ES2274664B1 - Levaduras bgs4delta autoliticas, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones en procedimientos de expresion de proteinas. - Google Patents
Levaduras bgs4delta autoliticas, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones en procedimientos de expresion de proteinas. Download PDFInfo
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Abstract
Levaduras bgs4delta autolíticas, procedimiento de obtención y sus aplicaciones en procedimientos de expresión de proteínas. La invención describe unas nuevas levaduras eficaces para la expresión y obtención de proteínas heterólogas de interés comercial que permite su secreción al medio mediante autolisis regulada. La ventaja es que se produce una lisis natural, sin producir otro tipo de alteraciones celulares como ocurre en otros procedimientos y que la rotura celular es inducida, por lo que se evita cualquier método de tratamiento físico, de otra manera necesario para romper la pared celular de la levadura y liberar su contenido. Igualmente, se describe su método de obtención y sus aplicaciones.
Description
Levaduras bgs4\Delta autolíticas,
procedimiento de obtención y sus aplicaciones en procedimientos de
expresión de proteínas.
La producción de extractos celulares por métodos
suaves preservando el contenido intracelular y la producción de
proteínas heterólogas de interés comercial accediendo al contenido
intracelular del organismo utilizado como sistema de expresión, son
técnicas de gran utilidad en los sectores farmacéutico, de la
alimentación o de la biotecnología, incluida su utilización como
herramienta en investigación básica, ya que son de uso muy frecuente
en dichos sectores. Su aplicación puede ir encaminada también a los
mismos sectores, para producir nuevos compuestos, de menor coste o
con mayor facilidad, ya sea farmacéutico (medicina, veterinaria),
biotecnológico (herramienta para investigación científica,
proteínas recombinantes, etc.) o de la alimentación (complementos o
aditivos
alimenticios).
alimenticios).
En el caso de hongos filamentosos y levaduras no
hay ningún sistema comercial descrito para la obtención de
extractos celulares mediante métodos menos traumáticos que los
utilizados convencionalmente, que requieren bien la rotura mecánica
celular o la degradación enzimática de su envuelta externa,
denominada pared celular, y su consiguiente lisis por choque
osmótico.
Los sistemas de expresión ofrecidos por las
compañías normalmente se basan en diferentes vectores de expresión
inducible para bacterias (Escherichia coli) o para células
de mamíferos (utilizando plásmidos de expresión directamente o a
través de adenovirus, baculovirus, etc.).
Son muy numerosas las compañías que ofrecen
diferentes cepas de la bacteria E. coli con diferentes
modificaciones genéticas y también ofrecen diferentes plásmidos de
expresión para las mismas. Este organismo es procariota y por lo
tanto la expresión en este organismo de proteínas heterólogas de
eucariotas tiene una serie de inconvenientes como es la ausencia de
procesamientos postraducionales (glicosilación, procesamiento
proteolítico, modificación de extremos, etc.) dando lugar a
proteínas carentes de actividad biológica, y a veces antigénica,
insolubles y acumuladas en los denominados cuerpos de
inclusión.
Compañías como Q-biogen, Quantum
Biotechnologies Inc., Novagen, Invitrogen, Stratagene, BD
Biosciences Clontech, etc., ofrecen sistemas de expresión en
eucariotas, utilizando vectores de adenovirus (Richards, C.A. et
al. 2000, BioTechniques 29:146-154. Craig, N.L.
1997, Annu. Rev. Biochem. 66: 437-474. He, T.C.,
et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95:2509-2514. Massie, B., et al. 1998, J.
Virol. 72: 2289-2296. Mosser, D.D., et al.
1997, BioTechniques 22: 150-161. Massie, B., et
al. 1998, Cytotechnology 28: 53-64), de
lentivirus (Yew, N.S. et al., 2001, Mol. Ther. 4:
75-82. Lois, C. et al., 2002, Science 295:
868-872) o de retrovirus (Ausubel, F.M., et
al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley
& Sons, NY), 9.10-9.14, Suplemento 36. Coffin,
J.M. and Varmus, H.E., (Eds.), 1998, in Retroviruses. CHSL Press,
NY. Fields, B.N., et al. 1996, Fields Virology, 3^{rd}
edition. Lippencott-Raven publishers, NY, capítulo
38) y expresándolos en células de mamíferos. Otro sistema de
expresión similar utiliza baculovirus y células de insecto (Smith,
G.E. et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:
2156-2165. O'Reilly, D.R. et al., 1992,
Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W.H. Freeman
and Co., NY. King, L.A. and Possee, R.D., 1992, The Baculovirus
Expression System: A Laboratory Manual, Chapman and Hall, UK,
Granados, R.R. and Naughton, M. 1976, Invertebrate Tissue Culture,
Applications in Medicine, Biology and Agriculture. Kutstak, F. and
Maramorsch, K. (Eds.) Academic Press, NY, 472-476.
Ogonah, O.W. et al., 1996, BioTechnology 14:
197-202. Wagner, R., et al. J. Virol. 70:
4103-4109. Wickman, T.J. et al.,
Biotechnology Progress 8: 391-396). Sin embargo,
estos sistemas de expresión producen un bajo rendimiento, son
costosos y de difícil aplicación a gran escala, por lo que su uso
queda restringido a una herramienta en trabajos de investigación
de
laboratorio.
laboratorio.
Las levaduras son organismos eucariotas
unicelulares, algunos de los cuales, como Schizosaccharomyces
pombe, tienen propiedades muy similares a las células de
mamíferos y otros organismos eucariotas (estructura y funciones de
los cromosomas, control del ciclo celular, procesamiento del RNA,
similar uso de codones en la traducción de proteínas, plegamiento de
proteínas y procesamiento postraducional, etc.). Además, a
diferencia de las células de insectos o de mamíferos, estos
organismos son de crecimiento rápido (se dividen cada
2-3 horas), y los medios que utilizan son de bajo
coste, por lo que pueden ser utilizados tanto a pequeña como a gran
escala. Por ello, las levaduras como S. pombe, Pichia pastoris,
Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis o Yarrowia
lipolytica, son unos organismos idóneos para ser utilizados
como sistemas de expresión de proteínas heterólogas (Nohr, J. et
al., 2003, Protein expression in yeasts, in Methods in Molecular
Biology. Protein Misfolding and Disease: Principies and Protocols.
Bross, P. and Gregersen, N. (Eds.). Human Press, Inc. Totowa, NJ,
111-126). Sin embargo, muchas proteínas heterólogas
producidas en estos organismos no se secretan al medio, o se
secretan en una pequeña proporción, o quedan retenidas en el
espacio periplásmico de la superficie celular. Además, estos
organismos presentan una estructura rígida externa a la célula,
denominada pared celular, que constituye un impedimento para
conseguir esta rotura celular, y los métodos que actualmente
existen para lisar o romper las células son tediosos y con
rendimiento variable y
escaso.
escaso.
Q-biogen ofrece un sistema para
romper células de levaduras (también aplicable para bacterias y
células de plantas y animales) y poder aislar proteínas o ácidos
nucleicos. El aparato comercializado, FastPrep®, está diseñado para
cantidades de células (máximo 1-1.5 gr), utiliza
tubos de 1.5 ml y la rotura celular se realiza mediante una rápida
agitación de una mezcla de células y bolas de vidrio. Este método
es únicamente útil para pequeñas muestras de laboratorio y presenta
el inconveniente de que se basa en la fricción mecánica de las
bolas de vidrio, las cuales elevan la temperatura de la muestra y
puede llegar a producir la desnaturalización de las proteínas.
Aparte del aparato ofrecido por
Q-biogen, los métodos más usados para romper las
células de levaduras utilizan la fricción de pequeñas bolas de
vidrio (mediante agitación de tubos en agitadores vortex o en
agitadores mecánicos de mayor tamaño) o la alta presión (en prensa
francesa), lo que eleva la temperatura y puede afectar a la
estabilidad de las proteínas. En algunos aparatos, esto se remedia
con nieve carbónica, pero no es una técnica precisa y tiene el
riesgo de congelar las muestras y desnaturalizar las proteínas.
Además, el grado de rotura celular varía con cada muestra y técnica
usada. También se utilizan complejos enzimáticos hidrolíticos para
degradar total o parcialmente la pared celular, de modo individual
o combinado con los métodos anteriores. Sin embargo, estos
complejos enzimáticos contienen proteasas, además de las enzimas
hidrolíticas de los polisacáridos de la pared celular, que pueden
degradar las proteínas heterólogas expresadas en las células.
Una ventaja que posee el sistema de expresión en
S. pombe es que existe una serie de plásmidos de expresión
regulable por tiamina (promotor nmt1^{+}, abreviatura de
"no mesenger with thiamine"), derivados de los plásmidos pREP,
que han sido descritos con tres variantes del promotor
nmt1^{+} (3x, 41x y 81x) cada uno con un diferente nivel de
expresión (Maundrell, K., 1990, J. Biol. Chem. 165:
10857-10864; Forsburg, S., 1993, Nucleic Acids Res.
21: 2955-2956; Moreno, M.B. et al., 2000,
Yeast 16: 861-872 (nuestros propios resultados)).
Estos plásmidos tienen unos niveles de expresión que van desde la
expresión obtenida con otros plásmidos (inducción por tetraciclina,
Faryar, K. y Gatz, C., 1992, Curr. Genet., 21:
345-349) en esta u otras levaduras hasta niveles
200-500 veces superiores, lo que les proporciona una
gran versatilidad dependiendo del nivel de toxicidad de la proteína
expresada. Por otro lado, las construcciones modificadas para baja
expresión (81x) permiten reprimir a niveles indetectables la
expresión del gen correspondiente. Estas represiones/inducciones se
pueden complementar con plásmidos de otros sistemas regulados por
otros compuestos como cobre (Bellemare, D.R., et al., 2001,
Gene, 273: 191-198), sacarosa/glucosa (lacovoni,
J.S., et al., 1999, Gene, 232: 53-58),
glucosa/otras fuentes de carbono (Hoffman, C.S. y Winston, F.,
1989, Gene, 84: 473-479).
Stratagene ofrece un sistema de expresión en
S. pombe utilizando plásmidos derivados de los plásmidos
pREP de expresión regulable por tiamina. Otro sistema de expresión
ofrecido utiliza la levadura Saccharomyces cerevisiae y
plásmidos de expresión inducibles por galactosa, pero en este caso
la expresión es mucho menor y la levadura presenta una serie de
diferencias con las células de mamíferos (procesamiento
postraducional, secreción, etc.) que la hace menos idónea como
organismo de expresión. En ambos casos, existen patentes que se
refieren a los plásmidos y a los componentes para purificación por
afinidad ofrecidos. Además, en ambos casos, las cepas de levaduras
ofrecidas poseen un fenotipo silvestre, y las únicas alteraciones
en su genotipo corresponden a requerimientos auxotróficos para la
selección de plásmidos.
Invitrogen ofrece sistemas de expresión de
proteínas en Pichia pastoris (Limited Use Label License No.
74. Patentes de Research Corporation Technologies Inc., Tucson,
Arizona para USA y otros países: 4,683,293; 4,808,537; 4,812,405;
4,818,700; 4,837,148; 4,855,231; 4,857,467; 4,879,231; 4,882,279;
4,885,242; 4,895,800; 4,929,555;
5,002,876; 5,004,688; 5,032,516; 5,122,465; 5,135,868; 5,166,329), Pichia methanolica (Limited Use Label License No. 73. Patentes de ZymoGenetics Inc., Seattle, Washington cedidas a Invitrogen para USA y otros países: 5,716,808; 5,736,383; 5,854,039; 5,888,768; 5,955,349) (Pichia Protocols: Methods in Molecular Biology. 1998. Higgins, D.R. and Cregg, J. (Eds.). The Human Press, Totowa, NJ. 284 pp.), S. cerevisiae (poseen licencias para el uso de determinados plásmidos pero no para el sistema de expresión) y S. pombe, utilizando plásmidos derivados de los plásmidos pREP (promotor nmt1^{+}), con tres niveles distintos de expresión regulable por tiamina (Basi, G. et al. 1993, Gene, 123: 131-136) (poseen licencias para el uso de estos plásmidos modificados con promotor nmt1^{+}, pero no para el sistema de expresión).
5,002,876; 5,004,688; 5,032,516; 5,122,465; 5,135,868; 5,166,329), Pichia methanolica (Limited Use Label License No. 73. Patentes de ZymoGenetics Inc., Seattle, Washington cedidas a Invitrogen para USA y otros países: 5,716,808; 5,736,383; 5,854,039; 5,888,768; 5,955,349) (Pichia Protocols: Methods in Molecular Biology. 1998. Higgins, D.R. and Cregg, J. (Eds.). The Human Press, Totowa, NJ. 284 pp.), S. cerevisiae (poseen licencias para el uso de determinados plásmidos pero no para el sistema de expresión) y S. pombe, utilizando plásmidos derivados de los plásmidos pREP (promotor nmt1^{+}), con tres niveles distintos de expresión regulable por tiamina (Basi, G. et al. 1993, Gene, 123: 131-136) (poseen licencias para el uso de estos plásmidos modificados con promotor nmt1^{+}, pero no para el sistema de expresión).
Todos los sistemas de expresión ofrecidos se
centran en los tipos de plásmidos o en la levadura a utilizar. Sin
embargo, todas estas levaduras tienen el mismo inconveniente que
una levadura silvestre, ya que únicamente presentan modificaciones
a uxotróficas (requerimientos de aminoácidos), y en ningún caso se
ha descrito un sistema de expresión utilizando organismos
modificados que sin alterar o modificar la expresión de proteínas,
faciliten la rotura celular, y la liberación y purificación de las
proteínas expresadas.
Finalmente, en la levadura S. pombe
existen cuatro genes bgs que codifican cuatro proteínas Bgs
homólogas, cada una esencial para la supervivencia de la célula.
Estas proteínas constituyen distintas subunidades o posibles
subunidades catalíticas de la actividad
(1,3)-\beta-D-glucán
sintasa. Sin embargo, de todas ellas, únicamente Bgs4p posee un
papel esencial en el mantenimiento de la integridad de la pared
celular, y por tanto, de la propia célula. Este hecho puede abrir
nuevas posibilidades de levaduras modificadas genéticamente que
permitirían el aislamiento de orgánulos celulares o la expresión de
proteínas heterólogas y su fácil extracción y purificación.
La presente invención se enfrenta al problema de
proporcionar nuevas herramientas y procedimientos para la expresión
y obtención de proteínas heterólogas de interés comercial mediante
ingeniería genética.
La solución proporcionada por esta invención se
basa en que los inventores han observado que es posible mantener la
expresión de proteínas heterólogas de interés industrial en hongos
filamentosos y levaduras modificadas genéticamente simultáneamente
con la capacidad para inducir de forma controlada la rotura y lisis
celular debido al debilitamiento de su pared celular mediante la
represión de la expresión del gen responsable de la síntesis
mayoritaria del componente estructural
(1,3)\beta-D-glucano de la
pared celular.
Así, un objeto de la presente invención lo
constituye una levadura autolítica con una pared frágil modificada
genéticamente, en adelante levadura bgs4\Delta de la
presente invención que, aunque presenta una deleción de su gen
bgs4 (bgs4\Delta), se mantiene como silvestre porque
contiene una construcción genética o un vector de expresión que
incluye, al menos, un promotor regulable, preferentemente
reprimible por un compuesto químico, y una secuencia de nucleótidos
bsg4^{+} que permite la producción regulada de una
proteína con actividad
(1,3)\beta-D-glucánsintasa,
en adelante Bgs4p, y que es compatible con la expresión de una
proteína heteróloga de interés industrial.
Un objeto particular de la invención lo
constituye una levadura bgs4\Delta cepa S. pombe
bgs4::ura4^{+} leu1-32
ura4-\Delta18 his3-\Delta1 pJG19
(cepa bgs4\Delta pJG19, CECT nº 13000); cepa
bgs4\Delta pJG33, ver Ejemplo 1.2, CECT nº 13002) y las
cepas S. pombe revertientes viables bgs4::ura4^{+}
leu1-32 ura4-\Delta18
his3-\Delta1 (cepa bgs4\Delta revertiente,
CECT nº 13001).
Otro objeto de la presente invención lo
constituye un procedimiento de obtención de las levaduras
bgs4\Delta, en adelante procedimiento de obtención de las
levaduras bgs4\Delta de la presente invención, por técnicas
habituales de ingeniería genética de levaduras que permitan
eliminar o alterar la expresión natural de bgs4^{+} de
modo que se consiga una lisis celular regulada a voluntad como
consecuencia de la ausencia de la actividad de la proteína
codificada por bgs4.
Finalmente, otro objeto de la invención lo
constituye el uso de las levaduras bgs4\Delta de la
presente invención en un procedimiento de expresión y purificación
de proteínas heterólogas, en adelante uso de las levaduras
bgs4\Delta de la presente invención.
La presente invención se basa en que los
inventores han observado que es posible mantener la expresión de
proteínas heterólogas de interés industrial en hongos filamentosos
y levaduras modificadas genéticamente simultáneamente con la
capacidad para inducir de forma controlada la rotura y lisis
celular debido al debilitamiento de su pared celular mediante la
represión de la expresión del gen responsable de la síntesis
mayoritaria del componente estructural de la pared celular
(1,3)\beta-D-glucano.
Por otro lado, los propios inventores, a lo
largo de un trabajo de caracterización de las glucan sintasas de
Schizosaccharomyces pombe y descrito finalmente en la
presente invención, observaron que, entre las cuatro distintas
isoformas, la actividad de la subunidad catalítica Bgs4p es la más
activa a la hora de su participación en la integridad de la pared
celular fúngica. Así, encontraron que la proteína Bgs4p es esencial
para la célula, implicada en la síntesis del
(1,3)\beta-D-glucano de la
pared celular fúngica, al igual que sus homólogas Fks1p de otras
levaduras y hongos filamentosos (Castro. C. et al., 1995, J.
Bacteriol., 177: 5732-5739. Mazur, P. et al.,
1995, Mol. Cell Biol., 15: 5671-5681. Douglas, C.
M. et al. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:
12907-12911. Zhao, C. et al., 1998, Mol. Cell
Biol., 18: 1013-1022. Inoue, S. B. et al.,
1995, Eur. J. biochem., 231: 845-854. Thompson, J.
R. et al. 1999, J. Bacteriol., 181: 444-453.
Mio, T. et al., 1997, J. Bacteriol., 179:
4096-4105. Schimoler-O'Rourke, R.,
et al., 2003, Curr. Microbiol., 46: 408-412.
Leon, M. et al., 2002, Yeast, 19: 1003-1014.
Kelly, R., et al., 1996, J. Bacteriol., 178:
4381-4391. Douglas, C. M., et al., 1 997,
Antimicrob. Agents Chemother., 41: 2 471-2479.
Beauvais, A. et al., 2001, J. Bacteriol., 183:
2273-2279. Pereira, M. et al., 2000, Yeast,
16: 451-462. Schimoler-O'Rourke, R.
et al., 2003, Curr. Microbiol., 46: 408-412.
Kottom, T. J. y Limper, A. H., 2000, J. Biol. Chem., 275:
40628-40634) lo que permitió crear nuevas
estrategias para la expresión y purificación de proteínas
heterólogas en levaduras y hongos
filamentosos.
filamentosos.
Como se ha demostrado en la presente invención
la ausencia de la proteína Bgs4p produce la lisis de levaduras y
hongos filamentosos sin producir otro tipo de alteraciones
celulares como sería el caso de proteínas implicadas en rutas de
regulación celular. También tiene la ventaja de que la lisis no está
promovida por una alteración termosensible de la proteína, de modo
que se evita cualquier tipo de alteración de rutas y expresiones
como consecuencia de un estrés térmico al elevar la temperatura de
crecimiento. Este proceso es ajeno a cualquier manipulación o
alteración interna de la célula que pudiera afectar el rendimiento
o la estabilidad de la proteína heteróloga expresada.
Por lo tanto, una cepa carente del gen
bgs4^{+} puede ser de gran utilidad biotecnológica como
organismo para acceder al contenido intracelular de un modo menos
drástico y conseguir así el acceso a diversos sistemas u órganos
subcelulares y su eventual purificación o la expresión y
purificación de proteínas solubles y no solubles heterologas no
secretadas al medio de cultivo por el sistema. Este método es
aplicable a todas las levaduras y hongos filamentosos, aunque por
facilidad de cultivo, las levaduras son los organismos idóneos.
Así, un objeto de la presente invención lo
constituye una levadura autolítica con una pared frágil modificada
genéticamente, en adelante levadura bgs4\Delta de la
presente invención que, aunque presenta una deleción de su gen
bgs4 (bgs4\Delta), se mantiene como silvestre porque
contiene una construcción genética o un vector de expresión que
incluye, al menos, un promotor regulable, preferentemente
reprimible por un compuesto químico, y una secuencia de nucleótidos
bsg4^{+} que permite la expresión regulada de una proteína
con actividad
(1,3)-\beta-D-glucán
sintasa, en adelante Bgs4p, y que es compatible con la expresión de
una proteína heteróloga de interés industrial.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "levadura modificada genéticamente" se refiere a
levaduras y hongos filamentosos de uso industrial en el sector de
la biotecnología, transformadas, transfectadas o modificadas por
cualquiera de las técnicas habituales en el sector de la técnica
(Ito, H., et al., 1983, J. Bacteriol., 153:
163-168. Elbe, R., 1992, Biotechniques, 13:
18-20. Gietz, R. D., et al. 1995, Yeast, 11:
355-360. Pichia Protocols: Methods in
Molecular Biology. 1998. Higgins, D.R. and Cregg, J. (Eds.). The
Human Press, Totowa, NJ. 284 pp.), para ser utilizadas como sistemas
de expresión de proteínas heterólogas (Nohr, J. et al.,
2003, Protein expression in yeasts, in Methods in Molecular
Biology. Protein Misfolding and Disease: Principies and Protocols.
Bross, P. and Gregersen, N. (Eds.). Human Press, Inc.Totowa, NJ,
111-126) y que pertenecen entre otras, a título
ilustrativo y sin pretender limitar el alcance de la invención, al
siguiente grupo: S. pombe, S. cerevisiae, Pichia pastoris,
Pichia methanolica, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis,
Yarrowia lipolytica, Ctyptococcus neoformans y Pneumocystis
carinii; y en las que un gen específico ha sido alterado
mediante las técnicas clásicas de Biología Molecular de levaduras y
hongos filamentosos, de modo que su expresión ha sido alterada,
preferentemente el gen cuya proteína tiene una similar o
equivalente a la función de la proteína codificada por el gen
bgs4^{+}. Esta modificación puede dar lugar a la supresión
de la expresión del gen, mediante la eliminación de la secuencia
codificante y reemplazamiento por un marcador de selección, o a la
expresión controlada del gen mediante la sustitución de su promotor
natural por un promotor regulable a voluntad por medio de la
adición o eliminación de algún compuesto químico del medio de
cultivo. La modificación en la expresión génica se puede realizar a
través de plásmidos autónomos, plásmidos integrativos o bien
remplazando la secuencia promotora del gen de interés.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "secuencia de nucleótidos bsg4" se refiere a la
secuencia de nucleótidos del gen bgs4^{+}, preferentemente
la secuencia contenida en la SEQ ID NO1 (entre los nucleótidos 10 y
5877) - la SEQ ID NO1 es la secuencia codificante de
bgs4^{+} modificada con extremos XhoI anterior al
codón de inicio y PstI posterior al codón de terminación
para su clonación el el plásmido reprimible por tiamina conteniendo
la versión de baja expresión 81X del promotor nmt1^{+};
secuencia disponible en GeneDB: http://www.genedb.orq/
accediendo al organismo S. pombe y buscando bgs4,
localizado en el cósmido SPCC1840.02c - así como a secuencias de
nucleótidos análogas a dicha secuencia bgs4 codificantes de
proteínas Bgs4p homólogas, nativas o modificadas con actividad
(1,3)-\beta-D-glucán
cintaza (como por ejemplo la SEQ ID NO2). Tal como se utiliza en la
presente invención el término "análoga" pretende incluir a
cualquier secuencia de ADN que puede ser aislada o construida, por
ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos
conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o
más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera
de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más
nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia. E
n general, una molécula de ADN análoga es sustancialmente homóloga
a la secuencia de nucleótidos descrita. En el sentido utilizado en
esta descripción, la expresión "sustancialmente homóloga"
significa que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un
grado de identidad, a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 40%,
preferentemente de, al menos un 80%, o más preferentemente de, al
menos, un 95%.
En este sentido, y a diferencia de S.
pombe, que contiene cuatro genes esenciales bgs, existen
otros organismos, por ejemplo Yarrowia lipolytica, Ciyptococcus
neoformans o Pneumocystis carinii que contienen un único
gen también esencial para el mantenimiento de la integridad de la
pared del organismo, denominado FKS1, cuya proteína Fks1p
presenta un 50-60% de identidad con el resto de
proteínas Fks y Bgs de otros organismos (Thompson, J. R. et
al. 1999, J. Bacteriol., 181: 444-453. Leon, M.
et al., 2002, Yeast, 19: 1003-1014. Kelly,
R., et al., 1996, J. Bacteriol., 178:
4381-4391; Kottom, T. J. y Limper, A. H., 2000, J.
Biol. Chem., 275: 40628-40634). De la misma forma a
las levaduras realizadas en la presente invención, y atendiendo al
estado de la técnica, un experto medio en la materia puede
construir y utilizar cepas fks1\Delta, mantenidas con un
plásmido regulable que exprese FKS1 en cada caso, de modo
que mantenga a las células viables cuando la expresión esté inducida
e induzca la lisis celular cuando se reprima su expresión. Por todo
ello, en la presente invención tal como se utiliza el termino
"gen bgs4" se refiere igualmente al gen FKS1, a
secuencias de nucleótidos análogas a FKS1 codificantes de la
proteína Fks1p y a sus formas análogas.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "promotor regulable, preferentemente reprimible, por un
compuesto químico" se refiere cualquier tipo de promotor
regulable que se conozca o pueda describirse en el futuro dentro
del área de las levaduras y hongos filamentosos, y en concreto un
promotor reprimible por un compuesto químico, entre otros, tiamina
(vitamina B1) (Maundrell, K., 1990, J. Biol. Chem. 165:
10857-10864; Forsburg, S., 1993, Nucleic Acids Res.
21: 2955-2956; Moreno, M.B. et al., 2000,
Yeast 16: 861-872), cobre (Bellemare, D.R., et
al., 2001, Gene, 273: 191-198), tetraciclina
(Faryar, K. y Gatz, C., 1992, Curr. Genet., 21:
345-349. Gari E., et al., 1997, Yeast 13:
837-848. Belli G., et al., 1998, Nucleic
Acids Res. 26: 942-947. Belli, G., et al.,
1998, Yeast 14: 1127-1138), sacarosa/glucosa
(lacovoni, J.S., et al., 1999, Gene 232:
53-58), glucosa/otras fuentes de carbono (Hoffman,
C.S. y Winston, F., 1989, Gene 84: 473-479),
maltosa/glucosa (Yao, B., et al., 1993, Gene 137:
223-226. Finley, R.L., et al., 2002, Gene
285: 49-57), \beta-estradiol
(Gao, C.Y. y Pinkham, J.L., 2000, Biotechniques 29:
1226-1231), galactosa/glucosa (Ludwig, D.L., et
al., 1993, Gene 132: 33-40. Sil, A.K., et
al., 2000, Protein Expr. Purif., 18: 202-212.
Farfan, M.J., et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 1
10-116), metanol/glucosa (Tschopp, J. F., et
al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:
3859-3876. Pichia Protocols: Methods in Molecular
Biology. 1998. Higgins, D.R. and Cregg, J. (Eds.). The Human Press,
Totowa, NJ. 284 pp. Sears, I.B., et al., 1998, Yeast 14:
783-790. Shen, S., et al., 1998, Gene 216:
93-102), lactosa, xilosa, peptona, etc. (Cereghino,
G.P. y Cregg J.M., 1999, Curr. Op. Biotechnol. 10:
422-427. Cereghino, J.L. y Cregg J.M., 2000, FEMS.
Microbiol. Rev. 24: 45-66).
Un objeto particular de la invención lo
constituye una levadura bgs4\Delta de la presente
invención caracterizada porque contiene un plásmido (multicopia)
que permite la expresión de la proteína Bgs4p y que puede ser
regulado porque contiene un promotor reprimible por un compuesto
químico, por ejemplo por tiamina (versión 81X del promotor
nmt1^{+}). Una realización concreta de una levadura de este
tipo es la cepa descrita en la presente invención: cepa S.
pombe bgs4::ura4^{+}
leu1-32 ura4-\Delta18
his3-\Delta1 pJG19 (cepa bgs4\Delta pJG19,
ver Ejemplo 1.1, CECT nº 13000).
Otro objeto particular de la invención lo
constituye una levadura bgs4\Delta de la presente
invención caracterizada porque contiene integrado en su cromosoma,
y por lo tanto estable, una secuencia de nucleótidos
bgs4^{+} (plásmido monocopia o integrativo) que permite la
expresión de la proteína Bgs4p y que puede ser regulado porque
contiene un promotor reprimible por un compuesto químico, por
ejemplo por tiamina (versión 81X del promotor nmt1^{+}).
En concreto una levadura de este tipo es la cepa descrita en la
presente invención como realización particular, cepa S.
pombe bgs4::ura4^{+} leu1-32
ura4-\Delta18 his3-\Delta1 pJG33 (cepa
bgs4\Delta pJG33, ver Ejemplo 1.2, CECT nº 13002) y las
cepas S. pombe revertientes viables bgs4::ura4^{+}
leu1-32 ura4-\Delta18
his3-\Delta1 (cepa bgs4\Delta revertiente
ver Ejemplo 1.3, CECT nº 13001).
A partir de la información descrita en la
presente invención y al conocimiento del estado de la técnica
pueden desarrollarse otras levaduras bgs4\Delta de la
presente invención por parte de un experto medio del sector de la
invención atendiendo a necesidades o conveniencias específicas del
tipo de levadura, condiciones de cultivo, péptido o proteína
heteróloga de interés comercial, vectores de expresión
seleccionado, etc y pertenecen al ámbito de la presente invención.
Así, otra realización particular de la invención lo constituye una
levadura bgs4\Delta de la presente invención caracterizada
porque contiene además la auxotrofía Ura^{-}(cepa
bgs4\Delta Ura^{-}, ver Ejemplo 1.4).
Un cultivo de la levadura S. pombe
bgs4::ura4^{+} leu1-32
ura4-\Delta18 his3- \Delta1 pJG19 (cepa
bgs4\Delta pJG19), S. pombe bgs4::ura4^{+}
leu1-32 ura4-\Delta18
his3-\Delta1 pJG33 (cepa bgs4\Delta pJG33)
y S. pombe bgs4::ura4^{+}
leu1-32 ura4-\Delta18
his3-\Delta1 (cepa bgs4\Delta revertiente)
han sido depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo
(CECT), Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus
de Burjasot, 46100 Burjasot, Valencia, España, el 19 de Febrero de
2004, correspondiéndole, el número de depósito CECT 13000, 13002 y
13001, respectivamente.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye un procedimiento de obtención de las levaduras
bgs4\Delta, en adelante procedimiento de obtención de las
levaduras bgs4\Delta de la presente invención, por técnicas
habituales de ingeniería genética de levaduras que permitan
eliminar o alterar la expresión natural de bgs4^{+} de
modo que se consiga una lisis celular regulada a voluntad como
consecuencia de la ausencia de la actividad de la proteína
codificada por bgs4.
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye el procedimiento de obtención de las levaduras
bgs4\Delta de la presente invención, preferentemente
levaduras bgs4\Delta pJG19, y más preferentemente S.
pombe bgs4\Delta pJG19, constituido por las siguientes
etapas:
- a)
- obtención de una levadura diploide bgs4\Delta/bgs4^{+} mediante la disrupción de la secuencia entera de lectura de bsg4^{+} de la levadura original, preferentemente S. pombe, por reemplazamiento con otro marcador de selección como por ejemplo el gen ura4^{+} que permite la selección en medio Ura^{-},
- b)
- transformación del diploide de a) mediante un vector multicopia o episómico de expresión génica, preferentemente un plásmido, que contiene una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína con actividad Bgs4, preferentemente el plásmido pJG19 (marcador de selección LEU2 de Saccharomyces cerevisiae que complementa leu1-32 de S. pombe pero no se recombina ni integra por no ser las mismas secuencias) que permite la selección en un medio carente de leucina (Leu^{-}),
- c)
- inducción de la esporulación y obtención a partir de las esporas de la levaduras bgs4\Delta pJG19 seleccionando clones con la deleción y el plásmido mediante crecimiento en un medio carente de uracilo (para la deleción) y leucina (para el plásmido) (Ura^{-}, Leu^{-}), y
- d)
- Comprobación de la deleción bgs4\Delta por técnicas clásicas de biología molecular (PCR, hibridación de DNA) y comprobación en un medio Ura^{-}, Leu^{-} y en presencia de tiamina que la expresión de bgs4 del plásmido se reprime y se produce la lisis de la cepa seleccionada.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el procedimiento de obtención de las levaduras
bgs4\Delta de la presente invención, preferentemente
levaduras bgs4\Delta pJG33 y más preferentemente S.
pombe bgs4\Delta pJG33, constituido por las siguientes
etapas:
- a)
- Transformación de una cepa leu1-32 ura4-\Delta18 his3-\Delta1 con el plásmido pJG33,
- b)
- Cruce genético de esta cepa con bgs4\Delta pJG19 y selección de esporas en medio Ura^{-} His^{-} para obtener una cepa bgs4\Delta pJG33,
- c)
- Comprobación de la ausencia de pJG19 en este clon analizando el fenotipo de ausencia de crecimiento en medio Leu^{-},
- d)
- Crecimiento repetido de la cepa en medio con histidina para eliminar la presión selectiva del plásmido y reaislamiento de clones en medio His^{-} para enriquecer la población con clones en los que se ha producido la integración del plásmido,
- e)
- Cruce genético de uno de los clones reaislados con una cepa leu1-32 ura4-\Delta18 his3-\Delta1 de sexo complementario, y análisis de tétradas para seleccionar un clon en los que la marca His^{+} de pJG33 segregue 2+:2-, indicativo de haberse integrado el plásmido, y
- f)
- Cruce genético con el clon integrado y una cepa his3^{+}, por ejemplo leu1-32 ura4-\Delta18, para comprobar que el marcador His^{+} segrega 4+:4-, indicativo de la integración del plásmido en la zona del gen his3^{+}.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el procedimiento de obtención de las levaduras
bgs4\Delta de la presente invención, preferentemente
levaduras bgs4\Delta revertientes y más preferentemente
S. pombe bgs4\Delta revertiente, constituido por
las siguientes etapas:
- a)
- Crecimiento de las cepas anteriores bgs4\Delta con pJG19 o pJG33 en medio en presencia de tiamina (el medio completo también es válido porque contiene tiamina) para inducir la represión de la expresión de bgs4\Delta y la aparición de células supervivientes revertientes,
- b)
- Recrecimiento y reaislamiento de clones supervivientes en presencia de tiamina, y
- c)
- Cruce genético con una cepa leu1-32 ura4-\Delta18 his3-\Delta1 y seleccione de clones Leu^{-} His^{-} Ura^{-} indicativo de la ausencia de cualquiera de ambos plásmidos y la presencia de la deleción bgs4\Delta. Estas células son esféricas, gigantes y son muy frágiles.
Finalmente, otro objeto de la invención lo
constituye el uso de las levaduras bgs4\Delta de la
presente invención en un procedimiento de expresión y purificación
de proteínas heterólogas, en adelante uso de las levaduras
bgs4\Delta de la presente invención.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "proteína heteróloga" se refiere a cualquier proteína
o péptido de interés comercial, de distinto origen (eucariota,
procariota, viral, etc), perteneciente entre otros, y a título
ilustrativo y sin limitar el alcance de la presente invención, al
siguiente grupo: enzimas, anticuerpos monoclonales, factores de
crecimiento, citocinas, hormonas, proteínas y péptidos de
aplicación en el sector alimentario, por ejemplo pepsina,
transglutaminasa, etc; agentes terapéutico, por ejemplo
IGF-I, antígenos inmunogénicos para la elaboración
de vacunas, etc.
Un objeto particular de la invención lo
constituye el uso de las levaduras bgs4\Delta de la
presente invención en un procedimiento de expresión y purificación
de proteínas heterólogas, en adelante uso de las levaduras
bgs4\Delta de la presente invención en un procedimiento de
expresión y purificación de proteínas heterólogas de la invención,
que comprende los siguientes pasos:
- a)
- transformación de la levadura bgs4\Delta de la invención, preferentemente una levadura bgs4\Delta pJG19 ó bgs4\Delta pJG33, y más preferentemente la levadura bgs4\Delta pJG19 CECT nº 13000 ó la levadura bgs4\Delta pJG33 CECT nº 13002, con un vector de expresión, preferentemente un plásmido, que contiene una secuencia de nucleótidos codificante de la proteína heteróloga de interés,
- b)
- crecimiento de la levadura de a) en un medio de cultivo que no contenga el componente químico que actúa como represor del promotor, preferentemente entre otros nmt1^{+}, que regula la expresión de bgs4^{+} hasta conseguir la masa celular deseada y manteniéndose el cultivo en fase de crecimiento exponencial,
- c)
- dilución del medio de cultivo e inducción de la represión del promotor, preferentemente entre otros nmt1^{+}, mediante la adición del compuesto químico represor (tiamina o vitamina B1 en el caso de nmt1^{+}) al medio de cultivo (medio mínimo) o mediante el cambio de medio de las células de medio mínimo a un medio complejo (YES), que contiene dicho represor de por sí y por lo tanto, induce en unas horas (20-22) la lisis celular, y
- d)
- obtención y purificación de la proteína heteróloga del medio de cultivo por medios estándares.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el uso de las levaduras bgs4\Delta de la
presente invención en un procedimiento de expresión y purificación
de proteínas heterólogas de la invención, cuando no se desea que la
proteína heteróloga se libere al medio de cultivo (por ejemplo, por
inestabilidad o por susceptibilidad a la degradación), en el que el
opcionalmente el punto c) puede realizarse de la siguiente
forma:
- -
- el crecimiento de las levaduras con el compuesto represor (c) se realiza durante un tiempo menor al que provoca una lisis mayoritaria (por ejemplo 14-15 horas) para evitar la rotura de las células,
- -
- aplicación de un tratamiento de rotura celular que siempre será mucho más suave que el tratamiento convencional aplicado a las células de levaduras silvestres y que consiste en, por ejemplo, a título ilustrativo y sin limitar el alcance de la invención, rotura mecánica con bolas de vidrio, aumento de la presión en una prensa, etc.), y finalmente
- -
- obtención y purificación de la proteína heteróloga del medio de cultivo.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el uso de las levaduras bgs4\Delta de la
presente invención en un procedimiento de expresión y purificación
de proteínas heterólogas de la invención, cuando no se desea que la
proteína heteróloga se libere al medio de cultivo, que se realiza de
la siguiente forma:
- -
- la transformación de la levadura bgs4\Delta de la invención, preferentemente una levadura bgs4\Delta revertiente, y más preferentemente la levadura bgs4\Delta revertiente CECT nº 13001, con un vector de expresión, preferentemente un plásmido, que contiene una secuencia de nucleótidos codificante de la proteína heteróloga de interés (a),
- -
- el crecimiento de la levadura transformada bgs4\Delta revertiente se realiza en un medio normal hasta la masa celular deseada,
- -
- se aplica un tratamiento suave de rotura celular, por ejemplo, a titulo ilustrativo y sin limitar el alcance de la invención, rotura mecánica con bolas de vidrio, aumento de la presión en una prensa, etc.), y finalmente
- -
- se obtiene y se purifica la proteína heteróloga del medio de cultivo, por medios estándares.
En la Figura 1 se muestra una curva de
crecimiento en medio mínimo (32ºC) de las cepas de S. pombe
silvestre y bgs4\Delta transformada con el plásmido pJG19
(promotor nm1^{+}-81X y secuencia de
bgs4^{+}) en ausencia (inducido) y en presencia de tiamina
(reprimido). Aunque el crecimiento se interrumpe a partir de las 14
horas, la lisis celular no es mayoritaria hasta las
18-22 horas.
En la Figura 2 se muestra el fenotipo de lisis
en los polos (durante el crecimiento apical) o en la zona del septo
(finalizada la septación) a las 18 horas de crecimiento de la cepa
bgs4\Delta pJG19 en presencia de tiamina (represión de la
expresión de bgs4^{+} del plásmido pJG19). Las células
están observadas mediante microscopía de contraste de fases (campo
claro) y microscopía de tinción específica del septo y la pared
celular con el fluorocromo Calcofluor White (campo oscuro).
En la Figura 3 se muestra el fenotipo de las
células revertientes bgs4\Delta, obtenidas tras inducir la
lisis de la cepa bgs4\Delta pJG19 en presencia de tiamina
(represión de la expresión de bgs4^{+} del plásmido pJG19),
seleccionar supervivientes al cabo de 72 horas e inducir la pérdida
del plásmido pJG19 de expresión/represión de bgs4^{+}. Las
células están observadas mediante microscopía de contraste de fases
(campo claro) y microscopía de tinción específica del septo y la
pared celular con el fluorocromo Calcofluor White (campo
oscuro).
En la Figura 4 se muestra un ejemplo de lisis y
liberación al medio de u na proteína heteróloga intracelular tras
inducir la lisis al apagar la expresión de bgs4^{+} en una
cepa bgs4\Delta. Las células fueron analizadas mediante
contraste de fases y mediante fluorescencia para detectar la
presencia de una proteína control marcada con proteína verde
fluorescente (GFP), con objetivos de aumentos 40X y 60X (Figuras 4A
y 4B respectivamente) para mostrar diferentes campos. La proteína
heteróloga utilizada es el homólogo Bgs1 p unido a GFP. Bgs1p es
una proteína integral de membrana que se localiza en polos de
crecimiento y septo (células control con bgs4^{+}
encendido). Tras 22 horas de incubación la lisis era mayoritaria y
la cantidad de Bgs1p-GFP había incrementado
considerablemente, encontrándose en orgánulos repartida por todo el
citoplasma y en agregados discretos liberados al medio tras la lisis
celular. Parte del material se utilizo para observación directa.
Otras dos alícuotas se agitaron en vortex en dos intervalos
separados de 15 minutos, conteniendo una de ellas 1M NaCl. Las
células y el material insoluble liberado se centrifugaron 10
minutos a 13K en una microcentrífuga para concentrar el material.
Las células de lisis control se centrifugaron únicamente 1 minuto.
Las muestras de células y material liberado fueron observadas
mediante microscopía de contraste de fases y fluorescencia como las
células control. La cantidad de material liberado aumentó
ligeramente tras la agitación y fue algo mayor en presencia de
NaCl. La adición de un detergente como Triton-X100
no incrementó la cantidad de material liberado y redujo la
funcionalidad de la proteína y que la fluorescencia apareció
notablemente reducida (datos no mostrados).
En la Figura 5 se muestran los mapas de los
plásmidos de expresión regulable por tiamina (promotor
nmt1^{+}-81X) pJR2-81XL y
pJR1-81XH (Moreno, M.B. et al., 2000, Yeast
16: 861-872) utilizados para la construcción de los
plásmidos pJG19 y pJG33 respectivamente.
\newpage
Ejemplo de
realización
Ejemplo
1
Esta cepa de S. pombe proviene de una
cepa similar excepto sin la auxotrofía his3-\Delta1
y con la auxotrofía ade6-M216, la cual
proviene de esporular el diploide homocigótico
leu1-32/leu1-32
ura4-\Delta18/ura4-\Delta18
ade6-M216/ade6- M216 (diploide creado
por nosotros a partir de dos cepas haploides iguales pero de sexo
contrario y seleccionando cepas diploides fértiles capaces de
esporular espontáneamente) en el que se ha realizado la disrupción
de la secuencia entera de lectura de bgs4^{+}
(bgs4::ura4^{+}, realizado mediante el reemplazamiento de
la secuencia de bgs4^{+} por un fragmento de 1,7 kb que
contiene el gen ura4^{+} y que está flanqueado por
secuencias adyacentes promotoras y terminadoras de
bgs4^{+}, las cuales dirigen la sustitución de
bgs4^{+} mediante recombinación homóloga de los extremos
del fragmento). Posteriormente, el diploide
bgs4\Delta/bgs4^{+} obtenido se transformó con el
plásmido pJG19 y se indujo su esporulación. A partir de dichas
esporas se obtuvieron cepas de levaduras bgs4\Delta
leu1-32 ura4-\Delta18
ade6-M216 haploides mantenidas viables por el
plásmido multicopia pJG19. Las transformáciones de material
genético, tanto para realizar el reemplazamiento genético de
bgs4^{+} como para introducir los distintos tipos de
plásmidos dentro de la levadura, se realizaron mediante la técnica
convencional de transformación con las sales de Acetato de litio
(Elbie, R., 1992, Biotechniques 13: 18-20. Gietz, R.
D., et al., 1995, Yeast 11: 355-360). Se
desarrollaron cepas de ambos tipos sexuales h^{-} y h^{+}, y
con las auxotrofías adicionales ura4-\Delta18
leu1-32 his3-\Delta1
(utilizadas para permitir la selección de la deleción
bgs4::ura4^{+} y la transformación de plásmidos de
expresión con marcador de selección LEU2 o leu1^{+},
e his3^{+}, respectivamente).
El plásmido pJG19 consiste en la secuencia de la
zona de lectura de bgs4^{+}, con los puntos de corte
insertados mediante mutagénesis dirigida XhoI justo antes
del iniciador ATG, y PstI justo después del terminador TAG
(SEQ ID NO1), y clonados en los sitios de corte XhoI -
PstI de la región de sitios únicos para clonación de
pJR2-81XL (Moreno, M.B. et al., 2000, Yeast
16: 861-872). El plásmido pJR2-81XL
contiene el marcador de selección LEU2 de S.
cerevisiae (compatible con leu1-32 de
S. pombe) y una secuencia de doce sitios de clonación únicos
flanqueados por la secuencia promotora y terminadora del promotor
nmt1^{+} (de "no messenger with thiamine"), en su
variedad de más baja expresión 81X, para conseguir la máxima
represión de la expresión de bgs4^{+} (Moreno, M.B. et
al., 2000, Yeast 16: 861-872; Figura 5A).
Esta cepa de S. pombe proviene de un
cruce de la cepa anterior descrita en el ejemplo 1.1. con la cepa
silvestre S. pombe leu1-32
ura4-\Delta18 his3-\Delta1 pJG33 y
selección de clones haploides Ura^{+} (bgs4::ura4^{+}),
His^{+} (pJG33) y Leu^{-} (carentes de pJG19) (Moreno, M.B.
et al., 2000, Yeast 16: 861-872). Además, se
seleccionaron cepas de ambos tipos sexuales h^{-} y h^{+}. Los
cruces genéticos se realizaron mediante técnicas convencionales de
manipulación de levaduras (Moreno, S., et al., 1991, Methods
Enzymol. 194: 795-823) consistentes en crecer las
dos cepas parentales en medio sólido hasta fase estacionaria
temprana, mezclar en agua cantidades iguales de cada cepa,
depositar 10-20 \mul de la mezcla en placas de
esporulación SPA (Egel, R., 1984, Curr. Genet. 8:
199-203), incubar a 28-30ºC durante
dos días hasta que se observan al microscopio ascas maduras
refringentes y algunas ascosporas ya sueltas, micromanipular las
ascas, esperando a que se autolisen para separar las cuatro
ascosporas de cada asca, y analizar los fenotipos de cada colonia
de cada tétrada mediante réplica en las correspondientes placas de
medio selectivo. Se ha comprobado mediante cruces genéticos que esta
cepa contiene integrado de forma estable el plásmido pJG33 en la
zona del marcador delecionado his3-\Delta1. Al igual que
pJG19, el plásmido pJG33 consiste en la secuencia XhoI -
PstI de la zona de lectura de bgs4^{+} de pJG19,
clonada en los sitios XhoI - PstI de
pJR1-81XH. El plásmido pJR1-81XH
contiene el marcador de selección his3^{+} de S.
pombe y una secuencia de doce sitios de clonación únicos
flanqueados por la secuencia promotora y terminadora del promotor
nmt1^{+} en su variedad de baja expresión 81X (Moreno, M.B.
et al., 2000, Yeast 16: 861-872; Figura
5B).
En estas cepas el plásmido está integrado en el
cromosoma del microorganismo y por lo tanto es estable. Además, el
uso de una construcción con el plásmido integrado en el cromosoma
tiene un nivel de apagado más rápido (el número de copias es
menor), lo que acorta el tiempo en el que se produce la lisis
celular.
Esta cepa se ha utilizado para construir
mediante cruce genético la cepa bgs4::ura4^{+}
leu1-32 ura4-\Delta18
his3-\Delta1 bgs1::ura4^{+}
P_{bgs1}^{+}::GFP-bgs1^{+}:leu1^{+}
pJG33 (cepa bgs4\Delta
GFP-bgs1^{+} pJG33), utilizada en el
próximo Ejemplo 3 (ver Figura 4).
Estos clones se obtuvieron a partir de una cepa
que contiene pJG19 (Cepa punto 1.1 anterior), reprimiendo la
expresión de bgs4^{+} en presencia de tiamina y
manteniendo el cultivo durante 3-4 días. Al cabo de
las primeras 20-24 horas en presencia de tiamina
empezaron a aparecer células esféricas en el cultivo. Estas células
son supervivientes a la lisis producida por la ausencia de Bgs4p.
Estas células no pierden el plásmido pJG19, posiblemente por haberse
integrado, y acaban revertiendo a una morfología silvestre debido a
la alteración del promotor nmt1^{+}-81X,
produciendo un mayor nivel de expresión, de modo que produce una
expresión de bgs4^{+} en niveles viables cuando está
reprimido y en niveles letales de alta expresión cuando está
desreprimido. Posteriormente, el plásmido pJG19 se eliminó mediante
cruce genético con una cepa silvestre
leu1-32 ura4-\Delta18
his3-\Delta1 y se seleccionaron varios clones
haploides Ura^{+} (bgs4::ura4^{+}), His^{-} y
Leu^{-} (carentes de plásmido). Estos clones son viables, pero
son muy frágiles y mantienen una morfología esférica (véase la
Figura 3). La pared debilitada de estas células las hace idóneas
para expresar proteínas que no se quieran liberar al sobrenadante y
poder lisar con poco esfuerzo y alta eficiencia el cultivo celular.
Estas cepas lo que tienen integrado es el fragmento
ura4^{+} sustituyendo la secuencia del gen
bgs4^{+}, o sea, tienen la deleción bgs4\Delta,
pero no tienen ninguna construcción de bgs4^{+}. Son
capaces de mantenerse en ausencia de bgs4^{+} probablemente
por activación de algún mecanismo compensatorio, quizá por
hiperactivación de los otros bgs, bgs1^{+} o
bgs3^{+}, o del gen mok1^{+}, que es la subunidad
catalítica de la \alpha(1,3)glucán sintasa, ya que
el \alpha(1,3)glucano de la pared celular también es
esencial para la célula, y sabemos por otros experimentos que
cuando se alteran Bgs4p o Bgs1p (apagado o sobrexpresión) se
produce una superproducción de \alpha-glucano en
la pared, llegando a producir hasta el doble de la cantidad que
normalmente contiene la pared).
Las levaduras de los tres apartados anteriores
se pueden convertir en Ura^{-} Para ello, se crece el cultivo
durante varios días en medio mínimo (líquido o placas) suplementado
con uracilo (3.75 mg/ml). Posteriormente se realizan estrías con
abundante cantidad del cultivo en placas selectivas conteniendo
ácido fluoroorótico (5'-FOA). Estas placas permiten
únicamente el crecimiento de cepas Ura de modo que se seleccionan
aquellos mutantes espontáneos que hayan perdido o inactivado el gen
ura4^{+} utilizado para realizar la deleción
bgs4::ura4^{+}. Al cabo de una semana habrán aparecido
colonias. Se pican las colonias más crecidas y se repite la estría
en nuevas placas de FOA para evitar falsos positivos. De este modo,
también se pueden utilizar plásmidos con el marcador de s elección
URA3 (de S. cerevisiae) o ura4^{+} (de S.
pombe) para expresar la proteína heteróloga y complementar el
fenotipo Ura^{-} adquirido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Las cepas bgs4\Delta (descritas en los
puntos 1 a 4 y extrapolable a otras cepas de levaduras y hongos
filamentosos) permiten conseguir una lisis natural, total y sin
problemas. El crecimiento de las cepas en condiciones de
desrepresión del plásmido nmt1^{+}-81X
tiene que realizarse en un medio definido como el medio mínimo o
EMM (Alfa, C., et al., 1993, Experiments with fission yeast:
a laboratory course manual. Cold Spring Harbor, NY. Cold Spring
Harbor Laboratory Press. Moreno, S., et al., 1991, Methods
Enzymol. 194: 785-823), ya que los medios complejos
(como YES, YEPD, YPAD, etc.) contienen tiamina, lo cual induciría
la lisis celular y la aparición posterior de
revertientes.
revertientes.
Esta represión se puede aplicar tanto en
plásmidos multicopia como en plásmidos monocopia o integrativos,
independientemente del marcador de selección utilizado en los
plásmidos de represión de bgs4^{+}, de los marcadores de
selección utilizados en los plásmidos de expresión de la proteína
heteróloga y de los marcadores auxotróficos disponibles en la cepa
bgs4\Delta.
La lisis del cultivo se consigue simplemente
creciendo la cepa en medio complejo (que contiene tiamina per
se) o en medio mínimo suplementado con tiamina (5 \mug/ml,
dilución 1x4000 de una solución stock en agua de 20 mg/ml) durante
20-22 horas y accediendo de ese modo al contenido
intracelular o permitiendo la recogida de las proteínas expresadas
del sobrenadante del cultivo. La represión del promotor
nmt1^{+}-81X se consigue a partir de las 14
horas de crecimiento en presencia de tiamina. En presencia de
tiamina, el cultivo crece durante las 14 primeras horas igual que
el cultivo control en ausencia de tiamina. A partir de las 14
horas, el cultivo en presencia de tiamina presenta un crecimiento
más lento que el control (véase la Figura 1) y a partir de las
15-16 horas el crecimiento está prácticamente
detenido. A partir de las 18 horas, y durante un corto periodo de
tiempo (puede variar entre 2 ó 4 horas, dependiendo del
experimento) se observa una rápida y progresiva lisis del cultivo.
Las células se lisan por las zonas de síntesis activa de pared
celular, los polos durante el crecimiento apical y alrededor del
septo durante la síntesis del septo y división celular. La lisis
provoca la liberación de todo el contenido citoplásmico de la
célula al medio. En la Figura 2 se observan células vistas en
microscopía de contraste de fases (campo claro) o de tinción con
Calcoflúor (campo oscuro) lisándose tanto por los polos como por el
septo. La tinción con Calcofluor muestra cómo el fluorocromo accede
al interior de la célula, tiñendo todo el citoplasma, a la vez que
muestra una tinción del material citoplásmico liberado al exterior
de la célula. En la Figura 4 se observa mediante microscopía de
contraste de fases y de fluorescencia cómo incluso una proteína
integral de membrana, marcada con una fusión fluorescente, se libera
eficientemente al medio de cultivo.
Para realizar la expresión de proteínas
heterólogas, se puede utilizar cualquiera de las cepas descritas
anteriormente, como por ejemplo la cepa bgs4\Delta pJG19 o
la cepa bgs4\Delta pJG33, dependiendo del marcador
selectivo que contenga el plásmido de expresión de la proteína
heteróloga correspondiente. Si el plásmido lleva el marcador de
selección LEU2 (de S. cerevisiae) o leu1^{+}
(de S. pombe) se transformará la cepa bgs4\Delta
pJG33. Si el plásmido lleva el marcador his3^{+}, se
transformará la cepa bgs4\Delta pJG19. En caso de usarse un
plásmido con el marcador de selección URA3 (de S.
cerevisiae) o ura4^{+} (de S. pombe), se
obtendrán previamente cepas Ura^{-} (véase apartado 1.4 de
obtención de
cepas).
cepas).
Para expresar la proteína heteróloga se pueden
utilizar cualquiera de las técnicas actualmente disponibles en el
mercado, como fusiones a epítopos (hemaglutinina HA,
c-myc, poli-histidinas 6xHis, FLAG,
glutation S-transferasa GST, GFP, etc), uniones con
secuencias de aminoácidos con puntos de corte específicos de
reconocimiento por proteasas específicas, purificación por afinidad
utilizando anticuerpos específicos contra la proteína o contra el
epítopo fusionado, etc.
Una vez transformada la cepa
bgs4\Delta, por ejemplo pJG19 o pJG33, con el plásmido de
expresión de la proteína heteróloga de interés correspondiente, se
crece en medio mínimo líquido EMM (Alfa, C., et al., 1993,
Experiments with fission yeast: a laboratory course manual. Cold
Spring Harbor, NY. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Moreno, S.,
et al., 1991, Methods Enzymol. 194:
785-823). En este caso no es necesario suplementar
el medio con aminoácidos ya que las tres auxotrofías iniciales de
la cepa están complementadas por los marcadores de los dos
plásmidos (LEU2 o leu1^{+} e his3^{+}) y
por el marcador utilizado para seleccionar la deleción de
bgs4 (ura4^{+}). El crecimiento se mantiene
aumentando el volumen de cultivo hasta conseguir la masa celular
deseada. El cultivo debe mantenerse en fase logarítmica de
crecimiento, ya que la lisis celular sólo se consigue durante el
crecimiento activo. Una buena densidad de crecimiento celular puede
ser 1-2 x 10^{7} células/ml.
Posteriormente se induce la represión de
bgs4^{+} regulado por el promotor
nmt1^{+}-81X. Para ello, se diluye el
cultivo y se añade tiamina a una concertación de 5 \mug/ml
(dilución 1x4000 de una solución stock en agua de 20 mg/ml).
Durante las siguientes 14 horas el cultivo seguirá creciendo, lo que
supone que el cultivo podrá crecer otras cuatro generaciones, y a
partir de entonces el crecimiento se frenará hasta pararse, aunque
todavía crecerá algo durante las horas siguientes. Por lo tanto, el
cultivo inicial antes de añadir tiamina tiene que ser diluido
teniendo en cuenta que cuando las células se lisen el cultivo tendrá
de 16 a 32 veces más células que las inoculadas y el cultivo debe
permanecer en fase logarítmica de crecimiento para permitir la lisis
celular. Otra alternativa para inducir la represión de la expresión
de bgs4^{+} consiste en transferir las células (con o sin
centrifugación previa) a medio complejo (YES, YEPD, etc.). Este
medio contiene tiamina y producirá la represión de la expresión de
bgs4^{+}.
A partir de las 19 horas de crecimiento en
presencia de tiamina, se controla a intervalos de 30 minutos el
estado de las células del cultivo mediante observación directa al
microscopio. Normalmente durante la siguiente hora o dos horas la
mayoría del cultivo se ha lisado.
En ese punto, se procesa el lisado para acceder
a los orgánulos o sistemas subcelulares deseados o se centrifuga el
cultivo para recoger el sobrenadante y proceder a la purificación
de la proteína heteróloga correspondiente.
Dependiendo del interés en que la proteína
heteróloga no se libere al medio de cultivo, pueden utilizarse dos
alternativas a este protocolo:
a) Crecimiento de las levaduras con tiamina (5
\mug/ml) a tiempos menores (13-14 horas). En este
punto, las células aún no se han lisado pero están muy debilitadas.
Estas células permiten la expresión de proteínas y posterior rotura
celular de un modo mucho más fácil que una cepa silvestre, ya que
poseen una pared celular parcialmente debilitada, mediante algunos
de los tratamientos de rotura celular ya existentes (rotura
mecánica con bolas de vidrio, aumento de la presión en una prensa,
etc.). Las células se romperán con mayor facilidad que las de
cultivos convencionales, por lo que el rendimiento será mayor.
Esto serviría por ejemplo, para aquel tipo de
proteínas que fueran susceptibles a las proteasas existentes en el
medio de cultivo o para purificar orgánulos o sistemas subcelulares
activos, que pudieran inactivarse, degradarse o descomponerse una
vez que la célula se hubiera muerto y lisado.
b) Otra alternativa consiste en realizar la
expresión con la cepa revertiente bgs4\Delta. En este caso
la ventaja es que el cultivo puede mantenerse en cualquier tipo de
medio, independientemente de la presencia de tiamina (descrita en
el Ejemplo 1.3). Además, estas cepas revertientes, al carecer de
plásmido regulando la expresión de bgs4^{+}, permiten el
uso de plásmidos con los promotores
nmt1^{+}-41X y
nmt1^{+}-3X para sobreexpresión de
proteínas heterólogas. Estos plásmidos tienen unos niveles de
expresión mucho mayores que los que utilizan la versión
nmt1^{+}-81X, y permiten obtener
expresiones altas o extremadamente altas de proteínas cuando están
desreprimidos, y la versión nmt1^{+}-3X
produce una expresión considerablemente alta incluso en condiciones
de represión. Estas células revertientes de bgs4\Delta son
viables, pero con un fenotipo débil, esférico, lo que facilita su
lisis o rotura celular.
La fragilidad de esta cepa revertiente
bgs4\Delta permite obtener un alto rendimiento de
recuperación de proteínas celulares con cualquier procedimiento
habitual de rotura celular (rotura mecánica con bolas de vidrio,
aumento de la presión en una prensa, etc.). En la Figura 3 se
muestra la morfología de cultivos de células esféricas revertientes
de bgs4\Delta. Normalmente, las células que muestran una
fragilidad en la integridad de su pared, ya sea debido a mutaciones
o a tratamientos en concentraciones subletales de antifúngicos
específicos de pared, muestran una protección y mejoría morfológica
cuando son incubadas en un medio estabilizado osmóticamente (como
por ejemplo, un medio suplementado con 1.2 M sorbitol), ya que este
medio compensa parte de la presión interna que origina el
hinchamiento y lisis celular cuando la pared está debilitada. Sin
embargo, estas células revertientes de bgs4\Delta están
tan debilitadas que mantienen la misma fragilidad incluso en
presencia de 1.2 M sorbitol.
\newpage
Ejemplo
3
Un ejemplo de expresión de proteínas heterólogas
se muestra en la Figura 4. Para ello, se ha utilizado la cepa
bgs4\Delta GFP-bgs1^{+} pJG33
obtenida tal como se describe en el ejemplo 1.2. Esta cepa expresa
una fusión funcional de la proteína homóloga Bgs1p y la proteína
fluorescente GFP (SEQ ID NO4) codificada por la secuencia de
nucleótidos GFP-Bspl (SEQ ID NO3). La secuencia de
nucleótidos de bgs1^{+} (codificante y secuencias
contiguas) está disponible en GeneDB:
http:I//www.genedb.org/ accediendo al organismo S.
pombe y buscando bgsl o cpsl, localizado en el cósmido
SPBC19G7.05c) (Cortés, J.C., I shiguro, J., Durán, A. and Ribas,
J.C. (2002) J. Cell Sci. 115, 4081-4096). Bgslp es
una proteína integral de membrana que en condiciones normales se
localiza en los polos de crecimiento o en el septo (células control
con bgs4^{+} encendido, Figura 4A.1). Cuando se reprime la
expresión de bgs4^{+} la cantidad de
GFP-Bgs1p aumenta, quedándose parte en los orgánulos
del citoplasma. Así, cuando la ausencia de bgs4^{+}
origina la lisis, la mayoría de GFP-Bgs1p se libera
al medio de cultivo, aunque parte puede permanecer retenida en la
célula, que correspondería principalmente a la proteína que estaba
asociada a la membrana citoplásmica.
Las células bgs4\Delta
GFP-bgs1^{+} pJG33 se mantuvieron en fase
logarítmica de crecimiento a 28ºC en medio mínimo con tiamina
(represión de la expresión de bgs4^{+}) y la lisis fue
controlándose a distintos tiempos mediante observación directa al
microscopio durante 22 horas. En estas condiciones la lisis celular
es muy elevada. Tiempos mayores de incubación da lugar al
enriquecimiento del cultivo con células revertientes.
Posteriormente se tomaron tres alícuotas de 1 ml del cultivo de
lisis. Una alícuota se dejó tal cual. Una segunda alícuota se
sometió a dos tratamientos de agitación de 15 minutos con 5 minutos
de reposo entre medias. La tercera alícuota se procesó como la
segunda pero suplementada el medio con 1 M NaCl, para analizar si
una alta fuerza fónica era capaz de liberar mayor cantidad de
componente citoplásmico y de membrana que pudiera haber permanecido
adherido a la célula lisada. Las alícuotas agitadas se
centrifugaron 10 minutos a 13K (1 minuto la alícuota control), se
descartó el sobrenadante y se resuspendieron en un pequeño volumen
(20 \mul de medio). Las células se observaron mediante contraste
de fases y fluorescencia para GFP con objetivos de inmersión y
aumentos de 40X y 63X.
Como se observa, las células control (sin
tiamina, encendido) son normales lo que indica que la expresión
81X-bgs4^{+} es lo suficiente como para mantener silvestre
a esta cepa (Figura 4A.1, paneles superiores). La lisis celular
producida al apagar la expresión de bgs4^{+} en presencia
de tiamina es mayoritaria, pero algunas células retienen parte del
contenido citoplásmico en su interior (Figura 4A1, paneles
inferiores). El tratamiento de agitación hace que se libere al
medio una mayor cantidad del material celular de las células
lisadas (Figura 4A.2, paneles superiores). La presencia de una
fuerza iónica como 1 M NaCl parece ayudar a liberar mayor cantidad
de material, pero con poca diferencia respecto al ensayo anterior
(Figura 4A.2, paneles inferiores). La adicción del detergente
Triton-X100, que ayuda a disolver las membranas
produjo una disminución de la fluorescencia de material en el medio
y en el interior de las células lisadas, probablemente producido
por desnaturalización de la proteína. En resumen, sobre todo en las
dos condiciones en las que se ha producido agitación, se ha
producido una liberación mayoritaria del contenido citoplásmico al
sobrenadante. De hecho, la condición más desfavorable, como sería
una proteína integral de membrana citoplásmica, es capaz de
liberarse al exterior de forma particulada produciendo grandes
masas insolubles pero activas como lo muestra la capacidad
fluorescente del fragmento GFP fusionado en la proteína quimera.
Por lo tanto, este método sería más ventajoso incluso en el caso de
utilizarse para la expresión de proteínas heterólogas solubles,
tales como anticuerpos monoclonales, factores de crecimiento,
hormonas, etc.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTIFICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> LEVADURAS bgs4delta
AUTOLÍTICAS, PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y SUS APLICACIONES EN
PROCEDIMIENTOS DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Bgs4 delta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5883
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Schizosaccharomyces pombe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(5877)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1955
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Schizosaccharomyces pombe
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 9563
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> GFP-Bgsl
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promoter
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<222> (1)..(2232)
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (2233)..(8160)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 1975
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Synthetic Construct
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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Claims (17)
1. Cepa autolítica
(FKS1\Delta/GSC1\Delta/bgs4\Delta) modificada genéticamente de
levadura ó de hongo caracterizada por:
- i.
- presentar inactivado el gen nativo (FKS1\Delta/GSC1\Delta/bgs4\Delta^{+}) codificador de la subunidad catalítica Fks1p/ Gsc1p/Bgs4p ó cualquier otra denominación que se utilice para una proteína ortóloga de éstas, catalítica de la actividad (1,3)-\beta-D-glucán sintetasa responsable de la síntesis del componente de la pared celular (1,3)-\beta-D-glucano, y por
- ii.
- contener una construcción genética constituida, al menos, por un promotor regulable mediante un compuesto químico fusionado a la correspondiente secuencia de nucleótidos del gen FKS1\Delta/GSC1\Delta/bgs4\Delta^{+} que permite controlar la expresión de la proteína Fks1p/Gsc1p/Bgs4p u otra ortóloga para la inducción de la lisis celular.
2. Cepa autolítica según la reivindicación 1
caracterizada porque es una levadura perteneciente al grupo:
Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae,
Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Cryptococcus
neoformans y Pneumocystis carinii.
3. Cepa autolítica
(FKS1\Delta/GSC1\Delta/bgs4\Delta) modificada genéticamente de
levadura ó de hongo según la reivindicación 1 caracterizada
porque la secuencia de nucleótidos FKSI/GSC1/bgs4^{+} está
constituida por:
- a)
- La secuencia del gen bgs4 (SEQ ID Nº1) de Schizosaccharomyces pombe codificador de la subunidad Bgs4 (SEQ ID Nº2) de la actividad (1,3)-\beta-D-glucán sintetasa
- b)
- Secuencias homólogas u ortólogas a bgs4 que codifican una proteina con una actividad enzimática responsable de la síntesis de (1,3)-\beta-D-glucano,
- c)
- La secuencia del gen FKS1 de Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Cryptococcus neoformans y Pneumocystis carinii que codifica a la correspondiente FKS1 con actividad (1,3)-\beta-D-glucán sintetasa
- d)
- Secuencias homólogas u ortólogas a los genes FKS1 codificadoras de proteínas homólogas u ortólogas a las correspondientes FKS1 con actividad (1,3)-\beta-D-glucán sintetasa.
4. Cepa autolítica según la reivindicación 1
caracterizada porque el vector de expresión es un plásmido
(multicopia) que permite la producción de la proteína Bgs4p y que
puede ser regulada porque contiene un promotor reprimible por un
compuesto químico, por ejemplo, por tiamina (versión 81X del
promotor nmt1^{+}).
5. Cepa autolítica según la reivindicación 4
caracterizada porque es la cepa S. pombe
bgs4::ura4^{+} leu1-32
ura4-\Delta18 his3-\Delta1 pJG19 (cepa
bgs4\Delta pJG19, CECT nº 13000).
6. Cepa autolítica según la reivindicación 1
caracterizada porque contiene integrado en su cromosoma una
secuencia de nucleótidos bgs4^{+} (plásmido monocopia o
integrativo) que permite la producción de la proteína Bgs4p y que
puede ser regulada porque contiene un promotor reprimible por un
compuesto químico, por ejemplo por tiamina (versión 81X del
promotor nmt1^{+}).
7. Cepa autolítica según la reivindicación 6
caracterizada porque es la cepa S. pombe
bgs4::ura4^{+} leu1-32
ura4-\Delta18 his3-\Delta1 pJG33 (cepa
bgs4\Delta pJG33, CECT nº 13002).
8. Cepa autolítica según la reivindicación 6
caracterizada porque es la cepa S. pombe revertiente
bgs4::ura4^{+} leu1-32
ura4-\Delta18 his3-\Delta1 (cepa
bgs4\Delta revertiente, CECT nº 13001).
9. Cepa autolítica según la reivindicación 1
caracterizada porque es una levadura que contiene además la
auxotrofía Ura^{-} (cepa bgs4\Delta Ura^{-}).
10. Procedimiento de obtención de las levaduras
bgs4\Delta preferentemente levaduras bgs4\Delta
pJG19, y también S. pombe bgs4\Delta pJG19 (CECT nº
13000) caracterizado por las siguientes etapas:
- a)
- obtención de una levadura diploide bgs4\Delta/bgs4^{+} mediante la disrupción de la secuencia entera (o la disrupción parcial o la sustitución de algún aminoácido y cree una mutación puntual, siempre que origine la alteración o disminución de la actividad de la proteína Bgs4p dando lugar a la lisis celular) de lectura de bsg4^{+} de la levadura original, preferentemente S. pombe, por reemplazamiento con otro marcador de selección como por ejemplo el gen ura4^{+} que permite la selección en medio Ura^{-},
- b)
- transformación del diploide de a) mediante un vector multicopia o episómico de expresión génica, preferentemente un plásmido, que contiene una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína con actividad Bgs4p, preferentemente el plásmido pJG19 (marcador de selección LEU2 de Saccharomyces cerevisiae que complementa leu1-32 de S. pombe pero no se recombina ni integra por no ser las mismas secuencias) que permite la selección en un medio carente de leucina (Leu^{-}),
- c)
- inducción de la esporulación y obtención a partir de las esporas de la levaduras bgs4\Delta pJG19 seleccionando clones con la deleción y el plásmido mediante crecimiento en un medio carente de uracilo (para la deleción) y leucina (para el plásmido) (Ura^{-}, Leu^{-}), y
- d)
- Comprobación de la deleción bgs4\Delta por técnicas clásicas de biología molecular (PCR, hibridación de DNA) y comprobación en un medio Ura^{-}, Leu^{-} y en presencia de tiamina que la expresión de bgs4^{+} del plásmido se reprime y se produce la lisis de la cepa seleccionada.
11. Procedimiento de obtención de las levaduras
bgs4\Delta preferentemente levaduras bgs4\Delta
pJG33 y también S. pombe bgs4\Delta pJG33 (CECT nº
13002) caracterizado por las siguientes etapas:
- a)
- Transformación de una cepa leu1-32 ura4-\Delta18 his3-\Delta1 con el plásmido pJG33,
- b)
- Cruce genético de esta cepa con bgs4\Delta pJG19 y selección de esporas en medio Ura^{-} His para obtener una cepa bgs4\Delta pJG33, JJ
- c)
- Comprobación de la ausencia de pJG19 en este clon analizando el fenotipo de ausencia de crecimiento en medio Leu^{-},
- d)
- Crecimiento repetido de la cepa en medio con histidina para eliminar la presión selectiva del plásmido y reaislamiento de clones en medio His^{-} para enriquecer la población con clones en los que se ha producido la integración del plásmido,
- e)
- Cruce genético de uno de los clones reaislados con una cepa leu1-32 ura4-\Delta18 his3-\Delta1 de sexo complementario, y análisis de tétradas para seleccionar un clon en los que la marca His^{+} de pJG33 segregue 2+:2-, indicativo de haberse integrado el plásmido, y
- f)
- Cruce genético con el clon integrado y una cepa his3^{+}, por ejemplo leu1-32 ura4-\Delta18, para comprobar que el marcador His^{+} segrega 4+:4-, indicativo de la integración del plásmido en la zona del gen his3^{+}.
12. Procedimiento de obtención de las levaduras
bgs4\Delta preferentemente levaduras bgs4\Delta
revertiente y también S. pombe bgs4\Delta
revertiente (CECT nº 13001) caracterizado por las siguientes
etapas:
- a)
- Crecimiento de las cepas anteriores bgs4\Delta con pJG19 o pJG33 en medio en presencia de tiamina (el medio completo también es válido porque contiene tiamina) para inducir la represión de la expresión de bgs4^{+} y la aparición de células supervivientes revertientes,
- b)
- Recrecimiento y reaislamiento de clones supervivientes en presencia de tiamina, y
- c)
- Cruce genético con una cepa leu1-32 ura4-\Delta18 his3-\Delta1 y seleccione de clones Leu^{-} His^{-} Ura^{+} indicativo de la ausencia de cualquiera de ambos plásmidos y la presencia de la deleción bgs4\Delta. Estas células son esféricas, gigantes y muy frágiles.
13. Uso de las levaduras bgs4\Delta
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 9 en un
procedimiento de expresión y purificación de proteínas
heterólogas.
14. Uso de las levaduras bgs4\Delta
según la reivindicación 13 caracterizado porque comprende
los siguientes pasos:
- a)
- transformación de la levadura bgs4\Delta de la invención, preferentemente una levadura bgs4\Delta pJG19 ó bgs4\Delta pJG33, y más preferentemente la levadura bgs4\Delta pJG19 CECT nº 13000 ó la levadura bgs4\Delta pJG33 CECT nº 13002, con un vector de expresión, preferentemente un plásmido, que contiene una secuencia de nucleótidos codificante de la proteína heteróloga de interés,
- b)
- crecimiento de la levadura de a) en un medio de cultivo que no contenga el componente químico que actúa como represor del promotor, preferentemente entre otros nmt1^{+}, que regula la expresión de bgs4^{+} hasta conseguir la masa celular deseada y manteniéndose el cultivo en fase de crecimiento exponencial,
- c)
- dilución del medio de cultivo e inducción de la represión del promotor, preferentemente entre otros nmt1^{+}, mediante la adición del compuesto químico represor (tiamina o vitamina B1 en el caso de nmt1^{+}) al medio de cultivo (medio mínimo) o mediante el cambio de medio de las células de medio mínimo a un medio complejo (YES), que contiene dicho represor de por sí y por lo tanto, induce en unas horas (20-22) la lisis celular, y
- d)
- obtención y purificación de la proteína heteróloga del medio de cultivo por medios estándares.
15. Uso de las levaduras bgs4\Delta
según la reivindicación 13 y en el que no se desea que la proteína
heteróloga se libere al medio de cultivo caracterizado
porque opcionalmente el punto c) puede realizarse de la siguiente
forma:
- -
- el crecimiento de las levaduras con el compuesto represor (c) se realiza durante un tiempo menor al que provoca una lisis mayoritaria (por ejemplo 14-15 horas) para evitar la rotura de las células,
- -
- aplicación de un tratamiento de rotura celular que siempre será mucho más suave que el tratamiento convencional aplicado a las células de levaduras silvestres y que consiste en, por ejemplo, a título ilustrativo y sin limitar el alcance de la invención, rotura mecánica con bolas de vidrio, aumento de la presión en una prensa, etc.), y finalmente
- -
- obtención y purificación de la proteína heteróloga del medio de cultivo.
16. Uso de las levaduras bgs4\Delta
según la reivindicación 13 y en el que no se desea que la proteína
heteróloga se libere al medio de cultivo, que se realiza de la
siguiente forma:
- -
- la transformación de la levadura bgs4\Delta de la invención, preferentemente una levadura bgs4\Delta revertiente, y más preferentemente la levadura bgs4\Delta revertiente CECT nº 13001, con un vector de expresión, preferentemente un plásmido, que contiene una secuencia de nucleótidos codificante de la proteína heteróloga de interés (a),
- -
- el crecimiento de la levadura transformada bgs4\Delta revertiente se realiza en un medio normal hasta la masa celular deseada,
- -
- se aplica un tratamiento suave de rotura celular, por ejemplo, a titulo ilustrativo y sin limitar el alcance de la invención, rotura mecánica con bolas de vidrio, aumento de la presión en una prensa, etc.), y finalmente
- -
- se obtiene y se purifica la proteína heteróloga del medio de cultivo, por medios estándares.
17. Uso de las levaduras bgs4\Delta
según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16
caracterizado porque la proteína heteróloga es cualquier
proteína o péptido de interés comercial, de distinto origen
(eucariota, procariota, viral, etc), perteneciente entre otros, al
siguiente grupo: enzimas, anticuerpos monoclonales, factores de
crecimiento, citocinas, hormonas, proteínas y péptidos de
aplicación en el sector alimentario, por ejemplo pepsina,
transglutaminasa, etc; agentes terapéutico, por ejemplo
IGF-I, antígenos inmunogénicos para la elaboración
de vacunas, etc.
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|---|---|---|---|
| ES200401042A ES2274664B1 (es) | 2004-04-30 | 2004-04-30 | Levaduras bgs4delta autoliticas, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones en procedimientos de expresion de proteinas. |
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Non-Patent Citations (8)
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