ES2213925T5 - Seleccion entre positivos y negativos en el caso de la recombinacion homologa. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la introducción de un ADN ajeno en una célula hospedante mediante recombinación homóloga, siendo transfectada la célula hospedante con un vector recombinante, que abarca dos secuencias de nucleótidos flanqueadoras, homólogas con respecto a una secuencia diana en el genoma de la célula hospedante, dentro de las cuales se encuentra una secuencia de nucleótidos que codifica un marcador de selección positiva, y fuera de las secuencias flanqueadoras se encuentra una secuencia de nucleótidos que codifica un marcador de selección negativa, que están unidas operativamente en cada caso con una secuencia de control de la expresión, activa en la célula hospedante, caracterizado porque como gen marcador de selección negativa se utiliza por lo menos una secuencia de nucleótidos, que codifica un polipéptido localizado junto a la superficie celular, verificándose que, después de una integración del vector mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula, no es expresado el genmarcador de selección negativa, y que, después de una integración casual del vector en el genoma de la célula, es expresado el gen marcador de selección negativa, y el producto génico de éste es presentado en la superficie de la célula.
Description
Selección entre positivos y negativos en el caso
de la recombinación homóloga.
El invento se refiere a un procedimiento para la
introducción de un ADN ajeno en el genoma de una célula diana
mediante recombinación homóloga, así como para la recombinación
homóloga de apropiadas estructuras artificiales (conocidas también
como construcciones) de ADN.
Se conocen procedimientos para la introducción
de un ADN ajeno en el genoma de células eucarióticas mediante
recombinación homóloga (véanse p.ej. los documentos de solicitudes
de patentes internacionales WO 90/11354, WO 91/09955). En este
caso, una célula de partida se transfecta con una estructura
artificial de ADN, que contiene por lo menos un segmento, y
preferiblemente dos segmentos, de la secuencia de ADN, que
es(son) homólogo(s) con zonas del genoma de la célula
que se ha de transfectar, un gen marcador de selección positiva y
eventualmente un gen marcador de selección negativa. Además, la
estructura artificial de ADN puede contener una secuencia de
control de la expresión heteróloga, cuando se ha de activar un gen
normalmente mudo (inactivo) en la célula transfectada. Las células
transfectadas se cultivan en unas condiciones, en las que tiene
lugar una selección en cuanto a la presencia del gen marcador de
selección positiva, que, al realizar una expresión, conduce a un
fenotipo seleccionable.
Con el fin de diferenciar células, en las que ha
tenido lugar una recombinación homóloga, con respecto de células,
en las que sólo se ha efectuado una integración casual del vector en
el genoma de la célula hospedante, usualmente se efectúa una
segunda etapa de selección. Para esto, se utiliza un gen marcador de
selección negativa, tal como por ejemplo el gen de la timidina
cinasa del HSV (HSV-TK), en el caso de cuya
presencia se destruyen células en presencia de un agente de
selección, p.ej. ganciclovir. En el caso de una recombinación
homóloga, la célula pierde el gen de la timidina cinasa del HSV, de
tal manera que las células son resistentes frente al ganciclovir.
Las células, en cuyo genoma se había incorporado el vector de
dirección hacia una diana mediante una integración casual, no
homóloga, no pierden el gen de la HSV-TK y son, por
lo tanto, sensibles frente al ganciclovir. Para este modo de
efectuar la selección mediante una combinación de
HSV-TK y ganciclovir se utilizan preferiblemente
células, que no contienen ningún gen de la timidina cinasa capaz de
funcionar (p.ej. el de la CEM tk de Ogden Bioservices Corp.,
Rockville MD, EE.UU., nº de catálogo 491).
Otras células hospedantes, utilizadas para la
recombinación homóloga, poseen, sin embargo, un propio gen de la
timidina cinasa. Sin embargo, este gen celular de la timidina cinasa
causa problemas de fondo en el caso de la selección negativa. Así,
por ejemplo, al realizar el escrutinio se puede llegar a la pérdida
de clones recombinados homólogamente. También se presentan
problemas similares en los casos de otros genes marcadores de
selección negativa, que codifican un producto génico, contra cuya
expresión se debe de seleccionar después de la trans-
fección.
fección.
Es conocida la utilización de polipéptidos
localizados junto a la superficie celular como marcadores de la
transfección positiva. Así, p.ej. el documento WO 95/06723 describe
un procedimiento para la marcación de células mediando utilización
de un gen parcialmente suprimido de un receptor situado en la
superficie celular.
Para evitar el problema que aparece en los casos
de los genes marcadores de selección negativa, utilizados hasta
ahora, se utiliza de acuerdo con el invento un gen marcador de
selección negativa, que codifica un polipéptido localizado junto a
la superficie celular.
Un objeto del presente invento es, por
consiguiente, un procedimiento para la introducción de un ADN ajeno
en una célula hospedante mediante recombinación homóloga, siendo
transfectada la célula hospedante con un vector recombinante, que
abarca dos secuencias de nucleótidos flanqueadoras, homólogas con
respecto a una secuencia diana en el genoma de la célula
hospedante, dentro de las cuales se encuentra una secuencia de
nucleótidos, que codifica un marcador de selección positiva, y
fuera de las secuencias flanqueadoras se encuentra una secuencia de
nucleótidos, que codifica un marcador de selección negativa, las
cuales están unidas operativamente en cada caso con una secuencia
de control de la expresión, activa en la célula hospedante,
caracterizado porque
como gen marcador de selección negativa se
utiliza por lo menos una secuencia de nucleótidos, que codifica un
polipéptido localizado junto a la superficie celular, realizándose
que, después de una integración del vector mediante recombinación
homóloga en el genoma de la célula, no es expresado el gen marcador
de selección negativa, y, después de una integración casual del
vector en el genoma de la célula, es expresado el gen marcador de
selección negativa, y el producto génico de éste es presentado en la
superficie de la célula,
llevándose a cabo una etapa de selección en
cuanto a la presencia del gen marcador de selección positiva y una
etapa de selección adicional en cuanto a la ausencia del gen
marcador de selección negativa, y la selección en cuanto a la
ausencia del gen marcador de selección negativa abarca (a) poner en
contacto las células transfectadas con una molécula de fijación,
que se fija al producto génico del gen marcador de selección
negativa, y (b) separar las células que contienen la molécula de
fijación fijada.
\newpage
De acuerdo con el invento, por consiguiente, con
el fin de evitar un procedimiento de selección negativa, en el que
se trabaja con un agente de selección que es tóxico para la célula,
se emplea un gen marcador de selección negativa, que codifica una
polipéptido localizado junto a la superficie, junto a un lugar
correspondiente en el vector para la recombinación homóloga.
Preferiblemente, se utiliza un gen marcador de selección negativa,
que codifica un polipéptido que normalmente no se presenta en la
célula hospedante.
Mediante el procedimiento de acuerdo con el
invento no aparecen problemas con la toxicidad ni con las señales
de fondo, tales como los que se han descrito en el caso de la
selección con una TK. Una ventaja más del procedimiento de acuerdo
con el invento consiste en que se reduce considerablemente el número
de células transfectadas, que se tienen que investigar en cuanto a
la expresión del gen diana.
La célula hospedante es de manera preferida una
célula eucariótica, de manera especialmente preferida una célula de
mamífero, y de la manera más preferida una célula humana.
Para la identificación y el aislamiento de
células, en las que ha tenido lugar una recombinación homóloga, se
llevan a cabo, de acuerdo con el invento, una etapa de selección en
cuanto a la presencia del gen marcador de selección positiva, y una
etapa de selección adicional en cuanto a la ausencia del gen
marcador de selección negativa.
La etapa de selección en cuanto a la presencia
del gen marcador de selección positiva se puede efectuar de una
manera usual. Como gen marcador de selección positiva se puede
utilizar en este caso un arbitrario gen marcador de selección,
apropiado en particular para células eucarióticas, que al realizar
la expresión conduce a un fenotipo seleccionable, p.ej. a una
resistencia frente a un antibiótico, o a una auxotrofía.
Preferiblemente, se utilizan genes de resistencia frente a
antibióticos, p.ej. el gen de resistencia frente a neomicina,
kanamicina, geneticina o higromicina. Un gen marcador de selección
positiva, especialmente preferido, es el gen de la fosfotransferasa
de neomicina.
El gen marcador de selección negativa, utilizado
para el procedimiento de acuerdo con el invento, codifica un
producto génico, que es presentado junto a la superficie de la
célula hospedante, preferiblemente un polipéptido situado en la
membrana. Ejemplos preferidos de tales polipéptidos situados en la
membrana son, por ejemplo, los receptores de LNGF, de CD24, de LDL
o de trk, o un fragmento de receptor que contiene el dominio de
fijación a un ligando del respectivo receptor. Apropiados
fragmentos de receptores, en los que el dominio intracelular ha
sido suprimido total o parcialmente, o ha sido modificado de tal
manera que el receptor presentado junto a la superficie no puede
producir ninguna transducción de señales, se describen en el
documento WO 95/06723. Un ejemplo especialmente preferido de un
fragmento de receptor de este tipo es un mutante por supresión
(deleción) del receptor de LNGF (denominado dLNGFR), en cuyo caso
se trata de un fragmento del receptor humano con baja afinidad del
factor del crecimiento de nervios (NGF), cuyo dominio intracelular y
transductor de señales había sido suprimido (documento WO
95/06723).
En la Figura 1 se muestra esquemáticamente el
principio de la recombinación homóloga mediando selección negativa
por medio del dLNGFR. Este principio de selección se puede
transferir, evidentemente, también a otros genes marcadores de
selección, que codifican polipéptidos asociados a superficies. Como
vector recombinante se utiliza un plásmido, que contiene dos
sectores de ácido nucleico flanqueadores (HR1, HR2), homólogos con
la secuencia diana deseada y entremedias el gen marcador de
selección positiva, a saber el gen de resistencia frente a
neomicina (NeoR). Fuera de las dos secuencias de nucleótidos
flanqueadoras, homólogas, está dispuesta en el plásmido la
secuencia de nucleótidos, que codifica el dLNGFR.
En el caso de una recombinación homóloga con una
región situada en la zona del gen diana (HR) se efectúa una
integración de las regiones HR1, NeoR y HR2 en el genoma. Por el
contrario, la secuencia que codifica el dLNGFR no es integrada en
el genoma. A diferencia de esto, en el caso de una integración
casual del plásmido en el genoma de la célula hospedante, el gen de
dLNGFR permanece en una forma capaz de ser expresada.
La selección, de acuerdo con el invento, en
cuanto a la ausencia del gen marcador de selección negativa en la
célula hospedante transfectada, abarca las etapas de:
- (a)
- poner en contacto la célula transfectada con una molécula de fijación, que se fija al producto génico del gen marcador de selección negativa, y
- (b)
- separar las células que contienen la molécula de fijación fijada.
Como moléculas de fijación se utilizan
sustancias, que pueden tomar parte en una fijación específica y, de
manera preferida, altamente afín con el marcador de selección
negativa. Preferiblemente, se utilizan las moléculas de fijación,
que no presentan ninguna reactividad cruzada perturbadora con otros
componentes superficiales de la célula hospedante. Ejemplos de
moléculas de fijación son anticuerpos, p.ej. anticuerpos
policlonales o monoclonales, fragmentos de anticuerpos, etc., que
están dirigidos contra el producto génico del gen marcador de
selección negativa. Apropiados anticuerpos contra el dLNGFR se
conocen, por ejemplo, por el documento WO 95/06723. En el caso de
la utilización de un receptor como marcador de selección negativa,
se puede utilizar como molécula de fijación, por supuesto, también
un partícipe natural en la fijación del receptor, p.ej. el ligando
de receptor, o un análogo a éste. Un ejemplo de tal ligando de
receptor lo constituyen los NGF como ligando del LNGFR.
\newpage
Con el fin de facilitar la separación de las
células marcadas con el marcador de selección negativa, se puede
utilizar una molécula de fijación, que está acoplada a una fase
sólida, pudiéndose efectuar este acoplamiento mediante adsorción,
fijación por enlace covalente, o a través de un par de fijación
altamente afín (p.ej. el de estreptavidina y biotina). Por lo
general, el tipo de la fase sólida no es crítico para el
procedimiento de acuerdo con el invento; preferiblemente se
utilizan las fases sólidas que hacen posible una fácil separación
de las células presentadoras del marcador de selección negativa, con
respecto de las células no marcadas. Por lo tanto, la fase sólida
puede presentarse, por ejemplo, en forma de una columna de
cromatografía, pero se prefieren especialmente las fases sólidas en
forma de partículas, tales como por ejemplo microperlas, en
particular microperlas magnéticas, que permiten una separación
especialmente sencilla.
Alternativamente, las células transfectadas se
pueden poner en contacto también con moléculas de fijación libres.
En este caso, las moléculas de fijación libres llevan
preferiblemente un grupo de marcación o/y un grupo de fijación a
una fase sólida. Ejemplos de apropiados grupos de marcación o/y
grupos de fijación a una fase sólida son biotina, derivados de
biotina, p.ej. imino-biotina,
amino-biotina o destio-biotina,
haptenos, p.ej. digoxigenina, fluoresceína, enzimas, p.ej. una
peroxidasa o fosfatasa alcalina, o colorantes, p.ej. colorantes
fluorescentes, tales como por ejemplo fluoresceína, ficoeritrina,
rodamina, la proteína de peridinina y clorofila, el rojo de Tejas o
derivados de
éstos.
éstos.
En el caso de la utilización de una molécula de
fijación, que lleva un grupo de fijación a una fase sólida, tal
como por ejemplo biotina, un derivado de biotina o un hapteno, la
célula marcada con la molécula de fijación se puede acoplar a una
fase sólida, que puede reaccionar con el grupo de fijación a una
fase sólida de la molécula de fijación. En el caso de la
utilización de una molécula de fijación, que lleva un grupo de
biotina, por ejemplo, las células que expresan el marcador de
selección negativa se pueden identificar mediante fijación a una
fase sólida, revestida con avidina o estreptavidina, y separar con
respecto de las células no marcadas.
En el caso de la utilización de una molécula de
fijación, que lleva un grupo enzimático de marcación, las células
que expresan el marcador de selección negativa, después de haber
añadido un substrato enzimático, son identificadas mediante una
reacción cromática catalizada por una enzima, y eventualmente son
separadas con respecto de las células no marcadas. Esta
identificación se puede efectuar, por ejemplo, mediante aplicación
de las células sobre un portaobjetos y un subsiguiente análisis con
microscopio.
Cuando se utiliza una molécula de fijación, que
lleva un colorante fluorescente, las células que expresan el
marcador de selección negativa se pueden identificar mediante un
análisis por citometría de flujo pasante, y separar con respecto de
las células no marcadas. Este procedimiento de separación es rápido
y sencillo y se puede llevar a cabo en los aparatos habituales para
FACS, los cuales hacen posible establecer ventanas de fluorescencia
y llevar a cabo una clasificación de las células.
Otro objeto del presente invento es un vector
recombinante para la recombinación homóloga en células de mamíferos,
que es apropiado para su utilización como vector de transfección en
el procedimiento de acuerdo con el invento. Este vector abarca:
- (a)
- dos secuencias de nucleótidos flanqueadoras, homólogas con una secuencia diana existente en una célula,
- (b)
- una secuencia de nucleótidos, que codifica un marcador de selección positiva, bajo el control de una secuencia de control de la expresión, activa en la célula, que se encuentra entre las dos secuencias flanqueadoras según (a),
- (c)
- una secuencia de nucleótidos, que codifica un marcador de selección negativa, bajo el control de una secuencia de control de la expresión, activa en la célula, que se encuentra fuera de las secuencias de nucleótidos flanqueadoras, homólogas, y el producto de expresión de éste es un polipéptido localizado junto a la superficie de la célula.
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Cuando el vector recombinante se debe de emplear
para la activación de un gen que se presenta endógenamente en la
célula hospedante, él contiene, entre las dos secuencias de
nucleótidos flanqueadoras, homólogas, todavía una secuencia de
control de la expresión heteróloga, que es activa en la célula
hospedante. Esta secuencia de control de la expresión abarca un
promotor y, preferiblemente, otras secuencias mejoradoras de la
expresión, p.ej. la de un intensificador. El promotor puede ser un
promotor regulable o un promotor constitutivo. Preferiblemente, el
promotor es un promotor vírico fuerte, p.ej. un promotor de SV40
(virus de simio 40) o un promotor de CMV (citomegalovirus). Se
prefiere especialmente el promotor/intensificador de CMV.
Cuando se desea una amplificación del gen diana
en la célula hospedante transfectada, el vector recombinante
contiene un gen de amplificación entre las dos secuencias
flanqueadoras. Ejemplos de apropiados genes de amplificación son
los de la dihidrofolato reductasa, la adenosina desaminasa, la
ornitina descarboxilasa, etc.. Un gen de amplificación
especialmente preferido es el gen de la dihidrofolato reductasa, en
particular un gen que codifica el mutante por arginina de la
dihidrofolato reductasa, que posee una sensibilidad para el agente
selectivo (metotrexato) menor que la del polipéptido de tipo
salvaje (Simonsen y colaboradores; Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80
(1983), 2.495).
La secuencia de nucleótidos, que codifica el
marcador de selección negativa, puede - como se ha ilustrado
precedentemente - ser seleccionada preferiblemente entre receptores
situados en la membrana o entre fragmentos de receptores situados
en la membrana, que contienen el dominio de fijación a un ligando
del respectivo receptor.
Las secuencias de nucleótidos flanqueadoras,
homólogas con una secuencia diana, se pueden seleccionar a partir
de arbitrarias zonas cromosómicas del genoma de la célula que se ha
de transfectar, que es de manera preferida una célula eucariótica,
de manera especialmente preferida una célula de mamífero, y de la
manera más preferida una célula humana. En el caso de células
humanas, las secuencias de nucleótidos flanqueadoras, homólogas,
procederán preferiblemente de la zona de los genes para factores
humanos, p.ej. EPO, tPA, G-CSF,
GM-CSF, TPO, interleucinas, interferones, factores
de crecimiento, una insulina, el factor de crecimiento del tipo de
insulina,
etc..
etc..
Las secuencias de nucleótidos flanqueadoras,
homólogas, pueden abarcar la zona codificadora del gen diana o una
parte de ésta. En esta parte, estas secuencias pueden ser
seleccionadas de tal manera que, en el caso de una recombinación
homóloga, provoquen una mutación en la zona codificadora del
polipéptido diana maduro con respecto a la secuencia que está
presente endógenamente en la célula. Esta mutación puede abarcar
sustituciones, supresiones e inserciones de aminoácidos
individuales o de segmentos enteros de aminoácidos.
Se divulga además la utilización de receptores
en la superficie, situados en la membrana, como marcadores de
selección negativa en un procedimiento de recombinación
homóloga.
Además, el invento es ilustrado mediante los
Ejemplos y las Figuras siguientes. Allí muestran:
la Figura 1: una representación esquemática
del principio de la recombinación homóloga mediando utilización de
acuerdo con el invento de una selección negativa mediante el
dLNGFR,
la Figura 2: el mapa de restricción del
plásmido pSV-dLNGFR,
las Figuras 3a y b: los resultados de un
análisis FACS de células que expresan el dLNGFR y de células que no
expresan el dLNGFR,
la Figura 4: el mapa de restricción del
plásmido p187-dLNGFR,
la Figura 5: el resultado de un análisis FACS
para diferenciar entre células negativas y células positivas en
cuanto a dLNGFR.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la manipulación de un ADN se utilizaron
métodos clásicos, tal como se describen en la cita de Sambrook, J.
y colaboradores, (1989) en; Molecular Cloning: A Laboratory Manual
[Clonación Molecular; Un Manual de Laboratorio], Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Los reactivos de
biología molecular utilizados se emplearon de acuerdo con los datos
del fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector se presentó disuelto en una
concentración de 1 \mug/\mul de agua bidestilada. Con el fin de
garantizar una alta eficiencia de la transfección, se transfectaron
las células con ayuda de la electroporación (BioRad, Genepulser®)
en condiciones determinadas previamente como óptimas (960 \muF /
260 MV / 18-22 \muS). Como linaje celular apropiad
se empleó un linaje de fibrosarcoma humano HT1080 (ATCC CCL 121)
que crece de manera adherente, en una concentración de 10^{7}
células/0,8 ml. Antes y después de la transfección, las células se
mantuvieron sobre hielo durante aproximadamente 10 min., con el fin
reconstituir de nuevo la membrana celular.
Las células transfectadas se sembraron en
botellas de cultivo T-175 y se cultivaron a 37ºC y
con 7% de CO_{2} en un armario de incubación. Después de 24 h, se
aplicó una presión de selección mediante adición de G418 (0,8
\mug/ml).
Después de 14 días en cultivo, se mostraron
clones resistentes en la cubeta de cultivo. Después de que hubieron
crecido focos grandes, las células se lavaron con PBS, se
tripsinizaron y se tiñeron como una suspensión de células
individuales.
\vskip1.000000\baselineskip
Las etapas de tinción se llevaron a cabo con
10^{5} células/tanda sobre hielo. El anticuerpo de ratón
anti-dLNGFR, añadido como anticuerpo primario, se
detectó mediante adición de un anticuerpo secundario de cabra
(\alpha-mlgG-FITC, 1:25, Caltag).
Como testigo de control en cuanto a una fijación inespecífica, se
tiñeron a solas las células con el anticuerpo secundario. Las
células muertas se detectaron mediante adición de yoduro de propidio
(10 \mug/ml). Los análisis se llevaron a cabo en un aparato
FACS-Vantage (de la entidad Becton Dickinson) de
acuerdo con los datos del fabricante. La fluorescencia específica de
las células que expresan el dLNGFR se determinó en el canal
FL-1, y las células muertas se determinaron en el
canal FL-3.
El gen para el dLNGFR (documento WO 95/06723, de
Boehringer Mannheim GmbH), que abarca 965 pb (pares de bases), se
amplificó con ayuda de la técnica de PCR (reacción en cadena de
polimerasa). A través de los cebadores utilizados, se introdujeron
en ambos extremos unos sitios de corte para las enzimas EcoRI y SaII
respectivamente. Tras la amplificación, los fragmentos de la PCR se
cortaron con ambas enzimas.
El vector pSV1, que contiene el promotor
temprano de SV40 y la señal de poliA de SV40 (Okayama y Berg, Mol.
Cell. Biol. 3 (1983), 280-289; Mulligan y Berg,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2.072-2.076),
se cortó igualmente con EcoRI y SaII. El vector aislado posee un
tamaño de 3.490 pb. El fragmento del dLNGFR se ligó en el vector
pSV1. El gen para el dLNGFR se encuentra bajo el control de la
expresión del promotor temprano de SV40 y de la señal de poliA de
SV40. La secuencia de casete de expresión total abarca 1.900 pb. El
resultante vector pSV-DLNGR se representado en la
Fig. 2.
Células del linaje HT1080 se transfectaron de
manera transitoria con el plásmido pSV-DLNGFR, tal
como se ha descrito anteriormente. Después de un crecimiento
durante dos días, las células se analizaron en cuanto a la
expresión del dLNGFR con ayuda del anticuerpo monoclonal
anti-dLNGFR. El resultado se reproduce en la Figura
3, que muestra que se pueden diferenciar mediante un análisis FACS
las células que expresan el dLNGFR y las células que no lo
expresan. Ésta muestra además que la reacción del anticuerpo
anti-dLNGFR es específica para células
transfectadas.
La casete de expresión de dLNGFR se aisló a
partir del pSV-DLNGFR con las enzimas de restricción
NotI y PvuII. El vector de dirección hacia un gen diana "p187"
para el gen de EPO humano (descrito en los documentos de
solicitudes de patentes europeas EP 97 112649,5 y EP 97 112640,5,
véase la Fig. 4b) se cortó con NotI y EcoRV. El fragmento de vector
con un tamaño de 14.551 pb se aisló y se ligó con la casete de
expresión del dLNGFR (Fig. 4). El resultante plásmido
"p187-DLNGFR" se transfectó en E. coli
y se propagó allí.
Células HT1080 se transfectaron con el
p187-DLNGFR y se seleccionaron en cuanto a una
integración estable, es decir que 24 horas después de la
transfección se añadió G418 al medio. El primer análisis FACS se
llevó a cabo después de un crecimiento durante aproximadamente 3
semanas y, ciertamente, después de haberse formado los primeros
focos, cuyas células se habían agrupado. Tal como lo muestra la
Figura 5, después de este periodo de tiempo, las células negativas
en cuanto a dLNGFR, en este caso un 14% de la población, se pueden
diferenciar mediante análisis FACS con respecto de las células que
expresan el dLNGFR.
En esta población celular se encuentran, junto
al suceso, que aparece raramente, de la recombinación homóloga,
también las células que tienen una densidad muy pequeña de
receptores en su superficie, y que, por tanto, no son reconocidas
por el sistema de detección. No obstante, de esta manera se puede
reducir claramente el número (aquí 14 de 100%) de los clones, que
tienen que ser ensayados a continuación en cuanto a la expresión
del gen diana.
Si en una tanda de transfección no se encuentra
ningún clon, que tiene presente recombinado de manera homóloga el
vector de dirección hacia una diana, esta circunstancia puede ser
demostrada sin gran esfuerzo de trabajo en comparación con el
escrutinio convencional. La ausencia de clones recombinados de
manera homóloga es demostrada por la aparición de una población que
reacciona en un 100% con el anticuerpo anti-dLNGFR.
Se puede suprimir entonces el escrutinio ulterior en cuanto a la
expresión del gen diana.
Claims (26)
1. Procedimiento para la introducción de un ADN
ajeno en una célula hospedante mediante recombinación homóloga,
siendo transfectada la célula hospedante con un vector recombinante,
que abarca dos secuencias de nucleótidos flanqueadoras, homólogas
con respecto a una secuencia diana en el genoma de la célula
hospedante, dentro de las cuales se encuentra una secuencia de
nucleótidos, que codifica un marcador de selección positiva, y fuera
de las secuencias flanqueadoras se encuentra una secuencia de
nucleótidos, que codifica un marcador de selección negativa, las
cuales están unidas operativamente en cada caso con una secuencia
de control de la expresión, activa en la célula hospedante,
caracterizado porque
como gen marcador de selección negativa se
utiliza por lo menos una secuencia de nucleótidos, que codifica un
polipéptido localizado junto a la superficie celular, realizándose
que, después de una integración del vector mediante recombinación
homóloga en el genoma de la célula, no es expresado el gen marcador
de selección negativa, y, después de una integración casual del
vector en el genoma de la célula, es expresado el gen marcador de
selección negativa, y el producto génico de éste es presentado en la
superficie de la célula,
llevándose a cabo una etapa de selección en
cuanto a la presencia del gen marcador de selección positiva y una
etapa de selección adicional en cuanto a la ausencia del gen
marcador de selección negativa, y la selección en cuanto a la
ausencia del gen marcador de selección negativa abarca (a) poner en
contacto las células transfectadas con una molécula de fijación,
que se fija al producto génico del gen marcador de selección
negativa, y (b) separar las células que contienen la molécula de
fijación fijada.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1,
caracterizado porque
se utiliza un gen marcador de selección
negativa, que codifica un receptor de LNGF, de CD24, de LDL o de
trk, o un fragmento del receptor que contiene el dominio de
fijación a un ligando, situado en la membrana.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque
como molécula de fijación se utiliza un
anticuerpo, que está dirigido contra el producto génico del gen
marcador de selección negativa.
4. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque
como molécula de fijación se utiliza un
partícipe natural en la fijación del marcador de selección negativa,
o un análogo a éste.
5. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque
se utiliza una molécula de fijación, que está
acoplada a una fase sólida.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5,
caracterizado porque
como fase sólida se utilizan microperlas
magnéticas.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado porque
se utiliza una molécula de fijación, que lleva
un grupo de marcación o/y un grupo de fijación a una fase
sólida.
\newpage
\global\parskip0.950000\baselineskip
8. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7,
caracterizado porque
el grupo de marcación o/y el grupo de fijación a
una fase sólida se seleccionan entre biotina, derivados de biotina,
haptenos, enzimas y colorantes.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8,
caracterizado porque
se utiliza biotina o un derivado de biotina
seleccionado entre imino-biotina,
amino-biotina y destio-biotina.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8,
caracterizado porque
como enzima se utiliza una fosfatasa alcalina o
una peroxidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8,
caracterizado porque
como colorante se utiliza un colorante
fluorescente.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11,
caracterizado porque
como colorante fluorescente se utiliza
fluoresceína, ficoeritrina, rodamina, la proteína de peridinina y
clorofila, o el rojo de Tejas.
13. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9,
caracterizado porque
las células, que expresan el marcador de
selección negativa, son identificadas mediante fijación a una fase
sólida revestida con avidina o estreptavidina.
14. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10,
caracterizado porque
las células, que expresan el marcador de
selección negativa, son identificadas mediante una reacción
cromática catalizada por una enzima.
15. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 11 ó 12,
caracterizado porque
las células, que expresan el marcador de
selección negativa, son identificadas mediante un análisis por
citometría de flujo pasante.
16. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque
la célula es una célula eucariótica, de manera
preferida una célula de mamífero, y de manera especialmente
preferida una célula humana.
17. Vector recombinante para la recombinación
homóloga en células de mamíferos, que abarca,
- (a)
- dos secuencias de nucleótidos flanqueadoras, homólogas con una secuencia diana en una célula,
- (b)
- una secuencia de nucleótidos, que codifica un marcador de selección positiva bajo el control de una secuencia de control de la expresión, activa en la célula, que se encuentra dentro de las secuencias flanqueadoras de acuerdo con (a).
\global\parskip1.000000\baselineskip
- (c)
- una secuencia de nucleótidos, que codifica un marcador de selección negativa bajo el control de una secuencia de control de la expresión, activa en la célula, que se encuentra fuera de las secuencias de nucleótidos flanqueadoras, homólogas, y el producto de expresión de éste es un polipéptido que está localizado junto a la superficie de la célula.
18. Vector de acuerdo con la reivindicación
17,
caracterizado porque
las secuencias de nucleótidos flanqueadoras,
homólogas, se seleccionan entre la zona de un gen para EPO, tPA,
G-CSF, GM-CSF, TPO, una
interleucina, un interferón, un factor de crecimiento, una insulina
o el factor de crecimiento del tipo de insulina.
19. Vector de acuerdo con una de las
reivindicaciones 17 ó 18,
caracterizado porque
la secuencia de nucleótidos, que codifica el
marcador de selección positiva, es un gen de resistencia frente a
neomicina, kanamicina, geneticina o higromicina.
20. Vector de acuerdo con una de las
reivindicaciones 17 a 19,
caracterizado porque
la secuencia de nucleótidos, que codifica el
marcador de selección negativa, es una secuencia que codifica un
receptor de LNGF, CD24, LDL o trk, o un fragmento situado en la
membrana, que contiene el dominio de fijación a un ligando de
éste.
21. Vector de acuerdo con una de las
reivindicaciones 17 a 20,
caracterizado porque
contiene, dentro de las secuencias
flanqueadoras, además una secuencia de control de la expresión
heteróloga.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Vector de acuerdo con la reivindicación
21,
caracterizado porque
la secuencia de control de la expresión abarca
un promotor de CMV.
\vskip1.000000\baselineskip
23. Vector de acuerdo con una de las
reivindicaciones 17 a 22,
caracterizado porque
contiene, dentro de las secuencias
flanqueadoras, además un gen de amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
24. Vector de acuerdo con una de las
reivindicaciones 17 a 23,
caracterizado porque
las secuencias de nucleótidos flanqueadoras,
homólogas, abarcan la zona codificadora del gen diana, o una parte
de ésta.
25. Vector de acuerdo con la reivindicación
24,
caracterizado porque
las secuencias de nucleótidos flanqueadoras,
homólogas, se seleccionan de tal manera que, en el caso de una
recombinación homóloga, aparece una mutación en la zona codificadora
del polipéptido diana maduro.
26. Utilización de un vector de acuerdo con una
de las reivindicaciones 17 a 25 en un procedimiento de recombinación
homóloga.
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