ES2301495T3 - Sistemas de expresion de proteinas para kinetoplastidae no patogenos. - Google Patents

Abstract

Un sistema de expresión y liberación que comprende un huésped L. tarentolae no patógeno y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína heteróloga unida de forma que puede operar con un promotor y en el que la secuencia de ácido nucleico heteróloga está flanqueada por UTRs 3'' y 5'' de un gen huésped L. tarentolae transcrito activamente.

Description

Sistemas de expresión de proteínas para Kinetoplastidae no patógenos

La invención se refiere a células huésped L. tarentolae útiles en la producción de proteínas recombinantes. En particular, la invención se refiere a células huésped L. tarentolae que se pueden usar en la expresión a alto nivel de proteínas recombinantes, especialmente enzimas.

Antecedentes de la invención

La tecnología recombinante se empleó con éxito para transferir ADN heterólogo codificante de genes al interior de una variedad de procariotas y eucariotas. Actualmente, hay una selección de sistemas de expresión que pueden ser elegidos para la producción de cualquier proteína dada, incluyendo huéspedes procarióticos y eucarióticos. A menudo la selección de un sistema de expresión apropiado no depende sólo de la capacidad que tenga la célula huésped para producir rendimientos adecuados de la proteína deseada en estado activo, sino que también puede venir determinado en gran parte por el uso que se pretenda dar a dicha proteína.

La integración genómica o episómica de los genes de la proteína deseada, acompañada por los elementos adecuados como promotores, sitios de poliadenilación y regiones 3' y 5' no traducidas (UTRs, por sus siglas en inglés) puede intervenir en la expresión génica heteróloga. Esta tecnología se aplicó con éxito a una variedad de tipos de células, como bacterias, levaduras, hongos filamentosos, cultivos celulares o insectos y organismos mamíferos enteros. Cada uno de estos sistemas de expresión se asocia con utilidades específicas y limitaciones en términos de rendimiento de proteínas, calidad y coste y no existe ningún huésped universal para la expresión de
proteínas.

Un huésped para la expresión de proteínas debe satisfacer varios criterios:

El huésped debe ser fácil de cultivar en medios baratos y debe ser fácilmente manipulable por procedimientos estándar de biología molecular. Además, el huésped debe producir proteínas activas en cantidades elevadas y debe permitir la extracción de éstas.

Los Kinetoplastidae son protozoos flagelados primitivos que se han encontrado en ambientes terrestres y acuáticos. Algunos de ellos causan enfermedades en organismos, desde plantas hasta vertebrados. La posición evolutiva de Kinetoplastidae y la estructura sistemática del grupo se describen en otros lugares (p. ej. Adoutte y Philippe, 1993). Dos grupos importantes de Kinetoplastidae son Leishmania y Trypanosomatidae. Kinetoplastidae ha sido particularmente valioso para el estudio de fenómenos moleculares y celulares fundamentales, como la edición del ARN (Stuart, 1991), el empalme en trans del ARNm (Perry y Agabian, 1991), el anclaje glicosilfosfatidilinositol de proteínas (Krakow y al., 1986), la variación antigénica (Borst y Rudenko, 1994), y organización de telómeros (Blackburn, 1991). Otra característica de los Trypanosomatidae única entre los eucariotas son las unidades de transcripción policistrónicas. En estas unidades, series de genes se disponen en estructuras tándem y son transcritos por ARN polimerasa como un transcrito individual de 50-100 kb (Myler et al., 1999; Teixeira, 1998). Después, este transcrito es procesado en el interior de ARNm de genes individuales por adición de un mini exón limitado en el extremo 5' mediante un proceso conocido como empalme en trans, seguido por poliadenilación y escisión. La expresión génica y su control en Kinetoplastidae parecen desviarse significativamente de los de otros eucariotas. En pocos casos, p. ej. Trypanosoma brucei, se identificaron promotores específicos de cada etapa como los promotores VSG y PARP (Barry et al., 1998; Hotz et al., 1998). Al contrario de todos los eucariotas descritos hasta ahora, estos promotores seleccionan ARN polimerasa I en lugar de ARN polimerasa II para los genes codificadores de proteínas (Teixeira, 1998). En el caso de la especie Leishmania, con exención del promotor de ARN ribosómico no se identificó ningún elemento que se pareciera a un promotor y según un modelo actual, la iniciación de la transcripción en Leishmania por ARN polimerasa IIes un proceso aleatorio. Como resultado de dicha organización genética, la mayor parte de la regulación génica tiene lugar a un nivel post-transcripcional (Teixeira, 1998).

Desde el inicio de los años noventa se ha hecho un progreso significativo hacia el establecimiento de metodologías de genética inversa para la investigación de Kinetoplastidae. Por primera vez se informó de vectores que permitían la expresión transiente de genes foráneos en Trypanosoma cruzi (Lu y Buck, 1991). Aportando el vector de transferencia con un gen NEO como marcador de resistencia al fármaco se hizo estable la transformación y sucesivamente se describió para otras muchas especies (Coburn et al., 1991). La transferencia de las construcciones de ADN se llevó a cabo por electroporación o bombardeo de partículas (Beverley y Clayton, 1993; Sbicego et al., 1998). Se mostró que Kinetoplastidae era capaz de replicar tanto los plásmidos foráneos como los derivados del genoma (Coburn et al., 1991; Patnaik et al., 1994; ten Asbroek et al., 1993) (Papadopoulou et al., 1994). Se demostró que uno o varios alelos de un gen funcional podrían borrarse por recombinación homóloga y se podrían integrar nuevos genes en el genoma (Cruz et al., 1991; Ray and Hines, 1995). Se desarrolló una variedad de métodos que permitía la expresión de proteínas citosólicas o secretadas en Leishmania y Trypanosomatidae. En líneas generales estas construcciones se podrían dividir en tres categorías:

A) Plásmidos episómicos que llevan promotores no definidos en el caso de Leishmania o promotores específicos de cada etapa en el caso de Trypanosoma bruci (LeBowitz et al., 1990) (La Flamme et al., 1996).

B) Construcciones integradas en clusters genéticos transcritos activamente (genes de tubulinas, genes de ARN de pequeñas subunidades ribosómicas, genes de ARN de grandes subunidades ribosómicas) (Misslitz A. et al., 1999; Tobin y Wirth, 1992; Wirtz et al., 1999).

C) Integración de genes foráneos de polimerasa en locus transcritos activamente y transcripción de los genes de interés por esta polimerasa (especialmente polimerasa T7 o T3 (Wirtz et al., 1994).

Usando estos enfoques se expresaron varios genes y se demostró que sus productos eran funcionalmente activos:

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p53 en Leishmania donovani (Zhang et al., 1995).

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Interferón gamma en Leishmania major (Tobin y Wirth, 1992).

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Luciferasa en Trypanosoma brucei (Biebinger et al., 1997).

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Polimerasa T7 y T3 en Trypanosoma brucei (Wirtz et al., 1994).

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Proteínas terapéuticas en Leishmania major (WO 00/58483).

La técnica anterior incluye también publicaciones que se interesan por métodos para el cultivo in vitro de una variedad de Kinetoplastidae, incluyendo el crecimiento sobre medios sólidos (placas) y líquidos (frascos o fermentadores) (Alfonzo et al., 1998). En la mayoría de casos los medios contenían una selección de aminoácidos esenciales y microelementos suplementados con suero bovino de ternera o sangre bovina (Beverley y Clayton, 1993; Hill y Fahey, 1987). Se demostró que muchas especies crecían en ausencia de suero en el medio simple no sintético. Las mejor descritas y estudiadas de estas especies como Leishmania tarentolae Parrot (parásito de la salamandra), Tarentola mauritanica y Tarentola annularis (Elwasila, 1988); o Crithidia fasciulata Leger parásito del mosquito Culex pipiens (Leger 1902) podían ser cultivadas en medio de infusión cerebro corazón (BHI) (Alfonzo et al., 1998) o medio Luria-Bertani (LB). También se demostró que estas especies crecían bien en grandes fermentadores. Leishmania tarentolae podía alcanzar la densidad de 2x10^{8} células por ml en la última fase estacionaria en fermentadores estándar de 15 L con el rendimiento de 10 g de peso celular seco por 1 L de cultivo (Alfonzo et al., 1998).

Sin embargo, otras especies de Kinetoplastidae -especialmente especies de Trypanosomatidae y Leishmania- no han demostrado ser útiles en la expresión de proteínas heterólogas, debido a riesgos sanitarios asociados, bajos porcentajes de crecimiento o medios de cultivo caros y poco comunes.

Un sistema de expresión y liberación ideal es aquél que está sustancialmente exento de la producción de proteasas, toxinas y grandes cantidades de otras proteínas del huésped secretadas y sintetizadas endógenamente, y que es capaz de alcanzar niveles de expresión de proteína elevados.

En la técnica anterior todos los experimentos e investigaciones se realizaron con especies patógenas in vitro o in vivo y no se realizaron intentos de aislar las proteínas recombinantes.

Los experimentos mostraron que la expresión deseada de proteína heteróloga se podría establecer con especies no patógenas de Kinetoplastidae, en particular a partir de Leishmania tarentolae, Crithidia fasciculata, Wallaceina inconstans (antigua Proteomonas inconstans), Leptomonas collos, Leptomonas sp. Cfm, Leptomonas sp. Nfm o Leptomonas seymouri.

Las especies descritas arriba mostraron porcentajes de crecimiento superiores en medios baratos, comparadas con otras Kinetoplastidae y por consiguiente demostraron su utilidad como huéspedes para la producción de proteínas.

Por tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo sistema de expresión y liberación y/o un huésped para la expresión de proteínas de Kinetoplastidae no patógenos que se pueda usar en la expresión a alto nivel de proteínas recombinantes, especialmente enzimas.

El objeto se consigue de acuerdo con la reivindicación 1 mediante células huésped de Leishmania tarentolae no patógena que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína heteróloga.

Especialmente mediante Leishmania tarentolae Parrot número ATCC 30143 y Crithidia fasciculata Leger número ATCC 12857 (número de la American Type Culture Collection).

Se entiende por proteína heteróloga una proteína que no es nativa para la célula huésped o una proteína nativa en la que se han realizado modificaciones para alterar la secuencia nativa. En una realización preferible la proteína es un enzima heterólogo. Por consiguiente, una secuencia codificante de ácidos nucleicos heterólogos se enlaza operativamente a una secuencia promotora adecuada y si resulta apropiado, a secuencias señal post transcripcionales, que son capaces de dirigir la expresión de la secuencia nucleica en las células huésped seleccionadas.

Los organismos del orden Kinetoplastidae, como las especies no patógenas Leishmania tarentolae, Crithidia fasciculata, Wallaceina inconstans, Leptomonas collos. Leptomonas sp. Cfm, Leptomonas sp. Nfm o Leptomonas seymouri, tienen un orgánulo único llamado kinetoplasto, un apéndice de su única mitocondria localizado cerca del cuerpo basal del flagelo que contiene una red de miles de pequeños ADNs circulares entrelazados. Los Kinetoplastidae tienen un tamaño de 50-400 micras. Los Kinetoplastidae se encuentran entre los eucariotas más antiguos, con linajes de ARNr que se extienden más atrás que los de animales, plantas e incluso hongos (Beverley, 1996). La especie Kinetoplastidae parasita un espectro muy diverso de huéspedes, desde plantas hasta seres humanos. Muchos representantes de Kinetoplastidae fueron aislados y se mantuvieron en cultivos durante extensos periodos de tiempo. El cultivo se pudo llevar a cabo tanto en medios líquidos como sólidos, definidos completa o parcialmente (Melo, 1981). Los Kinetoplastidae que crecen en un medio líquido forman suspensiones mientras que sembrados sobre placas en medio sólido conducen a la formación de colonias (Hill y Fahey, 1987).

Para la finalidad de la presente invención, "no patógeno" se define mediante la clasificación de los organismos en cuestión en el Nivel 1 de Bioseguridad según las directrices del U.S. department of Health and Human Servies (HHS Publication No. (CDCD 93-8395)) o en http://www.niehs.nih.gov/odhsb/biosafe/bio.htm.

La transformación de las especies seleccionadas se realiza usando cantidades de ADN que se encuentran entre 1-100 \mug y la selección con técnicas adecuadas de sembrado en placas y condiciones para una selección con antibiótico o con técnicas de dilución limitada. La eficacia de la transformación varía ampliamente dependiendo de las especies seleccionadas, siendo la más alta para la especie Leishmania y acercándose a 10^{-4}/célula (Kapler et al., 1990), (Coburn et al., 1991). Una sola célula puede mantener varias construcciones de expresión siempre que todas ellas lleven diferentes marcadores de selección (Wirtz et al., 1999). Los niveles de expresión varían significativamente dependiendo del huésped y la construcción elegida con plásmidos episómicos, encontrándose en el extremo inferior de la escala pero siendo todavía capaces de generar proteína recombinante hasta un 1% de la proteína celular total (LeBowitz et al., 1990).

Los resultados muestran claramente que las especies patógenas seleccionadas son capaces de expresar y secretar una proteína heteróloga. Así, se entiende que esta capacidad no se limita a una sola cepa sino que más bien es la característica de este grupo de especies como conjunto. Los expertos en la materia reconocerán que se pueden usar también otras cepas de estas especies en la expresión de proteínas heterólogas. Muchas cepas son de uso público. Por ejemplo, Leishmania tarentolae Parrot número ATCC 30143 y Crithidia fasciculata Leger número ATCC
12857.

El experto en la materia también reconocerá que la transformación exitosa de las especies huésped descritas aquí no se limita al uso de los vectores, promotores y marcadores de selección ejemplificados específicamente. También están implicadas otras técnicas, que son útiles en relación con las células huésped de L. tarentolae de la presente invención.

El término "útil" incluye, sin limitarse a ellas, técnicas que comprenden un gen de la higromicina fosfotransferasa (HYG) en combinación con higromicina, un gen de la neomicina fosfotransferasa (NEO) en combinación con G418, el producto del gen de Streptoalloteichus hindustanus BLE (BLE) en combinación con fleomicina y el gen codificante de la estreptotricin acetiltransferasa (SAT) en combinación con nourseotricina, las cuáles se usan para la selección de clones recombinantes. Adicionalmente incluye, pero sin limitarse a ellas, las regiones intergénicas 5' y 3' de genes del huésped transcritos activamente, como los genes de calmodulina, dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa y cisteín proteinasa.

La invención proporciona también un vector que es capaz de transformar Kinetoplatidae no patogénicos, en particular la especie mencionada L. tarentolae, en la que el ácido nucleico codifica para una proteína deseada flanqueada por UTR 5' y 3' de un gen de L. tarentolae transcrito activamente, incluyendo señales para un empalme en trans y una poliadenilación eficaces, y que contiene, si resulta apropiado, un marcador de selección. El sistema vectorial puede ser un vector individual o un plásmido o un sistema de dos o más vectores o plásmidos, los cuáles contienen juntos el ADN total que tiene que ser transferido al interior de la célula huésped. Los vectores o plásmidos pueden ser moléculas lineales o circulares cerradas.

Según una realización preferida de esta invención, el sistema vectorial comprende preferiblemente un ácido nucleico plasmídico linearizado y un ácido nucleico heterólogo que codifica para una proteína de interés flanqueado por regiones intergénicas de una proteína huésped traducida activamente enlazado de manera que puede operar con un gen marcador de resistencia flanqueado por segmentos de un gen huésped transcrito activamente. Dichos genes incluyen, sin limitarse a ellos, genes de ARN de pequeñas subunidades ribosómicas, genes de ARN de grandes subunidades ribosómicas, genes de \alpha o \beta-tubulina, el gen de la calmodulina o el gen gp63. La construcción se integra en clusters transcritos activamente, tales como clusters génicos de ARN de pequeñas subunidades ribosómicas, clusters génicos de ARN de grandes subunidades ribosómicas, clusters génicos de \alpha o \beta-tubulina, por recombinación homóloga y selección con el antibiótico apropiado.

Según otra realización preferida de esta invención el sistema vectorial comprende preferiblemente un ácido nucleico plasmídico linearizado y un ácido nucleico heterólogo que codifica para una proteína de interés flanqueado por regiones intergénicas de una proteína huésped traducida activamente enlazado de manera que puede operar con un gen marcador de resistencia flanqueado por fragmentos de ADN de un espaciador no traducido del cluster génico del ARNr. El gen codificante para la proteína de interés se prolonga con el promotor génico de ARN ribosómico y en algunos casos con elementos reguladores que incluyen, sin limitarse a ellos, elementos sensibles a represores Tet o Lac. La construcción se integra en el interior de un espaciador no transcrito de la región génica del ARNr mediante recombinación homóloga y selección con el antibiótico apropiado.

Según otra realización preferida de esta invención, el sistema vectorial comprende preferiblemente un ácido nucleico plasmídico circular disponible episómicamente y un ácido nucleico heterólogo que codifica para una proteína de interés flanqueado por regiones intergénicas de una proteína huésped traducida activamente enlazado de manera que puede operar con un marcador de resistencia. La construcción se mantiene en el organismo episómicamente bajo la presión de la selección con antibiótico y se pueden generar transcritos por iniciación aleatoria y transcripción "run-around".

Según otra realización preferida de esta invención, el sistema vectorial comprende preferiblemente un ácido nucleico plasmídico circular disponible episómicamente y un ácido nucleico heterólogo que codifica para una proteína de interés flanqueado por regiones intergénicas de una proteína huésped traducida activamente enlazado de manera que puede operar con un marcador de resistencia. El ácido nucleico que codifica para el gen de interés se extiende con un promotor ribosómico y sus elementos reguladores o bien con un promotor para una polimerasa de ARN foráneo, que incluye pero sin limitarse a ellas, T7, T3, etc. La construcción se mantiene en el organismo episómicamente bajo la presión de la selección con antibiótico y se generan transcritos mediante ARN polimerasa I en el caso del promotor génico de ARN ribosómico. En el caso de otros promotores (T7, T3, etc.) la transcripción es conducida por polimerasas foráneas integradas en el genoma.

Según otra realización preferida de la presente invención, el huésped se transforma con tres vectores, uno incluye el gen para una ARN polimerasa foránea (por ejemplo, la polimerasa T7 o T3) con regiones intergénicas de una proteína huésped expresada activamente enlazado de manera que puede operar con un gen marcador de resistencia y flanqueado por segmentos de un gen huésped activamente transcrito. Esta construcción se integra en el interior de un cluster génico activamente transcrito del huésped mediante recombinación homóloga.

El otro plásmido comprende el ADN heterólogo que codifica para un represor Tet con regiones intergénicas de una proteína huésped expresada activamente e incluye en frente un promotor, preferiblemente un promotor T3 o T7 atenuado. Este gen represor Tet modificado se enlaza de manera que puede operar con un gen marcador de resistencia a un antibiótico y la construcción entera está flanqueada por segmentos de un gen huésped activamente transcrito. Esta construcción se integra en el interior del cluster génico activamente transcrito del huésped mediante recombinación homóloga.

El tercer vector comprende un plásmido disponible episómicamente que contiene el ADN heterólogo que tiene que expresar la proteína de interés, flanqueado por regiones intergénicas de una proteína huésped expresada activamente y soportando preferiblemente un promotor específico T3 o T7 en el extremo 5' del gen indicado arriba para la proteína deseada. Este promotor es proporcionado adicionalmente con la secuencia de reconocimiento del represor TET para permitir el control de la transcripción dependiente de la tetraciclina. La construcción resultante se enlaza de forma que pueda operar con un gen marcador de resistencia a antibióticos y es mantenida episómicamente o provista de secuencias diana apropiadas que flanquean toda la construcción y se integra en una parte transcripcionalmente silenciosa del genoma huésped, como el espaciador génico de ARNr no transcrito.

Las especies presentes de célula huésped se pueden usar para expresar cualquier proteína heteróloga de interés, procariótica o eucariótica, y se usan preferiblemente para expresar proteínas eucarióticas. Por ejemplo, los nuevos sistemas de expresión y liberación se pueden usar para expresar enzimas como catalasa, lacasa, fenoloxidasa, oxidasa, oxidoreductasas, celulasa xilanasa, peroxidasa, lipasa, hidrolasa, esterasa, cutinasa, proteasa y otros enzimas proteolíticos, aminopeptidasa, carboxipeptidasa, fitasa, liasa, pectinasa y otros enzimas pectinolíticos, amilasa glucoamilasa, \alpha-galactosidasa, \beta-galactosidasa, \alpha-glucosidasa, \beta-glucosidasa, manosidasa, isomerasa, invertasa, transferasa, ribonucleasa, quitinasa, y desoxirribonucleasa. Los expertos en la materia entenderán que el término "enzimas" incluye no sólo a los enzimas nativos, sino también a aquellos enzimas que han sido modificados por sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, o cualquier otra modificación que se pueda haber realizado para incrementar su actividad, termoestabilidad, tolerancia al pH, etc.

Las presentes células huésped pueden usarse también en la producción recombinante de proteínas nativas para la célula huésped. Los ejemplos de dicho uso incluyen, sin limitarse a ello, la colocación de una proteína nativa del tipo Kinetoplastidae no patógeno bajo el control de un promotor diferente, para incrementar la expresión de la proteína, para agilizar la exportación de una proteína nativa de interés fuera de la célula mediante el uso de una secuencia señal, o para incrementar el número de copias de una proteína que normalmente es producida por las células huésped sujeto. Así, la presente invención abarca también la producción recombinante de proteínas homólogas, hasta el extremo de que dicha expresión supone el uso de elementos genéticos no nativos para la célula huésped, o el uso de elementos nativos que han sido manipulados para funcionar de una forma que no se observa normalmente en la célula huésped.

Para evitar la necesidad de ruptura de las células para obtener el producto expresado y para minimizar la extensión de la posible degradación del producto expresado en el interior de las células es preferible que el producto sea secretado fuera de las células. En una realización preferida, el gen de interés se fusiona con la secuencia de ADN para una pre-región como un péptido señal o líder que puede intervenir situando el producto expresado en la vía secretora de las células. La pre-región puede derivarse de genes para cualquier proteína secretada de cualquier organismo, o se prefiere una pre-región nativa de las especies seleccionadas o de la proteína seleccionada. Puede incluir, pero sin limitarse a ellas, una secuencia señal secretora de interferón gamma de mamíferos, una secuencia señal secretora de fosfatasa ácida secretada de Leishmania mexicana, una secuencia señal secretora de fosfatasa ácida soluble de Leishmania donovani, una secuencia señal secretora del gen 9P63 de L. tarentolae u otras señales secretoras de otras proteínas secretadas.

La invención proporciona también líneas celulares de L. tarentolae transformadas de forma estable, que se pueden obtener mediante el vector y el sistema vectorial revelados.

Otras características de la presente invención se describen más detalladamente en las siguientes

Figuras y ejemplos

Figura 1

Expresión de proteínas a partir de vectores episómicos en Kinetoplastidae

Representación esquemática de un vector plasmídico episómico para la expresión génica heteróloga en la especie Kinetoplastidae. El plásmido contiene un origen procariótico de replicación y un gen marcador de resistencia procariótico (Amp). El gen de interés está flanqueado por regiones intergénicas del huésped y un gen marcador de selección eucariótico (Hyg). La transcripción se inicia aleatoriamente y genera transcritos de longitud aleatoria.

Figura 2

Expresión de proteína mediada por ARN polimerasa en Kinetoplastidae

Representación esquemática de la expresión génica heteróloga en la especie Kinetoplastidae basada en una polimerasa de fago y controlada por un elemento sensible a Tet. Los genes de ARN polimerasa T7 y represor Tet se integran en un locus transcrito activamente, con preferencia dentro de un cluster génico fuertemente transcrito. El gen de interés se integra en la región transcripcionalmente silenciosa del genoma bajo el control del promotor T7 y el elemento sensible a Tet. La transcripción del gen de interés se inicia por adición de tetraciclina al medio de cultivo. Le sigue el empalme en trans, la poliadenilación y la traducción del ARNm maduro en la proteína de interés.

Figura 3

Transferencia Western de células de Leishmania tarentolae que expresan el proto-oncogén Miz-1 (A) y eritropoyetina humana (B)

Transferencia Western de células de Leishmania tarentolae que expresan el proto-oncogén Miz-1 (A). Las células transformadas con la construcción pIR-miz fueron seleccionadas por resistencia a antibiótico y se introdujeron en el caldo BHI que contenía 100 mg/L de nourseotricina. Las células se recogieron por centrifugación y se hirvieron directamente en tampón Laemmli o bien se dividieron primero en fracciones solubles e insolubles con Triton X-100. Los lisados se separaron en SDS-PAGE 10%, se transfirieron sobre nitrocelulosa y el Miz recombinante se probó con anticuerpos policlonales anti-miz-1.

La columna T (Fig. 3A) muestra el lisado total de células de L. tarentolae que expresan miz.

La columna P (Fig. 3A) muestra la fracción insoluble en TritonX-100 1% de las células de L. tarentolae que expresan miz.

La columna S (Fig. 3A) muestra la fracción soluble en TritonX-100 1% de las células de L. tarentolae que expresan miz.

La columna M muestra los marcadores de peso molecular, la columna C muestra el lisado de células control.

Transferencia Western del sobrenadante del cultivo de células de Leishmania tarentolae que expresan eritropoyetina humana (B). Para la expresión de la eritropoyetina se precipitaron 200 microlitros del sobrenadante del cultivo con TCA 10% (ácido tricloroacético) y se separaron en SDS-PAGE 15%, se transfirieron sobre nitrocelulosa y la eritropoyetina recombinante se probó con anticuerpos policlonales anti-eritropoyetina.

Las columnas T (Fig. 3B) muestran las diferentes cantidades de sobrenadante del cultivo de células de L. tarentolae que expresan Epo humana.

La columna M muestra los marcadores de peso molecular, la columna C muestra el lisado de células control.

Los ejemplos siguientes no están cubiertos por las reivindicaciones pero pueden servir como prueba del principio, sin restringir el mismo a los productos y realizaciones descritas en los ejemplos.

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Ejemplo 1

Expresión del proto-oncogén Miz-1 en Leishmania tarentolae Clonación del gen miz-l en el vector pIR

El vector pIR (Hubel A. y Beverley, 1999)(Wirtz, Leal, et al. 1999 ID: 267) contiene

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el origen de replicación ColE1 y el gen de resistencia a la ampicilina (Amp) para la propagación del plásmido y la selección en E. coli,

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un sitio BgIII para la inserción de casetes génicos, flanqueado por regiones intergénicas de los genes cys2 (cisteín proteinasa) y LPG1 (glicosiltransferasa) de Leishmania con señales para el empalme en trans y la poliadenilación del ARNm del gen para la proteína deseada,

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el gen de la estreptotricin acetiltransferasa (sat) del transposón Tn7, flanqueado por regiones intergénicas de los genes LPG1 y DHFR-TS (dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa) de Leishmania, confiriendo resistencia de la Leishmania al antibiótico nourseotricina,

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dos segmentos de aproximadamente 1 kbp (una parte 5' y una 3') del gen para la pequeña subunidad ribosómica de ARN (ssu) de Leishmania, relacionando las señales de expresión unidas al marcador de resistencia sat, y permitiendo la integración del ADN entre las cajas ssu en el interior del genoma de Leishmania tarentulae mediante recombinación homóloga y a continuación escisión del vector recombinante pIR con el enzima de restricción Smil.

La secuencia codificante de Miz-1 (acceso al banco genético nº Y09723) fue amplificada por PCR según los procedimientos estándar a partir de una fuente plasmídica (pFH50) que aportó la información genética para una marca hexahistidina extra en el extremo N' de la proteína Miz-1. Los cebadores siguientes se usaron introduciendo secuencias de reconocimiento para el enzima de restricción BcI a ambos extremos del fragmento de PCR de 2.6 kbp:

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Cebador directo F2460 miz-1: CTG CAG TGA TCA GTC GCC ACC ATG CGG GGT TCT CAT CAT CAT C (Sec. nº id. 1, codón de inicio subrayado) y

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Cebador inverso F2461 miz-1: CTG CAG TGA TCA AGA TCT TCA CTC GGC AGG CGG GGG AC (Sec. nº id. 2, codón de parada subrayado).

Se aplicaron técnicas estándar de clonación molecular para insertar el gen miz-1 en el vector pIR. Los extremos del fragmento de PCR se recortaron primero con BcII y el producto de PCR se ligó entonces con el vector pIR linearizado con BgIII. Después de la transformación de E. coli TG1 con la mezcla de ligación, los clones que contenían pIR recombinante con el inserto miz-1 en la orientación correcta (pIRmiz1) fueron identificados mediante PCR de colonia usando los cebadores F2718 (pIR-BgIII-directo) CTG CAC CGT GGT CGA CTG C (Sec. nº id. 3), hibridando hacia arriba del sitio BgIII de pIR y el cebador F2461 (miz-1 inverso, descrito anteriormente). El ADN plasmídico se extrajo de clones positivos y la estructura y secuencia correctas de pIRmiz1 se confirmaron mediante análisis de restricción y secuenciación. Se consiguieron preparaciones de plásmidos a gran escala con Plasmid Maxi Kit (Qiagen).

Transformación de Leishmania tarentolae con pIRmizl

Para la integración cromosómica del gen miz-1 en el interior del cluster ssu se escindieron aprox. 10 \mug de pIRmizl con el enzima de restricción Smil, se resuspendieron en 0,5 \mug/\mul y se introdujeron en células de Leishmania tarentolae por electroporación.

La electroporación se llevó a cabo con un Multiporator (Eppendorf) según el protocolo del fabricante. Por transformación, 1,0 ml de un cultivo en crecimiento de L. tarentolae en caldo BHI con 5 \mug/ml de hemina (OD_{600} = 1,0) se recogieron por centrifugación (1 min a 5000 x g), se lavaron una vez en tampón hipoosmolar (HOP) (Eppendorf nº cat 4308 070 501) y se resuspendieron en 1,0 ml de HOP. Se usaron 0,4 ml de esta suspensión celular por transformación. Las células se mantuvieron en hielo durante 10 min, se añadió el ADN y se realizó la electroporación en una cubeta d=2 mm a 1000 V y 160 \museg. Después de los pulsos, las células se mantuvieron en hielo durante 10 min y se resuspendieron en 10 ml de BHI con 5 \mug/ml de hemina y se incubaron a 26ºC. La selección con 100 \mug/ml de nourseotricina se aplicó 20 h después y las líneas recombinantes se seleccionaron por dilución limitada. La estructura cromosómica esperada de las células recombinantes de L. tarentolae ::pIRmizl (integración de la unidad de expresión con el gen heterólogo miz-1 en el interior del cluster ssu) se confirmó mediante diagnóstico por PCR del ADN genómico de estas células con tres parejas de cebadores específicos. La primera pareja de cebadores consistió en el cebador directo sat F2999 (CCT AGT ATG AAG ATT TCG GTG ATC) (Sec. nº id. 4) hibridando en el interior de la región recombinante (gen sat de pIR) y el cebador inverso ssu F3002 (CTG CAG GTT CAC CTA CAG CTA C) (Sec. nº id. 5) hibridando en el exterior de la región recombinante (la región 3' del gen ssu no está presente en pIR) y generó un fragmento característico de 2,3 kbp ausente en el control de tipo salvaje. Las otras dos parejas de cebadores fueron específicas para el segmento integrado de pIRmiz1 e incluyeron el cebador directo F2460 miz-1 y el cebador inverso F2461 miz-1 descritos anteriormente, generando el fragmento de PCR característico miz-1 de 2.6 kbp. La tercera pareja de cebadores fue el cebador directo F2460 miz-1 descrito anteriormente y el cebador inverso sat F3000 (GGC TAG TTA GGC GTC ATC CTG A) (Sec. nº id. 6) generando un fragmento de PCR característico de 4 kbp abarcando los genes sat y miz-1.

Para confirmar la construcción integrada a nivel nucleótido, el gen miz-1 con sus regiones flanqueantes fue amplificado por PCR a partir del ADN genómico de las células recombinantes de L. tarentolae ::pIRmiz1 usando la pareja de cebadores F2718 pIR-BgIII-dir. descrita anteriormente y F2719 pIR-BgIII-inv. (GGC CGA TTC ATT AAT GCA GGA C) (Sec. nº id. 7) que flanquea el sitio BgIII de pIRmiz1. Se secuenció el producto de PCR de 3 kbp y se encontró que se correspondía a la secuencia de nucleótidos predecida.

Cultivo de Leishmania tarentolae

L. tarentolae creció en caldo BHI (Difco) suplementado con 5 \mug/ml de hemina. Las células fueron cultivadas en cultivos estáticos usando placas de 24 pocillos o bien en cultivos mezclados activamente usando frascos de 2 L. La velocidad de agitación se ajustó a 50 rpms o menos. La manipulación de los cultivos se realizó según los procedimientos estándar descritos en (Alfonzo et al., 1998) y referencias de éste.

Identificación de la proteína Miz-1

Se inocularon células recombinantes de L. tarentolae ::pIRmiz1 en 10 ml de caldo BHI con 5 \mug/ml de hemina y se incubaron a 26ºC. 2 ml de cultivo en crecimiento se recogieron en la lectura OD_{600} = 1,0 por centrifugación (1 min a 10000 x g), el pelet celular se lisó en 200 \mul de tampón muestra Laemmli y se realizó una electroforesis de proteínas con muestras de 10 \mul en gel SDS-PAGE 10% según los procedimientos estándar. La proteína Miz1 se identificó por transferencia Western con anticuerpos monoclonales frente el marcador histidina introducido en el extremo N' de Miz-1 (Qiagen nº cat. 34610) y con anticuerpos policlonales de conejo desarrollados contra Miz-1 purificada.

Los resultados se muestran en la Fig. 3A. La columna T muestra el lisado total, la columna P muestra la fracción insoluble en TritonX-100 1% y la columna S show muestra la fracción soluble en TritonX-100 1% de las células L. tarentolae que expresan miz. La columna M muestra los marcadores de peso molecular, la columna C muestra el lisado de células control.

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Ejemplo 2

Ejemplo de la citoquina humana eritropoyetina (Epo) a partir del plásmido episómico Construcción de la cepa Leishmania tarentolae ARN-polimerasa T7 (T7 RNAP, por sus siglas en inglés)

Se construyó un vector pT724 que contenía ARN polimerasa T7 mediante excisión del gen T7RNAP fusionado a la señal de localización nuclear del virus SV40 del plásmido pLEW13 (Misslitz A. et al.; Tobin y Wirth, 1992; Wirtz et al., 1999) con los sitios BgIII y BamHI y subclonándolo dentro del sitio BgI II del vector pIR-SAT usando técnicas estándar de biología molecular. La integridad del marco de lectura abierto se verificó por secuenciación. Leishmania tarentolae se transformó con el vector resultante como se describe en el ejemplo 1 y se seleccionaron los clones resistentes al fármaco. La presencia de la proteína T7RNAP se identificó en los lisados totales de las células transformadas mediante transferencia Western con anticuerpos policlonales contra la T7RNAP.

Construcción de la expresión conducida por pIR-SAT y T7RNAP de la eritropoyetina humana

El vector de expresión pIR usado fue descrito en el ejemplo 1 pero el gen codificante de la estreptotricina acetiltransferasa se reemplazó con higromicina fosfotransferasa y se introdujo un cebador T7 en 5' de la región SSU. La longitud total de la secuencia codificante del precursor de la eritropoyetina humana que contiene la secuencia señal (EMBL acceso nº: X02158) se amplificó por PCR según los procedimientos estándar a partir de una fuente plasmídica (pcDNA3.1/GS-epo, Invitrogen) con secuencias que contienen cebadores para el enzima de restricción BamHI en ambos extremos del cebador. Se aplicaron técnicas estándar de clonación molecular para insertar el gen Epo en el vector pIR-Hyg en el sitio BgIII. La identificación de los clones positivos se realizó como arriba. El plásmido resultante se electroporó en la cepa Leishmania tarentolae T7 RNAP como se describe en el ejemplo 1, con la exención de que no se realizó ninguna linearización, asegurando que el ADN se retenía episómicamente. Los clones positivos se seleccionaron como se describe en el ejemplo 1 pero se usaron 50 \mug/ml^{-1} de higromicina para la selección. Los clones resistentes se seleccionaron, se introdujeron en medio BHI con 50 \mug/ml^{-1} de higromicina y se analizaron las células, así como el sobrenadante del cultivo, mediante transferencia Western con anticuerpos policlonales específicos. Los resultados se muestran en la Figura 3B. Las columnas T muestran que el sobrenadante de los cultivos contiene proteínas que reaccionan positivamente con los anticuerpos policlonales. La proteína recuperada en el sobrenadante migró lentamente. Este comportamiento se atribuyó a la glicosilación post-traduccional típica de Epo y se confirmó por desglicosilación con nuromidasa, que tuvo como resultado la emergencia de especies más pequeñas. La columna M (Fig. 3B) muestra los marcadores de peso molecular, la columna C muestra el lisado de las células control.

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<150> 99122222.5

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<210> I

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<211> 43

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<212> ADN

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 1

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ctgcagtgat cagtcgccac catgcggggt tctcatcatc atc

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43

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<210> 2

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ctgcagtgat caagatcttc actcggcagg cgggggac

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ctgcaccgtg gtcgactgc

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cctagtatga agatttcgqt gatc

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ctgcaggttc acctacagct ac

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ggctagttag gcgtcatcct ga

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ggccgattca ttaatgcagg ac

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Claims (25)

1. Un sistema de expresión y liberación que comprende un huésped L. tarentolae no patógeno y una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína heteróloga unida de forma que puede operar con un promotor y en el que la secuencia de ácido nucleico heteróloga está flanqueada por UTRs 3' y 5' de un gen huésped L. tarentolae transcrito activamente.

2. Un sistema de expresión y liberación de la reivindicación 1 en el que la secuencia de ácido nucleico heteróloga está flanqueada por secuencias señal para la secreción eficaz, el empalme en trans y la poliadenilación de un gen Kinetoplastidae transcrito activamente.

3. Un sistema de expresión y liberación de la reivindicación 1 a 2 en el que la secuencia de ácido nucleico heteróloga se incorpora en un plásmido o vector lineal o circular.

4. Un sistema de expresión y liberación de la reivindicación 1 a 3 en el que se incorporan dos o más plásmidos o vectores.

5. Un sistema de expresión y liberación de la reivindicación 1 a 4 en el que la proteína heteróloga es un enzima seleccionado del grupo consistente en catalasa, lacasa, fenoloxidasa, oxidasa, oxidoreductasas, celulasa xilanasa, peroxidasa, lipasa, hidrolasa, esterasa, cutinasa, proteasa y otros enzimas proteolíticos, aminopeptidasa, carboxipeptidasa, fitasa, liasa, pectinasa y otros enzimas pectinolíticos, amilasa glucoamilasa, \alpha-galactosidasa, \beta-galactosidasa, \alpha-glucosidasa, \beta-glucosidasa, manosidasa, isomerasa, invertasa, transferasa, ribonucleasa, quitinasa, y desoxirribo-
nucleasa.

6. Un sistema de expresión y liberación de la reivindicación 1 a 5 en el que el huésped L. tarentolae no patogénico o el vector o plásmido incorporado comprenden un gen marcador seleccionable.

7. Un sistema de expresión y liberación de la reivindicación 6 en el que el gen marcador se selecciona del grupo consistente en el gen de la higromicina fosfotransferasa (HYG) en combinación con higromicina, el gene de la neomicina fosfotransferasa (NEO) en combinación con G418, el producto del gen de Streptoalloteichus hindustanus BLE (BLE) en combinación con fleomicina y el gen codificante de la estreptotricina acetiltransferasa (SAT) en combinación con nourseotricina.

8. Un sistema de expresión y liberación de la reivindicación 1 a 7 en el que el promotor es un promotor génico de Kinetoplastidae activamente transcrito o un promotor heterólogo de iniciación fuerte de la transcripción.

9. Un sistema de expresión y liberación de la reivindicación 1 a 8 en el que la transcripción del ácido nucleico heterólogo es controlada por un elemento represor sensible en conexión con un gen represor incorporado y expresado.

10. Un sistema de expresión y liberación de la reivindicación 1 a 9 en el que al menos una copia del ácido nucleico heterólogo se localiza en un clúster génico transcrito activamente de la célula huésped L. tarentolae.

11. Un sistema de expresión y liberación de la reivindicación 10 en el que el clúster génico transcrito activamente es un clúster génico de ARNr.

12. Un sistema de expresión y liberación de la reivindicación 1 a 9 en el que el ácido nucleico heterólogo se localiza en un plástico transcrito episómicamente.

13. Un vector o plásmido que comprende el ácido nucleico heterólogo prolongado con un promotor y flanqueado por UTRs 5' y 3' de un gen huésped de L. tarentolae transcrito activamente.

14. Un vector o plásmido de la reivindicación 13 que comprende secuencias señal para la secreción eficaz, el empalme en trans y/o la poliadenilación de un gen Kinetoplastidae activamente transcrito.

15. Un vector o plásmido de la reivindicación 13 o 14 que comprende un gen marcador de selección.

16. Líneas celulares de L. tarentolae no patógeno de la reivindicación 1 que son transformadas de forma estable con el ácido nucleico heterólogo.

17. Líneas celulares de L. tarentolae no patógeno de la reivindicación 1 que son transformadas de forma estable con el ácido nucleico heterólogo, comprendiendo vectores o plásmidos de la reivindicación 13 a 15.

18. Un método para producir la proteína heteróloga en células huésped de L. tarentolae de la reivindicación 1 en el que una línea celular de L. tarentolae no patógeno transformada de forma estable, que comprende

a)

una secuencia de ADN codificante para un gen de un marcador seleccionable y

b)

una secuencia heteróloga de ADN codificante para una proteína deseada unida de forma que puede operar e integrada en un gen transcrito activamente,

se cultiva en medios de selección para la expresión génica heteróloga constitutiva.

19. Un método para producir la proteína heteróloga en células huésped de L. tarentolae de la reivindicación 1 en el que una línea celular de L. tarentolae no patógeno transformada de forma estable, que comprende

a)

una secuencia de ADN codificante para un gen de un marcador seleccionable y

b)

la secuencia heteróloga de ADN codificante para una proteína deseada unida de forma que puede operar en el interior de un ADN plasmídico mantenido episómicamente con un promotor activo,

se cultiva en medios de selección para la expresión génica heteróloga constitutiva.

20. Un método para producir una proteína heteróloga en células huésped de L. tarentolae de la reivindicación 1 en el que una línea celular de L. tarentolae no patógeno transformada de forma estable, que comprende

a)

una secuencia de ADN codificante para una ARN polimerasa heteróloga, integrada en el interior de un clúster génico transcrito activamente y

b)

una secuencia de ADN codificante para una marcador seleccionable, integrada en el interior de un clúster génico transcrito activamente y

c)

una secuencia de ADN codificante para un gen represor de la transcripción, integrada en el interior de un clúster génico transcrito activamente y

d)

una secuencia heteróloga de ADN codificante para una proteína deseada prolongada con el promotor heterólogo ARN polimerasa y un elemento sensible represor,

se cultiva con un marcador seleccionable y la expresión del gen heterólogo se induce con un inhibidor del represor heterólogo.

21. Un método de la reivindicación 20 en el que la ARN polimerasa heteróloga es ARN polimerasa T7 o T3.

22. Un método de la reivindicación 20 en el que el represor es un represor heterólogo Tet o Lac.

23. El uso de un sistema de expresión y/o liberación de la reivindicación 1 para la expresión de proteínas heterólogas.

24. El uso de un sistema de expresión y/o liberación de la reivindicación 1 para la liberación de proteínas heterólogas en el interior de células de plantas o animales por transfección con el huésped L. tarentolae no patógeno.

25. El uso de un sistema de expresión y/o liberación de la reivindicación 1 para la expresión y/o liberación de proteínas eucarióticas heterólogas.