻類型之管柱以及離子交換管柱。
亦涵蓋固相萃取及分餾之使用，其適用於使蛋白質及糖樣品脫鹽。其他方法可以包含使用HPLC、用於分析樣品之液相層析以及液-液萃取，描述於奧雷婭·安德雷德-埃里奧（Auréa Andrade-Eiroa）等人（分析化學趨勢（TrAC Trends in Analytical Chemistry） 第80卷, 2016年6月, 第641-654頁；以全文引用的方式併入本文中）中。
如本文所述之用於純化之「固相萃取」（Solid phase extraction，SPE）是指將溶解或懸浮於液體混合物中之化合物與混合物中之其他化合物根據其物理及化學特性分離的樣品製備方法。舉例而言，分析實驗室可以使用固相萃取來濃縮及純化樣品用於分析。固相萃取亦可用於自各種基質分離相關分析物，所述基質包含例如尿液、血液、水、飲料、土壤以及動物組織。在本文中之實施例中，在細胞溶解產物中或在細胞培養基中之化合物1可藉由固相萃取來純化。
SPE使用溶解或懸浮於液體（稱為移動相）中之溶質對樣品所通過之固體（稱為固定相）的親和力將混合物分離成所需要的組分及不需要的組分。SPE亦可直接用於且適用於氣-固相及液-固相，或藉由使用例如熱脫附與後續層析分析而間接用於固體樣品。此可造成樣品中之所需要的相關分析物或不需要的雜質被保留在固定相上。通過固定相之部分可視其是含有所需要的分析物還是不需要的雜質而定，收集或丟棄。若保留在固定相上之部分包含所需要的分析物，則其隨後可自固定相移除以在額外步驟中進行收集，其中用適當的溶離劑沖洗固定相。
可以進行固相萃取的方式不受限制。程序可以包含但不限於：正相SPE程序、逆相SPE、離子交換SPE、陰離子交換SPE、陽離子交換以及固相微萃取。固相萃取描述於賽義德（Sajid）等人及普洛替卡·維斯卡（Płotka-Wasylka）等人（分析化學學報（Anal Chim Acta.） 2017年5月1日;965:36-53, 分析化學評論（Crit Rev Anal Chem.） 2017年4月11日:1-11；以全文引用的方式併入本文中）中。
在一些實施例中，由細胞產生之化合物1藉由固相萃取來純化。在一些實施例中，例如藉由固相萃取純化之化合物1之純度為70%、80%、90%或100%純或由任何前述值限定之任何純度水準。
如本文所述之「醱酵」廣泛地指宿主細胞在宿主介質中塊狀生長，產生特定產物。在本文中之實施例中，最終產物產生化合物1。此亦可包含在存在或不存在空氣之情況下進行的方法且可在例如厭氧環境中進行。全細胞（重組宿主細胞）可在醱酵液（fermentation broth）中或在反應緩衝液中。
化合物1及用於製造化合物1之中間體羅漢果苷化合物可以藉由自重組細胞溶解產物或自上清液收集中間體羅漢果苷化合物及化合物1來分離。溶解產物可以在收集細胞且藉由剪切力（弗氏壓碎細胞（French press cell）或音波處理）或藉由清潔劑處理使細胞發生溶解之後獲得。溶解產物隨後可過濾且用硫酸銨處理以移除蛋白質，且在C18 HPLC（5×10公分 Atlantis製備型T3 OBD管柱，5微米，沃特世（Waters））上分級且在30分鐘內使用10% → 30% B之A/B梯度（A = 水 B = 乙腈）注射，以95% B洗滌，接著在1%下再平衡（總操作時間=42分鐘）。各輪以30毫升/部分收集在已稱皮重的管中（12部分/板，3板/輪）。亦可使溶解產物離心以移除固體及微粒物質。
板隨後可在Genevac HT12/HT24中乾燥。所要化合物預期與其他異構體一起溶離於部分21中。經合併之部分可以在氟苯基HPLC管柱（3×10公分，Xselect氟苯基OBD管柱，5微米，沃特世）上進一步分級47輪，在35分鐘內使用15% → 30% B之A/B梯度（A = 水，B = 乙腈），以95% B洗滌，接著在15%下再平衡（總操作時間=45分鐘）。各輪以30毫升/部分收集於12根已稱皮重的管中（12部分/板，1板/輪）。可以基於UPLC分析合併含有所要的具有所要純度之峰的部分且在減壓下乾燥以得到發白的粉末狀固體。可將純化合物再懸浮/溶解於10毫升水中且凍乾以獲得至少95%純度。
如本文所用之「糖苷鍵（glycosidic bond）」是指將兩個呋喃糖及/或哌喃醣基連接在一起的共價鍵。一般而言，糖苷鍵為一個呋喃糖或哌喃醣部分之變旋異構碳（anomeric carbon）與另一個呋喃糖或哌喃醣部分之氧之間的鍵。糖苷鍵使用所連碳原子之編號及α/β取向來命名。α-糖苷鍵及β-糖苷鍵根據變旋異構位置之相對立體化學及環中距離C1最遠之立構中心（stereocenter）來區分。舉例而言，蔗糖為由經由α1-2糖苷鍵連接之一個葡萄糖分子及一個果糖分子構成的雙醣，如下文所示。
β1-4糖苷鍵之實例可見於纖維素中：。
除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所用，單數形式「一（a/an）」及「所述（the）」包括複數個指示物。因此，舉例而言，提及「芳族化合物」時包含芳族化合物之混合物。
通常，本文中範圍以自「約」一個特定值及/或至「約」另一特定值表述。當表述此類範圍時，另一實施例包含自一個特定值及/或至另一特定值。類似地，當藉由在前面使用「約」來以近似值表示值時，應理解特定值形成另一實施例。另外應理解，範圍中之每一者的端點在相對於其他端點及獨立於其他端點時均為有效的。
如本文所述之「密碼子最佳化」是指將密碼子改為已知能提高最大蛋白質表現效率之密碼子的設計方法。在一些替代方案中，描述針對細胞中之表現的密碼子最佳化，其中密碼子最佳化可以藉由使用所屬領域中具通常知識者已知的演算法進行，從而產生針對人類中之高mRNA及蛋白質產率最佳化的合成基因轉錄物。可以針對例如細菌細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或植物細胞中之蛋白質表現使密碼子最佳化。含有使人類中之密碼子最佳化的演算法的程式容易獲得。此類程式可以包含例如OptimumGeneTM 或GeneGPS®演算法。另外，經密碼子最佳化之序列可以在商業上獲得，例如購自集成DNA技術公司（Integrated DNA Technologies）。在本文中之一些實施例中，用於產生化合物1之重組細胞包括編碼用於合成之酶的基因，其中所述基因針對表現進行密碼子最佳化。在一些實施例中，基因針對在細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞或昆蟲細胞中之表現進行密碼子最佳化。
如本文所用之術語「核酸」、「核酸分子」以及「多核苷酸」為可互換的且是指任何核酸，無論是由磷酸二酯鍵還是經修飾之鍵構成，諸如磷酸三酯、胺基磷酸酯（phosphoramidate）、矽氧烷、碳酸酯、羧基甲酯、乙醯亞胺酯（acetamidate）、胺基甲酸酯、硫醚、橋連胺基磷酸酯、橋連亞甲基膦酸酯（bridged methylene phosphonate）、橋連胺基磷酸酯、橋連胺基磷酸酯、橋連亞甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、膦酸甲酯（methylphosphonate）、二硫代磷酸酯（phosphorodithioate）、橋連硫代磷酸酯或磺內酯（sultone）鍵以及此類鍵之組合。術語「核酸」及「多核苷酸」亦特別包含由除五種生物學上存在之鹼基（腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶以及尿嘧啶）外的鹼基構成的核酸。
多核苷酸之非限制性實例包含去氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）或核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）、寡核苷酸、由聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）產生之片段以及由連接、切斷、核酸內切酶作用及核酸外切酶作用中之任一者產生之片段。核酸分子可由單體構成，所述單體為天然存在之核苷酸（諸如DNA及RNA），或天然存在之核苷酸之類似物（例如，天然存在之核苷酸之對映異構形式），或兩者之組合。經修飾之核苷酸可在糖部分中及/或嘧啶或嘌呤鹼基部分中發生改變。糖修飾包含例如用鹵素、烷基、胺及疊氮基置換一或多個羥基，或糖可官能化為醚或酯。此外，整個糖部分可用在空間上及電子上類似之結構，諸如氮雜-糖及碳環糖類似物置換。鹼基部分中修飾之實例包含烷基化之嘌呤及嘧啶、醯基化之嘌呤或嘧啶，或其他熟知之雜環取代。核酸單體可藉由磷酸二酯鍵或此類鍵聯之類似物連接。磷酸二酯鍵之類似物包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、胺基磷酸酯及其類似物。術語「核酸分子」亦包含所謂的「肽核酸」，其包含連接至聚醯胺主鏈之天然存在之或經修飾之核酸鹼基。核酸可為單股或雙股的。在一些替代方案中，提供一種編碼融合蛋白之核酸序列。在一些替代方案中，核酸為RNA或DNA。在一些實施例中，核酸包括SEQ ID NO: 1-1023中之任一者。
本文中使用「編碼（Coding for）」或「編碼（encoding）」，且其是指諸如基因、cDNA或mRNA之多核苷酸中之特定核苷酸序列充當諸如規定的胺基酸序列之其他大分子之合成模板的特性。因此，若對應於某個基因之mRNA在細胞或其他生物系統中之轉錄及轉譯產生蛋白質，則所述基因編碼所述蛋白質。在本文中之一些實施例中，提供一種重組細胞，其中重組細胞包括編碼下述酶之基因：諸如聚葡萄糖蔗糖酶、UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶、聚葡萄糖酶及/或UGT。在一些實施例中，轉葡萄糖苷酶包括由SEQ ID NO: 163-290及723中之任一者闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，CGTases由以下序列編碼或具有以下序列：SEQ ID NO: 1、3、78-101、147以及154中之任一者之序列。在一些實施例中，將編碼諸如聚葡萄糖蔗糖酶、UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶、聚葡萄糖酶及/或UGT之酶之基因針對在宿主細胞中之表現進行密碼子最佳化。「編碼多肽之核酸序列」包含所有作為彼此之簡併版本且編碼相同胺基酸序列的核苷酸序列。
亦可進行最佳化來減少多核苷酸中二級結構之存在。在所述方法之一些替代方案中，亦可在載體中進行序列最佳化來減小總GC/AT比。嚴格的密碼子最佳化會導致不必要的二級結構或導致二級結構的不合需要地高的GC含量。因此，二級結構影響轉錄效率。為了避免二級結構及GC含量最佳化，可以在密碼子使用最佳化之後使用諸如GeneOptimizer之程式。這些額外程式可用於在初始密碼子最佳化之後進行進一步最佳化及故障處理（troubleshooting），從而限制在第一輪最佳化之後可能出現的二級結構。用於最佳化之替代程式容易獲得。在所述方法之一些替代方案中，載體包括為了避免二級結構最佳化之序列及/或經最佳化以減小總GC/AT比之序列及/或針對在細菌細胞或酵母細胞中之表現最佳化之序列。
「載體」、「表現載體」或「構築體」為用於將異源核酸引入具有調節元件之細胞中以提供異源核酸在細胞中之表現的核酸。載體包含但不限於質體、微環（minicircles）、酵母以及病毒基因組。在一些替代方案中，載體為質體、微環、酵母或基因組。在一些替代方案中，載體用於諸如大腸桿菌（E. coli ）之細菌系統中之蛋白質表現。在一些替代方案中，載體用於諸如大腸桿菌之細菌系統中之蛋白質表現。在一些替代方案中，載體用於酵母系統中之蛋白質表現。在一些實施例中，表現用載體為病毒載體。在一些實施例中，載體為包括用於正調節基因之表現的啟動子序列的重組載體。「調節元件」可以指具有能夠影響轉錄或轉譯起始及速率、轉錄或轉譯產物之穩定性及移動性的核苷酸序列的核酸。
如本文所述之「重組宿主」或「重組宿主細胞」為基因組已藉由至少一個所併入之DNA序列而得到強化的宿主。所述併入之DNA序列可為編碼一或多種多肽之異源核酸。此類DNA序列包含但不限於天然不存在之基因、正常不轉錄成RNA或轉譯成蛋白質（「表現」）之DNA序列以及期望引入非重組宿主中之其他基因或DNA序列。在一些實施例中，重組宿主細胞用於防止表現問題，諸如密碼子偏倚（codon-bias）。存在用於蛋白質表現之商業宿主，例如BL21-CodonPlusTM 細胞、用於異源基因之表現的tRNA補充宿主菌株、用於增強蛋白質表現之RosettaTM （DE3）勝任菌株以及酵母屬（Saccharomyces ）、畢赤酵母屬（Pichia ）、克魯維酵母屬（Kluyveromyces ）、漢遜酵母屬（Hansenula ）以及耶氏酵母屬中之商業酵母表現系統。
重組宿主可為市售細胞，諸如用於表現可以具有稀有密碼子之酶的Rosetta細胞。
在一些實施例中，重組細胞包括用於產生包括下述者中之任一者的胺基酸序列之細胞色素P450多肽的重組基因：CYP533、CYP937、CYP1798、CYP1994、CYP2048、CYP2740、CYP3404、CYP3968、CYP4112、CYP4149、CYP4491、CYP5491、CYP6479、CYP7604、CYP8224、CYP8728、CYP10020以及CYP10285。在一些實施例中，在包括下述者中所闡述之序列中之任一者的基因中編碼P450多肽：SEQ ID No: 31-48、316、431、871、873、875、877、879、881、883、885、887以及891。
在一些實施例中，P450酶由至少一種CYP活化因子，諸如CPR4497輔助。在一些實施例中，重組宿主細胞更包括編碼CPR4497之基因，其中所述基因包括SEQ ID NO: 112中所闡述之核酸序列。在一些實施例中，重組宿主細胞更包括編碼CPR4497之基因，其中CPR4497之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO: 113中。
在一些實施例中，其中重組宿主細胞為酵母細胞，重組細胞缺失EXG1基因及/或EXG2基因以防止葡聚糖酶活性降低，葡聚糖酶活性降低會導致羅漢果苷去葡萄糖化（deglucosylation）。
宿主細胞之類型可以不同。舉例而言，宿主細胞可由下述者構成的族群中選出：傘菌屬（Agaricus ）、麴菌屬、桿菌屬（Bacillus ）、念珠菌屬、棒狀桿菌屬（corynebacterium ）、埃希氏菌屬（Escherichia ）、鐮刀菌屬（Fusarium ）/ 赤黴菌屬（Gibberella ）、克魯維酵母屬、絢孔菌屬（Laetiporus ）、香菇屬（Lentinus ）、法夫酵母屬（Phaffia ）、原毛平革菌屬（Phanerochaete ）、畢赤酵母屬、中歐葫蘆蘚屬（Physcomitrella ）、紅酵母屬（Rhodoturula ）、酵母屬、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces ）、痂圓孢菌屬（Sphaceloma ）、法夫酵母屬、耶氏酵母屬、虎皮香菇（Lentinus tigrinus ）、硫磺菌（Laetiporus sulphureus ）、黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium ）、巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris ）、小立碗蘚（Physcomitrella patens ）、黏紅酵母（Rhodoturula glutinis ）、膠紅酵母（Rhodoturula mucilaginosa ）、紅法夫酵母（Phaffia rhodozyma ）、紅法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous ）、徒長病菌（Fusarium fujikuroi ）/ 藤倉赤黴（Gibberella fujikuroi ）、高蛋白假絲酵母（Candida utilis ）、解脂耶氏酵母、羅漢果屬、苦瓜屬、絞股藍屬、南瓜屬、甜瓜屬、芥菜屬、蒿屬、甜菊屬、人參屬、睡茄屬、大戟屬、苜蓿屬、吊蘭屬、五加屬、楤木屬、桑屬、苜蓿屬、樺屬、黃耆屬、麻風樹屬、山茶屬、柳蕈屬、麴菌屬、茄屬、石杉屬、假繁縷屬、黃麻屬、常春藤屬、地錢屬及桑屬、髮癬菌屬、桑黃屬、台芝屬、鏈疫孢屬、盤二孢屬、色二孢黴屬、香菇屬、法夫酵母屬、普克尼亞屬、刺盤孢屬、間座殼屬、組織胞漿菌屬、球孢子菌屬、組織胞漿菌屬、桑黃屬、短梗黴屬、普克尼亞屬、青黴菌屬、孢子絲菌屬、黑殭菌屬、麴菌屬、耶氏酵母屬、油脂酵母屬、小巢狀麴菌、解脂耶氏酵母、圓紅冬孢酵母、念珠菌屬、酵母屬、酵母亞門、外囊菌亞門、裂殖酵母綱、駒形氏酵母屬、擔子菌門、傘菌亞門、銀耳綱、柄鏽菌亞門、短梗黴屬、錐毛殼屬、紅冬孢酵母屬及微球黑粉菌綱、藤倉赤黴、乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis ）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）、黑麴菌（Aspergillus niger ）、釀酒酵母、大腸桿菌（Escherichia coli ）、類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides ）以及莢膜紅細菌（Rhodobacter capsulatus ）。用於提高產物產率之方法已描述於例如釀酒酵母中。已知用於製造重組微生物之方法。
用於自麴菌屬製備重組宿主細胞之方法描述於以全文引用的方式併入本文中的WO2014086842中。基因組之核苷酸序列可以經由公開可用之基因資料庫獲得，且可實現途徑之合理設計及修改以提高且改良產物產率。
如本文所述之「培養基」可為在細胞產生階段用於生長及維持細胞的富營養培養液（nutrient rich broth）。用於維持及繁殖不同菌株的酵母培養物可能需要用於選殖及蛋白質表現之複合培養基的特定調配物，且所屬領域中具通常知識者應瞭解。可以使用例如來自賽默飛世爾（ThermoFisher）的市售培養基。培養基可為YPD培養液或可以具有酵母氮源基礎（yeast nitrogen base）。酵母可以在YPD或合成培養基中在30℃下生長。
溶源性培養液（Lysogeny broth，LB）通常用於細菌細胞。用於酶及羅漢果苷之生長的細菌細胞可以具有抗生素抗性以防止其他細胞在培養基中生長及污染。細胞可以具有抗生素基因卡匣以便對諸如氯黴素（chloramphenicol）、青黴素（penicillin）、康黴素（kanamycin）及胺苄青黴素（ampicillin）之抗生素具有抗性。
如本文所述之「融合蛋白」為經由最初編碼單獨蛋白質之部分或完整胺基酸序列的兩個或超過兩個核酸序列之連接產生的蛋白質。舉例而言，融合蛋白可以含有功能蛋白（例如酶（包含但不限於葫蘆二烯醇合成酶））及一或多個融合域。如本文所述之融合域可為蛋白質（例如，功能蛋白，包含但不限於酶、轉錄因子、毒素以及轉譯因子）之全長或一部分/片段。一或多個融合域在融合蛋白中之位置可以不同。舉例而言，一或多個融合域可位於融合蛋白之N端及/或C端區域（例如N端及/或C端）。一或多個融合域亦可位於融合蛋白之中心區域。不要求融合域位於融合蛋白之末端。融合域可經選擇以便賦予所要特性。舉例而言，融合域可以影響（例如增加或減小）與其融合之酶的酶活性，或影響（例如增加或減小）與其融合之蛋白質的穩定性。融合域可為多聚化（例如二聚及四聚）域及/或功能域。在一些實施例中，融合域可以增強或減弱與其融合之蛋白質的多聚化。舉一非限制性實例，融合蛋白可以含有全長蛋白A及與全長蛋白A之N端區及/或C端區融合之融合域。在一些實施例中，融合蛋白含有蛋白A之部分序列及與蛋白A之部分序列之N端區及/或C端區（例如N端及C端）融合的融合域。融合域可為例如蛋白A之一部分或完整序列，或不同於蛋白A之蛋白質的一部分或完整序列。在一些實施例中，適用於本文中所揭露之方法、系統及組成物中之酶中之一或多者可為融合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白由與表1中所列出之核酸序列中之一者具有至少70%、80%、90%、95%或99%序列一致性的核酸序列編碼。在一些實施例中，融合蛋白包括與表1中所列出之胺基酸序列中之一者具有至少70%、80%、90%、95%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白包括與表1中所列出之胺基酸序列中之一者具有至少80%、90%、95%或99%序列一致性的胺基酸蛋白質序列，及在融合蛋白之N端區、C端區或兩個末端區域之融合域。在一些實施例中，融合蛋白包括表1中所列出之胺基酸蛋白質序列中之一者，及位於融合蛋白之N端區、C端區或兩個末端區域之融合域。
融合域之長度可在以下範圍內變化，例如3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、12個、15個、20個、25個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、125個、150個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1100個、1200個、1300個、1400個、1500個或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的胺基酸。在一些實施例中，融合域之長度為約3個、4個、5個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、12個、15個、20個、25個、30個、40個、50個或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的胺基酸。在一些實施例中，融合域為功能蛋白（例如酶、轉錄因子或轉譯因子）之實質性部分或完整序列。在一些實施例中，融合蛋白為具有葫蘆二烯醇合成酶活性之蛋白質。
亦涵蓋使培養基中之細胞生長及蛋白質表現最佳化的技術。關於培養基中之生長，諸如酵母之細胞可能對低pH敏感（納倫德拉納斯（Narendranath）等人, 應用與環境微生物學（Appl Environ Microbiol.） 2005年5月; 71(5): 2239-2243；以全文引用的方式併入本文中）。在生長過程中，酵母必須維持恆定的細胞內pH。在生長及代謝過程中，在酵母細胞內存在許多酶的功能活動。各酶在其最佳pH下作用最佳，因為酵母本身之嗜酸性，所以酶之最佳pH為酸性。當細胞外pH偏離最佳水準時，為了維持最佳細胞內pH，酵母細胞需要投入能量來泵入或泵出氫離子。因此，含有緩衝液來控制pH的培養基將是最佳的。或者，若監測到pH較高，則亦可將細胞轉移至新培養基中。
細菌及酵母細胞之生長最佳化亦可藉由向培養基中添加營養物及補充劑來達成。或者，培養物可以在設計成溫度、pH控制且充氣速率控制的醱酵槽中生長。溶解氧及氮可以視需要流動至培養基中。
如本文所用之術語「可操作地連接」是指調節序列與異源核酸序列之間的功能鍵聯，其導致異源核酸序列之表現。
「羅漢果苷」及「羅漢果苷化合物」在本文中可互換地使用且是指三萜糖苷家族。羅漢果苷之非限制性例示性實例包含諸如羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III，其已自負責水果之甜味的羅漢果（Siraitia grosvenorii）果實（施文格（Swingle））鑑別。在本文中之實施例中，羅漢果苷中間體可用於活體內、離體或活體外產生具有以下結構之化合物1：（1 ） 在一些實施例中，用於產生化合物1之重組細胞另外產生羅漢果苷且包括編碼用於產生羅漢果苷之酶的基因。能夠產生羅漢果苷之重組細胞另外描述於以全文引用的方式併入本文中的WO2014086842中。在一些實施例中，重組細胞在允許酶表現及化合物1及羅漢果苷中間體產生的培養基中生長。在一些實施例中，化合物1藉由用剪切力（亦即弗氏壓碎細胞或音波處理）或藉由清潔劑溶解方法溶解細胞來獲得。在一些實施例中，在生長培養基中給細胞補充諸如羅漢果醇之前驅體分子以增強化合物1之產生。
如本文所用之「啟動子」是指引導結構基因轉錄之核苷酸序列。在一些替代方案中，啟動子位於基因之5'非編碼區中，鄰近結構基因之轉錄起始位點。用於起始轉錄之啟動子內的序列元件之特徵常常在於共同核苷酸序列。這些啟動子元件可以包含但不限於RNA聚合酶結合位點、TATA序列、CAAT序列、分化特異性元件（differentiation-specific element，DSE；麥吉（McGehee）等人, 分子內分泌學（Mol. Endocrinol.） 7:551 (1993)；在此清楚地以全文引用的方式併入本文中）、環AMP反應元件（cyclic AMP response element，CRE）、血清反應元件（serum response element，SRE；特雷斯曼（Treisman）等人, 癌症生物學研討會（Seminars in Cancer Biol.） 1:47 (1990)；以全文引用的方式併入本文中）、糖皮質激素反應元件（glucocorticoid response element，GRE）以及用於其他轉錄因子之結合位點，諸如CRE/ATF（奧萊利（O'Reilly）等人, 生物化學雜誌（J. Biol. Chem.） 267:19938 (1992)；以全文引用的方式併入本文中）、AP2（葉（Ye）等人, 生物化學雜誌 269:25728 (1994)；以全文引用的方式併入本文中）、SP1、cAMP反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB；洛肯（Loeken）等人, 基因表現（Gene Expr.） 3:253 (1993)；在此清楚地以全文引用的方式併入本文中）以及八聚物因子（一般參見沃森（Watson）等人編, 基因之分子生物學（Molecular Biology of the Gene）, 第4版 (本傑明/卡明斯出版公司（Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.） 1987；以全文引用的方式併入本文中)；以及雷麥格（Lemaigre）及盧梭（Rousseau）, 生物化學雜誌（Biochem. J.） 303:1 (1994)；以全文引用的方式併入本文中）。如本文所用之啟動子可為持續性表現型活性、可抑制型或可誘導型的。若啟動子為可誘導型啟動子，則轉錄速率響應於誘導劑增加。相比之下，若啟動子為持續性表現型啟動子，則轉錄速率不受誘導劑調節。
如本文所述之「核糖體跳躍序列（ribosome skip sequence）」是指在轉譯過程中，迫使核糖體「跳過（skip）」核糖體跳躍序列且轉譯核糖體跳躍序列後之區域而不形成肽鍵的序列。舉例而言，若干病毒具有允許單一核酸上之若干蛋白質之依序轉譯而不具有經由肽鍵連接之蛋白質的核糖體跳躍序列。如本文所述，此為「連接子」序列。在本文所提供之核酸之一些替代方案中，核酸包括在本文所述之酶之基因的序列之間的核糖體跳躍序列，使得蛋白質共表現且不用肽鍵連接。在一些替代方案中，核糖體跳躍序列為P2A、T2A、E2A或F2A序列。在一些替代方案中，核糖體跳躍序列為T2A序列。 化合物1
如本文中所揭露，化合物1為具有以下結構之化合物： （ 1 ） ，或其鹽。
化合物1為可用於各種需要甜味之產品中之高強度甜味劑。化合物1相對於諸如蔗糖或果糖之其他甜味劑提供低卡路里優勢。
在一些實施例中，化合物1呈經分離且經純化之形式。在一些實施例中，化合物1存在於一種組成物中，其中化合物1基本上經純化。
在一些實施例中，化合物1或其鹽經分離且呈固體形式。在一些實施例中，固體形式為非晶。在一些實施例中，固體形式為結晶。在一些實施例中，化合物呈凍乾物形式。在一些實施例中，化合物1經分離且在緩衝液內。
熟練技術人員應認識到，本文所述之一些結構可為可明確地由其他化學結構表示的化合物之共振形式或互變異構體，甚至在以動力學方式表示時；技術人員認識到，此類結構可僅表示此類化合物之樣品之極少部分。此類化合物被認為在所描繪之結構的範圍內，但本文中未呈現此等共振形式或互變異構體。
可在化合物1中存在同位素。如化合物結構中所表示的各化學元素可以包含所述元素之任何同位素。舉例而言，在化合物結構中，可明確揭露或理解在化合物中存在氫原子。在可存在氫原子之化合物之任何位置處，氫原子可為氫的任何同位素，包含但不限於氫-1（氕）及氫-2（氘）。由此，除非上下文另外明確指示，否則本文中提及之化合物涵蓋所有可能的同位素形式。在一些實施例中，本文所述之化合物中之一或多種同位素相對於此類同位素之天然盛行率（prevalence）增濃。在一些實施例中，本文所述之化合物中之氘增濃。在一些實施例中，本文所述之化合物中之氫原子中超過0.0312%為氘。在一些實施例中，本文所述之化合物中之氫原子中超過0.05%、0.08%或0.1%為氘。
在一些實施例中，化合物1能夠藉助於胺基及/或羧基或其類似基團之存在而形成酸鹽及/或鹼鹽。
在一些實施例中，化合物1基本上經分離。在一些實施例中，化合物1基本上經純化。在一些實施例中，化合物呈凍乾物形式。在一些實施例中，化合物為結晶。在一些實施例中，化合物為非晶。 製造組成物
在一些實施例中，製造組成物不含或含有小於一定量的非所要化合物。在一些實施例中，組成物含有或不含羅漢果苷I、羅漢果苷II以及羅漢果苷III之一或多種異構體。在一些實施例中，組成物含有重量百分比小於5%、3%、2%、1%、0.5%、0.3%、0.1%、800 ppm、500 ppm、200 ppm或100 ppm之羅漢果苷I、羅漢果苷II以及羅漢果苷III之所有異構體。在一些實施例中，組成物含有或不含羅漢果苷IIIE、11-側氧基-羅漢果苷IIIE、羅漢果苷IIIA2、羅漢果苷IE、羅漢果苷IIE以及11-側氧基-羅漢果醇中之一或多者。在一些實施例中，組成物含有重量百分比小於5%、3%、2%、1%、0.5%、0.3%、0.1%、800 ppm、500 ppm、200 ppm或100 ppm之羅漢果苷IIIE、11-側氧基-羅漢果苷IIIE、羅漢果苷IIIA2、羅漢果苷IE、羅漢果苷IIE以及11-側氧基-羅漢果醇中之一或多者。在一些實施例中，組成物含有重量百分比小於5%、3%、2%、1%、0.5%、0.3%、0.1%、800 ppm、500 ppm、200 ppm或100 ppm之羅漢果苷IIIE。在一些實施例中，組成物含有重量百分比小於5%、3%、2%、1%、0.5%、0.3%、0.1%、800 ppm、500 ppm、200 ppm或100 ppm之11-側氧基-羅漢果苷IIIE。在一些實施例中，組成物含有重量百分比小於5%、3%、2%、1%、0.5%、0.3%、0.1%、800 ppm、500 ppm、200 ppm或100 ppm之11-側氧基-羅漢果醇。
在一些實施例中，製造組成物呈固體形式，其可為結晶或非晶。在一些實施例中，組成物呈微粒形式。組成物之固體形式可以使用任何適合技術產生，包含但不限於再結晶、過濾、溶劑蒸發、研磨、碾磨、噴霧乾燥、噴霧附聚、流化床附聚、濕式或乾式粒化以及其組合。在一些實施例中，提供可流動的微粒組成物以方便在其他食品製造方法中使用。在一些此類實施例中，產生介於50微米與300微米之間、介於80微米與200微米之間或介於80微米與150微米之間的粒度。
一些實施例提供一種呈溶液形式的包括化合物1之製造組成物。舉例而言，在一些實施例中，由本文所述之製造方法中之一者產生之溶液不經進一步純化即使用。在一些實施例中，化合物1在溶液中之濃度按重量計大於300 ppm、500 ppm、800 ppm、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%或20%。在一些實施例中，羅漢果苷I、羅漢果苷II及羅漢果苷III之所有異構體之濃度小於5%、3%、2%、1%、0.5%、0.3%、0.1%、800 ppm、500 ppm、200 ppm或100 ppm。在一些實施例中，羅漢果苷IIIE、11-側氧基-羅漢果苷IIIE、羅漢果苷IIIA2、羅漢果苷IE、羅漢果苷IIE以及11-側氧基-羅漢果醇中之一或多者在製造組成物中之濃度為小於5%、3%、2%、1%、0.5%、0.3%、0.1%、800 ppm、500 ppm、200 ppm、100 ppm、50 ppm、30 ppm、20 ppm、10 ppm、5 ppm、1 ppm或0.1 ppm之羅漢果苷IIIE、11-側氧基-羅漢果苷IIIE、羅漢果苷IIIA2、羅漢果苷IE、羅漢果苷IIE以及11-側氧基-羅漢果醇中之一或多者。在一些實施例中，羅漢果苷IIIE之濃度小於5%、3%、2%、1%、0.5%、0.3%、0.1%、800 ppm、500 ppm、200 ppm、100 ppm、50 ppm、30 ppm、20 ppm、10 ppm、5 ppm、1 ppm或0.1 ppm。在一些實施例中，11-側氧基-羅漢果苷IIIE之濃度小於5%、3%、2%、1%、0.5%、0.3%、0.1%、800 ppm、500 ppm、200 ppm、100 ppm、50 ppm、30 ppm、20 ppm、10 ppm、5 ppm、1 ppm或0.1 ppm。在一些實施例中，11-側氧基-羅漢果醇之濃度小於5%、3%、2%、1%、0.5%、0.3%、0.1%、800 ppm、500 ppm、200 ppm、100 ppm、50 ppm、30 ppm、20 ppm、10 ppm、5 ppm、1 ppm或0.1 ppm。 化合物1及中間體羅漢果苷化合物之製造方法
在一些實施例中，化合物1藉由不同的起始化合物及/或中間化合物與一或多種酶之接觸產生。接觸可為活體內（例如，在重組細胞中）或活體外的。用於製造化合物1之起始化合物及中間化合物可以包含但不限於羅漢果苷V、羅漢果苷IIE、羅漢果苷IIIE 、賽門苷I、羅漢果苷VI異構體、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IVE 或羅漢果苷IVA 。
在一些實施例中，如本文中所揭露之化合物1如本文所述在重組宿主細胞中活體內產生或藉由修改這些方法產生。方法之修改方式尤其包含所屬領域中具通常知識者已知之溫度、溶劑、試劑等。本文中所展示且描述之方法僅為說明性的且既不打算亦不應理解為以任何方式限制申請專利範圍之範圍。所屬領域中具通常知識者將能夠基於本文中之揭露內容而想到所揭露方法之修改且設計替代途徑；所有此類修改及替代途徑均在申請專利範圍之範圍內。
在一些實施例中，本文中所揭露之化合物1藉由自重組細菌細胞、酵母細胞、植物細胞或昆蟲細胞純化及/或分離而獲得。在一些實施例中，重組細胞來自羅漢果。在一些此類實施例中，自羅漢果獲得之提取物可以使用適合純化技術分級。在一些實施例中，提取物使用HPLC分級且收集適當的部分以獲得呈經分離且純化之形式的所要化合物。
在一些實施例中，化合物1由自羅漢果分離之化合物之酶促改質產生。舉例而言，在一些實施例中，自羅漢果分離之化合物1與一或多種酶接觸以獲得所要化合物。接觸可為活體內（例如，在重組細胞中）或活體外的。用於製造化合物1之起始化合物及中間化合物可以包含但不限於羅漢果苷V、羅漢果苷IIE、羅漢果苷IIIE 、賽門苷I、羅漢果苷VI異構體、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IVE 或羅漢果苷IVA 。這些化合物中之一或多者可以活體內製造。適用於產生本文所述之化合物的酶可以包含但不限於果膠酶、β-半乳糖苷酶（例如阿洛瑪（Aromase））、纖維素酶（例如賽路克雷斯）、環麥芽糊精葡聚糖轉移酶（例如托魯茲（Toruzyme））、轉化酶、葡萄糖轉移酶（例如UGT76G1）、聚葡萄糖蔗糖酶、乳糖酶、阿拉伯糖酶（arabanse）、木聚糖酶、半纖維素、澱粉酶或其組合。在一些實施例中，酶為包括SEQ ID NO: 89-94中之任一者中所闡述之胺基酸序列的托魯茲。
一些實施例提供一種製造化合物1之方法， （ 1 ） ，方法包括在HPLC管柱上對羅漢果提取物進行分級且收集包括化合物1之溶離部分。
一些實施例提供一種製造化合物1之方法，，其中方法包括用葡萄糖轉移酶UGT76G1處理羅漢果苷IIIE 。在一些實施例中，UGT76G1由SEQ ID NO: 440中所闡述之序列編碼。在一些實施例中，UGT76G1包括SEQ ID NO: 439中所闡述之胺基酸序列。
可以使用多種羅漢果苷化合物作為用於製造化合物1之中間化合物。此類羅漢果苷化合物之非限制性實例為具有以下結構之化合物3： （ 3 ） 。在一些實施例中，化合物3之製造方法包括使羅漢果苷IIIE 與表現一或多種環麥芽糊精葡聚糖轉移酶之細胞（例如重組宿主細胞）接觸。在一些實施例中，環麥芽糊精葡聚糖轉移酶包括SEQ ID NO: 95中所闡述之胺基酸序列。
可以使用多種羅漢果苷化合物作為用於製造化合物1之中間化合物。此類羅漢果苷化合物之一個非限制性實例為具有以下結構之化合物12：（12 ）。在一些實施例中，化合物12之製造方法包括使羅漢果苷VI與表現一或多種轉化酶之細胞（例如重組宿主細胞）接觸。
可以使用多種羅漢果苷化合物作為用於製造化合物1之中間化合物。此類羅漢果苷化合物之一個非限制性實例為具有以下結構之化合物5：（5 ） 在一些實施例中，化合物5之製造方法包括使羅漢果苷IIIE 與表現一或多種環麥芽糊精葡聚糖轉移酶之細胞（例如重組宿主細胞）接觸。在一些實施例中，所述方法在澱粉存在下進行。
可以使用多種羅漢果苷化合物作為用於製造化合物1之中間化合物。此類羅漢果苷化合物之一個非限制性實例為具有以下結構之化合物4：（4 ）， 在一些實施例中，化合物4之製造方法包括使羅漢果苷IIIE 與表現一或多種環麥芽糊精葡聚糖轉移酶之細胞（例如重組宿主細胞）接觸。在一些實施例中，所述方法在澱粉存在下進行。 高糖基化羅漢果苷之水解
在一些實施例中，一或多種高糖基化羅漢果苷藉由與一或多種水解酶接觸而水解為羅漢果苷IIIE 。在一些實施例中，高糖基化羅漢果苷由羅漢果苷IV、羅漢果苷V、羅漢果苷VI以及其組合中選出。在一些實施例中，高糖基化羅漢果苷由羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IVE 以及其組合中選出。
意外發現，化合物1展示對某些水解酶水解之耐受性，即使此類酶展示出將高糖基化羅漢果苷水解為羅漢果苷IIIE之能力。化合物1中所存在之α-連接之糖苷因為其對水解之耐受性，所以相對於其他羅漢果苷（例如β-連接之糖苷）提供獨特優勢。在一些實施例中，在微生物產生化合物1之過程中，微生物宿主將會把不想要的β-連接之羅漢果苷水解回到羅漢果苷IIIE。這將改善化合物1之純度，因為：1）不想要的羅漢果苷VI、羅漢果苷V以及羅漢果苷IV之含量降低；2）水解將提高可用作用於製造化合物1之前驅體的羅漢果苷IIIE之量。
圖38示出經由糖基化酶產生高糖基化羅漢果苷，其隨後可以水解回到羅漢果苷IIIE。結果為羅漢果苷之混合物且高糖基化羅漢果苷之產率低於所期望的。可以移除水解酶，但仍然獲得羅漢果苷混合物且製造生物體（producing organism）之壽命會減少。然而，因為化合物1對水解具有抗性，所以可以使用水解來驅使高糖基化羅漢果苷成為羅漢果苷IIIE，羅漢果苷IIIE隨後可轉化為化合物1（如圖39中所示）。
在一些實施例中，水解酶為β-葡聚糖水解酶。在一些實施例中，水解酶為EXG1。EXG1蛋白質可以包括與SEQ ID NO: 1013或1014具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%或超過99%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，EXG1蛋白質包括或組成為SEQ ID NO: 1013或1014中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，水解酶為EXG2。EXG2蛋白質可以包括與SEQ ID NO: 1023具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%或超過99%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，EXG2蛋白質包括或組成為SEQ ID NO: 1023中所闡述之胺基酸序列。水解酶可為例如本文中所揭露之水解酶中之任一者。 自羅漢果苷IIIE產生化合物1
化合物1可以由羅漢果苷IIIE與一或多種能夠將羅漢果苷IIIE轉化為化合物1之酶接觸而產生。在一些實施例中，能夠催化化合物1之產生的酶為UDP糖基轉移酶、環麥芽糊精葡聚糖轉移酶（CGTase）、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。
在一些實施例中，能夠催化化合物1之產生的酶為CGTase。在一些實施例中，CGTase包括與SEQ ID NO: 1、3、78-101、148以及154中之任一者之序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，CGTase包括或組成為SEQ ID NO: 1、3、78-101、148以及154之胺基酸序列。在一些實施例中，能夠催化化合物1之產生的酶為聚葡萄糖蔗糖酶。在一些實施例中，聚葡萄糖蔗糖酶包括與SEQ ID NO: 2、103、106-110、156以及896中之任一者之序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，聚葡萄糖蔗糖酶包括或組成為SEQ ID NO: 2、103、106-110、156以及896中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，聚葡萄糖蔗糖酶由與SEQ ID NO: 104、105、157、158以及895中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼。在一些實施例中，聚葡萄糖蔗糖酶由包括或組成為SEQ ID NO: 104、105、157、158以及895中之任一者的核酸序列編碼。在一些實施例中，能夠催化化合物1之產生的酶為轉葡萄糖苷酶。在一些實施例中，轉葡萄糖苷酶包括與SEQ ID NO: 163-290及723中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，轉葡萄糖苷酶包括或組成為SEQ ID NO: 163-292及723中之任一者之胺基酸序列。用於測定序列一致性百分比之參數可以用ClustalW軟體藉由Blast搜尋進行（ncbi.nih.gov）。使用這些程式能夠測定蛋白質同源物之間的保守度。
在一些實施例中，能夠催化化合物1之產生的酶為尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶（UGT）。UGT可以包括例如與SEQ ID NO: 4-9、15-19、125、126、128、129、293-307、407、409、411、413、439、441以及444中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，UGT包括或組成為SEQ ID NO: 4-9、10-14、125、126、128、129、293-304、306、407、409、411、413、439、441以及444中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，UGT由與下述者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼：UGT1495（SEQ ID NO: 10）、UGT1817（SEQ ID NO: 11）、UGT5914（SEQ ID NO: 12）、UGT8468（SEQ ID NO:13）、UGT10391（SEQ ID NO:14）以及SEQ ID NO: 116-124、127、130、408、410、412、414、440、442、443以及445。在一些實施例中，UGT由包括、組成為UGT1495（SEQ ID NO: 10）、UGT1817（SEQ ID NO: 11）、UGT5914（SEQ ID NO: 12）、UGT8468（SEQ ID NO:13）、UGT10391（SEQ ID NO:14）、SEQ ID NO: 116-124、127、130、408、410、412、414、440、442、443以及445之核酸序列中之任一者的核酸序列編碼。在一些實施例中，酶可為UGT98或UGT SK98。舉例而言，如本文所述，能夠產生化合物1之重組宿主細胞可以包括編碼UGT98及/或UGT SK98之第三基因。在一些實施例中，UGT98或UGT SK98包括與SEQ ID NO: 9或16具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，UGT包括與下述者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列：UGT73C3（SEQ ID NO: 4）、UGT73C6（SEQ ID NO: 5）、UGT85C2（SEQ ID NO: 6）、UGT73C5（SEQ ID NO: 7）、UGT73E1（SEQ ID NO: 8）、UGT98（SEQ ID NO: 9）、UGT1576（SEQ ID NO: 15）、UGT SK98（SEQ ID NO: 16）、UGT430（SEQ ID NO: 17）、UGT1697（SEQ ID NO: 18）以及UGT11789（SEQ ID NO: 19）。在一些實施例中，UGT包括或組成為下述者中之任一者之胺基酸序列：UGT73C3（SEQ ID NO: 4）、UGT73C6（SEQ ID NO: 5)、85C2（SEQ ID NO: 6）、UGT73C5（SEQ ID NO: 7）、UGT73E1（SEQ ID NO: 8）、UGT98（SEQ ID NO: 9）、UGT1576（SEQ ID NO: 15）、UGT SK98（SEQ ID NO:16）、UGT430（SEQ ID NO:17）、UGT1697（SEQ ID NO: 18）以及UGT11789（SEQ ID NO:19）。在一些實施例中，UGT由與UGT1495（SEQ ID NO: 10）、UGT1817（SEQ ID NO: 11）、UGT5914（SEQ ID NO: 12）、UGT8468（SEQ ID NO:13）或UGT10391（SEQ ID NO: 14）具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%或超過99%的序列一致性的核酸序列編碼。在一些實施例中，UGT由包括或組成為UGT1495（SEQ ID NO: 10）、UGT1817（SEQ ID NO: 11）、UGT5914（SEQ ID NO: 12）、UGT8468（SEQ ID NO: 13）以及UGT10391（SEQ ID NO: 14）之序列中之任一者的核酸序列編碼。如本文中所揭露，能夠催化化合物1之產生的酶可以包括與本文中所揭露之UGT酶中之任一者具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或超過99%之序列一致性的胺基酸序列。此外，能夠產生化合物1之重組宿主細胞可以包括一種酶，所述酶包括或組成為與本文中所揭露之UGT酶中之任一者具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或超過99%之序列一致性的序列。在一些實施例中，重組宿主細胞包括一種酶，所述酶包括或組成為本文中所揭露之UGT酶中之任一者之序列。
在一些實施例中，化合物1之製造方法包括用葡萄糖轉移酶UGT76G1處理羅漢果苷IIIE ，例如SEQ ID NO: 439之UGT76G1及由SEQ ID NO: 440之核酸序列編碼之UGT76G1。 用於製造羅漢果苷化合物及化合物1之酶
如本文所述，UDP糖基轉移酶、環麥芽糊精葡聚糖轉移酶（CGTase）、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶這些酶可以包括本文中之序列表中所述之胺基酸序列且亦可由序列表中所述之核酸序列編碼。另外，酶亦可包含與序列表中所述之胺基酸序列具有至少70%序列一致性的功能同源物。用於測定序列一致性百分比之參數可以用ClustalW軟體藉由Blast搜尋進行（ncbi.nih.gov）。使用這些程式能夠測定蛋白質同源物之間的保守度。
在一些實施例中，轉葡萄糖苷酶包括與SEQ ID NO: 163-290及723中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，CGTase包括或組成為與SEQ ID NO: 1、3、78-101以及154中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，轉葡萄糖苷酶包括一種胺基酸序列或由一種核酸序列編碼，所述胺基酸序列或所述核酸序列與SEQ ID NO: 163-290以及723中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性。
本文中之方法亦包含將基因併入用於產生諸如丙酮酸鹽、乙醯輔酶A、檸檬酸鹽以及其他TCA中間體（檸檬酸循環）的中間體的重組細胞中。中間體可以另外用於製造用於製造化合物1之羅漢果苷化合物。用於提高角鯊烯含量之方法描述於格魯查塔卡（Gruchattka）等人及羅德里格斯（Rodriguez）等人（公共科學圖書館·綜合（PLoS One.） 2015年12月23日; 10(12；微生物細胞工廠（Microb Cell Fact.） 2016年3月3日; 15:48；以全文引用之方式併入本文中）中。
另外涵蓋用於產生氧化角鯊烯及二環氧角鯊烯之酶的表現。使用酶產生氧化角鯊烯及二環氧角鯊烯可用於藉由角鯊烯合成酶及/或角鯊烯環氧酶增強角鯊烯合成。舉例而言，蘇（Su）等人描述了編碼SgSQS之基因，一種來自羅漢果之用於角鯊烯合成酶的417個胺基酸的蛋白質（生物技術快報（Biotechnol Lett.） 2017年3月28日；以全文引用的方式併入本文中）。用於表現HMG CoA還原酶之重組細胞的基因工程亦適用於角鯊烯合成（應用與環境微生物學 1997年9月; 63(9):3341-4.；植物科學前沿（Front Plant Sci.） 2011年6月30日; 2:25；歐洲生物化學學會聯合會雜誌（FEBS J.） 2008年4月; 275(8):1852-9.；全部以全文引用的方式併入本文中）。在一些實施例中，2,3-氧化角鯊烯或二環氧角鯊烯由一種酶產生，所述酶包括與SEQ ID NO: 898或900具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列。在一些實施例中，2,3-氧化角鯊烯或二環氧角鯊烯由一種酶產生，所述酶由與SEQ ID NO: 897或899具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼。
亦涵蓋用於產生葫蘆二烯醇/環氧葫蘆二烯醇之酶的表現。涵蓋來自美國南瓜（C pepo）、羅漢果（S grosvenorii）、胡瓜（C sativus）、厚皮甜瓜（C melo）、中國南瓜（C moschata）以及筍瓜（C maxim）之葫蘆二烯醇合成酶之實例用於藉由表現載體工程化至重組細胞中。亦涵蓋用於三萜生物合成之氧化角鯊烯環化酶用於在重組細胞中表現，其將引起非環受質環化成各種亦可用作用於製造化合物1之中間體的多環三萜（有機與生物分子化學（Org Biomol Chem.） 2015年7月14日;13(26):7331-6；以全文引用的方式併入本文中）。
亦涵蓋展示環氧化物水解酶活性以製造羥基-葫蘆二烯醇之酶的表現。在本文中之一些實施例中，提供用於產生化合物1之重組細胞更包括編碼展示環氧化物水解酶活性以製造羥基-葫蘆二烯醇之酶的基因。此類酶提供於以全文引用的方式併入本文中之伊特金（Itkin）等人中。伊特金等人中所述之酶提供於本文所提供之序列表表1中。艾金（Ikin）等人亦描述用於製造關鍵羅漢果苷之酶、UGS家族、糖基轉移酶以及可經基因修飾逆轉諸如糖基化之反應的水解酶。
亦涵蓋酶在重組細胞中之表現以使羅漢果苷化合物羥基化產生羅漢果醇。這些酶可以包含CAZY家族之蛋白質、UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、B-葡萄糖苷酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶、聚葡萄糖酶、酵母及真菌水解酶。此類酶可用於例如將羅漢果苷V水解為羅漢果苷IIIE，其中羅漢果苷IIIE可以例如在活體內進一步處理以產生化合物1。在一些實施例中，真菌乳糖酶包括與SEQ ID NO: 678-722中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，產生羅漢果醇前驅體，諸如角鯊烯或氧化角鯊烯、羅漢果醇或羅漢果苷。羅漢果醇前驅體可用作化合物1產生過程中之前驅體。角鯊烯可以使用角鯊烯合成酶由焦磷酸法呢酯產生，且氧化角鯊烯可以使用角鯊烯環氧酶由角鯊烯產生。角鯊烯合成酶可為例如來自葫蘆科植物絞股藍（Gynostemma pentaphyllum）之角鯊烯合成酶（蛋白質寄存編號C4P9M2）。角鯊烯合成酶亦可包括來自下述者之角鯊烯合成酶：阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana ）（蛋白質寄存編號C4P9M3）、西洋油菜（Brassica napus ）、大葉萊檬（Citrus macrophylla ）、綠珊瑚（Euphorbia tirucalli ）（蛋白質寄存編號B9WZW7）、大豆（Glycine max ）、洋甘草（Glycyrrhiza glabra ）（蛋白質寄存編號Q42760、Q42761）、烏拉爾甘草（Glycrrhiza uralensis ）（蛋白質寄存編號D6QX40、D6QX41、D6QX42、D6QX43、D6QX44、D6QX45、D6QX47、D6QX39、D6QX55、D6QX38、D6QX53、D6QX37、D6QX35、B5AID5、B5AID4、B5AID3、C7EDD0、C6KE07、C6KE08、C7EDC9）、百脈根（Lotus japonicas ）（蛋白質寄存編號Q84LE3）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula ）（蛋白質寄存編號Q8GSL6）、豌豆、蓖麻（Ricinus communis ）（蛋白質寄存編號B9RHC3）。WO 2016/050890中描述了多種角鯊烯合成酶，WO 2016/050890之內容以全文引用的方式併入本文中。 重組宿主細胞
本文中所揭露之酶中之任一者可以在活體外、離體或活體內產生。舉例而言，可以將編碼酶（包含但不限於UGT、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶、聚葡萄糖酶、細胞色素P450、環氧化物水解酶、葫蘆二烯醇合成酶、角鯊烯環氧酶、角鯊烯合成酶、水解酶以及氧化角鯊烯環化酶中之任一者）之核酸序列活體內引入宿主重組細胞中，例如以含有編碼核酸序列之表現載體形式。可以藉由例如標準轉形技術（例如熱轉形）或藉由轉染將表現載體引入宿主細胞中。表現系統可以產生用於產生羅漢果苷及化合物1之酶，以便在細胞中活體內產生化合物1。有用的表現系統包含但不限於細菌、酵母及昆蟲細胞系統。舉例而言，可以用用於表現相關酶之重組病毒表現系統感染昆蟲細胞系統。在一些實施例中，針對在特定細胞中之表現使基因密碼子最佳化。在一些實施例中，基因可操作地連接於用於驅動酶蛋白質之轉錄及轉譯的啟動子。如本文所述，可以獲得密碼子最佳化，且最佳化序列隨後可工程化至用於重組宿主細胞轉形之載體中。
表現載體可以更包括轉錄或轉譯調節序列、轉錄或轉譯因子之編碼序列或多種啟動子（例如GPD1啟動子）及/或強化子，從而促進相關基因在酵母細胞中之轉錄。
在一些實施例中，如本文所述之重組細胞經基因修飾以在活體內產生化合物1。另外，可以在細胞生長過程中或在細胞生長之後向細胞給予羅漢果醇前驅體或羅漢果苷前驅體來增強用於活體內產生化合物1之途徑的特定中間體之產生速率。細胞可以呈懸浮狀或固定。細胞可以在醱酵液中或在反應緩衝液中。在一些實施例中，使用透化劑（permeabilizing agent）將羅漢果醇前驅體或羅漢果苷前驅體轉移至細胞中。在一些實施例中，羅漢果醇前驅體或羅漢果苷前驅體可以經純化形式或作為組成物或提取物之一部分提供。
重組宿主細胞可為例如植物細胞、雙殼貝類細胞、魚細胞、真菌細胞、細菌細胞或哺乳動物細胞。舉例而言，植物可以由下述者中選出：羅漢果屬、苦瓜屬、絞股藍屬、南瓜屬、甜瓜屬、芥菜屬、蒿屬、甜菊屬、人參屬、睡茄屬、大戟屬、苜蓿屬、吊蘭屬、五加屬、楤木屬、桑屬、苜蓿屬、樺屬、黃耆屬、麻風樹屬、山茶屬、柳蕈屬、麴菌屬、茄屬、石杉屬、假繁縷屬、黃麻屬、常春藤屬、地錢屬以及桑屬。真菌可以由下述者中選出：髮癬菌屬、桑黃屬、台芝屬、鏈疫孢屬、盤二孢屬、色二孢黴屬、香菇屬、法夫酵母屬、普克尼亞屬、刺盤孢屬、間座殼屬、組織胞漿菌屬、球孢子菌屬、組織胞漿菌屬、桑黃屬、短梗黴屬、普克尼亞屬、青黴菌屬、孢子絲菌屬、黑殭菌屬、麴菌屬、耶氏酵母屬以及油脂酵母屬。在一些實施例中，真菌為小巢狀麴菌、解脂耶氏酵母或圓紅冬孢酵母。在一些實施例中，重組宿主細胞為酵母細胞。在一些實施例中，酵母由下述者中選出：念珠菌屬、酵母屬、酵母亞門、外囊菌亞門、裂殖酵母綱、駒形氏酵母屬、擔子菌門、傘菌亞門、銀耳綱、柄鏽菌亞門、短梗黴屬、錐毛殼屬、紅冬孢酵母屬、耶氏酵母屬以及微球黑粉菌綱。在一些實施例中，細菌由下述者中選出：弗蘭克氏菌屬、放線菌門、鏈黴菌屬以及腸球菌屬。在一些實施例中，細菌為糞腸球菌（Enterococcus faecalis ）。
在一些實施例中，重組基因針對在細菌、哺乳動物、植物、真菌或昆蟲細胞中之表現進行密碼子最佳化。在一些實施例中，基因中之一或多者包括功能突變以提高所編碼之酶的活性。在一些實施例中，培養重組宿主細胞包括針對培養條件之pH、溶解氧含量、氮含量或其組合來監測所述培養。 自角鯊烯產生羅漢果醇
化合物1之製造方法之一些實施例包括製造用於化合物1之製造過程中之中間體。具有以下結構之化合物：（1 ）在重組宿主中活體內產生。在一些實施例中，化合物在重組宿主細胞中、分泌於重組細胞所生長之培養基中或兩者皆有。在一些實施例中，重組細胞另外在活體內產生諸如羅漢果苷化合物之中間體。重組細胞可以在表現本文中所揭露之基因的條件下在培養基中生長。本文描述使細胞生長之方法的一些實施例。
在一些實施例中，中間體為或包括角鯊烯、氧化角鯊烯、葫蘆二烯醇、羅漢果醇以及羅漢果苷中之至少一者。在一些實施例中，羅漢果苷為羅漢果苷IIE。如本文所述，羅漢果苷為能夠例如自植物或果實自然地分離的糖苷家族。如本文所涵蓋的，羅漢果苷可以由重組宿主細胞產生。
在本文所述方法之一些替代方案中，重組宿主細胞包括含有以下中之一或多者的多核苷酸或序列： 編碼角鯊烯環氧酶之基因； 編碼葫蘆二烯醇合成酶之基因； 編碼細胞色素P450之基因； 編碼細胞色素P450還原酶之基因；以及 編碼環氧化物水解酶之基因。
在一些實施例中，角鯊烯環氧酶包括與SEQ ID NO: 54具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列。在一些實施例中，角鯊烯環氧酶包括來自阿拉伯芥（蛋白質寄存編號：Q9SM02、065403、065402、065404、081000或Q9T064）、西洋油菜（蛋白質寄存編號10 065727、065726）、綠珊瑚（蛋白質寄存編號A7VJN1）、蒺藜苜蓿（蛋白質寄存編號Q8GSM8、Q8GSM9）、豌豆以及蓖麻（蛋白質寄存編號B9R6VO、B9S7W5、B9S6Y2、B9TOY3、B9S7TO、B9SX91）之序列以及與其共用至少70%、諸如至少80%、例如至少90%、諸如至少95%、例如至少98%序列一致性的前述中之任一者的功能同源物。在一些實施例中，角鯊烯環氧酶包括或組成為與SEQ ID NO: 50-56、60、61、334或335具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，細胞包括編碼ERG7（羊毛甾醇合成酶）之基因。在一些實施例中，羊毛甾醇合成酶包括與SEQ ID NO: 111具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列。在一些實施例中，在包括與如申請專利範圍第31項至第48項中之任一項具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列的基因中編碼P450多肽。在一些實施例中，可以用核糖體跳躍序列隔開序列以產生分開的蛋白質。
在一些實施例中，重組宿主細胞包括編碼具有葫蘆二烯醇合成酶活性之多肽的基因。在一些實施例中，具有葫蘆二烯醇合成酶活性之多肽包括如SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327-333、420、422、424、426、446、902、904以及906中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，具有葫蘆二烯醇合成酶活性之多肽包括與SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327-333、420、422、424、426、446、902、904以及906中之任一者之序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列。在一些實施例中，具有葫蘆二烯醇合成酶活性之多肽包括含有SEQ ID NO: 73中所闡述之序列的C端部分。在一些實施例中，編碼具有葫蘆二烯醇合成酶活性之多肽的基因發生密碼子最佳化。在一些實施例中，經密碼子最佳化之基因包括SEQ ID NO: 74中所闡述之核酸序列。
在一些實施例中，具有葫蘆二烯醇合成酶活性之多肽為包括與葫蘆二烯醇合成酶融合之融合域的融合多肽。融合域可以例如與葫蘆二烯醇合成酶之N端或C端融合。融合域可以例如位於融合多肽之N端區或C端區。融合域之長度可以不同。舉例而言，融合域可以為或約3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、12個、15個、20個、25個、30個、40個、50個、100個、150個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1500個、2000個或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的胺基酸長。在一些實施例中，融合域為3個到1000個胺基酸長。在一些實施例中，融合域為5個到50個胺基酸長。在一些實施例中，融合域包括功能蛋白之實質性部分或完整序列。在一些實施例中，融合域包括酵母蛋白之一部分或完整序列。舉例而言，具有葫蘆二烯醇合成酶活性之融合多肽可以包括與SEQ ID NO: 851、854、856、1024、859、862、865、867、915、920、924、928、932、936、940、944、948、952、956、959、964、967、971、975、979、983、987、991、995、999、1003、1007以及1011中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合多肽包括或組成為SEQ ID NO: 851、854、856、1024、859、862、865、867、915、920、924、928、932、936、940、944、948、952、956、959、964、967、971、975、979、983、987、991、995、999、1003、1007以及1011中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，融合多肽之融合域包括與SEQ ID NO: 866、870、917、921、925、929、933、937、941、945、949、953、957、961、968、972、976、980、984、988、992、996、1000、1004、1008以及1012中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，融合多肽之融合域包括或組成為866、870、917、921、925、929、933、937、941、945、949、953、957、961、968、972、976、980、984、988、992、996、1000、1004、1008以及1012中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，與融合域融合之葫蘆二烯醇合成酶包括與SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327、329-333、420、422、424、426、446、902、904以及906中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，與融合域融合之葫蘆二烯醇合成酶包括或組成為SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327、329-333、420、422、424、426、446、902、904以及906中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，與融合域融合之葫蘆二烯醇合成酶由一種基因編碼，所述基因包括與SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903以及905中之任一者具有或至少具有70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，與融合域融合之葫蘆二烯醇合成酶由一種基因編碼，所述基因包括或組成為SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903以及905中之任一者中所闡述之核酸序列。本文中所揭露的內容包含一種重組核酸分子，其包括編碼具有葫蘆二烯醇合成酶活性之融合多肽的核酸序列。所揭露的內容亦包含一種重組細胞，其包括具有葫蘆二烯醇合成酶活性之融合多肽或編碼融合多肽之重組核酸分子。
本文中所揭露之具有葫蘆二烯醇合成酶活性之融合多肽可作為葫蘆二烯醇合成酶用於催化酶促反應。舉例而言，可以使葫蘆二烯醇合成酶之受質與這些融合多肽中之一或多者接觸以產生反應產物。反應產物之非限制性實例包含葫蘆二烯醇、24,25-環氧葫蘆二烯醇及其任何組合。葫蘆二烯醇合成酶之受質的非限制性實例包含2,3-氧化角鯊烯、二氧化角鯊烯、二環氧角鯊烯及其任何組合。在一些實施例中，可以使受質與重組宿主細胞接觸，所述重組宿主細胞包括編碼一或多種具有葫蘆二烯醇合成酶活性之融合多肽的核酸序列。受質可以提供至重組宿主細胞、存在於重組宿主細胞中、由重組宿主細胞產生或其任何組合。
在一些實施例中，細胞色素P450為CYP5491。在一些實施例中，細胞色素P540包括與SEQ ID NO: 44及/或SEQ ID NO: 74中所闡述之序列具有或至少具有50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，P450還原酶多肽包括與SEQ ID NO: 46具有或至少具有50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，P450多肽由一種基因編碼，所述基因包括與SEQ ID NO: 31-48、316、431、871、873、875、877、879、881、883、885、887以及891中之任一者具有或至少具有50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列。
在一些實施例中，環氧化物水解酶包括與SEQ ID NO: 38或40具有或至少具有70%、80%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列。在一些實施例中，環氧化物水解酶包括或組成為SEQ ID NO: 38或40中所闡述之序列。 角鯊烯之一些製造方法以便製造羅漢果醇
角鯊烯為可在植物及動物中產生的天然30碳有機分子且為類固醇家族之生化前驅體。另外，角鯊烯可用作宿主重組細胞中活體內羅漢果醇合成之前驅體。角鯊烯末端雙鍵中之一者之氧化（經由角鯊烯單加氧酶）產生2,3-角鯊烯氧化物，其發生酶催化之環化，得到羊毛甾醇，羊毛甾醇隨後被加工成膽固醇及其他類固醇。如格魯查塔卡等人（「酵母中電腦模擬預測代謝工程化策略之活體內驗證：破壞α-酮戊二酸去氫酶及ATP-檸檬酸解離酶之表現用於萜類產生（In Vivo Validation of In Silico Predicted Metabolic Engineering Strategies in Yeast: Disruption of α-Ketoglutarate Dehydrogenase and Expression of ATP-Citrate Lyase for Terpenoid Production）」. 公共科學圖書館·綜合（PLOS ONE） 2015年12月23日；以全文引用的方式併入本文中）中所述，角鯊烯之合成可以首先從糖酵解循環之前驅體進行以產生角鯊烯。角鯊烯轉而可以藉由ATP-檸檬酸解離酶之過度表現正調節以增加角鯊烯之產生。本文中所揭露之一些實施例包含用於在例如重組酵母細胞之重組宿主細胞中產生角鯊烯及/或增強角鯊烯之產生的酶。ATP檸檬酸解離酶亦可介導乙醯輔酶A合成，其可用於角鯊烯及甲羥戊酸酯產生，如在釀酒酵母這種酵母中所見（羅得里格斯（Rodrigues）等人 「ATP檸檬酸解離酶介導之胞質乙醯輔酶A生物合成增加釀酒酵母中之甲羥戊酸酯產生（ATP citrate lyase mediated cytosolic acetyl-CoA biosynthesis increases mevalonate production inSaccharomyces cerevisiae ）」 微生物細胞工廠 2016; 15: 48.；以全文引用的方式併入本文中）。編碼用於介導乙醯輔酶A合成之酶之基因的實例闡述於SEQ ID NO: 130中。在本文中之一些實施例中，重組細胞包括用於介導乙醯輔酶A合成之序列。
本文中所揭露之一些實施例提供用於製造具有以下結構之化合物1的方法：（1 ）。
在一些實施例中，方法更包括產生用於活體內產生化合物1之途徑中之中間體。在一些實施例中，產生化合物1之重組宿主細胞包括至少一種能夠轉化二氧化角鯊烯以產生24,25環氧葫蘆二烯醇、將氧化角鯊烯轉化為葫蘆二烯醇、催化24,25-環氧葫蘆二烯醇羥基化為11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇之酶、催化葫蘆二烯醇羥基化為11-羥基-葫蘆二烯醇之酶、使葫蘆二烯醇環氧化為24,25環氧葫蘆二烯醇之酶、能夠催化11-羥基-葫蘆二烯醇之環氧化以產生11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇之酶、將11-羥基-葫蘆二烯醇轉化為11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇之酶、催化11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇之轉化以產生羅漢果醇之酶及/或催化羅漢果苷前驅體之糖基化以產生羅漢果苷化合物之酶。在一些實施例中，用於糖基化之酶由SEQ ID NO: 121、122、123以及124中之任一者中所闡述之序列編碼。
在一些實施例中，用於催化24,25環氧葫蘆二烯醇羥基化以形成11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇的酶為CYP5491。在一些實施例中，CYP5491包括SEQ ID NO: 49中所闡述之序列。在一些實施例中，角鯊烯環氧酶包括與SEQ ID NO: 54之序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列。
在一些實施例中，能夠使11-羥基葫蘆二烯醇環氧化之酶包括SEQ ID NO: 74中所闡述之胺基酸序列。
在一些替代方案中，重組細胞包括用於表現能夠進行下述者之酶的基因：將二氧化角鯊烯轉化為24,25環氧葫蘆二烯醇、將氧化角鯊烯轉化為葫蘆二烯醇、使24,25環氧葫蘆二烯醇羥基化為11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇、使葫蘆二烯醇羥基化以產生11-羥基-葫蘆二烯醇、使葫蘆二烯醇環氧化以產生24,25環氧葫蘆二烯醇及/或使11-羥基葫蘆二烯醇環氧化以產生11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇。在本文中之這些實施例中，中間體及羅漢果苷活體內產生。
在一些實施例中，化合物1之製造方法更包括製造羅漢果苷化合物及中間體中之一或多者，諸如氧化角鯊烯、二氧化角鯊烯、葫蘆二烯醇、24,25環氧葫蘆二烯醇、11-羥基-葫蘆二烯醇、11-羥基24,25環氧葫蘆二烯醇、羅漢果醇以及羅漢果苷化合物。 羅漢果苷化合物之製造方法
本文所述之內容包含羅漢果苷化合物之製造方法，所述羅漢果苷化合物例如WO2014086842（以全文引用的方式併入本文中）中所述之羅漢果苷化合物中之一者。羅漢果苷化合物可被細胞用作中間體以進一步產生本文中所揭露之化合物1。
諸如微生物、植物細胞或植物之重組宿主可用於表現適用於生物合成羅漢果醇（三萜核心）及多種羅漢果醇糖苷（羅漢果苷）的多肽。
在一些實施例中，製造方法可以按任何順序包括以下步驟中之一或多者： （1）提高氧化角鯊烯之含量 （2）提高二氧化角鯊烯之含量 （3）氧化角鯊烯→葫蘆二烯醇 （4）二氧化角鯊烯→24,25環氧葫蘆二烯醇 （5）葫蘆二烯醇→11-羥基-葫蘆二烯醇 （6）24,25環氧葫蘆二烯醇→11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇 （7）11-羥基-葫蘆二烯醇→羅漢果醇 （8）11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇→羅漢果醇 （9）羅漢果醇→多種羅漢果苷化合物。
在本文中之實施例中，氧化角鯊烯、二氧化角鯊烯、葫蘆二烯醇、24,25環氧葫蘆二烯醇或羅漢果醇亦可以由重組細胞產生。方法可包含使重組微生物在培養基中在表現一或多種催化本發明方法步驟之酶的條件下生長，所述酶例如合成酶、水解酶、CYP450及/或UGT。重組微生物可以饋料批式（fed batch）或連續法生長。通常，為了提高化合物1之產量，使重組微生物在醱酵槽中在規定的溫度下生長所期望的一段時間。
在一些實施例中，羅漢果苷化合物可以使用全細胞產生，向全細胞饋入含有前驅體分子之原材料以提高化合物1之產量。原材料可以在細胞生長過程中或在細胞生長之後饋入。全細胞可以呈懸浮狀或固定。全細胞可以在醱酵液中或在反應緩衝液中。
在一些實施例中，重組宿主細胞可以包括編碼能夠催化氧化角鯊烯變成葫蘆二烯醇、葫蘆二烯醇變成11-羥基葫蘆二烯醇、11-羥基-葫蘆二烯醇變成羅漢果醇及/或羅漢果醇變成羅漢果苷之酶或酶混合物的異源核酸。在一些實施例中，細胞可以更包含編碼能夠催化二氧化角鯊烯變成24,25環氧葫蘆二烯醇、24,25環氧葫蘆二烯醇變成羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇、11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇變成羅漢果醇及/或羅漢果醇變成羅漢果苷之酶或酶混合物的異源核酸。
宿主細胞可以包括編碼葫蘆二烯醇合成酶之重組基因及/或編碼細胞色素P450多肽之重組基因。
在一些實施例中，細胞包括與SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327-333、420、422、424、426、446、902、904以及906（葫蘆二烯醇合成酶）中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的蛋白質。
在一些實施例中，氧化角鯊烯至葫蘆二烯醇之轉化由SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327-333、420、422、424、426、446、902、904以及906中之任一者之葫蘆二烯醇合成酶或與其共用至少70%、諸如至少80%、例如至少90%、諸如至少95%、例如至少98%序列一致性的功能同源物催化。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶多肽包括含有SEQ ID NO: 73中所闡述之序列的C端部分。在一些實施例中，編碼葫蘆二烯醇合成酶多肽之基因發生密碼子最佳化。在一些實施例中，經密碼子最佳化之基因包括SEQ ID NO: 74中所闡述之核酸序列。
在一些實施例中，葫蘆二烯醇至11-羥基-葫蘆二烯醇之轉化由SEQ ID NO: 49之CYP5491或與其共用至少70%、諸如至少80%、例如至少90%、諸如至少95%、例如至少98%序列一致性的功能同源物催化。
在一些實施例中，11-羥基-葫蘆二烯醇至羅漢果醇之轉化包括由下述者所構成的族群中選出的多肽：SEQ ID NO: 29之環氧化物水解酶1、SEQ ID NO: 30之環氧化物水解酶2以及前述環氧化物水解酶之與其共用至少70%、諸如至少80%、例如至少90%、諸如至少95%、例如至少98%序列一致性的功能同源物。在一些實施例中，編碼環氧化物水解酶1及環氧化物水解酶2之基因針對表現進行密碼子最佳化。在一些實施例中，用於環氧化物水解酶之經密碼子最佳化之基因包括SEQ ID NO: 114或115中所闡述之核酸序列。
在一些實施例中，環氧化物水解酶包括如SEQ ID NO: 21-28中之任一者中所闡述之胺基酸序列（伊特金等人，以全文引用的方式併入本文中）。
在一些實施例中，在宿主重組細胞中羅漢果醇至羅漢果苷之轉化由一或多種由下述者所構成的族群中選出的UGT催化：SEQ ID NO: 15之UGT1576、SEQ ID NO: 9之UGT98、SEQ ID NO: 68之UGT SK98以及前述UGT之與其共用至少70%、諸如至少80%、例如至少90%、諸如至少95%、例如至少98%序列一致性的功能同源物。
在一些實施例中，宿主重組細胞包括編碼細胞色素P450多肽之重組基因，所述細胞色素P450多肽由SEQ ID NO: 31-48、316、431、871、873、875、877、879、881、883、885、887以及891中之序列中之任一者編碼。
在一些實施例中，宿主重組細胞包括編碼角鯊烯環氧酶多肽之重組基因，所述角鯊烯環氧酶多肽包括SEQ ID No: 50中之序列。
在一些實施例中，宿主重組細胞包括編碼SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327-333、420、422、424、426、446、902、904以及906中之任一者之葫蘆二烯醇合成酶多肽的重組基因。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶多肽包括含有SEQ ID NO: 73中所闡述之序列的C端部分。在一些實施例中，編碼葫蘆二烯醇合成酶多肽之基因發生密碼子最佳化。在一些實施例中，經密碼子最佳化之基因包括SEQ ID NO: 74中所闡述之核酸序列。 由羅漢果醇製造羅漢果苷化合物
在一些實施例中，化合物1之製造方法包括使羅漢果苷IIIE與能夠催化羅漢果苷IIIE產生化合物1之第一酶接觸。在一些實施例中，方法在活體內進行，其中重組細胞包括編碼能夠催化羅漢果苷IIIE產生化合物1之第一酶的基因。在一些實施例中，細胞更包括編碼能夠催化羅漢果醇產生羅漢果苷IE1之酶的基因。在一些實施例中，酶包括SEQ ID NO: 4-8中之任一者中所闡述之序列。
在一些實施例中，細胞更包括用於將羅漢果苷IIE轉化為羅漢果苷IV、羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V以及賽門苷I之酶。在一些實施例中，用於將羅漢果苷IIE轉化為羅漢果苷IV、羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V以及賽門苷I之酶由包括SEQ ID NO: 9-14及116-120中所闡述之核酸序列的基因編碼。在一些實施例中，化合物1之製造方法包括用葡萄糖轉移酶UGT76G1處理羅漢果苷IIIE 。
在一些實施例中，方法包括在HPLC管柱上分級來自重組細胞之溶解產物且收集包括化合物1之溶離部分。
在一些實施例中，方法包括使羅漢果苷IIIE與能夠催化羅漢果苷IIIE產生化合物1之第一酶接觸。在一些實施例中，使羅漢果苷IIIE與第一酶接觸包括使羅漢果苷IIIE與包括編碼第一酶之第一基因的重組宿主細胞接觸。在一些實施例中，第一基因與重組宿主細胞異源。在一些實施例中，羅漢果苷IIIE與包括編碼第一酶之第一多核苷酸的重組宿主細胞中之第一酶接觸。在一些實施例中，羅漢果苷IIIE存在於重組宿主細胞中。在一些實施例中，羅漢果苷IIIE由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，方法包括在培養基中在表現第一酶之條件下培養重組宿主細胞。在一些實施例中，第一酶為UDP糖基轉移酶、環麥芽糊精葡聚糖轉移酶（CGTase）、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。在一些實施例中，第一酶為CGTase。在一些實施例中，CGTase包括與SEQ ID NO: 1、3、78-101、148以及154中之任一者之序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，轉葡萄糖苷酶由SEQ ID NO: 163-290及723中之任一者編碼。在一些實施例中，CGTase包括或組成為SEQ ID NO: 1、3、78-101、148以及154中之任一者中所闡述之序列。在一些實施例中，第一酶為聚葡萄糖蔗糖酶。在一些實施例中，聚葡萄糖蔗糖酶包括與SEQ ID NO: 2、103、106-110、156以及896中之任一者之序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DexT包括SEQ ID NO: 2、103、106-110、156以及896中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，DexT包括SEQ ID NO: 104或105中所闡述之核酸序列。在一些實施例中，聚葡萄糖蔗糖酶包括SEQ ID NO: 2或106-110之胺基酸序列。在一些實施例中，第一酶為轉葡萄糖苷酶。在一些實施例中，轉葡萄糖苷酶包括與SEQ ID NO: 3163-291及723中之任一者之序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，轉葡萄糖苷酶包括SEQ ID NO: 163-291及723之胺基酸序列。在一些實施例中，轉葡萄糖苷酶由SEQ ID NO: 163-291及723中之任一者編碼。在一些實施例中，轉葡萄糖苷酶包括由SEQ ID NO: 163-290及723中之任一者闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，基因編碼包括SEQ ID NO: 1、3、78-101以及154中所闡述之序列中之任一者的CGTase。
在一些實施例中，方法包括使羅漢果苷IIA與用於產生羅漢果苷IIIE之重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞更包括編碼能夠催化羅漢果苷IIA產生羅漢果苷IIIE之第二酶的第二基因。在一些實施例中，羅漢果苷IIA由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，第二酶為UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。在一些實施例中，第二酶為尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶（UGT）。在一些實施例中，轉葡萄糖苷酶包括由SEQ ID NO: 163-290及723中之任一者闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，基因編碼包括SEQ ID NO: 1、3、78-101、148以及154中所闡述之胺基酸序列的CGTase。在一些實施例中，UGT為UGT73C3（SEQ ID NO: 4）、UGT73C6（SEQ ID NO: 5、444或445)、85C2（SEQ ID NO: 6）、UGT73C5（SEQ ID NO: 7）、UGT73E1（SEQ ID NO: 8）、UGT98（SEQ ID NO: 9或407) 、UGT1576（SEQ ID NO: 15）、UGT SK98（SEQ ID NO: 16）、UGT430（SEQ ID NO: 17）、UGT1697（SEQ ID NO: 18)或UGT11789（SEQ ID NO: 19)，或SEQ ID NO: 4、5、7-9、15-19、125、126、128、129、293-304、306、307、407、439、441以及444中之任一者。在一些實施例中，UGT由UGT1495（SEQ ID NO: 10）、UGT1817（SEQ ID NO: 11）、UGT5914（SEQ ID NO: 12）、UGT8468（SEQ ID NO: 13）或UGT10391（SEQ ID NO: 14）中所闡述之基因編碼。
在一些實施例中，方法包括使羅漢果醇與用於產生羅漢果苷IIIE之重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞更包括編碼一或多種能夠催化羅漢果醇產生羅漢果苷IIIE之酶的一或多個基因。在一些實施例中，羅漢果醇由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，一或多種酶包括UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。在一些實施例中，第二酶為尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶（UGT）。在一些實施例中，UGT為UGT73C3、UGT73C6、85C2、UGT73C5、UGT73E1、UGT98、UGT1495、UGT1817、UGT5914、UGT8468、UGT10391、UGT1576、UGT SK98、UGT430、UGT1697或UGT11789。
在一些實施例中，方法包括使羅漢果苷化合物與用於產生羅漢果苷IIIE之重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞更包括編碼一或多種能夠催化羅漢果苷化合物產生羅漢果苷IIIE之酶的一或多個基因，其中羅漢果苷化合物為羅漢果苷IA1、羅漢果苷IE1、羅漢果苷IIA1、羅漢果苷IIE、羅漢果苷IIIA1、羅漢果苷IIIA2、羅漢果苷III、羅漢果苷IV、羅漢果苷IVA、羅漢果苷V或賽門苷中之一或多者。在一些實施例中，羅漢果苷化合物由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，一或多種酶包括UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。在一些實施例中，轉葡萄糖苷酶包括由SEQ ID NO: 163-290及723中之任一者闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，基因編碼包括SEQ ID NO: 1、3、78-101、148以及154中所闡述之胺基酸序列的CGTase。在一些實施例中，方法包括使羅漢果苷IA1與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼UGT98或UGT SK98之基因。在一些實施例中，UGT98或UGT SK98酶包括與SEQ ID NO: 9、407或16具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，接觸引起在細胞中產生羅漢果苷IIA。在一些實施例中，一或多種酶包括由SEQ ID NO: 1、3、78-101、106-109、147、154、163-303、405、411、354-405、447-723、770、776以及782中之任一者所闡述之胺基酸。
在一些實施例中，方法更包括使11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞更包括編碼環氧化物水解酶之第三基因。在一些實施例中，11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，方法更包括使11-羥基-葫蘆二烯醇與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼細胞色素P450或環氧化物水解酶之第四基因。在一些實施例中，P450多肽在包括SEQ ID NO: 31-48、316、431、871、873、875、877、879、881、883、885、887以及891中之任一者中所闡述之序列的基因中編碼。在一些實施例中，11-羥基-葫蘆二烯醇由重組宿主細胞產生。
在一些實施例中，方法更包括使3,24,25-三羥基葫蘆二烯醇與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞更包括編碼細胞色素P450之第五基因。在一些實施例中，P450多肽在包括SEQ ID NO: 31-48、316以及318中之任一者中所闡述之序列的基因中編碼。在一些實施例中，3,24,25-三羥基葫蘆二烯醇由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，接觸引起在重組宿主細胞中產生羅漢果醇。在一些實施例中，細胞色素P450包括與SEQ ID NO: 20、308或315具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，P450多肽在包括SEQ ID NO: 31-48、316、431、871、873、875、877、879、881、883、885、887以及891中之任一者中所闡述之序列的基因中編碼。在一些實施例中，環氧化物水解酶包括與SEQ ID NO: 21-30及309-314中之任一者具有至少70%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，方法更包括使葫蘆二烯醇與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼細胞色素P450之基因。在一些實施例中，接觸引起11-葫蘆二烯醇之產生。在一些實施例中，11-羥基葫蘆二烯醇在包括編碼CYP87D18或SgCPR蛋白質之基因的細胞中表現。在一些實施例中，CYP87D18或SgCPR包括SEQ ID NO: 315、872或874中所闡述之序列。在一些實施例中，CYP87D18或SgCPR由SEQ ID NO: 316、871或873編碼。在一些實施例中，葫蘆二烯醇由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，編碼細胞色素P450之基因包括與SEQ ID No: 31-48、316、431、871、873、875、877、879、881、883、885、887以及891中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，細胞色素P450包括與SEQ ID NO: 31-48、316、431、871、873、875、877、879、881、883、885、887以及891具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，P450多肽在包括SEQ ID NO: 31-48、316、431、871、873、875、877、879、881、883、885、887以及891中之任一者中所闡述之序列的基因中編碼。
在一些實施例中，方法更包括使2,3-氧化角鯊烯與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼葫蘆二烯醇合成酶之第七基因。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶包括SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327-333、420、422、424、426、446、902、904或906中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶由SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903以及905中所闡述之序列中之任一者編碼。在一些實施例中，接觸引起葫蘆二烯醇之產生。在一些實施例中，2,3-氧化角鯊烯由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，2,3-氧化角鯊烯或二環氧角鯊烯由包括SEQ ID NO: 898或900中所闡述之序列的酶產生。在一些實施例中，2,3-氧化角鯊烯或二環氧角鯊烯由一種酶產生，所述酶由SEQ ID NO: 897或899中所闡述之核酸序列編碼。
在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶由包括SEQ ID NO: 74中所闡述之序列的基因編碼。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶由一種基因編碼，所述基因包括SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903以及905中之任一者中所闡述之核酸序列。在一些實施例中，11-羥基葫蘆二烯醇由細胞產生。在一些實施例中，11-OH葫蘆二烯醇在包括編碼CYP87D18或SgCPR蛋白質之基因的細胞中表現。在一些實施例中，CYP87D18或SgCPR包括SEQ ID NO: 315、872或874中所闡述之序列。在一些實施例中，CYP87D18或SgCPR由SEQ ID NO: 316、871或873編碼。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶多肽包括含有SEQ ID NO: 73中所闡述之序列的C端部分。在一些實施例中，編碼葫蘆二烯醇合成酶多肽之基因發生密碼子最佳化。在一些實施例中，經密碼子最佳化之基因包括SEQ ID NO: 74中所闡述之核酸序列。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶包括與SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327-333、420、422、424、426、446、902、904以及906（其包含例如來自美國南瓜、羅漢果、胡瓜、厚皮甜瓜、中國南瓜以及筍瓜之葫蘆二烯醇合成酶）中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶多肽包括含有SEQ ID NO: 73中所闡述之序列的C端部分。在一些實施例中，編碼葫蘆二烯醇合成酶多肽之基因發生密碼子最佳化。在一些實施例中，經密碼子最佳化之基因包括SEQ ID NO: 74中所闡述之核酸序列。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶包括含有來自下述者之多肽的胺基酸：百脈根（BAE53431）、毛果楊（Populus trichocarpa ）（XP_002310905）、總狀升麻（Actaea racemosa ）（ADC84219）、白樺（Betula platyphylla ）（BAB83085）、洋甘草（BAA76902）、釀酒葡萄（Vitis vinifera ）（XP_002264289）、雷公根（Centella asiatica ）（AAS01524）、人參（Panax ginseng ）（BAA33460）以及白樺（BAB83086），如以全文引用的方式併入本文中的WO 2016/050890中所述。
在一些實施例中，方法包括使角鯊烯與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼角鯊烯環氧酶之第八基因。在一些實施例中，接觸引起2,3-氧化角鯊烯之產生。在一些實施例中，角鯊烯由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，角鯊烯環氧酶包括與SEQ ID NO: 50-56、60、61、334或335具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，方法包括使焦磷酸法呢酯與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼角鯊烯合成酶之第九基因。在一些實施例中，接觸引起角鯊烯之產生。在一些實施例中，焦磷酸法呢酯由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，角鯊烯合成酶包括與SEQ ID NO: 69或336具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，方法更包括使香葉基-PP與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼法呢基-PP合成酶之第十基因。在一些實施例中，接觸引起法呢基-PP之產生。在一些實施例中，香葉基-PP由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，法呢基-PP合成酶包括與SEQ ID NO: 338具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，第一基因、第二基因、第三基因、第四基因、第五基因、第六基因、第七基因、第八基因、第九基因以及第十基因中之一或多者可操作地連接於異源啟動子。在一些實施例中，異源啟動子為CMV、EF1a、SV40、PGK1、人類β肌動蛋白、CAG、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、CaMV35S、Ubi、T7、T7lac、Sp6、araBAD、trp、lac、Ptac、pL啟動子或其組合。在一些實施例中，啟動子為可誘導型啟動子、可抑制型啟動子或持續性表現型啟動子。在一些實施例中，重組宿主細胞中之丙酮酸鹽、乙醯輔酶A、檸檬酸鹽以及TCA循環中間體中之一或多者的產生已被正調節。在一些實施例中，重組宿主細胞中之胞質定位已被正調節。在一些實施例中，第一基因、第二基因、第三基因、第四基因、第五基因、第六基因、第七基因、第八基因、第九基因以及第十基因中之一或多者包括至少一個編碼2A自裂解肽之序列。如本文所用之術語第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十以及類似術語不表示特定順序及/或要求存在更早的序號。舉例而言，本文所述之重組宿主細胞可以包括第一基因及第三基因，但不包括第二基因。作為另一實例，重組宿主細胞可以包括第一基因、第五基因以及第十基因，但不包括第二基因、第三基因、第四基因、第六基因、第七基因、第八基因以及第九基因。
重組宿主細胞可為例如植物細胞、雙殼貝類細胞、魚細胞、真菌細胞、細菌細胞或哺乳動物細胞。舉例而言，植物由下述者中選出：羅漢果屬、苦瓜屬、絞股藍屬、南瓜屬、甜瓜屬、芥菜屬、蒿屬、甜菊屬、人參屬、睡茄屬、大戟屬、苜蓿屬、吊蘭屬、五加屬、楤木屬、桑屬、苜蓿屬、樺屬、黃耆屬、麻風樹屬、山茶屬、柳蕈屬、麴菌屬、茄屬、石杉屬、假繁縷屬、黃麻屬、常春藤屬、地錢屬以及桑屬。在一些實施例中，真菌由下述者中選出：髮癬菌屬、桑黃屬、台芝屬、鏈疫孢屬、盤二孢屬、色二孢黴屬、香菇屬、法夫酵母屬、普克尼亞屬、刺盤孢屬、間座殼屬、組織胞漿菌屬、球孢子菌屬、組織胞漿菌屬、桑黃屬、短梗黴屬、普克尼亞屬、青黴菌屬、孢子絲菌屬、黑殭菌屬、麴菌屬、耶氏酵母屬以及油脂酵母屬。在一些實施例中，真菌為小巢狀麴菌、解脂耶氏酵母或圓紅冬孢酵母。在一些實施例中，重組宿主細胞為酵母細胞。在一些實施例中，酵母由下述者中選出：念珠菌屬、酵母屬、酵母亞門、外囊菌亞門、裂殖酵母綱、駒形氏酵母屬、擔子菌門、傘菌亞門、銀耳綱、柄鏽菌亞門、短梗黴屬、錐毛殼屬、紅冬孢酵母屬以及微球黑粉菌綱。在一些實施例中，細菌由下述者中選出：弗蘭克氏菌屬、放線菌門、鏈黴菌屬、腸球菌屬。在一些實施例中，細菌為糞腸球菌。在一些實施例中，第一基因、第二基因、第三基因、第四基因、第五基因、第六基因、第七基因、第八基因、第九基因以及第十基因中之一或多者已針對在細菌細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、真菌細胞或昆蟲細胞中之表現發生密碼子最佳化。在一些實施例中，第一基因、第二基因、第三基因、第四基因、第五基因、第六基因、第七基因、第八基因、第九基因以及第十基因中之一或多者包括功能突變以提高所編碼之酶的活性。在一些實施例中，培養重組宿主細胞包括針對培養條件之pH、溶解氧含量、氮含量或其組合來監測所述培養。在一些實施例中，方法包括分離化合物1。在一些實施例中，分離化合物1包括溶解重組宿主細胞。在一些實施例中，分離化合物1包括自培養基分離化合物1。在一些實施例中，方法包括純化化合物1。在一些實施例中，純化化合物1包括HPLC、固相萃取或其組合。在一些實施例中，純化包括收集重組細胞、保留上清液以及溶解細胞。在一些實施例中，溶解包括使細胞受到剪切力或清潔劑洗滌，從而獲得溶解產物。在一些實施例中，剪切力來自音波處理方法、弗氏壓碎細胞或珠粒。在一些實施例中，對溶解產物進行過濾及純化步驟。在一些實施例中，過濾溶解產物且藉由固相萃取來純化。
在一些實施例中，提供具有化合物1之結構的化合物（1 ），其中化合物由本文所提供之替代方法中之任一者之方法產生。
在一些實施例中，提供一種細胞溶解產物，其包括具有以下結構之化合物1：（1 ）。
在一些實施例中，提供一種重組細胞，其包括：具有以下結構之化合物1：（1 ），及編碼能夠催化羅漢果苷IIIE產生化合物1之酶的基因。在一些實施例中，基因為重組細胞之異源基因。
在一些實施例中，提供一種重組細胞，其包括第一基因，所述第一基因編碼第一酶，所述第一酶能夠催化羅漢果苷IIIE產生具有以下結構之化合物1：（1 ）。在一些實施例中，第一酶包括與SEQ ID NO: 1、3、78-101、148或154具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列（CGTase）。在一些實施例中，第一酶包括SEQ ID NO: 1、3、78-101、148或154之胺基酸序列（CGTase）。在一些實施例中，第一酶為聚葡萄糖蔗糖酶。在一些實施例中，聚葡萄糖蔗糖酶包括或組成為與SEQ ID NO: 2、103、106-110、156以及896中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，聚葡萄糖蔗糖酶包括或組成為SEQ ID NO: 2、103、104或105之胺基酸序列。在一些實施例中，聚葡萄糖蔗糖酶包括或組成為SEQ ID NO: 2、103-110及156-162以及896中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，DexT包括SEQ ID NO: 104或105中所闡述之核酸序列。在一些實施例中，第一酶為轉葡萄糖苷酶。在一些實施例中，轉葡萄糖苷酶包括與SEQ ID NO: 201或SEQ ID NO: 291之序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，重組細胞更包括編碼尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶（UGT）之第二基因。在一些實施例中，UGT包括與SEQ ID NO: 4、5、6、7、8、9、15、16、17、18以及19中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，UGT包括或組成為SEQ ID NO: 4、5、6、7、8、9、15、16、17以及18中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，UGT由UGT1495（SEQ ID NO: 10）、UGT1817（SEQ ID NO: 11）、UGT5914（SEQ ID NO: 12）、UGT8468（SEQ ID NO: 13）或UGT10391（SEQ ID NO: 14）中所闡述之序列編碼。在一些實施例中，細胞包括編碼UGT98或UGT SK98之第三基因。在一些實施例中，UGT98或UGT SK98包括與SEQ ID NO: 9、407或16具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，細胞包括編碼環氧化物水解酶之第四基因。在一些實施例中，環氧化物水解酶包括與SEQ ID NO: 21-30及309-314中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，細胞包括編碼P450之第五序列。在一些實施例中，P450包括與SEQ ID NO: 20、49、308、315或317具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，P450由包括SEQ ID NO: 31-48、316、431、871、873、875、877、879、881、883、885、887以及891中之任一者中所闡述之序列的基因編碼。在一些實施例中，更包括編碼葫蘆二烯醇合成酶之第六序列。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶包括與SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327-333、420、422、424、426、446、902、904以及906中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶多肽包括含有SEQ ID NO: 73中所闡述之序列的C端部分。在一些實施例中，編碼葫蘆二烯醇合成酶多肽之基因發生密碼子最佳化。在一些實施例中，經密碼子最佳化之基因包括SEQ ID NO: 74中所闡述之核酸序列。在一些實施例中，細胞更包括編碼角鯊烯環氧酶之第七基因。在一些實施例中，角鯊烯環氧酶包括與SEQ ID NO: 50-56、60、61、334以及335中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，細胞更包括編碼角鯊烯合成酶之第八基因。在一些實施例中，第八基因包括與SEQ ID NO: 69或SEQ ID NO: 336具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，細胞更包括編碼法呢基-PP合成酶之第九基因。在一些實施例中，法呢基-PP合成酶包括與SEQ ID NO: 338具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞、細菌細胞、真菌細胞或昆蟲細胞。在一些實施例中，細胞為酵母細胞。酵母之非限制性實例包含念珠菌屬、酵母屬、酵母亞門、外囊菌亞門、裂殖酵母綱、駒形氏酵母屬、擔子菌門、傘菌亞門、銀耳綱、柄鏽菌亞門、短梗黴屬、錐毛殼屬以及微球黑粉菌綱。在一些實施例中，植物由以下所構成的族群中選出：羅漢果屬、苦瓜屬、絞股藍屬、南瓜屬、甜瓜屬、芥菜屬、蒿屬、甜菊屬、人參屬、睡茄屬、大戟屬、苜蓿屬、吊蘭屬、五加屬、楤木屬、桑屬、苜蓿屬、樺屬、黃耆屬、麻風樹屬、山茶屬、柳蕈屬、麴菌屬、茄屬、石杉屬、假繁縷屬、黃麻屬、常春藤屬、地錢屬以及桑屬。在一些實施例中，真菌為髮癬菌屬、桑黃屬、台芝屬、鏈疫孢屬、盤二孢屬、色二孢黴屬、香菇屬、法夫酵母屬、普克尼亞屬、刺盤孢屬、間座殼屬、組織胞漿菌屬、球孢子菌屬、組織胞漿菌屬、桑黃屬、短梗黴屬、普克尼亞屬、青黴菌屬、孢子絲菌屬或黑殭菌屬。
在一些實施例中，細胞包括SEQ ID NO: 897、899、909、911、913、418、421、423、425、427、871、873、901、903或905中之任一者中所闡述之酶的序列。在一些實施例中，酶包括下述者中所闡述之序列或由下述者編碼：SEQ ID NO: 420、422、424、426、446、872、874-896、898、900、902、904、906、908、910、912以及951-1012中之序列。
在一些實施例中，DNA可以經由基因合成獲得。基因合成可以例如藉由Genescript或IDT進行。DNA可以經由標準分子生物學技術選殖至過度表現載體中，過度表現載體諸如：例如pQE1、pGEX-4t3、pDest-17、pET系列、pFASTBAC。可使用大腸桿菌宿主菌株，在OD600為1下使用1 mM IPTG誘導來產生酶（亦即Top10或BL21系列+/-密碼子增強版（codon plus））。大腸桿菌菌株可以在37℃，250轉/分鐘（rpm）下繁殖且在誘導過程中切換至室溫或30℃（150轉/分鐘）。當指定時，一些酶亦可經由SF9昆蟲細胞株，使用pFASTBAC及最佳化之MOI表現。含有酶之粗提取物可以經由音波處理產生且將其用於本文所述之反應。所有UDP-糖基轉移酶反應皆含有蔗糖合成酶，且可經由基因合成自阿拉伯芥獲得且在大腸桿菌中表現。 高糖基化羅漢果苷水解產生化合物1
在一些實施例中，可使高糖基化羅漢果苷水解產生化合物1。高糖基化羅漢果苷之非限制性實例包含羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。能夠催化水解過程以產生化合物1之酶可為例如CGTase（例如，在無澱粉之情況下展示水解）、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、轉葡萄糖苷酶、澱粉酶、果膠酶、聚葡萄糖酶以及真菌乳糖酶。這些酶中之一些的胺基酸序列及編碼這些酶中之一些的核酸序列可見於表1中。
在一些實施例中，化合物1展示對重組細胞中之水解酶的耐受性，其中水解酶展示將羅漢果苷VI、羅漢果苷V、羅漢果苷IV水解為羅漢果苷IIIE之能力。化合物1中所存在之α連接之糖苷因為其對水解之耐受性，所以相對於其他羅漢果苷（β-連接之糖苷）提供獨特優勢。在微生物產生化合物1之過程中，重組宿主細胞（例如微生物宿主細胞）可以將不想要的β-連接之羅漢果苷水解回到羅漢果苷IIIE。不受任何特定理論的限制，咸信由宿主細胞進行之水解能夠改善化合物1之純度，因為：1）不想要的羅漢果苷VI、羅漢果苷V以及羅漢果苷IV之含量降低；及/或2）水解將提高可用作用於製造化合物1之前驅體的羅漢果苷IIIE之量。 羅漢果苷化合物之純化
一些實施例包括分離羅漢果苷化合物，例如化合物1。在一些實施例中，分離化合物1包括溶解重組宿主細胞。在一些實施例中，分離化合物1包括自培養基分離化合物1。在一些實施例中，方法更包括純化化合物1。在一些實施例中，純化化合物1包括HPLC、固相萃取或其組合。在一些實施例中，純化包括收集重組細胞、保留上清液以及溶解細胞。在一些實施例中，溶解包括使細胞受到剪切力或清潔劑洗滌，從而獲得溶解產物。在一些實施例中，剪切力來自音波處理方法、弗氏壓碎細胞或珠粒。在一些實施例中，對溶解產物進行過濾及純化步驟。在一些實施例中，過濾溶解產物且藉由固相萃取來純化。溶解產物隨後可過濾且用硫酸銨處理以移除蛋白質，且在C18 HPLC（5×10公分 Atlantis製備型T3 OBD管柱，5微米，沃特世）上分級且在30分鐘內使用10% → 30% B之A/B梯度（A = 水 B = 乙腈）注射，以95% B洗滌，接著在1%下再平衡（總操作時間=42分鐘）。各輪以30毫升/部分收集在已稱皮重的管中（12部分/板，3板/輪）。亦可使溶解產物離心以移除固體及微粒物質。板隨後可在Genevac HT12/HT24中乾燥。所要化合物預期與其他異構體一起溶離於部分21中。經合併之部分可以在氟苯基HPLC管柱（3×10公分，Xselect氟苯基OBD管柱，5微米，沃特世）上進一步分級47輪，在35分鐘內使用15% → 30% B之A/B梯度（A = 水，B = 乙腈），以95% B洗滌，接著在15%下再平衡（總操作時間=45分鐘）。各輪以30毫升/部分收集於12根已稱皮重的管中（12部分/板，1板/輪）。可以基於UPLC分析合併含有所要的具有所要純度之峰的部分且在減壓下乾燥以得到發白的粉末狀固體。可將純化合物再懸浮/溶解於10毫升水中且凍乾以獲得至少95%純度。
關於化合物1之純化，在一些實施例中，可以藉由固相萃取來純化化合物，固相萃取可免除HPLC。可將化合物1純化至或至約例如70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%純度或在由任兩個前述值所述之範圍內的任何純度水準。在一些實施例中，藉由固相萃取純化之化合物1與經HPLC純化之材料相同或基本上相同。在一些實施例中，方法包括在HPLC管柱上分級來自重組細胞之溶解產物且收集包括化合物1之溶離部分。 醱酵
宿主細胞可以如本文所述醱酵以產生化合物1。此亦可包含在存在或不存在空氣之情況下進行的方法且可在例如厭氧環境中進行。全細胞（例如重組宿主細胞）可在醱酵液中或在反應緩衝液中。
亦可用羅漢果（Monk fruit，Siraitia grosvenorii ）提取物接觸細胞以便產生化合物1。在一些實施例中，提供一種製造化合物1之方法。方法可以包括使羅漢果提取物與能夠催化羅漢果苷產生化合物1之第一酶接觸，所述羅漢果苷諸如羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。在一些實施例中，接觸包括使羅漢果醇果實提取物與包括編碼第一酶之第一基因的重組宿主細胞接觸。在一些實施例中，第一基因與重組宿主細胞異源。在一些實施例中，羅漢果醇果實提取物與包括編碼第一酶之第一多核苷酸的重組宿主細胞中之第一酶接觸。在一些實施例中，羅漢果苷IIIE在羅漢果醇果實提取物中。在一些實施例中，羅漢果苷IIIE亦由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，方法更包括在培養基中在表現第一酶之條件下培養重組宿主細胞。在一些實施例中，第一酶為UDP糖基轉移酶、環麥芽糊精葡聚糖轉移酶（CGTase）、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。在一些實施例中，第一酶為CGTase。舉例而言，CGTase可以包括與SEQ ID NO: 1、3、78-101、148以及154中之任一者之序列具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或超過99%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，CGTase包括SEQ ID NO: 1、3、78-101、148以及154中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，CGTase包括SEQ ID NO: 78-101中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，第一酶為聚葡萄糖蔗糖酶。在一些實施例中，聚葡萄糖蔗糖酶包括與SEQ ID NO: 2、103、106-110、156以及896中所闡述之序列中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，聚葡萄糖蔗糖酶包括SEQ ID NO: 2、103、106-110、156以及896中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，第一酶為轉葡萄糖苷酶。在一些實施例中，轉葡萄糖苷酶包括與SEQ ID NO: 163-290及723中之任一者之序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，轉葡萄糖苷酶包括SEQ ID NO: 163-290及723中之任一者的胺基酸序列。在一些實施例中，第一酶為β-葡萄糖苷酶。在一些實施例中，β葡萄糖苷酶包括SEQ ID NO: 292中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 292具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，羅漢果醇果實提取物包括羅漢果苷IIA且重組宿主細胞包括編碼能夠催化羅漢果苷IIA產生羅漢果苷IIIE之第二酶的第二基因。在一些實施例中，羅漢果苷IIA亦由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，第二酶為UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。在一些實施例中，第二酶為尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶（UGT）。在一些實施例中，UGT為UGT73C3（SEQ ID NO: 4）、UGT73C6（SEQ ID NO: 5、444或445)、85C2（SEQ ID NO: 6）、UGT73C5（SEQ ID NO: 7）、UGT73E1（SEQ ID NO: 8）、UGT98（SEQ ID NO: 9或407) 、UGT1576（SEQ ID NO: 15）、UGT SK98（SEQ ID NO: 16）、UGT430（SEQ ID NO: 17）、UGT1697（SEQ ID NO: 18）、UGT11789（SEQ ID NO: 19），或包括與UGT73C3（SEQ ID NO: 4）、UGT73C6（SEQ ID NO: 5、444或445）、85C2（SEQ ID NO: 6）、UGT73C5（SEQ ID NO: 7）、UGT73E1（SEQ ID NO: 8）、UGT98（SEQ ID NO: 9或407）、UGT1576（SEQ ID NO: 15）、UGT SK98（SEQ ID NO: 16）、UGT430（SEQ ID NO: 17）、UGT1697（SEQ ID NO: 18）、UGT11789（SEQ ID NO: 19）具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，UGT由UGT1495（SEQ ID NO: 10）、UGT1817（SEQ ID NO: 11）、UGT5914（SEQ ID NO: 12）、UGT8468（SEQ ID NO: 13）或UGT10391（SEQ ID NO: 14）中所闡述之基因編碼。在一些實施例中，羅漢果提取物包括羅漢果醇。在一些實施例中，方法更包括接觸羅漢果提取物之羅漢果醇，其中重組宿主細胞更包括編碼一或多種能夠催化羅漢果醇產生羅漢果苷IIIE之酶的一或多個基因。在一些實施例中，羅漢果醇亦由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，一或多種酶包括UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。在一些實施例中，第二酶為尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶（UGT）。在一些實施例中，UGT為UGT73C3、UGT73C6、85C2、UGT73C5、UGT73E1、UGT98、UGT1495、UGT1817、UGT5914、UGT8468、UGT10391、UGT1576、UGT SK98、UGT430、UGT1697或UGT11789，或包括與那些UGT具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，方法更包括使羅漢果提取物與用於產生羅漢果苷IIIE之重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞更包括編碼一或多種能夠催化羅漢果苷化合物產生羅漢果苷IIIE之酶的一或多個基因，其中羅漢果苷化合物為羅漢果苷IA1、羅漢果苷IE1、羅漢果苷IIA1、羅漢果苷IIE、羅漢果苷IIA、羅漢果苷IIIA1、羅漢果苷IIIA2、羅漢果苷III、羅漢果苷IV、羅漢果苷IVA、羅漢果苷V或賽門苷中之一或多者。在一些實施例中，羅漢果苷化合物亦由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，一或多種酶包括UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。在一些實施例中，羅漢果苷化合物為羅漢果苷IIE。在一些實施例中，一或多種酶包括由SEQ ID NO: 293-303中之任一者闡述之胺基酸。在一些實施例中，羅漢果苷化合物為羅漢果苷IIA或羅漢果苷IIE，且其中羅漢果提取物與表現一或多種酶之重組細胞接觸產生羅漢果苷IIIA、羅漢果苷IVE以及羅漢果苷V。在一些實施例中，一或多種酶包括SEQ ID NO: 304中所闡述之胺基酸。在一些實施例中，一或多種酶由SEQ ID NO: 305中所闡述之序列編碼。在一些實施例中，羅漢果提取物包括羅漢果苷IA1。在一些實施例中，方法更包括使羅漢果提取物與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼UGT98或UGT SK98之基因。在一些實施例中，UGT98或UGT SK98酶包括與SEQ ID NO: 9、407、16或306具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，UGT98由SEQ ID NO: 307中所闡述之序列編碼。在一些實施例中，接觸引起在細胞中產生羅漢果苷IIA。在一些實施例中，羅漢果提取物包括11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇。在一些實施例中，方法更包括使羅漢果提取物與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞更包括編碼環氧化物水解酶之第三基因。在一些實施例中，11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇亦由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，方法更包括使羅漢果提取物與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼細胞色素P450或環氧化物水解酶之第四基因。在一些實施例中，11-羥基-葫蘆二烯醇亦由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，羅漢果提取物包括3,24,25-三羥基葫蘆二烯醇。在一些實施例中，方法更包括使羅漢果提取物與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞更包括編碼細胞色素P450之第五基因。在一些實施例中，3,24,25-三羥基葫蘆二烯醇亦由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，與羅漢果醇果實提取物接觸引起在重組宿主細胞中產生羅漢果醇。在一些實施例中，細胞色素P450包括與SEQ ID NO: 20或308具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，環氧化物水解酶包括與SEQ ID NO: 21-30及309-314中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，羅漢果提取物包括葫蘆二烯醇。在一些實施例中，方法更包括使葫蘆二烯醇與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼細胞色素P450之基因。在一些實施例中，接觸引起11-羥基葫蘆二烯醇之產生。在一些實施例中，11-羥基葫蘆二烯醇在包括編碼CYP87D18或SgCPR蛋白質之基因的細胞中表現。在一些實施例中，CYP87D18或SgCPR包括SEQ ID NO: 315、872或874中所闡述之序列。在一些實施例中，CYP87D18或SgCPR由SEQ ID NO: 316、871或873編碼。在一些實施例中，葫蘆二烯醇亦由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，編碼細胞色素P450之基因包括與SEQ ID No: 31-48、316、431、871、873、875、877、879、881、883、885、887以及891中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，細胞色素P450包括與SEQ ID NO: 20或49具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，羅漢果提取物包括2,3-氧化角鯊烯。在一些實施例中，方法更包括使羅漢果提取物之2,3-氧化角鯊烯與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼葫蘆二烯醇合成酶之第七基因。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶包括與SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327-333、420、422、424、426、446、902、904或906具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶由與SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903或905具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列編碼。在一些實施例中，羅漢果提取物包括羅漢果苷中間體，諸如羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。在一些實施例中，方法更包括使羅漢果苷中間體與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼葫蘆二烯醇合成酶之第七基因。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶包括與SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327-333、420、422、424、426、446、902、904或906具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶由與SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903或905具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列編碼。在一些實施例中，接觸引起葫蘆二烯醇之產生。在一些實施例中，2,3-氧化角鯊烯及二環氧角鯊烯亦由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，2,3-氧化角鯊烯或二環氧角鯊烯由一種酶產生，所述酶包括與SEQ ID NO: 898或900具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列，或包括SEQ ID NO: 898或900中所闡述之序列。在一些實施例中，2,3-氧化角鯊烯或二環氧角鯊烯由一種酶產生，所述酶由與SEQ ID NO: 897或899具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列編碼；或由SEQ ID NO: 897或899中所闡述之核酸編碼。
在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶包括與SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327-333、420、422、424、426、446、902、904以及906中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶為來自美國南瓜、羅漢果、胡瓜、厚皮甜瓜、中國南瓜或筍瓜之葫蘆二烯醇合成酶。在一些實施例中，葫蘆二烯醇合成酶由一種基因編碼，所述基因包括與SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903以及905中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列，或包括SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903以及905中之任一者中所闡述之核酸序列。在一些實施例中，11-OH葫蘆二烯醇由細胞產生。在一些實施例中，11-OH葫蘆二烯醇在包括編碼CYP87D18或SgCPR之基因的細胞中表現。在一些實施例中，CYP87D18或SgCPR包括與SEQ ID NO: 315、872或874具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列，或SEQ ID NO: 315、872或874中所闡述之序列。在一些實施例中，CYP87D18或SgCPR由與SEQ ID NO: 316、871或873具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的序列，或SEQ ID NO: 316、871或873中所闡述之序列編碼。在一些實施例中，羅漢果提取物包括角鯊烯。在一些實施例中，2,3-氧化角鯊烯或二環氧角鯊烯由一種酶產生，所述酶包括與SEQ ID NO: 898或900具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或超過99%之序列一致性的序列，或SEQ ID NO: 898或900中所闡述之序列。在一些實施例中，2,3-氧化角鯊烯或二環氧角鯊烯由一種酶產生，所述酶由與SEQ ID NO: 897或899具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的核酸序列，或SEQ ID NO: 897或899中所闡述之序列編碼。在一些實施例中，方法更包括使角鯊烯與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼角鯊烯環氧酶之第八基因。在一些實施例中，接觸引起2,3-氧化角鯊烯之產生。在一些實施例中，角鯊烯亦由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，角鯊烯環氧酶包括與SEQ ID NO: 50-56、60、61、334或335中之任一者具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%或在這些數值中之任兩者之間的範圍內的序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，角鯊烯環氧酶由SEQ ID NO: 335中所闡述之核酸序列編碼。在一些實施例中，羅漢果提取物包括焦磷酸法呢酯。在一些實施例中，方法更包括使焦磷酸法呢酯與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼角鯊烯合成酶之第九基因。在一些實施例中，接觸引起角鯊烯之產生。在一些實施例中，焦磷酸法呢酯亦由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，角鯊烯合成酶包括與SEQ ID NO: 69及336中之任一者具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或超過99%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，角鯊烯合成酶由包括SEQ ID NO: 337中所闡述之核酸序列的序列編碼。在一些實施例中，羅漢果提取物包括香葉基-PP。在一些實施例中，方法更包括使香葉基-PP與重組宿主細胞接觸，其中重組宿主細胞包括編碼法呢基-PP合成酶之第十基因。在一些實施例中，接觸引起法呢基-PP之產生。在一些實施例中，香葉基-PP亦由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，法呢基-PP合成酶包括與SEQ ID NO: 338具有至少70%、至少80%、至少最少90%、至少95%、至少98%、至少99%或超過99%之序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，法呢基-PP合成酶由SEQ ID NO: 339中所闡述之核酸序列編碼。在一些實施例中，第一基因、第二基因、第三基因、第四基因、第五基因、第六基因、第七基因、第八基因、第九基因以及第十基因中之一或多者可操作地連接於異源啟動子。在一些實施例中，異源啟動子為CMV、EF1a、SV40、PGK1、人類β肌動蛋白、CAG、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、CaMV35S、Ubi、T7、T7lac、Sp6、araBAD、trp、lac、Ptac、pL啟動子或其組合。在一些實施例中，啟動子為可誘導型啟動子、可抑制型啟動子或持續性表現型啟動子。在一些實施例中，重組宿主細胞中之丙酮酸鹽、乙醯輔酶A、檸檬酸鹽以及TCA循環中間體中之一或多者的產生已被正調節。在一些實施例中，重組宿主細胞中之胞質定位已被正調節。在一些實施例中，第一基因、第二基因、第三基因、第四基因、第五基因、第六基因、第七基因、第八基因、第九基因以及第十基因中之一或多者包括至少一個編碼2A自裂解肽之序列。在一些實施例中，重組宿主細胞為植物細胞、雙殼貝類細胞、魚細胞、真菌細胞、細菌細胞或哺乳動物細胞。在一些實施例中，植物由下述者中選出：羅漢果屬、苦瓜屬、絞股藍屬、南瓜屬、甜瓜屬、芥菜屬、蒿屬、甜菊屬、人參屬、睡茄屬、大戟屬、苜蓿屬、吊蘭屬、五加屬、楤木屬、桑屬、苜蓿屬、樺屬、黃耆屬、麻風樹屬、山茶屬、柳蕈屬、麴菌屬、茄屬、石杉屬、假繁縷屬、黃麻屬、常春藤屬、地錢屬以及桑屬。在一些實施例中，真菌由下述者中選出：髮癬菌屬、桑黃屬、台芝屬、鏈疫孢屬、盤二孢屬、色二孢黴屬、香菇屬、法夫酵母屬、普克尼亞屬、刺盤孢屬、間座殼屬、組織胞漿菌屬、球孢子菌屬、組織胞漿菌屬、桑黃屬、短梗黴屬、普克尼亞屬、青黴菌屬、孢子絲菌屬、黑殭菌屬、麴菌屬、耶氏酵母屬以及油脂酵母屬。在一些實施例中，真菌為小巢狀麴菌、解脂耶氏酵母或圓紅冬孢酵母。在一些實施例中，重組宿主細胞為酵母細胞。在一些實施例中，酵母由下述者中選出：念珠菌屬、酵母屬、酵母亞門、外囊菌亞門、裂殖酵母綱、駒形氏酵母屬、擔子菌門、傘菌亞門、銀耳綱、柄鏽菌亞門、短梗黴屬、錐毛殼屬、紅冬孢酵母屬以及微球黑粉菌綱。在一些實施例中，細菌由弗蘭克氏菌屬、放線菌門、鏈黴菌屬以及腸球菌屬所構成的族群中選出。在一些實施例中，細菌為糞腸球菌。在一些實施例中，第一基因、第二基因、第三基因、第四基因、第五基因、第六基因、第七基因、第八基因、第九基因以及第十基因中之一或多者已針對在細菌細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、真菌細胞或昆蟲細胞中之表現發生密碼子最佳化。在一些實施例中，第一基因、第二基因、第三基因、第四基因、第五基因、第六基因、第七基因、第八基因、第九基因以及第十基因中之一或多者包括功能突變以提高所編碼之酶的活性。在一些實施例中，培養重組宿主細胞包括針對培養條件之pH、溶解氧含量、氮含量或其組合來監測所述培養。在一些實施例中，方法包括分離化合物1。在一些實施例中，分離化合物1包括溶解重組宿主細胞。在一些實施例中，分離化合物1包括自培養基分離化合物1。在一些實施例中，方法更包括純化化合物1。在一些實施例中，純化化合物1包括HPLC、固相萃取或其組合。在一些實施例中，純化更包括收集重組細胞、保留上清液以及溶解細胞。在一些實施例中，溶解包括使細胞受到剪切力或清潔劑洗滌，從而獲得溶解產物。在一些實施例中，剪切力來自音波處理方法、弗氏壓碎細胞或珠粒。在一些實施例中，對溶解產物進行過濾及純化步驟。在一些實施例中，過濾溶解產物且藉由固相萃取來純化。在一些實施例中，方法更包括羅漢果提取物至重組宿主細胞之生長培養基中之第二次或第三次添加。另外，方法可藉由使羅漢果提取物與重組細胞溶解產物接觸來進行，其中重組細胞溶解產物包括本文中所列出的所表現的酶。
一般而言，如本文中所揭露及描述之化合物單獨或組合可以組成物形式提供，諸如可攝入組成物。在一個實施例中，如本文中所揭露及描述之化合物單獨或組合可以為可攝入組成物提供甜味。在其他實施例中，本文中所揭露及描述之化合物單獨或組合可以充當用於增強另一甜味劑之甜味的甜味增強劑。在其他實施例中，本文中所揭露之化合物藉由在甜味劑組成物中組合如本文中所揭露及描述之化合物中之一或多者與一或多種其他甜味劑而賦予甜味劑組成物更多類似於糖的時間特徵及/或風味特徵。在另一個實施例中，如本文中所揭露及描述之化合物單獨或組合可以藉由使其組成物與如本文中所揭露及描述之化合物接觸形成改質組成物來增加或增強組成物之甜味。在另一個實施例中，如本文中所揭露及描述之化合物單獨或組合可以呈調節在體內而不是在味蕾中表現的甜味受體及/或其配體的組成物形式。
如本文所用之「可攝入組成物」包含單獨或與另一物質一起適合於口服的任何組成物，不管是否打算用於食用。可攝入組成物包含「食品或飲料產品」及「不可食用產品」。「食品或飲料產品」意謂任何打算供人類或動物食用的可食用產品，包含固體、半固體或液體（例如飲料），且包含功能食品（例如，任何聲稱具有超過提供營養這一基本營養功能的促進健康及/或預防疾病的特性的新鮮食品或加工食品）。術語「非食品或飲料產品」或「非食物組成物（noncomestible composition）」包含人類或動物出於除了食用或作為食品或飲料以外的目的而放入口中的任何產品或組成物。舉例而言，非食品或飲料產品或非食物組成物包含補充劑、類藥劑營養品（nutraceuticals）、藥物及成藥（over the counter medication）、口腔護理產品，諸如牙粉及漱口水，以及口香糖（chewing gum）。 包括羅漢果苷化合物之組成物
本文中所揭露的內容亦包含組成物，例如可攝入組成物，其包括本文中所揭露之羅漢果苷化合物中之一或多者，包含但不限於化合物1及圖43中所示之化合物。在一些實施例中，可攝入組成物可為飲料。舉例而言，飲料可由下述者所構成的族群中選出：強化發泡飲料（enhanced sparkling beverage）、可樂（cola）、檸檬-萊檬味發泡飲料（lemon-lime flavored sparkling beverage）、橙子味發泡飲料、葡萄味發泡飲料、草莓味發泡飲料、鳳梨味發泡飲料、薑汁汽水（ginger-ale）、草根沙士（root beer）、果汁、水果味果汁、果汁飲料、花蜜（nectar）、蔬菜汁、蔬菜味果汁、運動飲料、能量飲料、強化水飲料、含有維生素的強化水、近水飲料（near water drink）、椰子汁（coconut water）、茶類飲料、咖啡、可可飲料、含有牛奶組分的飲料、含有穀物提取物的飲料以及冰沙（smoothies）。在一些實施例中，飲料可為清涼飲料（soft drink）。
「攝入可接受的成分」為適合於口服且可與本文所述之化合物組合形成可攝入組成物的物質。視產品之預定用途而定，攝入可接受的成分可採用任何形式，例如固體、半固體、液體、糊劑、凝膠、洗劑、乳膏、泡沫狀材料、懸浮液、溶液或其任何組合（諸如含有固體內含物之液體）。攝入可接受的成分可為人工的或天然的。攝入可接受的成分包含許多常用的食品成分，諸如呈中性、酸性或鹼性pH之水、水果汁或蔬菜汁、醋、醋滷（marinade）、啤酒、酒、天然水/脂肪乳液（諸如乳或煉乳）、食用油及酥油、脂肪酸及其烷基酯、丙二醇之低分子量寡聚物、脂肪酸甘油酯，及此類疏水性物質於水性介質中之分散液或乳液、鹽（諸如氯化鈉）、小麥麵粉、溶劑（諸如乙醇）、固體可食用稀釋劑（諸如蔬菜粉末或粉），或其他液體媒劑；分散助劑或懸浮助劑；界面活性劑；等張劑（isotonic agent）；增稠劑或乳化劑、防腐劑；固體黏合劑；潤滑劑及其類似物。
額外的攝入可接受的成分包含酸，包含但不限於檸檬酸、磷酸、抗壞血酸、酸式硫酸鈉（sodium acid sulfate）、乳酸或酒石酸；苦味成分，包含例如咖啡鹼（caffeine）、奎寧（quinine）、綠茶、兒茶素、多酚、羅布斯塔綠咖啡提取物（green robusta coffee extract）、綠咖啡提取物、乳清蛋白分離物（whey protein isolate）或氯化鉀；著色劑，包含例如焦糖色、紅色#40、黃色#5、黃色#6、藍色#1、紅色#3、紫色胡蘿蔔（purple carrot）、黑胡蘿蔔汁（black carrot juice）、甜紫薯（purple sweet potato）、蔬菜汁、果汁、β胡羅蔔素、薑黃薑黃素或二氧化鈦；防腐劑，包含例如苯甲酸鈉、苯甲酸鉀、山梨酸鉀、焦亞硫酸鈉（sodium metabisulfate）、山梨酸或苯甲酸；抗氧化劑，包含例如抗壞血酸、乙二胺四乙酸二鈉鈣（calcium disodium EDTA）、α生育酚、混合生育酚、迷迭香提取物、葡萄籽提取物、白藜蘆醇或六偏磷酸鈉；維生素或功能成分，包含例如白藜蘆醇、Co-Q10、ω-3脂肪酸、茶胺酸（theanine）、氯化膽鹼（尼古林（citocoline））、法貝索（fibersol）、菊糖（菊苣根）、牛磺酸、人參提取物、瓜拿納提取物（guanana extract）、薑提取物、L-苯丙胺酸、L-肉鹼、L-酒石酸鹽、D-葡萄糖醛酸內酯（D-glucoronolactone）、肌醇、生物類黃酮（bioflavonoids）、紫花馬藺菊屬（Echinacea）、銀杏（ginko biloba）、馬黛茶（yerba mate）、亞麻仁油（flax seed oil）、藤黃果果皮提取物（garcinia cambogia rind extract）、白茶提取物、核糖、乳薊提取物（milk thistle extract）、葡萄籽提取物、鹽酸吡哆醇（pyrodixine HCl）（維生素B6）、氰鈷胺（cyanoobalamin）（維生素B12）、菸鹼醯胺（維生素B3）、生物素、乳酸鈣、泛酸鈣（泛酸）、磷酸鈣、碳酸鈣、氯化鉻、多菸酸鉻（chromium polynicotinate）、硫酸銅、葉酸、焦磷酸鐵、鐵、乳酸鎂、碳酸鎂、硫酸鎂、磷酸二氫鉀（monopotassium phosphate）、磷酸二氫鈉（monosodium phosphate）、磷、碘化鉀、磷酸鉀、核黃素、硫酸鈉、葡糖酸鈉、多磷酸鈉、碳酸氫鈉、單硝酸硫胺素（thiamine mononitrate）、維生素D3、維生素A棕櫚酸鹽、葡萄糖酸鋅、乳酸鋅或硫酸鋅；混濁劑，包含例如酯槍（ester gun）、溴化植物油（brominated vegetable oil，BVO）或蔗糖乙酸異丁酸酯（sucrose acetate isobutyrate，SAIB）；緩衝劑，包含例如檸檬酸鈉、檸檬酸鉀或鹽；香料，包含例如丙二醇、乙醇、甘油、阿拉伯膠（gum Arabic/gum acacia）、麥芽糊精、改質玉米澱粉、右旋糖（dextrose）、天然香料、含有其他天然香料的天然香料（天然香料WONF）、天然及人工香料、人工香味、二氧化矽、碳酸鎂或磷酸三鈣；以及穩定劑，包含例如果膠、三仙膠（xanthan gum）、羧甲基纖維素（carboxylmethylcellulose，CMC）、聚山梨醇酯60（polysorbate 60）、聚山梨醇酯80、中鏈三酸甘油酯、纖維素凝膠、纖維素膠、酪蛋白鈉、改質食物澱粉、阿拉伯膠（gum Arabic/gum acacia）或角叉菜膠（carrageenan）。 實例
上文所論述之實施例之一些態樣在以下實例中進一步詳細揭露，所述實例不打算以任何方式限制本發明之範圍。 實例1：製造賽門苷I
如本文中所揭露，賽門苷I可為用於製造本文中所揭露之化合物1的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，賽門苷I可水解產生羅漢果苷IIIE，羅漢果苷IIIE隨後可用於製造化合物1。舉例而言，賽門苷I之製造方法可以包括：使羅漢果醇與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。舉例而言，可以使用表現來自棘孢麴黴（Aspergillus aculeatus ）之果膠酶的重組細胞。
作為另一實例，賽門苷I之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，可以使用來自棘孢麴黴之果膠酶。 實例2：製造羅漢果苷IVE
如本文中所揭露，羅漢果苷IVE 可為用於製造本文中所揭露之化合物1的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，來自羅漢果苷V之羅漢果苷IVE 隨後可用於製造化合物1。舉例而言，羅漢果苷IVE 之製造方法可以包括：使羅漢果苷V與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。作為另一實例，重組細胞可以包括編碼果膠酶之基因。果膠酶可以由來自棘孢麴黴之基因編碼。
作為另一實例，羅漢果苷IVE 之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，可以使用來自棘孢麴黴之果膠酶。 實例3：製造羅漢果苷IIIE
如本文中所揭露，羅漢果苷IIIE 可為用於製造本文中所揭露之化合物1的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，可以使羅漢果苷IIA 糖基化以產生羅漢果苷IIIE，羅漢果苷IIIE隨後可用於製造化合物1。
作為另一實例，羅漢果苷IIIE 之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、羅漢果苷IIA 、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，來自棘孢麴黴之果膠酶可以由重組宿主細胞內之基因編碼。 實例4：製造羅漢果苷IVA
如本文中所揭露，羅漢果苷IVA 可為用於製造本文中所揭露之化合物1的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，來自羅漢果苷V之羅漢果苷IVA 隨後可用於製造化合物1。
舉例而言，羅漢果苷IVA 之製造方法可以包括：使羅漢果苷V與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。酶亦可為例如來自米麴菌（Aspergillus oryzae ）之β-半乳糖苷酶。
作為另一實例，羅漢果苷IVA 之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，可以在方法中使用來自米麴菌之β-半乳糖苷酶。 實例5：製造羅漢果苷IIA
如本文中所揭露，羅漢果苷IIA 可為用於製造本文中所揭露之化合物1的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，羅漢果苷IIA 之製造方法可以包括：使羅漢果苷IA1 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。
作為另一實例，羅漢果苷IIA 之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷IA1 、羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，亦可使用賽路克雷斯。 實例6：由阿洛瑪製造羅漢果苷IIIA1
如本文中所揭露，羅漢果苷IIIA1 可為用於製造本文中所揭露之化合物1的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，羅漢果苷IIIA1 可為用於製造羅漢果苷IVA之中間體，羅漢果苷IVA隨後可用作用於製造化合物1之中間體。舉例而言，羅漢果苷IIIA1 I之製造方法可以包括：使賽門苷I與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。酶亦可為例如阿洛瑪。作為另一實例，羅漢果苷IIIA1 I之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。 實例7：製造化合物3
如本文中所揭露，化合物3可為與本文中所揭露之化合物1一起產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物3之製造方法可以包括：使羅漢果醇與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。酶可為來自地衣芽孢桿菌（Bacillus lichenformis）之環麥芽糊精葡聚糖轉移酶及/或托魯茲。
作為另一實例，化合物3之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA、羅漢果苷IIA、羅漢果苷IIA1、羅漢果苷IIA2、羅漢果苷IA、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE、11-側氧基-羅漢果苷IVE、羅漢果苷IIIE、羅漢果苷IE、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE、羅漢果苷IIIA2以及羅漢果苷III。舉例而言，可以使用CTGase酶。 實例8：製造化合物4
如本文中所揭露，化合物4在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生。舉例而言，化合物4之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IIIE與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。
作為另一實例，化合物4之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA、羅漢果苷IIA、羅漢果苷IIA1、羅漢果苷IIA2、羅漢果苷IA、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE、11-側氧基-羅漢果苷IVE、羅漢果苷IE、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE、羅漢果苷IIIA2以及羅漢果苷III。酶可為例如來自地衣芽孢桿菌之環麥芽糊精葡聚糖轉移酶及/或托魯茲。 實例9：製造化合物5
化合物5可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物5之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IIIE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。
作為另一實例，化合物5之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，可以使用來自地衣芽孢桿菌之CGTase或托魯茲。 實例10：製造化合物6
如本文中所揭露，化合物6可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物6之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IIIE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。
作為另一實例，化合物6之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，可以使用來自地衣芽孢桿菌之CGTase或托魯茲。 實例11：製造化合物7
如本文中所揭露，化合物7可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物7之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IIIE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。 作為另一實例，化合物7之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，可以使用來自地衣芽孢桿菌之CGTase或托魯茲。 實例12：製造化合物8
如本文中所揭露，化合物8可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物8之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IIIE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。
作為另一實例，化合物8之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，可以使用來自地衣芽孢桿菌之CGTase或托魯茲。 實例13：製造化合物9
如本文中所揭露，化合物9可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物9之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IIIE與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。
作為另一實例，化合物9之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA、羅漢果苷IIA、羅漢果苷IIA1、羅漢果苷IIA2、羅漢果苷IA、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE、11-側氧基-羅漢果苷IVE、羅漢果苷IE、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE、羅漢果苷IIIA2以及羅漢果苷III。舉例而言，可以使用來自地衣芽孢桿菌之CGTase或托魯茲。 實例14：製造化合物10
如本文中所揭露，化合物10可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物10之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IIIE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。
作為另一實例，化合物10之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，可以使用來自地衣芽孢桿菌之CGTase或托魯茲。 實例15：製造化合物11
如本文中所揭露，化合物11可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物11之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IIIE 或11-側氧基-MIIIE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。
作為另一實例，化合物11之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，可以使用來自地衣芽孢桿菌之CGTase或托魯茲。 實例16：製造化合物12
如本文中所揭露，化合物12可為可在本文中所揭露之化合物1之製造過程中使用的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物12之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷VI異構體與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶、轉化酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。酶可為例如來自焙用酵母（baker’s yeast）之轉化酶。
作為另一實例，化合物12之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶、轉化酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 、羅漢果苷VI異構體以及羅漢果苷III。 實例17：製造化合物13
如本文中所揭露，化合物13可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，方法可以包括使羅漢果苷IIIE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。所表現之酶亦可為例如賽路克雷斯。
作為另一實例，化合物13之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，可使用賽路克雷斯。 實例18：製造化合物14
如本文中所揭露，化合物14可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，方法可以包括使羅漢果苷IIIE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。所表現之酶亦可為例如賽路克雷斯。
作為另一實例，化合物14之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，可使用賽路克雷斯。方法亦可能需要存在糖，諸如α-乳糖。 實例19：製造化合物15
如本文中所揭露，化合物15可為可用於製造本文中所揭露之化合物1的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，方法可以包括使羅漢果苷IIA 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。
作為另一實例，化合物15之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，可以使用托魯茲。 實例20：製造化合物16
如本文中所揭露，化合物16可為可用於製造本文中所揭露之化合物1的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，方法可以包括使羅漢果苷IIA 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。
作為另一實例，化合物16之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，可以使用托魯茲。
酶可為例如托魯茲。重組細胞可以更包含例如編碼環麥芽糊精葡聚糖轉移酶（例如托魯茲）、轉化酶、葡萄糖轉移酶（例如UGT76G1）之基因。 實例21：製造化合物17
如本文中所揭露，化合物17可為用於製造本文中所揭露之化合物1的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物17可水解產生羅漢果苷IIIE，羅漢果苷IIIE隨後可用於製造化合物1。舉例而言，化合物17之製造方法可以包括：使賽門苷I與表現下述者中之一或多者的重組宿主細胞接觸：UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、轉葡萄糖苷酶、蔗糖合成酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶。舉例而言，可以使用表現UDP糖基轉移酶之重組細胞。
作為另一實例，化合物17之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，可以使用UDP糖基轉移酶。 實例22：製造化合物18
如本文中所揭露，化合物18可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物18可水解產生羅漢果苷IIIE，羅漢果苷IIIE隨後可用於製造化合物1。舉例而言，化合物18之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IIIE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。舉例而言，酶可為Sus1及UGT76G1。
作為另一實例，化合物18之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，酶可為UGT76G1。 實例23：製造化合物19
如本文中所揭露，化合物19可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物19可以進一步水解產生化合物1。舉例而言，化合物18之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IIIE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。舉例而言，酶可為Sus1及UGT76G1。
作為另一實例，化合物19之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，酶可為UGT76G1。舉例而言，酶亦可為蔗糖合成酶Sus1。 實例24：製造化合物20
如本文中所揭露，化合物20可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物20可以進一步水解產生化合物1。舉例而言，化合物20之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IIIE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。舉例而言，酶可為Sus1及UGT76G1。
作為另一實例，化合物20之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，酶可為UGT76G1。舉例而言，酶亦可為蔗糖合成酶Sus1。舉例而言，酶可為蔗糖合成酶Sus1及UGT76G1。 實例25：製造化合物21
如本文中所揭露，化合物21可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物21可以進一步水解產生化合物1。舉例而言，化合物21之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IVE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。舉例而言，酶可為Sus1及UGT76G1。
作為另一實例，化合物21之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、羅漢果苷IVE 、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，酶可為UGT76G1。舉例而言，酶亦可為蔗糖合成酶Sus1。舉例而言，酶可為蔗糖合成酶Sus1及GT76G1。 實例26：製造化合物22
如本文中所揭露，化合物22可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物22可以進一步水解產生化合物1。舉例而言，化合物22之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IVA與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。舉例而言，酶可為Sus1及UGT76G1。
作為另一實例，化合物22之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、羅漢果苷IVE 、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，酶可為UGT76G1。舉例而言，酶亦可為蔗糖合成酶Sus1。舉例而言，酶可為蔗糖合成酶Sus1及GT76G1。 實例27：製造化合物23
如本文中所揭露，化合物23可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物23可以進一步水解產生化合物1。舉例而言，化合物22之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IVE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。舉例而言，酶可為聚葡萄糖蔗糖酶。
作為另一實例，化合物23之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、羅漢果苷IVE 、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。酶可為聚葡萄糖蔗糖酶，例如所述酶將高糖基化羅漢果苷IVE 異構體水解為所要的羅漢果苷V異構體。 實例28及實例29：由真菌乳糖酶製造羅漢果苷IIA1 及羅漢果苷IIA2
如本文中所揭露，羅漢果苷IIA1 及羅漢果苷IIA2 可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，羅漢果苷IIA1 及羅漢果苷IIA2 可以進一步水解產生化合物1。舉例而言，羅漢果苷IIA1 及羅漢果苷IIA2 之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IVE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。舉例而言，酶可為來自真菌之乳糖酶。
作為另一實例，羅漢果苷IIA1 及羅漢果苷IIA2 之製造方法可以包含：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、羅漢果苷IVE 、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。 實例30：由維斯科茲（Viscozyme）製造羅漢果苷IA
如本文中所揭露，羅漢果苷IA 可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，羅漢果苷IA 可以進一步水解產生化合物1。羅漢果苷IA 之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IIA與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。舉例而言，酶可為維斯科茲。
作為另一實例，羅漢果苷IA 之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、羅漢果苷IVE 、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，酶可為維斯科茲。 實例31：製造化合物24
如本文中所揭露，化合物24可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物24可以進一步水解產生化合物1。化合物24之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IIIE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。舉例而言，酶可為聚葡萄糖蔗糖酶DexT。
作為另一實例，化合物24之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、羅漢果苷IVE 、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，酶可為聚葡萄糖蔗糖酶DexT。 實例32：製造化合物25
如本文中所揭露，化合物25可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物25可以進一步水解產生化合物1。化合物25之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IIIE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。舉例而言，酶可為聚葡萄糖蔗糖酶DexT。
作為另一實例，化合物25之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、羅漢果苷IVE 、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，酶可為聚葡萄糖蔗糖酶DexT。 實例33：製造化合物26
如本文中所揭露，化合物26可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物26可以進一步水解產生化合物1。化合物26之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IIIE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。舉例而言，酶可為聚葡萄糖蔗糖酶DexT。
作為另一實例，化合物26之製造方法可以包含：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、羅漢果苷IVE 、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，酶可為聚葡萄糖蔗糖酶DexT。 實例34及實例35：由果膠酶製造羅漢果醇及羅漢果苷IE
如本文中所揭露，羅漢果醇及羅漢果苷IE 可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。羅漢果醇可用作用於製造羅漢果苷IA1之受質，羅漢果苷IA1進一步水解形成化合物1，且舉例而言，羅漢果苷IE 可以進一步水解產生化合物1。羅漢果醇及羅漢果苷之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷V與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。舉例而言，酶可為來自棘孢麴黴之果膠酶。
作為另一實例，羅漢果醇及羅漢果苷IE 之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、羅漢果苷IVE 、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。 實例36：製造羅漢果苷IIE
如本文中所揭露，羅漢果苷IIE可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，羅漢果苷IIE可以進一步水解產生化合物1。羅漢果苷IIE之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷V與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。舉例而言，酶可為來自棘孢麴黴之果膠酶。
作為另一實例，羅漢果苷IIE之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、羅漢果苷IVE 、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。 實例37及實例38：製造化合物32及化合物33
如本文中所揭露，化合物32及化合物33可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物32及化合物33可以進一步水解產生化合物1。化合物32及化合物33之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、羅漢果苷IVE 、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。舉例而言，酶可為來自棘孢麴黴之果膠酶。
作為另一實例，化合物32及化合物33之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、羅漢果苷IVE 、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。 實例39及實例40：製造化合物34及化合物35
如本文中所揭露，化合物34及化合物35可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，化合物32及化合物33可以進一步水解產生化合物1。化合物34及化合物35之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IIIE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。舉例而言，酶可為賽路克雷斯。
作為另一實例，化合物34及化合物35之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、羅漢果苷IVE 、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。 實例41及實例42：製造羅漢果苷IIIA2 及羅漢果苷III
如本文中所揭露，羅漢果苷IIIA2 及羅漢果苷III可為在本文中所揭露之化合物1之製造過程中產生的中間羅漢果苷化合物。舉例而言，羅漢果苷IIIA2 及羅漢果苷III可以進一步水解產生化合物1。
舉例而言，羅漢果苷IIIA2 及羅漢果苷III亦可以接觸UGT以形成羅漢果苷IVA，羅漢果苷IVA為另一種可以用於製造羅漢果苷IIIE之羅漢果苷化合物，羅漢果苷IIIE進一步水解形成化合物1。
羅漢果苷IIIA2 及羅漢果苷III之製造方法亦可引起化合物1之產生，方法可以包括使羅漢果苷IIIE 與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸。舉例而言，酶可為賽路克雷斯。
作為另一實例，羅漢果苷IIIA2 及羅漢果苷III之製造方法可以包括：使下述者中之一或多者與表現UDP糖基轉移酶、CGTase、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者的重組宿主細胞接觸：羅漢果苷V、羅漢果苷IVE 、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、異羅漢果苷V、羅漢果苷IIIE 、11-去氧-羅漢果苷V、11-側氧基-羅漢果苷V、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 、羅漢果苷IIA 、羅漢果苷IIA1 、羅漢果苷IIA2 、羅漢果苷IA 、11-側氧基-羅漢果苷VI、11-側氧基-羅漢果苷IIIE 、11-側氧基-羅漢果苷IVE 、羅漢果苷IE 、羅漢果醇、11-側氧基-羅漢果醇、羅漢果苷IIE 、羅漢果苷IIIA2 以及羅漢果苷III。 實例43：使用CGT-SL酶來製造化合物1
在1毫升反應體積中，用攪拌棒將5毫克羅漢果苷IIIE、50毫克可溶澱粉、0.1 M NaOAC pH 5.0、125微升CGT-SL酶（來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobaccilus thermophillus ））以及水混合且在50℃下培育。獲取各時間點樣品用於HPLC。
HPLC資料：化合物1製造之質譜如圖1中所示。在一些實施例中，CTG-SL可以包括SEQ ID NO: 3、148或154中所闡述之序列。 實例44：選殖：對來自檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum ）ATCC11449之編碼聚葡萄糖蔗糖酶的基因進行PCR擴增且將其選殖至pET23a中。
生長條件：使BL21 Codon Plus RIL菌株在2xYT中在37℃、250轉/分鐘下生長，直到OD600為1。添加10 mM乳糖進行誘導，在室溫、150轉/分鐘下培育隔夜。藉由音波處理或滲壓衝擊（osmotic shock）獲得用於反應之粗提取物。
在一些實施例中，聚葡萄糖蔗糖酶包括或組成為SEQ ID NO: 2、103、106-110、156以及896中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，DexT可以包括SEQ ID NO: 103中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，DexT包括SEQ ID NO: 104或105中所闡述之核酸序列。 實例45：羅漢果苷IIIE與變種鏈球菌Clarke ATCC25175聚葡萄糖蔗糖酶反應產生化合物1
生長條件：如韋納姆（Wenham）、赫尼西（Henessey）以及科爾（Cole）（1979）中所指示，使上文指定的菌株在葡萄糖補充下厭氧生長，刺激聚葡萄糖蔗糖酶產生。將5毫克/毫升羅漢果苷IIIE添加至生長培養基中。獲取各時間點樣品用於HPLC。HPLC資料在圖2中呈現為化合物1製造之質譜。 實例46：羅漢果苷IIIE與CGTase之反應
在1毫升反應體積中，用攪拌棒將5毫克羅漢果苷IIIE、50毫克可溶澱粉、0.1 M NaOAC pH 5.0、125微升酶以及水混合且在50℃下培育。獲取各時間點樣品用於HPLC。所用酶為CGTase。產物化合物1見於如圖1中所示之HPLC資料及質譜資料中。質量峰對應於化合物1之大小。 實例47：羅漢果苷IIIE與賽路克雷斯之反應
用羅漢果苷IIIE與來自天然宿主里氏木黴（Trichoderma reesei ）之賽路克雷斯進行賽路克雷斯木糖基化。
反應條件：將5毫克羅漢果苷IIIE、100毫克木聚糖、50微升賽路克雷斯混合於含有0.1 M乙酸鈉pH 5.0之1毫升總體積中，在50℃下在攪拌下培育。獲取各時間點樣品用於HPLC。
在圖3中突出木糖基化產物。木糖基化產物可用作化合物1之製造過程中之中間體。賽路克雷斯之序列包含在表1中且在本文中用於製造木糖基化產物。 實例48：糖基轉移酶（麥芽三糖基轉移酶）（天然宿主：土芽孢桿菌屬（Geobacillus sp.）APC9669）
在此實例中，使用糖基轉移酶AGY15763.1（伊利諾伊州埃爾金之美國天野酶有限公司（Amano Enzyme U.S.A. Co., Ltd., Elgin, IL）；SEQ ID NO: 434，參見表1）。將20毫升去離子水、0.6毫升0.5M MES pH 6.5、6公克可溶澱粉、150毫克羅漢果苷IIIE以及3毫升酶添加至40毫升平底螺帽小瓶中。用黑色瓶蓋密封小瓶，在30℃下培育且使用磁棒以500轉/分鐘攪拌。關於總共600毫克用作起始物質之羅漢果苷IIIE，另建立3個相同反應。24小時後停止反應。藉由離心（4000轉/分鐘，5分鐘，艾本德（Eppendorf））移除不能溶解的澱粉。在攪拌（500轉/分鐘）下將上清液加熱至80℃，持續30分鐘，接著離心（4000轉/分鐘，10分鐘，艾本德）。經由250毫升0.22微米PES過濾上清液且藉由LC-MS（Sweet Naturals 2016-Enzymatic_2016Q4_A.SPL，1254系列）檢查以獲得HPLC資料。
AGY15763.1蛋白質（SEQ ID NO: 434）可由天然gDNA（SEQ ID NO: 437）或密碼子最佳化（針對大腸桿菌）之DNA序列（SEQ ID NO: 438）編碼。
期望以類似方式進行的額外糖基轉移酶之實例為來自甜菊（Stevia rebaudiana ）之UGT76G1蛋白質（SEQ ID NO: 439），其可以在大腸桿菌中表現。UGT76G1 （SEQ ID NO: 439）之天然編碼序列提供於SEQ ID NO: 440中。 實例49：在羅漢果醇存在下的UDP-糖基轉移酶UGT73C5
使羅漢果醇與UDP-糖基轉移酶反應，產生羅漢果苷I及羅漢果苷II。使1毫克/毫升羅漢果醇與200微升含有UGT73C5（阿拉伯芥）（334）之粗提取物、2微升含有蔗糖合成酶之粗提取物、5 mM UDP、1×M221蛋白酶抑制劑、200 mM蔗糖、0.5毫克/毫升觀黴素（spectinomycin）在0.1 M Tris-HCl pH 7.0中反應，在30℃下培育。2天後獲取樣品用於HPLC。反應產物為自羅漢果醇至羅漢果苷I及羅漢果苷II，如圖4及圖5中所示。
UGT73C5之蛋白質序列示出於SEQ ID NO: 441中，UGT73C5（SEQ ID NO: 441）之天然DNA編碼序列示出於SEQ ID NO: 442中，且UGT73C5編碼序列（針對大腸桿菌密碼子最佳化）示出於SEQ ID NO: 443中。 實例50：UDP-糖基轉移酶（UGT73C6）在羅漢果醇存在下用以產生羅漢果苷I
反應條件：使1毫克/毫升羅漢果醇與200微升含有UGT73C6之粗提取物、2微升含有蔗糖合成酶之粗提取物、5 mM UDP、1×M221蛋白酶抑制劑、200 mM蔗糖、0.5毫克/毫升觀黴素在0.1 M Tris-HCl pH 7.5中反應，在30℃下培育。2天後獲取樣品用於HPLC。反應產物為來自羅漢果醇之羅漢果苷I。如圖6之HPLC資料及質譜資料中所示。
蛋白質及編碼阿拉伯芥UGT73C6之gDNA序列分別示出於SEQ ID NO: 444及SEQ ID NO: 445中。 實例51：UDP-糖基轉移酶（338）在羅漢果醇存在下用以產生羅漢果苷I、羅漢果苷IIA以及兩種不同的羅漢果苷III產物
反應條件：使1毫克/毫升羅漢果醇或羅漢果苷IIA與200微升含有338之粗提取物、2微升含有蔗糖合成酶之粗提取物、5 mM UDP、1×M221蛋白酶抑制劑、200 mM蔗糖、0.5毫克/毫升觀黴素在0.1 M Tris-HCl pH 8.5中反應，在30℃下培育。2天後獲取樣品用於HPLC。
羅漢果醇與桿菌屬UDP-糖基轉移酶（338）之反應（潘岱（Pandey）等人，2014中所述；以全文引用的方式併入本文中）產生以下反應產物：羅漢果苷I、羅漢果苷IIA以及2種不同的羅漢果苷III產物。圖7至圖9示出在反應後獲得之產物的HPLC及質譜資料。圖8示出與羅漢果醇IIA之大小相關的峰。
蛋白質及編碼UGT 338之gDNA序列分別提供於SEQ ID NO: 405及SEQ ID NO: 406中。 實例52：UDP-糖基轉移酶（301（UGT98））在羅漢果苷IIIE存在下用以產生賽門苷I及羅漢果苷V
反應條件：使1毫克/毫升羅漢果苷IIIE與200微升含有301之粗提取物、2微升含有蔗糖合成酶之粗提取物、5 mM UDP、1×M221蛋白酶抑制劑、200 mM蔗糖、0.5毫克/毫升觀黴素在0.1 M Tris-HCl pH 7.0中反應，在30℃下培育。2天後獲取樣品用於HPLC及質譜分析。羅漢果苷IIIE之反應產物為賽門苷I及羅漢果苷V，如圖10至圖11中所示。
蛋白質及編碼羅漢果301 UGT98之gDNA序列分別提供於SEQ ID NO: 407及SEQ ID NO: 408中。 實例53：UDP-糖基轉移酶（339）在羅漢果醇、賽門苷I或化合物1存在下，由羅漢果醇產生羅漢果苷I、由賽門苷I產生異羅漢果苷V且由化合物1產生化合物1衍生物
反應條件：使1毫克/毫升羅漢果醇、賽門苷I或化合物1與200微升含有339（伊特金等人中所述，以全文引用的方式併入本文中）之粗提取物、2微升含有蔗糖合成酶之粗提取物、5 mM UDP、1×M221蛋白酶抑制劑、200 mM蔗糖、0.5毫克/毫升觀黴素在0.1 M Tris-HCl pH 7.0中反應，在30℃下培育。2天後獲取樣品用於HPLC。
羅漢果醇之反應產物為羅漢果苷I，賽門苷I之反應產物為異羅漢果苷V，且化合物1之反應產物為化合物1衍生物（圖12至圖14）。
蛋白質及編碼羅漢果UGT339之DNA序列分別提供於SEQ ID NO: 409及SEQ ID NO: 410中。 實例54：UDP-糖基轉移酶（330）在羅漢果苷IIA、羅漢果苷IIE、羅漢果苷IIIE、羅漢果苷IVA或羅漢果苷IVE存在下產生羅漢果苷IIIA、羅漢果苷IVE以及羅漢果苷V
如本文中所述，如野口（Noguchi）等人2008（以全文引用的方式併入本文中）所述之UDP-糖基轉移酶（330）之使用得到反應產物羅漢果苷IIIA、羅漢果苷IVE、羅漢果苷V。天然宿主為胡麻（Sesamum indicum ），且生產宿主（production host）為SF9。關於反應，使1毫克/毫升羅漢果苷IIA、羅漢果苷IIE、羅漢果苷IIIE、羅漢果苷IVA或羅漢果苷IVE與200微升含有330之粗提取物、2微升含有蔗糖合成酶之粗提取物、5 mM UDP、1×M221蛋白酶抑制劑、200 mM蔗糖、0.5毫克/毫升觀黴素在0.1 M Tris-HCl pH 7.0中反應，在30℃下培育。2天後獲取樣品用於HPLC。
反應得到出人意料的產物，諸如羅漢果苷IIIA、羅漢果苷IVE、羅漢果苷V。如圖15至圖20中所示，所產生之化合物之大小對應於羅漢果苷IIIA、羅漢果苷IVE以及羅漢果苷V。
蛋白質及編碼羅漢果UGT330蛋白質之gDNA序列分別提供於SEQ ID NO: 411及SEQ ID NO: 412中。 實例55：UDP-糖基轉移酶（328）（伊特金等人中所述）在羅漢果苷IIA、羅漢果苷IIE、羅漢果苷IIIE、羅漢果苷IVA或羅漢果苷IVE存在下產生羅漢果苷IIIA、羅漢果苷IVE以及羅漢果苷V
反應條件：使1毫克/毫升羅漢果苷IIIE與200微升含有330之粗提取物、2微升含有蔗糖合成酶之粗提取物、5 mM UDP、1×M221蛋白酶抑制劑、200 mM蔗糖、0.5毫克/毫升觀黴素在0.1 M Tris-HCl pH 7.0中反應，在30℃下培育。2天後獲取樣品用於HPLC。
反應產物為羅漢果苷IVE及羅漢果苷V。如圖21至圖22中所示，質譜資料中之產物大小對應於羅漢果苷IVE及羅漢果苷V。羅漢果UGT328蛋白質（糖基轉移酶）及其編碼序列分別提供於SEQ ID NO: 413及414中。
蔗糖合成酶AtSus1蛋白質序列及編碼AtSus1蛋白質之gDNA分別提供於SEQ ID NO: 415及416中。 實例56：在酵母中產生羅漢果醇
經由基因合成經由Genescript或IDT獲得DNA。關於葫蘆二烯醇合成酶中之一些，經由10天至60天齡幼苗獲得cDNA或基因組DNA，接著使用特異性及簡併引子進行PCR擴增。經由標準分子生物學技術將DNA選殖至以下過度表現載體中之一者中：pESC-Ura、pESC-His或pESC-LEU。釀酒酵母菌株YHR072（erg7異型接合（heterozygous））購自GE德哈瑪康（GE Dharmacon）。藉由使用Zymo酵母轉形套組II來轉形/共轉形含有羅漢果醇合成基因之質體（pESC載體）。使菌株在30℃、220轉/分鐘下生長於含有適當的2%葡萄糖或2%半乳糖選擇的標準培養基（YPD或SC）中以誘導異源基因。當指定時，添加羊毛甾醇合成酶抑制劑Ro 48-8071（開曼化工（Cayman Chemicals））（50微克/毫升）。誘導2天後，接著溶解（酵母破壞者（Yeast Buster））、乙酸乙酯萃取、乾燥以及再懸浮於甲醇中，由此準備羅漢果醇及前驅體之酵母生產。經由HPLC分析樣品。
在不含抑制劑之生長條件中藉由葫蘆二烯醇合成酶羅漢果SgCbQ催化葫蘆二烯醇之產生。
葫蘆二烯醇之產生示出於HPLC及質譜資料中，所述資料示出指定產物之質量峰（圖23）。蛋白質序列及編碼羅漢果SgCbQ之DNA序列分別提供於SEQ ID NO: 446及418中。
亦使用Cpep2在酵母中產生葫蘆二烯醇。如圖24中所示為質譜圖，其示出對應於葫蘆二烯醇之峰及特徵性碎片。Cpep2之蛋白質序列及編碼Cpep2蛋白質之DNA序列分別提供於SEQ ID NO: 420及421中。
在不含抑制劑之生長條件下在葫蘆二烯醇之製造過程中亦使用美國南瓜（Cucurbita pepo ）（傑克南瓜燈（Jack O’ Lantern））Cpep4。葫蘆二烯醇之產生示出於圖24及圖25中所示之質譜資料中。如所示，峰及碎片對應於葫蘆二烯醇。蛋白質序列及編碼Cpep4之DNA序列分別提供於SEQ ID NO: 422及423中。
自天然宿主筍瓜獲得代表Cmax之假定的葫蘆二烯醇合成酶蛋白質序列。推導的編碼DNA序列將用於基因合成及表現。蛋白質之葫蘆二烯醇合成酶序列及編碼葫蘆二烯醇合成酶之DNA示出如下：
以下的蛋白質及DNA編碼序列經由基因組DNA PCR產物序列與經由公共資料庫（Pubmed）可獲得的已知葫蘆二烯醇合成酶序列之比對獲得。預期這些Cmax蛋白質中之任一者可以用於本文中所揭露之用於製造化合物1之方法、系統、組成物（例如宿主細胞）中。非限制性例示性Cmax蛋白質為由Cmax1（DNA）（SEQ ID NO: 425）編碼之Cmax1（蛋白質）（SEQ ID NO: 424）。
自天然宿主中國南瓜（Cucurbita moschata ）獲得代表Cmos1之假定的葫蘆二烯醇合成酶蛋白質序列。推導的編碼DNA序列用於基因合成及表現。以下所示的蛋白質及DNA編碼序列經由基因組DNA PCR產物序列與經由公共資料庫（Pubmed）可獲得的已知葫蘆二烯醇合成酶序列之比對獲得。這些Cmos蛋白質中之任一者可以用於本文中所揭露之用於製造化合物1之方法、系統、組成物（例如宿主細胞）中。非限制性例示性Cmos1蛋白質為由Cmos1（DNA）（SEQ ID NO: 427）編碼之Cmos1（蛋白質）（SEQ ID NO: 426）。 實例57：在酵母（葫蘆二烯醇合成酶及環氧化物水解酶）中產生二羥基葫蘆二烯醇
考慮使用葫蘆二烯醇合成酶及環氧化物水解酶在酵母中產生二羥基葫蘆二烯醇。這些酶之天然宿主為羅漢果。
生長條件：SgCbQ與環氧化物水解酶（epoxide hydrolase，EPH）在羊毛甾醇合成酶抑制劑存在下共表現。
可能的二羥基葫蘆二烯醇產物示出於圖26中。
EPH蛋白質序列及編碼EPH蛋白質之DNA（密碼子最佳化之釀酒酵母）分別提供於SEQ ID NO: 428及429中。 實例58：由葫蘆二烯醇合成酶、環氧化物水解酶、細胞色素P450以及細胞色素P450還原酶製造羅漢果醇
四種酶，包含葫蘆二烯醇合成酶、環氧化物水解酶、細胞色素P450以及細胞色素P450還原酶，在釀酒酵母中共表現。關於生長條件，SgCbQ、EPH、CYP87D18及AtCPR（來自阿拉伯芥之細胞色素P450還原酶）在羊毛甾醇合成酶抑制劑存在下共表現。預期由釀酒酵母產生羅漢果醇。蛋白質序列及編碼SgCbQ、EPH、CYP87D18及AtCPR（來自阿拉伯芥之細胞色素P450還原酶）之DNA序列為：CYP87D18（蛋白質）（SEQ ID NO: 430）及CYP87D18（DNA）（SEQ ID NO: 431）；及AtCPR（蛋白質）（SEQ ID NO: 432）及AtCPR（DNA）（SEQ ID NO: 433）。 實例59：化合物1對微生物水解具有耐受性
在補充有1毫克/毫升羅漢果苷V或化合物1之YPD中培育酵母菌株釀酒酵母、解脂耶氏酵母以及假絲酵母（Candida bombicola ）。3天後，藉由HPLC分析上清液。
如HPLC資料中所示，環氧化物水解酶將羅漢果苷V水解為羅漢果苷IIIE。未觀察到化合物1之水解產物（圖37）。 實例60：變種鏈球菌Clarke ATCC 25175聚葡萄糖蔗糖酶
變種鏈球菌Clarke可在葡萄糖補充下厭氧生長。生長條件之實例可見於韋納姆、赫尼西以及科爾（1979）中，其中所述方法用來例如刺激聚葡萄糖蔗糖酶產生。將5毫克/毫升羅漢果苷IIIE添加至生長培養基中。舉例而言，可以獲取監測生產之各時間點樣品用於HPLC。多種聚葡萄糖蔗糖酶之序列可見於表1中，其包含聚葡萄糖蔗糖酶之蛋白質序列及編碼聚葡萄糖蔗糖酶之核酸序列（例如SEQ ID NO: 157-162）。在一些實施例中，聚葡萄糖蔗糖酶包括或組成為SEQ ID NO: 2、103、106-110、156以及896中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，DexT可以包括SEQ ID NO: 103中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，DexT包括SEQ ID NO: 104或105中所闡述之核酸序列。在本文中之一些實施例中，重組細胞編碼包括SEQ ID NO: 156-162中之任一者中所闡述之序列的蛋白質及/或包括一種核酸，所述核酸編碼包括SEQ ID NO: 157-162中之任一者中所闡述之核酸序列的聚葡萄糖蔗糖酶。此實例用於製造化合物1。 實例61：90%純的化合物1製造程序及感官評估
藉由用聚葡萄糖蔗糖酶/聚葡萄糖酶反應處理羅漢果苷IIIE （MIIIE ），接著進行SPE分級，獲得含有3種α-羅漢果苷異構體之混合物的部分。基於UPLC分析，此混合物具有3種異構體：11-側氧基-化合物1、化合物1以及羅漢果苷V異構體，比例分別為5%:90%:5%。這3種異構體藉由LC-MS、1D及2D NMR光譜純化不同部分/來源且藉由比較文獻中所報導之羅漢果苷系列中密切相關之異構體來表徵。另外藉由使用三點試驗法（triangle test）與純化合物1樣品比較，對此樣品進行感官評估。酶反應及純化程序
將100毫升pH 5.5 1 M乙酸鈉緩衝液、200公克蔗糖、100毫升聚葡萄糖蔗糖酶DexT（1毫克/毫升粗提取物，pET23a，BL21-Codon Plus-RIL，生長於2×YT中）、12.5公克羅漢果苷IIIE 以及600毫升水添加至2.8公升搖瓶（shake flask）中，且在30℃、200轉/分鐘下搖晃燒瓶。定期藉由LC-MS監測反應進度。72小時後，用2.5毫升聚葡萄糖酶（天野）處理反應物且繼續在30℃下搖晃燒瓶。24小時後，藉由在80℃下加熱淬滅反應混合物且在5000轉/分鐘下離心5分鐘，過濾上清液且將其直接加載至400公克C18 SPE管柱上且使用MeOH:H2 O 5/25/50/75/100逐級梯度（step-gradient）分級。將梯度中之各級別收集於6個廣口瓶中，各廣口瓶225毫升。將所要產物溶離於75% MeOH部分（SPE 75_2）之第二廣口瓶中且在減壓下乾燥。將其另外再懸浮/溶解於7毫升H2 O中，冷凍且凍乾小瓶3天，得到1.45公克白色固體。
根據UPLC分析（圖28及圖29），混合物具有3種已表徵之α-羅漢果苷異構體：11-側氧基-化合物1、化合物1以及羅漢果苷V異構體，比例分別為5%:90%:5%。基於1 H及13 C-NMR（吡啶-d5 + D2 O）分析，未觀察到殘留溶劑及/或結構上不相關的雜質。 感官評估
在2016年11月10日對純化合物1對比90%純的化合物1進行三點試驗法。測試兩種不同組成物：（1）LSB + 175 ppm純化合物1（標準）及（2）LSB + 175 ppm 90%純的化合物1。所有組成物樣品皆由pH約7.1的低鈉緩衝液（Low Sodium Buffer，LSB）製成且含有0%乙醇。
結論：官能檢查員發現，組成物（1）LSB + 175 ppm純化合物1（標準）與組成物（2）LSB + 175ppm 90%純的化合物1 （測試）並無顯著不同（p＞0.05）。測試分析結果中之一些示出於表2至表4中。表 2 .正確選擇不同樣品之官能檢查員的頻率。n = 38（19位官能檢查員×2複製）。 表 3 . 分析結果：測試日 表 4 .分析結果：測試日前一天 實例62：重組酵母細胞中之基因表現
經由基因合成經由Genescript、IDT或Genewiz獲得DNA。關於葫蘆二烯醇合成酶中之一些，經由10天至60天齡幼苗獲得cDNA或基因組DNA，接著使用特異性及簡併引子進行PCR擴增。經由標準分子生物學技術或經由酵母缺口修復選殖（yeast gap repair cloning）（傑斯卡（Joska）等人，2014）將DNA選殖至以下過度表現載體中之一者中：pESC-Ura、pESC-His或pESC-LEU。藉由以下啟動子中之一者調節基因表現：Gal1、Gal10、Tef1或GDS。使用Zymo酵母轉形套組II進行酵母轉形。使酵母菌株生長於含有適當的2%葡萄糖或2%半乳糖選擇的標準培養基（YPD或SC）中以誘導異源基因。使酵母菌株在30℃、140轉/分鐘至250轉/分鐘下生長於搖瓶或96孔盤中。當指定時，添加羊毛甾醇合成酶抑制劑Ro 48-8071（開曼化工）（50微克/毫升）。經由溶解（酵母破壞者）、乙酸乙酯萃取、乾燥及再懸浮於甲醇中，準備羅漢果醇及前驅體之酵母生產。經由以下所述之LCMS方法，使用A/B梯度（A = H2 O，B = 乙腈）分析樣品：
關於分析二環氧角鯊烯，LCMS方法包含使用C18 2.1×50毫米管柱，5% B 1.5分鐘，梯度5%至95% B或5.5分鐘，95% B 6分鐘，100% B 3分鐘，5% B 1.5，且流速均為0.3毫升/分鐘。
關於分析葫蘆二烯醇，第一LCMS方法包含使用C4 2.1×100毫米管柱，梯度1%至95% B 6分鐘，且流速為0.55毫升/分鐘；且第二LCMS方法包含使用Waters Acquity UPLC蛋白質BEH C4 2.1×100 mM，1.7微米，有保護，62%至67% B 2分鐘，100% B 1分鐘，且流速為0.9毫升/分鐘。
關於分析11-OH葫蘆二烯醇，LCMS方法包含使用C8 2.1×100毫米管柱，梯度60%至90% B 6分鐘，流速0.55毫升/分鐘。
關於分析羅漢果醇，LCMS方法包含使用C8 2.1×100毫米管柱，梯度50%至90% B 6分鐘，流速0.55毫升/分鐘。
關於分析羅漢果苷IIIE及化合物1，LCMS方法包含使用氟苯基2.1×100毫米管柱，梯度15%至30% B 6分鐘，流速0.55毫升/分鐘。 實例63：步驟 1. 增強氧化角鯊烯可獲得性
釀酒酵母菌株YHR072（羊毛甾醇合成酶erg7 異型接合）購自GE德哈瑪康。藉由將啟動子替換為cup1 之啟動子降低活性erg7 基因之表現（彭（Peng）等人，2015）。將在GDS啟動子控制下之截切型（truncated）酵母HMG-CoA還原酶（tHMG-CoA）及在Tef1啟動子控制下之酵母角鯊烯環氧酶（erg1 ）整合於基因組中。藉由製造二環氧角鯊烯來監測氧化角鯊烯增強，如HPLC及UV吸光度中所示（圖31）。 tHMG-CoA（蛋白質）SEQ ID NO: 898（途徑1） tHMG-CoA（DNA）SEQ ID NO: 897（途徑1） Erg1（蛋白質）SEQ ID NO: 900；Erg1（DNA）SEQ ID NO: 899
在一些實施例中，tHMG-CoA酶用於製造二環氧角鯊烯。
關於增強氧化角鯊烯/二環氧角鯊烯生產，選擇羅漢果中編碼假定角鯊烯環氧酶之基因（伊特金等人，2016）進行測試。3種角鯊烯環氧酶之關於其胺基酸及編碼序列（SEQ ID NO: 50-56、60、61、334或335）之序列可見於表1中。適用於本文中所揭露之用於製造氧化角鯊烯及/或二環氧角鯊烯及用於增強氧化角鯊烯及/或二環氧角鯊烯之製造的方法、系統及組成物中之角鯊烯環氧酶的額外序列包含：SQE1（蛋白質）SEQ ID NO: 908、SQE1（DNA）SEQ ID NO: 909；SQE2（蛋白質）SEQ ID NO: 910、SQE2（DNA）SEQ ID NO: 911；SQE3（蛋白質）SEQ ID NO: 912及SQE3（DNA）SEQ ID NO: 913。步驟 2 . 葫蘆二烯醇製造 葫蘆二烯醇合成酶
藉由氧化角鯊烯增強將含有羅漢果葫蘆二烯醇合成酶基因（SgCbQ）之質體轉形至酵母菌株中。使菌株在30℃、150轉/分鐘至250轉/分鐘下生長1天至3天。葫蘆二烯醇之產生示出於HPLC及質譜資料中，所述資料示出指定產物之質量峰（圖23）。SgCbQ蛋白質及編碼SgCbQ之gDNA分別提供於SEQ ID NO: 446及SEQ ID NO: 418中。亦使用美國南瓜（傑克南瓜燈）蛋白質Cpep2在酵母中產生葫蘆二烯醇。圖24示出含有對應於葫蘆二烯醇之峰及特徵性碎片的質譜圖。Cpep2蛋白質及編碼Cpep2之DNA分別提供於SEQ ID NO: 420及SEQ ID NO: 421中。亦使用美國南瓜（傑克南瓜燈）蛋白質Cpep4來製造葫蘆二烯醇。在不含抑制劑之生長條件下培養宿主細胞。在25圖中所示之質譜資料中證明葫蘆二烯醇之產生。如所示，峰及碎片對應於葫蘆二烯醇。Cpep4蛋白質及編碼Cpep4之DNA分別提供於SEQ ID NO: 422及SEQ ID NO: 423中。亦使用筍瓜蛋白質Cmax在酵母中產生葫蘆二烯醇。圖32示出含有對應於葫蘆二烯醇之峰及特徵性碎片的質譜圖。Cmax1蛋白質序列提供於SEQ ID NO: 424中，且Cmax1之編碼序列（DNA）提供於SEQ ID NO: 425中。亦使用厚皮甜瓜蛋白質Cmelo在酵母中產生葫蘆二烯醇。圖32示出含有對應於葫蘆二烯醇之峰及特徵性碎片的質譜圖。Cmelo蛋白質序列提供於SEQ ID NO: 902中，且Cmelo之編碼序列（DNA）提供於SEQ ID NO: 901中。預期亦可使用中國南瓜蛋白質Cmos1在例如酵母細胞之重組宿主細胞中產生葫蘆二烯醇。經由基因組DNA PCR產物序列與經由公共資料庫（Pubmed）可獲得的已知葫蘆二烯醇合成酶序列之比對獲得Cmos1序列Cmos1（蛋白質）（SEQ ID NO: 426）及Cmos1（DNA）（SEQ ID NO: 427）。預期Cmost 1蛋白質（SEQ ID NO: 426）可用於在例如酵母細胞之重組宿主細胞中產生葫蘆二烯醇。 將其他氧化角鯊烯環化酶轉化成葫蘆二烯醇合成酶
藉由氧化角鯊烯增強將含有經修飾氧化角鯊烯基因之質體轉形至酵母菌株中。使菌株在30℃、150轉/分鐘至250轉/分鐘下生長1天至3天。
亦使用來自天然宿主豌豆之蛋白質PSX Y118L在酵母中產生葫蘆二烯醇。當在位置118處之酪胺酸被轉化成白胺酸時，圖33示出含有對應於葫蘆二烯醇之峰及特徵性碎片的質譜圖。蛋白質及編碼經修飾氧化角鯊烯環化酶之DNA的序列為：PSXY118L（蛋白質）（SEQ ID NO: 904）及PSXY118L（DNA，密碼子最佳化）（SEQ ID NO: 903）。 亦使用來自網柱細胞黏菌屬之氧化角鯊烯環化酶在酵母中產生葫蘆二烯醇。如圖34中所示，當在位置80處之酪胺酸被轉化成白胺酸時，示出葫蘆二烯醇之HPLC峰。蛋白質及編碼經修飾氧化角鯊烯環化酶之DNA的序列為：DdCASY80L（蛋白質）（SEQ ID NO: 906）及DdCASY80L（DNA）（SEQ ID NO: 905）。 改善葫蘆二烯醇合成酶活性
編碼來自厚皮甜瓜之葫蘆二烯醇合成酶之基因經密碼子最佳化（SEQ ID：907）且用作用於產生修飾庫之起點。經由標準分子生物學技術引入由在酶之N端（亦即5'）或C端（亦即3'）末端的融合肽組成之修飾。藉由氧化角鯊烯增強將經修飾葫蘆二烯醇合成酶基因之質體庫轉形至酵母菌株中。使用上文所述之LCMS方法2，藉由葫蘆二烯醇對比內標在所期望的滯留時間的409個及427個正質量碎片之峰高度或面積之比來量測酶活性。按超過親本酶之平均活性的平均活性%給酶效能評分（n=8）。酶之步驟1序列及編碼酶之序列可見於SEQ ID NO: 951-1012中。步驟1序列亦包含如表1中所述之融合物SS2c-G10、SS2e-A7b、SS2d-G11、SS2e-A7a、SS4d-G5、SS4d-C7、SS3b-D8以及SS2c-A10a。步驟 3. 製造 11-OH 葫蘆二烯醇
CYP87D18（CYP450，羅漢果）及SgCPR（CYP450還原酶，羅漢果）在釀酒酵母菌株中表現，產生葫蘆二烯醇。使用HPLC及質譜資料（圖36）觀察11-OH葫蘆二烯醇（亦即11-羥基葫蘆二烯醇）。羅漢果CYP87D18蛋白質序列示出於SEQ ID NO: 872中，且CYP87D18（密碼子最佳化之DNA）編碼序列示出於SEQ ID NO: 871中。羅漢果SgCPR蛋白質序列示出於SEQ ID NO: 874中，且SgCPR1（密碼子最佳化之DNA）編碼序列示出於SEQ ID NO: 873中。
額外的來自羅漢果及甘草（CYP88D6）之CYP450在釀酒酵母菌株中表現，產生葫蘆二烯醇。酶之蛋白質序列及DNA編碼序列提供於SEQ ID NO: 875-890中。步驟 4. 製造羅漢果醇
CYP1798（CYP450酶，羅漢果）及EPH2A（環氧化物水解酶，羅漢果）在釀酒酵母菌株中表現，產生11-OH葫蘆二烯醇。使用HPLC及質譜資料（圖36）觀察羅漢果醇。關於序列，酶之DNA編碼序列及蛋白質序列提供於SEQ ID NO: 891-894中。 葫蘆二烯醇及/或11-OH葫蘆二烯醇之環氧化
為了測試環氧化，亦在釀酒酵母菌株中表現額外的來自羅漢果及甘草（CYP88D6）之CYP450及SQE，產生葫蘆二烯醇或11-OH葫蘆二烯醇。
關於SQE，酶之蛋白質序列及DNA編碼序列提供於SEQ ID NO: 882-888中。關於CYP450，酶之蛋白質序列及DNA編碼序列提供於SEQ ID NO: 875-890中。步驟 7 ： 在釀酒酵母中由羅漢果苷 IIIE 產生 化合物 1 。
表現截切型聚葡萄糖蔗糖酶（tDexT）之釀酒酵母菌株在含有7毫克/毫升羅漢果苷V之YPD（30℃，250轉/分鐘）中培育1天至2天，引起水解，變成羅漢果苷IIIE。將釀酒酵母細胞收集、溶解，且隨後重新與含有羅漢果苷IIIE之YPD上清液混合。為起始聚葡萄糖蔗糖酶反應，將蔗糖添加至200公克/公升之最終濃度，接著在30℃、250轉/分鐘下培育2天。使用HPLC（圖37）觀察化合物1之產生。tDexT之蛋白質序列示出於SEQ ID NO: 896中，且tDexT之DNA編碼序列示出於SEQ ID NO. 895中。 實例64
使釀酒酵母或解脂耶氏酵母在羅漢果苷V存在下生長，以便酵母中之水解酶產生羅漢果苷IIIE。1天或2天後，溶解細胞，藉由HPLC分析以測定羅漢果苷含量。培育1天後，釀酒酵母產生羅漢果苷V、羅漢果苷IV以及羅漢果苷IIIE之混合物。培育2天後，基本上所有羅漢果苷全轉化為羅漢果苷IIIE，如圖40A中所示。
類似地，培育2天後，解脂耶氏酵母主要產生羅漢果苷IIIE（圖40B中所示）。 實例65
釀酒酵母或解脂耶氏酵母在化合物1存在下生長。不同於其他羅漢果苷（參見實例64），未觀察到因為化合物1水解而產生的水解產物，如圖41中所示。 實例66
釀酒酵母經修飾以過度表現聚葡萄糖蔗糖酶（DexT）。此經修飾之菌株在羅漢果苷混合物存在下生長，以便釀酒酵母中之水解酶產生羅漢果苷IIIE。培育2天後，使細胞溶解以釋放出DexT酶，且補充蔗糖。24小時後，產生大量化合物1（圖42中所示）。 實例67：具有葫蘆二烯醇合成酶活性之融合蛋白的產生
製備葫蘆二烯醇合成酶基因之釀酒酵母同框（in-frame）融合多核苷酸之集合或庫（DNA編碼序列提供於SEQ ID NO: 907中，且蛋白質序列提供於SEQ ID NO: 902中）。將同框融合多核苷酸選殖至酵母載體分子中以產生融合蛋白。
產生多種融合蛋白且測試其葫蘆二烯醇合成酶活性。在此實例中所產生之融合蛋白中之一些的測試結果示出於表2中。表 2 .融合蛋白之葫蘆二烯醇合成酶活性 實例68：UDP-糖基轉移酶（311酶，SEQID: 436-438）在羅漢果苷IIIE、羅漢果苷IVE或羅漢果苷IVA存在下產生羅漢果苷IV及羅漢果苷V異構體
反應條件：向50毫升法爾康管（Falcon tube）中添加17毫升水、3毫升pH 7.0 1 M Tris-HCl、0.12公克UDP（卡博森斯（Carbosynth））、3公克蔗糖、300微升蛋白酶抑制劑100×M221、150微升康黴素（50毫克/毫升）、1.185毫升蔗糖合成酶Sus1（1毫克/毫升粗提取物）、150毫克起始羅漢果苷以及6毫升311酶（1毫克/毫升粗提取物）且在30℃、150轉/分鐘下培育。定期藉由LC-MS監測反應進度。3天後，藉由在攪拌（500轉/分鐘）下加熱至80℃持續30分鐘來停止反應。隨後使反應物離心（4000轉/分鐘，10分鐘，艾本德）且經由50毫升0.22微米PVDF過濾上清液。所鑑別到之反應產物描繪於圖43中。表 1 ： 本文中所揭露之一些蛋白質及DNA序列
雖然本發明已參考其具體實施例加以描述，但所屬領域中具通常知識者應理解，在不脫離本發明的真實精神和範圍的情況下，可進行各種改變且可替代同等物。這包含不提供本文中所闡述之所有益處及特徵的實施例。另外，可進行許多修改以使特定情形、材料、物質組成物、製程、一或多個製程步驟適合於本發明的目標、精神和範圍。所有此類修改意欲在此處所附之申請專利範圍之範圍內。因此，僅參考隨附申請專利範圍界定本發明之範圍。
1‧‧‧步驟
2‧‧‧步驟
3‧‧‧步驟
4‧‧‧步驟
5‧‧‧步驟
6‧‧‧步驟
7‧‧‧步驟
圖 1 示出在用CGTase處理羅漢果苷IIIE之後化合物1產生之HPLC資料及質譜資料（插圖）。圖 2 示出在用變種鏈球菌（Streptococcus mutans ）Clarke ATCC 25175聚葡萄糖蔗糖酶處理羅漢果苷IIIE之後化合物1產生之HPLC資料及質譜資料（插圖）。圖 3 示出在木聚糖存在下用賽路克雷斯（Celluclast）處理之後羅漢果苷糖基化反應之HPLC資料及質譜資料（插圖）。圖 4 及圖 5 示出在用UDP-糖基轉移酶處理之後羅漢果苷糖基化反應之HPLC資料及質譜資料（插圖）。圖 6 示出在用UDP-糖基轉移酶UGT73C6將羅漢果醇處理成羅漢果苷I之後的HPLC資料及質譜資料（插圖）。圖 7 至圖 9 示出在用UDP-糖基轉移酶（338）（SEQ ID NO: 405）將羅漢果醇處理成產物羅漢果苷I、羅漢果苷IIA以及2種不同的羅漢果苷III產物之後的HPLC資料及質譜資料（插圖）。圖 10 及圖 11 示出在用UDP-糖基轉移酶處理羅漢果苷IIIE以產生賽門苷I及羅漢果苷V產物之後的HPLC資料及質譜資料（插圖）。圖 12 至圖 14 示出在用UDP-糖基轉移酶（339）（SEQ ID NO:409）處理羅漢果醇、賽門苷I或化合物1以分別產生羅漢果苷I、異羅漢果苷V以及化合物1衍生物之後的反應產物的HPLC資料及質譜資料（插圖）。圖 15 至圖 20 示出羅漢果苷IIIA、羅漢果苷IVE、羅漢果苷V之HPLC資料及質譜資料（插圖），其分別是用UDP-糖基轉移酶（330）（SEQ ID NO: 411）處理羅漢果苷IIA、羅漢果苷IIE、羅漢果苷IIIE、羅漢果苷IVA或羅漢果苷IVE所產生的。圖 21 及圖 22 示出反應產物羅漢果苷IVE及羅漢果苷V之質譜圖。圖 23 示出藉由葫蘆二烯醇合成酶（SgCbQ）（SEQ ID NO: 417）產生葫蘆二烯醇。圖 24 示出使用酶Cpep2（SEQ ID NO: 420）產生葫蘆二烯醇。圖 25 示出使用酶Cpep4（SEQ ID NO: 422）產生葫蘆二烯醇。圖 26 示出藉由環氧化物水解酶（SEQ ID NO: 428）催化產生二羥基葫蘆二烯醇。圖 27A 至圖 27B 示出化合物1對微生物酶水解之耐受性。圖 28 示出來自Hilic_80_20_方法之α-羅漢果苷異構體混合物的UPLC層析圖。圖 29 示出基於Hilic_80_20_方法之UPLC分析的樣品純度。圖 30 示出流程圖，所述流程圖展示用於製造化合物1之非限制性例示性途徑。圖 31 示出圖30中所示之步驟1之用於增強氧化角鯊烯的二環氧角鯊烯的UV吸光度。圖 32 示出在步驟2中使用來自厚皮甜瓜（Cucumis melo ）及筍瓜（Cucurbita maxima ）之酶產生葫蘆二烯醇。圖 33 示出在步驟2中使用來自豌豆（Pisum sativum ）之酶產生葫蘆二烯醇。圖 34 示出在步驟2中使用來自網柱細胞黏菌屬（Dictyostelium sp. ）之酶產生葫蘆二烯醇。圖 35 示出圖30中所示之途徑之步驟3的中間體。圖 36 示出圖30中所示之途徑之步驟4羅漢果醇合成之中間體的質譜資料。圖 37 示出圖30中所示之途徑之步驟7化合物1之合成的中間體。圖 38 為示意性圖解，繪示了藉由糖基化酶產生高糖基化羅漢果苷，其隨後可以水解回到羅漢果苷IIIE。圖 39 為示意性圖解，繪示了可以怎樣使用水解來水解高糖基化羅漢果苷產生羅漢果苷IIIE，羅漢果苷IIIE隨後可轉化為化合物1。圖 40A 至圖 40B 示出在釀酒酵母或解脂耶氏酵母中培育2天之後，基本上所有羅漢果苷皆被轉化為羅漢果苷IIIE。圖 41 示出未在釀酒酵母或解脂耶氏酵母中偵測到化合物1之水解產物。圖 42 示出在經修飾以過度表現聚葡萄糖蔗糖酶（dextransucrase，DexT）之釀酒酵母中產生化合物1。圖 43 示出由311酶（UDP-糖基轉移酶）催化的酶促反應。

Claims (256)

  1. 一種製造化合物1的方法，所述化合物1具有以下結構，（1 ）， 所述方法包括： 使羅漢果苷IIIE 與能夠催化羅漢果苷IIIE 產生化合物1之第一酶接觸。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的製造化合物1的方法，其中使羅漢果苷IIIE 與所述第一酶接觸包括使羅漢果苷IIIE 與包括編碼所述第一酶之第一基因的重組宿主細胞接觸。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一基因與所述重組宿主細胞異源。
  4. 如申請專利範圍第2項或第3項所述的製造化合物1的方法，其中所述羅漢果苷IIIE 存在於及/或產自於所述重組宿主細胞。
  5. 如申請專利範圍第2項至第4項中任一項所述的製造化合物1的方法，包括在培養基中在表現所述第一酶之條件下培養所述重組宿主細胞。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一酶為UDP糖基轉移酶（UDP glycosyltransferase）、環麥芽糊精葡聚糖轉移酶（cyclomaltodextrin glucanotransferase，CGTase）、糖基轉移酶（glycotransferase）、聚葡萄糖蔗糖酶（dextransucrase）、纖維素酶（cellulase）、β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）、澱粉酶（amylase）、轉葡萄糖苷酶（transglucosidase）、果膠酶（pectinase）以及聚葡萄糖酶（dextranase）中之一者或多者。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一酶為環麥芽糊精葡聚糖轉移酶。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的製造化合物1的方法，其中所述環麥芽糊精葡聚糖轉移酶包括與SEQ ID NO: 1、3、78-101、148以及154中之任一者之序列具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  9. 如申請專利範圍第7項所述的製造化合物1的方法，其中所述環麥芽糊精葡聚糖轉移酶包括SEQ ID NO: 1、3、78-101、148以及154中之任一者的胺基酸序列。
  10. 如申請專利範圍第7項所述的製造化合物1的方法，其中所述環麥芽糊精葡聚糖轉移酶由SEQ ID NO: 1、3、78-101或154之胺基酸序列組成。
  11. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一酶為聚葡萄糖蔗糖酶。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的製造化合物1的方法，其中所述聚葡萄糖蔗糖酶包括與SEQ ID NO: 2、103、106-110、156、159-162以及896中所闡述之序列中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  13. 如申請專利範圍第11項所述的製造化合物1的方法，其中所述聚葡萄糖蔗糖酶由與SEQ ID NO: 104、105、157、158以及895中之任一者具有至少70%序列一致性的核酸序列所編碼。
  14. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一酶為轉葡萄糖苷酶。
  15. 如申請專利範圍第14項所述的製造化合物1的方法，其中所述轉葡萄糖苷酶包括與SEQ ID NO: 163-291及723中之任一者之序列具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  16. 如申請專利範圍第14項所述的製造化合物1的方法，其中所述轉葡萄糖苷酶包括SEQ ID NO: 163-291及723中之任一者的胺基酸序列。
  17. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一酶為β-葡萄糖苷酶。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的製造化合物1的方法，其中所述β-葡萄糖苷酶包括與SEQ ID NO: 102、292、354-374以及678-741中之任一者中所闡述之序列具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  19. 如申請專利範圍第1項至第18項中任一項所述的製造化合物1的方法，包括使羅漢果苷IIA與能夠催化羅漢果苷IIA產生羅漢果苷IIIE 之第二酶接觸。
  20. 如申請專利範圍第19項所述的製造化合物1的方法，其中使羅漢果苷IIA與所述第二酶接觸包括使羅漢果苷IIA與用於產生羅漢果苷IIIE 之重組宿主細胞接觸，且其中所述重組宿主細胞包括編碼所述第二酶之第二基因。
  21. 如申請專利範圍第20項所述的製造化合物1的方法，其中所述羅漢果苷IIA產自於及/或存在於所述重組宿主細胞中。
  22. 如申請專利範圍第20項或第21項所述的製造化合物1的方法，其中所述第二酶為UDP糖基轉移酶、環麥芽糊精葡聚糖轉移酶、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一者或多者。
  23. 如申請專利範圍第22項所述的製造化合物1的方法，其中所述第二酶為尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶（uridine diphosphate-glucosyl transferase，UGT）。
  24. 如申請專利範圍第23項所述的製造化合物1的方法，其中所述尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶為UGT73C3（SEQ ID NO: 4）、UGT73C6（SEQ ID NO: 5）、UGT85C2（SEQ ID NO: 6）、UGT73C5（SEQ ID NO: 7）、UGT73E1（SEQ ID NO: 8）、UGT98（SEQ ID NO: 9或407）、UGT1576（SEQ ID NO:15）、UGT SK98（SEQ ID NO:16）、UGT430（SEQ ID NO:17）、UGT1697（SEQ ID NO:18）、UGT11789（SEQ ID NO:19），或包括與SEQ ID NO: 4-9、15-19、125、126、128、129、293-307、407、409、411、413、439、441以及444中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  25. 如申請專利範圍第24項所述的製造化合物1的方法，其中所述尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶由與UGT1495（SEQ ID NO: 10）、UGT1817（SEQ ID NO: 11）、UGT5914（SEQ ID NO: 12）、UGT8468（SEQ ID NO:13）、UGT10391（SEQ ID NO:14）以及SEQ ID NO: 116-124、127、130、408、410、412、414、440、442、443以及445中所闡述之序列中之任一者包括至少70%序列一致性的核酸序列編碼。
  26. 如申請專利範圍第1項至第25項中任一項所述的製造化合物1的方法，包括使羅漢果醇與一或多種能夠催化羅漢果醇產生羅漢果苷IIIE 之酶接觸。
  27. 如申請專利範圍第2項至第26項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中使羅漢果醇與一或多種能夠催化羅漢果醇產生羅漢果苷IIE及/或羅漢果苷IIIE之酶接觸包括使羅漢果醇與所述重組宿主細胞接觸以產生羅漢果苷IIE及/或羅漢果苷IIIE，其中所述重組宿主細胞包括編碼一或多種能夠催化羅漢果醇產生羅漢果苷IIE及/或羅漢果苷IIIE之所述酶的一或多個基因。
  28. 如申請專利範圍第27項所述的製造化合物1的方法，其中所述羅漢果醇產自於及/或存在於所述重組宿主細胞中。
  29. 如申請專利範圍第27項或第28項所述的製造化合物1的方法，其中一或多種能夠催化羅漢果醇產生羅漢果苷IIE及/或羅漢果苷IIIE之所述酶中之至少一者包括與以下序列的序列中之任一者具有至少70%序列一致性的序列，或者由與以下序列的序列中之任一者具有至少70%序列一致性的序列所編碼：SEQ ID NO: 315、316、420、422、424、426、430、431、446、871、845-949以及951-1012。
  30. 如申請專利範圍第27項至第29項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中一或多種之所述酶包括UDP糖基轉移酶、環麥芽糊精葡聚糖轉移酶、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。
  31. 如申請專利範圍第27項至第30項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中一或多種之所述酶中之至少一者為尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶（UGT）。
  32. 如申請專利範圍第31項所述的製造化合物1的方法，其中所述尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶為UGT73C3、UGT73C6、85C2、UGT73C5、UGT73E1、UGT98、UGT1495、UGT1817、UGT5914、UGT8468、UGT10391、UGT1576、UGT SK98、UGT430、UGT1697或UGT11789，或包括與SEQ ID NO: 4-9、15-19、125、126、128、129、293-307、405、406、407、409、411、413、439、441以及444中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  33. 如申請專利範圍第1項至第32項中任一項所述的製造化合物1的方法，包括使羅漢果苷化合物與一或多種能夠催化羅漢果苷化合物產生羅漢果苷IIIE之酶進行接觸以產生羅漢果苷IIIE，其中所述羅漢果苷化合物為羅漢果苷IA1、羅漢果苷IE1、羅漢果苷IIA1、羅漢果苷IIE、羅漢果苷IIA、羅漢果苷IIIA1、羅漢果苷IIIA2、羅漢果苷III、羅漢果苷IV、羅漢果苷IVA、羅漢果苷V以及賽門苷（siamenoside）中之一或多者。
  34. 如申請專利範圍第33項所述的製造化合物1的方法，其中使羅漢果苷化合物與一或多種能夠催化羅漢果苷化合物產生羅漢果苷IIIE之酶接觸以產生羅漢果苷IIIE包括使所述羅漢果苷化合物與所述重組宿主細胞接觸，其中所述重組宿主細胞包括編碼一或多種能夠催化所述羅漢果苷化合物產生羅漢果苷IIIE之所述酶的一或多個基因。
  35. 如申請專利範圍第34項所述的製造化合物1的方法，其中所述羅漢果苷化合物產自於及/或存在於所述重組宿主細胞中。
  36. 如申請專利範圍第33項至第35項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中一或多種能夠催化所述羅漢果苷化合物產生羅漢果苷IIIE之所述酶包括UDP糖基轉移酶、環麥芽糊精葡聚糖轉移酶、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。
  37. 如申請專利範圍第33項至第36項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述羅漢果苷化合物為羅漢果苷IIE。
  38. 如申請專利範圍第33項至第37項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中一或多種能夠催化所述羅漢果苷化合物產生羅漢果苷IIIE之所述酶包括與SEQ ID NO: 1、3、78-101、106-109、147、154、163-303、405、411、354-405、447-723、770、776以及782中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  39. 如申請專利範圍第33項至第38項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述羅漢果苷化合物為羅漢果苷IIA或羅漢果苷IIE，且其中與一或多種酶之所述接觸產生羅漢果苷IIIA、羅漢果苷IVE及羅漢果苷V中之一或多者。
  40. 如申請專利範圍第33項至第37項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述一或多種酶包括SEQ ID NO: 304、405、411、872、874、978、880、882、884、886、888、890、892、894以及896中之任一者中所闡述之胺基酸。
  41. 如申請專利範圍第33項至第37項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述一或多種酶由SEQ ID NO: 305、406、412、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893以及895中之任一者中所闡述之序列編碼。
  42. 如申請專利範圍第2項至第41項中任一項所述的製造化合物1的方法，包括使羅漢果苷IA1與所述重組宿主細胞進行接觸，其中所述重組宿主細胞包括編碼UGT98酶或UGT SK98酶之基因。
  43. 如申請專利範圍第42項所述的製造化合物1的方法，其中所述UGT98酶或所述UGT SK98酶包括與SEQ ID NO: 9、407、16或306具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  44. 如申請專利範圍第42項所述的製造化合物1的方法，其中所述UGT98由SEQ ID NO: 307中所闡述之序列編碼。
  45. 如申請專利範圍第42項至第44項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述接觸引起在所述細胞中產生羅漢果苷IIA。
  46. 如申請專利範圍第2項至第45項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述方法包括使11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇（11-hydroxy-24,25 epoxy cucurbitadienol）與所述重組宿主細胞進行接觸，其中所述重組宿主細胞包括編碼環氧化物水解酶的第三基因。
  47. 如申請專利範圍第46項所述的製造化合物1的方法，其中所述11-羥基-24,25環氧葫蘆二烯醇存在於及/或產自於所述重組宿主細胞。
  48. 如申請專利範圍第2項至第47項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述方法包括使11-羥基-葫蘆二烯醇與所述重組宿主細胞接觸，其中所述重組宿主細胞包括編碼細胞色素P450或環氧化物水解酶的第四基因。
  49. 如申請專利範圍第48項所述的製造化合物1的方法，其中所述11-羥基-葫蘆二烯醇產自於及/或存在於所述重組宿主細胞中。
  50. 如申請專利範圍第1項至第49項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述方法包括使3,24,25-三羥基葫蘆二烯醇與所述重組宿主細胞接觸，其中所述重組宿主細胞包括編碼細胞色素P450的第五基因。
  51. 如申請專利範圍第50項所述的製造化合物1的方法，其中所述3,24,25-三羥基葫蘆二烯醇存在於及/或產自於所述重組宿主細胞。
  52. 如申請專利範圍第47項至第51項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述接觸引起在所述重組宿主細胞中產生羅漢果醇。
  53. 如申請專利範圍第50項至第52項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述細胞色素P450包括與SEQ ID NO: 20、49、308、315、430、872、874、876、878、880、882、884、886、888、889以及892中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列；或所述細胞色素P450由與SEQ ID NO: 31-48、316、431、871、873、875、877、879、881、883、885、887、890以及891中之任一者具有至少70%序列一致性的核酸序列編碼。
  54. 如申請專利範圍第46項至第53項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述環氧化物水解酶包括與SEQ ID NO: 21-30及309-314中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列；或所述環氧化物水解酶由與SEQ ID NO: 114及115中之任一者具有至少70%序列一致性的核酸序列編碼。
  55. 如申請專利範圍第2項至第54項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述方法包括使葫蘆二烯醇與所述重組宿主細胞進行接觸，且其中所述重組宿主細胞包括編碼細胞色素P450的基因。
  56. 如申請專利範圍第55項所述的製造化合物1的方法，其中所述接觸引起11-羥基葫蘆二烯醇之產生。
  57. 如申請專利範圍第55項或第56項所述的製造化合物1的方法，其中所述葫蘆二烯醇產自於及/或存在於所述重組宿主細胞中。
  58. 如申請專利範圍第55項至第57項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述細胞色素P450由與SEQ ID NO: 31-48、316、431、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889以及892中之任一者具有至少70%序列一致性的核酸序列編碼。
  59. 如申請專利範圍第55項至第57項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述細胞色素P450包括與SEQ ID NO: 20、31、49、308、315、430、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890以及891具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  60. 如申請專利範圍第2項至第59項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述方法包括使2,3-氧化角鯊烯、二氧化角鯊烯以及二環氧角鯊烯中之一或多者與所述重組宿主細胞進行接觸，其中所述重組宿主細胞包括編碼具有葫蘆二烯醇合成酶活性之多肽的第七基因。
  61. 如申請專利範圍第60項所述的製造化合物1的方法，其中具有葫蘆二烯醇合成酶活性之所述多肽為包括與葫蘆二烯醇合成酶融合之融合域（fusion domain）的融合蛋白。
  62. 如申請專利範圍第61項所述的製造化合物1的方法，其中所述融合蛋白包括與所述葫蘆二烯醇合成酶之N端區、C端區或兩者融合的融合域。
  63. 如申請專利範圍第62項所述的製造化合物1的方法，其中所述融合域為約3個至約1000個胺基酸長。
  64. 如申請專利範圍第62項所述的製造化合物1的方法，其中所述融合域為約5個至約50個胺基酸長。
  65. 如申請專利範圍第62項所述的製造化合物1的方法，其中所述融合域為功能蛋白之實質性部分或完整序列。
  66. 如申請專利範圍第61項所述的製造化合物1的方法，其中具有葫蘆二烯醇合成酶活性之所述多肽包括與SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327-333、417、420、422、424、426、446、902、904或906具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  67. 如申請專利範圍第61項或第62項所述的製造化合物1的方法，其中具有葫蘆二烯醇合成酶活性之所述多肽由與SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903或905具有至少70%序列一致性的核酸序列編碼。
  68. 如申請專利範圍第60項至第67項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述接觸引起葫蘆二烯醇及/或24,25-環氧葫蘆二烯醇之產生。
  69. 如申請專利範圍第60項至第68項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中2,3-氧化角鯊烯、二氧化角鯊烯以及二環氧角鯊烯中之一或多者產自於及/或存在於所述重組宿主細胞中。
  70. 如申請專利範圍第69項所述的製造化合物1的方法，其中所述2,3-氧化角鯊烯或所述二環氧角鯊烯由包括SEQ ID NO: 898或900中所闡述之序列的酶產生。
  71. 如申請專利範圍第69項所述的製造化合物1的方法，其中2,3-氧化角鯊烯、二氧化角鯊烯以及二環氧角鯊烯中之一或多者之產生有關由SEQ ID NO: 897或899中所闡述之核酸序列編碼的酶。
  72. 如申請專利範圍第60項所述的製造化合物1的方法，其中具有葫蘆二烯醇合成酶活性之所述多肽包括與SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327、329-333、420、422、424、426、446、902、904以及906中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  73. 如申請專利範圍第60項所述的製造化合物1的方法，其中具有葫蘆二烯醇合成酶活性之所述多肽由包括與SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903以及905中之任一者具有70%序列一致性之核酸序列的基因編碼。
  74. 如申請專利範圍第56項至第73項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述11-羥基葫蘆二烯醇產自於及/或存在於所述重組宿主細胞中。
  75. 如申請專利範圍第74項所述的製造化合物1的方法，其中所述重組宿主細胞包括編碼CYP87D18或SgCPR蛋白質之基因。
  76. 如申請專利範圍第75項所述的製造化合物1的方法，其中所述CYP87D18或所述SgCPR蛋白質包括與SEQ ID NO: 872或SEQ ID NO: 874具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  77. 如申請專利範圍第75項所述的製造化合物1的方法，其中所述CYP87D18或所述SgCPR蛋白質由與SEQ ID NO: 871或SEQ ID NO: 873具有至少70%序列一致性的核酸序列編碼。
  78. 如申請專利範圍第2項至第77項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述方法包括使角鯊烯與所述重組宿主細胞進行接觸，其中所述重組宿主細胞包括編碼角鯊烯環氧酶之第八基因。
  79. 如申請專利範圍第78項所述的製造化合物1的方法，其中所述接觸引起2,3-氧化角鯊烯之產生。
  80. 如申請專利範圍第78項或第79項所述的製造化合物1的方法，其中所述角鯊烯產自於及/或存在於所述重組宿主細胞中。
  81. 如申請專利範圍第78項至第80項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述角鯊烯環氧酶包括與SEQ ID No: 50-56、60、61、334以及335中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  82. 如申請專利範圍第78項至第80項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述角鯊烯環氧酶由與SEQ ID NO: 335具有至少70%序列一致性的核酸序列編碼。
  83. 如申請專利範圍第2項至第82項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述方法包括使焦磷酸法呢酯（farnesyl pyrophosphate）與所述重組宿主細胞進行接觸，其中所述重組宿主細胞包括編碼角鯊烯合成酶之第九基因。
  84. 如申請專利範圍第83項所述的製造化合物1的方法，其中所述接觸引起角鯊烯之產生。
  85. 如申請專利範圍第83項或第84項所述的製造化合物1的方法，其中所述焦磷酸法呢酯產自於及/或存在於所述重組宿主細胞中。
  86. 如申請專利範圍第83項至第85項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述角鯊烯合成酶包括與SEQ ID NO: 69及336中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  87. 如申請專利範圍第83項至第85項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述角鯊烯合成酶由包括與SEQ ID NO: 337具有至少70%序列一致性之核酸序列的序列編碼。
  88. 如申請專利範圍第2項至第87項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述方法包括使香葉基-PP（geranyl-PP）與所述重組宿主細胞進行接觸，其中所述重組宿主細胞包括編碼法呢基-PP合成酶之第十基因。
  89. 如申請專利範圍第88項所述的製造化合物1的方法，其中所述接觸引起法呢基-PP（farnesyl-PP）之產生。
  90. 如申請專利範圍第88項或第89項所述的製造化合物1的方法，其中所述香葉基-PP產自於及/或存在於所述重組宿主細胞中。
  91. 如申請專利範圍第88項至第90項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述法呢基-PP合成酶包括與SEQ ID NO: 338具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  92. 如申請專利範圍第88項至第90項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述法呢基-PP合成酶由與SEQ ID NO: 339具有至少70%序列一致性的核酸序列編碼。
  93. 如申請專利範圍第2項至第92項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一基因、第二基因、第三基因、第四基因、第五基因、第六基因、第七基因、第八基因、第九基因以及第十基因中之一或多者可操作地連接於異源啟動子。
  94. 如申請專利範圍第93項所述的製造化合物1的方法，其中所述異源啟動子為CMV、EF1a、SV40、PGK1、人類β肌動蛋白、CAG、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、CaMV35S、Ubi、T7、T7lac、Sp6、araBAD、trp、lac、Ptac、pL啟動子或其組合。
  95. 如申請專利範圍第93項或第94項所述的製造化合物1的方法，其中所述啟動子為可誘導型啟動子、可抑制型啟動子或持續性表現型啟動子。
  96. 如申請專利範圍第2項至第95項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述重組宿主細胞中之丙酮酸鹽、乙醯輔酶A、檸檬酸鹽以及TCA循環中間體中之一或多者的產生已被正調節。
  97. 如申請專利範圍第2項至第96項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述重組宿主細胞中之胞質定位已被正調節。
  98. 如申請專利範圍第2項至第97項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一基因、第二基因、第三基因、第四基因、第五基因、第六基因、第七基因、第八基因、第九基因以及第十基因中之一或多者包括至少一個編碼2A自裂解肽之序列。
  99. 如申請專利範圍第2項至第98項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述重組宿主細胞為植物細胞、雙殼貝類細胞、魚細胞、真菌細胞、細菌細胞或哺乳動物細胞。
  100. 如申請專利範圍第99項所述的製造化合物1的方法，其中所述植物由下述者所構成的族群中選出：羅漢果屬（Siraitia）、苦瓜屬（Momordica）、絞股藍屬（Gynostemma）、南瓜屬（Cucurbita）、甜瓜屬（Cucumis）、芥菜屬（Arabidopsis）、蒿屬（Artemisia）、甜菊屬（Stevia）、人參屬（Panax）、睡茄屬（Withania）、大戟屬（Euphorbia）、苜蓿屬（Medicago）、吊蘭屬（Chlorophytum）、五加屬（Eleutherococcus）、楤木屬（Aralia）、桑屬（Morus）、苜蓿屬、樺屬（Betula）、黃耆屬（Astragalus）、麻風樹屬（Jatropha）、山茶屬（Camellia）、柳蕈屬（Hypholoma）、麴菌屬（Aspergillus）、茄屬（Solanum）、石杉屬（Huperzia）、假繁縷屬（Pseudostellaria）、黃麻屬（Corchorus）、常春藤屬（Hedera）、地錢屬（Marchantia）以及桑屬。
  101. 如申請專利範圍第99項所述的製造化合物1的方法，其中所述真菌由下述者所構成的族群中選出：髮癬菌屬（Trichophyton）、桑黃屬（Sanghuangporus）、台芝屬（Taiwanofungus）、鏈疫孢屬（Moniliophthora）、盤二孢屬（Marssonina）、色二孢黴屬（Diplodia）、香菇屬（Lentinula）、法夫酵母屬（Xanthophyllomyces）、普克尼亞屬（Pochonia）、刺盤孢屬（Colletotrichum）、間座殼屬（Diaporthe）、組織胞漿菌屬（Histoplasma）、球孢子菌屬（Coccidioides）、組織胞漿菌屬、桑黃屬、短梗黴屬（Aureobasidium）、普克尼亞屬、青黴菌屬（Penicillium）、孢子絲菌屬（Sporothrix）、黑殭菌屬（Metarhizium）、麴菌屬、耶氏酵母屬（Yarrowia）以及油脂酵母屬（Lipomyces）。
  102. 如申請專利範圍第99項所述的製造化合物1的方法，其中所述真菌為小巢狀麴菌（Aspergillus nidulans ）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica ）或圓紅冬孢酵母（Rhodosporin toruloides ）。
  103. 如申請專利範圍第99項所述的製造化合物1的方法，其中所述重組宿主細胞為酵母細胞。
  104. 如申請專利範圍第103項所述的製造化合物1的方法，其中所述酵母由下述者所構成的族群中選出：念珠菌屬（Candida）、酵母屬（Sacccharaomyces）、酵母亞門（Saccharomycotina）、外囊菌亞門（Taphrinomycotina）、裂殖酵母綱（Schizosaccharomycetes）、駒形氏酵母屬（Komagataella）、擔子菌門（Basidiomycota）、傘菌亞門（Agaricomycotina）、銀耳綱（Tremellomycetes）、柄鏽菌亞門（Pucciniomycotina）、短梗黴屬、錐毛殼屬（Coniochaeta）、紅冬孢酵母屬（Rhodosporidium）以及微球黑粉菌綱（Microboryomycetes）。
  105. 如申請專利範圍第99項所述的製造化合物1的方法，其中所述細菌由下述者所構成的族群中選出：弗蘭克氏菌屬（Frankia）、放線菌門（Actinobacteria）、鏈黴菌屬（Streptomyces）以及腸球菌屬（Enterococcus）。
  106. 如申請專利範圍第99項所述的製造化合物1的方法，其中所述重組宿主細胞為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）細胞或解脂耶氏酵母細胞。
  107. 如申請專利範圍第2項至第106項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一基因、第二基因、第三基因、第四基因、第五基因、第六基因、第七基因、第八基因、第九基因以及第十基因中之一或多者為用於在細菌細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、真菌細胞及/或昆蟲細胞中表現的密碼子最佳化基因。
  108. 如申請專利範圍第2項至第107項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一基因、第二基因、第三基因、第四基因、第五基因、第六基因、第七基因、第八基因、第九基因以及第十基因中之一或多者包括功能突變以提高所編碼之酶的活性。
  109. 如申請專利範圍第5項至第108項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中培養所述重組宿主細胞包括針對培養條件之pH、溶解氧含量、氮含量或其組合來監測培養。
  110. 如申請專利範圍第1項至第109項中任一項所述的製造化合物1的方法，包括分離化合物1。
  111. 如申請專利範圍第110項所述的製造化合物1的方法，其中分離化合物1包括溶解所述重組宿主細胞及/或從所述培養基分離化合物1。
  112. 如申請專利範圍第1項至第111項中任一項所述的製造化合物1的方法，包括純化化合物1。
  113. 如申請專利範圍第112項所述的製造化合物1的方法，其中純化化合物1包括HPLC、固相萃取或其組合。
  114. 如申請專利範圍第112項或第113項所述的製造化合物1的方法，其中所述純化包括：收集所述重組宿主細胞；保留上清液；以及溶解所述重組宿主細胞。
  115. 如申請專利範圍第114項所述的製造化合物1的方法，其中所述溶解包括使所述細胞受到剪切力或清潔劑洗滌，從而獲得溶解產物。
  116. 如申請專利範圍第115項所述的製造化合物1的方法，其中所述剪切力來自音波處理方法、弗氏壓碎細胞（french pressurized cell）或珠粒。
  117. 如申請專利範圍第115項或第116項所述的製造化合物1的方法，其中所述溶解產物進行過濾步驟及純化步驟。
  118. 如申請專利範圍第117項所述的製造化合物1的方法，其中過濾所述溶解產物且藉由固相萃取純化。
  119. 如申請專利範圍第1項至第118項中任一項所述的製造化合物1的方法，包括在所述羅漢果苷IIIE與所述第一酶接觸之前使第一羅漢果苷與一或多種用於產生羅漢果苷IIIE之水解酶接觸。
  120. 如申請專利範圍第119項所述的製造化合物1的方法，其中所述水解酶為β-葡聚糖水解酶。
  121. 如申請專利範圍第119項所述的製造化合物1的方法，其中所述水解酶為EXG1或EXG2。
  122. 如申請專利範圍第119項所述的製造化合物1的方法，其中所述水解酶包括與SEQ ID NO. 292、366-368、372、376-398、447-520、524-845、1013、1014以及1023中之任一者包括至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  123. 如申請專利範圍第119項至第122項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一羅漢果苷由下述者所構成的族群中選出：羅漢果苷IV、羅漢果苷V、羅漢果苷VI以及其組合。
  124. 如申請專利範圍第119項至第122項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一羅漢果苷由下述者所構成的族群中選出：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 以及其組合。
  125. 如申請專利範圍第119項至第124項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中使所述第一羅漢果苷與一或多種所述水解酶接觸包括使所述第一羅漢果苷與包括編碼所述水解酶之基因的宿主細胞接觸。
  126. 如申請專利範圍第125項所述的製造化合物1的方法，其中包括編碼所述水解酶之基因的所述宿主細胞為所述重組宿主細胞。
  127. 如申請專利範圍第125項所述的製造化合物1的方法，其中包括編碼所述水解酶之基因的所述宿主細胞不是包括所述第一基因之所述重組宿主細胞，所述第一基因編碼能夠催化化合物1之產生的所述第一酶。
  128. 如申請專利範圍第125項至第127項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一羅漢果苷產自於及/或存在於所述宿主細胞中。
  129. 如申請專利範圍第125項至第128項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中編碼所述水解酶之所述基因與所述宿主細胞同源。
  130. 如申請專利範圍第125項至第129項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中編碼所述水解酶之所述基因以正常水準在所述宿主細胞中表現。
  131. 如申請專利範圍第125項至第130項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中編碼所述水解酶之所述基因在所述宿主細胞中過度表現。
  132. 如申請專利範圍第125項至第131項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中編碼所述水解酶之所述基因與所述宿主細胞異源。
  133. 如申請專利範圍第2項至第132項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述重組細胞更包括諸如環阿屯醇（cycloartenol）合成酶或β-芸香素合成酶之氧化角鯊烯環化酶，或編碼諸如環阿屯醇合成酶或β-芸香素合成酶之氧化角鯊烯環化酶的核酸序列，且其中所述氧化角鯊烯環化酶、環阿屯醇合成酶或β-芸香素合成酶已經修飾以產生葫蘆二烯醇或環氧葫蘆二烯醇。
  134. 如申請專利範圍第133項所述的製造化合物1的方法，其中所述氧化角鯊烯環化酶包括SEQ ID NO: 341、343以及346-347中之任一者中所闡述之序列。
  135. 如申請專利範圍第2項至第134項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述重組細胞包括細胞色素P450還原酶或編碼細胞色素P450還原酶之基因。
  136. 如申請專利範圍第135項所述的製造化合物1的方法，其中所述細胞色素P450還原酶包括SEQ ID NO: 318中所闡述之序列。
  137. 一種具有化合物1之結構的化合物，（1 ），其中所述化合物由如申請專利範圍第1項至第136項中任一項所述的製造化合物1的方法產生。
  138. 一種細胞溶解產物，包括具有以下結構之化合物1：（1 ）。
  139. 一種重組細胞，包括：具有以下結構之化合物1：（1 ），及編碼能夠催化羅漢果苷IIIE產生化合物1之酶的基因。
  140. 如申請專利範圍第139項所述的重組細胞，其中所述基因為所述重組細胞之異源基因。
  141. 一種重組細胞，包括編碼第一酶的第一基因，所述第一酶能夠催化羅漢果苷IIIE產生具有以下結構之化合物1：（1 ）。
  142. 如申請專利範圍第141項所述的重組細胞，其中所述第一酶為UDP糖基轉移酶、環麥芽糊精葡聚糖轉移酶（CGTase）、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。
  143. 如申請專利範圍第141項所述的重組細胞，其中所述第一酶為環麥芽糊精葡聚糖轉移酶。
  144. 如申請專利範圍第143項所述的重組細胞，其中所述環麥芽糊精葡聚糖轉移酶包括與SEQ ID NO: 1、3、78-101、148以及154中之任一者之序列具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  145. 如申請專利範圍第141項所述的重組細胞，其中所述環麥芽糊精葡聚糖轉移酶包括SEQ ID NO: 1、3、78-101、148以及154中之任一者之胺基酸序列。
  146. 如申請專利範圍第141項所述的重組細胞，其中所述第一酶為聚葡萄糖蔗糖酶。
  147. 如申請專利範圍第146項所述的重組細胞，其中所述聚葡萄糖蔗糖酶包括與SEQ ID NO: 2、103、106-110、156以及896中所闡述之序列中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  148. 如申請專利範圍第146項所述的重組細胞，其中所述聚葡萄糖蔗糖酶由與SEQ ID NO: 104、105、157、158以及895中之任一者具有至少70%序列一致性的核酸序列編碼。
  149. 如申請專利範圍第141項所述的重組細胞，其中所述第一酶為轉葡萄糖苷酶。
  150. 如申請專利範圍第149項所述的重組細胞，其中所述轉葡萄糖苷酶包括與SEQ ID NO: 163-291及723中之任一者之序列具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  151. 如申請專利範圍第149項所述的重組細胞，其中所述轉葡萄糖苷酶包括SEQ ID NO: 3、95-102、163-291以及723中之任一者的胺基酸序列。
  152. 如申請專利範圍第141項所述的重組細胞，其中所述第一酶為β-葡萄糖苷酶。
  153. 如申請專利範圍第152項所述的重組細胞，其中所述β葡萄糖苷酶包括與SEQ ID NO: 102、292、354-376以及678-741具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  154. 如申請專利範圍第141項至第153項中任一項所述的重組細胞，包括編碼尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶（UGT）之第二基因。
  155. 如申請專利範圍第154項所述的重組細胞，其中所述尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶包括與SEQ ID NO: 4-9、15-19、125、126、128、129、293-307、407、409、411、413、439、441或444具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  156. 如申請專利範圍第154項所述的重組細胞，其中尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶由與SEQ ID NO: 116-124、127、130、408、410、412、414、440、442、443以及445中之任一者具有至少70%序列一致性的核酸序列編碼。
  157. 如申請專利範圍第154項所述的重組細胞，其中所述尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶由UGT1495（SEQ ID NO: 10）、UGT1817（SEQ ID NO: 11）、UGT5914（SEQ ID NO: 12）、UGT8468（SEQ ID NO: 13）或UGT10391（SEQ ID NO: 14）中所闡述之序列編碼。
  158. 如申請專利範圍第141項至第157項中任一項所述的重組細胞，包括編碼UGT98或UGT SK98之第三基因。
  159. 如申請專利範圍第158項所述的重組細胞，其中所述UGT98或所述UGT SK98包括與SEQ ID NO: 9、407、16或306具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  160. 如申請專利範圍第158項所述的重組細胞，其中所述UGT98由SEQ ID NO: 307中所闡述之核酸序列編碼。
  161. 如申請專利範圍第141項至第160項中任一項所述的重組細胞，包括編碼環氧化物水解酶之第四基因。
  162. 如申請專利範圍第161項所述的重組細胞，其中所述環氧化物水解酶包括與SEQ ID NO: 21-30及309-314中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列；或由與SEQ ID NO: 114及115中之任一者具有至少70%序列一致性的核酸序列編碼。
  163. 如申請專利範圍第141項至第162項中任一項所述的重組細胞，包括編碼P450之第五序列。
  164. 如申請專利範圍第163項所述的重組細胞，其中所述P450包括與SEQ ID NO: 20、49、308、315、430、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890以及891中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列；或由與SEQ ID NO: 31-48、316、431、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889以及892中之任一者具有至少70%序列一致性的核酸序列編碼。
  165. 如申請專利範圍第163項所述的重組細胞，其中所述P450由包括SEQ ID NO: 31-48、316以及318中之任一者中所闡述之序列的基因編碼。
  166. 如申請專利範圍第141項至第165項中任一項所述的重組細胞，包括編碼具有葫蘆二烯醇合成酶活性之多肽的第六序列。
  167. 如申請專利範圍第166項所述的方法，其中具有葫蘆二烯醇合成酶活性之所述多肽為融合蛋白。
  168. 如申請專利範圍第167項所述的方法，其中所述融合蛋白包括與葫蘆二烯醇合成酶之N端、C端或兩者融合的融合域。
  169. 如申請專利範圍第168項所述的方法，其中所述融合域為約3個至約1000個胺基酸長。
  170. 如申請專利範圍第169項所述的方法，其中所述融合域為約5個至約50個胺基酸長。
  171. 如申請專利範圍第168項或第169項所述的方法，其中所述融合域為功能蛋白之實質性部分或完整序列。
  172. 如申請專利範圍第166項所述的重組細胞，其中具有葫蘆二烯醇合成酶活性之所述多肽包括與下述者中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列：SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327-333、417、420、422、424、426、446、902、904、906、851、854、856、1024、859、862、865、867、915、920、924、928、932、936、940、944、948、952、956、959、964、967、971、975、979、983、987、991、995、999、1003、1007以及1011。
  173. 如申請專利範圍第166項所述的重組細胞，其中具有葫蘆二烯醇合成酶活性之所述多肽由與SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903以及905中之任一者具有至少70%序列一致性的核酸序列編碼。
  174. 如申請專利範圍第141項至第173項中任一項所述的重組細胞，包括編碼角鯊烯環氧酶之第七基因。
  175. 如申請專利範圍第174項所述的重組細胞，其中所述角鯊烯環氧酶包括與SEQ ID NO: 50-56、60、61、334以及335中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  176. 如申請專利範圍第174項所述的重組細胞，其中所述角鯊烯環氧酶由與SEQ ID NO: 335具有至少70%序列一致性的核酸序列編碼。
  177. 如申請專利範圍第141項至第176項中任一項所述的重組細胞，包括編碼角鯊烯合成酶之第八基因。
  178. 如申請專利範圍第177項所述的重組細胞，其中所述角鯊烯合成酶包括與SEQ ID NO: 69或336具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  179. 如申請專利範圍第177項所述的重組細胞，其中所述角鯊烯合成酶由包括SEQ ID NO: 337中所闡述之核酸序列的序列編碼。
  180. 如申請專利範圍第141項至第179項中任一項所述的重組細胞，包括編碼法呢基-PP合成酶之第九基因。
  181. 如申請專利範圍第180項所述的重組細胞，其中所述法呢基-PP合成酶包括與SEQ ID NO: 338具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  182. 如申請專利範圍第180項所述的重組細胞，其中所述法呢基-PP合成酶由與SEQ ID NO: 339具有至少70%序列一致性的核酸序列編碼。
  183. 如申請專利範圍第141項至第182項中任一項所述的重組細胞，其中所述細胞為哺乳動物細胞、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞或昆蟲細胞。
  184. 如申請專利範圍第141項至第182項中任一項所述的重組細胞，其中所述細胞為酵母細胞，其中所述酵母由下述者所構成的族群中選出：念珠菌屬、酵母屬、酵母亞門、外囊菌亞門、裂殖酵母綱、駒形氏酵母屬、擔子菌門、傘菌亞門、銀耳綱、柄鏽菌亞門、短梗黴屬、錐毛殼屬以及微球黑粉菌綱。
  185. 如申請專利範圍第183項所述的重組細胞，其中所述植物由下述者所構成的族群中選出：羅漢果屬、苦瓜屬、絞股藍屬、南瓜屬、甜瓜屬、芥菜屬、蒿屬、甜菊屬、人參屬、睡茄屬、大戟屬、苜蓿屬、吊蘭屬、五加屬、楤木屬、桑屬、苜蓿屬、樺屬、黃耆屬、麻風樹屬、山茶屬、柳蕈屬、麴菌屬、茄屬、石杉屬、假繁縷屬、黃麻屬、常春藤屬、地錢屬以及桑屬。
  186. 如申請專利範圍第183項所述的重組細胞，其中所述真菌為髮癬菌屬、桑黃屬、台芝屬、鏈疫孢屬、盤二孢屬、色二孢黴屬、香菇屬、法夫酵母屬、普克尼亞屬、刺盤孢屬、間座殼屬、組織胞漿菌屬、球孢子菌屬、組織胞漿菌屬、桑黃屬、短梗黴屬、普克尼亞屬、青黴菌屬、孢子絲菌屬或黑殭菌屬。
  187. 如申請專利範圍第141項至第186項中任一項所述的重組細胞，其中所述重組細胞包括編碼至少一種能夠水解羅漢果苷V之水解酶的基因。
  188. 如申請專利範圍第141項至第187項中任一項所述的重組細胞，其中化合物1展示對所述重組細胞中之水解酶的耐受性，其中所述水解酶展示將羅漢果苷VI、羅漢果苷V、羅漢果苷IV水解為羅漢果苷IIIE的能力。
  189. 如申請專利範圍第141項至第188項中任一項所述的重組細胞，其中所述重組細胞更包括諸如環阿屯醇合成酶或β-芸香素合成酶之氧化角鯊烯環化酶，或編碼諸如環阿屯醇合成酶或β-芸香素合成酶之氧化角鯊烯環化酶的核酸序列，且其中所述氧化角鯊烯環化酶、環阿屯醇合成酶或β-芸香素合成酶已經修飾以產生葫蘆二烯醇或環氧葫蘆二烯醇。
  190. 如申請專利範圍第189項所述的重組細胞，其中所述氧化角鯊烯環化酶包括與SEQ ID NO: 341、343以及346-347中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  191. 如申請專利範圍第141項至第190項中任一項所述的重組細胞，其中所述細胞包括細胞色素P450還原酶或編碼細胞色素P450還原酶之基因。
  192. 如申請專利範圍第191項所述的重組細胞，其中所述細胞色素P450還原酶再生細胞色素P450活性。
  193. 如申請專利範圍第191項所述的重組細胞，其中所述細胞色素P450還原酶包括與SEQ ID NO: 318具有至少70%序列一致性的序列。
  194. 如申請專利範圍第141項至第193項中任一項所述的重組細胞，其中所述細胞包括SEQ ID NO: 897、899、909、911、913、418、421、423、425、427、871、873、901、903或905中所闡述之序列。
  195. 如申請專利範圍第141項至第193項中任一項所述的重組細胞，其中所述細胞包括一種酶，所述酶包括下述者中所闡述之序列或由下述者中所闡述之序列編碼：SEQ ID NO: 315、316、420、422、424、426、430、431、446、871、845-949或951-1012。
  196. 如申請專利範圍第141項至第195項中任一項所述的重組細胞，包括編碼能夠水解第一羅漢果苷以產生羅漢果苷IIIE之水解酶的基因。
  197. 如申請專利範圍第196項所述的重組細胞，其中所述水解酶為β-葡聚糖水解酶。
  198. 如申請專利範圍第196項所述的重組細胞，其中所述水解酶為EXG1或EXG2。
  199. 如申請專利範圍第196項所述的重組細胞，其中所述水解酶包括與SEQ ID NO. 292、366-368、372、376-398、447-520、524-845、1013、1014以及1023中之任一者包括至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  200. 如申請專利範圍第196項至第199項中任一項所述的重組細胞，其中所述第一羅漢果苷由下述者所構成的族群中選出：羅漢果苷IV、羅漢果苷V、羅漢果苷VI以及其組合。
  201. 如申請專利範圍第196項至第200項中任一項所述的重組細胞，其中所述第一羅漢果苷由下述者所構成的族群中選出：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA以及其組合。
  202. 如申請專利範圍第196項至第201項中任一項所述的重組細胞，其中編碼所述水解酶之所述基因與所述重組宿主細胞同源。
  203. 如申請專利範圍第196項至第202項中任一項所述的重組細胞，其中編碼所述水解酶之所述基因以正常水準表現。
  204. 如申請專利範圍第196項至第202項中任一項所述的重組細胞，其中編碼所述水解酶之所述基因過度表現。
  205. 如申請專利範圍第196項至第204項中任一項所述的重組細胞，其中編碼所述水解酶之所述基因與所述細胞異源。
  206. 如申請專利範圍第196項至第205項中任一項所述的重組細胞，其中所述細胞為酵母細胞。
  207. 如申請專利範圍第206項所述的重組細胞，其中所述細胞為釀酒酵母或解脂耶氏酵母。
  208. 一種製造化合物1的方法，所述化合物1具有以下結構，（1 ），所述方法包括： 使第一羅漢果苷與一或多種水解酶接觸以產生羅漢果苷IIIE ；及 使所述羅漢果苷IIIE 與能夠催化羅漢果苷IIIE 產生化合物1之酶接觸。
  209. 如申請專利範圍第208項所述的製造化合物1的方法，其中所述水解酶為β-葡聚糖水解酶。
  210. 如申請專利範圍第208項所述的製造化合物1的方法，其中所述水解酶為EXG1。
  211. 如申請專利範圍第210項所述的製造化合物1的方法，其中所述EXG1包括與SEQ ID NO: 1012或1014具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  212. 如申請專利範圍第208項所述的製造化合物1的方法，其中所述水解酶為EXG2。
  213. 如申請專利範圍第210項所述的製造化合物1的方法，其中所述EXG2包括與SEQ ID NO: 1023具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  214. 如申請專利範圍第208項至第213項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一羅漢果苷由下述者所構成的族群中選出：羅漢果苷IV、羅漢果苷V、羅漢果苷VI以及其組合。
  215. 如申請專利範圍第214項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一羅漢果苷由下述者所構成的族群中選出：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 以及其組合。
  216. 如申請專利範圍第208項至第215項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中使所述第一羅漢果苷與一或多種所述水解酶接觸包括使所述第一羅漢果苷與重組宿主細胞接觸，所述重組宿主細胞包括編碼所述水解酶之第一基因及編碼能夠催化化合物1之產生的所述酶的第二基因。
  217. 如申請專利範圍第208項至第216項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一羅漢果苷接觸重組宿主細胞中之一或多種所述水解酶，所述重組宿主細胞包括編碼所述水解酶之第一基因及編碼能夠催化化合物1之產生的所述酶的第二基因。
  218. 如申請專利範圍第208項至第217項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一羅漢果苷由所述重組宿主細胞產生。
  219. 如申請專利範圍第208項至第218項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一基因為所述重組宿主細胞之天然基因。
  220. 如申請專利範圍第208項至第219項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一基因以正常水準表現或過度表現。
  221. 如申請專利範圍第208項至第218項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中所述第一基因與所述重組宿主細胞異源或異源。
  222. 如申請專利範圍第208項至第221項中任一項所述的製造化合物1的方法，其中能夠催化化合物1之產生的所述酶為UDP糖基轉移酶、環麥芽糊精葡聚糖轉移酶（CGTase）、糖基轉移酶、聚葡萄糖蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、轉葡萄糖苷酶、果膠酶以及聚葡萄糖酶中之一或多者。
  223. 一種重組細胞，包括： 第一基因，編碼能夠水解第一羅漢果苷以產生羅漢果苷IIIE 之水解酶；及 第二基因，編碼能夠催化羅漢果苷IIIE 產生化合物1之酶，其中化合物1具有以下結構：（1 ）。
  224. 如申請專利範圍第223項所述的重組細胞，其中所述水解酶為β-葡聚糖水解酶。
  225. 如申請專利範圍第223項所述的重組細胞，其中所述水解酶為EXG1或EXG2。
  226. 如申請專利範圍第228項所述的重組細胞，其中所述EXG2蛋白質包括與SEQ ID NO 1023具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。
  227. 如申請專利範圍第223項至第226225項中任一項所述的重組細胞，其中所述第一羅漢果苷由下述者所構成的族群中選出：羅漢果苷IV、羅漢果苷V、羅漢果苷VI以及其組合。
  228. 如申請專利範圍第223項至第226227項中任一項所述的重組細胞，其中所述第一羅漢果苷由下述者所構成的族群中選出：羅漢果苷V、賽門苷I、羅漢果苷IVE 、羅漢果苷VI、羅漢果苷IVA 以及其組合。
  229. 如申請專利範圍第223項至第228項中任一項所述的細胞，其中所述第一基因與所述重組宿主細胞同源或異源。
  230. 如申請專利範圍第223項至第229項中任一項所述的重組細胞，其中所述第一基因以正常水準表現或過度表現。
  231. 如申請專利範圍第223項至第230項中任一項所述的重組細胞，其中所述細胞為酵母細胞。
  232. 如申請專利範圍第231項所述的重組細胞，其中所述細胞為釀酒酵母或解脂耶氏酵母。
  233. 一種融合多肽，具有葫蘆二烯醇合成酶活性，其中所述融合多肽包括與葫蘆二烯醇合成酶融合之融合域。
  234. 如申請專利範圍第233項所述的融合多肽，其中所述融合域與所述葫蘆二烯醇合成酶之N端融合。
  235. 如申請專利範圍第233項所述的融合多肽，其中所述融合域與所述葫蘆二烯醇合成酶之C端融合。
  236. 如申請專利範圍第233項至第235項中任一項所述的融合多肽，其中所述融合域為約3個至約1000個胺基酸長。
  237. 如申請專利範圍第233項至第236項中任一項所述的融合多肽，其中所述融合域為約5個至約50個胺基酸長。
  238. 如申請專利範圍第233項至第236項中任一項所述的融合多肽，其中所述融合域包括功能蛋白之實質性部分或完整序列。
  239. 如申請專利範圍第233項至第236項中任一項所述的融合多肽，其中所述融合域為功能蛋白之實質性部分或完整序列。
  240. 如申請專利範圍第233項至第239項中任一項所述的融合多肽，其中所述融合域包括酵母蛋白之一部分或完整序列。
  241. 如申請專利範圍第233項至第239項中任一項所述的融合多肽，其中所述融合域為酵母蛋白之一部分或完整序列。
  242. 如申請專利範圍第241項所述的融合多肽，其中所述融合多肽包括與下述者中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列：SEQ ID NO: 851、854、856、1024、859、862、865、867、915、920、924、928、932、936、940、944、948、952、956、959、964、967、971、975、979、983、987、991、995、999、1003、1007以及1011。
  243. 如申請專利範圍第241項所述的融合多肽，其中所述融合多肽包括下述者中之任一者中所闡述之胺基酸序列：SEQ ID NO: 851、854、856、1024、859、862、865、867、915、920、924、928、932、936、940、944、948、952、956、959、964、967、971、975、979、983、987、991、995、999、1003、1007以及1011。
  244. 如申請專利範圍第233項至第235項中任一項所述的融合多肽，其中所述融合多肽之所述融合域包括與下述者中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列：SEQ ID NO: 866、870、917、921、925、929、933、937、941、945、949、953、957、961、968、972、976、980、984、988、992、996、1000、1004、1008以及1012。
  245. 如申請專利範圍第233項至第235項中任一項所述的融合多肽，其中所述融合多肽之所述融合域包括下述者中之任一者中所闡述之胺基酸序列：SEQ ID NO: 866、870、917、921、925、929、933、937、941、945、949、953、957、961、968、972、976、980、984、988、992、996、1000、1004、1008以及1012。
  246. 如申請專利範圍第233項至第241項、第244項以及第245項中任一項所述的融合多肽，其中所述葫蘆二烯醇合成酶包括與下述者中之任一者具有至少70%序列一致性的胺基酸序列：SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327、329-333、420、422、424、426、446、902、904以及906。
  247. 如申請專利範圍第233項至第241項、第244項以及第245項中任一項所述的融合多肽，其中所述葫蘆二烯醇合成酶包括下述者中之任一者中所闡述之胺基酸序列：SEQ ID NO: 70-73、75-77、319、321、323、325、327、329-333、420、422、424、426、446、902、904以及906。
  248. 如申請專利範圍第233項至第241項、第244項以及第245項中任一項所述的融合多肽，其中所述葫蘆二烯醇合成酶由包括與下述者中之任一者具有70%序列一致性之核酸序列的基因編碼：SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903以及905。
  249. 如申請專利範圍第233項至第241項、第244項以及第245項中任一項所述的融合多肽，其中所述葫蘆二烯醇合成酶由包括下述者中之任一者中所闡述之核酸序列的基因編碼：SEQ ID NO: 74、320、322、324、326、328、418、421、423、425、427、897、899、901、903以及905。
  250. 一種重組核酸分子，包括編碼如申請專利範圍第233項至第249項中任一項所述的融合多肽的核酸序列。
  251. 一種重組細胞，包括如申請專利範圍第233項至第249項中任一項所述的融合多肽或如申請專利範圍第250項所述的重組核酸分子。
  252. 一種方法，包括使葫蘆二烯醇合成酶之受質與如申請專利範圍第233項至第249項中任一項所述的具有葫蘆二烯醇合成酶活性之融合多肽進行接觸。
  253. 如申請專利範圍第252項所述的方法，其中所述接觸引起葫蘆二烯醇、24,25-環氧葫蘆二烯醇或其組合之產生。
  254. 如申請專利範圍第252項或第253項所述的方法，其中所述葫蘆二烯醇合成酶之受質包括2,3-氧化角鯊烯、二氧化角鯊烯以及二環氧角鯊烯中之一或多者。
  255. 如申請專利範圍第252項至第254項中任一項所述的方法，其中所述接觸包括使所述受質與包括編碼所述融合多肽之核酸序列的重組宿主細胞接觸。
  256. 如申請專利範圍第255項所述的方法，其中所述受質存在於及/或產自於所述重組宿主細胞。
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