ES2257125B1 - Metodo para mejorar la viabilidad y la capacidad fermentativa de levaduras de panaderia en condiciones de estres hiperosmotico y estres por congelacion. - Google Patents
Metodo para mejorar la viabilidad y la capacidad fermentativa de levaduras de panaderia en condiciones de estres hiperosmotico y estres por congelacion. Download PDFInfo
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Abstract
Método para mejorar la viabilidad y la capacidad fermentativa de levaduras de panadería en condiciones de estrés hiperosmótico y estrés por congelación. La presente invención se refiere a un método para mejorar la viabilidad y la capacidad fermentativa de levaduras de panadería en condiciones de estrés hiperosmótico y estrés por congelación, mediante la transformación genética de las levaduras con una secuencia de nucleótidos que permite la expresión de una proteína con actividad Crz1.
Description
Método para mejorar la viabilidad y la capacidad
fermentativa de levaduras de panadería en condiciones de estrés
hiperosmótico y estrés por congelación.
La invención se centra en el campo de la
biotecnología y en particular en el de levaduras de panadería
utilizadas en procesos de fermentación en los que se requiere que
las células de este organismo exhiban una alta tolerancia a estrés
hiperosmótico (alta concentración de azúcares) y estrés por
congelación, condiciones que habitualmente dan lugar a una pérdida
de viabilidad y capacidad fermentativa. En concreto, la invención
hace referencia a un proceso para alterar la respuesta a estrés en
células de levadura, mediante la sobreexpresión del gen CRZ1 de
S. cerevisiae o de genes funcionalmente homólogos a éste, y a
un fragmento de nucleótidos que codifica una proteína con dedos de
zinc del tipo Cys2His2, requerida para la activación "vía
calcineurina" de genes de respuesta a estrés hiperosmótico.
La habilidad de las levaduras industriales de
panadería para hacer frente a condiciones ambientales adversas es
clave en el proceso de panificación. En consecuencia, la mejora de
la tolerancia a estrés de estas levaduras ha centrado la atención de
investigadores e industriales durante los últimos años. Este
interés se ha acrecentado por la enorme expansión del mercado de
productos de bollería, en particular, congelada, que ha pasado a
representar más del 10% de las ventas de productos de panadería en
Europa y un 25-30% en todo el mundo, previéndose un
fuerte crecimiento en los próximos años.
Las levaduras comerciales de panadería, son
cepas de Saccharomyces cerevisiae que han sido seleccionadas
durante años por su habilidad para producir, de forma rápida y
constante, el CO_{2} requerido en la fermentación de masas de pan
común. En masas de productos de bollería, su capacidad fermentativa
se ve, sin embargo, muy disminuida. Estos productos contienen hasta
un 30% de azúcar (sacarosa) o jarabe invertido (mezcla de glucosa y
fructosa), como agente edulcorante, además de leche en polvo, grasa
y sal, que reducen la actividad de agua y aumentan, por tanto, la
presión osmótica. En estas condiciones, las células de levadura se
deshidratan rápidamente, y reducen su capacidad de crecimiento y de
producción de gas [Attfield PV (1997) Stress tolerance: the key to
effective strains of industrial baker's yeast. Nature Biotechnol
15:1351-1357; Randez-Gil F, Sanz P,
Prieto JA (1999) Engineering baker's yeast: room for improvement.
Trends Biotechnol 17:237-244]. Como consecuencia, el
tiempo de fermentación se incrementa y el volumen de estos
productos se reduce.
Esta situación empeora en masas congeladas, ya
que la congelación de la masa es también una fuente de estrés
iónico y osmótico para la levadura. A temperaturas por debajo de
0ºC, el efecto deletéreo sobre las células depende de la velocidad
de congelación. A velocidades lentas, como las que se dan
habitualmente en la congelación de una masa panaria, se observa una
contracción celular y la formación de hielo extracelular [Kaul SC,
Obuchi K, Iwahashi H, Komatsu Y (1992) Cryoprotection provided by
heat shock treatment in Saccharomyces cerevisiae. Cell Mol
Biol 38:135-143], con el consiguiente estrés
osmótico [Wolfe J, Bryant G (1999) Freezing, crying,
and/orvitrification of
membrane-solute-water systems.
Criobiology 39:103-129]. A mayor velocidad de
congelación, ésta produce además, daños a nivel estructural y
desnaturalización de proteínas y macromoleculas [Myers DK, Attfield
PV (1999) Intracellular concentration of exogenous glycerol in
Saccharomyces cerevisiae provides for improved leavening of
frozen sweet doughs. Food Microbiol 16:45-51]. No es
de extrañar por tanto, que la tolerancia a la congelación en S.
cerevisiae dependa de diferentes factores, y entre ellos, de su
respuesta a estrés osmótico.
Por otra parte, la adición de sal (NaCl,
alrededor del 2%, base harina) en masas dulces puede generar
efectos adicionales, a los puramente osmóticos. En efecto, la
acumulación de Na^{+} y Cl^{-} en el citosol puede tener efectos
tóxicos para la mayoría de sistemas enzimáticos [Serrano R (1996)
Salt tolerance in plants and microorganisms: toxicity targets and
defense responses. Int Rev Cytol 165:1-52]. Estos
efectos son observados a concentraciones de Na^{+} y Cl^{-} en
el intervalo de 50-100 mM, lo cual es mucho más
bajo que los niveles requeridos para un efecto osmótico [Serrano R,
Márquez JA, Ríos G (1997) Crucial factors in salt stress tolerance.
In: Hohmann S, Mager WH (eds) Yeast Stress Responses.
Springer-Verlag, Heidelberg, pp
147-169]. La toxicidad de estos iones, y en
particular la del Na^{+}, se ha asociado a su capacidad para
inhibir rutas metabólicas específicas, entre ellas la asimilación de
sulfato [Murguia JR, Belles JM, Serrano R (1995) A
salt-sensitive
3'(2'),5'-bisphosphate nucleotidase involved in
sulfate activation. Science 267:232-234; Murguia JR,
Belles JM, Serrano R (1996) The yeast HAL2 nucleotidase is
an in vivo target of salt toxicity. J Biol Chem
271:29029-29033]. Se ha visto, que la inhibición por
Na^{+} de ciertas enzimas de esta ruta puede revertirse por
adición de potasio (K^{+}), sugiriendo que la relación
Na^{+}/K^{+} es crucial para la actividad enzimática, y no la
concentración absoluta de Na^{+}. Esto explicaria porque la
levadura en condiciones de estrés por Na^{+}, aumenta la expresión
de genes que codifican proteínas responsables del eflujo de
Na^{+} y Li^{+}, simultáneamente a aquellas que permiten la
retención intracelular de K^{+} [Posas F, Chambers JR, Heyman JA,
Hoeffler JP, de Nadal E, Ariño J (2000) The transcriptional response
of yeast to saline stress. J Biol Chem
275:17249-17255; Rep M, Krantz M, Thevelein JM,
Hohmann S (2000) The transcriptional response of Saccharomyces
cerevisiae to osmotic shock. Hotlp and Msn2p/Msn4p are required
for the induction of subsets of high osmolarity glycerol
pathway-dependent genes. J Biol Chem
275:8290-8300; Yale J, Bohnert HJ (2001) Transcript
expression in Saccharomyces cerevisiae at high salinity. J
Biol Chem 276:15996-16007].
Así pues, aquellas levaduras destinadas a la
producción de masas dulces y masas dulces congeladas deberían
exhibir una elevada tolerancia a estrés osmótico y a la toxicidad
del Na^{+}. Sin embargo, ninguna cepa comercial reúne estas
propiedades tecnológicas, por lo que es común en la elaboración de
estos productos, adicionar un exceso de levadura
(2-8%, base harina) para compensar la perdida de
capacidad fermentativa. No obstante, esta practica afecta
negativamente a la calidad organoléptica de los productos y
encarece su precio. Alternativamente, es también posible utilizar
agentes leudantes, como p.e. bicarbonato sódico, pero estos
productos modifican el sabor del producto. Además, existe un
rechazo generalizado por parte del consumidor al uso de aditivos
químicos. En consonancia, seria necesario un esfuerzo para dotar a
la levadura de la capacidad para responder y adaptarse a las
condiciones restrictivas encontradas en masas dulces y masas dulces
congeladas. En este sentido, existen datos suficientes como para
afirmar que las células de levadura ponen en marcha mecanismos de
respuesta y rediseñan su maquinaria metabólica para hacer frente y
superar condiciones medioambientales adversas [Gasch AP, Spellman
PT, Kao CM, Carmel-Harel O, Eisen MB, Storz G,
Botstein D, Brown PO (2000) Genomic expression programs in the
response of yeast cells to environmental changes. Mol Biol Cell
11:4241-4257; Causton HC, Ren B, Koh SS, Harbison
CT, Kanin E, Jennings EG, Lee TI, True HL, Lander ES, Young RA
(2001) Remodeling of yeast genome expression in response to
environmental changes. Mol Biol Cell 12:323-337;
Rodríguez-Vargas S, Estruch F,
Randez-Gil F (2002) Gene expression analysis of cold
and freeze stress in baker's yeast. Appl Environ Microbiol
68:3024-3030].
Estudios básicos en levadura han permitido
determinar los mecanismos de eflujo iónico y han identificado genes
clave en el mantenimiento de una alta relación K^{+}/Na^{+}
[Serrano R, Mulet JM, Rios G, Marquez JA, de LIF, Leube MP,
Mendizabal I, Pascual AA, Proft M, Ros R, Montesinos C (1999) A
glimpse of the mechanisms of ion homeostasis during salt stress. J
Exp Bot 50:1023-1036;
Rodriguez-Navarro A (2000) Potasium transport in
fungi and plants. Biochim Biophys Acta
1469:1-30].
Entre ellos, genes envueltos en la extrusión y
compartimentación vacuolar de iones Na^{+} son fundamentales.
Recientemente, se han identificado y caracterizado diversas proteína
kinasas y rutas de señalización implicadas en la respuesta a estrés
osmótico y iónico [Serrano R, Rodriguez-Navarro A
(2001) Ion homeostasis during salt stress in plants. Curr Opin Cell
Biol 13:399-404]. Entre ellas, la
proteína-fosfatasa calcineurina esta implicada en
diferentes procesos de señalización celular [Rusnak F, Mertz P
(2000) Calcineurin: form and function. Physiol Rev
80:1483-1521; Sherman F, Fink GR, Hicks JB (1986)
Methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, N.Y.; Sugiura R, Sio SO, Shuntoh H, Kuno T (2001)
Molecular genetic analysis of the calcineurin signalling pathways.
Cell Mol Life Sci 58:278-288]. En S.
cerevisiae, calcineurina es esencial en su tolerancia a sal, ya
que mutantes que carecen de la subunidad reguladora, codificada por
CNB1, son sensibles a Na^{+} y Li^{+} [Nakamura T, Liu Y,
Hirata D, Namba H, Harada S, Hirokawa T, Miyakawa T (1993) Protein
phosphatase type 2B (calcineurin)-mediated,
FK506-sensitive regulation of intracellular ions in
yeast is an important determinant for adaptation to high salt stress
conditions. EMBO J 12:4063-4071; Mendoza I, Rubio
F, Rodriguez-Navarro A, Pardo JM (1994) The protein
phosphatase calcineurin is essential for NaCl tolerance of
Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem
269:8792-8796]. Calcineurina activa la respuesta
transcripcional a estrés salino vía el factor transcripcional Crz1p
el cual es traslocado al núcleo después de su defosforilación por
calcineurina [Matheos DP, Kingsbury TJ, Ahsan US, Cunningham KW
(1997) Tcn1p/Crz1p, a calcineurin-dependent
transcription factor that differentially regulates gene expression
in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev
11:3445-3458; Stathopoulos AM, Cyert MS (1997)
Calcineurin acts through the CRZ1/TCN1-encoded transcription
factor to regulate gene expression in yeast. Genes Dev
11:3432-3444;
Stathopoulos-Gerontides A, Guo JJ, Cyert MS (1999)
Yeast calcineurin regulates nuclear localization of Crz1p
transcription factor through dephosphorylation. Genes Dev
13:798-803]. Crz1p se une especificamente a la
secuencia consenso CDRE (del Inglés
"Calcineurin-Dependent Response
Element"), localizada en una región de 24 pares de bases,
CAC
CAGTCGGTGGCTGTGCGCTTG, del promotor del gen FKS2 de S. cerevisiae [Stathopoulos AM, Cyert MS (1997) Calcineurin acts through the CRZ1/TCN1-encoded transcription factor to regulate gene expression in yeast. Genes Dev 11:3432-3444]. Recientemente, Mendizabal y col. [Mendizabal I, Pascual-Ahuir A, Serrano R, de Larrinoa IF (2001) promoter sequences regulated by the calcineurin-activated transcription factor Crz1 in the yeast ENA1 gene. Mol Genet Genomics 265:801-811] han propuesto que un fragmento de 9 pares de bases de la secuencia anterior, CGGTGGCTG, actúa como elemento central de unión de Crz1p, y han localizado variantes de esta secuencia en la región del promotor de varios genes regulados por calcineurina/Crz1p.
CAGTCGGTGGCTGTGCGCTTG, del promotor del gen FKS2 de S. cerevisiae [Stathopoulos AM, Cyert MS (1997) Calcineurin acts through the CRZ1/TCN1-encoded transcription factor to regulate gene expression in yeast. Genes Dev 11:3432-3444]. Recientemente, Mendizabal y col. [Mendizabal I, Pascual-Ahuir A, Serrano R, de Larrinoa IF (2001) promoter sequences regulated by the calcineurin-activated transcription factor Crz1 in the yeast ENA1 gene. Mol Genet Genomics 265:801-811] han propuesto que un fragmento de 9 pares de bases de la secuencia anterior, CGGTGGCTG, actúa como elemento central de unión de Crz1p, y han localizado variantes de esta secuencia en la región del promotor de varios genes regulados por calcineurina/Crz1p.
El elemento de respuesta dependiente de
calcineurina (CDRE), la secuencia central de unión a Crz1p de S.
cerevisiae y variantes de dicha secuencia encontradas en genes
diana de la ruta calcineurina/Crz1p se describen con profusión en la
literatura [Stathopoulos AM, Cyert MS (1997) Calcineurin acts
through the CRZ1/TCN1-encoded transcription factor to
regulate gene expression in yeast. Genes Dev
11:3432-3444; Mendizabal I,
Pascual-Ahuir A, Serrano R, de Larrinoa IF (2001)
promoter sequences regulated by the
calcineurin-activated transcription factor Crz1 in
the yeast ENA1 gene. Mol Genet Genomics
265:801-811].
La activación de la ruta calcineurina/Crz1p
induce la expression de ENA1 [Marquez JA, Serrano R (1996)
Multiple transduction pathways regulate the
sodium-extrusion gene PMR2/ENA1 during salt
stress in yeast. FEBS Lett 382:89-92], PMC1 y
PMR1, cuyos productos génicos confieren tolerancia a
Ca^{2+}, Mn^{2+} y Na^{+}, respectivamente [Matheos DP,
Kingsbury TJ, Ahsan US, Cunningham KW (1997) Tcn1p/Crz1p, a
calcineurin-dependent transcription factor that
differentially regulates gene expression in Saccharomyces
cerevisiae. Genes Dev 11:3445-3458; Stathopoulos
AM, Cyert MS (1997) Calcineurin acts through the
CRZ1/TCN1-encoded transcription factor to regulate gene
expression in yeast. Genes Dev 11:3432-3444].
Calcineurin acts through the CRZ1/TCN1-encoded transcription
factor to regulate gene expression in yeast. Genes Dev
11:3432-3444; Mendizabal I, Rios G, Mulet JM,
Serrano R, de Larrinoa IF (1998) Yeast putative transcription
factors involved in salt tolerance. FEBS Lett
425:323-328].
Además, el análisis global de la expresión
génica en S. cerevisiae, indica que la expresión de un gran
número de genes inducidos por estrés salino depende de la ruta
calcineurina/Crz1p [Yoshimoto H, Saltsman K, Gasch AP, Li HX, Ogawa
N, Botstein D, Brown PO, Cyert MS (2002)
Genome-wide analysis of gene expression regulated by
the calcineurin/Crzlp signaling pathway in Saccharomyces
cerevisiae. J Biol Chem 277:31079-31088]. No se
conoce, sin embargo, el efecto de la sobreexpresión de CRZ1
en la tolerancia a la congelación de S. cerevisiae, ni si la
presencia en células de este organismo de una cantidad por encima
de la habitual de Crz1p, puede alterar la capacidad fermentativa de
cepas de levadura de laboratorio o de levaduras industriales de
panadería en medios hiperosmóticos con un alto contenido en
azúcar.
La habilidad para transformar S.
cerevisiae mediante la utilización de la tecnología del ADN
recombinante, ha abierto la posibilidad para manipular un simple gen
o una ruta metabólica sin alterar otros genes de importancia para
un fin tecnológico en particular [Randez-Gil F,
Sanz P, Prieto JA (1999) Engineering baker's yeast: room for
improvement. Trends Biotechnol 17:237-244; Dequin S
(2001) The potential of genetic engineering for improving brewing,
wine-making and baking yeasts. Appl Microbiol
Biotechnol 56:577-588]. Es también posible, activar
o inactivar la expresión de un grupo de genes en una etapa
tecnológica, sin modificar su comportamiento durante su producción
a nivel industrial. Esta tecnología puede tener especialmente éxito
cuando se altera el nivel de expresión de un factor
transcripcional, pues estos elementos reguladores desencadenan una
cascada de alteraciones que pueden afectar dramáticamente la
respuesta a diferentes condiciones ambientales. Así, células
sobreexpresando factores transcripcionales de respuesta estrés deben
producir en mayor cantidad, proteínas implicadas en tolerancia y/o
adaptación a estas condiciones restrictivas. Esta alteración debería
aumentar la resistencia de estas células, permitiendo mejorar su
viabilidad y capacidad de crecimiento y desarrollo. De acuerdo a
esto, la identificación de proteínas, y en particular de factores
de transcripción, cuya expresión en bajo o alto número de copias,
sea capaz de aumentar la viabilidad y capacidad fermentativa de
levaduras de panadería tiene una gran importancia científica y
tecnológica.
Por otra parte, una estrategia valida para
alterar la capacidad de respuesta de un organismo, es la de
utilizar genes heterólogos procedentes de otra especie que muestre
una especial resistencia a las condiciones en las que se desea
cultivar o utilizar el organismo hospedador. La levadura
Torulaspora delbrueckii es aislada con frecuencia de bebidas
alcoholicas, jugos de frutas y alimentos conteniendo un alto
contenido en azúcar [Esteve-Zarzoso B, Gostincar A,
Bobet R, Uruburu F, Querol A (2001) Selection and molecular
characterization of wine yeasts isolated from the "El Pendes"
area. Food Microbiol 17:553-562]. T.
delbrueckii es también una de las especies de levadura más
abundantes en masas espontáneas de maíz y centeno [Hahn
Y-S, Kawai H (1990) Isolation and characterization
of freeze-tolerant yeasts from nature available for
the frozen-dough method. Agric Biol Chem
54:829-831; Almeida MJ, Pais CS (1996a)
Characterization of the yeast population from traditional corn and
rye bread doughs. Lett Appl Microbiol 23:154-158] y
ha sido caracterizada como tolerante a la congelación [Almeida MJ,
Pais CS (1996b) Leavening ability and freeze tolerance of yeasts
isolated from traditional corn and rye bread doughs. Appl Environ
Microbiol 62:4401-4404]. Este organismo, muestra
también una especial tolerancia a condiciones de estrés de interés
tecnológico. Así, células de T. delbrueckii exhiben una
especial resistencia a la toxicidad del Na^{+} y una elevada
capacidad fermentativa en masas dulces de elevado contenido en
azúcar [Hernandez-Lopez MJ, Prieto JA,
Randez-Gil F (2003) Osmotolerance and leavening
ability in sweet and frozen sweet dough. Comparative analysis
between Torulaspora delbrueckii and Saccharomyces
cerevisiae baker's yeast strains. Antonie van Leeuwenhoek
84:125-134). Estas características, hacen de esta
levadura un sistema modelo para conocer y explorar los mecanismos
que determinan la resistencia a estrés en levadura y una potencial
fuente para el aislamiento de genes que confieran resistencia a
diferentes condiciones de estrés.
Torulaspora delbrueckii IGC5321, muestra
un claro fenotipo de osmotolerancia, así como de tolerancia a la
toxicidad del Na^{+}. [Hernández-López MJ, Prieto
JA, Randez-Gil F (2003) Osmotolerance and leavening
ability in sweet and frozen sweet dough. Comparative analysis
between Torulaspora delbrueckii and Saccharomyces
cerevisiae baker's yeast strains. Antonie van Leeuwenhoek
84:125-134]. Utilizando una librería genómica de
este microorganismo, se ha aislado un clon capaz de mejorar el
crecimiento de cepas de laboratorio y cepas comerciales de panadería
de S. cerevisiae, en condiciones de estrés salino. El gen
heterólogo contenido en dicho clon, codifica una proteína con
cierta homología (37%) con Crz1p de S. cerevisiae
(ScCRZ1). La presente invención revela la funcionalidad de
esta secuencia y de la proteína que codifica, la cual complementa
el fenotipo de sensibilidad a Na^{+}, Li^{+} y Mn^{2+} de
mutantes crz1 y cnb1 de S. cerevisiae. Además,
esta proteína recombinante es capaz de activar la transcripción de
una fusión génica 4x-CDRE::lacZ. Todo esto
indica, que la proteína funciona como un activador transcripcional
de respuesta a calcineurina, y que el gen aislado de T.
delbrueckii es el homologo en esta levadura del gen CRZ1
de S. cerevisiae (ScCRZ1), por lo que se le ha
denominado TdCRZ1.
La expresión del gen TdCRZ1 no sólo
mejora la resistencia a la presencia de NaCl en el medio, sino
también su tolerancia a la congelación. Además, transformantes de
cepas de panadería conteniendo el gen TdCRZ1 en alto número
de copias, muestran una mayor capacidad fermentativa en masas
dulces (>20% de sacarosa) y en masas dulces congeladas.
Como muestra la presente invención, cepas de
levadura de panadería con mayor viabilidad y capacidad fermentativa
en condiciones de estrés hiperosmótico (alta concentración de
azúcares) y estrés por congelación, pueden ser también logradas por
incremento del número de copias del gen CRZ1/TCN1
(YNL027w) de S. cerevisiae (ScCRZ1).
En resumen, la presente invención se basa en que
los inventores han observado que la transformación genética de
levaduras de panadería mediante la introducción en las mismas de
una secuencia de nucleótidos que permite la expresión de una
proteína con actividad Crz1 les confiere una mayor viabilidad y
capacidad fermentativa. Estas últimas capacidades que adquieren
dichas levaduras de panadería se basan en que dicha proteína con
actividad Crz1 incrementa la resistencia de las levaduras a la
congelación, al estrés hiperosmótico y al estrés iónico.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "levaduras de panadería" se refiere a levaduras de
Saccharomyces cerevisiae y Torulaspora
delbrueckii.
El término "proteína con actividad Crz1"
tal como se utiliza en la presente invención se refiere a una
proteína o fragmento de proteína de levaduras con una homología en
la secuencia de aminoácidos de al menos el 30% con respecto a la
proteína o fragmento equivalente de Crz1 de S. cerevisiae
(ScCrz1p), con dedos de zinc del tipo Cys2His2 y capaz de activar
"in vivo" la transcripción de una fusión génica
4x-CDRE::lacZ.
Así, un objeto de la presente invención lo
constituye un método de obtención de levaduras de panadería con
alta capacidad de resistencia a la congelación, al estrés
hiperosmótico (alto contenido en azúcar) y al estrés iónico, en
adelante método obtención de levaduras de panadería de la presente
invención, basado en la transformación genética de dichas levaduras
mediante una secuencia de nucleótidos que permita la expresión de
una proteína con actividad Crz1.
Un objeto particular de la invención lo
constituye el método de obtención de levaduras de panadería de la
presente invención en el que la secuencia de nucleótidos que permite
la expresión de una proteína con actividad Crz1 es una secuencia
que comprende la secuencia de nucleótidos codificante de la
proteína Crz1p de S.cerevisiae (ScCrz1p) conjuntamente con
otras secuencias de nucleótidos que permiten la regulación de dicha
expresión. Una realización concreta del método de obtención de
levaduras de la presente invención es aquel método en el que de
dicha secuencia de nucleótidos codificante de la proteína ScCrz1p
es el plásmido YEpScCRZ1 que permite la expresión de un alto número
de copias del gen ScCRZ1.
Un objeto particular de la invención lo
constituye el método de obtención de levaduras de panadería de la
presente invención en el que la secuencia de nucleótidos que permite
la expresión de una proteína con actividad Crz1 es una secuencia
que comprende la secuencia de nucleótidos codificante de la
proteína Crz1p de Torulaspora delbrueckii (TdCrz1p)
conjuntamente con otras secuencias de nucleótidos que permiten la
regulación de dicha expresión. Una realización concreta del método
de obtención de levaduras de la presente invención es aquel en el
que de dicha secuencia de nucleótidos codificante de la proteína
TdCrz1p consiste o comprende alguna de las secuencias
pertenecientes al siguiente grupo:
- i)
- secuencia de nucleótidos codificante de la proteína TdCrz1p (SEQ ID NO 2),
- ii)
- construcción genética identificada en la SEQ ID NO 1, y
- iii)
- un vector de expresión que comprende la secuencia i) ó ii), y en concreto el plásmido YEpTdCRZ1, sin que este ejemplo de realización límite el alcance de la presente invención.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye una secuencia de nucleótidos codificante de la proteína
TdCrz1p que consiste o comprende alguna de las secuencias
pertenecientes al siguiente grupo:
- i)
- secuencia de nucleótidos codificante de la proteína TdCrz1p (SEQ ID NO 2),
- ii)
- construcción genética descrita en la SEQ ID NO 1, y
- iii)
- un vector de expresión que comprende la secuencia i) ó ii), y en concreto el plásmido YEpTdCRZ1, sin que este ejemplo de realización limite el alcance de la presente invención;
y, que permiten la realización del
método de obtención de levaduras de panadería de la presente
invención.
Una secuencia de nucleótidos codificante de una
proteína con actividad Crz1 puede encontrarse en forma parecida en
otras especies de levaduras distintas que las aquí descritas o que
formen parte del estado de la técnica actual, donde puede estar de
forma natural. Estas secuencia de nucleótidos codificante de una
proteína con actividad Crz1 pueden ser aisladas, mediante técnicas
convencionales, a partir del ADN de cualquier levadura, mediante el
empleo de sondas o de oligonucleótidos, preparados gracias a la
información y a la secuencia de nucleótidos proporcionada en la
presente invención. Además, forma parte de la presente invención
una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de nucleótidos
codificante de la proteína TdCrz1p (SEQ ID NO 2). En el sentido
utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende
incluir a cualquier secuencia de nucleótidos que pueda ser aislada
o construida en base a la secuencia de nucleótidos codificante de
la proteína TdCrz1p, descrita en la presente invención (ver SEQ ID
NO 1), por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de
nucleótidos conservativas o no conservativas, incluyendo la
inserción de uno o más nucleótidos, la adición de uno o más
nucleótidos en cualquiera de los extremos de la molécula o la
deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el
interior de la secuencia. En general, una secuencia de nucleótidos
análoga es sustancialmente homóloga a la secuencia de nucleótidos
identificada como la codificante de la proteína TdCrz1p (ver SEQ ID
NO 1). En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión
"sustancialmente homóloga" significa que las secuencias de
nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de
nucleótidos, de, al menos, un 30%, preferentemente de, al menos un
60%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.
La secuencia de nucleótidos codificante de la
proteína Crz1p, ya sea ScCrz1p ó TdCrz1p, indicadas anteriormente
en i) y ii) puede ser utilizada, en general, en la generación de un
vector de expresión iii), que permite la expresión de estas
proteínas en una amplia gama de células huésped. En general, el
vector de expresión de la presente invención comprende, al menos,
la secuencia de nucleótidos codificante de la proteína Crz1p (por
ejemplo TdCrz1p, SEQ ID NO 2) y, al menos, un promotor que dirige la
transcripción del gen de interés, al que está operativamente
enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas para la
transcripción del gen de interés y su regulación adecuada en tiempo
y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de
corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores
transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales
(silencers), etc. Ejemplos de vectores de expresión apropiados
pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y necesidades
de cada caso concreto entre plásmidos, o fragmentos de integración,
que pueden contener, además, un origen bacteriano o de levadura de
replicación para que pueda ser amplificado en bacterias o
levaduras, así como un marcador utilizable para seleccionar las
células transformadas diferente al gen o genes de interés. Por
tanto, la invención también se refiere a un vector que comprende
una secuencia de nucleótidos codificante de la proteína Crz1p. La
elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se
va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde
se introduce dicha secuencia de nucleótidos puede ser un plásmido
que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en
el genoma de dicha célula y se replica junto con el cromosoma de la
célula huésped. El vector de la invención puede ser obtenido por
métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia
[Kovesdi et al. 1997. Curr Opin Biotech
8:583-589 Transgenic Res. 10:83-103;
Coffin et al. 1998. Retroviruses, CSHLP; Robbins et
al. 1998. Trends Biotech. 16:35-40; Anderson.
1998. Nature 392:25-30; Schindelhauer. 1999.
BioEssays 21:76-83].
Así, el uso de las distintas secuencias de
nucleótidos de los puntos i) y ii) mencionados anteriormente en la
elaboración de un vector de expresión génica forma parte de la
presente invención. De igual forma, forma parte de la presente
invención el uso del vector de expresión mencionado anteriormente
en la transformación de levaduras de panadería para incrementar su
resistencia a la congelación, estrés hiperosmótico y estrés
iónico.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye la proteína TdCRZ1 descrita en la presente invención
(SEQ ID NO 2).
Otro objeto de la presente invención lo
constituye una levadura de panadería transformada genéticamente
mediante el método de la presente invención y en la que se expresa
de forma recombinante una proteína con actividad Crz1 y que
presentan un alta capacidad fermentativa con incremento de su
resistencia a la congelación, al estrés hiperosmótico y al estrés
iónico, en adelante levadura de panadería de la presente invención.
Un objeto particular de la presente invención lo constituye una
levadura de panadería, entre otras, S. cerevisiae, que
comprende
- i)
- una secuencia de nucleótidos capaz de expresar la proteína ScCrz1, y en concreto la levadura de panadería HS13(YEpScCRZ1) (Ejemplo 8), sin que este ejemplo de realización limite el alcance de la presente invención,
- ó
- ii)
- una secuencia de nucleótidos capaz de expresar la proteína TdCrz1, y en concreto la levadura de panadería HS13(YEpTdCRZ1) (Ejemplo 6 y 7), sin que este ejemplo de realización limite el alcance de la presente invención.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso de la levadura de la presente invención en la
elaboración de masa de panadería, dulce o de pan común, ya sea para
congelación o no.
Un cultivo de Escherichia coli DH10B,
portadora de un vector de expresión, identificado como YEpTdCRZ1,
ha sido depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo
(CECT), Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus
de Burjassot, 46100 Burjassot, Valencia, España, el 31 de Julio de
2003, correspondiéndole el número de depósito CECT 5837. Otro
cultivo de la bacteria Escherichia coli DH10B, portadora de
un vector de expresión identificado como YEpScCRZ1, ha sido
depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT),
Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus de
Burjassot, 46100 Burjassot, Valencia, España, el 31 de Julio de
2003, correspondiéndole el número de depósito CECT 5838.
A lo largo de la descripción detallada de la
presente invención, se hace referencia a las siguientes Figuras, en
las que,
La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos
del gen TdCRZ1 y su correspondiente secuencia de
aminoácidos, incluyendo parte de la secuencia del promotor y
terminador de dicho gen. Los codones de inicio y terminación, ATG y
TAG, respectivamente, se muestran en negrita. Los dos dominios
consensos caracteristicos de factores transcripcionales con dedos
de zinc del tipo Cys2His2 se muestran subrayados.
La Figura 2 muestra el mapa de restricción del
plásmido 14.A y esquematiza el proceso seguido para la construcción
a partir de éste, del plásmido YEpTdCRZ1.
La Figura 3 muestra el crecimiento de alícuotas
(3 \mul) de diluciones seriadas (10^{-1} a 10^{-5}) de una
suspensión de células de los transformantes YEplac 195 y YEpTdCRZ1
de las cepas de S. cerevisiae YPH499 (salvaje), DD12
(cnb1), ASY472 (crz1) y ASY475 (cnb1 crz1) en
placas de medio de cultivo conteniendo Mn_{2}Cl, LiCl o NaCl.
La Figura 4 muestra el crecimiento de alícuotas
(3 \mul) de diluciones seriadas (10^{-1} a 10^{-5}) de una
suspensión de células de los transformantes YEplac195 y YEpTdCRZ1 de
la cepa de levadura de panadería HS13 en placas de medio de cultivo
con o sin la adición de 1M de NaCl.
La Figura 5 es una gráfica en la que se muestra
las curvas de producción de CO_{2} de transformantes YEplac195
(símbolos llenos) y YEpTdCRZ1 (símbolos vacíos) de la cepa de
levadura de panadería HS13, durante la fermentación a 30ºC de masas
dulces conteniendo un 20 (circulo), 25 (triángulo) o 30% (cuadrado)
de sacarosa.
La Figura 6A muestra el crecimiento en placa de
alícuotas (3 \mul) de diluciones seriadas (10^{-1} a 10^{-5})
de una suspensión de células de los transformantes YEplac195 y
YEpTdCRZ1 de la cepa HS13 después de 12 días de almacenamiento a
-20ºC.
La Figura 6B es una gráfica en la que se
representa el logaritmo del número de viables frente al tiempo de
almacenamiento a -20ºC de suspensiones de células de los
transformantes YEplac195 (símbolos llenos) y YEpTdCRZ1 (símbolos
vacíos) de la cepa HS13.
La Figura 7 es una gráfica en la que se muestra
la perdida de capacidad fermentativa de masas elaboradas con los
transformantes YEplac195 (barras en negro) y YEpTdCRZ1 (barras en
gris) de la cepa HS13, antes (0), inmediatamente después de su
congelación (0') y durante su almacenamiento a -20ºC.
La Figura 8 es una gráfica en la que se muestra
las curvas de producción de CO_{2} de transformantes YEplac195
(símbolos llenos) y YEpTdCRZ1 (símbolos vacíos) de la cepa HS13,
durante la fermentación a 30ºC de masas dulces (30% de sacarosa)
después de su almacenamiento a -20ºC durante 12 días.
La Figura 9 es una gráfica en la que se
representa el logaritmo del número de viables frente al tiempo de
almacenamiento a -20ºC de suspensiones de células de los
transformantes YEplac195 (símbolos llenos) y YEpScCRZ1 (símbolos
vacíos) de la cepa HS13.
200 ml de un cultivo (DO_{600} = 2,5) de la
cepa de T. delbrueckii IGC5321 [Almeida MJ, Pais CS (1996b)
Leavening ability and freeze tolerance of yeasts isolated from
traditional corn and rye bread doughs. Appl Environ Microbiol
62:4401-4404] se centrifugan a 3.500 r.p.m. durante
5 min, recogiéndose el sedimento de células. Para la obtención de
protoplastos, el sedimento se resuspende en 20 ml de una solución de
pretratamiento (50 mM de Tris-HCl, 10 mM de DTT, a
pH = 8.0). La suspensión es incubada a 30ºC durante 30 min, tras lo
cual, se centrifuga a 3.000 rpm y 4ºC de temperatura, durante 5
min. El "pellet" o sedimento resultante se resuspende en 20 ml
de una solución en agua conteniendo sorbitol (1 M), tampón
Tris-HCl (50 mM, pH= 8.0) y Zymoliasa 20T (0,25
mg/ml) y se incuba a 30ºC durante 1 h. Se comprueba la presencia de
esferoplastos mediante observación al microscopio. Éstos, se recogen
por centrifugación a 3.000 r.p.m. (5 min) y se resuspenden, con la
pipeta, en 4 ml de solución de lisis (50 mM de tampón
Tris-HCl a pH = 8.0, 10 mM de EDTA, 0.15 M de
NaCl). A esta suspensión de células rotas se le añade SDS a una
concentración final del 1%, y se incuba a 65ºC durante 20 min. Se
añaden 1,5 ml de 5 M de acetato potásico, y los residuos celulares
se eliminan por centrifugación a 13.000 r.p.m. (10 min) a
temperatura ambiente. El sobrenadante se aspira con la ayuda de una
pipeta y los ácidos nucleicos se precipitan con etanol absoluto, en
una proporción de 1:2 (v:v). Tras centrifugar a 13.000 r.p.m. (15
min), el precipitado resultante se limpia de sales con etanol al
70% en agua (v:v), y se resuspende en tampón TE (10 mM de
Tris-HC1 a pH 8.0, 1 mM de EDTA) y se incuba 1 h a
37ºC con una solución acuosa de la enzima RNAsa (10 mg/ml) para
eliminar el RNA. El DNA resultante es extraído sucesivamente con un
volumen igual de fenol, fenol-cloroformo (1:19, v:v)
y cloroformo. Finalmente, el DNA es precipitado con etanol,
recogido por centrifugación y resuspendido en 0,5 ml de tampón
TE.
El DNA genómico de T. delbrueckii IGC5321
se digiere parcialmente con la enzima de restricción Sau3A.
A continuación, se separan los fragmentos resultantes en un
gradiente de sacarosa (10-30%, p:v) a 30.000 x g
durante 15 h,
seleccionándose las fracciones que contienen fragmentos de DNA entre 5 y 15 kilobases (kb) y se ligan en el vector lanzadera YEplac181 [Gietz RD, Sugino A (1988) New yeast-Escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites. Gene 74:527-534] digerido previamente con BamHI y defosforilado. La mezcla de plasmidos (genoteca) se utiliza para transformar mediante electroporación, células de la cepa de Escherichia coli DH10B. Los transformantes se seleccionan en placas de medio Luria Bertani, LB (1% de peptona, 0,5% de extracto de levadura, 0,5% de NaCl) suplementado con ampicilina (50 mg/l). Finalmente el DNA amplificado se recupera mediante extracción.
seleccionándose las fracciones que contienen fragmentos de DNA entre 5 y 15 kilobases (kb) y se ligan en el vector lanzadera YEplac181 [Gietz RD, Sugino A (1988) New yeast-Escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites. Gene 74:527-534] digerido previamente con BamHI y defosforilado. La mezcla de plasmidos (genoteca) se utiliza para transformar mediante electroporación, células de la cepa de Escherichia coli DH10B. Los transformantes se seleccionan en placas de medio Luria Bertani, LB (1% de peptona, 0,5% de extracto de levadura, 0,5% de NaCl) suplementado con ampicilina (50 mg/l). Finalmente el DNA amplificado se recupera mediante extracción.
Con el objeto de identificar genes de T.
delbrueckii que mejoren la osmotolerancia de Saccharomyces
cerevisiae, se transforma la cepa de laboratorio
CEN.PK2-1A (MAT a
ura3-52 his3-\Delta1
leu2-3,112 trp1-289 SUC2) con la
genoteca descrita en el Ejemplo 1 y los transformantes se
seleccionan en placas de medio sintético SD [0,17% de medio base
para levaduras (YNB), 0,5% de sulfato amónico] conteniendo glucosa
(2%), 0.5 M de NaCl, y una mezcla de aminoácidos, excepto leucina,
a las concentraciones descritas por Sherman y col. [Sherman F, Fink
GR, Hicks JB (1986) Methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.]. Después de 5 días de
incubación a 30ºC, se recogieron 18 colonias. Se extraen los
plásmidos de las levaduras [Robzyk K, Kassir Y (1992) A simple and
highly efficient procedure for rescuing autonomous plasmids from
yeast. Nucleic Acids Res 20:3790] y se obtiene su mapa fisico tras
digerirlos con endonucleasas de restricción, EcoRI,
PstI, BamHI y HindIII. Así agrupamos los 18
plásmidos según 5 patrones de restricción. Un plásmido
representante de cada grupo se reintrodujo en la cepa
CEN.PK2-1A, confirmándose que su presencia aumenta
la resistencia a estrés salino de esta levadura. Uno de estos
plásmidos, denominado 14.A y cuyo mapa de restricción se describe en
la Figura 2, reveló la existencia de una pauta de lectura abierta
(Figura 1) con un 37% de homología con el gen CRZ1/TCN1
(YNL027w) de S. cerevisiae [Matheos DP, Kingsbury TJ,
Ahsan US, Cunningham KW (1997) Tcn1p/Crz1p, a
calcineurin-dependent transcription factor that
differentially regulates gene expression in Saccharomyces
cerevisiae. Genes Dev 11:3445-3458;
Stathopoulos AM, Cyert MS (1997) Calcineurin acts through the
CRZ1/TCN1-encoded transcription factor to regulate gene
expression in yeast. Genes Dev 11:3432-3444], al
que denominamos en la presente invención ScCRZ1.
TdCrz1p es una proteína de 506 aminoácidos
(Figura 1), con un tamaño molecular calculado a partir de su
secuencia de 56 KDa, que contiene en su extremo
carboxi-terminal 2 dedos de zinc (posiciones
395-414 y 422-444) del tipo
Cys2His2, característicos de proteínas de unión a DNA [Evans RM,
Hollenberg SM (1988) Zinc fingers: Gilt by association. Cell
52:1-3; Desjarlais JR, Berg JM (1992) Toward rules
relating zinc forger protein sequences and DNA binding site
preferences. Proc Natl Acad Sci 89:7345-7349].
Además, TdCrzlp contiene un posible tercer dedo de zinc menos
conservado, conteniendo tan solo 1 residuo de cisteína, Cys
(posición 462, Figura 1) y 1 residuo de histidina, His (posición
475, Figura 1). Estas estructuras también se encuentran en ScCrz1p,
la proteína de Saccharomyces, que cuenta además, con tres
regiones de aminoácidos ácidos, separadas por una región rica en
glutamina (caracteristica de los dominios de activación
transcripcional) y otra rica en serina y threonina [Stathopoulos
AM, Cyert MS (1997) Calcineurin acts through the
CRZ1/TCN1-encoded transcription factor to regulate gene
expression in yeast. Genes Dev 11:3432-3444;
Matheos DP, Kingsbury TJ, Ahsan US, Cunningham KW (1997)
Tcn1p/Crz1p, a calcineurin-dependent transcription
factor that differentially regulates gene expression in
Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev
11:3445-3458]. La proteína de Torulaspora,
TdCrz1p carece, sin embargo, de estos motivos.
Para confirmar que el efecto observado en
transformantes de S. cerevisiae conteniendo el plásmido 14.A
de la librería genómica era debido a la presencia del gen heterólogo
TdCRZ1, el inserto contenido en dicho plásmido, se digirió
con los enzimas de restricción ScaI y EcoRI,
liberándose un fragmento de 1.980 pb correspondiente a 350 pb del
promotor, 1.518 pb de la pauta de lectura abierta y 122 pb del
terminados. Este fragmento se subclonó en el vector de expresión
YEplac 195 digerido con las enzimas de restricción SmaI y
EcoRI, obteniendose el plásmido YEpTdCRZ1. La Figura 2
muestra una representación esquemática de las etapas de
subclonación.
El plásmido YEpTdCRZ1 se utilizó para
transformar células de las cepas de laboratorio
CEN.PK2-1A e YPH499 (MATa
ura3-52 lys2-801
ade2-101 trp-\boxempty63
his3-\boxempty200
leu2-\boxempty1), [Sikorski RS, Hieter P
(1989) A system of shuttle vectors and yeast host strains designed
for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces
cerevisiae. Genetics 122:19-27],
seleccionándose los transformantes en medio SD sin uracilo. Como
control se obtuvieron transformantes de ambas cepas conteniendo el
plásmido vacío YEplac 195 [URA3 (Gietz RD, Sugino A (1988) New
yeast-Escherichia coli shuttle vectors constructed with
in vitro mutagenized yeast genes lacking
six-base pair restriction sites. Gene
74:527-534)]. Como se observa en la Figura 3, la
sobreexpresión del gen TdCRZ1 en células de la cepa YPH499
aumentó su resistencia a NaCl (1,0 M), LiCl (0,4 M) y MnCl_{2}
(2,5 mM). Resultados similares se observan para transformantes de la
cepa de S. cerevisiae CEN.PK2-1A (datos no
mostrados). Por consiguiente, el efecto encontrado para el plásmido
14.A se puede atribuir a la presencia del gen TdCRZ1.
Se ha descrito que la sobreexpresión de
ScCRZ1 suprime, parcialmente, el fenotipo de sensibilidad a
Mn^{2+} y Li^{+} de una cepa mutante en la subunidad reguladora,
CNB1, de calcineurina [Matheos DP, Kingsbury TJ, Ahsan US,
Cunningham KW (1997) Tcn1p/Crz1p, a
calcineurin-dependent transcription factor that
differentially regulates gene expression in Saccharomyces
cerevisiae. Genes Dev 11:3445-3458; Stathopoulos
AM, Cyert MS (1997) Calcineurin acts through the
CRZ1/TCN1-encoded transcription factor to regulate gene
expression in yeast. Genes Dev 11:3432-3444]. Así
pues, analizamos si el gen de T. delbrueckii era capaz de
complementar el defecto de crecimiento de un mutante cnb1
(cepa DD12), en medios con un elevado contenido en Na^{+},
Mn^{2+} o Li^{+}. La obtención de la cepa DD12
(cnb1::hisG), un derivado de la cepa salvaje YPH499 ha sido
descrita previamente [Cyert MS, Thomer J (1992) Regulatory subunit
(CNB1 gene product) of yeast
Ca^{2+}/calmodulin-dependent phosphoprotein
phosphatases is required for adaptation to pheromone. Mol Cell Biol
12:3460-3469]. Como vemos en la Figura 3,
transformantes YEpTdCRZ1 de la cepa DD12 muestran una mejora
importante en su capacidad de crecimiento en comparación con los
transformantes control (YEplac195), en todos los medios ensayados,
confirmando que la sobreexpresión de TdCRZ1 complementa la
mutación de CNB1. Además, la expresión en un alto número de
copias de TdCRZ1 en un mutante crzl de S. cerevisiae
(cepa ASY472), un derivado
(crz1::loxP-kanMX-loxP) de
YPH499 descrito anteriormente [Stathopoulos AM, Cyert MS (1997)
Calcineurin acts through the CRZ1/TCN1-encoded
transcription factor to regulate gene expression in yeast. Genes
Dev 11:3432-3444] complementó el fenotipo de
sensibilidad a NaCl y LiCl de éste. Similares resultados se
observan para transformantes YEpTdCRZ1 de un doble mutante cnb1
crz1 de la cepa salvaje YPH499 [cepa ASY475,
crz1::loxP-kanMX-loxP
(Stathopoulos y Cyert 1997)]. Por consiguiente la pauta de lectura
abierta encontrada en el plásmido 14.A es capaz de complementar en
alto número de copias la ausencia de la función de los genes
CRZ1 y/o CNB1 de S. cerevisiae.
Por otra parte, se analizó si la sobreexpresión
de TdCRZ1 era capaz de activar la expresión "in
vivo" del gen lacZ de E. coli bajo el control
de un promotor heterólogo constituido por 4 copias seguidas de la
secuencia CDRE (4x-CDRE::lacZ). Para ello, se
utilizó la cepa ASY834 (cedida por MS Cyert), un derivado de la
cepa mutante DD12 (crz1) que contiene integrado en el
locus URA3 el plásmido pBJ304
(TRP1-4x-CDRE-lacZ::ura3). Detalles de
la construcción de este plásmido pueden encontrarse en [Jiang B,
Cyert M (1999) Identification of a novel region critical for
calcineurin function in vivo and in vitro J.
Biol.Chem. 274:18543-18551]. El plásmido YEpTdCRZ1
descrito en el Ejemplo 4, se utilizó para transformar la cepa
ASY834, seleccionando aquellas células capaces de crecer en
ausencia de uracilo. Como control se prepararon transformantes de
dicha cepa con el plásmido vacío YEplac195 (URA3). Células de
ambos tipos de transformante se crecieron en medio SD, sin uracilo,
hasta fase exponencial (DO_{600} = 0,5-0,7), se
colectaron por centrifugación y se resuspendieron en medio rico YPD
(2% de extracto de levadura, 2% de peptona y 2% de glucosa) o en
medio YPD conteniendo CaCl_{2} (200 mM, concentración final). Las
células se incuban a 30ºC durante 4 h en un agitador orbital (200
r.p.m.), se centrifugan (15 unidades de DO_{600}), se lavan con
tampón Z (60 mM de Na_{2}HPO_{4}, 40 mM NaH_{2}PO_{4}, 10 mM
KCl, 1 mM MgSO_{4}, pH 7.0) y el deposito de células se congela a
-20ºC hasta su análisis. Para preparar los extractos celulares, las
células se resuspenden en 0,5 ml de tampón Z conteniendo
\beta-mercaptoetanol (38 mM, concentración final)
y la suspensión se transfiere a un tubo Eppendorf conteniendo 0,5 g
de perlas de vidrio (0,4-mm de diámetro), se agita
vigorosamente en el Vortex durante 3 periodos de 1 min y se
centrifuga a 12.000 x g (4ºC) durante 10 min. Finalmente, se
determina en el sobrenadante el contenido en proteína y el nivel de
actividad \beta-galactosidasa. El análisis de
proteína se llevó a cabo utilizando un "kit" comercial de
BioRad. La actividad \beta-galactosidasa se ensayó
a temperatura ambiente usando el substrato ONPG
(O-nitrofenil-\beta-D-galactopiranosido,
Sigma), de acuerdo al protocolo descrito por Miller (1972). Ésta se
expresa como nanomoles de ONPG transformadas por min y mg de
proteína. En células de los transformantes YEpTdCRZ1 transferidas
durante 4 h a medio YPD, el nivel de actividad
\beta-galactosidasa intracelular fue de 118,1
\pm 36 unidades, mientras que en las mismas células transferidas
a medio YPD + 200 mM de CaCl_{2} la actividad alcanzó las 722,1
\pm 295 unidades. En las mismas condiciones, YPD o YPD + 200 mM
de CaCl_{2}, ninguna actividad
\beta-galactosidasa, pudo ser detectada en
células de los transformantes control YEplac195. Por consiguiente,
el producto del gen TdCRZ1 es capaz de activar, en una forma
dependiente de calcineurina, la transcripción de un gen chivato
(lacZ) situado bajo el control de un promotor sintético
conteniendo una secuencia consenso (CDRE) de unión a la proteína
Crz1p de S. cerevisiae. Estos resultados confirman que, en
efecto, el gen TdCRZ1 codifica para el homologo del gen
ScCRZ1.
A la vista de los resultados descritos arriba,
decidimos probar el efecto de la sobreexpresión del gen
TdCRZ1 en el crecimiento y capacidad fermentativa de células
de una cepa de levadura de panadería. Para ello utilizamos como cepa
hospedadora HS13, un derivado de esporulación de la cepa comercial
S47 [Ura^{-} (Lesaffre International)] y como control, el
plásmido vacío YEplac195. Como se observa en la Figura 4, la
sobreexpresión de este gen heterólogo en células de la cepa HS13 no
alteró su capacidad de crecimiento en placas de medio SD isotónico
(-NaCl), con respecto a la observada en células control
(YEplac195). Por el contrario, en medio SD conteniendo NaCl (1 M)
la expresión de la proteína recombinante aumentó claramente la
tolerancia a estrés salino de la cepa hospedadora.
También analizamos el efecto de la
sobreexpresión del gen TdCRZ1, en la capacidad fermentativa
en masas dulces, de células de la levadura de panadería HS13. Para
ello, 300 \mul de una suspensión de células (20 unidades de
DO_{600} por ml, conteniendo 0,24 \mug/ml de biotina) de cada
uno de los transformantes analizados se siembra en placas de medio
melaza (0,5% de melaza, 0,05% de (NH4)_{2}HPO_{4}, 2,6%
de agar bacteriológico, pH 5,5) a 30ºC durante 20 h. A
continuación, se recogen las células con un volumen de 5 ml de agua
estéril por placa y se determina la DO_{600} de la suspensión
final. Esta suspensión se utiliza para preparar la masa panaria
según la siguiente formula, 50 g de harina de trigo (humedad 16%;
W, 113,5 x 10^{-4} J [Alveografo]; P/L, 0,26 [Alveografo]); 25 ml
de agua, 2572 unidades de DO_{600} de células de levadura
[equivalente a un 0,9% (base harina) de levadura (peso seco)], 1,0
g de sal común y 10, 12,5 o 15 g de azúcar para masas con un 20, 25
o 30% de azúcar (base harina), respectivamente. Los ingredientes se
amasan en la amasadora del Farinografo (Brabender, Alemania) durante
8 min y la masa resultante se divide en piezas de 35 g para
analizar su capacidad fermentativa. Para determinar la producción
de CO_{2} se siguió el principio de Burrows y Harrison, según el
que el volumen de gas desprendido corresponde al volumen de
desplazamiento de una solución alcalina, utilizando un Fermentómetro
(aparato Chittick, AACC, 12-10). La temperatura de
fermentación se mantuvo a 30ºC con la ayuda de un baño de agua
termostatado. La capacidad fermentativa se expresa como ml de
CO_{2} desprendido por mg de levadura (peso seco) frente al tiempo
de fermentación.
Como se observa en la Figura 5, la
sobreexpresión de TdCRZ1 en células de la cepa HS13
incrementó su capacidad de producción de CO_{2} con respecto al
observado para células control (YEplac195). Este efecto es más
acusado a medida que se incrementa el contenido de azúcar en la
formulación de la masa y por tanto la presión osmótica. Así, el
incremento a los 180 min de fermentación, fue de un 7% para masas
conteniendo un 20% de azúcar, mientras que este valor ascendió
hasta un 16 y un 25%, para masas conteniendo un 25 o un 30% de
azúcar, respectivamente (Figura 5).
El aumento de la presencia de sales en el medio,
no es la única condición ambiental que implica una reducción de la
actividad de agua celular. En efecto, la desecación y en particular
la congelación, también tienen en común la exposición de las células
a estrés hiperosmótico, lo que resulta en un movimiento de agua a
través de la membrana [Wolfe J, Bryant G (1999) Freezing, crying,
and/orvitrification of
membrane-solute-water systems.
Criobiology 39:103-129]. En consecuencia, decidimos
analizar el efecto de la sobreexpresión de TdCRZ1 en la
viabilidad y capacidad fermentativa de células de levadura de
panadería sometidas a condiciones de estrés por congelación. Con
este fin, preparamos biomasa de los transformantes YEpTdCRZ1 y
YEplac195 mediante su cultivo en placas de medio melaza, tal y como
se describió en el Ejemplo 6, excepto que la suspensión de células
se diluyo en una solución sálina (135 g de NaCl y 20 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4} en 5 l de agua desionizada) hasta
una densidad final de 15 mg de células (peso seco) por ml (1 unidad
de DO_{600} equivale a 0,35 mg de células, peso seco). 15 ml de
tal suspensión se mezclan con 15 ml de una solución de nutrientes
[(SN) 0,5% de extracto de levadura, 3,0% de glucosa, 9,0% de
maltosa, 0,4% de MgSO_{4}, 0,16% de KC1, 0,94% de
(NH_{4})_{2}HPO_{4}, 8 ppm de vitamina B1, 8 ppm de
vitamina B6, 80 ppm de ácido nicotínico y 0,3 M de tampón citrato,
pH 5.5). Alícuotas de 1 ml de la mezcla final, se transfieren a
tubos Eppendorf y se congelan a -20ºC. En diferentes momentos
durante su almacenamiento en congelación, la suspensión de células
se descongela a 30ºC durante 30 min y se determina el número de
viables y su crecimiento en placa. El número de viables se
determina mediante recuento del nº de colonias en placas de YPD
tras 48 h de incubación a 30ºC. Para visualizar el crecimiento,
alícuotas (3 ml) de diluciones seriadas (10^{-1} a 10^{-5}) de
la suspensión inicial se depositan sobre placas de YPD. Como
muestra la Figura 6A, la sobreexpresión de TdCRZ1 en células
de la cepa HS13 aumenta de forma notable su resistencia a la
congelación y almacenamiento a -20ºC. Así, después de 12 días de
almacenamiento en estas condiciones, la suspensión de células
transformantes YEpTdCRZ1 mantuvo un nivel de viables alrededor de un
orden de magnitud más alto que la suspensión de células control
YEplac195 (Figura 6B).
Este efecto se observa también en la capacidad
fermentativa de masas de pan común congeladas. Para analizar este
parámetro, piezas de 35 g de masas preparadas como se describió en
el Ejemplo 6, excepto que no contenían azúcar, se moldean a mano
hasta conseguir una lamina de un espesor de unos
0,5-cm, se envuelven en plástico y se congelan a
-80ºC. Después de 1 h a esta temperatura, las piezas se trasladan a
un congelador a -20ºC para su almacenamiento. A diferentes tiempos,
las piezas de masa congelada se descongelan a 30ºC durante 30 min y
se determina inmediatamente su capacidad fermentativa. Una masa sin
congelar (tiempo 0) y una masa congelada durante 3 h (tiempo 0') se
utilizaron como control. La Figura 7 muestra la variación de la
producción de CO_{2} a lo largo del almacenamiento durante un
máximo de 20 días (-20ºC) de masas elaboradas con los
transformantes YEpTdCRZ1 y YEplac195. Los resultados se expresan
como ml de CO_{2}/mg de levadura (base seca), a los 120 min de
fermentación a 30ºC. Como puede observarse, la capacidad
fermentativa de ambos transformantes se redujo con el tiempo de
almacenamiento en congelación. Sin embargo, este efecto fue menos
acusado para los transformantes YEpTdCRZ1, los cuales producen en
todos los tiempos ensayados más gas que los transformantes control
(Figura 7). Como ejemplo, a los 20 días de almacenamiento las masas
elaboradas con éstos transformantes muestran una producción de
CO_{2} un 38% superior a la registrada para las masas control
(YEplac195).
Una situación similar se observa para masas
dulces congeladas, elaboradas con cada uno de los transformantes
analizados, YEpTdCRZ1 y YEplac195. La Figura 8 muestra como ejemplo
la cinética de producción de CO_{2} en masas dulces (30% de
azúcar) almacenadas durante 20 días a -20ºC. En todos los tiempos
analizados, la producción de CO_{2} en masas elaboradas con los
transformantes YEpTdCRZ1 fue superior respecto a la observada en
masas control; por ejemplo a los 360 min de fermentación esta
diferencia alcanzó un valor del 53%.
Se analizó también si los efectos en levadura de
panadería de la sobreexpresión del gen TdCRZ1 podían también
obtenerse mediante expresión en un alto número de copias del gen
homologo de S. cerevisiae (ScCRZ1). Como se observa en
la Figura 9, transformantes YEpScCRZ1 de la cepa de panadería HS13
muestran una mayor resistencia a la congelación y mantenimiento en
esta situación (-20ºC), que transformantes conteniendo el plásmido
vacío YEplac195. El número de viables se determinó tal y como se
describió en el Ejemplo 7. La capacidad fermentativa de la cepa
hospedadora HS13 en masas dulces también se ve sensiblemente
mejorada por la sobreexpresión de ScCRZ1. Así, en masas
conteniendo un 30% de sacarosa, los transformantes YEpScCRZ1
producen a los 180 min de fermentación, un 40% más de CO_{2} que
los transformantes YEplac195. También el poder fermentativo de la
levadura HS13 en masas dulces congeladas mejora notablemente por la
sobreexpresión de ScCRZ1. En efecto, a los 360 min de
fermentación, las masas elaboradas con los transformantes YEpScCRZ1
producen un 125% más de CO_{2} que aquellas preparadas con los
transformantes control YEplac195.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
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<120> Método para mejorar la viabilidad y
la capacidad fermentativa de levaduras de panadería en condiciones
de estrés hiperosmótico y estrés por congelación
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<130> Mejora de levaduras de panadería
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<160> 4
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 3155
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<212> DNA
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<213> Torulaspora delbrueckii
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (395)..(414)
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<223> Zinc finger type Cys2His2
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<220>
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<221> CDS
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<222> (350)..(1867)
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<223>
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (422)..(444)
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<223> Zinc finger type Cys2His2
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (3083)..(3083)
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<223> unknown residue
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (3106)..(3106)
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<223> unknown residue
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 506
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<212> PRT
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<213> Torulaspora delbrueckii
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<222> (395)..(414)
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<223> Zinc finger type Cys2His2
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<222> (422)..(444)
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<223> Zinc finger type Cys2His2
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<222> (3083)..(3083)
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<223> unknown residue
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (3106)..(3106)
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 1518
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<212> DNA
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<213> Torulaspora delbrueckii
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1518)
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<223>
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 506
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<212> PRT
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<213> Torulaspora delbrueckii
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<400> 4
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Claims (16)
1. Método de obtención de levaduras de panadería
con alta capacidad de resistencia a la congelación, al estrés
hiperosmótico (alto contenido en azúcar) y al estrés iónico
caracterizado porque se basa en la transformación genética de
dichas levaduras mediante una secuencia de nucleótidos que permite
la expresión de una proteína con actividad Crz1.
2. Método de obtención de levaduras de panadería
según la reivindicación 1 caracterizado porque la secuencia
de nucleótidos que permite la expresión de una proteína con
actividad Crz1 es una secuencia que comprende la secuencia de
nucleótidos codificante de la proteína Crz1p de Saccharomyces
cerevisiae (ScCrz1p).
3. Método de obtención de levaduras de panadería
según la reivindicación 2 caracterizado porque la secuencia
de nucleótidos codificante de la proteína ScCrz1p es el plámido
YEpScCRZ1.
4. Método de obtención de levaduras de panadería
según la reivindicación 1 caracterizado porque la secuencia
de nucleótidos que permite la expresión de una proteína con
actividad Crz1 es una secuencia que comprende la secuencia de
nucleótidos codificante de la proteína Crz1p de Torulaspora
delbrueckii (TdCrz1p).
5. Método de obtención de levaduras de panadería
según la reivindicación 4 caracterizado porque la secuencia
de nucleótidos que codifica la proteína TdCrz1p consiste en la
secuencia codificante identificada como SEQ ID NO 3.
6. Método de obtención de levaduras de panadería
según la reivindicación 4 caracterizado porque la secuencia
de nucleótidos que codifica la proteína TdCrz1p está constituida
por la construcción genética identificada como SEQ ID NO 1.
7. Método de obtención de levaduras de panadería
según la reivindicación 4 caracterizado porque la secuencia
de nucleótidos que codifica de la proteína TdCrz1p consiste en un
vector de expresión, entre otros el vector YEpTdCRZ1, que comprende
la secuencia SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 1.
8. Secuencia de nucleótidos que codifica la
proteína TdCrz1p caracterizada porque consiste en la
secuencia codificante identificada como SEQ ID NO 3.
9. Secuencia de nucleótidos que codifica la
proteína TdCrz1p caracterizada porque consiste en la
construcción genética identificada como SEQ ID NO 1.
10. Secuencia de nucleótidos que codifica la
proteína TdCrz1p caracterizada porque consiste en un vector
de expresión, entre otros el vector YEpTdCRZ1, que comprende la
secuencia SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO 1.
11. Uso de cualquiera de las secuencias según
las reivindicaciones de la 8 a la 10 en la elaboración de un vector
de expresión génica.
12. Uso de un vector según la reivindicación 11
en la transformación de levaduras de panadería para incrementar su
resistencia a la congelación, estrés hiperosmótico y estrés
iónico.
13. Una levadura de panadería
caracterizada porque ha sido transformada genéticamente
mediante el método según las reivindicaciones de la 1 a la 7 para
la expresión recombinante de una proteína con actividad Crz1 y
porque presenta una alta capacidad fermentativa con incremento de
su resistencia a la congelación, estrés hiperosmótico y estrés
iónico.
14. Una levadura de panadería según la
reivindicación 13 caracterizada porque comprende una
secuencia de nucleótidos capaz de expresar la proteína ScCrz1,
entre otras la levadura de panadería HS13 (YEpScCRZ1).
15. Una levadura de panadería según la
reivindicación 13 caracterizada porque comprende una
secuencia de nucleótidos capaz de expresar la proteína TdCrzl,
entre otras la levadura de panadería HS13 (YEpTdCRZ1).
16. Uso de cualquiera de las levaduras según una
cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 15 en la
elaboración de masa de panadería, dulce o de pan común, ya sea
congelada o no congelada.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200302056A ES2257125B1 (es) | 2003-09-01 | 2003-09-01 | Metodo para mejorar la viabilidad y la capacidad fermentativa de levaduras de panaderia en condiciones de estres hiperosmotico y estres por congelacion. |
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200302056A ES2257125B1 (es) | 2003-09-01 | 2003-09-01 | Metodo para mejorar la viabilidad y la capacidad fermentativa de levaduras de panaderia en condiciones de estres hiperosmotico y estres por congelacion. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| ES2257125B1 true ES2257125B1 (es) | 2007-07-16 |
Family
ID=34259325
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| ES200302056A Withdrawn - After Issue ES2257125B1 (es) | 2003-09-01 | 2003-09-01 | Metodo para mejorar la viabilidad y la capacidad fermentativa de levaduras de panaderia en condiciones de estres hiperosmotico y estres por congelacion. |
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2003
- 2003-09-01 ES ES200302056A patent/ES2257125B1/es not_active Withdrawn - After Issue
-
2004
- 2004-08-03 WO PCT/ES2004/070065 patent/WO2005021760A1/es active Application Filing
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2257125A1 (es) | 2006-07-16 |
| WO2005021760A1 (es) | 2005-03-10 |
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