JP2012528570A - 遺伝子改変微生物を作製する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書に用いられる場合、用語「異種性」とは、通常には天然で見出されないものを指す。用語「異種性ヌクレオチド配列」は、天然で所定の細胞において通常には見出されないヌクレオチド配列を指す。それとして、異種性ヌクレオチド配列は、(a)その宿主細胞にとって外来であり得る(すなわち、その細胞にとって「外因性」であり得る);(b)宿主細胞において天然で見出されるが(すなわち、「内因性」)、細胞において不自然な量(すなわち、宿主細胞において天然で見出されるより多い量、または少ない量)で存在し得る;または(c)宿主細胞において天然で見出されるが、その天然の座の外側に位置し得る。
胞子形成および/または内因性接合能力において機能的に損なわれている遺伝子改変微生物、例えば、遺伝子改変酵母細胞(例えば、遺伝子改変Saccharomyces cerevisiae細胞)を含む組成物、ならびにそのような組成物を作製するための方法および材料が本明細書に提供される。本明細書に提供される方法は、微生物の有性生殖サイクルを中断させて、天然におけるその微生物の散在を最小限にし、遺伝子改変微生物と、天然において散在する能力が損なわれていない野生型微生物との間での遺伝物質の交換の可能性を最小限にする。
本明細書に提供された方法の実施において有用な微生物には、真核単細胞生物、具体的には真菌、より具体的には酵母が挙げられる。
組換えプラスミドまたは染色体組込みベクターを用いて微生物を遺伝的に改変する方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、Sherman,F.ら、Methods Yeast Genetics、Cold Spring Harbor Laboratory、N.Y.(1978);Guthrie,C.ら(編)Guide To Yeast Genetics and Molecular Biology 194巻、Academic Press、San Diego(1991);Sambrookら、2001、Molecular Cloning−A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY;およびAusubelら編、現行版、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、NYを参照;それらの開示は参照により本明細書に組み入れられている。
本明細書に提供された方法は、遺伝子改変微生物細胞において1つもしくは複数の胞子形成遺伝子および/または1つもしくは複数のフェロモン応答遺伝子を機能的に破壊する工程を含む。いくつかの実施形態において、1つまたは複数の胞子形成遺伝子の破壊は、胞子形成能力を欠く遺伝子改変微生物細胞を生じる。特に、遺伝子改変二倍体微生物細胞は胞子形成能力を欠く。いくつかの実施形態において、1つまたは複数のフェロモン応答遺伝子の破壊は、内因性接合が損なわれている微生物細胞を生じる。いくつかの実施形態において、1つまたは複数の胞子形成遺伝子の破壊および1つまたは複数のフェロモン応答遺伝子の破壊は、胞子形成および内因性接合が損なわれている微生物細胞を生じる。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された方法に従って破壊される酵母細胞におけるフェロモン応答遺伝子は、STE5である。STE5は、酵母接合経路を通してのマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)への直接的シグナル伝達に必要とされるスキャフォールドタンパク質をコードする。例えば、Goodら、Cell Mar 20;136(6):1085−97(2009)参照。Saccharomyces cerevisiaeの代表的なSTE5ヌクレオチド配列には、Genbankアクセッション番号L23856、ならびに本明細書に提供されているような配列番号17、45、73、101、および129が挙げられる。Saccharomyces cerevisiaeの代表的なSte5タンパク質配列には、Genbankアクセッション番号AAA35115、ならびに本明細書に提供されているような配列番号18、46、74、102、および130が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供された方法に従って破壊される酵母細胞における胞子形成遺伝子はIME1である。IME1遺伝子は、減数分裂の開始に必要とされる、初期減数分裂遺伝子転写を活性化する転写因子をコードする。Saccharomyces cerevisiaeのIME1遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Smith,H.E.ら、Mol.Cell.Biol.10(12):6103−6113(1990)参照。Saccharomyces cerevisiaeの代表的なIME1ヌクレオチド配列には、Genbankアクセッション番号M37188、ならびに本明細書に提供されているような配列番号1、29、57、85、および113が挙げられる。Saccharomyces cerevisiaeの代表的なIme1タンパク質配列には、Genbankアクセッション番号AAA86790、ならびに本明細書に提供されているような配列番号2、30、58、86、および114が挙げられる。
本明細書に提供された方法は、1つもしくは複数の胞子形成遺伝子における機能的破壊および/または1つまたは複数のフェロモン応答遺伝子における機能的破壊を含む一倍体細胞の間で接合を誘導する工程を含む。前記接合の結果として形成される二倍体細胞は、細胞の1つまたは複数の胞子形成遺伝子の機能的破壊による二倍体相に制約される安定な二倍体細胞である。
この実施例は、遺伝子改変一倍体S.cerevisiae細胞を作製する例示的な方法を記載する。
この実施例は、遺伝子改変一倍体S.cerevisiae細胞において胞子形成遺伝子およびフェロモン応答遺伝子を破壊して、胞子形成および内因性接合が損なわれている遺伝子改変一倍体S.cerevisiae細胞を生じるための例示的な方法を記載する。
この実施例は、胞子形成および内因性接合が損なわれている遺伝子改変一倍体S.cerevisiae細胞を二倍体にするための例示的な方法を記載する。
遺伝子改変S.cerevisiae細胞の胞子形成欠陥および内因性接合欠陥を確認するための例示的な方法を記載する。
この実施例は、胞子形成欠陥性および内因性接合欠陥性の遺伝子改変二倍体S.cerevisiae細胞が天然に散在することができないことを確認するための例示的な方法を記載する。
したがって、本発明は以下の項目を提供する:
(項目1)
(a)少なくとも1つの胞子形成遺伝子における機能的破壊、
(b)少なくとも1つのフェロモン応答遺伝子における機能的破壊、および
(c)目的のタンパク質をコードする、染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列
を含む遺伝子改変酵母細胞であって、該遺伝子改変酵母細胞は、胞子形成が損なわれ、および、内因性接合が損なわれている、遺伝子改変酵母細胞。
(項目2) ヘテロタリック(ho)である、項目1に記載の遺伝子改変酵母細胞。
(項目3) 二倍体である、項目1に記載の遺伝子改変酵母細胞。
(項目4) 二倍体である、項目2に記載の遺伝子改変酵母細胞。
(項目5) 接合型対立遺伝子について以外はホモ接合型である、項目4に記載の遺伝子改変二倍体酵母細胞。
(項目6) 一倍体である、項目1に記載の遺伝子改変酵母細胞。
(項目7) 一倍体である、項目2に記載の遺伝子改変酵母細胞。
(項目8) 機能性ホモタリズム(HO)タンパク質をコードする組換えプラスミドをさらに含む、項目7に記載の遺伝子改変一倍体酵母細胞。
(項目9) 項目8に記載の遺伝子改変一倍体酵母細胞であって、該遺伝子改変一倍体酵母細胞において機能的に破壊されている上記少なくとも1つのフェロモン応答遺伝子の機能性コピーをコードする少なくとも1つの組換えプラスミドをさらに含む、遺伝子改変一倍体酵母細胞。
(項目10) Saccharomyces cerevisiae細胞である、項目1〜9のいずれか一つに記載の遺伝子改変酵母細胞。
(項目11) 上記Saccharomyces cerevisiae細胞はパン酵母株、Mauri株、Santa Fe株、IZ−1904株、TA株、BG−1株、CR−1株、SA−1株、M−26株、Y−904株、PE−2株、PE−5株、VR−1株、BR−1株、BR−2株、ME−2株、VR−2株、MA−3株、MA−4株、CAT−1株、CB−1株、NR−1株、BT−1株、またはAL−1株である、項目10に記載の遺伝子改変酵母細胞。
(項目12) 上記Saccharomyces cerevisiae細胞はPE−2株である、項目10に記載の遺伝子改変酵母細胞。
(項目13) 上記Saccharomyces cerevisiae細胞はCAT−1株である、項目10に記載の遺伝子改変酵母細胞。
(項目14) 上記少なくとも1つの胞子形成遺伝子は、IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2、およびSPO21からなる群より選択される、項目1に記載の遺伝子改変酵母細胞。
(項目15) 上記少なくとも1つのフェロモン応答遺伝子は、STE5、STE4、STE18、STE12、STE7、およびSTE11からなる群より選択される、項目1に記載の遺伝子改変酵母細胞。
(項目16) IME1遺伝子の機能的破壊を含む、項目14に記載の遺伝子改変酵母細胞。
(項目17) STE5遺伝子の機能的破壊を含む、項目15に記載の遺伝子改変酵母細胞。
(項目18) IME1遺伝子およびSTE5遺伝子の機能的破壊を含む、項目1に記載の遺伝子改変酵母細胞。
(項目19) STE5遺伝子の機能的破壊、および機能性STE5タンパク質をコードする組換えプラスミドを含む、項目9に記載の遺伝子改変一倍体酵母細胞。
(項目20) 胞子形成および内因性接合が損なわれている遺伝子改変二倍体酵母細胞を作製する方法であって、以下の工程
(a)第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞および第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞のそれぞれを、該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞および該第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞の内因性接合欠陥を相補することができるタンパク質をコードする少なくとも1つのプラスミドで形質転換する工程であって、該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、胞子形成および内因性接合が損なわれており、および、目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を含み、該第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、胞子形成および内因性接合が損なわれており、該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞と反対の接合型であり、および、該目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を含む、工程、
(b)該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞を該第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞と接合させ、それにより、遺伝子改変二倍体酵母細胞を形成する工程、ならびに
(c)1つまたは複数の該プラスミドを該遺伝子改変二倍体酵母細胞から除去する工程であって、その結果生じた該遺伝子改変二倍体酵母細胞は、胞子形成および内因性接合が損なわれており、および、該目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を2コピー含む、工程
を含む、方法。
(項目21) 上記第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞および上記第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、少なくとも1つのフェロモン応答遺伝子の機能的破壊によって内因性接合が損なわれている、項目20に記載の方法。
(項目22) 工程(a)が、上記第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞および上記第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞のそれぞれを、該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞および該第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞において機能的に破壊されている上記少なくとも1つのフェロモン応答遺伝子の機能性コピーをコードする少なくとも1つのプラスミドで形質転換する工程を含む、項目21に記載の方法。
(項目23) 上記フェロモン応答遺伝子は、STE5、STE4、STE18、STE12、STE7、およびSTE11からなる群より選択される、項目21に記載の方法。
(項目24) 上記フェロモン応答遺伝子は、STE5、STE4、STE18、STE12、STE7、およびSTE11からなる群より選択される、項目22に記載の方法。
(項目25) 上記フェロモン応答遺伝子はSTE5である、項目21に記載の方法。
(項目26) 上記フェロモン応答遺伝子はSTE5である、項目22に記載の方法。
(項目27) 上記第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞および上記第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、少なくとも1つの胞子形成遺伝子の機能的破壊によって胞子形成が損なわれている、項目20に記載の方法。
(項目28) 上記胞子形成遺伝子は、IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2、およびSPO21からなる群より選択される、項目27に記載の方法。
(項目29) 上記胞子形成遺伝子はIME1である、項目28に記載の方法。
(項目30) 上記第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞および上記第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、STE5遺伝子の機能的破壊によって内因性接合が損なわれており、および、IME1遺伝子の機能的破壊によって胞子形成が損なわれている、項目20に記載の方法。
(項目31) 上記第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、上記第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞の集団において接合型切り換えを誘導することによって得られる、項目20に記載の方法。
(項目32) 上記第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞の集団はヘテロタリック(ho)であり、かつ、該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞を機能性ホモタリズム(HO)タンパク質をコードする組換えプラスミドで形質転換することによって接合型を切り換えるように誘導され、該HOタンパク質の発現は該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞の接合型切り換えを誘導することができる、項目31に記載の方法。
(項目33) 上記遺伝子改変二倍体酵母細胞はSaccharomyces cerevisiae細胞である、項目20に記載の方法。
(項目34) 上記Saccharomyces cerevisiae細胞はパン酵母株、IZ−1904株、TA株、BG−1株、CR−1株、SA−1株、M−26株、Y−904株、PE−2株、PE−5株、VR−1株、BR−1株、BR−2株、ME−2株、VR−2株、MA−3株、MA−4株、CAT−1株、CB−1株、NR−1株、BT−1株、またはAL−1株である、項目33に記載の方法。
(項目35) 上記Saccharomyces cerevisiae細胞はPE−2株である、項目33に記載の方法。
(項目36) 上記Saccharomyces cerevisiae細胞はCAT−1株である、項目33に記載の方法。
(項目37) 項目20〜36のいずれか一つに記載の方法によって作製された、胞子形成および内因性接合が損なわれた二倍体酵母細胞。
(項目38) 胞子形成および内因性接合が損なわれた遺伝子改変ヘテロタリック(ho)二倍体酵母細胞を作製するための方法であって、以下の工程
(a)第1の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞の集団を機能性ホモタリズム(HO)タンパク質をコードするプラスミドで形質転換して、第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞を生じる工程であって、該HOタンパク質の発現は該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞の接合型切り換えを誘導することができ、それにより、該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞と反対の接合型の第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞が得られ、該第1の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞は、目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列ならびにSTE5遺伝子およびIME1遺伝子における機能的破壊を含む、工程、
(b)該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞および該第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞のそれぞれを、STE5タンパク質をコードするプラスミドで形質転換する工程であって、結果として、該形質転換工程は、該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞と該第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞との接合を生じ、それにより遺伝子改変二倍体酵母細胞を形成する、工程、ならびに
(c)該遺伝子改変二倍体酵母細胞から任意のプラスミドを除去して、遺伝子改変ヘテロタリック二倍体酵母細胞を生じる工程であって、生じた該遺伝子改変ヘテロタリック二倍体酵母細胞は胞子形成および内因性接合が損なわれており、および、該目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を2コピー含む、工程
を含む、方法。
(項目39) 上記胞子形成および内因性接合が損なわれたヘテロタリック(ho)二倍体酵母細胞はSaccharomyces cerevisiae細胞である、項目39に記載の方法。
(項目40) 上記Saccharomyces cerevisiae細胞はパン酵母株、Mauri株、Santa Fe株、IZ−1904株、TA、BG−1株、CR−1株、SA−1株、M−26株、Y−904株、PE−2株、PE−5株、VR−1株、BR−1株、BR−2株、ME−2株、VR−2株、MA−3株、MA−4株、CAT−1株、CB−1株、NR−1株、BT−1株、またはAL−1株である、項目39に記載の方法。
(項目41) 上記Saccharomyces cerevisiae細胞はPE−2株である、項目39に記載の方法。
(項目42) 上記Saccharomyces cerevisiae細胞はCAT−1株である、項目39に記載の方法。
(項目43) 項目38〜42のいずれか一つに記載の方法によって作製された、胞子形成および内因性接合が損なわれたヘテロタリック(ho)二倍体酵母細胞。
(項目44) MATα/a ste5/ste5 ime1/ime1酵母細胞。
Claims (44)
- (a)少なくとも1つの胞子形成遺伝子における機能的破壊、
(b)少なくとも1つのフェロモン応答遺伝子における機能的破壊、および
(c)目的のタンパク質をコードする、染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列
を含む遺伝子改変酵母細胞であって、該遺伝子改変酵母細胞は、胞子形成が損なわれ、および、内因性接合が損なわれている、遺伝子改変酵母細胞。 - ヘテロタリック(ho)である、請求項1に記載の遺伝子改変酵母細胞。
- 二倍体である、請求項1に記載の遺伝子改変酵母細胞。
- 二倍体である、請求項2に記載の遺伝子改変酵母細胞。
- 接合型対立遺伝子について以外はホモ接合型である、請求項4に記載の遺伝子改変二倍体酵母細胞。
- 一倍体である、請求項1に記載の遺伝子改変酵母細胞。
- 一倍体である、請求項2に記載の遺伝子改変酵母細胞。
- 機能性ホモタリズム(HO)タンパク質をコードする組換えプラスミドをさらに含む、請求項7に記載の遺伝子改変一倍体酵母細胞。
- 請求項8に記載の遺伝子改変一倍体酵母細胞であって、該遺伝子改変一倍体酵母細胞において機能的に破壊されている前記少なくとも1つのフェロモン応答遺伝子の機能性コピーをコードする少なくとも1つの組換えプラスミドをさらに含む、遺伝子改変一倍体酵母細胞。
- Saccharomyces cerevisiae細胞である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母細胞。
- 前記Saccharomyces cerevisiae細胞はパン酵母株、Mauri株、Santa Fe株、IZ−1904株、TA株、BG−1株、CR−1株、SA−1株、M−26株、Y−904株、PE−2株、PE−5株、VR−1株、BR−1株、BR−2株、ME−2株、VR−2株、MA−3株、MA−4株、CAT−1株、CB−1株、NR−1株、BT−1株、またはAL−1株である、請求項10に記載の遺伝子改変酵母細胞。
- 前記Saccharomyces cerevisiae細胞はPE−2株である、請求項10に記載の遺伝子改変酵母細胞。
- 前記Saccharomyces cerevisiae細胞はCAT−1株である、請求項10に記載の遺伝子改変酵母細胞。
- 前記少なくとも1つの胞子形成遺伝子は、IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2、およびSPO21からなる群より選択される、請求項1に記載の遺伝子改変酵母細胞。
- 前記少なくとも1つのフェロモン応答遺伝子は、STE5、STE4、STE18、STE12、STE7、およびSTE11からなる群より選択される、請求項1に記載の遺伝子改変酵母細胞。
- IME1遺伝子の機能的破壊を含む、請求項14に記載の遺伝子改変酵母細胞。
- STE5遺伝子の機能的破壊を含む、請求項15に記載の遺伝子改変酵母細胞。
- IME1遺伝子およびSTE5遺伝子の機能的破壊を含む、請求項1に記載の遺伝子改変酵母細胞。
- STE5遺伝子の機能的破壊、および機能性STE5タンパク質をコードする組換えプラスミドを含む、請求項9に記載の遺伝子改変一倍体酵母細胞。
- 胞子形成および内因性接合が損なわれている遺伝子改変二倍体酵母細胞を作製する方法であって、以下の工程
(a)第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞および第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞のそれぞれを、該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞および該第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞の内因性接合欠陥を相補することができるタンパク質をコードする少なくとも1つのプラスミドで形質転換する工程であって、該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、胞子形成および内因性接合が損なわれており、および、目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を含み、該第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、胞子形成および内因性接合が損なわれており、該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞と反対の接合型であり、および、該目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を含む、工程、
(b)該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞を該第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞と接合させ、それにより、遺伝子改変二倍体酵母細胞を形成する工程、ならびに
(c)1つまたは複数の該プラスミドを該遺伝子改変二倍体酵母細胞から除去する工程であって、その結果生じた該遺伝子改変二倍体酵母細胞は、胞子形成および内因性接合が損なわれており、および、該目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を2コピー含む、工程
を含む、方法。 - 前記第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞および前記第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、少なくとも1つのフェロモン応答遺伝子の機能的破壊によって内因性接合が損なわれている、請求項20に記載の方法。
- 工程(a)が、前記第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞および前記第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞のそれぞれを、該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞および該第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞において機能的に破壊されている前記少なくとも1つのフェロモン応答遺伝子の機能性コピーをコードする少なくとも1つのプラスミドで形質転換する工程を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記フェロモン応答遺伝子は、STE5、STE4、STE18、STE12、STE7、およびSTE11からなる群より選択される、請求項21に記載の方法。
- 前記フェロモン応答遺伝子は、STE5、STE4、STE18、STE12、STE7、およびSTE11からなる群より選択される、請求項22に記載の方法。
- 前記フェロモン応答遺伝子はSTE5である、請求項21に記載の方法。
- 前記フェロモン応答遺伝子はSTE5である、請求項22に記載の方法。
- 前記第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞および前記第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、少なくとも1つの胞子形成遺伝子の機能的破壊によって胞子形成が損なわれている、請求項20に記載の方法。
- 前記胞子形成遺伝子は、IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2、およびSPO21からなる群より選択される、請求項27に記載の方法。
- 前記胞子形成遺伝子はIME1である、請求項28に記載の方法。
- 前記第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞および前記第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、STE5遺伝子の機能的破壊によって内因性接合が損なわれており、および、IME1遺伝子の機能的破壊によって胞子形成が損なわれている、請求項20に記載の方法。
- 前記第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞は、前記第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞の集団において接合型切り換えを誘導することによって得られる、請求項20に記載の方法。
- 前記第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞の集団はヘテロタリック(ho)であり、かつ、該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞を機能性ホモタリズム(HO)タンパク質をコードする組換えプラスミドで形質転換することによって接合型を切り換えるように誘導され、該HOタンパク質の発現は該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞の接合型切り換えを誘導することができる、請求項31に記載の方法。
- 前記遺伝子改変二倍体酵母細胞はSaccharomyces cerevisiae細胞である、請求項20に記載の方法。
- 前記Saccharomyces cerevisiae細胞はパン酵母株、IZ−1904株、TA株、BG−1株、CR−1株、SA−1株、M−26株、Y−904株、PE−2株、PE−5株、VR−1株、BR−1株、BR−2株、ME−2株、VR−2株、MA−3株、MA−4株、CAT−1株、CB−1株、NR−1株、BT−1株、またはAL−1株である、請求項33に記載の方法。
- 前記Saccharomyces cerevisiae細胞はPE−2株である、請求項33に記載の方法。
- 前記Saccharomyces cerevisiae細胞はCAT−1株である、請求項33に記載の方法。
- 請求項20〜36のいずれか一項に記載の方法によって作製された、胞子形成および内因性接合が損なわれた二倍体酵母細胞。
- 胞子形成および内因性接合が損なわれた遺伝子改変ヘテロタリック(ho)二倍体酵母細胞を作製するための方法であって、以下の工程
(a)第1の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞の集団を機能性ホモタリズム(HO)タンパク質をコードするプラスミドで形質転換して、第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞を生じる工程であって、該HOタンパク質の発現は該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞の接合型切り換えを誘導することができ、それにより、該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞と反対の接合型の第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞が得られ、該第1の遺伝子改変ヘテロタリック一倍体酵母細胞は、目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列ならびにSTE5遺伝子およびIME1遺伝子における機能的破壊を含む、工程、
(b)該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞および該第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞のそれぞれを、STE5タンパク質をコードするプラスミドで形質転換する工程であって、結果として、該形質転換工程は、該第1の遺伝子改変一倍体酵母細胞と該第2の遺伝子改変一倍体酵母細胞との接合を生じ、それにより遺伝子改変二倍体酵母細胞を形成する、工程、ならびに
(c)該遺伝子改変二倍体酵母細胞から任意のプラスミドを除去して、遺伝子改変ヘテロタリック二倍体酵母細胞を生じる工程であって、生じた該遺伝子改変ヘテロタリック二倍体酵母細胞は胞子形成および内因性接合が損なわれており、および、該目的のタンパク質をコードする染色体に組み込まれた異種性ヌクレオチド配列を2コピー含む、工程
を含む、方法。 - 前記胞子形成および内因性接合が損なわれたヘテロタリック(ho)二倍体酵母細胞はSaccharomyces cerevisiae細胞である、請求項39に記載の方法。
- 前記Saccharomyces cerevisiae細胞はパン酵母株、Mauri株、Santa Fe株、IZ−1904株、TA株、BG−1株、CR−1株、SA−1株、M−26株、Y−904株、PE−2株、PE−5株、VR−1株、BR−1株、BR−2株、ME−2株、VR−2株、MA−3株、MA−4株、CAT−1株、CB−1株、NR−1株、BT−1株、またはAL−1株である、請求項39に記載の方法。
- 前記Saccharomyces cerevisiae細胞はPE−2株である、請求項39に記載の方法。
- 前記Saccharomyces cerevisiae細胞はCAT−1株である、請求項39に記載の方法。
- 請求項38〜42のいずれか一項に記載の方法によって作製された、胞子形成および内因性接合が損なわれたヘテロタリック(ho)二倍体酵母細胞。
- MATα/a ste5/ste5 ime1/ime1酵母細胞。
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