ES2464740T3

ES2464740T3 - Método para generar un microbio modificado genéticamente

Info

Publication number: ES2464740T3
Application number: ES10721095.7T
Authority: ES
Inventors: Jeffrey A. Ubersax
Original assignee: Amyris Inc
Current assignee: Amyris Inc
Priority date: 2009-06-01
Filing date: 2010-06-01
Publication date: 2014-06-03
Anticipated expiration: 2030-06-01
Also published as: KR20120034652A; SG176626A1; CN102482636B; WO2010141438A1; US20130089914A1; CA2762822A1; HK1164934A1; AU2010256803A1; MX2011012765A; CA2762822C; EP2438156A1; EP2438156B1; AU2010256803B2; JP5695639B2; JP2012528570A; DK2438156T3; ZA201108380B; CN102482636A; US8357527B2; US20100304490A1

Abstract

Una célula de levadura diploide modificada genéticamente que comprende: (a) una alteración funcional en al menos un gen de esporulación (b) una alteración funcional en al menos un gen de respuesta a feromonas, en donde el al menos un gen de respuesta a feromonas es diferente del al menos un gen de esporulación; y (c) una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica una proteína de interés; en donde dicha célula de levadura diploide modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación, incapacitada para el emparejamiento endógeno y es homocigota excepto en su alelo de tipo de emparejamiento.

Description

Método para generar un microbio modificado genéticamente

5 1. Campo de la invención

Los métodos y composiciones que se proporcionan en el presente documento generalmente se refieren al uso industrial de microorganismos que se han modificado para reducir significativamente el riesgo de su diseminación en la naturaleza, y en particular, la diseminación en la naturaleza de sus secuencias de ADN recombinante. También se

10 proporcionan métodos para producir y usar tales microorganismos genéticamente modificados.

2. Antecedentes

Los avances en tecnología de ADN recombinante ha permitido la producción industrial de sustancias útiles en

15 grandes cantidades por medio de la utilización de procariotas y eucariotas. Entre los eucariotas, las levaduras (en particular las levaduras pertenecientes al género Saccharomyces), se han utilizado ampliamente para la producción de productos fermentados. Generalmente, las levaduras pueden crecer rápidamente y se pueden cultivar con una alta densidad en comparación con las bacterias, y no requieren un ambiente aséptico en el centro industrial. Además, las células de levadura se pueden separar fácilmente del medio de cultivo en comparación con las

20 bacterias, lo que simplifica mucho el proceso para la extracción del producto y su purificación. Debido a estas características, las levaduras (en particular las levaduras modificadas genéticamente que portan secuencias de ADN recombinante) se han empleado como huéspedes para la producción de productos útiles, y se ha establecido la utilidad de tales levaduras. Sin embargo, la utilización de levaduras modificadas genéticamente en la industria conlleva un riesgo medioambiental potencial, debido a que la dispersión de tales levaduras, y/o las secuencias de

25 ADN recombinante que están contenida en tales levaduras, puede tener consecuencias impredecibles en el ecosistema. Por tanto existe una necesidad de levaduras que sean adecuadas para las aplicaciones industriales pero que posean un riesgo reducido de que se diseminen y propaguen en la naturaleza, y en particular, posean un riesgo reducido de diseminación de sus secuencias de ADN recombinante en la naturaleza.

30 Ramírez y col, Applied And Environmental Microbiology, vol. 74, nº 7, Abril 2008 (2008-04), páginas 2129-2134, describen la construcción de levaduras del vino Saccharomyces cerevisiae imeI Delta-transgénicas incapaces de diseminarse en la naturaleza. Hadfield y col, Current Genetics, vol. 18, nº 4, Noviembre 1990 (1990-11), páginas 303-313, describen la resistencia a G418 como marcador dominante e indicador de la expresión génica en Saccharomyces cerevisiae. Mukai y col, Molecular And Cellular Biology vol. 13, nº 4, 1993, páginas 2050-2060,

35 describen la función de la ruta Ste de transducción de señal de feromonas de emparejamiento que sostiene la transcripción de MAT-alfa-1 en Saccharomyces cerevisiae.

Sumario de la invención

40 La presente invención se refiere a métodos para generar cepas de levadura modificadas genéticamente, que están incapacitadas para la esporulación y el emparejamiento endógeno. Los métodos que se proporcionan en el presente documento comprenden la alteración funcional de uno o más genes de esporulación y uno o más genes de respuesta a feromonas en células de levadura haploides modificadas genéticamente, y la inducción de dichas células haploides genéticamente modificadas para formar diploides estables que son sexualmente estériles eficaces

45 y constreñidas en el estado diploide de su ciclo vital debido a su falta de capacidad para emparejarse y esporular. Las cepas de levadura, genéticamente modificadas de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento encuentran una utilidad en aplicaciones industriales, por ejemplo, en aplicaciones de fermentación industrial y pueden proporcionar la ventaja de poseer un riesgo significativamente reducido de que se diseminen y se propaguen en la naturaliza por medio del emparejamiento con microorganismos del tipo silvestre.

50 En un aspecto, se proporciona en el presente documento una célula de levadura diploide modificada genéticamente que comprende: (a) una alteración funcional de al menos un gen de esporulación; (b) una alteración funcional de al menos un gen de respuesta a feromonas, en el que el al menos un gen de respuesta a feromonas es diferente del al menos un gen de esporulación; (c) una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que

55 codifica una proteína de interés; en el que dicha célula de levadura haploide heterotálica (ho) está incapacitada para la esporulación e incapacitada para el emparejamiento endógeno. En algunas realizaciones, la célula de levadura modificada genéticamente es heterotálica (ho). En algunas realizaciones, la célula haploide modificada genéticamente comprende además un plásmido recombinante que codifica una proteína de homotalismo (HO). En algunas realizaciones, la célula haploide modificada genéticamente comprende uno o más plásmidos recombinantes

60 que codifican el uno o más genes de respuesta a feromonas que están funcionalmente alterados en dicha célula de levadura.

En algunas realizaciones, la célula de levadura modificada genéticamente útil para la práctica de los métodos proporcionados en el presente documento es una célula de Saccharomyces cerevisiae.

65 En algunas realizaciones, el uno o más genes de esporulación alterados en la célula de levadura modificada genéticamente se seleccionan de entre el grupo que consiste en IME1, IME2, NDT80, SPO11, SPO20, AMA1, HOP2, y SP021. En realizaciones particulares, se ha alterado el gen IME1. En algunas realizaciones, el uno o más genes de respuesta a feromonas alterados en la célula de levadura modificada genéticamente se seleccionan de entre el grupo que consiste en STE5, STE4, STE18, STE12, STE7, y STE11. En realizaciones particulares el gen STE5 está alterado. En realizaciones particulares, la célula de levadura genéticamente modificada comprende una alteración funcional de los genes STE5 e IME1. En algunas realizaciones, una célula haploide de la célula de levadura modificada genéticamente comprende una alteración funcional del gen STE5 y un plásmido recombinante que codifica una proteína STE5.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un método para generar una célula de levadura diploide modificada genéticamente que está incapacitada para la esporulación y emparejamiento endógeno. El método comprende: (a) transformar cada primera y segunda células de levadura haploides modificadas genéticamente con al menos un plásmido que codifica una proteína capaz de complementar la incapacidad de emparejamiento endógeno de dicha primera y segunda células de levadura haploides modificadas genéticamente, en que dicha primera célula de levadura haploide modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno y comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica una proteína de interés, y en que dicha segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno, es del tipo de emparejamiento opuesto a la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente, y comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica dicha proteína de interés: (b) emparejar la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente con la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente, formando de esta manera una célula de levadura diploide modificada genéticamente; y, (c) eliminar el uno o más plásmidos de la célula de levadura diploide modificada genéticamente, con lo que la célula de levadura diploide modificada genéticamente resultante esté incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno, homocigota excepto en su alelo de tipo emparejamiento, y comprende dos copias de una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica dicha proteína de interés; en que dicha primera célula de levadura haploide modificada genéticamente y la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente están incapacitadas para el emparejamiento endógeno debido a una alteración funcional de al menos un gen de respuesta a feromonas e incapacitadas para la esporulación debido a una alteración funcional de al menos un gen de esporulación, de forma que el al menos un gen de respuesta a las feromonas es diferente del al menos un gen de esporulación.

En algunas realizaciones, el uno o más genes de respuesta a feromonas se seleccionan de entre el grupo que consiste en STE5, STE4, STE18, STE12, STE7, y STE11. En ciertas realizaciones, la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente y la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente están incapacitadas para el emparejamiento endógeno debido a una alteración funcional en el gen STE5.

En algunas realizaciones, la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente y la segunda célula de levadura haploides modificadas genéticamente están incapacitada para la esporulación debido a una alteración funcional de uno o más genes de esporulación. En algunas de tales realizaciones, el uno o más genes de esporulación se selecciona de entre el grupo que consiste en IME1, IME2, NDT80, SPO11, SPO20, AMA1, HOP2, y SP021. En algunas realizaciones, la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación debido a una alteración funcional del gen IME1. En realizaciones particulares, la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente y la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente están incapacitadas para el emparejamiento debido a una alteración funcional del gen STE5, y están incapacitadas para la esporulación debido a una alteración funcional del gen IME1.

En algunas realizaciones, la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente se obtiene induciendo un cambio en el tipo de emparejamiento en una población de la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente. El algunas de tales realizaciones, la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente es heterotálica (ho), y dicha población se induce a cambiar de tipo de emparejamiento trasformando la célula de levadura haploide modificada genéticamente con un plásmido recombinante que codifica la proteína de homotalismo (HO), de forma que la expresión de la proteína HO induce un cambio en el tipo de emparejamiento de la célula de levadura haploide modificada genéticamente.

En otras realizaciones, la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente se obtiene cambiando el locus de tipo de emparejamiento en la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente utilizando tecnologías de ADN recombinante. En algunas realizaciones la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente está transformada con una construcción de integración que comprende como secuencia de integración una secuencia de nucleótidos que codifica un tipo de emparejamiento distinto que el tipo de emparejamiento de la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente, flanqueada por secuencias homólogas que son homólogas a las secuencias de nucleótidos que flanquean el locus del tipo de emparejamiento en la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente. En la integración de la secuencia integrante por medio de recombinación homóloga, el locus del tipo de emparejamiento de la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente se sustituye por el locus del tipo de emparejamiento codificado por la secuencia de inserción, dando como resultado la generación de una segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente. En algunas realizaciones, la construcción de integración se utiliza para cambiar el tipo de emparejamiento de la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente de a a alfa utilizando una construcción de integración codificante que codifica el tipo de emparejamiento alfa (MAT alfa). En algunas realizaciones, la construcción de integración comprende la SEC ID Nº 155. En otras realizaciones, la construcción de integración se utiliza para cambiar el tipo de emparejamiento de la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente de alfa a a utilizando una construcción de integración codificante que codifica el tipo de emparejamiento a (MAT a). En algunas realizaciones, la construcción de integración comprende la SEC ID Nº 156.

En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un método para generar una célula de levadura diploide heterotálica (ho) incapacitada para la esporulación y emparejamiento endógeno, comprendiendo el método: (a) obtener una primera célula de levadura haploide heterotálica modificada genéticamente, en que la primera célula de levadura haploide heterotálica modificada genéticamente comprende: (i) una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica una proteína de interés; y (ii) alteraciones funcionales en el gen STE5 y el gen IME1; (b) transformar una población de la primera célula de levadura haploide heterotálica modificada genéticamente con un plásmido que comprende un polinucleótido que codifica una proteína de homotalismo (HO), de forma que la expresión de la proteína HO induce un cambio del tipo de emparejamiento de la primera célula de levadura haploide heterotálica modificada genéticamente, de manera que se obtiene una segunda célula de levadura haploide heterotálica modificada genéticamente, en que la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente es del tipo de emparejamiento opuesto a la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente, y comprende (i) una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica dicha proteína de interés; y (ii) alteraciones funcionales del gen STE5 y el gen IME1; (c) transformar la primera y la segunda células de levadura haploides heterotálicas con un plásmido que codifica un gen STE5; (d) emparejando la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente con la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente, formado de esta manera una célula de levadura diploide modificada genéticamente; y (e) eliminar cualquier plásmido de la célula de levadura diploide modificada genéticamente, de forma que la célula de levadura diploide heterotálica modificada genéticamente resultante está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno.

También se proporciona en el presente documento una célula de levadura diploide heterotálica (ho) que carece de capacidad para la esporulación y el emparejamiento endógeno que es homocigota excepto por su alelo de tipo de emparejamiento generada por los métodos presentes.

También se proporciona en el presente documento una célula de levadura diploide MAT !/a ste5/ste5 ime1/ime1 que es homocigota excepto en su alelo de tipo de emparejamiento.

3. Breve descripción de las Figuras

La FIG.1 proporciona la estructura de la construcción de alteración Fase I y del locus diana después de la integración de la secuencia de alteración por recombinación homóloga. La FIG. 2 proporciona la estructura de la construcción de alteración Fase II y del locus diana después de la integración de la secuencia de alteración por recombinación homóloga. La FIG. 3 proporciona la estructura de la construcción de alteración Fase III y del locus diana después de la integración de la secuencia de alteración por recombinación homóloga. La FIG. 4 proporciona la estructura de la construcción de reciclado del marcador Fase I y del locus diana después de la integración de la construcción por recombinación homóloga. La FIG. 5 proporciona la estructura de la construcción de reciclado del marcador Fase II y del locus diana después de la integración de la construcción por recombinación homóloga. La FIG. 6 proporciona la estructura de la construcción de reciclado del marcador Fase III y del locus diana después de la integración de la construcción por recombinación homóloga. La FIG. 7 proporciona la estructura de la construcción de alteración de STE5 y del locus diana después de la integración de la secuencia de alteración por recombinación homóloga. La FIG. 8 proporciona la estructura de la construcción de alteración de IME1 y del locus diana después de la integración de la secuencia de alteración por recombinación homóloga. La FIG. 9 proporciona una comparación de la capacidad de emparejamiento de células Y1915 haploides modificadas genéticamente con incapacidad para el emparejamiento endógeno y células Y1912 modificadas genéticamente competentes para el emparejamiento endógeno. La FIG. 10 proporciona una comparación de la capacidad de esporulación de células Y1979 diploides modificadas genéticamente incapacitadas para la esporulación y el emparejamiento endógeno y las células Y1198 no modificadas genéticamente competentes para el emparejamiento endógeno y la esporulación. La FIG. 11 proporciona una comparación de la supervivencia en el suelo de células Y1979 diploides modificadas genéticamente incapacitadas para la esporulación y el emparejamiento endógeno y las células Y1198 no modificadas genéticamente competentes para la esporulación y el emparejamiento endógeno.

5. Descripción detallada de las realizaciones

5.1 Terminología

Como se utiliza en el presente documento, el término “heterólogo” se refiere a que no se encuentra normalmente en la naturaleza. La expresión “secuencia de nucleótidos heteróloga” se refiere a una secuencia de nucleótidos que no se encuentra normalmente en una célula determinada en la naturaleza. Como tal, una secuencia de nucleótidos heteróloga puede ser: (a) ajena a su célula huésped (es decir, es “exógena” para la célula); (b) se encuentra naturalmente en la célula huésped (es decir, “endógena”) pero se presenta en una cantidad no natural en la célula (es decir en una cantidad menor o mayor que la que se encuentra naturalmente en la célula huésped); o (c ) se encuentra naturalmente en la célula huésped pero se posiciona fuera de su locus natural.

Como se utiliza en el presente documento, “funcionalmente alterado” o una “alteración funcional” de un gen diana, por ejemplo un gen de respuesta a feromonas o un gen de esporulación, significa que el gen diana está alterado de tal manera que disminuye en la célula huésped la actividad de la proteína codificada por el gen diana. En algunas realizaciones, la actividad de la proteína codificada por el gen diana se ha eliminado en la célula huésped. En otras realizaciones, la actividad de la proteína codificada por el gen diana está disminuida en la célula huésped. La alteración funcional del gen diana se puede conseguir eliminando todo o parte del gen de tal manera que se elimina

o reduce la expresión génica, o de forma que la actividad del producto génico se elimina o reduce. La alteración funcional del gen diana también se puede conseguir por mutación de un elemento regulador del gen, por ejemplo, el promotor del gen, de forma que se elimina o se reduce la expresión, o por mutación de la secuencia codificante del gen de forma que la actividad del producto génico se elimina o reduce. En algunas realizaciones, la alteración funcional del gen diana da como resultado la eliminación de la fase de lectura abierta completa del gen diana.

Como se utiliza en el presente documento, “emparejamiento endógeno” y “capacidad de emparejamiento endógeno” se refiere a la capacidad de las células microbianas haploides para el emparejamiento con tipos opuestos, es decir los tipos de emparejamiento a y !, para formar una célula diploide en ausencia de expresión del gen heterólogo, por ejemplo, la expresión de una copia heteróloga de un gen de respuesta a las feromonas o de cualquier gen capaz de inducir el emparejamiento entre tales haploides.

Como se utiliza en el presente documento “incapacidad de emparejamiento endógeno” se refiere a una reducción en la capacidad de emparejamiento endógeno de una célula microbiana que es suficiente para inhibir el emparejamiento en una población de haploides de tal célula microbiana, con respecto a una población de células microbianas haploides tipo silvestre. En algunas realizaciones, la inhibición comprende una reducción de al menos el 10 %, 20%, 30%, 40 %, 50%, 60%, 65%, 70%, 75% 80%, 85%, 90%, o 95% en la tasa de emparejamiento de una población de células microbianas haploides con respecto a la tasa de emparejamiento de una población de células microbianas haploides de tipo silvestre.

Como se utiliza en el presente documento, “esporulación incapacitada” se refiere a una reducción en la actividad de esporulación de una célula microbiana diploide suficiente para inhibir la esporulación en una población de diploides de tales células microbianas, con respecto a una población de células microbianas diploides de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la inhibición comprende una reducción de al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de la tasa de esporulación de una población de células microbianas diploides con respecto a la tasa de esporulación de una población de células microbianas diploides tipo silvestre.

Como se utiliza en el presente documento, el término “complementación” en el contexto de un gen se refiere a un gen que tiene la habilidad para remplazar la función de un gen alterado funcionalmente, por ejemplo, un gen de esporulación o respuesta a las feromonas alterado funcionalmente. En algunas realizaciones, el mecanismo de función del gen complementario y el gen alterado no necesita ser idéntico. En algunas realizaciones, un gen diana, por ejemplo, un gen de esporulación o un gen de respuesta a feromonas, que se ha alterado funcionalmente se puede complementar por un gen heterólogo que produce una proteína homóloga a la proteína codificada por el gen alterado o una proteína que proporciona un fenotipo que permita, por ejemplo la esporulación o el emparejamiento por medio de un mecanismo alternativo.

5.2 Microbios genéticamente modificados y métodos para producir los mismos

Se proporcionan en el presente documento composiciones que comprenden un microbio modificado genéticamente, por ejemplo una célula de levadura modificada genéticamente (por ejemplo, una célula de Saccharomyces cerevisiae modificada genéticamente), que está incapacitada funcionalmente para su esporulación y/o su capacidad de emparejamiento endógeno, y métodos y materiales para generar tales composiciones. Los métodos proporcionados en el presente documento interrumpen el ciclo reproductivo sexual del microbio para minimizar la diseminación del microbio en la naturaleza y para minimizar la probabilidad de un cambio de material genético entre el microbio genéticamente modificado y el microbio de tipo silvestre que no está afectado en su capacidad para diseminarse en la naturaleza.

Muchas células fúngicas, por ejemplo, las células de levadura, se pueden reproducir tanto sexual como asexualmente. La reproducción asexual implica solo una célula parental y posibilita el rápido crecimiento de la población. Por el contrario, la reproducción sexual implica la formación y fusión de gametos, y permite la generación más rápida de diversidad genética por transferencia genética lateral entre las células. La reproducción sexual en las células fúngicas asume que hay dos estados celulares a lo largo de su ciclo vital, uno es un estado celular diploide y el otro es un estado celular haploide. Las células fúngicas diploides generalmente son muy estables, y generalmente permanecerán en la fase diploide a menos que se encuentren con uno o varios estímulos medioambientales particulares (por ejemplo, una falta de nutrientes). Cuando se encuentran con uno o más de tales estímulos, las células diploides esporulan para formar cuatro esporas haploides (llamadas tétradas). Cuando vuelven las condiciones favorables, estas esporas haploides germinan para producir cuatro células haploides (dos de tipo de emparejamiento a, y dos de tipo de emparejamiento alfa), que se pueden emparejar entonces con otras células haploides del tipo de emparejamiento opuesto para formar de nuevo una célula diploide.

La capacidad de las células fúngicas diploides para esporular y de las células fúngicas haploides para emparejarse depende de la función de productos génicos específicos. Entre estas células de levadura hay productos de los genes de esporulación, tales como los genes IME1, IME2, NDT80, SPO11, SPO20, AMA1, HOP2, y SPO21, y productos de los genes de respuesta a feromonas, tales como los genes STE5, STE4, STE18, STE12, STE7 y STE11.

En un aspecto, en el presente documento se proporciona una célula fúngica haploide modificada genéticamente que está incapacitada para la esporulación y/o emparejamiento endógeno, y comprende una secuencia de nucleótido heteróloga integrada cromosómicamente que codifica una proteína de interés. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide en la que al menos un gen de esporulación y/o al menos un gen de respuesta a feromonas se ha alterado funcionalmente.

En algunas realizaciones, la célula fúngica genéticamente modificada es una célula de levadura haploide en la que uno o más de los siguientes genes de esporulación están funcionalmente alterados: IME1, IME2, NDT80, SPO11, SPO20, AMA1, HOP2, y SPO21. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen IME1 está funcionalmente alterado. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide en la que el gen IME2 está funcionalmente alterado. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide en la que el gen NDT80 está funcionalmente alterado. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide en la que el gen SPO11 está funcionalmente alterado. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide que tiene el gen AMA1 funcionalmente alterado. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide que tiene el gen HOP2 funcionalmente alterado. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide que tiene el gen SPO21 funcionalmente alterado. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide en la que más de un gen de esporulación, seleccionados de entre el grupo que consiste en IME1, IME2, NDT80, SPO11, SPO20, AMA1, HOP2, y SPO21 están alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide en la que más de dos genes de esporulación seleccionados de entre el grupo que consiste en IME1, IME2, NDT80, SPO11, SPO20, AMA1, HOP2, y SPO21 están alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide en la que más de tres genes de esporulación seleccionados de entre el grupo que consiste en IME1, IME2, NDT80, SPO11, SPO20, AMA1, HOP2, y SPO21 están alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide en la que más de cuatro genes de esporulación seleccionados de entre el grupo que consiste en IME1, IME2, NDT80, SPO11, SPO20, AMA1, HOP2, y SPO21 están alterados.

En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide en la que uno o más de los siguientes genes de respuesta a feromonas está funcionalmente alterado: STE5, STE4, STE18, STE12, STE7, y STE11. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen STE5 está funcionalmente alterado. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen STE4 está funcionalmente alterado. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen STE18 está funcionalmente alterado. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen STE12 está funcionalmente alterado. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen STE7 está funcionalmente alterado. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen STE11 está funcionalmente alterado. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide en la que más de un gen de esporulación, seleccionados de entre el grupo que consiste en STE5, STE4, STE18, STE12, STE7, y STE1 está alterado. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide en la que más de dos genes de esporulación seleccionados de entre el grupo que consiste en STE5, STE4, STE18, STE12, STE7, y STE11 está alterado. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide en la que más de tres genes de esporulación seleccionados de entre el grupo que consiste en STE5, STE4, STE18, STE12, STE7, y STE11 está alterado. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide en la que más de cuatro genes de esporulación seleccionados de entre el grupo que consiste en

STE5, STE4, STE18, STE12, STE7, y STE11 está alterado.

En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide en la que al menos un gen de esporulación y al menos un gen de respuesta a feromonas ha sido alterado funcionalmente.

En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen IME1 y gen STE5 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen IME2 y gen STE5 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen NDT80 y gen STE5 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO11 y gen STE5 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO20 y gen STE5 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen AMA1 y gen STE5 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen HOP2 y gen STE5 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO21 y gen STE5 están funcionalmente alterados.

En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen IME1 y gen STE4 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen IME2 y gen STE4 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen NDT80 y gen STE4 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO11 y gen STE4 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO20 y gen STE4 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen AMA1 y gen STE4 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen HOP2 y gen STE4 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO21 y gen STE4 están funcionalmente alterados.

En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen IME1 y gen STE18 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen IME2 y gen STE18 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen NDT80 y gen STE18 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO11 y gen STE18 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO20 y gen STE18 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen AMA1 y gen STE18 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen HOP2 y gen STE18 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO21 y gen STE18 están funcionalmente alterados.

En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen IME1 y gen STE12 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen IME2 y gen STE12 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen NDT80 y gen STE12 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO11 y gen STE12 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO20 y gen STE12 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen AMA1 y gen STE12 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen HOP2 y gen STE12 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO21 y gen STE12 están funcionalmente alterados.

En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen IME1 y gen STE7 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen IME2 y gen STE7 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen NDT80 y gen STE7 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO11 y gen STE7 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO20 y gen STE7 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen AMA1 y gen STE7 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen HOP2 y gen STE7 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO21 y gen STE7 están funcionalmente alterados.

En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen IME1 y gen STE11 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen IME2 y gen STE11 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen NDT80 y gen STE11 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO11 y gen STE11 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO20 y gen STE11 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen AMA1 y gen STE11 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen HOP2 y gen STE11 están funcionalmente alterados. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide cuyo gen SPO21 y gen STE11 están funcionalmente alterados.

En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide que comprende una copia cromosómica funcionalmente alterada de uno o más genes de respuesta a feromonas, y uno o más plásmidos recombinantes que comprenden una copia funcional extracromosómica de una secuencia codificante de dicho uno o más genes de respuesta a feromonas. En algunas realizaciones la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide que comprende un gen STE5 funcionalmente alterado y un plásmido recombinante que comprende una copia extracromosómica de una secuencia codificante del gen STE5. En algunas realizaciones la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide que comprende un gen STE4 funcionalmente alterado y un plásmido recombinante que comprende una copia extracromosómica de una secuencia codificante del gen STE4. En algunas realizaciones la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide que comprende un gen STE18 funcionalmente alterado y un plásmido recombinante que comprende una copia extracromosómica de una secuencia codificante del gen STE18. En algunas realizaciones la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide que comprende un gen STE12 funcionalmente alterado y un plásmido recombinante que comprende una copia extracromosómica de una secuencia codificante del gen STE12. En algunas realizaciones la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide que comprende un gen STE7 funcionalmente alterado y un plásmido recombinante que comprende una copia extracromosómica de una secuencia codificante del gen STE7. En algunas realizaciones la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura haploide que comprende un gen STE11 funcionalmente alterado y un plásmido recombinante que comprende una copia extracromosómica de una secuencia codificante del gen STE11.

En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una célula fúngica diploide modificada genéticamente que es incapaz de esporulación y/o emparejamiento endógeno y que comprende dos copias de una secuencia de nucleótidos heteróloga cromosómicamente integrada que codifica una proteína de interés. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura diploide en la que ambas copias de al menos un gen de esporulación y/o ambas copias de al menos un gen de respuesta a feromonas se han alterado funcionalmente.

En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura diploide en la que dos copias de uno o más de los siguientes genes de esporulación están funcionalmente alterados: IME1, IME2, NDT80, SPO11, SPO20, AMA1, HOP2, y SPO21. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura diploide en la que ambas copias del gen IME1 están funcionalmente alteradas. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura diploide en la que ambas copias de uno o más de los siguientes genes de respuesta a feromonas están funcionalmente alterados: STE5, STE4, STE18, STE12, STE7, y STE11. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura diploide en la que ambas copias del gen STE5 están funcionalmente alteradas. En otras realizaciones más, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura diploide en la que ambas copias de al menos un gen de esporulación y ambas copias de al menos un gen de respuesta a feromonas están funcionalmente alteradas. En algunas realizaciones, la célula fúngica modificada genéticamente es una célula de levadura diploide en la que ambas copias del gen IME1 y ambas copias del gen STE5 están funcionalmente alteradas.

En algunas realizaciones, la célula fúngica diploide modificada genéticamente es homocigota excepto en su alelo del tipo de emparejamiento. Por ejemplo, si la célula fúngica diploide modificada genéticamente tiene que esporular, las cuatro células fúngicas haploides resultantes deberían ser genéticamente idénticas excepto por su alelo de tipo de emparejamiento. En tal caso, dos de las células haploides serían del tipo de emparejamiento a y las otras dos células haploides serían del tipo de emparejamiento alfa. En algunas realizaciones, la célula fúngica diploide no incluye un gen heterólogo que confiere resistencia a un compuesto antibiótico.

La célula fúngica diploide modificada genéticamente proporcionada en la presente invención posee varias protecciones contra la propagación no deseada de las secuencias de nucleótidos heterólogas contenidas en la misma. Primero, las células fúngicas diploides generalmente son muy estables y, en su estado diploide, no se pueden emparejar con otras células fúngicas. Segundo, la célula fúngica diploide proporcionada en la presente invención tiene una capacidad reducida para esporular y por tanto, incluso en presencia del estímulo medioambiental apropiado, tiene poca o ninguna capacidad para formar esporas. Tercero, en el improbable caso de que se formen esporas, las células fúngicas haploides resultantes tienen una capacidad reducida para emparejarse. En conjunto, la naturaleza deficiente de esporulación y emparejamiento de la célula fúngica modificada genéticamente proporcionada en la presente invención reduce la posibilidad de la migración de secuencias heterólogas de nucleótidos a células fúngicas tipo silvestre.

En otro aspecto, se describe aquí un método para generar una célula fúngica haploide modificada genéticamente que se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el método comprende:

(a): obtener una primera célula fúngica haploide modificada genéticamente, en que la primera célula fúngica haploide modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno y comprende una secuencia heteróloga de nucleótidos integrada cromosómicamente que codifica una proteína de interés;

(b): obtener una segunda célula fúngica haploide modificada genéticamente, en que la segunda célula fúngica haploide modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno, es del tipo de emparejamiento opuesto que la primera célula fúngica haploide modificada genéticamente, y comprende una secuencia heteróloga de nucleótidos integrada cromosómicamente que codifica dicha proteína de interés; (c) transformar tanto la primera como la segunda células fúngicas haploides modificadas genéticamente con uno o más plásmidos que codifican una proteína capaz de complementar la deficiencia de emparejamiento endógeno de dicha primera y segunda células fúngicas haploides modificadas genéticamente; (d) emparejar la primera célula fúngica haploide modificada genéticamente con la segunda célula fúngica haploide modificada genéticamente, formando de esta manera una célula fúngica diploide modificada genéticamente; y (e) eliminar el uno o más plásmidos de la célula fúngica diploide modificada genéticamente, de forma que la célula fúngica diploide modificada genéticamente resultante está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno y comprende dos copias de una secuencia heteróloga de nucleótidos integrada cromosómicamente que codifica dicha proteína de interés.

En algunas realizaciones, la primera célula fúngica haploide modificada genéticamente y la segunda célula fúngica haploide modificada genéticamente están incapacitadas para para el emparejamiento endógeno debido a una alteración funcional de uno o más genes de respuesta a feromonas. En algunas realizaciones, la etapa (c) del método descrito anteriormente comprende la transformación de la primera y la segunda células fúngicas haploides modificadas genéticamente con uno o más plásmidos que codifican una copia funcional de uno o más de los genes de respuesta a las feromonas que están alterados funcionalmente en dicha primera y segunda células fúngicas haploides modificadas genéticamente. En algunas realizaciones, la primera y segunda células fúngicas modificadas genéticamente son células de levadura haploides y el uno o más genes de respuesta a las feromonas se seleccionan de entre el grupo que consiste en STE5, STE4, STE18, STE12, STE7, y STE11. En ciertas realizaciones, la primera y segunda células fúngicas haploides modificadas genéticamente son células de levadura haploides que tienen incapacidad para el emparejamiento endógeno debido a una alteración funcional del gen STE5.

En algunas realizaciones, la primera célula fúngica haploide modificada genéticamente y la segunda célula fúngica haploide modificada genéticamente están incapacitadas para la esporulación debido a una alteración funcional de uno o más genes de esporulación. En algunas realizaciones, la primera y segunda células fúngicas haploides modificadas genéticamente son células de levadura haploides, y el uno o más genes de esporulación se seleccionan de entre el grupo que consiste en IME1, IME2, NDT80, SPO11, SPO20, AMA1, HOP2, y SPO21. En algunas realizaciones, la primera y segunda células fúngicas haploides modificadas genéticamente son células de levadura haploides que están incapacitadas para la esporulación debido a una alteración funcional del gen IME1. En realizaciones particulares, la primera y segunda células fúngicas haploides modificadas genéticamente son células de levadura haploides que están incapacitadas para el emparejamiento endógeno debido a una alteración funcional del gen STE5, y están incapacitadas para la esporulación debido a una alteración funcional del gen IME1.

En algunas realizaciones, la segunda célula fúngica haploide modificada genéticamente se obtiene induciendo un cambio en el tipo de emparejamiento de la primera célula fúngica haploide modificada genéticamente. En ciertas realizaciones, la primera célula fúngica haploide modificada genéticamente es una célula haploide heterotálica (ho) de Saccharomyces cerevisiae, y se induce un cambio en el tipo de emparejamiento de dicha población celular de Saccharomyces cerevisiae haploide heterotálica (ho) transformando dicha célula de Saccharomyces cerevisiae haploide heterotálica (ho) con un plásmido que codifica la proteína de homotalismo (HO), de forma que la expresión de la proteín HO induce un cambio de tipo de emparejamiento en la célula de Saccharomyces cerevisiae haploide para producir una segunda célula de Saccharomyces cerevisiae haploide modificada genéticamente. Las células de Saccharomyces cerevisiae haploides heterotálicas (ho) se caracterizan por la virtual falta de cambio espontáneo del tipo de emparejamiento (una frecuencia de solo 10-6). Expresando transitoriamente la proteína HO, la frecuencia de cambios espontáneos del tipo de emparejamiento en una células de Saccharomyces cerevisiae haploide se puede incrementar hasta una vez cada división celular, proporcionando una población de células haploide de tipos de emparejamiento opuestos que se pueden emparejar entre ellos produciendo células de Saccharomyces cerevisiae diploides.

En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un método para generar una célula de levadura diploide heterotálica (ho) modificada genéticamente que carece de capacidad de esporulación y emparejamiento endógeno, comprendiendo el método: (a) obtener una primera célula de levadura haploide heterotálica modificada genéticamente, en que la primera célula de levadura haploide heterotálica modificada genéticamente comprende: (i) una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente; y (ii) alteraciones funcionales en uno más genes de esporulación y en uno o más genes de respuesta a feromonas; (b) transformar una población de la primera célula de levadura haploide heterotálica modificada genéticamente con un plásmido que codifica una proteína de homotalismo (HO) para producir una primera célula de levadura haploide modificada genéticamente, en la que la expresión de la proteína HO induce un cambio en el tipo de emparejamiento de la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente, de tal forma que se obtiene una segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente, en que la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente es del tipo de emparejamiento opuesto de la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente y comprende: (i) una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica dicha proteína de interés; y (ii) alteraciones funcionales en uno o más genes de esporulación y uno o más genes de respuesta a feromonas; (c) transformar cada primera y segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente con un plásmido que codifica una o más proteínas de respuesta a feromonas que están alteradas funcionalmente en dichas primera y segunda células de levadura haploides; (d) emparejar la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente con la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente, de manera que se forma una célula de levadura diploide modificada genéticamente que es homocigota excepto en su alelo de tipo de emparejamiento; y (e) eliminar cualquier plásmido de la célula de levadura diploide modificada genéticamente para producir un célula de levadura diploide heterotálica modificada genéticamente, en la que la célula de levadura diploide heterotálica modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno y comprende dos copias de una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica dicha proteína de interés.

Aunque las etapas de los métodos proporcionados en el presente documento y descritos en mayor detalle posteriormente están presentadas en orden secuencial, un experto en la técnica reconocerá que el orden de varias etapas se puede intercambiar, combinar o repetir sin sobrepasar el ámbito de la invención. Por tanto, en algunas realizaciones una célula de levadura heterotálica (ho) modificada genéticamente que carece de capacidad para la esporulación y el emparejamiento endógeno se genera transformando primero una célula de levadura haploide heterotálica modificada genéticamente con un plásmido que codifica una o más proteínas de respuesta a feromonas que está funcionalmente alterada en dicha célula de levadura haploide heterotálica modificada genéticamente, y luego transformando la célula con un plásmido que codifica la proteína de homotalismo (HO). En otras realizaciones, la célula de levadura diploide heterotálica (ho) genéticamente modificada que carece de capacidad para la esporulación y el emparejamiento endógeno se genera transformando simultáneamente una célula de levadura haploide heterotálica modificada genéticamente con un plásmido que codifica una o más proteínas e respuesta a feromonas que están alteradas funcionalmente en dicha célula de levadura haploide heterotálica modificada genéticamente, y un plásmido que codifica una proteína de homotalismo (HO).

5.2.1 Selección de microbios

Los microbios útiles en la práctica de los métodos proporcionados en el presente documento incluyen organismos eucariotas unicelulares, particularmente hongos, y más particularmente levaduras.

En algunas realizaciones, las levaduras útiles en los métodos presentes incluyen levaduras que se han depositado en depósitos de microorganismos (por ejemplo, IFO, ATCC, etc.) y pertenecen a los géneros Aciculoconidium, Ambrosiozyma, Arthroascus, Arxiozyma, Ashbya, Babjevia, Bensingtonia, Botryoascus, Botryozyma, Brettanomyces, Bullera, Bulleromyces, Candida, Citeromyces, Clavispora, Cryptococcus, Cystofilobasidium, Debaryomyces, Dekkara, Dipodascopsis, Dipodascus, Eeniella, Endomycopsella, Eremascus, Eremothecium, Erythrobasidium, Fellomyces, Filobasidium, Galactomyces, Geotrichum, Guilliermondella, Hanseniaspora, Hansenula, Hasegawaea, Holtermannia, Hormoascus, Hyphopichia, Issatchenkia, Kloeckera, Kloeckeraspora, Kluyveromyces, Kondoa, Kuraishia, Kurtzmanomyces, Leucosporidium, Lipomyces, Lodderomyces, Malassezia, Metschnikowia, Mrakia. Myxozyma, Nadsonia, Nakazawaea, Nematospora, Ogataea, Oosporidium. Pachysolen, Phachytichospora, Phaffia, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycodes, Saccharomycopsis, Saitoella, Sakaguchia, Saturnospora, Schizoblastosporion, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, Sporidiobolus, Sporobolomyces, Sporopachydermia, Stephanoascus, Ster igmatomyces, Sterigmatosporidium, Symbiotaphrina, Sympodiomyces, Sympodiomycopsis, Torulaspora, Trichosporiella, Trichosporon, Trigonopsis, Tsuchiyaea, Udeniomyces, Waltomyces, Wickerhamia, Wickerhamiella, Williopsis, Yamadazyma, Yarrowia, Zygoascus, Zygosaccharomyces, Zygowilliopsis, y Zygozyma, entre otros.

En algunas realizaciones, el microbio es Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, SchizoSaccharomyces pombe, Dekkera bruxellensis, Kluyveromyces lactis (llamado anteriormente Saccharomyces lactis), Kluveromyces marxianus, Arxula adeninivorans, o Hansenula polymorpha (ahora conocido como Pichia angusta). En algunas realizaciones, el microbio es una cepa del género Candida, tales como Candida lipolytica, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida pseudotropicalis, o Candida utilis.

En una realización en particular, el microbio es Saccharomyces cerevisiae. Cepas de Saccharomyces cerevisiae que se utilizan en la industria incluyen la levadura de Baker, CBS 7959, CBS 7960, CBS 7961, CBS 7962, CBS 7963, CBS 7964, IZ-1904, TA, BG-1, CR-1, SA-1, M-26, Y-904, PE-2, PE-5, VR-1, BR-1, BR-2, ME-2, VR-2, MA-3, MA-4, CAT-1, CB-1, NR-1, BT-1, y AL-1.

En algunas realizaciones, el microbio es un microbio que es adecuado para la fermentación industrial, por ejemplo la fermentación de bioetanol. En realizaciones particulares, el microbio está condicionado a subsistir bajo concentraciones altas de disolvente, alta temperatura, utilización de sustrato expandido, limitación de nutrientes, estrés osmótico debido a azúcar y sales, acidez, sulfitos y contaminación bacteriana, o combinaciones de los mismos, que son condiciones reconocidas de arco de estrés del ambiente de fermentación industrial.

5.2.2 Modificación genética de microbios

Los métodos para modificar genéticamente microbios que utilizan plásmidos recombinantes o vectores de integración cromosómica se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Sherman, F., y col., Methods Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1978); Guthrie, C., y col. (Eds.) Guide To Yeast Genetics and Molecular Biology Vol. 194, Academic Press, San Diego (1991); Sambrook y col., 2001, Molecular Cloning --A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; and Ausubel y col., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY.

En algunas realizaciones, el microbio se modifica genéticamente para comprender una o más secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican enzimas de una nueva ruta metabólica, es decir, una ruta metabólica que produce un metabolito que no produce el microbio endógenamente. En otras realizaciones, el microbio se modifica genéticamente para comprender una o más secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican enzimas de una ruta metabólica que es endógena del microbio, es decir, una ruta metabólica que produce un metabolito que produce el microbio endógenamente.

En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención necesitan el uso de plásmidos recombinantes para la expresión transitoria en el microbio de una proteína particular tal como la que codifica uno de los genes de respuesta a las feromonas u HO. Ejemplos ilustrativos de los plásmidos recombinantes adecuados para su uso en células de levadura incluyen CEN / ARS y plásmidos 2∀.

En algunas realizaciones, los microbios de la presente invención no comprenden una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica resistencia a antibióticos. Los marcadores de resistencia a antibióticos se utilizan comúnmente en la construcción de células genéticamente modificadas. En tales realizaciones de la presente invención en la que se utilizan marcadores de resistencia a antibióticos para marcar modificaciones genéticas introducidas en el microbio, estos marcadores son posteriormente eliminados después de que se han hecho todas las modificaciones genéticas deseadas en el microbio. De manera alternativa, se pueden utilizar otras herramientas de selección en la construcción de microbios modificados genéticamente, tales como la complementación auxotrófica (por ejemplo, HIS3, LEU2, LYS1, MET15, TRP1, ADE2, URA3, y LYS2).

5.2.3. Alteración de los genes de esporulación y/o respuesta a feromonas

Los métodos proporcionados en el presente documento comprenden una etapa de alteración funcional de uno o más genes de esporulación y/o uno o más genes de respuesta a feromonas en una célula microbiana modificada genéticamente. En algunas realizaciones, la alteración de uno o más genes de esporulación da como resultado una célula microbiana modificada genéticamente que carece de capacidad de esporulación. En particular, las células microbianas diploides modificadas genéticamente carecen de capacidad de esporulación. En algunas realizaciones, la alteración de uno o más genes de respuesta a feromonas da como resultado una célula microbiana que está incapacitada para el emparejamiento endógeno.

En algunas realizaciones, la alteración de un gen de esporulación o de respuesta a feromonas se consigue utilizando una construcción de alteración que es capaz de alterar específicamente un gen de esporulación o de respuesta a feromonas diana al introducirse la construcción en la célula microbiana, de forma que se produce un gen alterado no funcional. En algunas realizaciones, la alteración del gen diana evita la expresión de una proteína funcional. En algunas realizaciones, la alteración del gen diana da como resultado la expresión de una proteína no funcional a partir del gen alterado. En algunas realizaciones la alteración de un gen de esporulación o de respuesta a feromonas diana se consigue por la integración de una “secuencia de alteración” en el locus del gen diana por recombinación homóloga. En tales realizaciones, la construcción de alteración comprende una secuencia de alteración flanqueada por un par de secuencias de nucleótidos que son homólogas a un par de secuencias de nucleótidos del locus del gen diana (secuencias homólogas). En la sustitución de una parte determinada del gen diana por la construcción de alteración, la secuencia de alteración evita la expresión de una proteína funcional, o produce la expresión de una proteína no funcional, a partir del gen diana.

Las construcciones de alteración capaces de alterar uno o más genes de esporulación o de respuesta a feromonas se puede construir utilizando técnicas de referencia de biología molecular bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., 2001, Molecular Cloning --A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, y Ausubel y col., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY. Los parámetros de la construcción de alteración que se pueden variar en la práctica de los presentes métodos incluyen, pero sin limitarse a estos, las longitudes de las secuencias homólogas; la secuencia de nucleótidos de las secuencias homólogas; la longitud de la secuencia de alteración, la secuencia de nucleótidos de la secuencia de alteración; y la secuencia de nucleótidos del gen diana. En algunas realizaciones, un intervalo eficaz de longitud de cada secuencia homóloga es de 50 a 5.000 pares de bases. Para una exposición de la longitud de homología que se necesita para el direccionamiento génico, véase Hasty y col., Mol Cell Biol 11:5586-91 (1991). En algunas realizaciones, las secuencias homólogas comprenden secuencias codificantes del gen diana. En algunas realizaciones, una secuencia homóloga comprende una secuencia de nucleótidos que es homóloga a una secuencia de nucleótidos localizada en el 5’ de la secuencia codificante del gen diana, y la otra secuencia homóloga comprende una secuencia de nucleótidos que es homóloga a una secuencia de nucleótidos localizada en el 3’ de la secuencia codificante del gen diana. En algunas realizaciones, la secuencia de alteración comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un marcador genético que hace posible la selección de células microbianas que comprenden la secuencia de alteración. Por tanto, en tales realizaciones, la construcción de alteración tiene una doble función, es decir, altera funcionalmente el gen diana y proporciona un marcador genético para la identificación de células en las que el gen diana está alterado funcionalmente. En algunas realizaciones, un codón de terminación se posiciona en fase con y corriente abajo de la secuencia de nucleótidos que codifica el marcador genético para evitar la lectura traduccional que puede producir una proteína de fusión que tenga algún grado de actividad de proteína tipo silvestre codificado por el gen diana. En algunas realizaciones, la longitud de la secuencia de alteración es un par de bases. La inserción de un único par de bases puede ser suficiente para alterar un gen diana porque la inserción del único par de bases en una secuencia codificante podría constituir una mutación de cambio de fase que podría evitar la expresión de una proteína funcional. En algunas realizaciones, la secuencia de la secuencia de alteración se diferencia de la secuencia de nucleótidos del gen diana localizada entre las secuencias homólogas por un único par de bases. En la sustitución de la secuencia de nucleótidos en el gen diana con la secuencia de alteración, la sustitución del único par de bases que se introduce podría dar como resultado la sustitución de un único aminoácido en un sitio crítico de la proteína y la expresión de una proteína no funcional. Se debería reconocer, sin embargo, que las alteraciones efectuadas utilizando secuencias de alteración muy cortas son susceptibles de reversión a la secuencia de tipo silvestre por medio de mutación espontánea, dando lugar a la restauración de la capacidad de emparejamiento o esporulación en la cepa huésped. En consecuencia, en realizaciones particulares, las secuencias de alteración son más largas que uno o pocos pares de bases. Por el contrario, una secuencia de alteración de longitud excesiva es improbable que confiera alguna ventaja sobre la secuencia de alteración de longitud moderada, y puede disminuir la eficacia de transfección o selección de la diana. Una longitud excesiva en este contexto es varias veces más larga que la distancia entre las secuencias homólogas escogidas en el gen diana. Por tanto, en ciertas realizaciones, la longitud de la secuencia de alteración puede ser de 2 a 2.000 pares de bases. En otras realizaciones, la longitud de la secuencia de alteración tiene una longitud equivalente aproximadamente a la distancia entre las regiones del locus del gen diana que coinciden con las secuencias homólogas de la construcción de alteración.

En algunas realizaciones, la construcción de alteración es una molécula de ADN lineal. En otras realizaciones, la construcción de alteración es una molécula de ADN circular. En algunas realizaciones, la construcción de alteración circular comprende un par de secuencias homólogas separadas por una secuencia de alteración, como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, la construcción de alteración circular comprende una secuencia homóloga única. Tales construcciones de alteración circulares, en la integración al locus del gen diana, se podrían convertir en lineales, con una porción de la secuencia homóloga posicionada en cada extremo y los segmentos remanentes de la construcción de alteración se insertan en el gen diana alterándolo sin remplazar ninguna secuencia de nucleótidos del gen diana. En realizaciones en particular, la secuencia única homóloga de una construcción de alteración circular es homóloga a una secuencia localizada en la secuencia codificante del gen diana.

Las construcciones de alteración se pueden introducir en una célula microbiana por cualquier método conocido por un experto en la técnica sin limitación. Tales métodos incluyen pero sin limitarse a estos, la toma directa de la molécula por una célula a partir de una solución, o la toma facilitada por medio de lipofección utilizando, por ejemplo, liposomas o inmunoliposomas; transfección mediada por partículas; etc. Véase por ejemplo Patente de EE. UU. 5.272.065; Goeddel y col., eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression --A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning --A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; y Ausubel y col., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY. Métodos particulares para la transformación de células de levadura se conocen bien en la técnica. Véase Hinnen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 75: 1292-3 (1978); Cregg y col., Mol. Cell. Biol. 5: 3376-3385 (1985). Las técnicas ejemplares incluyen pero sin limitarse a estas, esferoplastos, electroporación, transformación mediada por PEG 1000 y transformación mediada por cloruro de litio o acetato de litio.

5.2.3.1 Genes de respuesta a feromonas

En algunas realizaciones, el gen de respuesta a feromonas alterado en una célula de levadura de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento es STE5. El gen STE5 codifica una proteína scaffold que se requiere para dirigir la señalización por medio de la ruta de emparejamiento de levaduras a la proteín quinasa de mitógeno activado (MAPK). Véase, por ejemplo, Good y col., Cell Mar 20; 136 (6): 1085-97 (2009). Las secuencias de nucleótidos del STE5 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank L23856, y las SEC ID Nos 17, 45, 73, 101, y 129 que se proporcionan en el presente documento. Las secuencias de proteína Ste5 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank AAA35115, y las SEC ID Nos 18, 46, 74, 102, y 130 que se proporcionan en el presente documento.

En algunas realizaciones, el gen de respuesta a las feromonas alterado en una célula de levadura de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento es STE4. El gen STE4 codifica una subunidad beta de la proteína G que forma un dímero con Ste18p para activar la ruta de señalización del emparejamiento. La secuencia del gen STE4 de Saccharomyces cerevisiae se han descrito previamente. Dujon y col., Nature 387 (6632 Supl):98102 (1997). Las secuencias de nucleótidos de STE4 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank NC_00114.5, y las SEC ID Nos 19, 47.75.103, y 131 que se proporcionan en el presente documento. Las secuencias de la proteína Ste4 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluye el número de registro Genbank NP_014855, y las SEC ID Nos 20, 48, 76, 104, y 132 que se proporcionan en el presente documento.

En algunas realizaciones, el gen de respuesta a feromonas alterado en una célula de levadura de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento es STE18. El gen STE18 codifica la subunidad gamma de la proteína G que forma un dímero con Ste4p para activar la ruta de señalización de emparejamiento. La secuencia del gen STE18 de Saccharomyces cerevisiae se ha descrito previamente. Véase, por ejemplo, Goffeau y col., Science 274 (5287): 546-547 (1996). Las secuencias de nucleótidos de STE18 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro de Genbank NC_001147.5, y las SEC ID Nos 21, 49, 77, 105, y 133 que se proporcionan en el presente documento. Las secuencias de la proteína Ste18 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank NP_012619, y las SEC ID Nos 22, 50, 78, 106, y 134 que se proporcionan en el presente documento.

En algunas realizaciones, el gen de respuesta a feromonas alterado en una célula de levadura de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento es STE12. El gen STE12 codifica un factor de transcripción que se activa por la cascada de señalización de la MAP quinasa, y que activa genes que están implicados en las rutas de emparejamiento o crecimiento pseudohifal/ invasivo. La secuencia del gen STE12 de Saccharomyces cerevisiae se ha descrito anteriormente. Véase, por ejemplo, Goffeau y col., Science 274 (5287): 546-547 (1996). Las secuencias del STE12 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank NC_001140.5, y las SEC ID Nos 23, 51, 79, 107, y 135 que se proporcionan en el presente documento. Las secuencias de la proteína Ste12 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank NP_011952, y las SEC ID Nos 24, 52, 80, 108 y 136 que se proporcionan en el presente documento.

En algunas realizaciones, el gen de respuesta a feromonas alterado en una célula de levadura de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento es STE7. El gen STE7 codifica una señal de transducción de la MAP quinasa, quinasa que está implicada en la respuesta a feromonas cuando fosforila el Fus3p. La secuencia del gen STE7 de Saccharomyces cerevisiae se ha descrito anteriormente. Véase por ejemplo, Teague y col., Proc Natl Acad Sci USA. 83 (19): 7371-5 (1986). Las secuencias de nucleótidos de STE7 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro de Genbank Z74207, y las SEC ID Nos 25, 53, 81, 109, y 137 que se proporcionan en el presente documento. Las secuencias de la proteína Ste7 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluye el número de registro de Genbank CAA98732, y las SEC ID Nos 26, 54, 82, 110, y 138 que se proporcionan en el presente documento.

En algunas realizaciones, el gen de respuesta a feromonas alterado en una célula de levadura de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento es STE11. El gen STE11 codifica una señal de transducción de la MEK quinasa implicada en las rutas de respuesta a feromonas y crecimiento pseudohifal/ invasivo en que fosforila a Ste7p. La secuencia del gen STE11 de Saccharomyces cerevisiae se ha descrito previamente. Véase, por ejemplo, Johnston y col., Nature 387 (6632 Suppl), 87-90 (1997). Las secuencias de nucleótidos del STE11 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank NC_001144.4, y las SEC ID

Nos

27, 55, 83, 111, y 139 que se proporcionan en el presente documento. Las secuencias de la proteína Ste11 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank NP_013466, y las SEC ID Nos 28, 56, 84, 112, y 140 que se proporcionan en el presente documento.

5.2.3.2 Genes de esporulación

En algunas realizaciones, el gen de esporulación alterado en una célula de levadura de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento es IME1. El gen IME1 codifica un factor de transcripción que activa la transcripción génica meiótica precoz, que se necesita para el inicio de la meiosis. La secuencia del gen IME1 de Saccharomyces cerevisiae se ha descrito previamente. Véase, por ejemplo, Smith, H.E., y col., Mol. Cell. Biol. 10 (12): 6103-6113 (1990). Las secuencias de nucleótidos del IME1 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank M37188, y las SEC ID Nos 1, 29, 57, 85, y 113 que se proporcionan en el presente documento. Las secuencias de la proteína Ime1 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank AAA86790, y las SEC ID Nos 2, 30, 58, 86, y 114 que se proporcionan en el presente documento.

En algunas realizaciones, el gen de esporulación alterado en una célula de levadura de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento es IME2. El gen IME2 codifica una proteín quinasa serina/ treonina implicada en la activación de la meiosis. La secuencia del gen IME2 de Saccharomyces cerevisiae se ha descrito previamente. Véase, por ejemplo, EMBO J. 15 (9), 2031-2049 (1996). Las secuencias de nucleótidos del IME2 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluye el número de registro Genbank NC_001142, y las SEC ID Nos 3; 31, 59, 87, y 115 que se proporcionan en el presente documento. Las secuencias de la proteína Ime2 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank NP_012429, y las SEC ID Nos 4, 32, 60, 88, y 116 que se proporcionan en el presente documento.

En algunas realizaciones, el gen de esporulación alterado en una célula de levadura de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento es NDT80. El gen NDT80 codifica un factor de transcripción específica de meiosis requerido para la salida de la paquitene y para la recombinación meiótica. La secuencia del gen NDT80 de Saccharomyces cerevisiae se ha descrito previamente. Véase, por ejemplo, Goffeau y col., Science 274 (5287): 546547 (1996). Las secuencias de nucleótidos del NDT80 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank NC_001140, y las SEC ID Nos 5, 33, 61, 89, y 117 que se proporcionan en el presente documento. Las secuencias de la proteína Ndt80 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank NP_011992, y las SEC ID Nos 6, 34, 62, 90, y 118 que se proporcionan en el presente documento.

En algunas realizaciones, el gen de esporulación alterado en una célula de levadura de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento es SPO11. El gen SPO11 se requiere para la recombinación meiótica. La secuencia del gen SPO11 de Saccharomyces cerevisiae se ha descrito previamente. Véase, por ejemplo, Atcheson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (22), 8035-8039 (1987). Las secuencias de nucleótidos del SPO11 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank J02987, y las SEC ID Nos 7, 35, 63, 91, y 119 que se proporcionan en el presente documento. Las secuencias de la proteína Spo11 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank AAA65532, y las SEC ID Nos 8, 36, 64, 92, y 120 que se proporcionan en el presente documento.

En algunas realizaciones, el gen de esporulación alterado en una célula de levadura de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento es SPO20. El gen SPO20 codifica una subunidad específica de meiosis del complejo t-SNARE, necesaria la formación de la membrana proespora durante la esporulación. La secuencia del gen SPO20 de Saccharomyces cerevisiae se ha descrito previamente. Véase, por ejemplo, Bowman y col., Nature 387 (6632 Supl), 90-93 (1997). Las secuencias de nucleótidos SPO20 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank AF078740, y las SEC ID Nos 9, 37, 65, 93, y 121 que se proporcionan en el presente documento. Las secuencias de la proteína Spo20 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank NP_013730, y las SEC ID Nos 10, 38, 66, 94, y 122 que se proporcionan en el presente documento.

En algunas realizaciones, el gen de esporulación alterado en una célula de levadura de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento es AMA1. El gen AMA1 codifica un activador del complejo promotor de la anafase de meiosis. La secuencia del gen AMA1 de Saccharomyces cerevisiae se ha descrito previamente. Véase, por ejemplo, Tettelin y col., Nature 387 (6632 Supl): 81-84 (1997). Las secuencias de nucleótidos del AMA1 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank NC_001139.8, y las SEC ID

Nos

11, 39, 67, 95, y 123 que se proporcionan en el presente documento. Las secuencias de la proteína Ama1 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank NP_011741, y las SEC ID Nos 12, 40, 68, 96, y 124 que se proporcionan en el presente documento.

En algunas realizaciones, el gen de esporulación alterado en una célula de levadura de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento es HOP2. El gen HOP2 codifica una proteína específica de meiosis que asegura la sinapsis entre cromosomas homólogos. La secuencia del gen HOP2 de Saccharomyces cerevisiae se ha descrito previamente. Véase, por ejemplo, Leu y col., Cell 94 (3): 375-386 (1998). Las secuencias de nucleótidos del HOP2 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank AF_078740.1, y las SEC ID Nos 13, 41, 69, 97, y 125 que se proporcionan en el presente documento. Las secuencias de la proteína Hop2 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank AAC31823, y las SEC ID Nos 14, 42, 70, 98, y 126 que se proporcionan en el presente documento.

En algunas realizaciones, el gen de esporulación alterado en una célula de levadura de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento es SPO21. El gen SPO21 codifica un componente de la placa meiótica externa el cuerpo polar del huso, implicado en la modificación de la placa externa que se necesita antes de la formación de la membrana proespora. La secuencia del gen SPO21 de Saccharomyces cerevisiae se ha descrito previamente. Véase, por ejemplo, Dujon y col., Nature 387 (6632 Supl): 98-102 (1997). Las secuencias de nucleótidos del SPO21 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank NC_001147.5, y las SEC ID Nos 15, 43, 71, 99, y 127 que se proporcionan en el presente documento. Las secuencias de la proteína Spo21 representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro Genbank NP_014550, y las SEC ID Nos 16, 44, 72, 100, y 128 que se proporcionan en el presente documento.

5.2.4 Preparación de diploides

Los métodos proporcionados en el presente documento comprenden una etapa de inducción del emparejamiento entre células haploides que comprende una alteración funcional en uno o más genes de esporulación y/o una alteración funcional en uno o más genes de respuesta a feromonas. Las células diploides formadas como resultado de dicho emparejamiento son células diploides estables constreñidas en la fase diploide debido a la alteración funcional de uno o más genes de esporulación en la célula.

Para formar una célula diploide a partir de células haploides que carecen de capacidad para el emparejamiento, las células haploides incapaces de emparejarse se transforman con un “plásmido complementario de emparejamiento”, es decir, un plásmido recombinante que comprende un gen heterólogo que puede complementar la deficiencia de emparejamiento producida por la alteración funcional en el uno o más genes de respuesta a feromonas. La expresión transitoria del gen de respuesta a feromonas en las células haploides restaura temporalmente la función de emparejamiento en las células y capacita células haploides de tipo de emparejamiento opuesto para formar una célula diploide estable. En particular, las células diploides estables formadas de esta manera son homocigotas excepto para su alelo de tipo de emparejamiento, generándose a partir de haploides de la misma población modificada genéticamente.

Por tanto, en algunas realizaciones en las que la célula haploide comprende una alteración funcional del gen STE5, la célula haploide se transforma con un plásmido complementario de emparejamiento que comprende una secuencia codificante de STE5. En algunas realizaciones en las que la célula haploide comprende una alteración funcional del gen STE4, la célula haploide se transforma con un plásmido complementario de emparejamiento que comprende una secuencia codificante STE4. En algunas realizaciones en las que la célula haploide comprende una alteración funcional del gen STE18, la célula haploide se transforma con un plásmido complementario de emparejamiento que comprende una secuencia codificante STE18. En algunas realizaciones en las que la célula haploide comprende una alteración funcional del gen STE12, la célula haploide se transforma con un plásmido complementario de emparejamiento que comprende una secuencia codificante STE12. En algunas realizaciones en las que la célula haploide comprende una alteración funcional del gen STE7, la célula haploide se transforma con un plásmido complementario de emparejamiento que comprende una secuencia codificante STE7. En algunas realizaciones en las que la célula haploide comprende una alteración funcional del gen STE11, la célula haploide se transforma con un plásmido complementario de emparejamiento que comprende una secuencia codificante STE11.

Las técnicas para la construcción de vectores de expresión y la expresión de genes en las células que comprenden los vectores de expresión son bien conocidas en la técnica. Véase por ejemplo, Sambrook y col., 2001, Molecular Cloning --A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, y Ausubel y col., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY. Los plásmidos que codifican genes complementarios de emparejamiento se pueden introducir en la célula huésped por cualquier método conocido por un experto en la técnica.

Los sistemas basados en plásmidos requieren generalmente presión selectiva sobre los plásmidos para mantener el ADN ajeno en la célula. La mayoría de los plásmidos en las levaduras son relativamente inestables, de forma que una célula de levadura normalmente pierde el 10 % de los plásmidos contenidos en la célula después de la división mitótica. Por tanto, en algunas realizaciones, la selección de células diploides que se formaron por emparejamiento de células haploides que comprendían un plásmido que codificaba un gen complementario de emparejamiento pero que ya no comprenden en las mismas el plásmido, se consigue permitiendo que las células diploides se sometan a las suficientes divisiones mitóticas para que el plásmido se diluya eficazmente en la población. De manera alternativa, las células diploides se pueden seleccionar seleccionando la ausencia del plásmido, por ejemplo, seleccionando contra una respuesta de un marcador genético (tal como, por ejemplo, URA3) o colocando en placas colonias idénticas en medio tanto selectivo como no selectivo y luego seleccionando una colonia que no crece en el medio selectivo pero que crece en el medio no selectivo.

En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento comprenden una etapa de transformación de una célula de levadura heterotálica (ho) haploide con un plásmido recombinante que codifica una proteína de homotalismo (HO), en la que la expresión de la proteína HO induce un cambio en el tipo de emparejamiento de la célula haploide. La secuencia del gen HO de Saccharomyces cerevisiae se ha descrito anteriormente. Véase, por ejemplo, Russell y col., Mol. Cell. Biol. 6 (12): 4281-4294 (1986). Las secuencias de nucleótidos del HO representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro en Genbank NC_001136, y la SEC ID Nº 151 que se proporciona en el presente documento. Las secuencias de la proteína HO representativas de Saccharomyces cerevisiae incluyen el número de registro en Genbank NP_010054, y la SEC ID Nº 152 que se proporciona en el presente documento.

6. Ejemplos

6.1 Ejemplo 1:

Generación de células haploides modificadas genéticamente

Este ejemplo describe un método ejemplar para generar células de S. cerevisiae haploides modificadas genéticamente.

La construcción de alteración Fase I (Figura 1; SEC ID Nº 141) comprende como secuencia de alteración secuencias de nucleótidos que codifican un marcador genético (hygA, que confiere resistencia a la higromicina B); dos enzimas de la ruta MEV de S. cerevisiae (la secuencia codificante truncada HMG1, que codifica una HMG-CoA reductasa truncada, y la secuencia codificante ERG13, que codifica la HMG-CoA sintasa), y otra enzima de S. cerevisiae (la secuencia codificante ERG10, que codifica la acetoacetil-CoA tiolasa) bajo el control de promotores inducibles por galactosa (promotores de los genes GAL1 y GAL 10 de S. cerevisiae); flanqueada por secuencias que consisten en secuencias corriente arriba y abajo del locus GAL80 de S. cerevisiae. Para la introducción en una célula S. cerevisiae huésped, la construcción de alteración Fase I puede integrarse por recombinación homóloga en el locus GAL80 del genoma de la célula S. cerevisiae huésped, y alterar funcionalmente el locus GAL80 sustituyendo la secuencia codificante del GAL80 con su secuencia alterante. La construcción de alteración Fase I se clonó en el vector de clonación TOPO Zero Blunt II (Invitrogen, Carlsbad, CA), produciendo el plásmido TOPO-construcción de alteración Fase I. La construcción se propagó en las células TOP10 cultivadas en agar LB que contenía 50 ∀g/ml de kanamicina.

La construcción de alteración Fase II (Figura 2; SEC ID Nº 142) comprende como secuencia de alteración secuencias de nucleótidos que codifican un marcador genético (natA, que confiere resistencia a la noursetricina) y varias enzimas de la ruta MEV de S. cerevisiae (la secuencia codificante ERG12, que codifica la mevalinato quinasa, y la secuencia codificante EGR8 que codifica la fosfomevalonato quinasa), bajo el control de promotores inducibles por galactosa (promotores de los genes GAL1 y GAL10 de S. cerevisiae); así como la secuencia codificante del gen GAL4 del S. cerevisiae bajo el control del promotor GAL4oc (promotor GAL4 que comprende una mutación que elimina el sitio de unión MIG1, haciendo así el promotor menos sensible a la represión por glucosa); flanqueada por secuencias homólogas que consisten en secuencias de nucleótidos corriente arriba y abajo del locus LEU2 de S. cerevisiae. Para la introducción en una célula S. cerevisiae huésped, la construcción de alteración Fase II puede integrarse por recombinación homóloga en el locus LEU2 del genoma de un célula S. cerevisiae huésped, y altera funcionalmente el locus LEU2 sustituyendo la secuencia codificante LEU2 con su secuencia de alteración. La construcción de alteración Fase II se clonó en el vector de clonación TOPO Zero Blunt II, produciendo un plásmido TOPO-construcción de alteración Fase II. La construcción se propagó en células TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) cultivadas en agar LB que contenía 50 ∀g/ml de kanamicina.

La construcción de alteración Fase III (Figura 3; SEC ID Nº 143) comprende como secuencia de alteración secuencias que codifican un marcador genético (kanA, que confiere resistencia a G418); una enzima de la ruta MEV de S. cerevisiae (la secuencia codificante ERG19, que codifica la difosfomevalonato decarboxilasa), y dos enzimas de S. cerevisiae implicadas en la conversión del producto de la ruta MEV, IPP, en FPP (la secuencia codificante EWRG20 codifica la farnesil pirofosfato sintasa, y la secuencia codificante IDI 1 codifica la isopentenil pirofosfato decarboxilasa), bajo el control de promotores inducibles por galactosa (promotores de los genes GAL1, GAL 10, y GAL7 de S. cerevisiae); así como el promotor del gen CTR3 de S. cerevisiae; flanqueada por secuencias de nucleótidos corriente arriba o abajo del locus ERG9 de S. cerevisiae. Para la introducción en la célula S. cerevisiae huésped, la construcción de alteración Fase II puede integrarse por recombinación homóloga corriente arriba del locus ERG9 del genoma de la célula S. cerevisiae huésped, sustituyendo el promotor nativo ERG9 con el promotor CTR3 de tal manera que la expresión de ERG9 (escualen sintasa) puede modularse con cobre. La construcción de alteración Fase III se clonó en el vector de clonación TOPO Zero Blunt II, produciendo el plásmido TOPOconstrucción de alteración Fase III. La construcción se propagó en células TOP 10 cultivadas en agar LB que contenía 50 ∀g/ml de kanamicina.

La construcción de reciclado del marcador Fase I (Figura 4; SEC ID Nº 144) comprende secuencias de nucleótidos que codifican un marcador genético (URA 3, que confiere la capacidad para crecer en un medio carente de uracilo); y una enzima de A. annua (la secuencia codificante FS, que codifica la farnesen sintasa), bajo el control regulador del promotor del gen GAL7 de S. cerevisiae; flanqueada por secuencias de nucleótidos corriente arriba del locus GAL80 de S. cerevisiae y las secuencias codificantes del gen HMG1 de S. cerevisiae. Para la introducción en la célula S. cerevisiae huésped, la construcción de reciclado del marcador Fase I puede integrarse por recombinación homóloga en la secuencia de alteración Fase I que ya está integrada, tal que el marcador selectivo hphA se sustituye por URA3.

La construcción de reciclado del marcador Fase II (Figura 5; SEC ID Nº 145) comprende secuencias de nucleótidos que codifican un marcador genético (URA3, que confiere la capacidad de crecer en un medio que carece de uracilo) y una enzima de A. annua (la secuencia codificante FS, que codifica la farnesen sintasa), bajo el control regulador del promotor del gen GAL7 de S. cerevisiae; flanqueada por secuencias de nucleótidos corriente arriba del locus LEU2 de S. cerevisiae y secuencias codificantes del gen ERG12 de S. cerevisiae. Para la introducción en la célula

S. cerevisiae huésped, la construcción de reciclado del marcador Fase II puede integrarse por recombinación homóloga en la secuencia de alteración Fase II ya integrada tal que el marcador selectivo natA se sustituye con URA

3.

La construcción de reciclado del marcador Fase III (Figura 6; SEC ID Nº 146) comprende secuencias de nucleótidos que codifican un marcador genético (URA 3, que confiere la capacidad de crecer en medios carentes de uracilo) y una enzima de A. annua (la secuencia codificante FS, que codifica la farnesen sintasa), bajo el control regulador del promotor del gen GAL7 de S. cerevisiae; flanqueada por secuencias de nucleótidos corriente arriba del locus ERG9 de S. cerevisiae y secuencias codificantes del gen ERG19 de S. cerevisiae. Para la introducción en la célula S. cerevisiae huésped, la construcción de reciclado del marcador Fase II puede integrarse por recombinación homóloga en la secuencia de alteración Fase III ya integrada tal que el marcador selectivo kanA se sustituye con URA 3.

El plásmido de expresión pAM404 (SEC ID Nº 153) codifica la #-farnesen sintasa. La secuencia de nucleótidos insertada se generó sintéticamente, utilizando como matriz la secuencia codificante del gen de la #-farnesen sintasa de Artemisia annua (número de registro GenBank AY835398) optimizada por codón para la expresión en Saccharomyces cerevisiae.

La cepa huésped iniciadora Y1198 se generó resuspendiendo la levadura PE-2 seca activa (aislada en 1994; regalo de Santelisa Vale, Sertäozinho, Brasil) en 5 ml de medio YPD que contenía 100 ug/ml de carbenicilina y 50 ug/ml de kanamicina. El cultivo se incubó una noche a 30 ºC en un agitador rotatorio a 200 rpm. Se colocó en placas una alícuota de 10 ul del cultivo sobre una placa YPD y se dejó secar. Las células se sembraron en estrías seriadamente en colonias únicas, y se incubaron durante 2 días a 30 ºC. Se escogieron doce colonias únicas, y se parchearon en una nueva placa de YPD, y se dejaron que crecieran durante una noche a 30 ºC. Las identidades de las cepas de las colonias se verificaron analizando sus tamaños cromosómicos en un sistema Bio-Rad CHEF DR II (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando el kit Bio-Rad CHEF Genomic ADN Plug (Bio-Rad, Hercules. CA) según las especificaciones del fabricante. Se escogió una colonia y se almacenó como cepa Y1198.

Las cepas Y1661, Y1662, y Y1664 se generaron a partir de la cepa Y1198 preparando la cepa haploide para permitir la manipulación genética. Se cultivó la cepa Y1198 durante una noche en 5 ml de medio YPD a 30 ºC en un tubo de cristal en una batería rotatoria. Se midió la DO600, y se diluyeron las células hasta una DO600 de 0,2 en 5 ml de medio YP que contenía un 2 % de acetato potásico. El cultivo se cultivó durante una noche a 30 ºC en un tubo de cristal en una batería rotatoria. Se midió de nuevo la DO600, y se recolectaron 4 DO600*ml de células por centrifugación a 5.000 x g durante 2 minutos. El aglomerado celular se lavó una vez con agua estéril, y luego se resuspendieron en 3 ml de acetato potásico al 2 % conteniendo un 0,02 % de rafinosa. Las células se cultivaron durante 3 días a 30 ºC en un tubo de cristal en una batería rotatoria. Se confirmó por microscopía la esporulación. Se transfirió una alícuota de 33 ∀l del cultivo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se centrífugo a 14.000 rpm durante 2 minutos. El aglomerado celular se resuspendió en 50 ∀l de agua estéril que contenía 2∀l de Zymolasa 100T a 10 mg/ml (MP Biomedicals, Solon, OH), y se incubaron las células durante 10 minutos en un baño de agua a 30 ºC. El tubo se transfirió a hielo, y se añadieron 150 ∀l de agua fría de deshielo. Se añadió una alícuota de 10 ∀l de esta mezcla a una placa YPD de 12 ml, y se disecaron las tétradas en un microscopio de disección Singer MSM 300 (Singer, Somerset, UK). La placa YPD se incubó a 30 ºC durante 3 días, tras lo cual las esporas se sembraron en una placa YPD nueva y se dejaron creciendo una noche a 30 ºC. Los tipos de emparejamiento de cada espora de 8 tétradas de cuatro esporas se analizaron por PCR de colonia. Se escogió una única tétrada de 4 esporas con 2 MATa y 2 MAT! y se almacenaron como cepas Y1661 (MATa), Y1662 (MATa), Y1663 (MAT!), y Y1664 (MAT!).

Para las transformaciones celulares de la levadura, se inocularon 25 ml de medio Extracto de Levadura Peptona Dextrosa (YPD) con una colonia única de una cepa huésped de inicio. El cultivo se dejó creciendo durante una noche a 30º C en un agitador rotatorio a 200 rpm. Se midió la DO600 del cultivo, y luego se utilizó este cultivo para inocular 50 ml de medio YPD a una DO600 de 0,15. El nuevo cultivo inoculado se dejó crecer a 30 ºC en un agitador rotatorio a 200 rpm hasta una DO600 de 0,7 a 0,9, en cuyo punto las células se transformaron con 1 ∀g de ADN. Se dejó que las células se recuperaran en medio YPD durante 4 horas antes de colocarse en placas sobre agar que contenían un agente selectivo para identificar las células huésped transformantes.

La cepa huésped Y1515 se generó transformando la cepa Y1664 con el plásmido TOPO-construcción de alteración Fase I por digestión completa utilizando la endonucleasa de restricción Pmel. Las células huésped transformantes se seleccionaron con medio YPD que contenía 300 ug/ml de higromicina B, y se verificaron los transformantes positivos que comprendían la secuencia de alteración Fase I integrada en el locus GAL80 por amplificación por PCR.

La cepa huésped Y1762 se generó transformando la cepa Y1515 con el plásmido TOPO-construcción de alteración Fase II digerido completamente utilizando la endonucleasa de restricción PmeI. Los transformantes se seleccionaron en medio YPD que contenía 100 ug/ml de noursetricina, y se verificaron los transformantes positivos que comprendían la secuencia de alteración Fase II integrada en el locus LEU2 por amplificación por PCR.

La cepa huésped Y1770 se generó trasformando la cepa Y1762 en dos etapas con el plásmido pAM404 y el plásmido TOPO-construcción de alteración Fase III digerido completamente utilizando la endonucleasa de restricción PmeI. Las células huésped transformantes con pAM404 se seleccionaron en Medio Sintético Completo (CSM) que carecía de metionina y leucina. Las células transformantes con pAM404 y construcción de alteración Fase III se seleccionaron en medio CSM carente de metionina y leucina y que contenía 200 ug/ml de G418 (Geneticina®), y se verificaron las transformantes positivas que comprendían la secuencia de alteración Fase III integrada en el locus ERG9 por amplificación PCR.

La cepa huésped Y1793 se generó transformando la cepa Y1770 con una construcción de anulación URA3 (SEC ID Nº 154). La construcción de anulación URA3 comprende secuencias corriente arriba y abajo del locus URA3 (generadas a partir del ADN genómico de la cepa Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2). Las células huésped transformantes se seleccionaron en medio YPD que contenía 5-FOA.

La cepa huésped YAAA se generó transformando la cepa Y1793 con la construcción de reciclado del marcador Fase

I. Se seleccionaron los transformantes en CSM carente de metionina y uracilo. El marcador URA3 se escindió cultivando las células una noche en medio YPD a 30 ºC en un agitador rotatorio a 200 rpm, y luego se colocaron las células en placas en agar que contenía 5-FOA. La escisión del marcador se confirmó por PCR de colonia.

La cepa huésped YBBB se generó transformando la cepa YAAA con la construcción de reciclado del marcador Fase

II. Se seleccionaron las células transformantes en medio CSM carente de metionina y uracilo. El marcador URA3 se escindió cultivando las células una noche en un medio YPD a 30 ºC en un agitador rotatorio a 200 rpm, y luego colocando las células en placas agar que contenía 5-FOA. Se confirmó la escisión del marcador por PCR de colonia.

La cepa huésped Y1912 se generó transformando la cepa YBBB con la construcción de reciclado del marcador Fase

III. Las células huésped transformantes se seleccionaron en CSM carente de metionina y uracilo. El marcador URA3 se escindió cultivando las células una noche en medio YPD a 30 ºC en un agitador rotatorio a 200 rpm, y luego se colocaron las células en placas en agar que contenía 5-FOA. La escisión del marcador se confirmó por PCR de colonia.

6.2. Ejemplo 2: Generación de células haploides modificadas genéticamente incapacitadas para laesporulación y el emparejamiento endógeno

Este ejemplo describe un método ejemplar para la alteración de un gen de esporulación y un gen de respuesta a feromonas en una célula haploide de S. cerevisiae modificada genéticamente para dar lugar a una célula haploide de S. cerevisiae modificada genéticamente que está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno.

La construcción de alteración STE5 (Figura 7; SEC ID Nº 147) comprende como secuencia de alteración, secuencias de nucleótidos que codifican un marcador genético (URA3, que confiere la capacidad de crecer en un medio carente de uracilo); y una enzima de la ruta MEV de S. cerevisiae (la secuencia codificante HMG2 truncada, que codifica una HMG-CoA reductasa), bajo el control regulador del promotor del gen THD3 de S. cerevisiae; flanqueada por secuencias homólogas que consisten en secuencias de nucleótidos corriente arriba y abajo del locus STE5 de S. cerevisiae. Para la introducción en células S. cerevisiae huésped, la construcción de alteración STE5 se puede integrar por recombinación homóloga en el locus STE5 del genoma de la célula S. cerevisiae huésped, alterando funcionalmente el locus STE5 sustituyendo la secuencia codificante STE5 por su secuencia de alteración.

La construcción de alteración IME1 (Figura 8; SEC ID Nº 148) comprende como secuencia de alteración, secuencias de nucleótidos que codifican un marcador genético (LEU2, que confiere la capacidad de crecer en un medio carente de leucina); y una enzima de A. annua (la secuencia codificante FS, que codifica una farnesen sintasa), bajo el control regulador del promotor del gen THD3 de S. cerevisiae; flanqueada por secuencias homólogas que consisten en secuencias de nucleótidos corriente arriba y abajo del locus IME5 de S. cerevisiae. Para la introducción en células S. cerevisiae huésped, la construcción de alteración IME1 se puede integrar por recombinación homóloga en el locus IME1del genoma de la célula S. cerevisiae huésped, alterando funcionalmente el locus IME1 sustituyendo la secuencia codificante IME1por su secuencia de alteración.

La cepa huésped Y1913 se generó a partir de la cepa Y1912 (véase el Ejemplo 1) con la construcción de alteración STE5. Las células huésped transformantes se seleccionaron en CSM carente de metionina y uracilo, y los transformantes positivos se verificaron por amplificación por PCR.

La cepa Y1915 se generó a partir de la cepa Y1913 polimerizando la cepa con pAM404 y transformando la cepa resultante con la construcción de alteración IME1. La cepa Y1913 se propagó en medio YPD no selectivo durante 3 días a 30 ºC en un agitador rotatorio a 200 rpm. Se pusieron aproximadamente 100 células en placas con medio YPD sólido y se les permitió crecer durante 3 días a 30 ºC. Las células polimerizadas se identificaron por su capacidad para crecer en un medio mínimo que contenía leucina y su incapacidad para crecer en un medio carente de leucina. Se escogió una única de tales colonias y se transformó con la construcción de alteración IME1. Las células huésped transformantes se seleccionaron en CSM carente de metionina y leucina.

6.3 Ejemplo 3: Generación de células diploides modificadas genéticamente incapacitadas para la esporulación y el emparejamiento endógeno

Este ejemplo describe un método ejemplar para convertir en diploide una célula haploide de S. cerevisiae modificada genéticamente que está incapacitada para esporulación y emparejamiento endógeno.

La cepa huésped Y1979 diploide se generó por autoemparejamiento de la cepa Y1915. Para generar células de tipos de emparejamiento opuesto y para producir una cepa Y1915 transitoriamente capaz de emparejarse, la cepa se cotransformó con el plásmido pAM1124 (SEC ID Nº 149), que codifica la proteína HO y el marcador de resistencia a la noursetricina; y el plásmido pAM1758 (SEC ID Nº 150), que codifica STE5 y el marcador de resistencia G418. Las células huésped transformantes se seleccionaron en CSM que contenía G418 y noursetricina. Los transformantes positivos se colocaron en placas para colonias únicas en un medio no selectivo, y se identificaron las sensibles a G418 y las sensibles a noursetricina diploides por medio de selección utilizando PCR de colonia.

6.4 Ejemplo 4:

Confirmación de la incapacidad para la esporulación y el emparejamiento endógeno

Este ejemplo describe métodos ejemplares con los que se confirman la incapacidad para la esporulación y el emparejamiento endógeno de las células de S. cerevisiae modificadas genéticamente.

Para confirmar la incapacidad de la cepa Y1915 para emparejarse, las células Y1915 haploides (MAT! Kans URA3 STE5) o las células haploides Y1912 (MAT! Kans URA3 STE5) se combinaron en medio YEPD sólido con células haploides Y1792 (MATa KanR URA3 STE5). Los cultivos de emparejamiento se incubaron durante 16 horas a 30 ºC. Luego se pusieron en placas alícuotas idénticas de cada cultivo de emparejamiento en medio CSM sólido carente de uracilo y que contenía G418, y se incubaron los cultivos durante una semana a 30 ºC. Como se muestra en la Figura 9, el crecimiento de las colonias se observó solo en las placas que contenían una alícuota del cultivo de emparejamiento Y1792 x Y1912 pero no en las placas que contenían una alícuota del cultivo de emparejamiento Y1792 x Y1915.

Para confirmar la incapacidad de la cepa Y1979 para esporular, las células de la cepa Y1979 y las células de la cepa Y1198 se cultivaron durante 7 días en un medio de inducción a esporulación (medio carente de una fuente de carbono no fermentativa, por ejemplo, acetato potásico, que induce a las células de S. cerevisiae nativas a abandonar el ciclo mitótico celular y pasar a la meiosis y esporular). Los cultivos se dividieron entonces y se trataron durante 15 minutos con agua o dietil éter. Las suspensiones se homogenizaron por inversión, se resuspendieron en agua estéril, se diluyeron y se colocaron en placas de medio YEPD sólido, y se cultivaron durante 3 días. Como se muestra en la Figura 10, el 95 % de las células de la cepa Y1198 formaron tétradas de esporas bajo estas condiciones mientras que las células de la cepa Y1979 no lo hicieron.

6.5 Ejemplo 5: Confirmación de la incapacidad para diseminarse en la naturaleza de células incapacitadas para la esporulación y emparejamiento endógeno

Este ejemplo describe métodos ejemplares con los que se confirma la incapacidad de las células diploides de S. cerevisiae modificadas genéticamente incapaces para la esporulación y el emparejamiento endógeno para diseminarse en la naturaleza.

Se evaluó la supervivencia de Y1979 y su isolínea no transgénica, Y1198 (PE-2) en el suelo. Para esto, se llenaron matraces de 45 l con aproximadamente un 25 % de vermiculita y un 75 % de suelo de caña (un total de 40 l) y se plantaron con 1 Saccharum spp., planta de azúcar de caña cultivar RB 86-7515 (de aproximadamente 6 meses de edad). Cada tiesto se fertilizó con una mezcla de Nitrógeno/ Fósforo/ Potasio de 5-25-30, y se cultivaron las plantas durante 14 días en un invernadero de contención. A cada tiesto se añadieron 600 ml de suspensión celular de la cepa Y 1979 o la cepa Y 1198. La aplicación de las células de levadura es la equivalente a alcanzar una concentración de 107 células/g en la primera capa de 5 cm de suelo. Se recolectaron cinco muestras de 1,5 x 5 cm de centros de suelo en los siguientes puntos de tiempo: t = 0 (pre exposición), 0 (post exposición), 3, 7, 14, 28, 40, 60, y 90 días (el volumen total de suelo muestreado era de 44 ml, y el peso total de suelo muestreado era aproximadamente de 50 g). A partir de las muestras de compuesto, se separaron 10 gramos y se resuspendieron en 100 ml de agua destilada. Para cuantificar la supervivencia de la levadura, se colocaron en placas 100 ∀l de las extracciones acuosas directamente en medio YPED (25 ml/placa), pH 5,5 ajustado con ácido sulfúrico 6 N con la adición de 0,05 g/l de rosa de bengala (Sigma nº R6877) y que contenía 0,2 g/l de ampicilina (Sigma A0166). Las muestras se colocaron en placas por duplicado, en series de diluciones de 1-107, o el número de diluciones que se colocaba en las placas estaba basada en los recuentos de supervivientes obtenidas en las muestras previas para cada tratamiento. Inmediatamente después de la colocación en placas, se diseminó el líquido con una espátula Drigalski. Las placas se dejaron abiertas al flujo de aire durante 30 minutos para la evaporación total del líquido y luego se cerraron, invirtieron y se incubaron durante 48 horas a 30 ºC. El número de colonias por placa se leyó utilizando un contador de colonias (CP600 Plus, Phoenix), en diluciones contables, y el resultado se expresó en UFC/ placa. Los recuentos se consideraron solamente si el número total de colonias era entre 30 y 300 colonias. Como se muestra en la Figura 11 (cada punto de dato es una media de cinco repeticiones), las células Y 1979 eran claramente menos viables en el suelo que las células parentales no modificadas genéticamente capaces de esporulación y emparejamiento de la cepa Y 1198.

La presente invención se ha descrito en detalle por medio de la ilustración y los ejemplos con el fin de clarificar su comprensión, y se define por las reivindicaciones.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Ubersax, Jeffrey A. Amyris Biotechnologies, Inc.

<120> MÉTODO PARA GENERAR UN MICROBIO MODIFICADO GENÉTICAMENTE

<130> 11836-0045-228

<140> desconocido

<141> en la misma fecha

<150> 61/183.031

<151>

<160> 156

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 3083

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 1

<210> 2

<211> 360

<212> PRT

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<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 64

<210> 65

<211> 3194

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 65

<210> 66

<211> 397

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 66

<210> 67

<211> 3875

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 67

<210> 68

<211> 593

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 68

<210> 69

<211> 2727

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 69

<210> 70

<211> 218

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 70

<210> 71

<211> 3830

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 71

<210> 72

<211> 609

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 72

<210> 73

<211> 4754

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 73

<210> 74

<211> 917

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 74

<210> 75

<211> 3272

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 75

<210> 76

<211> 423

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 76

<210> 77

<211> 2333

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 77

5 <210> 78

<211> 110

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

10 <400> 78

<210> 79

<211> 4067

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 79

<210> 80

<211> 688

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 80

<210> 81

<211> 3548

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 81

<210> 82

<211> 515

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 82

<210> 83

<211> 4154

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 83

<210> 84

<211> 717

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 84

<210> 85

<211> 3083

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 85

10 <210> 86

<211> 360

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

15 <400> 86

<210> 87

<211> 3938

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 87

<210> 88

<211> 645

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 88

<210> 89

<211> 3884

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 89

<210> 90

<211> 627

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 90

<210> 91

<211> 3197

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 91

<210> 92

<211> 398

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 92

<210> 93

<211> 3194

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 93

<210> 94

<211> 397

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 94

<210> 95

<211> 3875

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 95

<210> 96

<211> 593

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 96

<210> 97

<211> 2727

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 97

<210> 98

<211> 218

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 98

<210> 99

<211> 3830

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 99

<210> 100

<211> 609

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 100

<210> 101

<211> 4754

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 101

<210> 102

<211> 917

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 102

<210> 103

<211> 3272

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 103

<210> 104

<211> 423

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 104

<210> 105

<211> 2333

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 105

<210> 106 5 <211> 110

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 106 10

<210> 107

<211> 4067

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 107

<210> 108

<211> 688

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 108

<210> 109

<211> 3548

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 109

<210> 110

<211> 515

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 110

<210> 111

<211> 4154

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 111

<210> 112

<211> 717

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 112

<210> 113

<211> 3083

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 113

<210> 114

<211> 360

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 114

<210> 115

<211> 3938

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 115

<210> 116

<211> 645

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 116

<210> 117

<211> 3884

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 117

<210> 118

<211> 627

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 118

<210> 119

<211> 3197

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 119

<210> 120

<211> 398

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 120

<210> 121

<211> 3194

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 121

<210> 122

<211> 397

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 122

<210> 123

<211> 3875

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 123

<210> 124

<211> 593

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 124

<210> 125

<211> 2727

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 125

<210> 126

<211> 218

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 126

<210> 127

<211> 3830

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 127

<210> 128

<211> 609

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 128

<210> 129

<211> 4754

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 129

<210> 130

<211> 917

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 130

<210> 131

<211> 3272

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 131

<210> 132

<211> 423

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 132

<210> 133

<211> 2333

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 133

<210> 134

<211> 110

<212> PRT 10 <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 134

<210> 135

<211> 4067

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 135

<210> 136

<211> 688

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 136

<210> 137

<211> 3548

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 137

<210> 138

<211> 515

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 138

<210> 139

<211> 4154

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 139

<210> 140

<211> 717

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 140

<210> 141

<211> 11077 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la construcción de alteración fase I 10

<400> 141

<210> 142

<211> 9664 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la construcción de alteración fase II 10

<400> 142

<210> 143

<211> 8640 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la construcción de alteración fase III 10

<400> 143

<210> 144

<211> 6344 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la construcción de reciclado del marcador Fase I 10

<400> 144

<210> 145

<211> 6184 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la construcción de reciclado del marcador fase II 10

<400> 145

<210> 146

<211> 6042

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la construcción de reciclado del marcador fase III

<400> 146 10

<210> 147

<211> 5213 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la construcción de alteración de STE5 10

<400> 147

<210> 148

<211> 5417 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la construcción de alteración de IME1 10

<400> 148

<210> 149

<211> 9492 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos del plásmido pAM1124 10

<400> 149

<210> 150

<211> 8845 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos del plásmido pAM1758 10

<400> 150

<210> 151

<211> 1761

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 151

<210> 152

<211> 586

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 152

<210> 153

<211> 8987 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos del plásmido pAM404 10

<400> 153

<210> 154

<211> 746 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de la construcción de anulación URA3 10

<400> 154

15 <210> 155

<211> 4961

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

20 <400> 155

<210> 156

<211> 4856

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 156

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula de levadura diploide modificada genéticamente que comprende:

(a)

una alteración funcional en al menos un gen de esporulación

(b)

una alteración funcional en al menos un gen de respuesta a feromonas, en donde el al menos un gen de respuesta a feromonas es diferente del al menos un gen de esporulación; y

(c)

una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica una proteína de interés;

en donde dicha célula de levadura diploide modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación, incapacitada para el emparejamiento endógeno y es homocigota excepto en su alelo de tipo de emparejamiento.
2.

La célula de levadura diploide modificada genéticamente de la reivindicación 1 que es heterotálica (ho).
3.

Una célula de levadura haploide heterotálica (ho) modificada genéticamente que comprende:

(a)

una alteración funcional en al menos un gen de esporulación

(b)

una alteración funcional en al menos un gen de respuesta a feromonas, en donde el al menos un gen de respuesta a feromonas es diferente del al menos un gen de esporulación; y

(c)

una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica una proteína de interés;

en donde dicha célula de levadura haploide heterotálica (ho) modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación e incapacitada para el emparejamiento endógeno.
4.

La célula de levadura haploide modificada genéticamente de la reivindicación 3, que comprende además un plásmido recombinante que codifica una proteína de homotalismo (HO) funcional.
5.

La célula de levadura haploide modificada genéticamente de la reivindicación 4, que comprende además un plásmido recombinante que codifica una copia funcional del al menos un gen de respuesta a feromonas que está alterado funcionalmente en dicha célula de levadura haploide modificada genéticamente.
6.

La célula de levadura modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 que es una célula de Saccharomyces cerevisiae.
7.

La célula de levadura modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dicho al menos un gen de esporulación se selecciona del grupo que consiste en IME1, IME2, NDT80, SPO11, SPO20, AMA1, HOP2 y SP021.
8.

La célula de levadura modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dicho al menos un gen de respuesta a feromonas se selecciona del grupo que consiste en STE5, STE4, STE18, STE12, STE7 y STE11.
9.

La célula de levadura modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que comprende una alteración funcional del gen IME1 y del gen STE5.
10.

Un método para generar una célula de levadura diploide modificada genéticamente que está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno, comprendiendo el método:

(a)

transformar cada primera y segunda células de levadura haploides modificadas genéticamente con al menos un plásmido que codifica una proteína capaz de complementar una incapacidad de emparejamiento endógeno de dichas primera y segunda célulass de levadura haploides modificadas genéticamente, en donde dicha primera célula de levadura haploide modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno y comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica una proteína de interés, y en donde dicha segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno, es del tipo de emparejamiento opuesto al de la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente y comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica dicha proteína de interés;

(b)

emparejar la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente con la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente, formando de esta manera una célula de levadura diploide modificada genéticamente; y

(c)

eliminar el uno o más plásmidos de la célula de levadura diploide modificada genéticamente,

en donde la célula de levadura diploide modificada genéticamente resultante está incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno, es homocigota excepto para su alelo de tipo de emparejamiento y comprende dos copias de una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada cromosómicamente que codifica dicha proteína de interés.

en donde dicha primera célula de levadura haploide modificada genéticamente y la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente están incapacitadas para el emparejamiento endógeno debido a una alteración funcional en al menos un gen de respuesta a feromonas, e incapacitadas para la esporulación debido a una alteración funcional en al menos un gen de esporulación, en donde el al menos un gen de respuesta a feromonas es diferente del al menos un gen de esporulación.
11.

El método de la reivindicación 10, en el que la etapa (a) comprende la transformación de cada primera y segunda células de levadura haploides modificadas genéticamente con al menos un plásmido que codifica una copia funcional del al menos un gen de respuesta a feromonas que está alterado funcionalmente en dichas primera y segunda células de levadura haploides modificadas genéticamente.
12.

El método de las reivindicaciones 10 u 11, en el que el gen de respuesta a feromonas se selecciona del grupo que consiste en STE5, STE4, STE18, STE12, STE7 y STE11.
13.

El método de la reivindicación 10 u 11, en el que el gen de esporulación se selecciona de entre el grupo que consiste en IME1, IME2, NDT80, SPO11, SPO20, AMA1, HOP2 y SP021.
14.

El método de las reivindicaciones 10 u 11, en el que la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente se obtiene induciendo un cambio en el tipo de emparejamiento en una población de la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente.
15.

El método de la reivindicación 14, en el que la población de la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente es heterotálica (ho) y se induce para cambiar el tipo de emparejamiento transformando la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente con un plásmido recombinante que codifica una proteína de homotalismo (HO) funcional, en donde la expresión de proteína HO es capaz de inducir un cambio en el tipo de emparejamiento de dicha primera célula de levadura haploide modificada genéticamente.
16.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que la primera célula de levadura haploide modificada genéticamente y la segunda célula de levadura haploide modificada genéticamente están incapacitadas para el emparejamiento endógeno debido a una alteración funcional del gen STE5, y están incapacitadas para la esporulación debido a una alteración funcional del gen IME1.
17.

El método de la reivindicación 16, en el que la célula de levadura diploide modificada genéticamente es una célula de Saccharomyces cerevisiae
18.

Una célula de levadura diploide incapacitada para la esporulación y el emparejamiento endógeno que es homocigota excepto para su alelo de tipo de emparejamiento, generada por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 10-17.
19.

Una célula de levadura diploide MAT!/a ste5/ste5 ime1/ime1 que es homocigota excepto en su alelo de tipo de emparejamiento.

Figura 3