JP5091141B2 - テトラヒメナ二元機能性ジヒドロ葉酸還元酵素−チミジル酸合成酵素欠損およびその使用 - Google Patents
テトラヒメナ二元機能性ジヒドロ葉酸還元酵素−チミジル酸合成酵素欠損およびその使用 Download PDFInfo
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Description
即ち、これはアルベオラータ(Alveolata)に属し、アピコンプレキサに最も近い近縁種である。テトラヒメナは、二元機能性DHFR-TS酵素によるdTMP合成の機能性サルベージ経路を支持するチミジンの存在なしに、化学的に確定した培地中で培養することが可能である。この酵素活性における欠損により、チミジン添加培地においてのみ生長する細胞系が得られるべきである。DHFR-TS活性を破壊するため、例えば、標的遺伝子ノックアウト、必須アミノ酸の部位特異的突然変異およびランダム変異導入のような、様々な通常の技術を使用し得る。DHFR-TS欠損クローンのスクリーニングは、チミジンを含む(T+)か含まない(T−)培地中でのレプリカ平板培養によって実施し得る。可能性のあるクローンはT+でのみ生長し、T−では生長すべきではない。T−で生長するであろう細胞を産する機能性DHFR-TS酵素をコードするDNA断片で上記の細胞を形質転換することによって、酵素活性の再構成を成功裏に達成し得る。この方法によって、薬剤や抗生物質を使用せずに形質転換体を選択することが可能になる。寄生性アピコンプレキサに由来する外因性の組み換えDHFR-TSの場合、高スループットシステムにおいて容易に使用し得る、葉酸拮抗薬スクリーニングのための理想的なモデルシステムが達成される。
a)内因性DHFR-TSをコードする遺伝子を変化させる対立遺伝子を含む構造物を、繊毛虫の大核(MAC)の内因性DHFR-TS遺伝子の少なくとも一つに挿入することによって、繊毛虫細胞を形質転換する工程、
b)形質転換された繊毛虫細胞において対立遺伝子の類別を誘導して、MACのほとんどまたは全ての機能性DHFR-TS遺伝子において構造物が挿入された細胞を産生する工程、および
c)工程b)で産生された細胞を、チミジンを有するか有しない培養によって同定する工程
を含む。
a)該細胞を被験化合物と接触させる工程、
b)該細胞のDHFR-TS酵素活性を測定する工程、および
c)DHFR-TS酵素活性を対照細胞のDHFR-TS酵素活性と比較する工程
を含む。
テトラヒメナ好熱菌(Tetrahymena thermophila)B 1868.4株、B 1868.7株およびB 2068.1株を、ペーターJ.ブランズ(Peter J. Bruns)に御提供いただき、SPPまたはCDM培地中の脱脂粉乳培地(2%脱脂粉乳、0.5%酵母抽出物、0.1%硫酸第一鉄キレート溶液および1%グルコース)において培養した。
DHFR-TSのcDNA遺伝子およびその5'および3'隣接部位は、以下のプライマー対を用いて増幅し得る。小文字のヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼの部位を記号化したものである。
DHFR 5'1 F NotI: 5´-cccgcggccgcACAGAGTTAATGGAAATGGAGC-3´、
DHFR 5'2 R BamHI: 5´-gggggatccATATTTAAGCGATCTTTCAATGG-3;
DHFR-TSのcDNAおよびイントロンを有する遺伝子の増幅:
DHFR CDS F: 5´-cgcGAATTCATGAAAACAAGACATTTTGATATAGTTTTAGC-3´,
DHFR CDS R: 5´-gcgCTCGAGTCAGACAGCCATTTTCATTTATATTTTAGGG-3´,
DHFR-TS 3´隣接領域の増幅:
DHFR 3'1 F XhoI: 5´-gggctcgagATGCTCATGTTTACTCTAATCACG-3´,
DHFR 3'1 R Acc65I: 5´-gggggtaccAGTAAAAATAGAGTAGAAGGAG-3´
pKOI(ノックアウト/イン)プラスミドを以下の通り構築した:大腸菌における選択および増殖の骨格として、pBS II SKプラスミドを使用した。NotIおよびBamHI部位を用いてpBS II SK中にクローニングしたDHFR 5' 1 F NotIとDHFR 5' 2 R BamHIとのプライマー対を用いて、1.5 kbの5´-DHFR-TS挿入部位を増幅した。pH4T2 (neo2)由来の1.4 kbのパロモマイシン選択カセットを、BamHIおよびSmaI部位によって中間体pBS IISK中にクローニングした。最後に、プライマーDHFR 3' 1 F XhoIおよびDHFR 3' 1 R Acc65Iによって3´-DHFR-TS挿入部位を増幅し、XhoIおよびAcc65I部位を用いてクローニングして、DHFR-TSノックアウトカセットを完成した。
我々は、接合細胞、および、栄養増殖性非接合固定テトラヒメナ好熱菌(T. thermophila)株を使用した。テトラヒメナ好熱菌細胞の形質転換は、ゲルティッヒらによって先に記載されたとおり実施した。
テトラヒメナ好熱菌(T. thermophila)細胞増殖分析:遺伝子銃撃後、最初の約16時間、形質転換体を脱脂粉乳培地中で培養した。その後、形質転換細胞を、対立遺伝子の類別法を支持するためパロモマイシンの濃度を漸増した(100 μg/mL〜1000 μg/mL)SPP培地上で培養した。3〜4週間後、チミジン(10 mg/mL)含有または非含有CDMレプリカプレート上で、各クローンを培養した。機能性DHFR-TSノックアウトクローンのみが、チミジン添加CDM培地中で成長することが可能である。DHFR-TSノックアウト株の生存能力は、成長速度を測定することによってモニターした(図5)。
DHFR01F: 5´-CTTTTTAACAGCCTGCTGCTCG-3´,
DHFR02R: 5´-GATTTTGATGCTTCAATAAGGTTG-3´,
DHFR03F: 5´-TTATTTGTTTTATCATAGTGGAAAAGG-3´,
DHFR04R: 5´-CAGACACCTCAATCATATCAAAG-3´,
DHFR05F: 5´-GGTCCTCCATCAGATTGTGG-3´
DHFR06R: 5´-CGCGTCGAGTCAGACAGCCATTTTCATTTA-3´
Hex01F: 5´-ATGCAAAAGATACTTTTAATTACTTTC-3´
Hex02R: 5´- TATATTTTAGGAATGTTGTAATC-3´
形質転換細胞およびSPP上澄の一定分量を試料緩衝液中に再懸濁し、15% SDS-PAGEで分離した。ゲルをニトロセルロース膜上にブロットし、0.05%のTween 20および5%の脱脂粉乳を含有するPBS(PBS-TM)においてブロックした。形質転換した繊毛虫における組み換えヒトDNase Iの発現を、ヒトDNase Iに対するウサギ由来の2つの特異的抗血清によって検出した(抗原:組換えヒトDNase I、パルモザイム、ロシュ)。両血清は組換えDNase I抗原を検出した。血清は、PBS-TMで1:500に希釈して使用した。PBS/Tで洗浄した後、HRP接合抗ウサギ血清を適用した。化学発光を用いてブロットを発現させた。
メチルグリーンに基づくDNase活性分析を既刊のとおり実施した。サンプルをマイクロタイタープレート上、37℃で24時間インキュベートした。吸光度を620nmで測定した。各実験において、ロシュ(Roche)(CHO由来)のパルモザイムの規定されたDNase Iユニットを異なる量用い、線形回帰により、分析の検定を行った。半定量的ウエスタンブロット法と組み合わせたこれらの結果を用いて、発現されたDNase Iの比活性度を計算した。
製造元の説明書に従って、リパーゼ活性分析を実施した(リフレクトクアント(登録商標) (Reflectoquant)試験紙および反射率計RQflex(登録商標))(VWRインターナショナル社(VWR InteRNAtional GmbH)、独国ダームシュタッド(Darmstadt) 64295、ヒルペアシュトラーセ(Hilpertstrase) 20a、商品番号:1.05851.0001)。
原生動物であるテトラヒメナ好熱菌(T. thermophila)は繊毛虫に属する。これらの真核生物は、2つの核、体細胞系列の大核(MAC)および遺伝子の小核(MIC)よりなる。MICは、生殖細胞の核であり、すなわち、有性後代の遺伝情報を保持する。MICは2倍体であり、5対の染色体を含有する。これに対し、MACは体細胞核であり、MACのDNAは有性後代に受け継がれない。MACは、MICに由来する200〜300の自己複製断片(ARP)を含有する。これらのユニットはそれぞれ、細胞1個当り約10,000コピーに独立して増幅されるrDNAを除いて、約45コピー存在する。MACのDNAは転写されたDNAであるので、テトラヒメナ好熱菌の実際の表現型に関与する。
テトラヒメナ好熱菌(T. thermophila)の内因性DHFR-TS遺伝子のノックアウトもまた、DHFR-TSノックアウト株において異種発現し得るさらなる外来遺伝子においてノックする可能性を与える。この目的のため、pKOI DVLプラスミドを構築した。これは、PLA1遺伝子の前駆体配列の最初の115個のアミノ酸(aa)および成人DNase I(アミノ酸23〜281)をコードする、さらなる発現カセットを有するpKOI骨格よりなる。内因性リパーゼ発現のための構築物は、内因性繊毛虫リパーゼプレプロペプチド配列および成熟内因性繊毛虫リパーゼを含有する。
DHFR-TS欠損テトラヒメナ(Tetrahymena)株におけるDHFR-TS活性の再構築は、他のアルベオラータ(Alveolata)の二元機能性DHFR-TS酵素を異種発現することによってなし得る。序文で既に記した通り、この系統群は、繊毛虫類(Ciliata)、渦鞭毛藻虫類(Dinoflagellata)およびアピコンプレキサ(Apicomplexa)/胞子虫類(Sporozoa)よりなる。特に、アピコンプレキサは、全ての構成員が細胞内寄生体であり、それらの幾つかが非常に重篤な疾病(マラリア、トキソプラズマ症、クリプトスポリジウム症)を引き起こすことから、大いに医学的興味が持たれる。
1.ゲーティッヒ(Gaertig), J., ザッチャー(Thatcher), T.H., グ(Gu), L.およびグロフスキ(Gorovsky), M. A. テトラヒメナ好熱菌における陽性および陰性選択可能なβ−チューブリン遺伝子のエレクトロポレーション媒介置換(Electroporation-mediated replacement of a positively and negatively selectable beta-tubulin gene in Tetrahymena thermophila). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 91巻, 4549-4553頁 (1994年).
2.ガーレット(Garrett), C. E.ら. 原虫における二元機能性チミジル酸合成酵素−ジヒドロ葉酸還元酵素(A bifunctional thymidylate synthetase-dihydrofolate reductase in Protozoa). Mol. Biochem. Parasitol. 11巻, 257-265頁 (1984年).
3.コチファキ(Kotsifaki), H., カポウラス(Kapoulas), V.およびデリコンスタンチノス(Deliconstantinos), G. テトラヒメナ・ピリフォルミス細胞に対するメトトレキサート含有リポソームの標的化(Targeting of liposomes containing methotrexate towards Tetrahymena pyriformis cells). Gen. PharMACol. 16巻, 573-577頁 (1985年).
4.シュテフマン(Stechmann), A.およびキャバリエル−スミス(Cavalier-Smith), T. 誘導遺伝子融合の使用による真核生物系の発根(Rooting the eukaryote tree by using a derived gene fusion). Science 297巻, 89-91頁 (2002年).
5.ヘイスティングス(Hastings), M. D.およびシブレイ(Sibley), C. H. ピリメタミンおよびWR99210は三日熱マラリア原虫由来のジヒドロ葉酸還元酵素に対抗選択を働く(Pyrimethamine and WR99210 exert opposing selection on dihydrofolate reductase from Plasmodium vivax). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99巻, 13137-13141頁 (2002年).
6.シャン(Shang), Y.ら. 頑強な誘導−抑制プロモーターは、テトラヒメナ好熱菌の相同および異種遺伝子のノックアウト、条件付き発現および過剰発現を大いに促進する(A robust inducible-repressible promoter greatly facilitates gene knockouts, conditional expression, and overexpression of homologous and heterologous genes in Tetrahymena thermophila). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99巻, 3734-3739頁 (2002年).
7.ゲーティッヒ(Gaertig), J., グ(Gu), L., ハイ(Hai), B.およびグロフスキ(Gorovsky), M. A. テトラヒメナにおける高頻度ベクター媒介形質転換および遺伝子置換(High frequency vector-mediated transformation and gene replacement in Tetrahymena). Nucleic Acids Res. 22巻, 5391-5398頁 (1994年).
8.ゲーティッヒ(Gaertig), J.およびグロフスキ(Gorovsky), M. A. テトラヒメナにおけるDNA媒介形質転換(DNA-mediated transformation in Tetrahymena). Methods Cell Biol. 47巻, 559-569頁 (1995年).
9.シニクロピ(Sinicropi), D., ベーカー(Baker), D. L., プリンス(Prince), W. S., シッファー(Shiffer), K.およびシャック(Shak), S. DNAメチルグリーン基質によるDNase I活性の比色定量. Anal. Biochem. 222巻, 351-358頁 (1994年).
Claims (17)
- a)内因性DHFR-TSをコードする遺伝子を変化させる対立遺伝子を含む構造物を、繊毛虫の大核(MAC)の内因性DHFR-TS遺伝子の少なくとも一つに挿入することによって、繊毛虫細胞を形質転換する工程、
b)形質転換された繊毛虫細胞において対立遺伝子との組換えを誘導して、MACのほとんどまたは全ての機能性DHFR-TS遺伝子において挿入された構造物を有する細胞を産生する工程、
c)工程b)で産生された細胞を、チミジンを有するか有しない比較培養によって同定する工程
を含む、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)の活性が低下したか若しくは実質的に活性がない、または、チミジル酸合成酵素(TS)の活性が低下したか若しくは実質的に活性がない、または、ジヒドロ葉酸還元酵素およびチミジル酸合成酵素(DHFR-TS)の活性が低下した若しくは実質的に活性がない、繊毛虫細胞の製造方法であって、
繊毛虫がテトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophila)であり、かつ
DHFR-TS遺伝子が配列番号1のヌクレオチド配列を有する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、工程a)において、内因性DHFR-TSをコードする遺伝子を変化させる対立遺伝子を含む構造物を、繊毛虫の小核(MIC)の内因性DHFR-TS遺伝子の少なくとも一つに挿入し、かつ、工程b)において、MACのほとんどまたは全ての機能性DHFR-TS遺伝子において挿入された構造物を有する細胞が、工程a)の細胞を他の繊毛虫細胞と交配することによって産生されて、変化したMICに由来する新たなMACを含む後代を製造する、方法。
- 請求項1または2に記載の方法であって、DHFR-TS二元機能性酵素をコードする細胞の内因性遺伝子の1.5kbの上流および下流の領域が、さらに変更される、方法。
- 請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法であって、機能性非内因性DHFR-TS酵素をコードするDNAまたはRNA分子での細胞の形質転換によって、DHFR-TS活性を再構成する工程をさらに含む、方法。
- 請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法であって、機能性内因性DHFR-TS酵素および別のタンパク質をコードするDNAまたはRNA分子での細胞の形質転換によって、DHFR-TS活性を再構成する工程をさらに含む、方法。
- 請求項4または5に記載の方法であって、機能性DHFR-TS酵素をコードするDNAまたはRNA分子がアルベオラータ(alveolate)に由来する、方法。
- 請求項4〜6のいずれか1つに記載の方法であって、機能性DHFR-TS酵素をコードするDNAまたはRNA分子が繊毛虫に由来する、方法。
- 請求項4〜7のいずれか1つに記載の方法であって、機能性DHFR-TS酵素をコードするDNAまたはRNA分子がテトラヒメナ(Tetrahymena)に由来する、方法。
- 請求項4〜6のいずれか1つに記載の方法であって、機能性DHFR-TS酵素をコードするDNAまたはRNA分子がアピコンプレクサ(apicomplexan)に由来する、方法。
- 請求項5に記載の方法であって、機能性DHFR-TS酵素をコードするDNA分子のヌクレオチド配列が配列番号1である、方法。
- 請求項1に記載の方法によって得られた、DHFRの活性が低下したか若しくは実質的に活性がない、または、TSの活性が低下したか若しくは実質的に活性がない、または、DHFR-TSの両者の活性が低下した若しくは実質的に活性がない、繊毛虫細胞。
- 請求項4に記載の方法によって得られた、再構成DHFR-TS活性を有する繊毛虫細胞。
- 請求項5に記載の方法によって得られた、別のタンパク質を発現する再構成DHFR-TS活性を有する繊毛虫細胞。
- 請求項12に記載の繊毛虫細胞の、DHFR-TS酵素活性に影響する化合物を検出するアッセイにおける使用であって、
a)該細胞を被験化合物と接触させる工程、
b)該細胞のDHFR-TS酵素活性を測定する工程、および
c)DHFR-TS酵素活性を対照細胞のDHFR-TS酵素活性と比較する工程
を含む、繊毛虫細胞の使用。 - 請求項13に記載の繊毛虫細胞の、別のタンパク質の製造のための使用。
- 配列番号1に記載のヌクレオチド配列を有する、DHFR-TSタンパク質をコードする、核酸。
- 配列番号3に記載のアミノ酸配列を有する、DHFR-TSタンパク質。
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