KR102488349B1 - 유전적으로 변형된 효모주의 제조 방법 - Google Patents

유전적으로 변형된 효모주의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

효모 미토콘드리아 전사 인자의 유전자가 포유 동물 미토콘드리아 전사 인자로 치환된 효모주의 세포질을 불활성화시키고, 상기 세포질이 불활성화된 효모주와, 포유동물 미토콘드리아 DNA를 함유하는 이종 미토콘드리아를 갖는 효모주를 스페로플라스트 융합시키는 단계를 포함하는 것인, 유전적으로 변형된 효모주의 제조 방법이 제공된다.

Description

유전적으로 변형된 효모주의 제조 방법{METHOD FOR PREPARING GENETICALLY MODIFIED YEAST}
본 발명은 유전적으로 변형된 효모주의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 포유 동물 미토콘드리아 전사 인자(mitochondrial transcription factor A, Tfam)를 발현하고 포유 동물 미토콘드리아 DNA를 함유한 이종 미토콘드리아(xenomitochondria)를 갖는 효모주의 제조 방법에 관한 것이다.
미토콘드리아는 진핵 세포의 세포질에 존재하는 세포 내 소기관이다. 독특한 특징으로, 이들 소기관은 그들 자신의 게놈, 미토콘드리아 DNA(mtDNA)를 갖는다. 대부분의 포유류 세포에서, 원형 mtDNA 게놈은 크기가 대략 16.5kb이고 ATP-생산 경로의 13개 폴리펩티드 성분뿐만 아니라 미토콘드리아 유전자 발현에 필요한 tRNA 및 rRNA를 암호화한다. 상대적으로 작은 크기에도 불구하고, 동물 세포의 mtDNA 게놈은 정상적인 세포 기능을 유지하는 데 필수적이며, 이러한 게놈의 돌연변이는 광범위한 불치의 질병 및 미토콘드리아 기능 장애를 통해 매개되는 암, 당뇨병 및 신경 변성과 같은 다른 복잡한 상태를 유발할 수 있습니다. 정상적인 세포 기능 및 인간 건강에 대한 mtDNA 게놈의 중요한 중요성이 현재 잘 이해되고 있지만, 동물 세포에서 mtDNA를 유전자 적으로 변형시키는 실제적인 방법이 없기 때문에 mtDNA의 다양한 측면을 조사하고 병원성 돌연변이로 인한 미토콘드리아 질병을 모델링할 수 없었다.
본 발명의 배경기술은 한국등록특허 제10-2068107호 등에 개시되어 있다.
본 발명의 목적은 표적화된 포유 동물 미토콘드리아 DNA 게놈을 유지하고 분석하는데 매우 유용한 효모의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 유전적으로 변형된 효모주의 제조 방법이 제공된다.
1. 유전적으로 변형된 효모주의 제조 방법은 효모 미토콘드리아 전사 인자의 유전자가 포유 동물 미토콘드리아 전사 인자로 치환된 제1효모주의 세포질을 불활성화시키고; 상기 세포질이 불활성화된 제1효모주와, 포유 동물 미토콘드리아 DNA를 함유하는 이종 미토콘드리아(xenomitochondria)를 갖는 제2효모주를 스페로플라스트 융합(spheroplast fusion)시키는 단계를 포함한다.
2.1에서, 상기 효모 미토콘드리아 전사 인자는 ABF2일 수 있다.
3.1-2에서, 상기 포유 동물 미토콘드리아 전사 인자는 마우스 Tfam일 수 있다.
4.1-3에서, 상기 제1효모주, 상기 제2효모주 중 1종 이상은 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.
5.1-4에서, 상기 세포질의 불활성화는 항균성 또는 항진균성 화합물에 의해 수행될 수 있다.
6.5에서, 상기 항균성 또는 항진균성 화합물은 N-에틸말레이미드를 포함할 수 있다.
본 발명은 표적화된 포유 동물 미토콘드리아 DNA 게놈을 유지하고 분석하는데 매우 유용한 효모의 제조 방법을 제공하였다.
도 1은 마우스 Tfam이 삽입된 효모주의 작제 과정 및 효모 미토콘드리아에 마우스 Tfam의 표적화를 확인한 결과이다.
도 2는 마우스 mtDNA를 함유하는 이종 미토콘드리아를 갖는 효모주의 작제 과정 및 해당 효모주의 형성을 확인한 결과이다.
도 3은 효모주에서 마우스 mtDNA 게놈의 안정성 평가 결과이다.
도 4는 마우스 Tfam이 효모 ABF2의 상보적 기능이 있는지를 평가하기 위한 효모 균주의 작제 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 마우스 Tfam이 효모 미토콘드리아 내 효모 mtDNA를 뒷받침하는지를 평가한 결과이다.
본 명세서에서 수치 범위를 나타낼 때 "X 내지 Y"는 "X 이상 Y 이하(X≤ 그리고 ≤Y)"를 의미한다.
이하, 본 발명 일 실시예에 따른 유전자 변형된 효모주의 제조 방법을 설명한다. 구체적으로, 본 발명은 포유 동물 미토콘드리아 전사 인자(mitochondrial transcription factor, Tfam)를 발현하고 포유 동물 미토콘드리아 DNA를 함유한 이종 미토콘드리아(xenomitochondria)를 갖는 효모주를 제조하는 방법이다.
구체적으로, 본 발명은 효모 미토콘드리아 전사 인자의 유전자가 포유 동물 미토콘드리아 전사 인자로 치환된 제1효모주의 세포질을 불활성화시키고; 상기 세포질이 불활성화된 제1효모주와 포유동물 미토콘드리아 DNA를 함유하는 이종 미토콘드리아를 갖는 제2효모주를 스페로플라스트 융합시키는 단계를 포함한다.
효모 미토콘드리아 전사 인자의 유전자가 포유 동물 미토콘드리아 전사 인자로 치환된 제1효모주는 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 이때, 제1효모주는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속으로서 예를 들면 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다. 예를 들면, 제1효모주는 기탁번호: KCTC18840P(기탁 기관: 한국생명공학연구원 생명자원센터, 기탁일: 2020년 08월 27일, Saccharomyces cerevisiae 3482-16-1)의 3482-16-1 ρ0 Tfam 균주일 수 있다.
일 구체예에서, 효모 미토콘드리아 전사 인자는 ABF2 locus일 수 있다. 효모 미토콘드리아 전사 인자 중 ABF2 locus가 포유 동물 미토콘드리아 전사 인자로 치환되더라도 포유 동물 미토콘드리아 전사 인자가 ABF2 활성을 보상할 수 있음을 확인하였다.
일 구체예에서, 포유 동물 미토콘드리아 전사 인자는 마우스 미토콘드리아 전사 인자 A(Tfam)일 수 있다. 미토콘드리아 전사 인자 A(Tfam)은 효모 ABF2 locus에 삽입시 ABF2 대체 활성을 구현할 수 있다.
효모주의 세포질의 불활성화는 도 2에서 도시된 바와 같이 Donor와 Recepient 간의 접합에서 Recepient의 세포질을 재활성화시켜 Donor 내에 들어있는 포유동물 미토콘드리아 DNA가 Recepient로 들어오도록 할 수 있다.
제1효모주의 세포질을 불활성화시키는 방법은 항균성 또는 항진균성 화합물로 효모주를 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 항균성 또는 항진균성 화합물로 N-에틸말레이미드를 사용할 수 있다. N-에틸말레이미드는 효모주의 세포질을 100% 불활성화시키는 효과를 제공하였다.
세포질이 불활성화된 제1효모주와 포유동물 미토콘드리아 DNA를 함유하는 이종 미토콘드리아를 갖는 제2효모주를 스페로플라스트 융합시킴으로써, 포유 동물 미토콘드리아 전사 인자(Tfam)를 발현하고 포유 동물 미토콘드리아 DNA를 함유한 이종 미토콘드리아를 갖는 효모주를 제조할 수 있다. 포유동물 미토콘드리아 DNA를 함유하는 이종 미토콘드리아를 갖는 제2효모주는 미국공개특허 2009-0098653호 등에서 기술된 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 제2효모주는 효모 MCC109 ρ0 ABF2 균주로부터 제조된 MCC109 ρ- (rho minus) 효모 균주일 수 있다.
스페로플라스트 융합은 핵 또는 미토콘드리아 유전자 선택 마커를 사용하지 않고서도 본 발명의 효모주를 용이하게 제조하도록 할 수 있다. 포유동물 미토콘드리아 DNA를 함유하는 이종 미토콘드리아를 갖는 효모주는 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 이때, 제2효모주는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속으로서 예를 들면 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석될 수는 없다.
배지 준비
포도당을 함유하는 완전 배지(YPD; 1% 효모 추출물, 2% 펩톤 및 2% 포도당), 발효 불가능한 탄소원으로서 에탄올 및 글리세롤을 함유하는 완전 배지(YPEG; 1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 3% 에탄올 및 3% 글리세롤), 글루코스를 함유하는 합성 최소 배지(SD), 발효 불가능한 탄소원으로서 에탄올과 글리세롤을 함유하는 합성 최소 배지(SEG)를 제조하였다. 효모의 유전자 조작은 통상의 방법으로 수행하였다.
균주 및 DNA 준비
효모 균주 MCC109 ρ0(MATa, ade2-101, ura3-52, kar1-1, ρ0) 및 효모 균주 MCC124(MATa, ade2-101, ura3-52, kar1-1, ρ+, cox2-V25 mit-)는 Fox 박사(Cornell University)로부터 얻었다. 효모 균주 3482-16-1 ρ0(MATa, ura3-52, leu2-3,112, trp1-289, his3-△1, met2, Cyh R , ρ0)는 Livingston 박사(University of Minnesota)로부터 얻었다. MCC109 ρ+는 MCC109 ρ0를 AH109(MATa, trp1-901, leu2-3, ρ+) 균주와 접합시키고 반수체 MCC109 세포를 스크리닝함으로써 생성하였다. 상술된 효모 균주는 모두 Saccharomyces cerevisiae이다.
대장균 균주 DH5α λatt::pirwt를 사용하여 γ-ori-을 함유하는 플라스미드를 유지하였다. 마우스 STO 배아 섬유 아세포(CRL-1503, ATCC)로부터 마우스 세포 전장 DNA를 분리하였다.
미토콘드리아 형질전환 및 DNA 분석
효모 미토콘드리아 형질 전환은 생물학적 형질 전환 장치인 PDS-1000/He (Bio-Rad)를 사용하여 공개된 방법에 따라 수행되었다. 미토콘드리아 형질 전환 체를 스크리닝하기 위해, 마우스 mtDNA-특이적 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 수행하였다. 총 효모 DNA를 1% 아가로스 겔에서 분별하고, 완전한 마우스 mtDNA를 프로브로서 사용하여 서던 블롯팅으로 분석하였다.
마우스 Tfam 이 삽입된 효모주의 작제
도 1을 참조하여 마우스 Tfam이 삽입된 효모주를 제조하였다.
도 1의 A를 참조한다. 마우스 Tfam IMAGE 클론 1890394(Invitrogen, Carlsbad, CA)로부터 PCR에 의해 마우스 Tfam 유전자를 증폭시켰다. 이와 별개로 URA3 선택 마커 유전자를 PCR로 증폭시켰다. 증폭시킨 마우스 Tfam 유전자와 URA3 선택 마커 유전자를 재조합 PCR을 수행하여 Tfam-URA3 융합 작제물을 얻었다.
효모의 ABF2 유전자의 5'-말단과 3'-UTR 영역의 50개 및 52개 뉴클레오타이드를 상기 제조한 Tfam-URA3 융합 작제물의 5' 말단과 3' 말단에 포함시켰다. 이를 통해 동종 재조합(homologus recombination)에 의해 효모 균주의 ABF2 locus에 Tfam이 삽입되도록 하였다.
미토콘드리아 DNA(mtDNA)가 없는 효모 균주 3482-16-1 ρ0를 상기 제조한 Tfam-URA3 융합 작제물로 형질 전환시켜, 효모 균주 3482-16-1 ρ0의 ABF2 locus에 Tfam-URA3을 삽입하였다.
그런 다음, 우라실이 없고 포도당을 함유하는 최소 합성 배지(SD/Ura-)에서 배양시켜 우라실 제거 배지에서 성장하는 형질 전환체(Ura+ transformant)를 선택하였다. 그런 다음, YPD 배지에서 2일 동안 배양하고, 5-FOA(5-fluoroorotic acid)를 함유하는 합성 완전 배지에서 스프레딩하여 효모 균주 중 URA3 선택 마커를 제거함으로써 ABF2 locus에 마우스 Tfam이 삽입된 효모주인, 3482-16-1 ρ0 Tfam 균주(기탁 기관: 한국생명공학연구원 생명자원센터, 기탁 번호: KCTC18840P, 기탁일: 2020년 08월 27일, Saccharomyces cerevisiae 3482-16-1)를 제조하였다.
효모 균주 3482-16-1 ρ0 중 ABF2의 결실은 ABF2 internal (5'-GATAAATGGCAATCCTTGGATC-3', 서열번호 1) 및 ABF2assay 3'(5'-GGTGAGGACGAGTTATGGTG-3', 서열번호 2) 프라이머를 사용하여 PCR로 확인하였다. 효모 균주 3482-16-1 ρ0 중 Tfam 삽입은 전체 효모 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 확인하였다. 이때, Tfam forward 프라이머(서열번호 3: 5'-CTTTCCACGAATCTTCTAAGCCCCTTTTCAATTTGGCTAGCACCTTGTTG TCCAGCATGGGTAGCTAT-3'(ABF2 5'homology 선도 펩타이드는 밑줄, 선도 서열 뒤의 Tfam 펩타이드는 이탤릭체로 표시함)) 및 Tfam reverse 프라이머(서열번호 4: 5'-GAGTACCGCGGTCTAGTTGAGAGGTTAATGCTCAGAGATGTCTCC-3'(Tfam과 URA3를 연결하기 위한 재조합 PCR의 수행을 위해 디자인한 프라이머로서 URA3 homology는 밑줄, 3' end Tfam은 이탤릭체로 표시함) 또는 Tfam forward 프라이머(서열번호 3) 및 ABF2assay3' 프라이머(서열번호 5: 5'-GGTGAGGACGAGTTATGGTG-3')를 사용하였다.
도 1의 B를 참조하여 효모 미토콘드리아에서 마우스 Tfam의 표적화를 확인하였다.
Abf2 리더 서열(leader sequence)(ABF2L)-Tfam-GFP 융합 단백질을 발현하는 작제물을 생성하기 위해 재조합 PCR을 수행하였다. 이 PCR 작제물이 효모 균주 3482-16-1 ρ0 세포로 형질 전환되었을 때, Tfam-GFP 단백질이 이들 세포에서 명확하게 발현된다. 이러한 경우 세포의 주변부 근처에 위치한 점상형 형광 패턴을 나타내며, 이는 Abf2p-GFP를 발현할 때 보이는 전형적인 전형적인 형태학적 형광과 유사한 패턴을 나타내었다. 구두점 형광 패턴은 mitotracker로 염색하여 얻은 패턴과 밀접하게 일치하였다. 이것은 마우스 Tfam 단백질이 효모 균주 3482-16-1 ρ0 세포에서 미토콘드리아에 효율적이고 정확하게 표적화될 수 있음을 나타낸다.
마우스 Tfam 을 발현하며, 마우스 미토콘드리아 DNA를 함유한 이종 미토콘드리아를 갖는 효모주의 제조
도 2의 A를 참조하여 마우스 미토콘드리아 DNA를 함유하는 이종 미토콘드리아를 갖는 효모주를 제조하였다.
위에서 제조한 마우스 Tfam이 삽입된 효모주 3482-16-1 ρ0 Tfam 균주를 YPD 액체 배지 내에서 배양하고, 원심 분리에 의해 포집한 다음, 2배 부피의 환원 용액(reducing solution)(0.02M EDTA, 0.02M Tris-HCl(pH 8.0), 0.1M β-mercaptoethanol, 0.7 M KCl)으로 35℃에서 15분 동안 전처리하여 세포벽 내 이황화 결합을 제거하였다. 그런 다음 0.7M KCl 중 lyticase(1mg/ml)로 35℃에서 30분 동안 처리하여, 스페로플라스트를 형성하였다. 얻은 스페로플라스트를 EMI(N-에틸말레이미드)(0.7M KCl 중 50㎍/ml)로 1시간 동안 실온에서 처리하였으며 0.7M KCl로 세척 및 원심 분리를 반복하였다. 이를 통해 도 2의 오른쪽 Receipient(Tfam, ρ0)를 얻었다.
마우스 mtDNA Donor(공여자) 효모 균주는 MCC109 ρ- (rho minus) 효모 균주로서 이 균주의 스페로플라스트를 Donor(도 2A의 왼쪽 Donor (ABF2, ρ-) 균주이며 도 2B와 도2C의 레인 2 분석에 사용한 균주)로 사용하였다. 이것은 마우스 mtDNA를 함유하는 이종 미토콘드리아를 갖는다. 효모 MCC109 ρ0 ABF2 균주는 Cornell University의 Dr. Thomas D. Fox의 실험실에서 분양받아 사용했다.
도 2A의 왼쪽 Donor 효모 균주 MCC109 ABF2 ρ- (자신의 미토콘드리아에 마우스 mtDNA를 지님)를 YPD 액체 배지 내에서 배양하고, 원심 분리에 의해 포집한 다음, 2배 부피의 환원 용액(reducing solution)(0.02M EDTA, 0.02M Tris-HCl(pH 8.0), 0.1M β-mercaptoethanol, 0.7 M KCl)으로 35℃에서 15분 동안 전처리하여 세포벽 내 이황화 결합을 제거하였다. 그런 다음 0.7M KCl 중 lyticase(1mg/ml)로 35℃에서 30분 동안 처리하여, 스페로플라스트를 형성하였다.
상기와 같은 방법으로 제조한 도 2A의 오른쪽 Receipient(3482-16-1 ρ0 Tfam) (Tfam, ρ0)의 스페로플라스트와, 상기 제조한 도 2A의 왼쪽 Donor (ABF2, ρ-)의 스페로플라스트 각각 108개를 준비하고, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액(20% PEG 6000, 0.1M CaCl2) 2ml로 30분 동안 실온에서 처리하였다. 원심 분리에 의해 PEG 용액을 제거한 후에 얻은 스페로플라스트를 0.3M CaCl2에서 희석시키고, 0.4M CaCl2를 함유하는 2% 탑 아가에서 45℃에서 함침시켰다. 얻은 혼합물을 최소 선택 배지를 사용하여 선택함으로써 마우스 Tfam을 발현하며, 마우스 mtDNA를 함유한 이종 미토콘드리아를 갖는 효모주를 얻었다.
도 2의 B, 도 2의 C를 참조하여, 마우스 Tfam을 발현하며, 마우스 미토콘드리아 DNA를 함유한 이종 미토콘드리아를 갖는 효모주가 제대로 형성되었는지 여부를 평가하였다.
Donor 스페로플라스트(ura3 - /TRP1 + )는 합성 우라실 결핍 선별 배지에서 성장할 수 없지만, Recepient 스페로플라스트(URA3 + /trp1 - )는 이 배지에서 생존 할 수 있다. 화학적으로 불활성화된 Recepient 스페로플라스트는 스페 로플라스트 융합을 통해 Donor 스페로플라스트로부터의 기능성 세포질에 의해서만 재활성화될 수 있다(도 2의 A를 참조). 이 스페로플라스트 융합 방법을 사용하면 Donor 스페로플라스트가 kar1-1 돌연변이를 가지고 있기 때문에 반수체와 이배체 세포를 얻을 수 있다.
합성 우라실- 및 트립토판-결핍 선택 배지에서 융합된 세포들을 처리함으로써, 상기 두개의 선택 배지에서 성장할 수 있는 이배체 세포를 제거할 수 있다. 그런 다음, 합성 우라실-결핍 선택 배지에서만 성장할 수 있는 반수체 Tfam 균주만을 분리할 수 있다.
도 2의 B는 완전한 마우스 mtDNA 게놈이 wild type MCC109 Donor 세포 (레인 2) 및 wild type 3482-16-1 ABF2 Recipient 균주(레인 7 및 8)에서와 같이 3482-16-1 Tfam Recipient 균주 (레인 4 및 5)에서도 안정적으로 유지됨을 보여준다.
PCR 분석에 의해, Tfam 유전자 삽입(도 2의 C, Tfam 패널, 레인 3-5) 및 효모 ABF2 유전자 결실(도 2의 C, ABF2 패널, 레인 3-5)을 확인하였다. ABF2 Recipient 균주는 ABF2 야생형 유전자만을 함유하고 있다(도 2의 C, ABF2 패널, 레인 6-8).
마우스 mtDNA 게놈을 함유하는 이종 미토콘드리아를 abf2△ 돌연변이 효모에 상술한 스페로플라스트 융합 방법을 사용하여 시도하였다. 그러나, ABF2가 결실된 경우 이종 미토콘드리아가 효모 내에 도입되지 않았다.
이에 기초할 때, 마우스 mtDNA 게놈을 함유하는 효모 미토콘드리아는 Tfam 효모 균주로 전달될 수 있고, 전달된 포유류 mtDNA 게놈은 마우스 Tfam 단백질의 미토콘드리아 게놈 유지 활성에 의해 효모 미토콘드리아에서 유지될 수 있음을 알 수 있다.
마우스 Tfam 을 발현하며, 마우스 미토콘드리아 DNA를 함유한 이종 미토콘드리아를 갖는 효모주에서 마우스 미토콘드리아 게놈의 안정성 평가
전달된 마우스 mtDNA 게놈이 야생형 ABF2 Donor 균주뿐만 아니라 Tfam 균주에서 안정적으로 유지되는지 여부를 평가하였다.
마우스 mtDNA 게놈을 함유하는 각각의 균주로부터의 효모 콜로니를 YPD 배지에 접종하였다. 이들 배양물을 30℃에서 진탕 배양기에서 밤새 성장시켰다. 다음날, 얻은 배양물 중 100분의 1을 고체 YPD 플레이트에 펼치고 콜로니가 형성 될 때까지 배양하고, 마우스 mtDNA 게놈을 보유한 콜로니의 수를 세었다. 남은 배양물 중 100분의 1을 다시 취하여 새로운 YPD 배지로 다시 접종하고 밤새 배양하였다. 이러한 연속 희석 및 배양은 연속 4 일 동안 반복되었고, 마우스 mtDNA 게놈은 각 시점(1, 2, 3 및 4 일)에 마우스 mtDNA- 특이적 프라이머를 사용하여 PCR로 분석하였다. 마우스 mtDNA 게놈을 함유하는 효모 세포의 평균 백분율을 도 3에 나타내었다.
도 3의 흑색 막대와 백색 막대를 참조하면, 야생형 ABF2 Donor 및 ABF2 Recepient 균주(각각 도 3에서 흑색 및 백색 막대)에는 마우스 mtDNA가 이러한 효모 미토콘드리아 환경에서 안정적으로 유지됨을 확인하였다. 그러나, Tfam 균주(도 3의 회색 막대)에서는 마우스 mtDNA 게놈을 함유하는 효모 집단의 백분율이 야생형 효모 균주에 비해 상대적으로 낮음을 확인하였다. 그러나, 미토콘드리아에서 마우스 mtDNA를 유지하는 Tfam 균주는 본 실험 조건 하에서 많은 세대 동안 일정한 비율(15~25%)로 마우스 mtDNA를 유지하여 비교적 안정적이었음을 확인하였다.
마우스 Tfam이 효모 ABF2와 상보적 기능이 있는지 여부를 평가
마우스 Tfam이 효모 ABF2 활성을 대체할 수 있는지 여부를 평가하였다.
이를 위해, 도 4의 A를 참조하면, 효모 3482-16-1 r0 균주에서 ABF2 자리에 마우스 Tfam이 삽입되어 있고, 더불어 효모 미토콘드리아 DNA를 함유하는 효모 균주를 제조하였다. Donor로서 ABF2와 효모 mtDNA를 갖는 wild type의 효모 균주인 MCC109 ρ+와 Recepient로서 효모 mtDNA는 없으나 ABF2 자리에 마우스 Tfam이 삽입된 3482-16-1 Tfam r0 균주를 접합시켜 마우스 Tfam과 효모 mtDNA를 유지하는 반수체 세포를 제조하였다.
도 4의 B, 도 4의 C를 참조하면, 상술 접합에 의해 마우스 Tfam이 효모 ABF2에 삽입되었음을 확인할 수 있다. 도 4의 B의 abf2 제거 균주(abf2D)는 효모 mtDNA의 손실로 인해 활성화된 미토콘드리아 기능이 저해되고 이로 인해 성장을 위한 탄소원으로서 에탄올과 글리세롤을 사용할 수 없으므로 합성 우라실-결핍 에탄올 글리세롤 선택 배지(SEG/Ura-)에서 성장할 수 없었다. 반면에 도 4의 B의 Recepient Tfam r+ 균주는 합성 우라실-결핍 에탄올 글리세롤 선택 배지에서 성장할 수 있었는데, 이는 마우스 Tfam 단백질이 효모 mtDNA를 유지하는 활성을 제공하므로 이를 통해 세포가 활성화된 미토콘드리아 기능을 유지할 수 있기 때문이다.
마우스 Tfam 단백질이 효모 미토콘드리아에서 효모 mtDNA의 유지를 어떻게 지원하는지를 결정하기 위해, MCC109 ρ+ Tfam 세포를 생성하였다; 이 세포들은 ade 돌연변이를 지니고 있으므로 활성화된 미토콘드리아 기능이 있을 때 즉, 효모 mtDNA를 유지하고 있을 때는 적색 콜로니를 생성하지만 미토콘드리아 기능이 상실되면 즉, 효모 mtDNA를 손실했을 때는 백색 콜로니를 생성한다.
MCC109 ρ+ wild type 및 MCC109 ρ+ Tfam 세포를 발효 불가능한 탄소원인 에탄올과 글리세롤(SEG)을 함유하는 합성 최소 배지에서 성장시킨 다음, 포도당을 함유하는 완전 배지(YPD)로 옮겨 성장시켰다. MCC109 ρ+ Tfam 세포(도 5의 B)에 의해 나타난 적색 콜로니가 급격히 사라져서 흰색으로 바뀌었다(도 5의 D). MCC109 ρ+ wild type 세포는 양쪽 성장 배지에서 적색 콜로니를 유지하였다(도 5의 A 및 C). 붉은 콜로니(도 5의 B)와 함께 이 흰색 콜로니(도 5의 D)를 SEG 배지에 스트리킹했을 때, 흰색 콜로니는 자라지 못했지만, 붉은 콜로니는 이 배지에서 생존하였다(데이터는 나타내지 않음). 이는 포도당을 함유하는 비 선택적 완전 배지에서 세포를 성장시킬 때, Tfam 균주에서의 미토콘드리아 기능은 효모 Abf2p 야생형 균주보다 높은 속도로 손실됨을 의미한다(도 5의 C 및 D). 그러나, 미토콘드리아의 기능을 필요로하는 에탄올과 글리세롤 선택 배지에서는 마우스 Tfam 단백질이 효모 Abf2p 단백질의 기능을 보상하여 활성화된 미토콘드리아 기능을 유지할 수 있음을 의미하기도 한다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
<110> Jungwon IACF <120> METHOD FOR PREPARING GENETICALLY MODIFIED YEAST <130> 25078 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABF2 internal primer <400> 1 gataaatggc aatccttgga tc 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABF2 assay primer <400> 2 ggtgaggacg agttatggtg 20 <210> 3 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tfam forward primer <400> 3 ctttccacga atcttctaag ccccttttca atttggctag caccttgttg tccagcatgg 60 gtagctat 68 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tfam reverse primer <400> 4 gagtaccgcg gtctagttga gaggttaatg ctcagagatg tctcc 45 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABF2assay3' primer <400> 5 ggtgaggacg agttatggtg 20

Claims (6)

  1. 효모 미토콘드리아 전사 인자의 유전자가 포유 동물 미토콘드리아 전사 인자로 치환된 제1효모주의 세포질을 불활성화시키고,
    상기 세포질이 불활성화된 제1효모주와, 포유 동물 미토콘드리아 DNA를 함유하는 이종 미토콘드리아(xenomitochondria)를 갖는 제2효모주를 스페로플라스트 융합(spheroplast fusion)시키는 단계를 포함하며,
    상기 효모 미토콘드리아 전사 인자는 ABF2이고,
    상기 포유 동물 미토콘드리아 전사 인자는 3482-16-1 ρ0 Tfam 균주(기탁 기관: 한국생명공학연구원 생명자원센터, 기탁 번호: KCTC18840P, 기탁일: 2020년 08월 27일, Saccharomyces cerevisiae 3482-16-1)에 삽입되어 있는 마우스의 미토콘드리아 전사 인자인 Tfam이고,
    상기 포유동물 미토콘드리아 DNA는 마우스의 미토콘드리아 DNA인 것인,
    유전적으로 변형된 효모주의 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1효모주, 상기 제2효모주 중 적어도 1종 이상은 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)인 것인, 유전적으로 변형된 효모주의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포질의 불활성화는 항균성 또는 항진균성 화합물에 의해 수행되는 것인, 유전적으로 변형된 효모주의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항균성 또는 항진균성 화합물은 N-에틸말레이미드인 것인, 유전적으로 변형된 효모주의 제조 방법.

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