JP5131457B2 - 酵母宿主、形質転換体および異種タンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
酵母のうちでも、特にS.pombeは、進化過程で他の酵母とは早い時期に分かれ、別の進化をとげた結果、出芽ではなく分裂という手段で増殖することからもわかるように、動物細胞に近い性質を持つことが知られている。このため異種タンパク質を発現する宿主としてS.pombeを用いることによって、動物細胞の場合と同様の、より天然体に近い遺伝子産物が得られることが期待される。
2.標的遺伝子が、psp3(SPAC1006.01)、sxa2(SPAC1296.03c)、ppp51(SPAC22G7.01c)およびppp52(SPBC18A7.01)からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子である、請求項1に記載の構築方法。
3.遺伝子組換え法により導入した外来遺伝子を発現させるためのシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)からなる改良宿主を構築する方法において、メタロプロテアーゼをコードする遺伝子(メタロプロテアーゼ遺伝子群)、セリンプロテアーゼをコードする遺伝子(セリンプロテアーゼ遺伝子群)、システインプロテアーゼをコードする遺伝子(システインプロテアーゼ遺伝子群)およびアスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子(アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群)からなる群から選ばれる2種以上の遺伝子を標的として当該2種以上の遺伝子を削除または不活性化する、シゾサッカロミセス・ポンベ宿主の構築方法。
4.2種以上の遺伝子が、メタロプロテアーゼ遺伝子群から選ばれる1種以上の遺伝子とセリンプロテアーゼ遺伝子群から選ばれる2種以上の遺伝子の合計3種以上の遺伝子である、前項3に記載の構築方法。
5.2種以上の遺伝子が、cdb4(SPAC23H4.09)、ppp22(SPBC14C8.03)およびppp53(SPAP14E8.04)からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子と、isp6(SPAC4A8.04)、ppp16(SPBC1711.12)、psp3(SPAC1006.01)およびsxa2(SPAC1296.03c)からなる群から選ばれる2種以上の遺伝子の合計3種以上の遺伝子である、前項3または4に記載の構築方法。
6.前記遺伝子のORF(オープンリーディングフレーム)部分をマーカー遺伝子に置換して当該遺伝子を削除または不活性化する、前項1〜5のいずれかに記載の構築方法。
7.遺伝子組換え法により導入した外来遺伝子を発現させるためのシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)からなる改良宿主であって、psp3(SPAC1006.01)、sxa2(SPAC1296.03c)、ppp51(SPAC22G7.01c)およびppp52(SPBC18A7.01)からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子が削除または不活性化されている、シゾサッカロミセス・ポンベ宿主。
8.遺伝子組換え法により導入した外来遺伝子を発現させるためのシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)からなる改良宿主であって、メタロプロテアーゼをコードする遺伝子(メタロプロテアーゼ遺伝子群)、セリンプロテアーゼをコードする遺伝子(セリンプロテアーゼ遺伝子群)、システインプロテアーゼをコードする遺伝子(システインプロテアーゼ遺伝子群)およびアスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子(アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群)からなる群から選ばれる2種以上の遺伝子が削除または不活性化されている、シゾサッカロミセス・ポンベ宿主。
9.2種以上の遺伝子が、メタロプロテアーゼ遺伝子群から選ばれる1種以上の遺伝子とセリンプロテアーゼ遺伝子群から選ばれる2種以上の遺伝子の合計3種以上の遺伝子である、前項8に記載の宿主。
10.2種以上の遺伝子が、cdb4(SPAC23H4.09)、ppp22(SPBC14C8.03)およびppp53(SPAP14E8.04)からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子と、isp6(SPAC4A8.04)、ppp16(SPBC1711.12)、psp3(SPAC1006.01)およびsxa2(SPAC1296.03c)からなる群から選ばれる2種以上の遺伝子の合計3種以上の遺伝子である、前項8または9に記載の宿主。
11.前項7〜10のいずれかに記載の宿主に、異種タンパク質をコードする遺伝子を導入してなる形質転換体。
12.異種タンパク質をコードする遺伝子とともに分泌シグナル遺伝子を導入してなる、前項11に記載の形質転換体。
13.前項11または12に記載の形質転換体を培養して異種タンパク質を生産し採取することを特徴とする異種タンパク質の製造方法。
14.前項12に記載の形質転換体を培養し、異種タンパク質を生産し該異種タンパク質を培養液に分泌させ、該培養液から該異種タンパク質を採取することを特徴とする異種タンパク質の製造方法。
15.異種タンパク質がヒト成長ホルモン(hGH)である、請求項13または14の製造方法。
本発明においては、異種タンパク質の生産に不要または有害なゲノム部分として、セリンプロテアーゼ遺伝子群、アミノペプチダーゼ遺伝子群、カルボキシペプチダーゼ遺伝子群およびジペプチダーゼ遺伝子群の4群のプロテアーゼ関連遺伝子群から選ばれる1種以上のプロテアーゼ関連遺伝子を標的として当該1種以上の遺伝子を削除または不活性化して形質転換体の異種タンパク質の生産効率を向上させることに成功した。本発明において改良された酵母宿主は、上記4群のプロテアーゼ関連遺伝子群から選ばれる1種以上の遺伝子が削除または不活性化してなるものであり、さらにこの遺伝子以外の遺伝子の一部がさらに削除または不活性化されていてもよい。
上記4群のプロテアーゼ関連遺伝子群から選ばれる標的遺伝子としては、該S.pombeにおいてプロテアーゼまたはプロテアーゼと推定されるタンパク質をコードする遺伝子である、psp3(SPAC1006.01)、sxa2(SPAC1296.03c)、ppp51(SPAC22G7.01c)およびppp52(SPBC18A7.01)からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子が好ましい。なお、psp3(SPAC1006.01)およびsxa2(SPAC1296.03c)はセリンプロテアーゼ遺伝子群の遺伝子である。また、ppp51(SPAC22G7.01c)およびppp52(SPBC18A7.01)はアミノペプチダーゼと推定されるタンパク質をコードする遺伝子(アミノペプチダーゼ遺伝子群の遺伝子)であり、これらはまた下記メタロプロテアーゼ遺伝子(金属イオンを含むプロテアーゼの遺伝子)の1種でもある。
以下、上記4群のプロテアーゼ関連遺伝子群から選ばれる2種以上の遺伝子を削除または不活性化する本発明の構築方法、および同2種以上の遺伝子を削除または不活性化された本発明の宿主について説明する。前記1種以上の遺伝子の削除または不活性化の場合もこれと同様に実施できる。
メタロプロテアーゼ遺伝子群:cdb4(SPAC23H4.09)、mas2(SPBC18E5.12c)、pgp1(SPCC1259.10)、ppp20(SPAC4F10.02)、ppp22(SPBC14C8.03)、ppp51(SPAC22G7.01c)、ppp52(SPBC18A7.01)、ppp53(SPAP14E8.04)。
セリンプロテアーゼ遺伝子群:isp6(SPAC4A8.04)、ppp16(SPBC1711.12)、psp3(SPAC1006.01)、sxa2(SPAC1296.03c)。
システインプロテアーゼ遺伝子群:ppp80(SPAC19B12.08)、pca1(SPCC1840.04)、cut1(SPCC5E4.04)、gpi8(SPCC11E10.02c)。
アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群:sxa1(SPAC26A3.01)、yps1(SPCC1795.09)、ppp81(SPAC25B8.17)。
標的として好ましいメタロプロテアーゼ遺伝子群の遺伝子は、cdb4(SPAC23H4.09)、pgp1(SPCC1259.10)、ppp20(SPAC4F10.02)、ppp22(SPBC14C8.03)、ppp52(SPBC18A7.01)、ppp53(SPAP14E8.04)であり、そのうちでもcdb4(SPAC23H4.09)、ppp22(SPBC14C8.03)、ppp53(SPAP14E8.04)がより好ましい。
標的として好ましいセリンプロテアーゼ遺伝子群の遺伝子は、isp6(SPAC4A8.04)、ppp16(SPBC1711.12)、psp3(SPAC1006.01)、sxa2(SPAC1296.03c)である。
他の遺伝子群の遺伝子としては、ppp80(SPAC19B12.08)が好ましい。
より具体的な標的遺伝子の組合せとしては、cdb4(SPAC23H4.09)、ppp22(SPBC14C8.03)およびppp53(SPAP14E8.04)からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子と、isp6(SPAC4A8.04)、ppp16(SPBC1711.12)、psp3(SPAC1006.01)およびsxa2(SPAC1296.03c)からなる群から選ばれる2種以上の遺伝子の合計3種以上の遺伝子の組合せが好ましい。より好ましくは、ppp53(SPAP14E8.04)およびcdb4(SPAC23H4.09)からなる群から選ばれる少なくとも1種の遺伝子およびisp6(SPAC4A8.04)とpsp3(SPAC1006.01)とを含む合計3種以上の遺伝子の組合せである。例えば、psp3(SPAC1006.01)、isp6(SPAC4A8.04)、ppp53(SPAP14E8.04)の少なくとも3種が好ましい(後記表3参照)。
さらに好ましくは、ppp53(SPAP14E8.04)、isp6(SPAC4A8.04)、psp3(SPAC1006.01)およびppp16(SPBC1711.12)を含む4種以上の遺伝子の組合せであり、さらにはppp53(SPAP14E8.04)、isp6(SPAC4A8.04)、psp3(SPAC1006.01)、ppp16(SPBC1711.12)およびppp22(SPBC14C8.03)を含む5種以上の遺伝子の組合せが好ましい。さらに6種以上の遺伝子を標的とする場合は、これら5種の遺伝子にさらにsxa2(SPAC1296.03c)を組合せることが好ましい(後記表3参照)。
破壊する遺伝子の種類の数の上限は、本発明の目的が達せられる限り特に限定されない。しかし、あまりに多種類の遺伝子を破壊すると増殖速度が低下しすぎるなどの好ましくない影響が生じやすい。本発明における遺伝子破壊宿主の相対増殖速度(遺伝子を破壊する前のS.pombe菌株に比較した増殖速度)は0.6以上が好ましく、特に0.8以上が好ましい。また、破壊されても増殖速度低下に影響が少ない遺伝子であっても、それが破壊されたことにより外来遺伝子の発現効率向上の効果が少ない遺伝子もあると考えられる。このような遺伝子は本発明において破壊する意義が少ない。このような理由により、通常、破壊される遺伝子の種類の数の上限は20種類以下が適当であると推定され、10種類以下が好ましい。
以下において、パーセント(%)は、断らない限りいずれも質量%を表わす。
全てのS.pombe菌株はARC001(h-leu1-32)およびARC010(h-leu1-32ura4-D18)由来のものを用いた。形質転換は、酢酸リチウム形質転換方法(Okazaki K et al. 1990. Nucleic Acids Res 18: 6485-6489.)を用いて行なった。形質転換混合物をMMA(アガー添加最小培地、Qbiogene社製)またはMMA+Leu(ロイシン添加) へプレーティングし、32℃にて3〜4日間インキュベートした。培養物をYES培地[サプリメント添加酵母抽出物、0.5%Bactoyeast extract(Becton、Dickinson and Company社製)、3%グルコース及びSPサプリメント(Qbiogene社製)を含有]、YPD培地[1%Bactoyeast extract、2%Bacto peptone(Becton、Dickinson and Company社製)及び2% グルコース]、SDC-UraおよびSDC-Ura-Lue培地(ウラシル又はウラシル及びロイシンの両方を欠乏する合成デキストロース完全培地、Qbiogene社製)にて培養した。
組換えDNAはSambrookらの方法(Sambrook J et al. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nded. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor)を用いて作製した。制限酵素及びDNA修飾酵素はタカラバイオ社製、TOYOBO(東洋紡績)社製、ニッポンジーン社製またはロシュダイアグノスティックス社製のものを使用した。PCR増幅による遺伝子破壊断片は、KOD Dash DNAポリメラーゼ(TOYOBO社製)を使用して調製した。全ての酵素は製造元のプロトコールに従い使用した。プラスミドはEscherichiacoli strain DH5(TOYOBO社製)を使用して調製した。DNAシーケンシングはDNA sequencerABI Prism 3100 genetic analyzer(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて行なった。酵母ゲノムDNAはDNeasy genomic DNA purification kit(キアゲン社製)を用いて調製した。
染色体の配列データ(Wood et al., 2002, http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_pombe/)及びS.pombe Gene DB (http://www.genedb.org/genedb/pombe/)における記述により、62個の遺伝子をS.pombe推定プロテアーゼ(S.pombe putative proteases、ppp)としてリスト化した。表1にS.pombeの既知および推定プロテアーゼのリストを示す。リスト化されたプロテアーゼ遺伝子のORF(オープンリーディングフレーム)を、ura4遺伝子カセットを選択マーカーとして用いるPCR媒介相同組換え法(Bahler J et al. 1998. Yeast 14: 943-951.)により破壊した。すなわち、200〜300bpの各標的ORFに対する5´および3´のフランキング配列を、適切な遺伝子間アダプターペアを用いた2回のPCRによりS.pombe親株ARC001の染色体DNAから増幅した。該遺伝子間アダプターペアは5´及び3´末端が各々融合するように設計した。さらなる融合伸長PCRを行うことにより、ura4遺伝子カセットを二つの調製された融合PCR産物の間に挟んで連結させて、プロテアーゼ遺伝子を破壊するためのベクター(以下、遺伝子破壊ベクターという)を作製した。
上記方法で得られたプロテアーゼ遺伝子が破壊されたS.pombe菌株の細胞増殖速度を測定した。バイオフォトレコーダー(アドバンテック東洋社製、TN-1506)を用いてS.pombe株の増殖曲線を得た。細胞は、L字型試験管において5mlのYES培地中で32℃にて振とう培養した。660nmの吸光度において細胞の濁度を5分毎に測定した。52個のプロテアーゼ破壊株の各最大比増殖速度(μmax)を測定した。ARC001株で測定されたμmax値(0.26-0.30/時間)を基準として、これらの相対μmax値を算出した。図1に、プロテアーゼ遺伝子が破壊された株の相対的な最大比増殖速度を示す。
r-hGHを分泌発現するためのマルチカセットベクターを作製し、r-hGHを産生する形質転換体ARC001(hGH)を構築した。高発現するS.pombe遺伝子であるadh、tpi及びgdp1のORF配列により、S.pombeでの翻訳に好ましい(高バイアス)コドン表を用い、594bpのhGH-ORFを人工的に合成した(Gene. Art社製)。制限酵素AflII及びBamHIを用いて融合ベクターpXL4(Isoai et al., 2002 Biotechnol Bioeng 80: 22-32.)から、合成hGH遺伝子を下流のP3分泌シグナル(WO96/023890参照)と共にフレームに融合させた。そして、文献(Ikeda et al., 2004 J. Biosci Bioeng98: 366-373)の方法で、図2に示したタンデムな8個のhGH発現カセット(hCMV-プロモーター/P3-シグナル/hGH-ORF/ターミネーター)から構成される、マルチカセット発現ベクターpTL2P3hGHhb(M5)-8XLを構築した。該マルチカセット発現ベクターおいて、タンデムな8個のhGH発現カセットを、上記方法により得られたプロテアーゼ遺伝子を削除したS.pombe株のleu1遺伝子座に挿入し、形質転換した。SDC-Leu-Ura培地にて2〜3日間培養することによりロイシン非要求性の株を取得し、再びYPD培地(24ウェルプレート)に移し32℃にて振とうしながらインキュベートした後、r-hGH分泌を確認した。
上記方法により得られた形質転換体ARC001(hGH)におけるr-hGHの分泌及び分解を確認した。該形質転換体をガラス管又は24ウェルプレート中のYPD培地に32℃にて振とうしながら培養した後、様々な培養時間において0.5〜1.0mlの培養培地を回収した。その後、培養上清をTCA(終濃度10%トリクロロ酢酸)で沈殿させた後に一連のSDS-PAGE分析を行なった。標準的なSDS-PAGEは、還元性条件下で18%ポリアクリルアミドゲル(テフコ社製)を用いて行なった。ゲルをCBB染色してhGH検出した。ヒト下垂体由来の天然hGH(バイオジェネシス社製)をコントロールとして用いた。4つのクローンのうち1つの陽性クローンを選択し、-80℃にて25%グリセロールで保存した。
上記方法により得られた形質転換体の培養培地に各種プロテアーゼ阻害剤を添加して、r-hGH分解性の細胞外プロテアーゼのスクリーニングを行なった。r-hGH産生S.pombe株ARC001[pTL2P3hGHhp(M5)-8XL]を、20mlのYPD培地で32℃にて24時間2次培養した。そして、24時間培養した細胞を含む培地を新しい24ウェルプレートに移し(1.0ml/ウェル)、一連のプロテアーゼ阻害剤を用いて細胞外のプロテアーゼ活性をスクリーニングした。培養上清の一部をこの時点で-20℃にて陽性コントロールとして保存した。その他の細胞は、一連のプロテアーゼ阻害剤を各ウェルに別々に添加した後、さらに32℃にて2日間振とう培養した。プロテアーゼ阻害剤セット(ロシュダイアグノスティックス社製)に含まれる10種のプロテアーゼ阻害剤をそれぞれ規定量各ウェルに別々に添加した。ネガティブコントロールのウェルには阻害剤を全く添加しなかった。各ウェルについて0.5mlのYPD培養上清を培養時間72及び96時間において回収し、TCA(10%w/v)沈殿により濃縮した後、SDS-PAGEにより分析した。
上記方法で得られた形質転換体ARC001(hGH)におけるr-hGHの分泌レベルの経時変化を分析した。プロテアーゼ遺伝子が破壊された株およびARC001をhGH発現ベクターで形質転換した株について0.5mlのYPD培養上清を培養時間72及び96時間において回収し、該培養上清をTCAにより濃縮し、SDS-PAGEにより解析した。SDS-PAGEは、還元条件下にて18%のポリアクリルアミドゲルで行い、クマシーブリリアントブルーG-250で染色した。各株をその削除したプロテアーゼ遺伝子名により示す:分子量マーカーとしてBench Mark prestained protein ladder(インビトロジェン社製)を用いた。図4に、その結果を示す。
実施例1、2(非特許文献1)における記述により、S.pombeプロテアーゼ関連遺伝子の単独破壊によって作製された52種類のプロテアーゼ関連遺伝子単独破壊株の中から選抜された、表2に示す13個を、多重破壊候補のプロテアーゼ関連遺伝子とした。表2にリスト化されたプロテアーゼ関連遺伝子のORF(オープンリーディングフレーム)を、ura4遺伝子カセットを選択マーカーとして用いるPCR媒介相同組換え法(非特許文献1)により破壊した。すなわち、200〜300bpの各標的ORFに対する5´および3´のフランキング配列を、適切な遺伝子間アダプターペアを用いた2回のPCRによりS.pombe親株ARC001の染色体DNAから増幅した。該遺伝子間アダプターペアは5´及び3´末端が各々融合するように設計した。
さらなる融合伸長PCRを行うことにより、ura4遺伝子カセットを二つの調製された融合PCR産物の間に挟んで連結させて、プロテアーゼ関連遺伝子を破壊するための遺伝子破壊ベクターを作製した。
上記方法で得られたプロテアーゼ関連遺伝子が破壊されたS.pombe菌株の細胞増殖速度を測定した。バイオフォトレコーダー(アドバンテック東洋社製、TN-1506)を用いてS.pombe株の増殖曲線を得た。細胞は、L字型試験管において5mlのYES培地中で32℃にて振とう培養した。660nmの吸光度において細胞の濁度を5分毎に測定した。17個のプロテアーゼ多重破壊株の各最大比増殖速度(μmax)を測定した。ARC001株で測定されたμmax値(0.26-0.30/時間)を基準として、これらの相対μmax値を算出した。
図5に、プロテアーゼ関連遺伝子が破壊された株の相対的な最大比増殖速度を示す。ARC001株(A0と示されている)のμmax測定値(0.30±0.02/h)を標準値として、各菌株のμmax測定値からそれぞれの相対μmax値を算出した。グラフの縦軸は相対μmax値を、横軸は菌株名略称(前記表3にその詳細を示した)を示す。
実施例1、2(非特許文献1)では、ヒト成長ホルモン(以下hGHと記載する)を用いたプロテアーゼ単独破壊株の有効性評価手法すなわちhGHを生産する形質転換体ARC001(hGH)の構築ならびに形質転換体ARC001(hGH)より分泌されたhGHの検出による手法、ならびにそのタンパク質の分泌型異種生産モデルとしての有効性を記載した。本実施例4においても、hGHを同じく分泌型異種タンパク質のモデルとして採用し、プロテアーゼ多重破壊株の有効性評価を行った。その実験では、各株によるhGHの分泌生産能力から、プロテアーゼ関連遺伝子の多重破壊の生産物分解に与える抑制効果を調べた。hGHをプロテアーゼ多重破壊株で発現させるために、実施例2(非特許文献1)に記載の染色体組込型hGH構成分泌発現ベクターpTL2P3hGHhb(M5)-8XLを用いて、酢酸リチウム法によって各株の形質転換を行った。6個の形質転換体の中から、hGHを一番安定的に分泌生産できるクローン1個を選び、分泌量を経時的に測定した。さらに実験の再現性を確認するために、異なるクローンも同様に用いた。
特に両グループの多重破壊株の中でも主な株に絞って、hGH量の経時変化をSDS-PAGEによって詳しく調べた。その結果を図6に示す。
図6は、S.pombeプロテアーゼ関連遺伝子多重破壊株によるhGH分泌生産量の経時変化を示すSDS-PAGE観察図である。分泌生産されたhGHの経時変化をSDS-PAGEによって解析した結果(クマシーブリリアントブルー染色)を示す。各株の各培養時点での培養上清0.5mlをTCA沈澱した後、SDS-PAGEで分析した。各レーン上段に菌株名略称(前記表3にその詳細を示した)を示すとともに、下段にはプロテアーゼ関連遺伝子の削除の流れも示した。レーンA0(nond: non-disrupted strain)はプロテアーゼ非破壊株ARC001を表す。
図7は、S.pombeプロテアーゼ関連遺伝子6重および7重破壊株によるhGH分泌生産量の経時変化を示すSDS-PAGE観察図である。各株の各培養時点での培養上清0.5mlをTCA沈澱した後、SDS-PAGE(クマシーブリリアントブルー染色)で分析した。各レーン上段に菌株名略称(前記表3にその詳細を示した)を示す。レーンA0はプロテアーゼ非破壊株ARC001を表す。
その結果から、7重破壊株は6重破壊株とほとんど同じ効果を示し、216h時点までhGH分泌生産量経時変化にほとんど違いが無いことが確認された。今回の実証実験方法を用いた際には、5重破壊以降の有効性での差異を確認するのは難しく、違いの検出には限界が見られた。これは、プロテアーゼに更に弱い異種タンパク質をモデルした実証実験によって解決できる可能性があると考えられる。
なお、2005年8月3日に出願された日本特許出願2005−225638号及び2006年6月8日に出願された日本特許出願2006−160347号の明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
Claims (12)
- 遺伝子組換え法により導入した外来遺伝子を発現させるためのシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)からなる改良宿主を構築する方法において、メタロプロテアーゼをコードする遺伝子(メタロプロテアーゼ遺伝子群)、セリンプロテアーゼをコードする遺伝子(セリンプロテアーゼ遺伝子群)、システインプロテアーゼをコードする遺伝子(システインプロテアーゼ遺伝子群)およびアスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子(アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群)からなる群から選ばれる3種以上の遺伝子を標的として当該3種以上の遺伝子を削除または不活性化する、シゾサッカロミセス・ポンベ宿主の構築方法、ここで、当該3種以上の遺伝子は、psp3、isp6及びppp53を含むことを特徴とする改良宿主を構築する方法。
- 3種以上の遺伝子が、メタロプロテアーゼ遺伝子群から選ばれる1種以上の遺伝子とセリンプロテアーゼ遺伝子群から選ばれる2種以上の遺伝子の合計4種以上の遺伝子であり、並びに当該4種以上の遺伝子は、psp3、isp6及びppp53を含む、請求項1に記載の構築方法。
- 3種以上の遺伝子は、psp3、isp6及びppp53、並びにcdb4、ppp22、ppp16及びsxa2からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子の合計4種以上の遺伝子である、請求項1または2に記載の構築方法。
- 前記遺伝子のORF(オープンリーディングフレーム)部分をマーカー遺伝子に置換して当該遺伝子を削除または不活性化する、請求項1〜3のいずれか1に記載の構築方法。
- 遺伝子組換え法により導入した外来遺伝子を発現させるためのシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)からなる改良宿主であって、メタロプロテアーゼをコードする遺伝子(メタロプロテアーゼ遺伝子群)、セリンプロテアーゼをコードする遺伝子(セリンプロテアーゼ遺伝子群)、システインプロテアーゼをコードする遺伝子(システインプロテアーゼ遺伝子群)およびアスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子(アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子群)からなる群から選ばれる3種以上の遺伝子が削除または不活性化されているシゾサッカロミセス・ポンベ宿主、ここで、当該3種以上の遺伝子は、psp3、isp6及びppp53を含むことを特徴とする改良宿主。
- 3種以上の遺伝子が、メタロプロテアーゼ遺伝子群から選ばれる1種以上の遺伝子とセリンプロテアーゼ遺伝子群から選ばれる2種以上の遺伝子の合計4種以上の遺伝子であり、当該4種類以上の遺伝子は、psp3、isp6及びppp53を含む請求項5に記載の改良宿主。
- 3種以上の遺伝子は、psp3、isp6及びppp53、並びにcdb4、ppp22、ppp16及びsxa2からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子の合計4種以上の遺伝子である、請求項5または6に記載の宿主。
- 請求項5〜7のいずれか1に記載の宿主に、異種タンパク質をコードする遺伝子を導入してなる形質転換体。
- 異種タンパク質をコードする遺伝子とともに分泌シグナル遺伝子を導入してなる、請求項8に記載の形質転換体。
- 請求項8または9に記載の形質転換体を培養して異種タンパク質を生産させ採取することを特徴とする異種タンパク質の製造方法。
- 請求項9に記載の形質転換体を培養し、異種タンパク質を生産させ該異種タンパク質を培養液に分泌させ、該培養液から該異種タンパク質を採取することを特徴とする異種タンパク質の製造方法。
- 異種タンパク質がヒト成長ホルモン(hGH)である、請求項10または11に記載の製造方法。
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