JPS62282585A - ハイブリツドプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規なプラスミドに関し、更に詳しくは放線菌
に属する微生物で複製増殖できるプラスミドのマーカー
付けに利用できるハイブリッドグラスミドに関するもの
である。

従来の技術 近年、遺伝子操作技術は大腸菌、枯草隋、酵母などにお
いて広く応用され、従来微生物では生産されなかっ九有
用物質が生産されるようになった。

また、その技術は微生物生産物そのものの改良や、増収
に投置っている。一方、放線菌は抗生物質、酵素阻害剤
、酵素などの生定菌として工業上重要な微生物である。

就中、ストレプトミセス属は有用な抗生物質の生産菌株
であり、抗生物質の改良や増収に期待がかけられ、犬Ｐ
＆菌等と同様に遺伝子操作技術を応用すべく各種のベク
タープラスミドが提案されている。これらの具体的なも
のとしては、例えば、５ＬＰ１．２　、　ｐｌＪｌｏｌ
　、　５ＣＰ２　　及びこれらの誘導体が挙げられる〔
例えば、デ・）４イオロジー・オプ・ザ論アクテノミセ
イテス（ＴｈｅＢｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃ＠ｔｅａ　）　ｓ　２２９〜２８６頁（１
９８３）アカデミツクプレス（Ａｃａｄ＠ｍｉｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ　）　：ザ・ジェネラル・マイクロビオロノー（
Ｔｈ＠Ｇ＠ｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　）
　、１２９゜２７０３〜２７１４頁（１９８０）：ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２８４，５２６〜５３１頁（
１９８０）：同、２８６，５２５〜５２７頁（１９８０
）；ジャーナル番バクテリオロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ）ｅ１５１．６６８〜６７７頁（１９８
２）参照〕。

発明が解決しようとする問題点 ところが、上記のプラスミド、例えば、５ＣＰ２＊およ
び５ＬＰＩ、２由来のプラスミドの宿主はストレグトミ
セスーコエリコラー（５ｔｒｓ　ｔｏｍｙｃｅａ　（以
下「下、」と略記する）　ｅｏｅｌｌｃｏｌｏｒ　）ま
たはストレプトミセス・リビダンス（ａｓ　１ｉｖｌｄ
ａｎｓ　）に限定され、他の工業上重要な抗生物質生産
菌では複製維持されず、ベクターとしての応用範囲が狭
いという難点がある。ＰＩＪＩＯＩ由来のプラスミドの
宿主域は比較的広いが、すべての抗生物質生産菌を宿主
とすることはできない。またコピー数が４０〜３００コ
ピ一／染色体と多く、クローン化にさいし、挿入された
外来ＤＮＡから翻訳される蛋白により宿主自体の代謝系
を不必要に乱す可能性がある〔モレキユラー・アンド・
ジェネラル・ジェネｙティクス（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
ａｎｄ　Ｇｅｎ＠ｒａｌ　Ｇｅｕｅｔｉｃｍ　）　。

１８５．２２３〜２３８頁（１９８２））。

工業上有用な物質を生産する放線菌、とくにストレプト
ミセスについて遺伝子工学的手法によ）育種する場合、
幸運にもその菌株に天然のグラスミドが存在し、適当な
制限酵素切断部位があればよいが、通常はプラスミドが
自然に含まれることが少なく、もし存在しても適当な制
限酵素切断部位が存在しないことが多い。

一般に放線菌由来のプラスミドは機能が知られているも
のが少なく抗生物質生産がグラスミドに支配されている
のはメチレノマイシンが知られて１／Ｉ　　Ｚ、／７’
ｌ　　ｊｈ　　１嘩　ｆ＞　　Ｌ　　ｒ　　Ｊ＝　　−
、１ｐ　＾　−、Ｌｅ　　　　ａｓ　　　　　　　ｗ　
　　　＠Ｐ　　　６ ジヤーナＡ−ｅオプ・ジェネラルＯマイクロピオロジ−
（Ｈｏｐｗｏｏｄ　＊　Ｄ−Ａ、　ａｔ　ａｌｓ　：　
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ　）　（１９７７）　ｅ　９８　ｐ２３９−
２５２頁〕。また一部のプラスミドはポック形成能があ
シ、選択マーカーとなり得るが〔トムプソン、シー、ジ
ェーら；ネイチャー（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｐ　Ｃ，Ｊ、
　ａｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　）　、　２８６　。

５２５−５２７（１９８８０））、宿主によってはポッ
ク形成が認められない場合があり、その性質は不安定で
ある。なおグラスミドによる形質転換において最も良い
マーカーは、薬剤耐性である。

しかし、放線菌から得られる天然のプラスミドで薬剤耐
性を持ったものは皆無であシ、通常、機能の知られない
（ｅｒｙｐｔｉｃ　）プラスミドを単離して、各種制限
酵素切断部位をしらべ、別の放線菌ＤＮＡから薬剤耐性
遺伝子をクローニングする努力がなされる。一つのプラ
スミドについて、このような方法でマーカー付は操作を
行って対象菌株に導入してもその宿主の制限修飾系酵素
によって、そのプラスミドがａ製で六かけれげ、ネを警
１１のデラスミドについて同様の操作をしなければなら
ず、多大の労力時間を要する結果となる０例えば、放線
菌プラスミドへの薬剤耐性による選択マーカー付は次の
如くして行われている。

Ｃ，Ｊ、　トンプソンらはプラスミド５ＬＰＩ、２の制
限酵素分解部位をしらぺ、そのＢａｍＨ１部位にストレ
プトミセス・アズレウス（Ｓａ　ａｚｕｒｓｕｓの染色
体ＤＮＡの制限酵素Ｍｂｏ１部分分解物（２−２０ｋｂ
　）を連結し、ストレプトミセス・リビダンスに形質転
換後、チオストレプトン耐性株を分離している。

この耐性株よりチオストレプトン耐性遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片が挿入されたプラスミドが得られている（ネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）２８６ｔ５２５（１９８０））。

コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　）らはグラスミドｐＴ
Ａ４００１にストレプトスリシン耐性遺伝子を導入する
ために、先ずｐＴＡ４００１の制限酵素地図を作成した
。ストレプトミセス・ラペンジュラ（Ｓ、　１ａｖｅｎ
ｄｕｌａａ　）の染色体ＤＮＡからプラスミドｐＩＪ４
１　’ｉ用いてストレプトスリシン耐性遺伝子をクロー
ニングしハイブリットプラスミドｐＩＪ４１−８Ｒ５１
’に得た。つぎにｐＩＪ４１−８Ｒ５１よりＢａｍＨ１
分解フラグメンｔｔ−精製しｐＴＡ４００ｆのＢｇｌ１
１部位に連結し、ストレプトミセス・リビダンスに形質
転換した。かくしてストレプトスリシン耐性コロニーよ
り目的グラスミドを得ている（　Ｔ、　Ｋｏｂａｙａｓ
ｈｌら：ジャーナル・オプ・アンティバイオティクス（
Ｊ・Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　）　３７　、３６８　（
１９８４）　）。

そこで、本発明者らは適当な制限酵素切断部位を有し、
かつ、適当な選択マーカーを有する放線菌グラスミドの
構築に用いられる汎用性あるベクターを開発すべく研究
を行ったところ、ある種の大腸菌プラスミドと放線菌グ
ラスミド９から得られるハイブリットプラスミドが各種
の放線菌全宿主として使用できるプラスミドに容易に選
択マーカーを付は得ること金兄い出し本発明を完成した
。

問題点を解決するための手段 しかして、本発明は一以上の選択可能な放線菌遺伝子を
含むＤＮＡ断片及び二つ以上の選択可能な大腸菌遺伝子
を含むＤＮＡ断片を有し、該大腸菌遺伝子のうち、少な
くとも一つは挿入失活による選択可能な遺伝子からなる
ことｔｌ−ｔｖ！徴とするノ・イブリッドプラスミドが
提供される。

本発明にいう挿入失活による選択可能な遺伝子とは、犬
腸廚の遺伝子断片の制限酵素切断部位に外来ＤＮＡ　’
ｔ”挿入したとき該大腸菌遺伝子断片の有する機能の発
現を喪失する遺伝子をいい、複数の適当な制限酵素切断
部位を有し、かつ薬剤耐性その他の選択可能な大腸菌遺
伝子を含むものであればその起源を問わない。より具体
的には市販の遺伝子断片、例えば、テトラサイクリン耐
性遺伝子（ＴｅｔｒＧｅｎ　Ｂｌｏｃｋ　、）７　ルマ
シア社製）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣＡＴ
　Ｇｅｎ　Ｂｌｏｃｋ　、同上）−ネオマイシン耐性遺
伝子（ｐＮＥｏ　、同上）、カナマイシン耐性遺伝子（
ＫｉｎｒＧｅｎ　Ｂｌｏｃｋ　、同上）若しくはかかる
機能を担うプラスミド、例工ばｐＵＣ８（ファルマシア
社製）等からそれ自体公知の調製方法〔例えば、Ｇ＠ｎ
ｅ　、　２　、９５　（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ、２８
２，８６４（１９７９）等〕によって調製されろアンピ
ンリン耐性遺伝子若しくはラロン（ｔｒｐ　）　ｋ挙げ
ることができる。これらのうち、特にラクトースオペロ
ンを含む遺伝子断片が、ＤＮＡの組み換えの結果を視覚
的に追跡できる点で好適である。

従って、二以上の選択可能な大腸＠遺伝子を含むＤＮＡ
断片とは、上記挿入失活による選択可能な遺伝子の他に
更に、上述し北ような選択可能な大腸菌遺伝子を併せも
つものが挙げられる。

次に、一以上の選択可能な放線菌遺伝子を含むＤＮＡ断
片とは、宿主として放線菌を用いて、該断片を有するプ
ラスミドを形質転換したとき、薬剤耐性、栄養要求性等
により非形質転換体から選択しうる形質を与えるものを
いう。好適には薬剤耐性遺伝子を担うＤＮＡ断片が用い
られ、具体的にはチオストレプトン耐性遺伝子１：　Ｆ
Ｊ、カッツら：ジャーナル・オプージェネラルマイクロ
バイオロジ−（Ｊ、　Ｇａｎ、　Ｍｔｃｒｏｂｌｏｌ、
　）　１２９　、２７０３（１９８３）］、ストレグト
スライシン耐性遺伝子〔Ｔ、コバヤシら：ジャーナル礫
オブ・アンティ（１９８４）　〕Ｊカナマイシン耐性遺
伝子〔Ｍ。

ナカノら：ジャーナル・オプ・バクテリオロジー（Ｊａ
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）　１５　’、　ｅ　７９　
（１９８４）　Ｌネオマイシン耐性遺伝子（Ｃ，Ｊ・ト
ンプソンら：グロシーディング・オプ・ナシ璽ナルアカ
デミツクサイエンス）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ＠Ｓｃｉ、　■５５ｔ９０（１９８３））、エリス
ロマイシン耐性遺伝子〔ＣゆＪ、トンプソンら：ジーン
（Ｑｅｎ・〕。

２０．５１（１９８２））＃テトラサイクリン耐性遺伝
子〔Ｔ、オーヌキら：ジャーナル曝オプ・バクテリオロ
ジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）　１６１　ｅ　
１０１０（１９８５））等を含む遺伝子断片を好適なも
のとして挙げることができる。

しかして、本発明のハイブリットプラスミドは上述の一
以上の選択可能な放線菌遺伝子を含むＤＮＡ断片と二つ
以上の選択可能な大腸菌遺伝子を含むＤＮＡ断片を有す
るものであればいずれの組み合せに係るものでもよい。

より具体的には、茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番３
号の工業技術院微生物工業技術研究所に昭和６１年９月
２７日付で受託番号：微工研菌寄第ｇυＩ　号で菌寄さ
れているエシェリヒア、・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｌ　）　ＪＭ１０３　（ｐｓＲ８５８）よシ
それ自体公知のプラスミド分離・精製法によって採取す
ることができる〔例えば、ヌクレイツクアシド・リサー
チ（Ｎｕｃｌｅｉｅａｃｉｄ　Ｒｅｓ、）　ｅユ、　１
５１３〜１５２３頁（１９７９）参照〕、第２図で示さ
れるプラスミドｐｓＲ８５８を挙げることができる。

本発明のプラスミドは目的に応じた原料遺伝子断片を選
び、それぞれ第１図に示す１橿に準じて調製することが
できる。

以下、大腸菌のプラスミドｐ　ＵＯ３及び放線菌のプラ
スミドｐＩＪ７０２’を出発原料とした場合を例に本発
明のハイブリッドグラスミドの調製法を説明する。

大腸菌プラスミドｐＵＣ８（ファルマシア社製）はｐＢ
Ｒ３２２由来のアンピンリン耐性遺伝子（Ａｍｐ　）と
ＤＮＡの複製開始点および大腸菌のｌａｃ　Ｚ遺伝子と
から成っている〔Ｊ、フイーラ（ｖｉｅｉｒａ　）らニ
ジ−”ｙ（Ｇａｎｓ　）　１９　、２５９頁（１９８２
）：ｌ。

１ａｃＺ領域には、制限酵素認識部位（ＨｉｎｄＩ［ｌ
　ｅＰｓｔｌ　　ｅ　　５ａｉｌ　　、Ａｃｃｌ　　ｐ
　ｌ１ｉｎｅｌｌ　　ｅ　　ＢａｍＨＩ　　、Ｓｍａｌ
　　ｐＸｍａｌ　、　ＥｃｏＲｌ　）が迷ったＤＮＡが
挿入されておシこれらの認識部位はいずれもこのプラス
ミドの他の領域には存在しない。このグラスミドをＬａ
ｃ−大腸菌（ＪＭ１０３　）に導入し、Ｘ−ｇａｌ　（
５−Ｂｒｏｍｏ　−４−Ｃｈｌｏｒｏ　−３−１ｎｄｏ
ｌｙｌ−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ　）
存在下で培饗するとコロニーは青色となる。外来のＤＮ
Ａ断片をこれらの制限酵素認識部位の中のどの部位に挿
入してもＬａｃ遺伝子は不活性化され白いコロニーとな
る。この性質を利用して放線菌のプラスミドｐｌＪ７０
２より制限酵素Ｂｅ１ｌで切り出したチオストレプトン
耐性遺伝子（ｔｓｒ　）のＤＮＡフラグメントをｐｔｙ
ｃｓのＢａｍＨ［部位にクローニングした。これらの組
換えグラス１　　　ミドの分子量の大きさと制限酵素Ｃ
１ａｌとＰｓｔｌの二重分解によりｔｓｒＤＮＡの組込
みの方向を決め反時計回りの方向に入ったプラスミド’
ｌｉ　ｐｓＲ８５７１。

時計回りの方向に入ったプラスミドをｐｓＲ８５７２と
した（第１図参照）。

ダーゼ遺伝子のＮ末端をコードするＤＮＡフラグメン）
　＜　ｔａｃ　Ｚ’）　を挿入シ大ｈｙ菌ＪＭ１０３株
中でβ−ガラクトシダーゼ活性を現わすベクターを構築
するために以下の操作を行った。

（ａ）　　プラスミドｐＵＣ８から制限酵素Ｔａｑ　１
部分分解によｐ、１ａｃＺ’遺伝子を単離する。

（ｂ）　　単離しｆＩ−１ａｃＺ’遺伝子をｐＳＲ８５
７２の制限酵素Ｃ１ｍ１部位にクローニングする。

（ｃ）　　（ｂ）で得られた組換えプラスミドをＰｓｔ
ｌ分解し１ａｃＺ’遺伝子を単離した。

（ｄ）　　（ｅ）で得られた１ａｃＺ’遺伝子１　ｐｓ
Ｒ８５７１のＰｓｔ１部位にクローニングした。かくし
て本発明のハイブリッドグラスミドの一つであるｐｓＲ
８５８が得られる。

作用 本発明のプラスミドは、上述したごとく選択可能な大腸
菌遺伝子を含むことから大腸菌を宿主として容易に増殖
せしめることができ、更に挿入失活による選択可能な遺
伝子断片を有するため、外ドの選択が容易である特徴を
示す。

即ち、ｌａｃ遺伝子断片を有するハイブリッドグラスミ
ドを例にその作用を説明すると、上述のとと（ｌａｃ遺
伝子断片の有する適当な制限酵素認識部位に外来の遺伝
子を挿入することによりその形質が失われるため、）（
−ｇａｌ存在下で視覚的にクローニングプラスミドの選
択が可能であシ、かつ、他の選択可能な遺伝子断片の作
用と相俟って所望のクローニングプラスミドの選択を容
易にする作用を示す。

以下に実施例、参考例を示し、本発明の効果を明らかに
するとともに、本発明をよシ詳細に説明する。

実施例１ 犬腸呵プラスミドはＪ、　Ｍｅｓｓｉｎｇらの開発した
ｐＵＣ８（ファルマシア社製）を用いた。Ｅ＠　Ｋａｔ
ｚらの開発したプラスミドｐＩＪ７０２　（ＡＴＣＣ屓
３５２８７）より制限酵素Ｂｃｌｌにより分解しエタノ
ール沈澱後・ライダーシ田ンパッファ−（トリス嘩ＨＣ
６２０ｍＭ。

ＭｇＣ４２・６Ｈ６Ｈ２Ｏ１０ｒｒＬに溶かしたもの（
５ｔＪ　）と、ｐＵＣ８ｆ　ＢａｍＨＩにて完全に分解
しエタノール沈澱後うイダーシ冒ンバツフア−に溶かし
たもの（２，５μｊ）とを混合し、蒸溜水３２μｊと５
μｊの１０倍濃度のライダーシｊンパッファー（トリス
・ＨＣｌ　　２　　０　　０　　　ミ　　リ　　モ　ル
　／　７番　　、　　　ＭｇＣｌ２　・６Ｈ２０１００
ミ　リモル／Ｚ）’ｒ加え、さらに９．０５　ｍＭＡＴ
Ｐ　ｆ　５　μｌｋ。

ＩＭソチオエリスリトールを０．５μ７．Ｔ４−ＩＪガ
ーゼ（２０ユニツト／μｚ）’Ｉｉμ＃加、（２５℃で
１３時間反応した。この反応液５μＺ　ｆ　Ｆ２．　ｃ
ｏｌｔＪＭ１０３株（ファルマシア社）に公知の形質転
換法（Ｅ、Ｍ、　Ｌｅｄｅｒｂｓｒｇ　ａｎｄ　Ｓ、Ｎ
、　Ｃｏｈｓｎ　：　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ　１１９　、１０７２　（１９７４））
で形質転換した。形質転換体は、選択培地（アンピンリ
ン２５μｙ−／ｆｎｔとＸ−ｇａｌ　４０　μｔ／ｍｌ
　、　ＩＰＴＧ４８μ？／−ヲ含むし一培地）上で白色
となるコロニーとして選択できた。得られた白色コロニ
ーを別の平板培地（アンピンリン２５μ？／、ｄ’に含
ｔｒＬ−培地）に移し、充分に生育させた後４ｏコロニ
ーから公知の方法（Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ａｎｄ
　Ｊ、　Ｄ−ｏｌｙ：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒａ
ａｅａｒｃｈ　　７　　ｐ　　１　５　１　３　　（１
９７９））でプラスミドを抽出し、アガロース電気泳動
によシ分子量をしらべた。

ｐＩＪ７０２のＢｅ　１１完全分解物の中ではｔｓｒ遺
伝子は最も分子量が小さいので、しらべた組換えプラス
ミドの中で最も分子量の小さいものが目的のｔｓｒ　を
組込んだプラスミドである。しらべた４０株のプラスミ
ドの分子量は４ａｉ類あり、最も小さいプラスミドを含
むコロニー４株を目的のプラスミドとして選択すること
は容易であった。この４株のプラスミドのｔｓｒの挿入
方向を決めるために以下の実験を行った。

各グラスミドの制限酵素Ｃ１ｍ１で完全分解しアガロー
ス電気泳動で分子量をしらべると３株からは８２３　ｂ
、ｐｅ　（塩基対）と３．０ｋｂｐの７ラグメントが、
１株からは２５４　ｂ、ｐ、と３．５８　ｋｂ、ｐ、の
フラグメントが検出された。前者のプラスミドにはｔａ
ｒが反時計回りに入っており（ｐｓＲ８５７１）後者か
った（第１四参照）。

プラスミＰｐＵｃ８浴液２００μ！（２μ？）、蒸溜水
１６０　ａＺ　、バッファー（Ｉ　ＭＮａＣ２，’１０
０ｒｒＭ　　　ト　　リ　　ス　　・　　ＨＣＬ　　　
、　　　６　　０　　　ｍＭ　　Ｍｇ（：ｔ２　　、　
　６　　０　　　ｍＭ　　　２＠　− メルカプトエタノール、ｐＨ８，４）４０μｊおよび制
限酵素Ｔａｑ　Ｉ浴液２μ１（１１ユニツト）を加え６
０℃で２時間反応後ｌＯμノをと９分解反応を７ガロー
ス電気泳動でしらべた後、さらにＴａｑｌ　３μｉ！、
−を添加し６０℃、２時間反応を行った。これをフェノ
ール処理、エタノール沈澱ヲ行い、ＤＮＡ’ｚ２００μ
ｌの蒸溜水に溶解した。このＤＮＡを１．３５係の低融
点アガロースで電気泳動を行い、同時に行ったλファー
ジＨ１ｎｄ［ｌ　ＤＮＡ　ｆ分子量マーカーとして使い
、１．３４　ｋｂのＤＮＡを回収した。このＤＮＡ断片
に１ａｃＺ’遺伝子が含まれる。

乙！ し、Ｃ１ｍ１は（５’）ＡＴＣＧＡＴ（３つのＴとＣの
間を切断する。従ってＴａｑ　Ｉ切断部とＣ１ｍ１切断
部は付着性末端となり箋容易に結合ができる。すなわち
、ｐｓＲ８５７２のＣ１ｍ１切断物ｓ　μ７　（ｌ　ｔ
ｔｆ　）と前述の１．３４ｋｂの１ａｃＺ’遺伝子を含
むＤＮＡ　１０　ｐｉ　（２ａｔ　）とを混ぜ１００倍
量のライゲージｌンパッファ５μｌおよび蒸溜水２４．
５　ａｔ　、　９．０５　ｍＭ　ＡＴＰ溶液５μ６゜１
Ｍジチオスレイトール溶液０．５μ！、Ｔ４−リガーゼ
１μｔ（２０ユニツト）を加え３７℃、２時間反応後さ
らに２５℃で２時間反応を行った。このＤＮＡ溶液５μ
ｊを用いて、前述のコーエンらの方法によってＦ、、　
ｃａｄｉ　ＪＭ１０３株を形質転換した。この菌株を選
択培地（アンピンリン２５μｆ７ｍｌ　、　Ｘ−ｇａ１
４０μＰ／ｄ　ＩＰＴＧ　４８μ？／−を含むＬ−培地
）に生育させ、青色を示すコロニーを選択し、プラスミ
ドを抽出後Ｐｓｔ１分解すると、０．７２ｋｂのフラグ
メントを生成するグラスミドと１．　ｌ　４　ｋｂの７
ラグメントを生成するプラスミドがあったが、これらは
１ａｃＺ’ＤＮＡの挿入方向が互に逆向きのものであっ
た。０．７２　ｋｂフラグメントを生成するプラスミド
金ｐＳＲ８５７３とした（第１図参照）。

（ｄ）　ｐｓＲ８５７３から１ａｃＺ’遺伝子の単離ｐ
ｓＰ、８５７３を有する形質転換体をＬ−グロス（アン
ピンリン２５μｐ−含有）にて培養し、２体から前述の
Ｂｉｒｎｂｏｌｍらの方法によってプラスミドを抽出し
た。このグラスミドｐｓＲ８５７３の溶液２００μｊ（
２μ？〕に蒸溜水１６０μ６とバッファー（５００ｍＭ
　　（ＮＨ４）２ＳＯ４−２００ｍＭ　　ト　リ　ス　
−ＨＣｌ　（ＦＪ（７，５）　　。

１００　ｍＭ　ＭｇＣｌ２）　４０　ＡＺおよびＰａｔ
ｌ　１０　ＡＺ（７３，５ユニツト）ｔ−加え３７Ｃ，
６時間反応を行った。この反応液’ｋ　１．３　％低融
点アガロースを用いて電気泳動を行い、同時に泳動した
λファージＨ１ｎｄＩＩＩ分子量マーカーと対照して０
．７２　ｋｂのＤＮＡ　’ｉ単単離精製した。７０チエ
タノール沈澱後１００μｌの蒸溜水に溶解した。

一ニング ｐｓＲ８５７１’ｅ保有するＢＥ、　ｃａｌｌ　ＪＭ１
０３株をアンピンリン２５ｒ鷹を含むＬ−培地（２５ｍ
／２５０ｍ１容三角フラスコ）４本で培養（３７℃、２
４時間）し果直後前述のＢｉｒｎｂｏｉｍらの方法によ
りグラφ スミドを抽出した。このプラスミド液２０μＡ（１μ？
）に蒸溜水７０μｌ、バッファー（５００ｍＭ（ＮＨ４
）２ＳＯ４，２００ｍＭ　　Ｉ’リス−ＨＣｌＣｐＨ’
７．ｓ　　）　　−１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２　）　１０
μＡ’ｉ加え、さらにＰｓｔ１２μＡ（１４，７ユニツ
ト）を加えて３７℃、６時間反応を行った。反応液をフ
ェノール抽出・クロロホルム抽出後、７０チエタノール
沈＃を行い、蒸溜水１００μｊに溶解した。このＤＮＡ
液１０μｌに前述の０．７２　ｋｂの１ａｃＺ’遺伝子
溶液１０μｌ。

１０　倍！ｉのライｒ−シ胃ンパッファ−５μｌ。

蒸溜水１９．５　ｔＪを加え、さらに９．０５　ｍＭ　
Ａ’ｒｐ　５μ＃、１Ｍジチオスレイトール０．５μｊ
およびＴ４−リガーゼｌμＡ（２０ユニツト）ｔ−加え
て３７Ｃ，２時間、つづいて２５℃で１８時間反応を行
った。この反応液５μｌを用いて前述のコーエンらの方
法により旦、−叩１１　ＪＭ１０３を形質転換し、選択
培地（アンピンリン２５μｆ／ｍｌ　、　Ｘ−Ｇａ１４
０　ｆｉｔ／ｍｌ。

ｒＰＴＧ　４８μ？鷹を含むＬ−培地）上で青色となる
スミ気泳動によ）組換えプラスミドｐｓ１８５８　（４
，５４ｋｂ　）を得た。ｐｓＲ８５８の制限酵素地図は
第２図のとおりである。

実施例２ 実施例１で得られたプラスミドｐｓＲ８５７１のＥＣｏ
Ｒｌ分解物溶液２０μＡ（１μ？）とカナマイシン耐性
遺伝子（ＧｅｎＢｌｏｃｋ　、フフルマシア社製）２０
μｊ（１μ？）と金混ぜ、２倍量のエタノールと１／１
０愈の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）を加え一２０
℃にて２０時間放置後遠心分離によってＤＮＡ　１ｒ集
めた。これをエタノールで洗浄、遠心分離し沈澱ｔ−３
８，５μ！の蒸溜水に溶かし、１０倍本度の２イグーシ
ヨンパツフｙ　５　Ａｌ　、　９．０５　ｍＭ　ＡＴＰ
　俗液５μ＃、１Ｍジチオスレイトール溶液０．５μ＃
、Ｔ４−リガーゼ１μ１（２０＄ニツト）ｔ−加え１６
℃。

３６時間反応を行った。このＤＮＡ溶液５μｊを用いて
前述のコーエンらの方法によりＥ、　ｃｏｌｔ　ＨＢＩ
ＯＩ株全形質転換し、選択培地（カナマイシン２５μｆ
／ 春１イ／′ＬーＩＰｌ−一ち１（１４ 得られたコロニーから本発明のハイブリッドグラスミド
ｐｓＲ９５８（５，３ｋｂ　）が得られた。

効果 本発明のハイブリッドグラスミドは前述の作用を有する
±め、それ自体自己増殖能のあるＤＮＡ領域を含む放線
菌を宿主とするプラスミドをクローニングすることによ
り、適当な選択マーカー及び外来のＤＮＡ断片の挿入可
能な制限酵素認識部位を有する放線菌で使用可能なベク
タープラスミドの構築に供し得る有用性がある。

即ち、対応する放線菌グラスミドを選ぶことにより、抗
生物質、酵素、酵素阻害剤等の生産に用いられる放線菌
で使用可能なベクタープラスミドに選択マーカー、適当
な制限酵素認識部位を付与し得る有用性がある。

用途の一例全参考例によシ以下に説明する。

参考例 土壌より分離したー放線菌ストレグトマイセス・エスピ
ー（５ｔｒｅ　ｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、　）　Ｐ　９６
１８菌（ＦＥＲＭＰ−３Ｂ７　）のプラスミドｐｓＲ９
６１８（１４Ｂｋｂ　）の自己増殖能のあるＤＮＡ領域
を本発明のプラスミドｐ８Ｒ８５８ｔ−用いてクローニ
ングした。

（ｐｓＲ９６１８の調製） 放線菌Ｐ９６１８株のスラントよシ胞子を１白金耳量と
り、ＮＺ培地（ＮＺ−アミンＡ１．Ｏチ、グリセリン２
．０チ、酵母エキス０．　ｌチ、　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
００，０５，％　、　Ｋ２ＨＰＯ４０，０５％　、ｐＨ
７，０、２５ｍ／２５０−三角フラスコ）に接糧し２８
℃で２日間振とう培養した。培養液２５０−より集菌し
、前述のＢｉｒｎｂｏｉｍらの方法によりプラスミドを
抽出し、アガロース電気泳動によシブラスミドの精製を
行った。このＤＮＡ液９０μＡ（１μ？）にバッファー
（５００ｍＭ　　ＮａＣｔ　−６０ｍＭ　　）　　リ　
ス　−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）。

５０　ｍＭ　Ｍｇｃｚ２）　１０　ＡＪと制限酵素Ｂｇ
ｌｌｌ　２　ｔｔＺ（２０ユニツト）を加え３７℃、６
時間反応を行った。この反応液をフェノール−クロロホ
ルム（１：１）抽出、イソアミルアルコール沈澱処理を
行った後ｌＯＯμ！の蒸溜水に浴かした。

（ｐｓＲ８５８のＢａｍＨＩ分解物の調製）実施例１で
得られたｐｓｇｓｓｓを有する大腸菌’ｋＬ−培地（２
５μ？／−アンピンリン含有）にて培養し、その培養液
１００−より前述のＢｉｒｎｂｏｉｍの方法によシブラ
スミドを抽出精製した。得られたＤＮＡ　’ｉ　５００
μｊの蒸溜水に溶かし、その２０μｌに蒸溜水７０μ！
、バッファー（６０ｍＭ　）リス・ＨＣｌ（Ｆ）１７．
５　）　、　ＫＣｌ　２００　ｍＭ　、　ＮａＣｔ２−
６Ｈ２０６０’ｍＭ　、ジテオスレイトール６０　ｍＭ
　）　１０　ａｔおよびＢａｍＨＩ　２　μＺ　（１０
ユニツト）ｔ−加え３７℃。

１４時間反応を行った。常法によシ、フェノール−り０
０ホルム抽出、イソアミルアルコール洗浄を行った後１
００μ！の蒸溜水に溶かした。

（連結反応） 上述の実験により得られたｐＳＲり６１８のＢｇｌ　［
１分解液２０μ！と、ｐｓＲ８５８のＢａｍＨＩ分解物
５　ｐｉとを混合し、さらに１０倍濃度のライダーショ
ンパｙ　７７　５　ｔ’１　％蒸溜水１４．５　ｔｔｌ
　、　９．０５　Ｍ　ＡＴＰ５μＡ、１Ｍジチオスレイ
トール０．５μｊおよびＴ４リガーゼ１μ！（２０ユニ
ツト）ヲ加え３７℃。

２時間反応後、４℃で２０時間放置した。

（大ｉ菌への形質転換） 上述の連結反応混合物１０μｊを用いて前述のコーエン
らの方法によりＦ、、　ｃｏｌｔ　ＪＭ１０３にグラス
ミドを導入した。この菌液をアンピンリン２５μＰ／ｄ
含有のＬ−４％’天培天上地上げ、３７℃で一夜培養す
ると４６４５個のコロニーが出現しその中２８０個が白
色、４３６５個が青色であった。白色コロニーから前述
のＢｌｒｎｂｏｌｍらの方法によりグラスミドを抽出し
、アガロース電気泳動により分子量の大東さをしらべる
と２３８コロニー（８５チ）が組換えプラスミドである
ことが分かった、この組換えグラスミドの検出割合の高
さからも本発明のプラスミドｐｓＲ８５８の有用性が証
明されるが、さらに続く沃の実施例から本発明のプラス
ミドの有用性が証明される。

（放線菌へのプラスミド導入） 前述の組換えプラスミドを保有する白色コロニー５０株
をＬ−培地（アンピンリン２５　ａｔ／ｍｌを含有、３
耐／試験管）Ｋ植え３７℃で１６時間培した。この菌体
より常法によジグラスミドを抽出単離し、得たＤＮＡ’
ｔ　３００μｌの蒸溜水に溶かした。

このＤＮＡ溶液３０μｊに３０チシエークロース溶液３
０　μＡ　ｊＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃ＠ｓ　１ｉｖｉｄａ
ｎａ　１３２６のプロトゲラスト（ホップウッドら：ジ
ャーナル・オツ・バクテリオロジー（Ｊ、　Ｂａｅｔ　
）　、　１５１　ｅ　６６８−６７７（１９８２）の方
法によシ調製）溶液（１０コ／ａｔ　）　１００μＡｆ
ｔ加え、さらに４０チポリエチレングリコール１５００
（両画ら：ジャーナル・オプ・ジェネラルマイクロパイ
オロソ−（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｌｃｒｏｂｉｏｌ　）　
　、　８０　　、３８９　（１９７４）記載のＰ培地に
溶解し九もの）溶液９６μ！を加え静かに撹拌し室温に
１分間放置後、Ｐ培地１ｍを添加し、Ｒ２ＹＥ培地（Ｄ
、Ａ、ホップウッドら：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
２８６，５２５（１９８０）に記載）上に０．１　ｍＡ
づつ拡げた。２８℃で２０時間培養後、この寒天培地を
別のチオベプチン２５μｍ／−ヲ含むＲ２ＹＥ培地上に
移しさらに２日間培養した。出現したコロニーｔ″ＮＺ
培地（グリセリン２−　％　ｔ　ＮＺ　７ミンＡ　１　
％　を酵母エキス０．１　ｔＩｊ、Ｍｇ５ｏ４−７Ｈ２
００，０５チ、　Ｋ２ＨＰＯ４０，０５チ、Ｐ［（７，
０，３−／試験管）に植え２８℃にて２４時ｆｉｌ振と
う培養し、常法によシブラスミドを抽出しアガロース電
気泳動により分子量全比較したところすべてが組換えプ
ラスミドを保有していた。つまシ、もとのｐＳＲ８５８
は放線菌中で複製増殖する遺伝子は持っていないので、
ＰＳＲ９６１８の複製に関与するＢｇｌＩｌ断片がＳ、
　１ｉｖｉｄａｎａで機能し、チオストレプトン耐性を
表わしたものである０本発明の組換えプラスミドはかく
の如く、放線菌の自己増殖領域をクローニングするのに
有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＵＣ８とｐｌＪ７０２を用い本発明のハイブ
リッドブーラスミドの調製法金示すフローチャートであ
る。 第２図は本発明のハイブリットプラスミドｐＳＲ８５８
の制限酵素地図を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一以上の選択可能な放線菌遺伝子を含むＤＮＡ断片
   及び二つ以上の選択可能な大腸菌遺伝子を含むＤＮＡ断
   片を有し、該大腸菌遺伝子のうち少なくとも一つは挿入
   失活による選択可能な遺伝子からなることを特徴とする
   ハイブリットプラスミド。 ２、二つ以上の選択可能な大腸菌遺伝子を含むＤＮＡ断
   片が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃ）、アンピ
   ンリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）、テトラサイクリン耐性遺
   伝子（ｔｅｔ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃ
   ｈｌ）、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）及びカナマ
   イシン耐性遺伝子（ｋａｎａ）から選ばれる二以上の遺
   伝子を含むＤＮＡ断片である特許請求の範囲第１項記載
   のプラスミド。 ３、挿入失活による選択可能な遺伝子がβ−ガラクトシ
   ダーゼ遺伝子（ｌａｃ）である特許請求の範囲第１項又
   は第２項記載のプラスミド。 ４、放線菌遺伝子を含むＤＮＡ断片がチオストレプトン
   耐性遺伝子（ｔｓｒ）、ストレプトスライシン耐性遺伝
   子（ｓｔｈ）、カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎａ）、
   ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、エリスロマイシン
   耐性遺伝子（ｅｒｙ）又はテトラサイクリン耐性遺伝子
   （ｔｅｔ）を含むＤＮＡ断片である特許請求の範囲第１
   項から第３項のいずれかに記載のプラスミド。 ５、放線菌遺伝子を含むＤＮＡ断片がチオストレプトン
   耐性遺伝子断片である特許請求の範囲第１項から第４項
   のいずれかに記載のプラスミド。 ６、該プラスミドが下記の制限酵素地図 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される特許請求の範囲第１項から第５項のいずれか
   に記載されるプラスミド。