KR20210069602A - 리얼타임 ｐｃｒ을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 관상어인 구피에 피해를 주는 대표적인 원생생물인 테트라하이메나와 백점충을 리얼타임 PCR을 이용하여 동시에 모두 검출할 수 있는 기술로서, 기존의 구피의 원생생물 감염증 검사법 보다 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 구피의 원생생물 감염증을 검사할 수 있는 방법 및 키트를 제공한다. 본 발명에 따르면, 리얼타임 PCR을 이용하여 구피의 원생생물 감염증을 일으키는 원인체인 테트라하이메나와 백점충을 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 동시에 모두 검출할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 본 발명은 관상어인 구피(guppy)에 큰 피해를 주는 대표적인 원생생물인 테트라하이메나와 백점충을 구피의 원생생물 감염증 발병 초기에 특이도 및 민감도 높게 동시에 모두 검출할 수 있는 기술을 제공함으로써, 구피의 원생생물 감염증 방역 대책을 정확하고 신속하게 수립하여 적절한 초기 대처를 가능케 하고 구피의 원생생물 감염증의 진행과 치료 후 과정의 모니터링을 효율적으로 할 수 있다.
Description
본 발명은 리얼타임 PCR (실시간 중합효소 연쇄반응)을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트 및 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 관상어인 구피(guppy)에 큰 피해를 주는 대표적인 원생생물인 테트라하이메나(Tetrahymena)와 백점충을 리얼타임 PCR로 동시에 모두 검출할 수 있는 구피의 원생생물 감염증 검사 키트 및 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 구피의 원생생물 감염증을 일으키는 원인체인 테트라하이메나와 백점충을 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 동시에 모두 검출할 수 있는 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트 및 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 관상어인 구피(guppy)에 큰 피해를 주는 대표적인 원생생물인 테트라하이메나와 백점충을 구피의 원생생물 감염증 발병 초기에 특이도 및 민감도 높게 동시에 모두 검출할 수 있는 기술을 제공함으로써, 구피의 원생생물 감염증 방역 대책을 정확하고 신속하게 수립하여 적절한 초기 대처를 가능케 하고 구피의 원생생물 감염증의 진행과 치료 후 과정의 모니터링을 효율적으로 할 수 있는 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트 및 방법에 관한 것이다.
구피(guppy)는 포에킬리아(Poeciliidae)과에 속하는 열대송사리목 어류이며 학명은 포에킬리아 레티큘라타(Poecilia reticulata)이다. 구피의 원산지는 베네수엘라와 인근 섬 지역의 따뜻한 하천으로 모기의 유충의 제거를 위해 다양한 지역으로 전파되어 현재는 전 세계적으로 관상어로 인기가 많다. 구피는 다양한 색상과 지느러미 모양을 가지며 새끼를 낳는 난태생어의 특징을 가지고 있다.
전 세계적으로 관상어 시장 규모는 기자재 용품을 포함하여 연간 45조원에 이르며, 국내 시장도 연간 4천억원 이르는 것으로 추정된다(국내 관상어시장 규모, 농림수산식품부, 2009년 자료 참조). 관상어 중 구피는 난태생어로 사육과 번식이 쉽고 다양한 형질을 보유하고 있어 관상어로 인기가 매우 높다. 하지만, 대량 사육을 하는 특성과 열대어종으로 다소 높은 수온에서 사육하기 때문에 다양한 병원체에 노출되어 집단 폐사하는 경우가 많아 효과적인 질병의 관리방법이 필요하다.
가장 대표적인 구피의 질병으로는 섬모충류의 일종인 테트라하이메나(Tetrahymena)와 백점충에 의한 원생생물 감염증이 있다. 섬모충류는 동물성 단세포 생물 분류군의 하나로 전신에 섬모가 있어 이를 이용하여 이동한다. 짚신벌레, 나팔벌레, 종벌레, 테트라하이메나가 대표적인 섬모충류이며, 민물에 서식하면서 편리공생에서 병원체로도 변환할 수 있는 특징을 가진다. 테트라하이메나 피리포르미스(Tetrahymena pyriformis)와 테트라하이메나 코르리시(Tetrahymena corlissi)가 주요한 구피 감염의 원인으로 알려져 있으며, 다른 테트라하이메나의 감염도 가능하기에 특정 종을 선택적으로 검출하는 방법 보다는 동일 속을 검출하는 방식의 진단법이 보다 효과적이다.
한편, 백점병은 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)의 기생에 의해 발생하며, 백점충에 감염된 구피는 유영능력에 문제가 발생하고 백점충은 구피에 2차 감염을 일으켜서 폐사 등의 피해를 발생시키는 것으로 알려져 있다. 백점충은 기생 단계(parasitic stage)인 영양체(trophont), 생식 단계(reproductive stage)인 토몬트(tomont), 마지막으로 감염 단계(infective stage)인 세론트(theront)의 3단계 생활환을 가지며, 일반적으로 낮은 수온이 지속될 경우 구피에 감염을 일으키는 것으로 알려져 있다.
구피의 테트라하이메나 및/또는 백점충의 감염 여부를 확인하기 위한 방법으로는 현미경을 이용하거나 육안으로 관찰하는 방법이 널리 사용된다. 그러나 현미경 또는 육안으로 확인하는 방법은 구피의 원생생물 감염증의 초기에는 확인이 어렵다는 단점이 있고 정확한 진단이 어렵다. 구피의 원생생물 감염증을 초기에 검사하지 못하면 구피의 폐사로 이어지고 구피를 밀집하여 양식하는 양어장에서는 쉽게 감염증이 전파되어 구피의 집단 폐사의 위험이 있다.
따라서, 본 발명이 속한 기술분야에서는 구피의 원생생물 감염증 발병 초기에 신속하면서도 정확하게 그리고 특이도 및 민감도 높게 구피의 원생생물 감염증을 검사할 수 있는 새로운 기술의 제공이 요구되고 있다고 할 수 있다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명은 관상어인 구피(guppy)에 큰 피해를 주는 대표적인 원생생물인 테트라하이메나(Tetrahymena)와 백점충을 리얼타임 PCR로 동시에 모두 검출할 수 있는 구피의 원생생물 감염증 검사 키트 및 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 구피의 원생생물 감염증을 일으키는 원인체인 테트라하이메나와 백점충을 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 동시에 모두 검출할 수 있는 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트 및 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
추가로, 본 발명은 관상어인 구피(guppy)에 큰 피해를 주는 대표적인 원생생물인 테트라하이메나와 백점충을 구피의 원생생물 감염증 발병 초기에 특이도 및 민감도 높게 동시에 모두 검출할 수 있는 기술을 제공함으로써, 구피의 원생생물 감염증 방역 대책을 정확하고 신속하게 수립하여 적절한 초기 대처를 가능케 하고 구피의 원생생물 감염증의 진행과 치료 후 과정의 모니터링을 효율적으로 할 수 있는 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트 및 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기한 발명의 기술적 과제를 해결하고 상기한 발명의 목적에 부합되도록 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명자는 관상어인 구피에 피해를 주는 대표적인 원생생물인 테트라하이메나와 백점충을 리얼타임 PCR을 이용하여 동시에 모두 검출할 수 있는 기술로서, 기존의 구피의 원생생물 감염증 검사법 보다 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 구피의 원생생물 감염증을 검사할 수 있는 방법 및 키트를 고안하기에 이르렀다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "검체"란 어류의 체표, 표피 하층, 아가미, 지느러미, 내장 외에도 테트라하이메나 및/또는 백점충의 유전자 검출이 가능한 각종 시료, 예를 들어 어류의 체표 점액, 아가미 점액 또는 점질물, 살점, 그 밖에 테트라하이메나 및/또는 백점충의 유전자 검출이 가능한 다양한 어류 환경 샘플 등도 포함하는 개념으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "유전자 샘플"이란 DNA, RNA, 역전사 효소에 의해 RNA로부터 생성된 cDNA, pre-PCR (예비 PCR)을 통해 증폭된 DNA 또는 cDNA 등을 포함하는 광의의 개념으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 "리얼타임(real-time) PCR"이란 형광물질(fluorescent material)을 PCR 기법에 응용한 것으로 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission) 정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 방법이다. 이러한 리얼타임(real-time) PCR은 SYBR 그린(SYBR Green)을 사용하는 방법과 이중 표지된 프로브를 이용하는 방법으로 나누어진다.
SYBR 그린(SYBR green) 기법은 리얼타임 PCR 증폭 과정에서 증폭된 DNA에 SYBR 그린 염색약이 끼어들어가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광신호를 발생하게 되고 이러한 형광신호를 검출하여 표적 유전자의 존재 여부와 이로부터의 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있는 방법이다. 또한, 이중 표지된 프로브(dual labeled probe)를 이용한 리얼타임 PCR 기법은 5'말단에 형광물질이 표지되어 있고 3'말단에 소광물질(Quencher)이 표지된 이중 표지된 프로브를 이용하는 방법으로서, 이중 표지된 프로브에 의한 형광신호를 통해 이중 표지된 프로브가 표적 유전자의 PCR 증폭 산물과 어닐링되었는지 여부를 확인할 수 있고, 표적 유전자의 존재 여부와 이로부터의 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있는 방법이다. 본 발명에서는 상기 방법 이외에 TaqMan 프로브법 등 당업계에 알려진 리얼타임 PCR이 적용가능함은 물론이다.
본 발명은 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 방법에서 사용되는 리얼타임 PCR용 프라이머 세트를 제공한다. 본 발명의 리얼타임 PCR용 프라이머 세트는 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)의 18S rRNA 표적 유전자를 특이적으로 증폭하는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과, 테트라하이메나(Tetrahymena) 속(屬)의 18S rRNA 표적 유전자를 특이적으로 증폭하는 서열번호 4 및 5의 프라이머 쌍을 포함한다.
또한, 본 발명은 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)의 18S rRNA 표적 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 테트라하이메나(Tetrahymena) 속의 18S rRNA 표적 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함하는 구피의 원생생물 감염증 검사용 프로브 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트를 제공한다.
본 발명의 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트는,
백점충(Ichthyophthirius multifiliis)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서, 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)의 18S rRNA 표적 유전자를 특이적으로 증폭하는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과, 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)의 18S rRNA 표적 유전자에 특이적인 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와의 제1조합과,
테트라하이메나(Tetrahymena) 속을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서, 테트라하이메나(Tetrahymena) 속의 18S rRNA 표적 유전자를 특이적으로 증폭하는 서열번호 4 및 5의 프라이머 쌍과, 테트라하이메나(Tetrahymena) 속의 18S rRNA 표적 유전자에 특이적인 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와의 제2조합을 포함한다.
본 발명의 일구체예의 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트는, DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 더 포함한다.
본 발명의 일구체예의 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트에 있어서, 상기 표지물질은 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단과, 테트라하이메나(Tetrahymena) 속의 18S rRNA 표적 유전자 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단에 표지될 수 있다.
본 발명의 일구체예의 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트에 있어서, 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와, 테트라하이메나(Tetrahymena) 속의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브는 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지되는 것이 바람직하다. 이와 같이 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와, 테트라하이메나(Tetrahymena) 속의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브가 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 경우 1개의 검사 튜브에서 백점충과 테트라하이메나(Tetrahymena) 속을 동시에 모두 검출할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일구체예의 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭량과, 테트라하이메나(Tetrahymena) 속의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭량을 산출할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 방법은, 검체로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계와, 전술한 바와 같은 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트를 이용하여, 상기 유전자 샘플을 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와, 리얼타임 PCR 결과에 기초하여 상기 검체 내의 백점충 및 테트라하이메나(Tetrahymena) 속의 원생생물을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 방법은, 증폭 전, 상기 각 표적 유전자의 카피수를 알고 있는 유전자 샘플인 양성 표준자를, 전술한 바와 같은 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트와 상기 각 표적 유전자와 관련하여 유전자 증폭량을 나타내는 표지물질을 이용하여 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
상기 양성 표준자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하여 얻어진 표준곡선으로부터 상기 양성 표준자의 카피수와, Cp값 또는 Ct값을 대응시키는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 각 표적 유전자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 각 표적 유전자를 PCR 증폭하여 얻은 Cp값 또는 Ct값을 상기 양성 표준자의 카피수에 대응시켜, 상기 검체 내의 상기 각 표적 유전자를 정량하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 일구체예의 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 방법에 있어서, 상기 표지물질은 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단과, 테트라하이메나(Tetrahymena) 속의 18S rRNA 표적 유전자 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단에 표지될 수 있다.
이와 관련하여 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와, 테트라하이메나(Tetrahymena) 속의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브는 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지되는 것이 바람직하다. 이와 같이 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브와, 테트라하이메나(Tetrahymena) 속의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브가 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 경우 1개의 검사 튜브에서 백점충과 테트라하이메나(Tetrahymena) 속을 동시에 모두 검출할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일구체예의 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 방법에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭량과, 테트라하이메나(Tetrahymena) 속의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭량을 산출할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단은 Cy5, Cy3, x-로다민, 텍사스 레드, SYBR 그린 (SYBR green), FAM, VIC, JOE, NED, HEX, 555 및 TET 등과 같은 형광물질로 표지될 수 있고, 프로브의 다른쪽 말단, 예를 들어 3'말단은 IABkFQ, DABCYL, TAMRA, ECLIPSE, BHQ (BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 등), SFCQ 등과 같은 소광물질로 표지될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명에 따르면, 관상어인 구피(guppy)에 큰 피해를 주는 대표적인 원생생물인 테트라하이메나(Tetrahymena)와 백점충을 리얼타임 PCR로 동시에 모두 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 구피의 원생생물 감염증을 일으키는 원인체인 테트라하이메나와 백점충을 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 동시에 모두 검출할 수 있는 장점이 있다.
따라서, 본 발명은 관상어인 구피(guppy)에 큰 피해를 주는 대표적인 원생생물인 테트라하이메나와 백점충을 구피의 원생생물 감염증 발병 초기에 특이도 및 민감도 높게 동시에 모두 검출할 수 있는 기술을 제공함으로써, 구피의 원생생물 감염증 방역 대책을 정확하고 신속하게 수립하여 적절한 초기 대처를 가능케 하고 구피의 원생생물 감염증의 진행과 치료 후 과정의 모니터링을 효율적으로 할 수 있다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 백점충 및 테트라하이메나 속에 각각 특이적인 프라이머 및 프로브의 설계를 위해 MEGA X 상동성 프로그램을 이용하여 수행된 18개의 18S rRNA 유전자들에 대한 상동성 분석결과를 나타내는 도면이다.
도 2a는 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용하여 백점충 및 테트라하이메나 속의 합성 유전자(양성대조물질)에 대해 각 농도별(107, 105, 및 103 copy/μL)로 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이고, 도 2b 및 도 2c는 각각 백점충 및 테트라하이메나 속의 합성 유전자 각각에 대한 증폭성능을 평가하여 나타낸 표준곡선이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용하여 인터널 포지티브 콘트롤(Internal Positive Control; IPC)에 대해 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 4a 내지 도 4g는 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용하여 백점충의 합성 유전자의 다양한 농도별로 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프로서, 백점충의 최소검출한계 (Limited of Dectection; LoD)를 나타낸다.
도 5는 도 4a 내지 도 4g 및 표 6의 결과들에 대해 R 프로그램을 이용하여 백점충 프로빗 분석(probit analysis)을 한 결과 그래프이다.
도 6a 내지 도 6g는 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용하여 테트라하이메나 속의 합성 유전자의 다양한 농도별로 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프로서, 테트라하이메나 속의 최소검출한계 (Limited of Dectection; LoD)를 나타낸다.
도 7은 도 6a 내지 도 6g 및 표 7의 결과들에 대해 R 프로그램을 이용하여 테트라하이메나 속 프로빗 분석(probit analysis)을 한 결과 그래프이다.
도 8a 내지 도 8c는 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용하여 양성 대조군에 대한 리얼타임 PCR를 실시한 결과 그래프, 백점충 검출을 위한 프라이머 쌍과 프로브의 조합을 이용하여 24개의 표준 미생물 핵산에 대한 리얼타임 PCR를 실시한 결과 그래프, 그리고 테트라하이메나 속 검출을 위한 프라이머 쌍과 프로브의 조합을 이용하여 24개의 표준 미생물 핵산에 대한 리얼타임 PCR를 실시한 결과 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용하여 백점충 및 테트라하이메나 속의 합성 유전자(양성대조물질)에 대해 각 농도별(107, 105, 및 103 copy/μL)로 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이고, 도 2b 및 도 2c는 각각 백점충 및 테트라하이메나 속의 합성 유전자 각각에 대한 증폭성능을 평가하여 나타낸 표준곡선이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용하여 인터널 포지티브 콘트롤(Internal Positive Control; IPC)에 대해 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 4a 내지 도 4g는 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용하여 백점충의 합성 유전자의 다양한 농도별로 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프로서, 백점충의 최소검출한계 (Limited of Dectection; LoD)를 나타낸다.
도 5는 도 4a 내지 도 4g 및 표 6의 결과들에 대해 R 프로그램을 이용하여 백점충 프로빗 분석(probit analysis)을 한 결과 그래프이다.
도 6a 내지 도 6g는 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용하여 테트라하이메나 속의 합성 유전자의 다양한 농도별로 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프로서, 테트라하이메나 속의 최소검출한계 (Limited of Dectection; LoD)를 나타낸다.
도 7은 도 6a 내지 도 6g 및 표 7의 결과들에 대해 R 프로그램을 이용하여 테트라하이메나 속 프로빗 분석(probit analysis)을 한 결과 그래프이다.
도 8a 내지 도 8c는 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용하여 양성 대조군에 대한 리얼타임 PCR를 실시한 결과 그래프, 백점충 검출을 위한 프라이머 쌍과 프로브의 조합을 이용하여 24개의 표준 미생물 핵산에 대한 리얼타임 PCR를 실시한 결과 그래프, 그리고 테트라하이메나 속 검출을 위한 프라이머 쌍과 프로브의 조합을 이용하여 24개의 표준 미생물 핵산에 대한 리얼타임 PCR를 실시한 결과 그래프이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예 1: 백점충 및 테트라하이메나 속의 표적유전자 상동성 분석
백점충(Ichthyophthirius multifiliis) 및 테트라하이메나(Tetrahymena spp.) 속에 각각 특이적인 프라이머 및 프로브를 설계하기 위해 하기 표 1과 같이 Genbank에 등록되어 있는 18개의 18S rRNA 유전자들의 염기서열을 이용하여 상동성 분석을 실시하였다. 이들 유전자들의 상동성은 Mega X 상동성 분석 소프트웨어 (https://www.megasoftware.net/)를 이용하여 분석하였다.
| 원생생물명 | Accession No. | 원생생물명 | Accession No. |
| I. multifiliis | KJ690569, KJ690571, KJ690571, U17354 |
T. malaccensis | M26360 |
| Ophryoglena catenula | U17355 | T. mobilis | AF364040 |
| T. canadensis | X56170 | T. pigmentosa | M26358 |
| T. hegewischi | X56166 | T. pyriformis | EF070255 |
| T. hyperangularis | X56173 | T. rostrata | AF364042, KR778778 |
| T. corlissi | U17356 | T. setosa | AF364041 |
| T. empidokyrea | U36222 | T. transformation | LC074723 |
실시예 2: 백점충 및 테트라하이메나 속의 검출을 위한 프라이머 및 프로브 설계
본 발명자는 상기 실시예 1의 표 1에 기술된 바와 같은 18개의 18S rRNA 유전자들의 서열 정보를 바탕으로 예의 연구를 거듭한 결과, 리얼타임 PCR로 백점충 및 테트라하이메나 속을 동시에 모두 검출할 수 있는 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 디자인하였다. 즉, 상기 실시예 1의 표 1에 기재된 미생물들의 18개의 18S rRNA 유전자 정보들을 이용하여 백점충 또는 테트라하이메나 속만을 선택하여 검출할 수 있는 백점충 특이적인 염기서열 범위 또는 테트라하이메나 속 특이적인 염기서열 범위를 결정하였고, 이에 기초하여 백점충 또는 테트라하이메나 속 특이적인 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 디자인하였다.
하기 표 2에 기재된 프라이머 쌍들과 프로브들의 각각의 서열은 동일한 온도 조건에서 실험이 가능하도록 유사한 Tm 값을 유지할 수 있도록 디자인하였고, 헤어핀이나 올리고뉴클레오타이드의 다이머 등 PCR 증폭을 저해하는 구조 형성 여부를 확인하여 디자인하였다. 하기 표 2의 프라이머와 프로브의 길이, GC%, Tm 값의 분석은 IDT(INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES)社에서 제공하는 웹 기반 프로그램인 OligoAnalyzer 프로그램(https://sg.idtdna.com/calc/analyzer)을 이용하여 수행하였다. 백점충의 18S rRNA 표적 유전자 및 테트라하이메나 속의 18S rRNA 표적 유전자 증폭을 위한 프라이머 및 프로브 서열은 아래의 표 2와 같다.
| 서열번호 | 5' 표지 | 서열정보 (5'→3') | 3' 표지 | 길이 (bp) |
GC(%) | Tm(℃) | 증폭산물 (bp) |
| 서열번호 1 | CTTCTTAGAGGGACTATTGTGCATTT | 26 | 38.5 | 54.9 | 207 | ||
| 서열번호 2 | AATTCCTCGTTCAAGATCTATAGTTT | 26 | 30.8 | 52.2 | |||
| 서열번호 3 | FAM | ACAATGGCTGGCTCAAAAAGTAT | SFCQ | 23 | 39.1 | 55.3 | |
| 서열번호 4 | ACGGCTACTACAACTACGGTTC | 22 | 50 | 56.3 | 86 | ||
| 서열번호 5 | CAGCTTGCTATTTCTTGTCACTGG | 24 | 45.8 | 56.3 | |||
| 서열번호 6 | 555 | AGCAGGGAAGAAAATTGGCCAATCC | SFCQ | 25 | 48 | 60.1 |
서열번호 1의 프라이머(정방향 프라이머)와 서열번호 2의 프라이머(역방향 프라이머)의 쌍은 백점충의 18S rRNA 표적 유전자를 선택적으로 증폭하는 프라이머이고, 서열번호 3의 프로브는 리얼타임 PCR로 백점충의 18S rRNA 표적 유전자를 특이적으로 검출하기 위해 사용되는 프로브이다. 따라서, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과, 서열번호 3의 프로브의 조합으로 백점충의 18S rRNA 표적 유전자를 특이적으로 증폭하여 확인할 수 있다. 서열번호 4의 프라이머(정방향 프라이머)와 서열번호 5의 프라이머(역방향 프라이머)의 쌍은 테트라하이메나 속의 18S rRNA 표적 유전자를 선택적으로 증폭하는 프라이머이고, 서열번호 6의 프로브는 리얼타임 PCR로 테트라하이메나 속의 18S rRNA 표적 유전자를 특이적으로 검출하기 위해 사용되는 프로브이다. 따라서, 서열번호 4 및 5의 프라이머 쌍과, 서열번호 6의 프로브의 조합으로 테트라하이메나 속의 18S rRNA 표적 유전자를 특이적으로 증폭하여 확인할 수 있다.
서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과, 서열번호 4 및 5의 프라이머 쌍은 IDT社에 의뢰하여 합성하였고, 서열번호 3의 프로브와 서열번호 6의 프로브는 SFC사(www.sfc-dye)에 의뢰하여 합성하였다. 또한, 서열번호 3의 프로브의 5' 말단에는 FAM 형광물질을 표지하였고, 3' 말단에는 소광물질 SFCQ를 표지하였다. 참고로, SFCQ[에스에프씨(주)(대한민국 충청북도 소재)에서 판매하는 제품명]는 BHQ1과 같은 소광물질(quencher)이다. 다음으로, 서열번호 6의 프로브의 5' 말단에는 VIC, JOE, HEX의 형광물질과 호환되는 555[에스에프씨(주)에서 판매하는 제품명]를 표지하였고, 3' 말단에는 소광물질 SFCQ를 표지하였다. 한편, 프로브를 표지하는 형광물질 및 소광물질로는 전술한 예시에 한정되는 것이 아니고, 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
실시예 3: 양성대조물질 (positive control)의 합성
상기 실시예 2에서 설계된 프라이머의 쌍과 프로브의 각각의 조합을 이용하여 대응하는 백점충의 18S rRNA 표적 유전자 및 테트라하이메나 속의 18S rRNA 표적 유전자 증폭이 가능한지 여부를 확인하기 위해 백점충 및 테트라하이메나 속 검출용 양성대조물질을 합성하였다. 유전자 합성은 IDT社에서 제공하는 서비스를 이용하여 하기 표 3의 염기서열에 따라 수행하였고, 합성된 유전자는 써모피셔 사이언티픽社(Thermo fisher scientific)(미합중국 매사추세츠주 소재)의 Qubit 3.0을 이용하여 OD 값을 측정하였다. 측정된 OD 값을 기준으로 웹 기반 유전자 카피(copy) 수 계산 프로그램인 DNA/RNA 카피 수 계산기(DNA/RNA Copy Number Calculator)(http://www.endmemo.com/bio/dnacopynum.php)를 이용하여 합성된 유전자를 정량하였다.
| 서열정보 | |
| 백점충 양성대조물질 (합성유전자 서열) |
AGACCTTAACCTGCTAACTAGTCGACCTGTGAACAACGGGTTGTACTTCTTAGAGGGACTATTGTGCATTTAAGCCAATGGAAGTTTAAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCCTAGACGTGCTCGGCCGCACGCGCGTTACAATGGCTGGCTCAAAAAGTATTTCCTGACCTGGAAAGGTTCGGGTAATCTTATTAATACCAGTCGTGTTAGGGATAGTTCTTTGAAACTATAGATCTTGAACGAGGAATTTCTAGTAAGTGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTATGTCCCTGCCGTTTGTACACACCGCCCGTCGCTTGTAGTAACGAATGGTCTGGTGAACCTTCTGGACCGAGGTCGCAAGGCTTTGGGAAGTTAAGTAAACCCTACCA (서열번호 7) |
| 테트라하이메나 양성대조물질 (합성유전자 서열) |
ACGGCTACTACAACTACGGTTCGGCAGCAGGGAAGAAAATTGGCCAATCCTAATTCAGGGAGCCAGTGACAAGAAATAGCAAGCTG (서열번호 8) |
실시예 4: 양성대조물질을 이용한 백점충 및 테트라하이메나 속의 검출 실험
상기 실시예 3에서 합성된 백점충 및 테트라하이메나 속 검출을 위한 양성대조물질(합성 유전자)을 107, 105, 및 103 copies/μL가 되도록 준비하여 후속의 리얼타임 PCR 실험의 주형으로 사용하였다.
리얼타임 RT-PCR 증폭실험은 써모피셔 사이언티픽社의 ABI 7500 패스트 리얼타임(fast real-time) PCR 장비를 이용하여 수행하되, 하기 표 4에 기술된 바와 같은 리얼타임 PCR 반응 조성액을 조제하여 사용하였다. 반응 당 107, 105, 및 103 copies/μL의 농도가 되도록 1μL의 준비된 양성대조물질(DNA 주형)을 상기 반응 조성액에 첨가하였다. 2X 리얼타임 PCR 마스터 믹스(Real-time PCR Master Mix)는 제이에스 바이오테크(대한민국 경기도 소재)의 제품을 사용하였다.
| 구성물 | 농도 | 반응당 첨가량 |
| 서열번호 1 | 100 μM | 0.1 μL |
| 서열번호 2 | 100 μM | 0.1 μL |
| 서열번호 3 | 100 μM | 0.05 μL |
| 서열번호 4 | 100 μM | 0.1 μL |
| 서열번호 5 | 100 μM | 0.1 μL |
| 서열번호 6 | 100 μM | 0.05 μL |
| PCR 마스터믹스 | 2X | 10 μL |
| DNA 주형 | - | 1 μL |
| 증류수 | - | 8.5 μL |
| 전체 부피 | - | 20 μL |
리얼타임(real-time) PCR 방법은 형광물질과 소광물질을 PCR 기법에 응용한 것으로 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission) 정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속하고 정확하게 분석할 수 있다. 리얼타임 PCR의 기본 원리는 중합효소와 형광공명 에너지 이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광의 검출과 정량에 있다.
리얼타임 PCR에서의 정량은 PCR시 매 주기의 진행 상황을 감시하여 지수 증가기(exponential phase) 범위 내에서 실시간으로 증폭산물을 측정하는 방법으로서, 이때 중요한 개념이 Ct(threshold cycle) 또는 Cp(crossing point)라는 수치이다. 이 값은 전술한 이중 표지된 프로브에 의해 생기는 형광의 세기가 기본값(baseline level)을 넘어서 감지될 수 있을 정도로 두드러지게 증가하는 시점의 주기수이며, 이는 표적 유전자의 초기 주형량(본 발명의 경우 백점충 및 테트라하이메나 속의 18S rRNA 표적 유전자 카피수)을 정확하게 반영한다. 따라서, 백점충 및 테트라하이메나 속 각각의 표적 유전자를 포함하는 시료를 PCR 증폭하여 전체 PCR 증폭 기간에 대한 형광물질의 형광세기의 변화를 측정하고 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하고 형광세기의 표준 곡선을 얻은 후, 백점충 및 테트라하이메나 속 각각의 표적 유전자가 존재하는지 여부와 시료 내에 포함된 백점충 및 테트라하이메나 속 각각의 표적 유전자의 초기 주형량을 정량적으로 분석할 수 있다.
본 실시예에서는 상기 실시예 3에서 합성된 백점충 및 테트라하이메나 속 검출을 위한 양성대조물질(합성 유전자)에 대해 상기 표 4에 나타낸 바와 같은 리얼타임 PCR 증폭 반응액의 조성 하에서, 하기 표 5의 리얼타임 PCR 반응조건으로 실험을 진행하였으며, Ct 값을 기준으로 검출 대상이 되는 백점충 및 테트라하이메나 속의 음/양성(백점충 및 테트라하이메나 속 각각의 표적 유전자 존재 여부)을 판정하였다.
| 변성(Denaturation) | 95℃, 5분 | 1 사이클 |
| 변성(Denaturation) | 95℃, 15초 | 40 사이클 |
| 어닐링 및 연장 | 50℃, 45초 |
리얼타임 PCR 실험 시 각 구간별로 3회 반복하여 수행하였고 기본적인 증폭성능 평가를 진행하였다. 도 2a에는 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용하여 백점충 및 테트라하이메나 속의 합성 유전자(양성대조물질)에 대해 각 농도별로 리얼타임 PCR을 실시한 결과가 도시되어 있다. 이러한 결과에 기초하여 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들에 의한 백점충의 표적 유전자 및 테트라하이메나 속의 표적 유전자 증폭성능을 평가하여 표준곡선으로 나타내었다(도 2b 및 도 2c 참조). 그 결과, 백점충의 경우 기울기 값이 -3.643, R2 값은 1, 그리고 증폭효율은 88.138 %이었고, 테트라하이메나 속의 경우 기울기 값이 -3.484, R2 값은 1, 그리고 증폭효율은 93.665 %로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들은 백점충의 표적 유전자 및 테트라하이메나 속 표적 유전자에 대해 우수한 증폭성능을 갖는 것을 알 수 있다.
실시예 5: 백점충 및 테트라하이메나 속의 검출 민감도 평가
본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들에 의한 백점충 및 테트라하이메나 속의 검출 민감도를 측정하기 위해 상기 실시예 3에서 합성된 양성대조물질을 이용하여 최소검출한계를 확인하였다. 측정방법은 합성된 양성대조물질을 정량하여 1000, 100, 50, 10, 5, 2.5, 1.25 copies/μL 농도로 준비한 후 1000, 100 copies/μL 농도구간은 8회 반복, 나머지 농도 구간은 16회 반복하여 실험을 진행하였다. 실험결과 95% 이상의 양성을 보이는 구간을 최소검출한계로 판정하고 R 프로그램을 이용하여 프로빗 분석(probit analysis)을 진행하였다.
도 4a 내지 도 4g에는 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용하여 백점충의 합성 유전자의 다양한 농도별(1000, 100, 50, 10, 5, 2.5, 1.25 copies/μL 농도)로 리얼타임 PCR을 실시한 결과가 그래프로 도시되어 있다. 또한, 백점충 최소검출한계(Limited of Detection, LoD) 실험결과를 도표로서 정리하면 하기 표 6과 같다.
| No | 농도 (copy/rxn) | ||||||
| 1 000 | 100 | 50 | 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | |
| 1 | 30.4 | 33.3 | 33.7 | 36.0 | 36.7 | 37.9 | - |
| 2 | 29.8 | 33.3 | 33.9 | 35.1 | 35.1 | - | 39.2 |
| 3 | 29.9 | 33.4 | 34.0 | 35.8 | 36.0 | 37.9 | - |
| 4 | 29.8 | 33.0 | 34.2 | 37.8 | 35.8 | 36.2 | 38.3 |
| 5 | 29.8 | 33.6 | 34.2 | 36.8 | 36.2 | - | 39.5 |
| 6 | 29.9 | 33.8 | 33.9 | 35.5 | 36.5 | 36.1 | 39.2 |
| 7 | 29.9 | 33.1 | 34.9 | 36.0 | 35.7 | - | 37.4 |
| 8 | 29.9 | 32.7 | 34.3 | 35.7 | 36.7 | 36.8 | - |
| 9 | 33.3 | 35.3 | 38.0 | - | 38.0 | ||
| 10 | 33.6 | 34.8 | 36.6 | 36.2 | 38.2 | ||
| 11 | 34.1 | 35.3 | 35.5 | - | 37.6 | ||
| 12 | 34.6 | 34.8 | 36.2 | 37.4 | 38.0 | ||
| 13 | 34.2 | 35.5 | 35.6 | - | 38.0 | ||
| 14 | 33.6 | 34.6 | 35.9 | 38.5 | 37.1 | ||
| 15 | 33.6 | 34.7 | 38.1 | 37.4 | 37.1 | ||
| 16 | 34.3 | 34.6 | 35.9 | 38.6 | 37.1 | ||
| Positive | 8/8 | 8/8 | 16/16 | 16/16 | 16/16 | 10/16 | 13/16 |
| Average CT | 29.9 | 33.3 | 34.0 | 35.5 | 36.3 | 37.3 | 38.1 |
| CV (%) | 0.6 | 1.1 | 1.0 | 2.4 | 2.3 | 2.5 | 2.2 |
도 4a 내지 도 4g 및 표 6의 결과들에 대해 R 프로그램을 이용하여 백점충 프로빗 분석(probit analysis)을 한 결과를 도 5에 도시하였다. 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용하여 백점충과 테트라하이메나 속의 검출용 합성 유전자에 대한 이중 리얼타임 PCR (duplex real-time PCR)을 수행하였으며, 각 형광값을 기준으로 측정한 결과, 백점충의 경우 최소검출한계가 반응당 8.66 카피 (8.66 copy/rxn)로 확인되어 높은 검출 민감도를 나타내는 것을 알 수 있다. 백점충의 경우, 반응당 5 카피 농도까지는 100%의 양성 결과를 확인하였고, 반응당 2.5 카피 농도에서는 68.7 %의 양성 결과를 확인하였으며, 반응당 1.25 카피 농도에서는 81.25 %의 양성 결과를 확인하였다.
또한, 도 6a 내지 도 6g에는 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용하여 테트라하이메나 속의 합성 유전자의 다양한 농도별(1000, 100, 50, 10, 5, 2.5, 1.25 copies/μL 농도)로 리얼타임 PCR을 실시한 결과가 그래프로 도시되어 있다. 또한, 테트라하이메나 속의 최소검출한계(Limited of Detection, LoD) 실험결과를 도표로서 정리하면 하기 표 7과 같다.
| No | 농도 (copy/rxn) | ||||||
| 1 000 | 100 | 50 | 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | |
| 1 | 30.2 | 33.5 | 34.0 | 35.8 | 36.2 | 37.9 | - |
| 2 | 30.0 | 33.2 | 34.0 | 35.7 | 35.1 | - | 38.4 |
| 3 | 30.1 | 33.5 | 34.2 | 35.8 | 36.0 | 38.2 | - |
| 4 | 30.0 | 33.1 | 34.1 | 36.6 | 35.7 | 36.5 | 38.2 |
| 5 | 29.9 | 33.5 | 34.2 | 37.0 | 36.4 | - | 38.1 |
| 6 | 30.0 | 33.8 | 34.0 | 35.7 | 36.4 | 36.4 | 38.2 |
| 7 | 30.2 | 33.3 | 35.2 | 36.1 | 35.8 | - | 37.7 |
| 8 | 30.2 | 32.9 | 34.4 | 36.0 | 36.4 | 38.1 | - |
| 9 | 33.6 | 35.6 | 37.3 | 39.2 | 38.2 | ||
| 10 | 33.6 | 34.8 | 36.7 | 36.5 | 38.2 | ||
| 11 | 34.0 | 35.7 | 35.5 | - | 38.2 | ||
| 12 | 34.6 | 35.0 | 36.4 | 38.2 | 38.2 | ||
| 13 | 34.2 | 35.6 | 35.7 | - | 38.4 | ||
| 14 | 33.5 | 34.7 | 36.0 | 38.2 | 37.4 | ||
| 15 | 33.7 | 34.9 | 37.6 | 37.3 | 37.3 | ||
| 16 | 34.6 | 34.9 | 36.0 | 38.1 | 37.4 | ||
| Positive | 8/8 | 8/8 | 16/16 | 16/16 | 16/16 | 11/16 | 13/16 |
| Average CT | 30.0 | 33.3 | 34.1 | 35.6 | 36.2 | 37.7 | 38.0 |
| CV (%) | 0.4 | 0.9 | 1.2 | 1.3 | 1.8 | 2.4 | 1.1 |
도 6a 내지 도 6g 및 표 7의 결과들에 대해 R 프로그램을 이용하여 테트라하이메나 속의 프로빗 분석(probit analysis)을 한 결과를 도 7에 도시하였다. 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용하여 백점충과 테트라하이메나 속의 검출용 합성 유전자에 대한 이중 리얼타임 PCR (duplex real-time PCR)을 수행하였으며, 각 형광값을 기준으로 측정한 결과, 테트라하이메나 속의 경우 최소검출한계가 반응당 8.36 카피 (8.36 copy/rxn)로 확인되어 높은 검출 민감도를 나타내는 것을 알 수 있다.
테트라하이메나 속의 경우, 반응당 5 카피 농도까지는 100%의 양성 결과를 확인하였고, 반응당 2.5 카피 농도에서는 62.5 %의 양성 결과를 확인하였으며, 반응당 1.25 카피 농도에서는 81.25 %의 양성 결과를 확인하였다.
실시예 6: 백점충 및 테트라하이메나 속의 검출 특이도 평가
본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용한 백점충 및 테트라하이메나 속의 검출 특이도를 확인하기 위해 총 24개로 구성된 표준 미생물 핵산을 PCR 주형으로 이용하여 비특이적인 반응 여부를 확인하였다(표 8 참조). 그 결과, 본 발명의 백점충 검출을 위한 프라이머 쌍과 프로브의 조합을 이용하여 24개의 표준 미생물 핵산에 대한 리얼타임 PCR를 실시한 결과 비특이적인 증폭반응이 없었음을 확인하였고(도 8b 참조), 본 발명의 테트라하이메나 속 검출을 위한 프라이머 쌍과 프로브의 조합을 이용하여 24개의 표준 미생물 핵산에 대한 리얼타임 PCR를 실시한 결과 역시 비특이적인 증폭반응이 없었음을 확인하였다(도 8c 참조).
즉, 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들은 백점충 및 테트라하이메나 속의 표적 유전자 각각에 대해 특이적인 PCR 증폭 반응을 수행하였고, 24개의 표준 미생물 핵산에 대해서는 비특이적 PCR 반응을 수행하지 않았다. 따라서, 본 발명의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들은 백점충 및 테트라하이메나 속 검출에 있어 우수한 특이도를 보유하고 있음이 실험적으로 확인되었다.
| 미생물 번호 | 미생물 명 | 미생물 번호 | 미생물 명 |
| KCTC* 1636 | Pseudomonas aeruginosa | KCTC 1092 | Bacillus cereus |
| KCTC 1685 | Enterobacter cloacae | KCTC 7532 | Dekkera bruxellensis |
| KCTC 2190 | Enterobacter aerogenes | KCTC 7144 | Pichia guilliermondii |
| KCTC 2508 | Acinetobacter baumannii | NATGIP-BIO** | Entamoeba histolytica |
| KCTC 2949 | Enterobacter sakazakii | NATGIP-BIO | Giardia lamblia |
| KCTC 12555 | Enterobacter gergoviae | NATGIP-BIO | Cryptosporidium parvum |
| KCTC 6983 | Aspergillus oryzae var. oryzae | NATGIP-BIO | Cyclospora cayetanesis |
| KCTC 6984 | Aspergillus flavus | NCCP*** 12243 | Salmonella Enteritidis |
| KCTC 3284 | Streptococcus sanguinis | NCCP 10932 | Salmonella Typhi |
| KCTC 3286 | Streptococcus gordonii | NCCP 14744 | Shigella flexneri |
| KCTC 2583 | Rhodobacter capsulatus | NCCP 14745 | Shigella boydii |
| KCTC 1014 | Bacillus cereus | KCCM 41046 | Alicyclobacillus acidoterrestris |
* Korean Collection for Type Culture, KCTC: 생물자원센터
** NATGIP-BIO- Zeptometrix NATtrol™ GI (GastroIntestinal) Panel
*** National Culture Collection for Pathogens, NCCP: 국가병원체 자원은행
상기 결과들을 종합하면 본 발명의 구피의 원생생물 감염증 검사 키트 및 방법은 구피의 원생생물 감염증을 일으키는 원인체인 테트라하이메나와 백점충을 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 동시에 모두 검출할 수 있어, 구피의 원생생물 감염증 방역 대책을 정확하고 신속하게 수립하여 적절한 초기 대처를 가능케 하고 구피의 원생생물 감염증의 진행과 치료 후 과정의 모니터링하는 방역 시스템에 적합하다고 할 수 있다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
<110> YOON, Hyun Kyu
<120> Method and kit for detecting protist infection in guppy using
real-time PCR
<130> P17-0040KR
<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ichthyophthirius multifiliis forward primer
<400> 1
cttcttagag ggactattgt gcattt 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ichthyophthirius multifiliis reverse primer
<400> 2
aattcctcgt tcaagatcta tagttt 26
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ichthyophthirius multifiliis probe
<400> 3
acaatggctg gctcaaaaag tat 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tetrahymena spp. forward primer
<400> 4
acggctacta caactacggt tc 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tetrahymena spp. reverse primer
<400> 5
cagcttgcta tttcttgtca ctgg 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tetrahymena spp. probe
<400> 6
agcagggaag aaaattggcc aatcc 25
<210> 7
<211> 394
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ichthyophthirius multifiliis positive control sequence
<400> 7
agaccttaac ctgctaacta gtcgacctgt gaacaacggg ttgtacttct tagagggact 60
attgtgcatt taagccaatg gaagtttaag gcaataacag gtctgtgatg cccctagacg 120
tgctcggccg cacgcgcgtt acaatggctg gctcaaaaag tatttcctga cctggaaagg 180
ttcgggtaat cttattaata ccagtcgtgt tagggatagt tctttgaaac tatagatctt 240
gaacgaggaa tttctagtaa gtgcaagtca tcagcttgcg ttgattatgt ccctgccgtt 300
tgtacacacc gcccgtcgct tgtagtaacg aatggtctgg tgaaccttct ggaccgaggt 360
cgcaaggctt tgggaagtta agtaaaccct acca 394
<210> 8
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tetrahymena spp. positive control sequence
<400> 8
acggctacta caactacggt tcggcagcag ggaagaaaat tggccaatcc taattcaggg 60
agccagtgac aagaaatagc aagctg 86
Claims (8)
- 이중 리얼타임 PCR (duplex real-time PCR)을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트로서,
백점충(Ichthyophthirius multifiliis)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서, 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)의 18S rRNA 표적 유전자를 특이적으로 증폭하는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과, 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)의 18S rRNA 표적 유전자에 특이적인 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와의 제1조합과,
테트라하이메나(Tetrahymena) 속을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서, 테트라하이메나(Tetrahymena) 속의 18S rRNA 표적 유전자를 특이적으로 증폭하는 서열번호 4 및 5의 프라이머 쌍과, 테트라하이메나(Tetrahymena) 속의 18S rRNA 표적 유전자에 특이적인 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와의 제2조합을 포함하고,
상기 프라이머 및 프로브의 조합들을 구성하는 각 프로브는 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지되며,
백점충의 18S rRNA 표적 유전자와 테트라하이메나 속의 18S rRNA 표적 유전자를 동시에 모두 검출하되, 백점충의 경우 최소검출한계가 반응당 8.66 카피이고 테트라하이메나 속의 경우 최소검출한계가 반응당 8.36 카피인 것을 특징으로 하는, 이중 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트. - 제1항에 있어서,
DNA 중합효소, dNTPs 및 PCR 완충용액을 더 포함하는, 이중 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트. - 제1항에 있어서,
상기 표지물질은 상기 프라이머 및 프로브의 각 조합을 구성하는 프로브의 한쪽 말단에 표지되는 것을 특징으로 하는, 이중 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트. - 제1항에 있어서,
상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭량과, 테트라하이메나(Tetrahymena) 속의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭량을 산출하는 것을 특징으로 하는, 이중 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트. - 검체로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계와,
청구항 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 이중 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트를 이용하여, 상기 유전자 샘플을 이중 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
이중 리얼타임 PCR 결과에 기초하여 상기 검체 내의 백점충 및 테트라하이메나(Tetrahymena) 속의 원생생물을 검출하는 단계를 포함하고,
백점충의 18S rRNA 표적 유전자와 테트라하이메나 속의 18S rRNA 표적 유전자를 동시에 모두 검출하되, 백점충의 경우 최소검출한계가 반응당 8.66 카피이고 테트라하이메나 속의 경우 최소검출한계가 반응당 8.36 카피인 것을 특징으로 하는, 이중 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 방법. - 제5항에 있어서,
증폭 전, 상기 각 표적 유전자의 카피수를 알고 있는 유전자 샘플인 양성 표준자를, 상기 이중 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 키트와 상기 각 표적 유전자와 관련하여 유전자 증폭량을 나타내는 표지물질을 이용하여 이중 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
상기 양성 표준자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하여 얻어진 표준곡선으로부터 상기 양성 표준자의 카피수와, Cp값 또는 Ct값을 대응시키는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 각 표적 유전자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 각 표적 유전자를 PCR 증폭하여 얻은 Cp값 또는 Ct값을 상기 양성 표준자의 카피수에 대응시켜, 상기 검체 내의 상기 각 표적 유전자를 정량하는 단계를 더 포함하는, 이중 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 방법. - 제6항에 있어서,
상기 표지물질은 상기 프라이머 및 프로브의 각 조합을 구성하는 프로브의 한쪽 말단에 표지되는 것을 특징으로 하는, 이중 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 방법. - 제6항에 있어서,
상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 백점충(Ichthyophthirius multifiliis)의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭량과, 테트라하이메나(Tetrahymena) 속의 18S rRNA 표적 유전자의 증폭량을 산출하는 것을 특징으로 하는, 이중 리얼타임 PCR을 이용한 구피의 원생생물 감염증 검사 방법.
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|---|---|---|---|---|
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-
2021
- 2021-03-01 KR KR1020210027082A patent/KR20210069602A/ko unknown
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