ES2444275T3 - Deficiencia de dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa bifuncional en Tetrahymena y su uso - Google Patents

Deficiencia de dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa bifuncional en Tetrahymena y su uso

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ES2444275T3
ES2444275T3 ES06806785.9T ES06806785T ES2444275T3 ES 2444275 T3 ES2444275 T3 ES 2444275T3 ES 06806785 T ES06806785 T ES 06806785T ES 2444275 T3 ES2444275 T3 ES 2444275T3
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Abstract

Un procedimiento para producir una célula ciliada con actividad de de dihidrofolato reductasa (DHFR) reducida oesencialmente sin actividad de o con actividad de de timidilato sintasa (TS) reducida o esencialmente sin actividadde o con ambas actividades de dihidrofolato reductasa y de timidilato sintasa (DHFR-TS) reducidas o esencialmentesin actividad, que comprende las etapas de: a) transformación de células ciliadas insertando una construcción que contiene un alelo que altera el gen quecodifica la DHFR-TS endógena en al menos uno de los genes DHFR-TS endógenos del macronúcleo del ciliado(MAC). b) inducción de un proceso de mezclado alélico en las células ciliadas transformadas para generar células quetienen la construcción insertada en la mayoría de todos los genes DHFR-TS funcionales del MAC, e c) identificación de las células generadas en la etapa b) por cultivo comparativo con o sin timidina,y el gen DHFR-TS tiene una secuencia de nucleótidos de acuerdo con Sec. ID Nº 1.

Description

Deficiencia de dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa bifuncional en Tetrahymena y su uso
5 Campo de la invención
La presente invención se dirige a los campos de biología molecular recombinante, en particular al uso de una enzima marcadora bifuncional en Tetrahymena que permite la selección de transformandos y facilita el descubrimiento de fármacos en la investigación de parásitos protozoarios.
Antecedentes de la invención
Tetrahymena es un organismo unicelular eucariota que pertenece al reino Protozoa y que tiene dos núcleos, uno transcripcionalmente silente, el micronúcleo de línea germinal diploide (MIC) y uno transcripcionalmente activo, el
15 macronúcleo somático poliploide (MAC). En 1923, cuando el Premio Nobel Andre Lwoff tuvo éxito en el cultivo de Tetrahymena en cultivo puro, puso las bases de la explotación de este alveolado como modelo. Los descubrimientos en Tetrahymena hechos por Milestone son el descubrimiento de los motores de dineína, los telómeros, la catálisis mediada por ARN, la telomerasa y la función de las histona acetiltransferasas en la regulación de la transcripción. En las últimas décadas, las técnicas de biología molecular se han desarrollado como para alterar el genoma y el proteoma de Tetrahymena: los procedimientos de transfección de ADN comprenden entre otros la microinyección en el MAC por electroporación y bombardeo biolístico del MIC y MAC. Están disponibles plásmidos episomales basados en un replicón de ADNr, así como las técnicas knock-out/in basadas en recombinación homóloga. A nivel proteico, se ha llevado a cabo la expresión heteróloga de especies relacionadas y también se han silenciado las proteínas endógenas por una nueva técnica de antisentido ribosómico. Las ventajas de la utilización de
25 Tetrahymena en las aplicaciones biotecnológicas incluyen el crecimiento rápido, la alta biomasa, la fermentación en instalaciones ordinarias para bacterias/levaduras, la producción a gran escala, así como la existencia de medios baratos y definidos químicamente.
Hasta ahora, solamente se han descrito unos pocos marcadores que se puedan utilizar en Tetrahymena: las resistencias mediadas por mutación de punto ribosómica, una resistencia a la neomicina basada en un plásmido y un marcador complicado de selección de beta-tubulina que utiliza un promotor inducible en combinación con tubulinas mutadas que son resistentes/ sensibles al fármaco mitótico taxol1. Aún no está disponible ningún marcador auxotrófico verdadero que permita la selección sin el uso de antibióticos o fármacos. Esto es lo que solicita la presente invención.
35 Schlichterle, I Martha y col., desvelan en Molecular and general genetics vol. 250, Nº 6, 1996, páginas 665-673 un análisis de clonación y molecular del gen de la dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa bifuncional en el protozoario ciliado Paramecium tetraurelia.
Descripción de la invención
Las enzimas críticas en la biosíntesis de pirimidina son las enzimas dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidilato sintasa (TS). La DHFR cataliza la producción de tetrahidrofolato a partir del dihidrofolato; la TS se encarga de la transferencia de un grupo metilo de N5. N10-metilén- tetrahidrofolato a dUMP generando de esta manera dTMP y
45 tetrahidrofolato. Estas enzimas son cruciales para la síntesis de pirimidina y se han utilizado como marcadores auxotróficos en varios sistemas por destrucción génica dirigida, pero también se han desarrollado varios inhibidores (antifolatos) como fármacos antiparasitarios. En los animales, hongos y eubacterias el gen de la DHFR y TS se traducen por separado, mientras que en plantas, Alveolata y Euglenozoa tienen una fusión génica bifuncional que combina en una proteína las actividades de ambas enzimas (“DHFR-TS”).
La existencia de la enzima bifuncional en Tetrahymena pyriformis se postuló en 19842 y 19853 pero no se ha llevado a cabo ningún análisis funcional ni molecular biológico. En 20014 se publicó una secuencia de aminoácidos parcial de DHFR-TS, de una “cepa similar a T. pyriformis” sin determinar, pero a este trabajo le falta cualquier prueba de la relación del ADNc parcial descrito con la función de la enzima.
55 La presente invención proporciona una caracterización detallada del gen DHFR-TS de T. thermophila incluyendo la estructura génica y los datos funcionales de la enzima incluyendo datos de la función in vivo. Además de un marcador auxotrófico simple que se describe por primera vez en ciliados, la combinación de estos resultados con ciertas propiedades fuera de lo común de Tetrahymena dan como resultado una herramienta poderosa para el desarrollo y descubrimiento de nuevos antifolatos contra los parásitos apicomplejos como por ejemplo Plasmodium sp. (malaria), Toxoplasma gondii (toxoplasmosis) y Cryptosporidium sp. (criptosporidiosis).
Se han hecho grandes esfuerzos para luchar contra estos graves problemas en todo el mundo, dirigiéndose contra la DHFR-TS de los parásitos mencionados anteriormente con antifolatos. El éxito inicial en la lucha contra la malaria
65 fue superado por la aparición de cepas de Plasmodium resistentes a los fármacos. Especialmente en el caso de la malaria, la diversidad de DHFR-TS es múltiple debido a la existencia de cepas diferentes (P. falciparum, P. vivax, P.
malariae, P. ovale) y a la alta frecuencia de recombinación de ADN / mutaciones que producen nuevas resistencias una y otra vez. Revelando la estructura cristalina de las enzimas mutantes y por tanto DHFR-TS resistentes, se han desarrollado nuevos fármacos de molécula pequeña por modelado molecular asistido por ordenador. El problema principal es el ensayo de la eficacia de los fármacos candidatos: ya que los endoparásitos son difíciles de cultivar y 5 tienen un ciclo vital anormalmente complejo que hace casi imposible el ensayo directo de los nuevos compuestos. Se puede dar un rodeo, utilizando el gen deficiente dhr1 de cepas S5 de levaduras, que expresen la enzima funcional DHFR-TS parasitaria de interés y de esta manera reconstituir la deficiencia de dhr1. Sin embargo esta estrategia tiene muchas desventajas: el codón de utilización en parásitos apicomplejos, es muy diferente de todos los que se utilizan comúnmente en los sistemas de expresión como E. coli, levaduras y líneas celulares de mamíferos y algunos
10 de los ARNt que se necesitan para la traducción no son abundantes en estos modelos de organismos. Apicomplexa/ Sporozoa, pertenecen al grupo filogenético Alveolata, que posee varias características celulares biológicas especiales, la más notable es la presencia de alveolos corticales, vesículas aplanadas envueltas en una capa continua que sirve de soporte a la membrana. Ningún modelo de organismo descrito hasta ahora tiene esa variedad de propiedades especiales que tendrá una influencia en la absorción y virtudes de los fármacos.
15 Todos estos problemas mencionados anteriormente se pueden superar con el uso de Tetrahymena:
Pertenece a los Alveolata y es la especie más estrechamente relacionada con los apicomplejos. La Tetrahymena es capaz de crecer en medios químicos definidos sin la presencia de timidina compitiendo por una ruta funcional 20 silvestre para la síntesis de dTMP por medio de una enzima DHFR-TS bifuncional. La deficiencia en la actividad de de esta enzima debería dar líneas celulares que solo crecieran en medios suplementados con timidina. Para destruir la actividad de DHFR-TS se pueden utilizar varias técnicas comunes como por ejemplo, knockout del gen elegido, mutagénesis dirigida al sitio de aminoácidos esenciales y mutagénesis aleatoria. La selección de clones deficientes de DHFR-TS se puede llevar a cabo por replicación del cultivo en placas en medios con (T+) o sin 25 timidina (T-). Los clones potenciales deberían crecer solamente en T+ pero no en T-. La reconstitución satisfactoria de la actividad de la enzima se puede conseguir transformando las células mencionadas anteriormente con fragmentos de ADN que codifiquen una enzima DHFR-TS funcional que produzcan las células que crezcan en T-. Este procedimiento permite la selección de transformandos sin utilizar fármacos o antibióticos. Para el caso de los exógenos, DHFR-TS recombinante que se deriva de los parásitos apicomplejos,
30 se consigue un sistema modelo ideal para la selección de fármacos antifolato que se puede utilizar fácilmente en un sistema de alto rendimiento.
Se reivindica un procedimiento para producir una célula ciliada con actividad de dihidrofolato reductasa (DHFR) reducida o esencialmente sin actividad o actividad de timidilato sintasa (TS) reducida o esencialmente sin actividad o 35 actividades de dihidrofolato reductasa y de timidilato sintasa (DHFR-TS) reducidas o esencialmente sin actividad, comprendiendo las etapas de
a) transformar células ciliadas insertando una construcción que contiene un alelo que altera el gen que codifica la DHFR-TS endógena en al menos uno de los genes endógenos DHFR-TS del macronúcleo (MAC) del ciliado,
40 b) inducir un proceso de mezclado alélico en las células ciliadas transformadas para generar células que tengan la construcción insertada en la mayoría de todos los genes DHFR-TS funcionales del MAC, e
c) identificar las células generadas en la etapa b) por cultivo con y sin timidina.
45 El procedimiento de acuerdo con la invención también puede utilizar el hecho de que el micronúcleo (MIC) almacena la información genética para la descendencia sexual. En consecuencia el procedimiento de acuerdo con la invención también engloba que en la etapa a) la construcción que contiene el alelo que altera el gen codificante de DHFR-TS se inserta en al menos uno de los genes DHFR-TS endógenos del micronúcleo del ciliado (MIC), y en la etapa b) la
50 células que tienen la construcción insertada en la mayoría de todos los genes DHFR-TS funcionales del MAC se generan por reproducción de las células de la etapa a) con otras células ciliadas para producir una descendencia que contiene un nuevo MAC derivado del MIC alterado.
De acuerdo con la invención puede preferirse que el ciliado sea Tetrahymena, preferentemente Tetrahymena 55 thermophila.
El gen DHFR-TS de acuerdo con la invención puede tener una secuencia de nucleótidos según la Sec. ID Nº 1.
Se puede preferir además que la región de 1,5 kb secuencia arriba y abajo del gen endógeno de la célula que 60 codifica la enzima DHFR-TS bifuncional esté alterada.
El procedimiento de acuerdo con la invención puede comprender una etapa adicional de reconstitución de la actividad de de la DHFR-TS por transfección de las células con una molécula de ADN o ARN que codifique una enzima DHFR-TS funcional no endógena.
65 La expresión “no endógena” significa que la molécula de ADN o ARN está derivada de un organismo diferente, preferentemente de una especie alveolada diferente.
Además el procedimiento de acuerdo con la invención puede comprender una etapa adicional de reconstitución de la 5 actividad de de DHFR-TS por transfección de las células con una molécula de ADN o ARN que codifique una enzima DHFR-TS funcional endógena así como otra proteína.
La molécula de ADN o ARN que codifica una enzima DHFR-TS endógena o no endógena puede derivarse de un alveolado, preferentemente un ciliado, incluso más preferentemente de Tetrahymena y más preferentemente de Tetrahymena thermophila. También se puede derivar de un apicomplejo.
Además la molécula de ADN o ARN que codifica una enzima DHFR-TS funcional puede estar representada por la Sec. ID Nº 1 y la secuencia de aminoácidos de la enzima puede estar representada por la Sec. ID Nº 3.
15 La presente invención también comprende una célula ciliada con auxotrofía por la timidina. Preferentemente la célula ciliada de acuerdo con la invención tiene una actividad de DHFR reducida o no tiene esencialmente actividad o una actividad de TS reducida o no tiene esencialmente actividad o ambas actividades de DHFR-TS reducidas o no tiene esencialmente actividad. Dicha célula ciliada se puede obtener utilizando procedimientos como los que se describen en el presente documento.
También se desvela una célula ciliada con la actividad de DHFR-TS reconstituida, en la que la enzima DHFR-TS no es la forma endógena. Dicha célula ciliada puede obtenerse utilizando los procedimientos que se describen en el presente documento.
25 Además la presente invención engloba una célula ciliada con actividad reconstituida de DHFR-TS endógena que expresa otra proteína. Dicha célula ciliada puede obtenerse utilizando los procedimientos que se describen en el presente documento.
También se reivindica el uso de las células ciliadas de acuerdo con la presente invención que tienen una actividad enzimática reconstituida DHFR-TS no endógena en un ensayo para detectar compuestos químicos que afectan la actividad de la enzima DHFR-TS, que comprende las etapas de
a) poner en contacto las células con el compuesto a ensayar,
35 b) medir la actividad de la enzima DHFR-TS de las células, y
c) comparar la actividad de la enzima DHFR-TS con la actividad de la enzima DHFR-TS de las células de control.
Las células ciliadas de acuerdo con la invención que tienen una actividad enzimática reconstituida DHFR-TS endógena se pueden utilizar para la producción de otra proteína.
También está en el ámbito de la presente invención un ácido nucleico aislado que codifica la proteína DHFR-TS que tenga la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Sec. ID Nº 1.
45 Figura 1: Estructura genómica de la enzima DHFR-TS bifuncional de T. thermophila La estructura del gen DHFR-TS de T. thermophila consiste en tres exones (gris) y 2 intrones (negro). Los pares cebadores para la amplificación del ADN de la integración homóloga y la amplificación del CDS o ADNc se muestran en la parte de abajo.
Figura 2: pKOI: construcción knockout de DHFR-TS La figura 2 muestra la construcción knockout utilizada para el knockout dirigido del gen DHFR-TS en T. thermophila. Consiste en las regiones adyacentes 5’ y 3’ del gen DHFR-TS de T. thermophila y partes de su secuencia codificante (CDS), destruidas por un casete funcional de neomicina que confiere resistencia a la paromomicina.
55 Figura 3: Generación de cepas deficientes en DHFR-TS por mezclado alélico. Las cepas silvestres se transfectaron con pKOI. En una copia de 45 ARP el gen DHFR-TS endógeno se sustituye por la construcción knockout (etapa 2). Por división amitótica del MAC y selección de clones por alta presión surgirá que se han resuelto todos los genes DHFR-TS endógenos y se retienen solamente los genes DHFR-TS recombinantes y defectuosos (etapa 3).
Figura 4: Selección de células knockout DHFR-TS por crecimiento en timidina Las células Tetrahymena con gen DHFR-TS destruido (clon 1-3) no crecen sin la presencia de timidina (CDM-T), mientras que las células silvestres sí. La adición de timidina al medio (CDM+T) recupera el crecimiento.
65 Figura 5: Crecimiento de Tetrahymena deficiente en DHFR-TS comparada con el tipo silvestre Las cinéticas de crecimiento de las células knockout DHFR-TS comparadas con las células silvestres en medios con y sin timidina muestran que la cepa knockout (pKOI) crece igual de rápido que las células silvestres en medios suplementados con timidina (CDM+T). Las células knockout mueren sin la presencia de timidina (CDM-T). Las curvas se calcularon por los valores medios de al menos tres experimentos
5 independientes.
Figura 6: Integración apropiada de la construcción knockout DHFR-TS Esta figura señala el método PCR para determinar que la construcción desactivada/activada estaba integrada en los locus del gen DHFR-TS.
10 Se ensayaron tres células diferentes: K1 es el control silvestre, K2 son células transfectadas con un plásmido que llevaba solamente los casetes destructores pero no las secuencias genéticas DHFR-TS y pKOI DVL son células transformadas con el plásmido pKOI DVL. PCR1 es un control de la reacción de amplificación de 369 pb del gen de la beta-hexosaminidasa. PCR2 es para detectar DHFR-TS endógeno (nótese que en las células pKOI DVL el gen silvestre está aún en el MIC!). PCR3 solamente da lugar a un producto PCR para el
15 ADN pKOI DVL integrado correctamente. PCR4 muestra que se ha integrado el casete de expresión de longitud completa.
Figura 7: Función de diana desactivada de la enzima (DNasa) Se ensayó la actividad de DNasa de los sobrenadantes de tres clones transformados por pKOI DVL. Solo las
20 células inducidas (+) mostraron actividad alta de DNasa, aunque las células no inducidas mostraron una actividad enzimática ligeramente elevada comparada con la de las células silvestres debido a la baja actividad básica del promotor.
Figura 8: Expresión de diana desactivada
25 Las transferencias de Western muestran la expresión de la DNasa I recombinante humana: Solo las células transformadas e inducidas (+) muestran señales fuertes debido a los anticuerpos anti-DNasa I. Se visualiza la proteína de fusión PLA1-DNasa en el gráfico de la izquierda por las muestras de fragmentos celulares. Las bandas se producen a pesos moleculares mayores que en los controles positivos maduros y procesados. En el de la derecha, los sobrenadantes se sometieron a transferencia western; el tamaño de la proteína
30 segregada de Tetrahymena compite por un proceso correcto cuando se compara con el control positivo.
Figura 9: Visión de la reconstitución de la actividad de DHFR-TS por activación La etapa I muestra las construcciones necesarias para la recombinación homóloga en distintos genes DHFR-TS exógenos en el locus destruido del gen DHFR-TS de Tetrahymena. La cepa descrita en el ejemplo 1 se
35 transfecta con estos ADN haciendo posible la selección por el medio deficiente en timidina (etapa III). Después se obtienen líneas celulares por mezclado de alelos estable (etapa IV) que se pueden utilizar en la selección de fármacos antifolato.
Figura 10: Función enzimática (lipasa endógena) de diana activada
40 Comparable a la Figura 6 los genes de una lipasa de ciliado endógena se combinaron con un promotor inducible y las regiones adyacentes del gen DHFR-TS de Tetrahymena. Posteriormente se integró la construcción en un vector de transformación (construcción llamada pKOIX_M_Lipasa) y se transformaron en Tetrahymena. Después de la integración homóloga de la construcción de DHFR-TS en el locus DHFR-TS de Tetrahymena y a continuación de la selección de los clones (comparable al procedimiento descrito en la Fig.
45 3-Fig. 6), se ensayó la actividad de la lipasa en los sobrenadantes de un clon transformado con pKOIX_M_Lipasa. Solamente se ensayó la actividad de la lipasa en las células que tenían pKOIX_M_Lipasa. Solamente las células que tenían la construcción pKOIX_M_Lipasa integrada, mostraron altos niveles de actividad de la lipasa. Las células silvestres mostraron un nivel bajo de actividad enzimática de lipasa debido a la baja actividad promotora del promotor de lipasa endógeno. El gráfico inferior muestra la construcción
50 integrante en toda su longitud. La Figura 10 muestra la actividad de la lipasa en el sobrenadante de células silvestres y transformantes inducidos, medida con un ensayo enzimático de lipasa Reflectoquant® de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Figura 11:
55 La figura 11 muestra la construcción del casete de longitud total de integración/expresión para la lipasa (pKOIX_M_Lipasa), que se transformó en las células de Tetrahymena con el fin de obtener la sobreexpresión de Lipasa endógena de ciliados.
Ejemplos
60 Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar las realizaciones de la presente invención, pero no pretenden limitar su ámbito.
Células y cultivo celular 65 Las cepas de Tetrahymena thermophila B 1868.7 y B 2068.1 fueron amablemente proporcionadas por Peter J. Bruns y se cultivaron en medio de leche desnatada (2 % de leche desnatada, 0,5 % de extracto de levadura, 0,1 % de solución quelada de sulfato ferroso y 1 % de glucosa), en medio SPP o en CDM.
5 Amplificación del gen DHFR-TS de T. thermophila
El ADNc del gen DHFR-TS y sus sitios adyacentes 5’ y 3’ se pueden amplificar utilizando los siguientes pares cebadores. Los nucleótidos en minúscula codifican sitios de restricción de endonucleasas.
10 Amplificación de la región adyacente 5’ de DHFR-TS:
DHFR 5’1 F NotI: 5’-cccgcggccgcACAGAGTTAATGGAAATGGAGC-3’,
DHFR 5’2 R BamHI: 5’-gggggatccATATTTAAGCGATCTTTCAATGG-3; 15 Amplificación del ADNc DHFR-TS y el gen con intrones:
DHFR CDS F: 5’-cgcGAATTCATGAAAACAAGACATTTTGATATAGTT’TTAGC-3’,
20 DHFR CDS R: 5’-gcgCTCGAGTCAGACAGCCATTTTCATTTATATTTTAGGG-3’,
Amplificación de la región adyacente 3’ de DHFR-TS:
DHFR 3’1 F XhoI: 5’-gggctcgagATGCTCATGTTTACTCTAATCACG-3’, 25 DHFR 3’1 R Acc65I: 5’-gggggtaccAGTAAAAATAGAGTAGAAGGAG-3’.
Construcción de plásmidos
30 El plásmido pKOI (desactivación/activación) se construyó como sigue: Como estructura se utilizó el plásmido pBS II SK, para la selección y propagación en E. coli. Se amplificó el sitio 5’-DHFR-TS de integración de 1,5 kb utilizando el par cebador DHFR 5’ F Notl y DHFR 5’ 2 R BamHI clonados en el pBS II SK utilizando los sitios Notl y BamHI. Luego se clonó el casete de selección de 1,4 kb de la paromomicina del pH4T2 (neo2) en el pBS II SK intermediario por medio de los sitios BamHI y Smal. Finalmente el sitio de integración 3’ DHFR-TS se amplificó con los cebadores
35 DHFR 3’ 1 F Xhol y DHFR 3’ 1 R Acc65I y se clonó utilizando los sitios Xhol y Acc65I para finalizar el casete DHFR-TS desactivado.
El sitio Sacl de la estructura del pBS II SK se había destruido por mutagénesis dirigida al sitio para facilitar el uso del sitio Sacl endógeno en la secuencia integrante DHFR-TS 3’ y el sitio Xhol como sitio único de clonación en el pKOI. 40 Estos sitios se utilizaron para insertar casetes para la expresión de enzimas recombinantes (activación). En este estudio utilizamos un casete de expresión/secreción de DNasa I humana recombinante y un casete de expresión/secreción de lipasa de ciliados endógena. Para la DNasa consiste en los primeros 115 aa del precursor PLA1 endógeno y los aa 23-281 de la DNasa I humana madura. Para asegurar la traducción apropiada de esta proteína de fusión se utilizó un codón sintético optimizado del gen DNasa I humano. La expresión se controló por el promotor
45 inducible MTT-1 descrito anteriormente, la terminación se reguló por el terminador BTU2, como en el casete neo2 de pH4T27.
Transformación de plásmidos pKOI (bombardeo biolístico)
50 Utilizamos células de conjugación en crecimiento, así como vegetativas, y no conjugadas estacionarias de cepas de
T. thermophila. La transformación de las células de T. thermophila se llevó a cabo como describió anteriormente Gaertig y col.8
Ensayo de selección, mezclado alélico y desactivación de DHFR-TS
55 Ensayo de proliferación celular de T. thermophila: En primer lugar circ. 16 h tras el bombardeo biolístico los transformantes se cultivaron en el medio de leche desnatada. Después las células transformadas se cultivaron en el medio SPP con concentraciones crecientes de paromomicina (de 100 μg/ml a 1000 μg/ml) para apoyar el proceso de mezclado alélico. Tras 3-4 semanas cada clon se cultivó en placas de replicación CDM con y sin timidina (10 mg/ml).
60 Los clones desactivados DHFR-TS funcionales son los únicos capaces de crecer en el medio CDM suplementado con timidina. La viabilidad de las cepas desactivadas de DHFR-TS se controló determinando la cinética de crecimiento (Figura 5).
La ausencia del gen endógeno DHFR-TS del tipo silvestre en el MAC así como la completa integración del DHFR-ST 65 desactivado y la DNasa I rh desactivada en el casete se confirmó por PCR utilizando los siguientes cebadores:
DHFR01F: 5’-CTTTTTAACAGCCTGCTGCTCG-3’,
DHFR02R: 5’-GATTTTGATGCTTCAATAAGGTTG-3’,
5 DHFR03F: 5’-TTATTTGTTTTATCATAGTGGAAAAGG-3’,
DHFR04R: 5’-CAGACACCTCAATCATATCAAAG-3’,
DHFR05F: 5’-GGTCCTCCATCAGATTGTGG-3’
DHFR06R: 5’-CGCGTCGAGTCAGACAGCCATTTTCATTTA-3’
Hex01F: 5’-ATGCAAAAGATACTTTTAATTACTTTC-3’
15 Hex02R: 5’- TATATTTTAGGAATGTTGTAATC-3’
Se utilizó un plásmido pH4T2 que llevaba los mismos casetes de expresión/secreción neo2 y DNasa I como control de la PCR. El método PCR se ilustra en la Figura 6.
SDS-PAGE y transferencia Western
Se resuspendieron alícuotas de las células transformadas y sobrenadantes SPP en un tampón de ensayo y se separaron en SDS-PAGE al 15 %. Los geles se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se bloquearon en PBS que contenía un 0,05 % de Tween 20 y un 5 % de leche desnatada (PBS-TM). Se detectó la expresión de DNasa I
25 recombinante humana en los ciliados transformados por dos antisueros específicos de conejo contra DNasa I humana (antígeno: DNasa I recombinante humana, Pulmozyme, Roche). Ambos sueros detectaron el antígeno DNasa I recombinante. El suero se utilizó en una dilución 1:500 en PBS-TM. Después del lavado con PBS/T se aplicó un suero anticonejo conjugado con HRP. Se desarrollaron las transferencias utilizando quimioluminiscencia.
Ensayo de la actividad de DNasa I
Se llevó a cabo en ensayo de actividad de la DNasa basado en el verde de metilo como ya se ha publicado9. Las muestras se incubaron a 37 ºC durante 24 h en una placa microtiter. Se midió la absorbancia a 620 nm. Se consiguió la calibración del ensayo con diferentes cantidades de Unidades definidas de DNasa de Pulmozyme de Roche
35 (derivado CHO) en cada experimento y la regresión lineal. Estos resultados combinados con transferencia de western semi-cuantitativa se utilizaron para calcular la actividad específica de la DNasa I que se había expresado.
Ensayo de la actividad de lipasa
Se llevó a cabo el ensayo de actividad de la Lipasa (tiras de ensayo Reflectoquant® con el Reflectómetro RQflex®) según las instrucciones del fabricante (VWR International GmbH, Hilpertstraße 20a, 64295 Darmstadt, Alemania, número de artículo: 1.05851.0001).
Ejemplo 1: Generación de heterocariones auxotróficos
45 El protozoo T. thermophila pertenece a los ciliados. Estos eucariotas constan de dos núcleos, un macronúcleo somático (MAC) y el micronúcleo genético (MIC). El MIC es el núcleo de la línea germinal, es decir, guarda la información genética para la descendencia sexual. El MIC es diploide y contiene cinco pares de cromosomas. Por el contrario, el MAC es el núcleo somático y no se transmite ningún ADN MAC a la descendencia sexual. El MAC contiene 200-300 piezas replicantes autónomas (ARP) que se derivan del MIC. Cada una de estas unidades está presente en aproximadamente 45 copias excepto en el gen del ADNr que está amplificado independientemente a circ. 10.000 por célula. El ADN MAC es el ADN transcrito y por tanto es el responsable del fenotipo presente de las células de T. thermophila.
55 Es obvio que la manipulación genética en último término necesita la transformación del MAC funcional que es el que se encarga de la expresión proteica. Las primeras estrategias de expresión heteróloga se hicieron usando plásmidos que utilizan la enorme amplificación del gen del ADNr durante el desarrollo del MAC. Sin embargo la presencia episómica de estos plásmidos depende de la concentración del fármaco y el plásmido puede recombinarse homólogamente y no direccionalmente en unidades endógenas de ADNr.
La forma más prometedora es la transformación estable de las células. Esto significa la integración estable de los casetes de expresión en el MAC y/o el MIC de T. thermophila. Se puede conseguir la transformación del MIC por transformación estable del ADN cromosómico del MIC diploide. Después de la conjugación de dos diferentes tipos de emparejamiento desaparece el antiguo MAC de las células que se conjugan y se construyen nuevos MAC en la
65 progenie derivados de los MIC recombinantes que llevan la nueva información. Todo el proceso sigue las estadísticas de la genética Mendeliana. La ventaja de esta estrategia es que se obtienen clones estables que mantienen las propiedades genéticas y que se pueden cruzar por medio de la genética clásica para combinar varias propiedades de diferentes cepas de T. thermophila. Esta estrategia es muy elaborada y consume mucho tiempo. Además, se ha demostrado recientemente que los ARN scan derivados del antiguo MAC tienen un papel importante en la eliminación de ADN durante el desarrollo del MAC somático a partir de la línea germinal MIC. La secuencia
5 primaria de estos pequeños ARN explica como el MAC parental controla epigenéticamente la reordenación del genoma en el nuevo MAC. En el caso de transformantes estables MIC este mecanismo similar a ARNi inhibe el establecimiento y mantenimiento de los casetes de expresión ajenos en el nuevo MAC en desarrollo.
En lugar de una transformación episómica por plásmidos basados en ADNr o la transformación estable del MIC se
10 utilizó un atajo por la combinación de una transformación del MAC estable con una estrategia inmediata de mezclado alélico. Esta combinación tiene varias ventajas. En primer lugar, la transformación del MAC es mucho más eficaz porque hay al menos aproximadamente 45 sitios de integración potencial por locus génico. En segundo lugar, no solo se pueden transformar cepas conjugadas sino también no conjugadas, y por tanto definidas. Finalmente, las recolocaciones del genoma informadas recientemente en el MAC en desarrollo que están reguladas por
15 mecanismos de ARN scan se pueden atajar por transformación MAC combinada con mezclado alélico.
Para llevar a cabo los experimentos de desactivación/activación se amplificaron el gen DHFR-TS de T. thermophila y sus regiones adyacentes utilizando los pares cebadores DHFR 5’1 F Not, DHFR 5’2 R BamHI para la región 5’ región no codificante, el par cebador 3’1 F Xhot: 5, DHFR 3’1 R Acc65I para la región 3’ y los cebadores DHFR CDS
20 F, DHFR CDS R para la amplificación de la región codificante. La comparación de la región codificante de la estructura génica DHFR-TS con el ADNc DHFR-TS (amplificado por el mismo par cebador DHFR CDS F/R), reveló la arquitectura exón-intrón de la estructura (Figura 1).
Para empezar los experimentos de desactivación se construyó el plásmido pKOI (Figura 2). Se utilizó el casete neo2
25 de pH4T2 para controlar la entrada del plásmido con éxito por selección contra la paromomicina. El casete neo2 de pKOI está flanqueado por los fragmentos de 1,5 kb de la región 5’ y 3’ de las regiones no codificantes del gen DHFR-TS, respectivamente (Figura 2). Debido a que el pKOI carece de un origen apropiado para la replicación, los clones resistentes a la paromomicina de T. thermophila competían por un evento de recombinación homóloga apropiado en el locus génico DHFR-TS. Sin embargo, la prueba más convincente de la integración correcta en el
30 locus DHFR-TS es la pérdida de la actividad de DHFR-TS en la cepa transformada. En el caso de los ciliados para esto se necesita remplazar completamente todos los alelos cromosómicos DHFR-TS del tipo silvestre (∼45 ARP) por las ARP que incluye el casete desactivado. Nosotros lo conseguimos por mezclado alélico. Este mezclado alélico o fenotípico se basa en la distribución al azar de las unidades cromosómicas del MAC (ARP) durante la mitosis. Con el fin de forzar el proceso de mezclado en la dirección deseada – concretamente del gen de resistencia recombinante –
35 las células transformadas se cultivaron durante al menos 2-3 semanas utilizando concentraciones crecientes del fármaco paromomicina. Los clones simples se aislaron y se ensayaron para ver la deficiencia de DHFR-TS utilizando un medio químico mínimo determinado (CDM) con (+T) y sin timidina (-T). En la Figura 4 y la Figura 5 se demuestra que los clones DHFR-TS desactivados descubiertos son cepas realmente auxotrópicas: los mutantes son capaces de crecer en CDM con timidina como las cepas silvestres o las cepas con un mezclado alélico incompleta. En CDM
40 carente de timidina no son capaces de crecer (véase la Figura 4 y la Figura 5).
Ejemplo 2: Desactivación DHFR-TS para activar el gen de interés
La desactivación del gen endógeno DHFR-TS de T. thermophila también proporciona la posibilidad de la activación
45 de un gen ajeno más que se puede expresar heterólogamente en las cepas DHFR-TS desactivadas. Para este fin se construyó el plásmido pKOI DVL. Este consiste en la estructura del pKOI con un casete de expresión adicional que codifica los primeros 115 aminoácidos (aa) de la secuencia precursora del gen PLA1 y la DNasa I madura humana (aminoácidos 23 a 281). La construcción para la expresión de la lipasa endógena contiene la secuencia del péptido prepro-lipasa de ciliados-endógeno y la lipasa de ciliados endógena madura.
50 El péptido prepro PLA1 (aa 1 a 110) tiene una similitud significativa con los miembros de la familia de la catepsina L e interviene en la secreción al medio. Igual que el péptido prepro PLA1 el péptido prepro de lipasa de ciliados endógena interviene en la secreción de lipasa al medio.
55 En el caso de la DNasa los cinco aminoácidos adicionales (aa 111 a 115) deberían asegurar una escisión óptima de la proteína de fusión PLA1-DNasa I por propeptidasas endógenas. Por el contrario el casete de expresión neo2 de la proteína de fusión ppPLA115-DNasa está regulado por el promotor inducible MTT1. Se seleccionó el sistema inducible porque permite una discriminación clara entre la actividad de DNasa de la DNasa I recombinante humana expresada heterólogamente y la actividad basal que se debe al menos a dos DNasas endógenas. De acuerdo con
60 esto el sistema inducible se seleccionó también en el caso de la lipasa porque permite una discriminación clara entre el nivel basal de la actividad de la lipasa endógena y la actividad de la lipasa endógena homóloga sobre-expresada. La transformación, selección de los clones positivos y el mezclado alélico dirigido se hicieron como se expone en el ejemplo 1. Además la integración correcta y completa de ambos casetes de expresión (neo2 y el DNasa I) en el locus DHFR-TS se ensayó con un método PCR. La Figura 6 muestra que este es el caso.
65 Con el fin de demostrar el concepto pKOI, las células de estas cepas desactivadas DHFR-TS que tenían el casete de expresión ppPLA115-DNasa se trataron con y sin Cadmio. Solo las cepas inducidas mostraron una actividad de DNasa elevada en el sobrenadante (Figura 7). Para confirmar estos datos enzimáticos se utilizó un antisuero específico contra DNasa I humana para analizar los extractos celulares y el sobrenadante de estas cepas
5 desactivadas DHFR-TS que expresan DNasa humana por trasferencia de western. Los resultados ilustran que las cepas desactivadas DHFR-TS eran capaces de expresar y segregar la proteína recombinante humana funcional (Figura 8).
Ejemplo 3: Reconstitución recombinante de la actividad de DHFR-TS para crear cepas de selección de alta 10 producción de antifolatos
La reconstitución de la actividad de DHFR-TS en las cepas de Tetrahymena deficientes en DHFR-TS se puede hacer por expresión heteróloga de las enzimas DHFR-TS bifuncionales de otros Alveolata. Como ya se mencionó en la introducción, este grupo filogenético consiste en Ciliata, Dinoflagellata y Apicomplexa / Sporozoa. Especialmente
15 los Apicomplexa son de alto interés médico debido a que todos sus miembros son parásitos intracelulares y algunos de ellos causan enfermedades muy graves (malaria, toxoplasmosis, criptosporidiosis).
Aparte del hecho de que las cepas de T. thermophila deficientes en DHFR-TS en combinación con un plásmido/vector DHFR-TS proporcionan un nuevo marcador para la biología molecular, el mismo sistema se puede 20 utilizar para generar cepas de ensayo definidas para aplicaciones de desarrollo de fármacos. Debido a la estrecha relación filogenética también es posible recuperar la actividad de DHFR-TS en cepas deficientes de Tetrahymena con enzimas DHFR-TS de otros miembros del grupo Alveolata. Esto implica la aplicación de cepas de T. thermophila deficientes en DHFR-TS en la búsqueda y ensayos de nuevos fármacos anti DHFR-TS (antifolatos). Esto es de gran importancia porque los antifolatos han sido unos de los fármacos más prometedores en la lucha contra la malaria. El 25 hecho de que los fármacos anti-DHFR-TS se hayan administrado durante mucho tiempo a, por ejemplo, pacientes de malaria, es la razón de que durante las últimas décadas muchos de estos parásitos se hayan hecho resistentes. A día de hoy se están explorando muchas estrategias para encontrar nuevos fármacos más específicos y eficaces contra la enzima DHFR-TS del parásito. Como la investigación de nuevos folatos se basa en la determinación de la estructura utilizando técnicas NMR y de cristalización, la mayoría de estas estrategias son muy costosas en tiempo y
30 dinero.
Las cepas de T. thermophila deficientes en DHFR-TS que expresan una DHFR-TS parasitaria activa, no solo son capaces de crecer en un medio carente de timidina, sino que también son adecuadas para buscar nuevos antifolatos. Por tanto las cepas deficientes en DHFR-TS recuperadas por la bienzima homóloga de los parásitos 35 representa un sistema de ensayo in vivo simple y flexible conferible a otras enfermedades producidas por parásitos del grupo Apicomplexa. Por ejemplo, no se han considerado los antifolatos contra cepas de Plasmodium vivax porque no estaba disponible un sistema de ensayo in vivo apropiado y flexible para una estrategia de producción de alto rendimiento. Esto se puede hacer fácilmente por recuperación de la actividad de DHFR-TS de cepas de T. thermophila utilizando las bienzimas homólogas de Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale así 40 como enzimas de Apicomplexa / Sporozoa que causan toxoplasmosis y criptosporidiosis. La Figura 9 ilustra este concepto. Se utilizó la enzima DHFR-TS de la cepa 3D7 de Plasmodium falciparum sensible a la pirimetamina para recuperar la actividad de DHFR-TS en una cepa de T. thermophila que carecía de actividad de DHFR-TS. En paralelo, se ha ensayado una DHFR-TS de una cepa de Plasmodium falciparum que es resistente al tratamiento con pirimetamina (por ejemplo el mutante S108N DHFR-TS). Midiendo el efecto de la pirimetamina en unas curvas de
45 dosis respuesta de los dos transformandos distintos se puede determinar fácilmente la resistencia y la sensibilidad al fármaco. Posteriormente se pueden añadir nuevos fármacos potenciales al medio para mostrar su efectividad en mutantes DHFR-TS que ya son resistentes.
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<222> (1761)..(1839) 30 <223>
<220>
<221> Intrón
<222> (2191)..(2302)
<223> 35 <220>
<221> CDS1
<222> (1346)..(1760)
<223>
<220> 40 <221> CDS2
<222> (1840) .. (2190)
<223>
<220>
<221> CDS3 45 <222> (2303)..(2994)
<223>
<220>
<221> 3’UTR
<222> <(1)..(1760) 50 <223>
<220>
<221> 5’UTR <222>(2995)..( 4556)
<223> 55 <400> 1
Sec ID 2:
<210> 2
<211> 1458
<212> ADN
<213> Tetrahymena thermophile
<400> 2
Sec ID 3:
<210> 3
<211> 485
<212> PRT
<213> Tetrahymena thermophila
<400> 3

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para producir una célula ciliada con actividad de de dihidrofolato reductasa (DHFR) reducida o esencialmente sin actividad de o con actividad de de timidilato sintasa (TS) reducida o esencialmente sin actividad
    5 de o con ambas actividades de dihidrofolato reductasa y de timidilato sintasa (DHFR-TS) reducidas o esencialmente sin actividad, que comprende las etapas de:
    a) transformación de células ciliadas insertando una construcción que contiene un alelo que altera el gen que codifica la DHFR-TS endógena en al menos uno de los genes DHFR-TS endógenos del macronúcleo del ciliado
    10 (MAC). b) inducción de un proceso de mezclado alélico en las células ciliadas transformadas para generar células que tienen la construcción insertada en la mayoría de todos los genes DHFR-TS funcionales del MAC, e c) identificación de las células generadas en la etapa b) por cultivo comparativo con o sin timidina,
    15 y el gen DHFR-TS tiene una secuencia de nucleótidos de acuerdo con Sec. ID Nº 1.
  2. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que en la etapa a) la construcción que contiene un alelo que altera el gen que codifica la DHFR-TS endógena se inserta en al menos uno de los genes DHFR-TS endógenos del micronúcleo del ciliado (MIC), y en la etapa b) las células que tienen la construcción insertada en la mayoría de
    20 todos los genes DHFR-TS funcionales del MAC se generan por cruce de las células de la etapa a) con otras células ciliadas para producir una descendencia que contiene un nuevo MAC derivado del MIC alterado.
  3. 3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 y/o 2, en el que el ciliado es Tetrahymena, en particular
    Tetrahymena thermophila. 25
  4. 4. El procedimiento de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1-3, en el que además se ha alterado la región de 1,5 kb secuencia arriba y abajo del gen endógeno de la célula que codifica la enzima bifuncional DHFR-TS.
    30 5. El procedimiento de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1-4 que comprende una etapa adicional de reconstitución de la actividad de la DHFR-TS por transfección de las células con una molécula de ADN o ARN que codifica una enzima DHFR-TS endógena funcional así como otra proteína o enzima DHFR-TS no endógena funcional.
    35 6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la molécula de ADN o ARN que codifica una enzima DHFR-TS funcional se deriva de un alveolado.
  5. 7. El procedimiento de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 5 y/o 6, en el que la molécula de ADN o ARN que
    codifica una enzima DHFR-TS funcional se deriva de un ciliado. 40
  6. 8. El procedimiento de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 5 - 7, en el que la molécula de ADN o ARN que codifica una enzima DHFR-TS se deriva de Tetrahymena.
  7. 9. El procedimiento de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 5 - 6, en el que la molécula de ADN o ARN 45 que codifica una enzima DHFR-TS funcional se deriva de un apicomplejo.
  8. 10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en el que la secuencia de nucleótidos de la molécula de ADN o ARN que codifica una enzima DHFR-TS funcional es la Sec. ID Nº 1.
    50 11. Una célula ciliada con una auxotrofía por la timidina, obtenible por un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1.
  9. 12. La célula ciliada de acuerdo con la reivindicación 11 con actividad de DHFR reducida o esencialmente sin
    actividad o actividad de TS reducida o esencialmente sin actividad o ambas actividades de DHFR-TS reducidas o 55 esencialmente sin actividad, en particular obtenible por un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1.
  10. 13. Una célula ciliada con actividad de DHFR-TS reconstituida, obtenible por un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5.
    60 14. El uso de células ciliadas de acuerdo con la reivindicación 13 en un ensayo para detectar compuestos químicos que afectan a la actividad de la enzima DHFR-TS, que comprende las etapas de:
    a) poner en contacto las células con el compuesto a ensayar, b) medir la actividad de la enzima DHFR-TS de las células, y 65 c) comparar la actividad de la enzima DHFR-TS con la actividad de la enzima DHFR-TS de las células de control.
  11. 15. Un ácido nucleico aislado que codifica la proteína DHFR-TS que tiene la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Sec. ID Nº 1.
    Figura 2: pKOI: Construcción de inactivación de GHFR-TS
    El transformante contiene Pérdida de actividad de al menos un alelo DHFR-DHFR-TS por el reemplazo TS inactivado completo del gen DHFR-TS recombinante funcional con el alelo
    inactivado
    Figura 4: Selección de células DHFR-TS inactivadas por crecimiento en timidina
    Figura 7: Función enzimática de desactivación en la diana
    Figura 8: Expresión de la diana activada
    Figura 9: Resumen de la reconstitución de la actividad de DHFR-TS mediante activación
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