KR20080049056A - 테트라히메나 이작용성 디히드로폴레이트리덕타아제-티미딜레이트 신타아제 결핍 및 그의 용도 - Google Patents
테트라히메나 이작용성 디히드로폴레이트리덕타아제-티미딜레이트 신타아제 결핍 및 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
디히드로폴레이트 리덕타아제(DHFR)가 감소되거나 또는 실질적으로 없거나, 또는 티미딜레이트 신타아제(TS)가 감소되거나 또는 실질적으로 없거나, 또는 디히드로폴레이트 리덕타아제 및 티미딜레이트(DHFR-TS)가 모두 감소되거나 또는 실질적으로 없는 섬모충 세포를 생성하는 방법으로서, a) 내생(endogenous) DHFR-TS를 코딩하는 유전자를 변화시키는 대립형질을 포함하는 작제물(construct)을 상기 섬모충 세포 대핵(MAC)의 하나 이상의 내생 DHFR-TS 유전자에 삽입하는 것에 의해 섬모충 세포를 형질전환시키는 단계, b) 상기 형질전환된 섬모충 세포에서 대립형질 조합(allelic assortment process)을 유도하여 상기 MAC의 대부분 또는 모든 기능성 DHFR-TS 유전자에 상기 작제물이 삽입된 세포를 생성하는 단계, 및 c) 티미딘 포함 또는 불포함 조건에서의 비교 배양에 의해 상기 단계 b)에서 생성된 세포를 식별하는 단계를 포함하는 것인 방법이 개시된다.
DHFR-TS, 이작용성 효소, 테트라히메나 써모필라
Description
본 발명은 재조합 분자 생물학 분야, 특히, 형질전환체(transformant)의 선택을 가능하게 하고 기생성 원생동물 연구에서 약물 발견을 촉진하는 테트라히메나의 이작용성 마커 효소(bifunctional marker enzyme)의 용도에 관한 것이다.
테트라히메나는 원생동물문에 속하고, 두 개의 핵, 전사적으로 비활성인(transcriptionally silent), 이배체 생식핵인 소핵(MIC) 및 전사적으로 활성인, 다배체의 영양핵인 대핵(MAC)를 갖는, 섬모를 갖는(ciliated) 진핵 단세포 개체이다. 1923년에, 노벨상 수상자인 Andre Lwoff가 순수 배양으로 테트라히메나의 증식에 성공했을 때, 이 알베올레이트(alveolate)를 모델 개체로 이용할 기반이 구축되었다. 테트라히메나에서 기념비적인 발견은 다이네인(dynein) 모터, 텔로미어(telomre), RNA-매개 촉매, 테로머라아제(telomerase) 및 전사 조절에서 히스톤 아세틸트랜스퍼라아제의 기능이다. 최근 수십 년 내에 테트라히메나의 게놈 및 프로테옴(proteome)을 변형시키는 분자 생물학적 기법이 개발되었다: DNA 형질감염(transfection)은 특히(inter alia) 전기천공(electroporation)에 의한 MAC로의 미세주입(microinjection) 및 MIC와 MAC의 생물투사적 충돌(biolistic bombardment)을 포함한다. rDNA-레플리콘(replicon)에 기반한 에피좀 플라스미드(episomal plasmid) 및 상동성 재조합(homologous recombination)에 근거한 넉-아웃/-인 기법이 이용가능하다. 단백질 수준에서, 관련된 종들의 이종(heterologus) 발현이 수행되고 또한 내인성 단백질이 신규한 안티센스-리보솜-기법에 의해 사일런싱되었다. 생물공학적 응용에서 테트라히메나를 이용하는 것의 장점은 빠른 성장, 높은 바이오매스, 통상적인 세균/효모 장치에서의 발효, 규모 확장성(up-scalability) 및 값싸고 화학적으로 정의된 배지(chemically defined media)의 존재를 포함한다.
지금까지, 테트라히메나에서 사용될 수 있는 여러 마커가 개시되었다: 리보솜 점 돌연변이 매개 저항성, 플라스미드 기반 네오마이신 저항성 및 유사분열성 약물(mitotic drug) 탁솔에 내성/감수성을 갖는, 돌연변이된 투불린과 조합된 유도성 프로모터를 이용한 복합 베타-투불린 선택 마커. 그러나, 항생제 또는 약물의 사용 없이 선택을 가능하게 하는 진정한 영양요구성(auxotrophic) 마커는 없다. 이 부분이 본 발명의 적용되는 부분이다.
피리미딘 생합성에서 핵심적인 효소는 효소 디히드로폴레이트 리덕타아제(DHFR) 및 티미딜레이트 신타아제(TS)이다. DHFR은 디히드로폴레이트로부터 테트라히드로폴레이트의 생성을 촉매하고; TS는 N5,N10-메틸렌-테트라히드로폴레이트로부터 메틸기를 dUMP로 전달하여, 그에 의해 dTMP 및 테트라히드로폴레이트를 생성한다. 이 효소들은 피리미딘 합성을 위해 필수적이기 때문에 표적화된 유전자 파괴(targeted gene disruption)에 의해 다양한 시스템에서 영양요구성(auxotrophic) 마커로 이용되었고, 또한 다수의 억제제(항폴린산제(antifolate))가 구충제(anti parasite drug)로 개발되었다. 동물, 균류 및 진정세균(eubacteria)에서, DHFR 및 TS 유전자는 별개로 번역되나, 식물, 알베올라타(Alveolata) 및 유글렌조아(Eugelenzoa)는 상기 두 효소 활성이 하나의 단백질("DHFR-TS")로 조합된 이작용성 융합 유전자를 갖는다.
테트라히메나 파이리포르미스(Tetrahymena pyriformis)에서 이작용성 효소의 존재는 1984년2 및 1985년3에 주장되었으나, 기능 분석 또는 심지어 분자 생물학적 분석은 수행되지 않았다. 결정되지 않은1 "테트라히메나 파이리포르미스-유사 변종(T. pyriformis-like strain)"의 DHFR-TS의 부분적인 아미노산 서열이 20014년에 발표되었으나4, 이 연구에는 개시된 부분적인 cDNA와 효소 기능 간의 연관에 대한 증거가 없다.
본 발명은 인 비보 기능에 대한 데이터를 포함한 DHFR-TS 효소에 대한 유전자 구조 및 기능 테이터를 포함한 테트라히메나 써모필라(T. thermophila) DHFR-TS 유전자의 상세한 특성규명을 제공한다. 섬모충에서 최초로 개시된 단순한 영양요구성 마커 외에, 이 결과들과 테트라히메나의 일부 특이한 특성들의 조합은 예를 들면, 플라스모디움 종(Plasmodium sp .)(말라리아), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)(톡소플라스마증) 및 크립토스포리디움 종(Cryptosporidium sp .)(크립토스포리디움증)과 같은 기생성 아피콤플렉산(apicomplexans)에 대한 신규한 항폴린산제의 개발 및 발굴을 위한 놀라울 정도로 강력한 도구를 산출한다.
전술된 기생충의 DHFR-TS를 항폴린산제에 의해 표적화하는 것에 의해 이와 같은 가장 심각한 전세계적 문제를 해결하고자 하는 많은 노력이 진행되고 있다. 말라리아 퇴치에서의 초기 성공은 약물 내성 플라스모디움 변종의 창궐에 의해 무력화되었다. 특히, 말라리아의 경우, 상이한 변종의 발생(플라스모디움 팔시파룸(P. falciparum), 플라스모디움 비백스(P. vivax), 플라스모디움 말라리애(P. malariae), 플라스모디움 오발(P. ovale) 및 거듭해서 새로운 내성을 생성하는 고 빈도의 DNA-재조합/-돌연변이 때문에, DHFR-TS의 다양성이 크다. 돌연변이되고 그에 의해 내성을 갖는 DHFR-TS 효소의 결정 구조를 규명하는 것에 의해, 컴퓨터 기반 분자 모델링(computer aided molecular modelling)에 의해 새로운 소형 분자 약물들이 개발되고 있다. 주요 문제는 약물 후보들의 효능 테스팅이다: 내부기생충(endoparasite)은 배양이 어렵고 비정상적인 복잡한 생애 주기(life cycle)을 갖기 때문에, 신규한 화합물의 직접적인 테스팅이 거의 불가능하다. 기능성, 기생성 DHFR-TS 목적 효소를 발현하여, dhrl 결핍을 재구성하는 dhrl 결핍 효모 변종5을 이용하는 우회방법(detour)이 개시되었다. 그러나, 이 방식은 다수의 단점을 갖는다: 기생성 아피콤플렉산의 코돈 사용(codon usage)은 대장균, 효모 및 포유동물 세포주와 같은 모든 통상적으로 사용되는 발현 시스템과 매우 상이하고 번역을 위해 필요한 일부 tRNA는 이 모델 개체들에서 풍부하지 않다. 알베올라타의 계통 군에 속하는 아피컴플렉사(Apicomplexa)/스포로조아(Sporozoa)는 다수의 특별한 세포 생물학적 특징을 가지며, 가장 두드러진 특징은 막을 지지하는 연속층에 충전된 편평화된 소포인 피질 꽈리(cortical alveoli)의 존재이다. 현재까지 개시된 모델 개체 중 어느 것도 약물 흡수 및 효능에 영향을 미치는 특정한 특성들의 이 조합을 갖지 않는다.
전술된 모든 문제들은 테트라히메나의 사용에 의해 극복될 수 있다:
테트라히메나는 알베올라타에 속하며 아피콤플렉산에 가장 밀접하게 관련된 종이다. 테트라히메나는 티미딘의 존재 없이 화학적 한정 배지(chemical defined medium)에서 성장할 수 있어서, 이작용성 DHFR-TS 효소에 의한 dTMP 합성에 대한 기능적인 구제 경로(salvage pathway)를 입증한다. 이 효소 활성의 결핍은 티미딘이 보충된 배지에서만 성장하는 세포주를 생성할 것이다. DHFR-TS 활성을 파괴하기 위해, 표적화된 유전자 넉아웃, 필수 아미노산의 부위-특이적 돌연변이생성(site-directed mutagenesis) 및 무작위 돌연변이생성(random mutagenesis)과 같은 다양한 통상적인 기법들이 이용될 수 있다. DHFR-TS 결핍 클론의 스크리닝은 티미딘 포함 배지(T+) 또는 티미딘 불포함 배지(T-)에서 평판 복사배양(replica plated culturing)에 의해 수행될 수 있다. 잠재적인 클론은 T+에서만 성장하고, T-에서는 성장하지 않는다. 효소 활성의 성공적인 재구성은 전술된 세포를 기능성 DHFR-TS 효소를 코딩하는 DNA 단편으로 형질전환시켜 T-에서 성장하는 세포를 생성하는 것에 의해 달성될 수 있다. 이 방법은 약물 또는 항생제를 상용하지 않고 형질전환체의 선택을 가능하게 한다. 외생의 재조합 DHFR-TS가 기생성 아피콤플렉산으로부터 유래되는 경우, 고 효율 시스템(high throughput system)에서 용이하게 이용될 수 있는 항폴린산제 약물 스크리닝을 위한 이상적인 모델 시스템이 달성된다.
디히드로폴레이트 리덕타아제(DHFR) 활성이 감소되거나 또는 실질적으로 없거나(reduced or essentially no DHFR activity), 또는 티미딜레이트 신타아제(TS) 활성이 감소되거나 또는 실질적으로 없거나, 또는 디히드로폴레이트 리덕타아제 및 티미딜레이트(DHFR-TS) 활성이 모두 감소되거나 또는 실질적으로 없는 섬모충 세포를 생성하는 방법으로서,
a) 내생(endogenous) DHFR-TS를 코딩하는 유전자를 변화시키는 대립형질(allele)을 포함하는 작제물(construct)을 상기 섬모충 세포 대핵(MAC)의 하나 이상의 내생 DHFR-TS 유전자에 삽입하는 것에 의해 섬모충 세포를 형질전환시키는 단계,
b) 상기 형질전환된 섬모충 세포에서 대립형질 조합(allelic assortment process)을 유도하여 상기 MAC의 대부분 또는 모든 기능성 DHFR-TS 유전자에 상기 작제물이 삽입된 세포를 생성하는 단계, 및
c) 티미딘 포함 또는 티미딘 불포함 조건에서의 배양에 의해 상기 단계 b)에서 생성된 세포를 식별하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 소핵(MIC)이 유성생식 자손(sexual progeny)을 위한 유전적 정보를 저장한다는 사실을 이용할 수 있다. 결과적으로, 본 발명에 따른 방법은 또한 단계 a)에서 내생 DHFR-TS를 코딩하는 유전자를 변화시키는 대립형질을 포함하는 작제물이 섬모충의 소핵(MIC)의 하나 이상의 내생 DHFR-TS 유전자에 삽입되고, 및 단계 b)에서 상기 변형된 MIC로부터 유래된 새로운 MAC를 포함하는 자손을 생성하기 위해 상기 단계 a)의 세포를 다른 섬모충 세포와 접합(breed)시키는 것에 의해, MAC의 대부분의 또는 모든 기능성 DHFR-TS 유전자에 삽입된 상기 작제물을 갖는 세포가 생성되는 것인 방법을 포괄한다.
본 발명에 따르면, 섬모충은 테트라히메나이고, 바람직하게는 테트라히메나 써모필라(Tetrahymena thermophila)인 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에 따른 DHFR-TS 유전자는 서열번호 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
DHFR-TS 이작용성 효소를 코딩하는 세포의 내생 유전자의 상류 및 하류 1.5 kb 영역(the region 1.5 kb up- and downstream of the cell's endogenous gene coding for the DHFR-TS bifunctional enzyme)이 추가적으로 변형되는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 세포를 기능성 비-내생 DHFR-TS 유전자를 코딩하는 DNA 또는 RNA 분자에 의한 형질감염에 의해 DHFR-TS 활성을 재구성하는 추가적인 단계를 포함할 수 있다.
용어 "비-내생(non-endogenous)"은 상기 DNA 또는 RNA 분자는 상이한 개체, 바람직하게는 상이한 알베올레이트 종으로부터 유래된다는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에 따른 방법은 기능성 내생(functional endogenous) DHFR-TS 효소 및 하나의 다른 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA에 의한 상기 세포의 형질감염에 의해 상기 DHFR-TS 활성을 재구성하는 추가적인 단계를 포함할 수 있다.
기능성 내생 또는 비-내생 DHFR-TS 효소를 코딩하는 DNA 또는 RNA 분자는 알베올레이트, 바람직하게는 섬모충, 훨씬 더 바람직하게는 테트라히메나, 및 가장 바람직하게는 테트라히메나 써모필라로부터 유래될 수 있다. 상기 분자는 또한 아피콤플렉산으로부터 유래될 수 있다.
또한, 기능성 DHFR-TS 효소를 코딩하는 DNA 또는 RNA 분자는 서열번호 1로 표시될 수 있고, 상기 효소의 아미노산 서열은 서열번호 3에 의해 표시될 수 있다.
본 발명은 또한 티미딘에 대한 영양요구성을 갖는 섬모충 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 섬모충 세포는 감소되거나 또는 완전히 제거된 DHFR 활성, 감소되거나 또는 완전히 제거된 TS 활성 또는 감소되거나 또는 완전히 제거된 DHFR-TS 활성을 갖는다. 상기 섬모충 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 수득가능할 수 있다.
재구성된 DHFR-TS 활성을 갖는 섬모충 세포가 또한 개시되며, 상기에서 DHFR-TS 효소는 내생 형태가 아니다. 상기 섬모충 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 수득가능할 수 있다.
또한, 본 발명은 또 다른 단백질을 발현하는 재구성된 내생 DHFR-TS 활성을 갖는 섬모충 세포를 포괄한다. 상기 섬모충 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 수득가능할 수 있다.
a) 세포를 테스트될 화합물과 접촉시키는 단계,
b) 상기 세포의 DHFR-TS 효소 활성을 측정하는 단계, 및
c) 상기 DHFR-TS 효소 활성을 대조구 세포의 DHFR-TS 활성을 비교하는 단계를 포함하는, DHFR-TS 효소 활성에 영향을 미치는 화학적 화합물을 검출하기 위한 분석법에서 재구성된 비-내생 DHFR-TS 효소 활성을 갖는 본 발명에 따른 섬모충 세포의 용도가 또한 청구된다.
재구성된 내생 DHFR-TS 효소 활성을 갖는 본 발명에 따른 섬모충 세포가 또 다른 단백질의 생산을 위해 이용될 수 있다.
서열번호 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 갖는 DHFR-TS 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 및 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 갖는 분리된 DHFR-TS 단백질이 또한 본 발명의 범위 내에 속한다.
도 1: 테트라히메나 써모필라 DHFR-TS 이작용성 효소의 게놈 구조
테트라히메나 써모필라의 DHFR-TS 유전자 구조는 3개의 엑손(회색)과 2개의 인트론(흑색)으로 구성된다. 상동성 삽입(homologous integration)을 위한 DNA를 증폭하는 프라이머 쌍 및 CDS 또는 cDNA를 증폭하는 프라이머 쌍이 바닥 부분에 도시된다.
도 2: pKOI: DHFR-TS 넉아웃 작제물
도 2는 테트라히메나 써모필라에서 DHFR-TS 유전자의 표적화된 넉아웃을 위해 이용된 넉아웃 작제물을 도시한다. 상기 작제물은 테트라히메나 써모필라 DHFR-TS 유전자의 3' 및 5' 플랭킹 영역(flanking region) 및 파로모마이신에 대한 저항성을 부여하는 기능성 네오마이신 카세트에 의해 파괴된, 그의 코딩 서열(CDS)의 부분으로 구성된다.
도 3: 대립형질 조합(allelic assortment)에 의한 DHFR-TS 결핍 변종의 제조
야생형 종을 pKOI로 형질감염시켰다. 45 ARP의 하나의 카피에서, 내생의 DHFR-TS 유전자를 넉아웃 작제물에 의해 치환시켰다(단계 2). MAC의 무사분열(amitotic division) 및 높은 선택 압력에 의해, 모든 내생성 DHFR-TS 유전자를 제외시키고 재조합 및 불완전 DHFR-TS 유전자만을 유지하는 클론들이 수득될 것이다(단계 3).
도 4: 티미딘에서의 성장에 의한 DHFR-TS 넉아웃 세포의 선택
티미딘의 존재가 없는 경우(CDM-T), 파괴된 DHFR-TS 유전자를 갖는 테트라히메나 세포(클론 1-3)는 성장하지 않으나, 야생형 세포들은 성장한다. 티미딘을 배지에 첨가하면(CDM+T) 성장을 회복한다.
도 5: 야생형 대비 DHFR-TS 결핍 테트라히메나의 성장
티미딘 포함 또는 티미딘 불포함 배지에서 야생형 세포 대비 DHFR-TS 넉 아웃 세포의 성장 역학(growth kinetics)은 넉 아웃 변종(pKOI)이 티미딘이 보충된 배지(CDM+T)에서 야생형 세포만큼 빠르게 성장한다는 것을 보여준다. 넉 아웃 세포는 티미딘이 존재하지 않는 경우(CDM-T) 사멸된다. 성장 곡선은 3회 이상의 독립적인 실험의 평균값에 의해 계산된다.
도 6: DHFR-TS 넉아웃 작제물의 적합한 삽입
본 도면은 넉 아웃/-인 작제물이 DHFR-TS 유전자 좌로 삽입되었는지 여부를 결정하기 위한 PCR 접근방법을 보여준다.
세 종류의 상이한 세포를 테스트하였다: Kl은 야생형 대조구이고, K2는 파괴시키는 카세트만을 포함하고 DHFR-TS 유전자 서열은 갖지 않는 플라스미드에 의해 형질감염된 세포이며, pKOI DVL은 pKOI DVL 플라스미드로 형질전환된 세포이다. PCRl은 베타-헥소오스아미니다아제(beta-hexosaminidase) 유전자의 369 bp를 증폭시키는 대조구 반응이다. PCR2는 내생의 DHFR-TS를 검출하는 것이다(pKOI DVL 세포에서, MIC에 여전히 야생형 유전자가 존재한다는 것에 유의함). PCR3은 올바르게 삽입된 pKOI DVL DNA에 대한 PCR-생성물만을 산출한다. PCR4는 전장 발현 카세트가 삽입되었다는 것을 보여준다.
도 7: 넉 인 표적(knock in target)의 효소 기능(DNase)
pKOI DVL로 형질감염된 3개의 클론의 상층액을 대상으로 DNase 활성을 분석하였다. 유도된 세포(+)만이 높은 수준의 DNase 활성을 보인다. 형질전환되었으나, 유도되지 않은 세포는 낮은 기본적인 프로모터 활성 때문에 야생형 대비 약간 증가된 효소 활성을 보인다.
도 8: 넉-인 표적의 발현
웨스턴 블롯은 재조합 인간 DNase I의 발현을 보여준다: 형질전환되고 유도된 세포(+)만이 항-DNase I 항체 때문에 강한 신호를 보인다. 세포내 PLA1-DNase-융합 단백질은 세포 용해물의 시료에 의해 좌측 블롯 상에서 가시화된다. 밴드는 성숙한 가공된 양성 대조구보다 높은 분자량에 존재한다. 우측에, 상층액에 대한 웨스턴 블롯이 표시된다: 테트라히메나의 분비된 단백질의 크기는 양성 대조구에 비교시, 올바른 가공을 입증한다.
도 9: 넉-인(knock in)에 의한 DHFR-TS 활성의 재구성 개요
단계 I은 파괴된 테트라히메나 DHFR-TS 유전자 좌로의 상이한 외래 DHFR-TS 유전자의 상동성 재조합을 위해 필요한 작제물을 도시한다. 실시예 1에 기재된 변종은 이 DNA에 의해 형질감염되어 티미딘의 결핍 배지에 의한 선택을 가능하게 한다(단계 III). 대립형질 조합 후에, 항폴린산제 약물 스크리닝에서 이용될 수 있는 상이한 재조합 DHFR-TS 특성을 갖는 안정한 세포주가 수득된다(단계 IV).
도 10: 넉 인 표적의 효소(내생 리파아제)의 기능
도 6과 유사하게, 내생의 섬모충-리파아제(Ciliate-Lipase)의 유전자가 유도성 프로모터 및 테트라히메나 DHFR-TS 유전자의 플랭킹 영역과 조합되었다. 뒤이어, 상기 작제물이 형질전환 벡터(pKOIX_M_Lipase로 지칭된 작제물)에 통합되고 테트라히메나로 형질전환된다. DHFR-TS 작제물의 테트라히메나 DHFR-TS 좌로의 상동성 통합 및 클론의 선택 후에(도 3 - 도 6에 도시된 절차와 유사함), pKOIX_M_Lipase로 형질전환된 하나의 클론의 상층액을 대상으로 리파아제 활성을 분석했다. pKOIX_M_Lipase 작제물을 통합한 세포들만이 높은 수준의 리파아제 활성을 보인다. 야생형 세포는 내생의 리파아제 프로모터의 낮은 프로모터 활성 때문에, 낮은 수준의 리파아제 효소 활성을 보인다. 하부의 그래프는 전장 통합 작제물(full-length integrative construct)을 보여준다. 도 10은 제조사의 Reflectoquant® 리파아제 효소 분석법으로 측정된 야생형 세포 및 유도된 형질전환체의 상층액 중의 리파아제 활성을 도시한다.
도 11:
도 11은 내생의 섬모충-리파아제의 과 발현을 수득하기 위해 테트라히메나 세포로 형질전환된, 리파아제에 대한 전장 통합/발현 카세트(pKOIX_M_Lipase)의 작제를 도시한다.
하기의 실시예는 본 발명의 구체예를 예시하기 위해 제공되나, 본 발명의 범위를 한정하도록 의도되지 않는다.
세포 및 세포 배양
테트라히메나 써모필라 B 1868.4, B 1868.7 및 B 2068.1은 Peter J. Bruns가 제공했고 CDM 배지 또는 SPP에 담긴 탈지유 배지(skimmed milk meidum)(2%, 탈지유, 0.5% 효모 추출물, 0.1% 황화철 킬레이트 용액 및 1% 글루코오스)에서 배양하였다.
테트라히메나 써모필라의 DHFR-TS 유전자의 증폭
DHFR-TS cDNA 유전자 및 그의 5' 및 3' 플랭킹 부위를 하기의 프라이머쌍을 이용하여 증폭시킬 수 있다. 소문자로 기재된 뉴클레오티드는 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)를 위한 부위를 코딩한다.
DHFR-TS 5' 플랭킹 영역의 증폭:
DHFR 5'1 F NotI: 5'-cccgcggccgcACAGAGTTAATGGAAATGGAGC-3',
DHFR 5'2 R BamHI: 5'-gggggatccATATTTAAGCGATCTTTCAATGG-3';
인트론을 포함한 DHFR-TS cDNA 및 유전자의 증폭:
DHFR CDS F: 5'-cgcGAATTCATGAAAACAAGACATTTTGATATAGTTTTAGC-3',
DHFR CDS R: 5'-gcgCTCGAGTCAGACAGCCATTTTCATTTATATTTTAGGG-3',
DHFR-TS 3'플랭킹 영역의 증폭:
DHFR 3'1 F XhoI: 5'-gggctcgagATGCTCATGTTTACTCTAATCACG-3',
DHFR 3'1 R Acc65I: 5'-gggggtaccAGTAAAAATAGAGTAGAAGGAG-3'.
플라스미드의 작제
하기와 같이 pKOI(넉 아웃/인) 플라스미드를 작제하였다: 대장균에서 선택 및 증식을 위한 백본으로서, pBS II SK 플라스미드를 사용하였다. Notl 및 BamHI 부위를 이용하여 pBS II SK로 클로닝된 DHFR 5' 1 F Notl 및 DHFR 5' 2 R BamHI 프라이머 쌍을 이용하여 1.5 kb 5'-DHFR-TS 통합 부위를 증폭하였다. 그 후, pH4T2 (neo2)로부터 유래된 1.4 kb 파로모마이신 선택 카세트를 BamHI 및 SmaI 부위에 의해 중간(intermediate) pBS II SK로 클로닝하였다. 최종적으로, 프라이머 DHFR 3' 1 F XhoI 및 DHFR 3' 1 R Acc65I에 의해 3'-DHFR-TS 통합 부위를 증폭시키고 XhoI 및 Acc65I 부위를 이용하여 클로닝하여 DHFR-TS 넉 아웃 카세트를 완성하였다.
3'-DHFR-TS 통합 서열의 내생 SacI 부위 및 Xho1 부위의 pKOI의 고유의 클로닝 부위로서의 이용을 촉진하기 위해 부위 특이적 돌연변이생성(site directed mutagenesis)에 의해 pBS II SK 백본의 SacI 부위를 파괴시켰다. 재조합 효소의 발현을 위한 카세트를 삽입하기 위해 이 부위들을 이용하였다(넉 인). 이 연구에서 본 발명자들은 인간 재조합 DNase I 발현/분비 카세트 및 섬모충-내생 리파아제 발현/-분비 카세트를 이용하였다. DNase의 경우, 내생 PLA1 전구체의 최초 115개의 아미노산 및 성숙한 인간 DNase I의 아미노산 22-281로 구성된다. 이 융합 단백질의 적절한 번역을 확보하기 위해, 코돈 최적화된(codon optimized) 합성 인간 DNase I 유전자를 사용하였다. 상기 발현은 이전에 개시된6 유도성 MTT-I 프로모터에 의해 제어되고, 종료는 pH4T27의 neo2 카세트에서와 같이, BTU2 터미네이터에 의해 조절된다.
pKOI 플라스미드의 형질전환(바이올리스틱 충격(biolistic bombardment))
본 발명자들은 접합(conjugating) 세포, 및 영양형(vegetative) 세포, 성장(growing) 세포 및 비-접합성 정지(non-conjugating stationary) 테트라히메나 써모필라 균주를 이용하였다. 테트라히메나 써모필라 세포의 형질전환을 Gaertig 등8에 의해 이전에 개시된 바와 같이 수행하였다.
선택, 대립형질 조합 및 DHFR-TS 넉 아웃 분석법
테트라히메나 써모필라 세포 증식 분석법: 바이올리스틱 충격 후 최초 약 16 시간 동안, 형질전환체를 탈지유 배지에서 성장시켰다. 그 후, 대립형질 조합 과정을 지원하기 위해 파로모마이신의 농도를 증가시키면서(100 ㎍/mL에서 1000 ㎍/mL까지) SPP 배지에서 성장시켰다. 3-4 주 후에, 티미딘(10 mg/mL)과 함께 또는 티미딘 없이 CDM 복제 플레이트 상에서 배양하였다. 기능성 DHFR-TS 넉 아웃 클론만이 티미딘으로 보충된 CDM 배지에서 성장할 수 있다. 성장 속도를 결정하여 DHFR-TS 넉 아웃 균주를 모니터링하였다(도 5).
MAC에 내생의 야생형 DHFR-TS 유전자의 부재 및 카세트인 DHFR-TS 넉 아웃 및 rhDNase I 넉 인의 완전한 통합을 하기의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 확인하였다:
DHFR0lF: 5'-CTTTTTAACAGCCTGCTGCTCG-3',
DHFR02R: 5'-GATTTTGATGCTTCAATAAGGTTG-3',
DHFR03F: 5'-TTATTTGTTTTATCATAGTGGAAAAGG-3',
DHFR04R: 5'-CAGACACCTCAATCATATCAAAG-3',
DHFR05F: 5'-GGTCCTCCATCAG ATTGTGG-3'
DHFR06R: 5'-CGCGTCGAGTCAGACAGCCATTTTCATTTA-3'
HexOlF: 5'-ATGCAAAAGATACTTTTAATTACTTTC-3'
HexO2R: 5'-TATATTTTAGGAATGTTGTAATC-3'
동일한 neo2 및 DNase I 발현/분비 카세트를 운반하는 pH4T2 플라스미드를 PCR 대조구로 이용하였다. PCR 전략은 도 6에 예시된다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯
형질전환된 세포와 SPP 상층액의 분획을 동일한 완충액에 재현탁시키고 15% SDS-PAGE 상에서 분리시켰다. 겔을 니트로셀룰로오스 막으로 블롯팅시키고 0.05% 트윈 20 및 5% 탈지유를 포함하는 PBS로 차단시켰다(PBS-TM). 형질전환된 섬모충에서 재조합 인간 DNase I의 발현은 토끼로부터 유래된 인간 DNase I에 대한 두개의 특정한 항 혈청에 의해 검출하였다(항원: 재조합 인간 DNase I, Pulmozyme, Roche). 두 개의 혈청 모두 재조합 DNase I 항원을 검출하였다. 상기 혈청은 PBS-TM에 의해 1:500의 희석 비율로 사용하였다. PBS/T로 세척한 후, HRP-컨쥬게이트된 항 토끼 혈청을 적용하였다. 화학발광(chemiluminescence)을 이용하여 블롯을 현상시켰다.
DNase I 활성 분석법
이미 공개된 바에 따라 메틸 그린 기반 DNase 활성 분석법을 수행하였다9. 시료를 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 상에서 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 620 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 실험 및 선형 회귀에서 Roche(CHO 유래) Pulmozyme의 정의된 DNase I 유닛의 상이한 양에 의해 상기 분석법의 보정을 수행하였다. 반-정량적(semi-quantitative) 웨스턴 블롯팅과 조합된 이 결과를 이용하여 발현된 DNase I의 비활성(specific activity)을 계산하였다.
리파아제 활성 분석법
제조사의 설명서에 따라 리파아제 활성 분석법(Reflectoquant® test strips together with the Reflectometer RQflex®)을 수행하였다(VWR International GmbH, Hilpertstraβe 20a, 64295 Darmstadt, Germany, article number: 1.05851.0001).
실시예 1: 영양요구성 이형핵(heterokaryon)의 생성
원생동물 테트라히메나 써모필라는 섬모충에 속한다. 이 진핵생물은 두개의 핵, 체세포성 대핵(MAC) 및 유전성 소핵(MIC)으로 구성된다. MIC는 생식핵(germline nucleus)(MIC)이고, 즉, 이는 유성생식 자손(sexual progeny)에 대한 유전적 정보를 저장한다. MIC는 이배체이고 5쌍의 염색체를 포함한다. 이와 대조적으로, MAC는 영양핵(somatic nucleus)이고 MAC DNA는 유성생식 자손에 전달되지 않는다. MAC는 MIC로부터 유래된 200-300개의 자율적으로 복제하는 조각(Autonomously Replicating Piece: ARP)을 포함한다. 이 단위들 각각은 독립적으로 세포당 약 10000 카피까지 증폭되는 rDNA 유전자를 제외하고는 약 45 카피로 존재한다. MAC DNA는 전사되는 DNA이고 따라서 테트라히메나 써모필라 세포의 실제 표현형을 담당한다.
유전공학은 궁극적으로 단백질 발현을 담당하는 기능성 MAC의 형질전환을 필요로 한다는 것이 명확하다. 이종 발현(heterologous expression)에 대한 최초의 접근방식은 MAC 발생 동안 rDNA 유전자의 광범위한 증폭을 이용하는 플라스미드를 이용하여 수행되었다. 그러나, 이 플라스미드의 에피좀으로서의 존재(episomal presence)는 약물 농도에 의존하고 플라스미드는 상동적으로(homologously) 및 방향성 없이(non-directionally) 내생의 rDNA 유닛으로 재조합될 수 있다.
보다 유망한 방식은 세포의 안정한 형질전환이다. 이는 발현 카세트의 테트라히메나 써모필라의 MAC 및/또는 MIC로의 안정한 통합을 의미한다. MIC 형질전환은 이배체 MIC의 염색체 DNA를 안정적으로 형질전환시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 두 개의 상이한 교배 유형(mating type)의 접합 후에, 접합하는 세포들의 구(old) MAC는 사라지고 새로운 MAC가 새로운 정보를 운반하는 재조합 MIC로부터 유래된 자손에 형성되었다. 전체 과정은 멘델 유전학의 통계학을 따른다. 이 방식의 장점은 유전적 특성을 유지하고 상이한 테트라히메나 써모필라 세포들의 다양한 특성들을 조합하기 위해 고전적 유전학을 통해 교배될 수 있는 안정한 클론을 수득한다는 것이다. 이 방식은 매우 정교하고 시간이 소요된다. 또한, 최근에 구 MAC로부터 유래된 스캔(scan) RNA가 생식핵인 MIC로부터 영양핵인 MAC의 발생 동안 DNA 제거에서 중요한 역할을 수행한다는 것이 입증되었다. 이 작은 RNA의 일차 서열은 부모 MAC가 새로운 MAC에서 어떻게 게놈 재배열을 후생유전적으로(epigenetically) 제어하는지를 설명한다. 안정한 MIC 형질전환체의 경우, RNAi-유사 메카니즘이 새로운 MAC의 발생에서 외래 발현 카세트의 구축 및 유지를 억제한다.
rDNA 기반 플라스미드의 에피좀 형질전환 또는 MIC의 안정한 형질전환 대신, 안정한 MAC 형질전환과 즉각적인 대립형질 조합 접근방식과의 조합에 의한 용이한 방법(shortcut)을 이용하였다. 이 조합은 여러 장점을 갖는다. 첫째, 유전자 좌 당 약 45개 이상의 잠재적인 통합부위들이 있기 때문에 MAC 형질전환이 훨씬 더 효율적이다. 둘째, 접합 세포 및 비-접합(non-conjugating) 세포 및 따라서 정의된 세포들이 형질전환될 수 있다. 마지막으로, 스캔 RNA 메카니즘에 의해 조절되는 발생중인 MAC에서 최근에 보고된 게놈 재배열은 대립형질 조합과 결합된 MAC-형질전환에 의해 간소화될 수 있다.
넉 아웃/-인 실험을 수행하기 위해, 테트라히메나 써모필라 DHFR-TS 유전자 및 그의 플랭킹 영역을 5'-영역 비코팅 영역을 위한 프라이머 쌍 DHFR 5'1 F Not, DHFR 5'2 R BamHI, 3' 영역을 위한 프라이머 쌍 DHFR 3'1 F XhoI: 5, DHFR 3'1 R Acc65I 및 코딩 영역의 증폭을 위한 프라이머 DHFR CDS F, DHFR CDS F을 이용하여 증폭하였다. DHFR-TS 구조 유전자의 코딩 영역과 DHFR-TS cDNA(동일한 DHFR CDS F/R 프라이머 쌍에 의해 증폭됨)의 비교는 상기 구조의 엑손-인트론 아키텍쳐를 보여주었다(도 1).
DHFR-TS 넉 아웃 실험을 개시하기 위해, 플라스미드 pKOI를 작제하였다(도 2). 파로모마이신에 대한 선택에 의해 상기 플라스미드의 성공적인 흡수(uptake)를 모니터링하기 위해 pH4T2의 neo2 카세트를 이용하였다. pKOI의 neo2 카세트는 각각 DHFR-TS 유전자의 비-코딩 영역의 5' 및 3' 영역의 1.5 kb 단편에 의해 둘러싸인다(도 2). pKOI는 적합한 복제 원점을 갖지 않기 때문에, 파로모마이신 저항성 테트라히메나 써모필라 클론은 DHFR-TS 유전자 좌에서 적합한 상동성 재조합의 발생을 보여준다. 그럼에도 불구하고, DHFR-TS 좌로의 올바른 통합에 대한 가장 확 실한 증거는 형질전환된 세포에서 DHFR-TS 활성의 상실이다. 섬모충의 경우, 이는 넉 아웃 카세트를 포함하는 ARP에 의한 모든 염색체 DHFR-TS 야생형 대립형질(~45 ARP)의 모든 완전한 치환을 요구한다. 본 발명자들은 대립형질 조합에 의해 이를 달성하였다. 이 대립형질 조합 또는 표현형 조합은 유사 분열 동안 MAC 염색체 유닛(ARP)의 무작위 분포에 근거한다. 조합 과정을 원하는 방향으로-즉, 재조합 저항성 유전자로- 진행시키기 위해, 약물 파로모마이신의 증가된 농도를 이용하여 2-3주 이상동안 배양하였다. 단일 클론을 분리하고 티미딘 포함(T+) 또는 티미딘 불포함(T-)인 최소 화학적 한정 배지(CDM)를 이용하여 DHFR-TS 결핍 여부를 테스트하였다. 도 4 및 도 5에서, 발견된 DHFR-TS 넉 아웃 클론은 진정한 영양요구성 세포이며; 돌연변이체는 야생형 세포 또는 불완전한 대립형질 조합과 같이 티미딘 포함 CDM에서 성잘할 수 있었다. 티미딘 불포함 CDM에서, 그들은 성장할 수 없었다(도 4 및 도 5 참조).
실시예 2: 목적 유전자를 넉 인하기 위한 넉 아웃 DHFR-TS
테트라히메나 써모필라의 내생 DHFR-TS 유전자의 넉 아웃은 또한 DHFR-TS 넉 아웃 균주에서 이종적으로 발현될 수 있는 또 다른 외래 유전자를 넉 인할 수 있는 가능성을 제공한다. 이 목적을 위해, pKOI DVL 플라스미드를 작제하였다. pKOI DVL 플라스미드는 pKOI 백본과 PLA1 유전자의 전구체 서열의 최초 115개의 아미노산 및 성숙한 인간 DNase I (23 내지 281번 아미노산)을 코딩하는 추가적인 발현 카세트 로 구성된다. 내생 리파아제의 발현을 위한 작제물은 내생-섬모충-리파아제 프리프로 펩티드(prepro peptide) 서열 및 성숙한 내생 섬모충-리파아제를 포함한다.
PLA1 프리프로 펩티드(1 내지 110번 아미노산)는 카텝신 L 패밀리의 구성물에 상당한 유사성을 가지며 배지 내로의 분비를 매개한다. PLA1 프리프로 펩티드와 유사하게, 내생-섬모충-리파아제 프리프로 펩티드는 리파아제의 배지로의 분비를 매개한다.
DNase의 경우, 5개의 추가적인 아미노산(111 내지 115번 아미노산)이 내생 프로-펩티다아제에 의한 프로 PLA1-DNase I 융합 단백질의 최적 절단을 보장해야 한다. neo2 카세트와 대조적으로, ppPLA115-DNase I 융합 단백질의 발현은 유도성 MTT1 프로모터에 의해 조절된다. 유도성 시스템은 이종적으로 발현된 재조합 인간 DNase I의 DNase 활성과 둘 이상의 내생 DNase에 의한 기초 활성(basal activity) 간의 명확한 구별을 가능하게 하므로, 유도성 시스템을 선택했다. 이에 따르면, 내생 리파아제 활성의 기초 수준과 상동성의 과발현된 내생 리파아제 활성 간의 명확한 구별을 가능하게 하므로 리파아제의 경우에도 유도성 시스템을 선택했다. 형질변환, 양성 클론의 선택 및 방향성 대립형질 조합(directed allelic assortment)은 실시예 1에 요약된 바와 같이 수행하였다. 또한, DHFR-TS 유전자 좌에서 두 개의 발현 카세트(neo2 및 DNase I)의 올바르고 완전한 통합을 PCR 방법에 의해 테스트하였다. 도 6은 이러한 경우를 보여준다.
pKOI 개념을 입증하기 위해, ppPLA115-DNase 발현 카세트를 갖는 이 DHFR-TS 넉 아웃 균주의 세포들을 카드뮴의 존재 및 부재 하에 처리하였다. 유도된 균주들만이 상층액에서 증가된 DNase 활성을 보였다(도 7). 이 효소 데이터를 확인하기 위해, 인간 DNase I에 대한 특이적 항혈청을 이용하여 이 인간 DNase 발현 DHFR-TS 넉 아웃 균주의 세포 추출물 및 상층액을 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 그 결과는 DHFR-TS 넉 아웃 균주들이 기능성 재조합 인간 단백질을 발현하고 분비할 수 있다는 것을 보여준다(도 8).
실시예 3 : 고속(high throughput) 항폴린산제 스크리닝용 균주를 생성하기 위한 DHFR-TS 활성의 재조합 재구성
DHFR-TS 결핍 테트라히메나 균주에서 DHFR-TS 활성의 재구성은 다른 알베올라타의 이작용성 DHFR-TS 효소를 이종적으로 발현하는 것에 의해 이루어질 수 있다. 서두에서 전술된 바와 같이, 이 계통발생학적 그룹은 실리아타(Ciliata), 디노플라겔라타(Dinoflagellata) 및 아피컴플렉사(Apicomlexa)/스포로조아(Sporozoa)로 구성된다. 특히, 아피컴플렉사는 모든 구성 개체가 세포내 기생충이고 그들 중 일부는 매우 심각한 질병(말라리아, 톡스플라스마증, 크립토스포리듐증)을 유발하기 때문에 의학적으로 중요하다.
DHFR-TS 플라스미드/벡터와 조합된 DHFR-TS 결핍 테트라히메나 써모필라가 분자 생물학을 위한 새로운 마커를 제공한다는 사실과 별개로, 동일한 시스템이 약물 개발 응용을 위한 한정된 테스트 균주(defined test strain)를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 밀접한 계통발생학적 관계 때문에, 결핍된 테트라히메나 균주에서 DHFR-TS 활성을 알베올라타 그룹의 다른 구성 개체들로부터 유래된 DHFR-TS 효소에 의해 회복시키는 것이 가능하다. 이는 신규한 항 DHFR-TS 약물(항폴린산제)의 탐색 및 테스트에서 DHFR-TS 결핍 테트라히메나 써모필라 균주의 응용을 암시한다. 항폴린산제는 말라리아 퇴치에서 가장 유망한 약물들 중 하나이기 때문에 매우 중요하다. 항 DHFR-TS 약물이 오랫동안 예를 들면 말라리아 환자에 투여되었다는 사실이 최근 수십 년 동안 다수의 기생충이 저항성을 가지게 된 이유이다. 현재 기생충의 DHFR-TS 효소에 대한 신규하고 보다 특이적이며 효율적인 약물을 찾기 위한 다수의 방법들이 시도되고 있다. 신규한 항폴린산제에 대한 탐색은 NMR 및 결정화 기법을 이용한 구조 결정에 의존적이기 때문에, 이와 같은 방법들의 대부분은 고도로 시간 및 비용 집약적이다.
활성의 기생충 DHFR-TS를 발현하는 DHFR-TS 결핍 테트라히메나 써모필라 균주는 티미딘 불포함 배지에서 성장할 수 있을 뿐 아니라, 그들은 또한 신규한 항폴린산제의 탐색에 적합하다. 따라서, 기생충의 상동성 이효소(bienzyme)에 의해 회복된 DHFR-TS 결핍 균주는 아피컴플렉사 그룹의 다른 질병 유발 기생충에 부여될 수 있는 단순하고 유연성 있는 인 비보 테스트 시스템을 나타낸다. 예를 들면, 플라스모디움 비백스(Plasmodium vivax) 균주에 대한 항폴린산제는 고속(high throughput) 접근방식을 위한 적합하고 유연성 있는 인 비보 시스템이 없기 때문에 고려되지 않았다. 이는 플라스모디움 비백스, 플라스모디움 말라리애(Plasmodium malariae), 플라스모디움 오발(Plasmodium ovale) 및 톡소플라스마증 또는 크립토스포리듐증을 유발하는 아피컴플렉사/스포로조아의 상동성 이효소를 이용하여 테트 라히메나 써모필라의 DHFR-TS 활성을 회복시키는 것에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 도 9는 이 개념을 예시한다. 피리메타민-민감성 플라스모디움 팔시파룸 3D7의 DHFR-TS 효소를 이용하여 DHFR-TS 활성이 결핍된 테트라히메나 써모필라 균주에서 DHFR-TS 활성을 회복시켰다. 이와 병행하여, 피리메타민 치료에 대해 내성을 갖는 플라스모디움 팔시파룸(예를 들면, DHFR-TS S108N 돌연변이체)으로부터 유래된 DHFR-TS를 테스트하였다. 두 개의 상이한 형질변환체에 대한 투여량 반응 곡선에서 피리메타민의 효과를 측정하는 것에 의해, 약물 저항성 및 감수성(sensitivity)을 용이하게 결정할 수 있다. 뒤이어, 여전히 내성을 갖는 DHFR-TS 돌연변이체에 대한 효과를 입증하기 위해, 새로운 잠재적 약물이 배지에 첨가될 수 있다.
참조문헌
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SEQUENCE LISTING
<110> Cilian AG
<120> Tetrahymena bifunctional Dihydrofolate Reductase - Thymidylate
Synthase Deficiency and its Use
<130> 062215wo
<140> PCT/EP 06/066545
<141> 2006-09-20
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 4556
<212> DNA
<213> Tetrahymena thermophila
<220>
<221> 3'UTR
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<220>
<221> CDS1
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<220>
<221> Intron
<222> (1761)..(1839)
<220>
<221> CDS2
<222> (1840)..(2190)
<220>
<221> Intron
<222> (2191)..(2302)
<220>
<221> 5'UTR
<222> (2995)..(4556)
<400> 1
acagagttaa tggaaatgga gctatgattg tcagtccttc tcgtgttcct cagagaggtg 60
gtgctattgg aactagacag aacttacctg atactatgta gcatattttc gctacaaacc 120
attaaatata acagccccag acagtagaag atttgcaaag aatggaagaa atataaagaa 180
atatagaaaa cgaaaacaat atttatagta ataataccca taataatata gaaaatccag 240
agaatgaaaa ttaggaatcg cgagtaaact aagttcctac tttcctataa aacaactaat 300
tttaaataaa caacatttct gataaaaaaa aatgagctaa ttgacaacct cgcctatcta 360
caaacaaata agttgtatta gctaattatt ctttacttac tcttctacta aaattttaat 420
ctaataaata aatttatata atcaaaaaca attttcttga tctgaagtaa atagcatgtc 480
cgccacctct aaaaataatc aaaataaaaa atacataaaa tttaagcaaa ttcaaaaaaa 540
ttcttaaaaa aaagaatgaa tgaatgaatg aagatggata caaagagcta tcaaaaaaga 600
aataactaat agaataattt attaaaatct ataaaatcat agatctaatt ccagtttttt 660
tcttctacga aagtgaaagt tagttttata agattgatag aaagatattt gtatctatta 720
gcattaaaat agaattaaga tcttctaaga tattctctat ccctacctta tacctctctt 780
ttactaatat acctataata aataacatct acttattaat ttatgatact ccttttattc 840
aaaattatta actaaaataa aaatttatta cagaaatctt acttttaaat tctaaaagtt 900
aagcttctaa ttactattaa ataaataaat aatatatatt tatcttgtat tttgtaaaaa 960
tatttcactt ttattgccat ttcagttcat tctatttatt catttctata ctttttgcta 1020
ttaacttaat aaaatatatt ttatactatg aaaatttact ttgttaagtt gagagaattt 1080
aattcttttt ataaaaaatc tatcttgaga ttactctagt atcatctaaa aatcaaaaat 1140
agctatttat aatttattgg cgcaatcctt aaaagatcgc gggtattatg aatcactaac 1200
tcattcactg gcttgcatcg cttaactttg aatttagctt atatatccgc tatattttta 1260
caaatcaaat tttaatttat aaaataagtg aaaagtaaat tgaaattaaa aatagaaatt 1320
taacaaataa acagactcag tataaatgaa aacaagacat tttgatatag ttttagctta 1380
gactttaaaa aaatagggta taggttataa gaacagttta ccatggagac tacctaatga 1440
gcttaaaaac tttaaaaaaa taactacaga aactaagaac aaaggcctat aaaacgctgt 1500
tatcatgggt aaaaatactt gggaagcact acctaaaaag caataaccat tgaaagatcg 1560
cttaaatatt gttatttcca ctactatgca agaggggtaa attgcagatc attcctacgc 1620
ctgtaaaagc ttagattctg ctttaaactt tttagaatag taaaattaaa tataagatgc 1680
ccttgtaatt ggaggagcta aactttgcca ataagcatta agcgatcaga gacttagata 1740
gattcatcta acaagagtag gtcagtagaa ttaaatttat taaatacttt ctttttatga 1800
acaaaagaga taattaaata acttttcaaa aatatttagg tgtcgaagtt gagtgcgatg 1860
tttttatgca aaaggactac ttaaaaaact ttgatatgat tgaggtgtct gaaacttaaa 1920
gcgaaaataa tttaaattat gattttacta ggtattttaa taagaattat aaaggataag 1980
ttgacccttc tctctttaag aaaatgtaca agcctcatca agaatattaa tacttagaac 2040
ttatcgatga aattataaag aatggacatg ttaaaacaga cagaactgga actggtacaa 2100
tttctcagtt tggcaagttg atgagatttg acttatcaaa gagttttcct ctgcttacta 2160
ccaaaaatgt tttttggaga ggtgtagtag aagtaataaa tatatttatt tatttattaa 2220
tttatagttt gatagattta aaaatgaaat ttagtctgat ttttagtaga ataaataaaa 2280
taatctaaat atataaatta ataggaactt atttggttta tcaaaggcag tacaaacagc 2340
aaaatacttt cagaaaaagg agttaaaata tgggacggta atggcagcag agaattttta 2400
gattaattag gctttaaaaa cagagaagaa ggagatttag gtcctgttta tggtttctaa 2460
tggagacact tcggtgctga atataaagat atgcatacaa attataaagg taaaggtgtc 2520
gaccagcttc aagatttaat taacacaata aagaaaaatc ctgacagcag aaggatgatt 2580
atgaatgcct ggaatgttaa agatctacca ttgatggctt tacctccttg tcatgtcatg 2640
agctagtttt atgtaaatga taataaacta agctgtatga tgtactaaag atcttgtgat 2700
atgggtttag gaataccatt taatatagcc agttatgctt tattgactca tatgatagct 2760
taagtcacta atatgtaagt tggagagttt atacatgttc taggtgatgc tcatgtttac 2820
tctaatcacg tagattaact aaaaatttaa ttagaaagag ctccataccc cttccctctt 2880
ttaaaaatta ataacaacaa gtaatataac tctattgaag acttcactct tgaagatttc 2940
gaattaattg gatacaacta tcaccctaaa atataaatga aaatggctgt ctgaaatgat 3000
taaagactta tatattttgg ataatcttac tactaaaata ctaactaact taaatggtta 3060
tatacaataa atctatctta ataagctatt ttaaatttta aatcaatcgt tcaattcttt 3120
attttataaa ctttcaaatc attatcaagc aaattttaaa taaatatttt ttttttatat 3180
attgttgaac ttttgttcag cctgaatggc atagagctaa gtaattgtaa agttgaaaca 3240
ttaaaaatca aaattcaata gaaaatttgg aaaaagaatt ttttatttag ttagaaataa 3300
aacaaattat ttatataatt ttttatagtt gattgatata tttatttatt taatttcata 3360
tttagagtga gcataatctt aggcacttta aaagctaagc tctaattaat tttagatttt 3420
atttgaatct ttatattata aaaatattaa atattattgt agaaaataga atttaattac 3480
tgaataggca tctttataga ttataatttt ctaaactttc tgattttgtt tgatatattt 3540
attaaatgat cataatttac ctaattatgt ctataaatag agtaaaaata tcatttttta 3600
agagtaataa tttactataa gtcaatctat aatccaacta aacttggtaa tttactcaaa 3660
ttttcaataa gttcttatac ttaatcattt cctaaatggc aattactaat tattattttg 3720
taatgaaaat taaatatata taataaaatc actaattaat ttaccttaaa cctaaattta 3780
aatattttaa acagctgaat tgagtgagta tagaagctat cgacaaaaca cattctttac 3840
atccaatatt atcactgttg ttttatattt tataatttaa ataaaaatct tataaaacaa 3900
tttaattaat tttactctaa attaaattat agtttattta attgattaaa tctacatagc 3960
tactctttaa aagcctgtgc ataactagtg cctatataat tatacctatc aataatttaa 4020
tttttagtaa ttataattaa ataagaattt actataattg aagggtaagg tttctaatag 4080
actaaaattc ggtaagtcca tttatgatat tattcaatga tttctaggag agagaacatt 4140
tacttaataa tatttaacag attaatttta aatctttttt aaaaaattct actttaatga 4200
taagtttaat tcagatagct acttacagaa attaactgtg tttattgaca attcttaatt 4260
aaattctatt ttattttcac taatttaata aaaaaaatag ctaaaaataa aatttttaat 4320
taaaataatt atactccaaa actagttcta gcttttttaa gctttaaaat tcacttaaat 4380
attcaaatac ttaagatata tctccttcta ctctattttt acttaataga ataattttta 4440
tatcataact cttaaaaact aaaattacct caacaaaaac gttagatttt caagatattg 4500
attttatttt agcttcaaaa aaaagtatta aagcccttct ttgcttattt aattgt 4556
<210> 2
<211> 1458
<212> DNA
<213> Tetrahymena thermophila
<400> 2
atgaaaacaa gacattttga tatagtttta gcttagactt taaaaaaata gggtataggt 60
tataagaaca gtttaccatg gagactacct aatgagctta aaaactttaa aaaaataact 120
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gcactaccta aaaagcaata accattgaaa gatcgcttaa atattgttat ttccactact 240
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tgccaataag cattaagcga tcagagactt agatagattc atctaacaag agtaggtgtc 420
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gaagacttca ctcttgaaga tttcgaatta attggataca actatcaccc taaaatataa 1440
atgaaaatgg ctgtctga 1458
<210> 3
<211> 485
<212> PRT
<213> Tetrahymena thermophila
<400> 3
Met Lys Thr Arg His Phe Asp Ile Val Leu Ala Gln Thr Leu Lys Lys
1 5 10 15
Gln Gly Ile Gly Tyr Lys Asn Ser Leu Pro Trp Arg Leu Pro Asn Glu
20 25 30
Leu Lys Asn Phe Lys Lys Ile Thr Thr Glu Thr Lys Asn Lys Gly Leu
35 40 45
Gln Asn Ala Val Ile Met Gly Lys Asn Thr Trp Glu Ala Leu Pro Lys
50 55 60
Lys Gln Gln Pro Leu Lys Asp Arg Leu Asn Ile Val Ile Ser Thr Thr
65 70 75 80
Met Gln Glu Gly Gln Ile Ala Asn His Ser Tyr Ala Cys Lys Ser Leu
85 90 95
Asn Ser Ala Leu Asn Phe Leu Glu Gln Gln Asn Gln Ile Gln Asp Ala
100 105 110
Leu Val Ile Gly Gly Ala Lys Leu Cys Gln Gln Ala Leu Ser Asp Gln
115 120 125
Arg Leu Arg Gln Ile His Leu Thr Arg Val Gly Val Glu Val Glu Cys
130 135 140
Asn Val Phe Met Gln Lys Asp Tyr Leu Lys Asn Phe Asp Met Ile Glu
145 150 155 160
Val Ser Glu Thr Gln Ser Glu Asn Asn Leu Asn Thr Asp Phe Thr Arg
165 170 175
Tyr Phe Asn Lys Asn Tyr Lys Gly Gln Val Asp Pro Ser Leu Phe Lys
180 185 190
Lys Met Tyr Lys Pro His Gln Glu Tyr Gln Tyr Leu Glu Leu Ile Asp
195 200 205
Glu Ile Ile Lys Asn Gly His Val Lys Thr Asp Arg Thr Gly Thr Gly
210 215 220
Thr Ile Ser Gln Phe Gly Lys Leu Met Arg Phe Asp Leu Ser Lys Ser
225 230 235 240
Phe Pro Leu Leu Thr Thr Tyr Asn Val Phe Trp Arg Gly Val Val Glu
245 250 255
Glu Leu Ile Trp Phe Ile Lys Gly Ser Thr Asn Ser Lys Ile Leu Ser
260 265 270
Glu Lys Gly Val Lys Ile Trp Asp Gly Asn Gly Ser Arg Glu Phe Leu
275 280 285
Asp Gln Leu Gly Phe Lys Asn Arg Glu Glu Gly Asp Leu Gly Pro Val
290 295 300
Tyr Gly Phe Gln Trp Arg His Phe Gly Ala Glu Tyr Lys Asp Met His
305 310 315 320
Thr Asn Tyr Lys Gly Lys Gly Val Asp Asn Leu Asn Asp Leu Ile Asn
325 330 335
Thr Ile Lys Lys Asn Pro Asp Ser Arg Arg Met Ile Met Asn Ala Trp
340 345 350
Asn Val Lys Asp Leu Pro Leu Met Ala Leu Pro Pro Cys His Val Met
355 360 365
Ser Gln Phe Tyr Val Asn Asp Asn Lys Leu Ser Cys Met Met Tyr Gln
370 375 380
Arg Ser Cys Asp Met Gly Leu Gly Ile Pro Phe Asn Ile Ala Ser Tyr
385 390 395 400
Ala Leu Leu Thr His Met Ile Ala Gln Val Thr Asn Met Gln Val Gly
405 410 415
Glu Phe Ile His Val Leu Gly Asp Ala His Val Tyr Ser Asn His Val
420 425 430
Asp Gln Leu Lys Ile Gln Leu Glu Arg Ala Pro Tyr Pro Phe Pro Leu
435 440 445
Leu Lys Ile Asn Asn Asn Lys Gln Tyr Asn Ser Ile Glu Asp Phe Thr
450 455 460
Leu Glu Asp Phe Glu Leu Ile Gly Tyr Asn Tyr His Pro Lys Ile Gln
465 470 475 480
Met Lys Met Ala Val
485
Claims (23)
- 디히드로폴레이트 리덕타아제(DHFR)가 감소되거나 또는 실질적으로 없거나, 또는 티미딜레이트 신타아제(TS)가 감소되거나 또는 실질적으로 없거나, 또는 디히드로폴레이트 리덕타아제 및 티미딜레이트 신타아제(DHFR-TS)가 모두 감소되거나 또는 실질적으로 없는 섬모충 세포를 생성하는 방법으로서,a) 내생(endogenous) DHFR-TS를 코딩하는 유전자를 변화시키는 대립형질을 포함하는 작제물(construct)을 상기 섬모충 세포 대핵(MAC)의 하나 이상의 내생 DHFR-TS 유전자에 삽입하는 것에 의해 섬모충 세포를 형질전환시키는 단계,b) 상기 형질전환된 섬모충 세포에서 대립형질 조합(allelic assortment process)을 유도하여 상기 MAC의 대부분 또는 모든 기능성 DHFR-TS 유전자에 상기 작제물이 삽입된 세포를 생성하는 단계, 및c) 티미딘 포함 또는 불포함 조건에서의 비교 배양에 의해 상기 단계 b)에서 생성된 세포를 식별하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 a)에서 상기 내생 DHFR-TS를 코딩하는 유전자를 변화시키는 대립형질을 포함하는 작제물이 상기 섬모충의 소핵(MIC)의 하나 이상의 내생 DHFR-TS 유전자에 삽입되고, 및 상기 단계 b)에서 상기 변형된 MIC로부터 유래된 새로운 MAC를 포함하는 자손을 생성하기 위해 상기 단계 a)의 세포를 다른 섬모충 세포와 접합시키는 것에 의해, 상기 MAC의 대부분의 또는 모든 기능성 DHFR- TS 유전자에 삽입된 상기 작제물을 갖는 세포가 생성되는 것인 방법.
- 제1항 및/또는 제2항에 있어서, 상기 섬모충은 테트라히메나인 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 섬모충은 테트라히메나 써모필라(Tetrahymena thermophila)인 것인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 하나 이상의 항에 있어서, 상기 DHFR-TS 유전자는 서열번호 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 하나 이상의 항에 있어서, 상기 DHFR-TS 이작용성 효소를 코딩하는 상기 세포의 내생 유전자의 상류 및 하류 1.5 kb 영역이 추가적으로 변형되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 하나 이상의 항에 있어서, 기능성 비-내생(non-endogenous) DHFR-TS 효소를 코딩하는 DNA 또는 RNA 분자에 의한 상기 세포의 형질감염에 의해 상기 DHFR-TS 활성을 재구성하는 추가적인 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 하나 이상의 항에 있어서, 기능성 내생(endogenous) DHFR-TS 효소 및 하나의 다른 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 분자에 의한 상기 세포의 형질감염에 의해 상기 DHFR-TS 활성을 재구성하는 추가적인 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제7항 및/또는 제8항에 있어서, 상기 기능성 DHFR-TS 효소를 코딩하는 DNA 또는 RNA 분자는 알베올레이트(alveolate)으로부터 유래되는 것인 방법.
- 제7항 내지 제9항 중 하나 이상의 항에 있어서, 상기 기능성 DHFR-TS 효소를 코딩하는 DNA 또는 RNA 분자는 섬모충으로부터 유래되는 것인 방법.
- 제7항 내지 제10항 중 하나 이상의 항에 있어서, 상기 기능성 DHFR-TS 효소를 코딩하는 DNA 또는 RNA 분자는 테트라히메나로부터 유래되는 것인 방법..
- 제7항 내지 제11항 중 하나 이상의 항에 있어서, 상기 기능성 DHFR-TS 효소를 코딩하는 DNA 또는 RNA 분자는 아피콤플렉산(apicomplexan)으로부터 유래되는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 기능성 DHFR-TS 효소를 코딩하는 DNA 또는 RNA 분자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1인 것인 방법.
- 티미딘에 대한 영양요구성(auxotrophy)을 갖는 섬모충 세포.
- 제14항에 있어서, DHFR 활성이 감소되거나 또는 실질적으로 없거나, 또는 TS 활성이 감소되거나 또는 실질적으로 없거나, 또는 DHFR-TS 활성이 감소되거나 또는 실질적으로 없는 것인 섬모충 세포.
- 제14항에 있어서, 제1항의 방법에 의해 수득가능한, DHFR 활성이 감소되거나 또는 실질적으로 없거나, 또는 TS 활성이 감소되거나 또는 실질적으로 없거나, 또는 DHFR-TS 활성이 감소되거나 또는 실질적으로 없는 것인 섬모충 세포.
- 재구성된(reconstituted) DHFR-TS 활성을 갖는 섬모충 세포.
- 제7항의 방법에 의해 수득가능한, 재구성된 DHFR-TS 활성을 갖는 섬모충 세포.
- 제8항의 방법에 의해 수득가능한, 또 다른 단백질을 발현하는 재구성된 DHFR-TS 활성을 갖는 섬모충 세포.
- a) 세포를 테스트될 화합물과 접촉시키는 단계,b) 상기 세포의 DHFR-TS 효소 활성을 측정하는 단계, 및c) 상기 DHFR-TS 효소 활성을 대조구 세포의 DHFR-TS 활성과 비교하는 단계를 포함하는, DHFR-TS 효소 활성에 영향을 미치는 화학적 화합물을 검출하기 위한 분석법에서 제17항 및/또는 제18항에 따른 섬모충 세포의 용도.
- 또 다른 단백질의 생산을 위한 제19항에 따른 섬모충 세포의 용도.
- 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DHFR-TS 단백질을 코딩하는 분리된 핵산.
- 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 분리된 DHFR-TS 단백질.
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