JPH022385A - 蛋白質又は蛋白質含有遺伝子生産物の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本光明は、遺伝子工学的方法で、真核生物の宿主＃Ｉ胞
を、所望の蛋白質の遺伝子を含有する組換え俸ＤＮＡ分
子で形質転換し、その細胞を培養し、かつ遺伝子生産’
ｍｖ公知方法で単離することに工υ、蛋白質又は蛋白質
官有遺伝子生産物全製造する方法に関する。

従来の技術 今日、臨床化学的パラメータの測定は太規俣に酵素法で
行なわれる。そのために必要な試薬の製造に使われる酵
素は植物又は動物に由来する棟々の原料からあるいは微
生物から得ら几る。

酵素及び他の蛋白質の製造に当って、微生物がますます
１要になっている。それというのも微生物だけが醗酵に
工す任意の童で使用可能であり、従って多本の蛋白質の
単離が可能たからである。特にＮ賛なのは周知の二うに
例えはサツカロミセス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉ８１ａｅ　）のような酵母であ
る。そｆＬというのもこの生体中では蛋白質の相同発椀
が真核生物の例えば治療に貞女な蛋白質の非相同発現と
全く同様に可能でるる。こｎに対して、最も頻繁に使わ
扛る宿主生体のＥ、コリ中では多数の非相同発現蛋白質
は相同系で発現さｎる七の天然物とは異ｌりかつ生物学
的に活性ではないか、あるいは不活性の不活性蛋白質凝
集物じしとして生じる。多くの真核生物の蛋白質は、Ｅ
。

コリ中では不活性で発現感れ、Ｓ、セレビシェ中では俗
性かつ活性で形成される。じＢｊｏｔｅｃｈ−ｎｏｌｏ
ｇｙ　ａｎｄ　Ｇｅ’ｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ　Ｒｓｖｊｅｗｓ３．３７７〜４１６頁（１９８５
年）〕。とυわけこのことは、酵母が典型的な真核生物
の翻訳後修飾糸２例えば蛋白質の折ジた九み、蛋白質成
熟、グリコジル化及びアセチル化を介して分泌可能であ
りかつポリペプチド及び蛋白質中のジスルフィド架橋の
形成を可能にすることにエリ惹起さするのであろう。史
に、酵母は病原性でほなくかつＥ、コリとは異なり毒素
及び発熱涼性裾胞壁成分を含有していない。

酵母は人間の最も古いｊ＠誉機微生物１つである。今で
も主としてアルコール醗酵（ワイン。

ビール寺）に及びドウ製品の１ベーキング助剤（Ｂａｃ
ｋｈｊｌｆｅ　）″として使わｎている。そｎと同時に
、酵母は例えはＮＡＤ　、　ＡＴＰ及びグルタチオンの
工つな低分子物質及び例えばＤＮＡ　、　ＲＮＡ及びと
りわけ酵素２例えばアルコールーデヒドロデナーゼ、ア
ルデヒドーデヒドロデナーゼ。

アセテルーＣｏＡ−シンテターゼ、α−グルコシダーゼ
、グリセリンアルデヒド−６−ホスフニートテヒドロ’
Ｉ’す一−ｔ’　、グルコース−６−ホスフニートーデ
ヒドロｒナーゼ及びヘキソキナーゼのような高分子物質
に＊離するための低兼な原料として工業的に重要でおる
。酵母は簡単に培養することができかつ長年の性験から
工条的規俟で闇早に醗酵させることができる。下等な真
核生物に含まｔしる牟細胞生物の酵母は真惧生物の典型
的な特徴ｒ有するが、遺伝学的実験及び遺伝学的操作に
使い易く、特に組換えＤＮＡ工学の点で宿主生物として
好適であり、つ１υ生物学的に活性なポリペプチド及び
蛋白質の相同及び非相同発現に好適である。

しかしながらたいていの場合、酵母中で蛋白７Ｊｊに発
現する際に、形成される蛋白質の蕪が不十分である。し
ばしば、形成された微生物のバイオマスが上昇するにも
かかわらず、成長の定Ｊ（期に到達後、所望の蛋白質の
特異的粘性が定常期の間に低下するのが認められる。こ
れは、とりわけ宿主性異的７″ａテアーゼによる、形成
された蛋白質に対する伍白買分解作用に帰因している。

発明が購決し二つとする課題 そｎ故、本発明の課題は、遺伝子工学的方法で、発げの
定常期でも蛋白質を形成することができ、安定に杏積す
ることができ、そｌし故師酵法の収率勿高めることので
さる、蛋白質の製法を開示することである。

１粗密屏決する丸めの手段 本発明にＬ！ｌ１１　この殊題は、冥核生物の宿主＃１
１１胞を所望の蛋白質の遺伝子？含有する組換え体ＤＮ
Ａ分子で形貴転換し、細肥？培養し、かつ発現埃に遺伝
子生題物會単離することにより、蛋白質又は蛋白質貧有
遺伝子生産物を製造する方法において、イｄ主＃Ｉ肥と
して、プロテアーゼＡ及びＢが欠損している酵母株を使
用することにエフ所決される。

付加的に、酵母株〉プロテアーゼＤが欠損していると後
れている。

他の漬れた実施形では、プロテアーゼＡｊＢ及び場合に
よｆ）Ｄが欠損していることに加えて、カルボキシペプ
チダーゼＹ及びＳの少なくとも一方が欠損している酵母
株ン使用する。不明細台におけるプロテアーゼ及びカル
ボキシペプチダーゼの表記の仕方はＩ′酵母（Ｙｅａｓ
ｔ　）　”　＋　１巻、１６９〜１５４頁（１９８５年
ンに相応する。

本発明方法で、この二つなテロテアーゼ久偵酵母体ｒ使
用することにより、蛋白質又は缶白買含有遺伝子牛庄物
會酵母中で高い収率で製造することができ、その際１ｃ
者しく長い醗Ｍ時間でもあるいは引続いて行なう公知方
法に工／８早岨の際にも蛋白質分解作用、従って蛋白質
の失活化は起らない。

本発明の特に汝ｔ′１．九実施形では、宿主細胞として
酵母株ＡＢＹＳＤ　−１１、ＤＳＭ　４３２２　＊便用
する。この宿主株はプロテアーゼＡ、Ｂ、Ｄ及びカルボ
キシペプチダーゼＹ及びＳが欠損している。更に、この
宿主株はアデニン、ヒスチジン及びリジンの生合成にお
いて栄養す求性七有する。栄養要求性とは、微生物（＃
Ｉ菌又は酵母の変異株）が例えばアミノ酸のような一定
の成育因子を間車なＮＩＪ駆体から甘成し得る能力を狩
つ１いないことを表わす。相応する野生型株とは反対に
、栄髪賛求変異株は／９ｒ＝Ｓ最少培地では生育しない
。その代りに、自身で台底することりできない取置に必
すな成分を含有する完全坩池を必豐とする。家主’ａは
１極のめるいはまた数Ｔ１の成育因子に対して宋交安求
性でめって工い〔Ｌ　Ｌ、　Ｗｉｎｎａｃｉｃｅｒ　−
９、’　Ｇｅｎｅ　ｕｎｄ　Ｋｒｏｎｅ’。

付ｄ　Ｃ、ＶｅｒｌａｇＣｈｅｍｉｅ出Ｊ（１９８５年
）〕。

本発明の他の潰れた実施形では、前記のプロテアーゼ欠
偵醇母株を他の栄養要求性及び／又は架剤感受性酵母株
と交雑し、胞子形成後、栄養要求性及び／又は感受性を
介して生成ハイブリッド株から選択することにぶり、少
なくともプロテアーゼＡ及びＢが欠損して３りかつ親株
の栄養要求性及び／又は薬剤感受性の少なくとも一方を
有する酵母株を分離し、かつこのハイブリッド株？宿主
細胞として使用する。

薬剤感受性とは、一定の薬剤、例えばメトトレキセート
、クロラムフェニコール及びゲンタマイシン訪導体Ｇ４
．１８’に含有する培地中では住＃しない微生物の特性
を次わす。微生物にこれらの薬剤に対する抵抗性？河与
する這伝子會含有する組換え体ＤＮＡ　（デヒドロフオ
レートリダクターセ、　ＤＨＦＲ；クロラムフェニコー
ル−７セテルートランスフエラーゼ、　ＣＡＴ　；　）
ランスボゾンＴｎ　６０１コード化アミノグリコシド−
ホスホトランスフェラーゼ寺）で値生物紮形＊＝ｍ後に
初めて微生物は用地中で成育でさる。

例えは、５ｃ雑及び胞子形成は、ジャーマン及びその他
共４　（Ｓｈｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　、″メン
ズ・イン・イースト・ジエネテイツクス（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓｌｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｍ　）”（Ｃｏ１
ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂＯｒａｔＯｒ７出
版、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　、　Ｎ
ｅｖｔＹｏｒｋ任（１９８４年）〕と同様にして実施す
ることかできる。本発明の特に優れた丈施形でハ、酵母
株ＡＢＹＳＤ　−１１，ＤＳＭ　４３２２　（ａ　。

子並びにウラシル−及びヒスチジン生合成における栄養
要求性もしくはヒスチジン−、ロイシン−、ウラシル−
及びトリプトファン生合成における栄養要求性を勺する
酵母株ＴＣＹ　２８２４−１人（αｍａｔ１ｓ−△ｕｒ
ａ　３−５２　ｈｊｓ　４　）　、　ＤＳＭ４６１７又
はＤＥＦＹ　７４６　、　ＤＳＭ　４３１６　（αその
後、有利に、グロテアーゼＡ、Ｂ及び場合にり、！１ｌ
ｌＤ並ひにカルざキシペグテダーゼＹ及びＳが欠損して
２＃）かつ付加的に親株の少なくとも１種もしくは数株
の栄′４！蒙水性、例えばウラシル−、リジン−及びマ
ルターゼ有効化（Ｖｅｒｗｅｒｔ、ｕｎｇ）栄養要求性
又はロイシン−及びトリプトファン栄養要求性あるいは
ロイシン−、ウラシル−及びヒスチジン栄＃要求ｆ４ｆ
有するハイブリッド株七単雅する。

それ故、本発明の他の優ｆ１７ｃ実施形では、組換え体
ＤＮＡ分子が所望の蛋白質又は蛋白質官有遺伝子生産物
の遺伝子に加えて、宿主株の栄養要求性及び／又は薬剤
感受性を相補う遺伝子１種又は数種を含有する。

本発明の優れた実施形により、形質転換さ扛た宿主細胞
と形質転換されていない宿主細胞との藺単な区分が可能
である。宿主株の栄養要求性及び／又は架剤感受性１つ
以上を相補う遺伝子の存在及び発現は、形買松挨妊ｎた
卸ｊ詔會、例えば宿主株自体が台底することのできない
アミノ酸ヲ官有していないが、組換え体ＤＮＡ分子上に
その遺伝子が存在している培地上でも瓜ｎさせることが
できる。これに対して、形負４ｍＭされていない、従っ
て組換え体ＤＮＡ分子及びその上に官有されている栄養
璧求性相補性消伝子ｒ有していないイｄ主株はこのエラ
な培地中では成育し得ない。これに工り、藺単に、形質
転換さｎた宿主細胞の選択？行なうことができ、それ故
、所望の蛋白質の遺伝子全含有する組換え体ＤＮＡが醗
酵の間に失なわれる危険も回避さｎる。そｎというのも
生前有利性は形質転換されなかつ；Ａ細胞にＬつては生
じないからである。

場合に工９、宿主株の栄養要求性及び／又は楽蒼り感受
性金、この宿主＃Ｉ胞の栄養要求性もしくは架剤感受性
を相補う遺伝子１ａ！以上全導入することに工９児服す
ることもできる。しかしその除に、所望の生匹物の遺伝
子１ａ！する宿主細廐全選択する簡単な可能性は認めら
ｒシない。

粕侠え体ＤＮＡ分子には、酵母細記ｒ形質転換すること
かでさかつ外米遺伝子業兄現することのでさるすべての
組換え体ＤＮＡ分子が該当する。

この際Ｖこ、例えばプラスミドの東色体外鴨与が該当す
るはかジでなく、所望の蛋白質の遺伝子？１１−＋：Ｔ
シぞれ完全な発攻カセット〔プロモータ。

ターミネータ、調節遺伝子、転写増強遺伝子：Ｔｒａｎ
ｓｋｒｉｐｔｌｏｎｓｖｅｒｓｔａｒｋｅｒ　弄）　＊
　ａ　自−する状せベクター（Ｉｎｔ、ｅｇｒａｔｉｏ
ｎｓｖｅにｔｏｒ　）又は統合性ＤＮＡフラグメント勿
介して酵母ケ９ツム中に取込みかつ酵母８目の蛋白質と
一緒に発現することもできる。このための前提は組換え
体ＤＮＡ分子及び染色体の酵母配列上の相同性の存在で
るる。そのＬつな相同性領域？介して、統合性ＤＮＡフ
ラグメント２公知方法にエフ酵母染色体中に導入するこ
とができる。

それ故、本発明の他の愛れた実施形では組換え体ＤＮＡ
分子はグラスミドめるいは統合ベクター又は統合性ＤＮ
Ａフラグメントである。プラスミドとしてａ１細胞中で
高いコピー数で産出する酵母プラスミドが轡に潰れてい
る。例えば、この工つな酵母プラスミドは静置／Ｅ、コ
リーハイブリッドベクター（“シャトルベクター”）で
あり、これはＹＲｐ　、　ＹＥｐ　、　ＹＩｐ及びＹＣ
ｐとして表わされる。ＹＥｐ−及びＹＲｐ−プラスミド
たけが細胞中で尚いコピー数で産出する。これらのプラ
スミドは酵母染色体の複製とは関係なく該プラスミドの
独立した複製ｋＭＮヒにする配列の存在に基ついておジ
かつ一般に細胞１個当りコピー５〜４００個数で存在す
る。ＹＩｐ７’ラスミドは酵母デノム中への統合に工っ
て発現され得るに過ぎない。それ故、そγしは統合ベク
ターの例である。ＹＩｐ　ニア’″ラスミドは”／１０
の低い形買私換率全有するが、そのためにＹＲｐ−及び
ＹＥｐ　ｆラスミドに比べて著しく高い安知性勿有する
。ＹＲｐ・−及びＹＥｐプラスミドは選択圧なしで細胞
増殖の際に失なわれ得る（　”　Ｎａｔｕｒｅ３０５．
３９１〜６９７自（１９８３年）〕。

しかしその工うな選択圧は、栄養要求性又は桑炸Ｊ１糸
受性の宿主体の醗酵を厳小培地中で又は宿主体か感受性
である一定の４創を含有する培地中で実施しかつ付加的
に組換え体ＤＮＡが栄養要求性又は感覚性全相補う遺伝
子１個又ｔゴ数個を有する本発明の浚ｎた実施形で生じ
る。

本発明にニジ、相同性又は非相同性蛋白質又は蛋白質含
有遺伝子生産物が高収率でかつ蛋白質分解作用？しない
形で発現可能であり、その除にｌた形質転換さＩＬ九軸
肥の選択並ひにそれ故Ｐ′９［望の遺伝子生圧物の収率
を旬めることも藺単に実施することができる。細胞を砕
騎する★曾及び公知方法にエリ遺伝子生産物を取得する
他の処理の場合にも、宿主細胞のプロテアーゼ欠損のた
めに形成された生産物に対する蛋白質分解作用は惹起さ
ｎない。

本発明の優れた実施形において蛋白質のα−グルコシダ
ーゼＰＩが製造さｎる（例４参照）。

実施例 次に、本発明を実施例により詳説する。

例　　１ サツカロミセス株ＡＢＹＳＭＡＬ　８１及びＡＢＹＳＤ
ＭＡＬ８１の製造に当り、プロテアーゼＡ、Ｂ及びＤＩ
ＥひにカルざキシペテテダーゼＹ及びＳが欠損しており
かつ付加的に７デニンー、ヒスチジン−及びリジン生合
成における栄養要求性７有スる一倍体のサツカロミセス
・セレビシェ固体ＡＢＹＳＤ　−１１（ａ　ｐｒａ　１
　　ｐｒｂ　１　　ｐｒｅ　１ｐｒｄ　１　　ｃｐｓ　
１　　ａｄｅ　ｌｙｓ　ｈｉｓ　７　）　、　ＤＳＭ４
３２２會、欠陥α−グルコシダーゼ栴造道伝子及びウラ
シル−及びヒスチジン生合成における宋″＃妥求性ｔ％
徴とするサツカロミセス・カールスペルケ９ンシス（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓ
ｉｓ）引続いて、胞子形成を行ない、かつ生成した酵母
分離体〒七の栄養晋求性について種々の違択培地上でＸ
ｆ！−板培養しかつプロテアーゼ欠損について細胞浴牌
物中でプロテアーゼ曲性を測定することにエフ試峡した
。囲体ＡＢＹＳＤＭＡＬ　８１分離体７　ＹＥＰＤ培地
（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）５
ｍδ中で発育させ、対数期後期乃至定常期早期の発育用
の細胞を採取し、２回水で洗いかつガラスピーズを用い
て回転ミックス（Ｗｈｉｒｌｍｌｘ　）で均質化するこ
とに↓９枠解する〔”ＭＧＧ″　１４５巻、６２７〜６
６３貞（１９７６年ン〕。細胞ｋ　２０　ｍｍｏＬ／ｌ
トリス（ｐ！−１７，０）１μで抽出しかつ迷心分離後
に上澄みｔ粗製エキスとして更に加工処理した。プロテ
アーゼの活性化の九めに粗製エキスｋｐ８５．０に滴定
しかつ２５℃で２４時時間幅保狩した〇 プロテアーゼＡ欠損（ｐｒａ　１　）の検出細胞エキス
による１、２％−酸変性ヘモグロビンの加水分解なしｅ
　ｐＨ６，０（”　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｊｏ−ｃｈｅｍ
、　　、　４２　、６２１〜６２９自（１９７４年）〕 酸変性したヘモグロビン１．２％勿金含有る口０、Ｉ　
Ｎｏｔ　／　ｌ−ラクテート緩備液（ｐＨ３，０）０．
５Ｍ勿枇胞浴解物０．１社と２５℃で恒温保狩し友。６
０分後に、１０チートリクロロ酢酸０．５Ｍで反応を停
止しかつ遠心分離後にトリクロロ酊酸司浴性生成物ｋ　
２８０　ｎｍで吸光度測定するか又はマクドナルド及び
チェノ （ＭｃＤｏｎａｌｄ及びＣｈｅｎ共著＊　”　Ａｎａｌ
、　Ｂｊｏｃｈｅｍ、　。

１０巻、１７５〜１７７頁（１９６５年９〕による変性
７オリン測定エク（測定した。

比活性の計算に肖ってデーメンホフ（Ｚａｍｅｎ−ｈｏ
ｆ　）による蛋白質測定を行なつ７（（”Ｍｅｔｈｏｄ
ｓＥｎｚｙｍｏｌ、　　＋　３巻、７０２頁（１９５７
年９〕。

プロテアーゼ人欠損は、飲変性ヘモグロビンに対する細
胞溶解物の特異的な加水分解活性が野生型株に比べて５
％ニジ低い数値に低下した場合に認められる。

グロテアーゼＢ久摺（ｐｒｂ　１　）の慄出明７で細胞
エキスによる２、４％−ア・アコル（Ａｚｏｃｏｌ’ｌ
　）の加水分解なしく　”　Ｅｕｒ、　ＩＪ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　＋　４２巻、６２１〜６２６頁（
１９７４年〕〕 ０．１　ｍｏｌ／　ｌ−ホスフェート緩衝液＜　ｐｉ１
７．０）中の２，４チーア・戸コル懸濁液０．５ＩＩＬ
Ｌ全細胞浴所物Ｑ、１ｍｌと振盪下に２５°Ｃで恒温保
持した。

プロテアーゼＢの活性化に轟９ａ製エキスに活性測定ｎ
ｉｌにドデシル硫酸ナトリウム（最終ａ展肌２５％）？
加えた。

６０分後に、反応ｔ１０％−トＩＪクロロ酢酸Ｑ、５Ｒ
６（７：）添加にニジ停止しかつ忠心後、上澄み中の吸
光度ｋ　５５　［］　ｎｍで測定した。

プロテアーゼＢは、ア・戸コルに対する細胞溶解物の加
水分解比活性が野生型株に比べて５チ：ジ低い数値に低
下すると欠損している。

アミノペプチダーゼＭの存在における５０ｍｍｏｔ／ｌ
トリス／マレエート後備液（ｐｉ−１７，０）中でＱ、
５　ｍｍｏｔ／　ｌ　Ｂｚ　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ　−Ａ
ｒｇ−ＮＡ　（ペン１１イル−Ｌ−プロピル−Ｌ−フエ
ニ／Ｌ／　７　ラニルーＬ−フルイニルーｐ−ニトロア
ニリド）は細胞エキスに工り加水分解されない〔′″Ｊ
、　ｇｔｃｌ、　Ｃｈｅｍ、　　、　２６０巻、４５８
５〜４５９０頁（１９８５年）〕 試験ｙＡ理ニ ー→〕 Ｈｚ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＡ　　　　　Ｂｚ−
Ｐｒｏ＋Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＡ アミノセダーぜＭ　Ｐｈｅ＋Ａｒｇ＋４−＝ｔＣ２ｔ−
２ア＝Ｐｈｅ−−ＮＡ リン ０．５　ｍｏｔ／　ｌ　ト　リ、ｘ、　／　？　ｖ　ｘ
　　　）　Ｍ　＠＊　（ｐｌ（７，０）０．０３１Ｕｋ
１　０ｍｍｏｔ／ｌ　Ｂｚ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ａｒｇ
−ＮＡ　（ジメチルスルホキシド中に浴＃　）　０−０
１５　ａｓ　ｒアミノペプチダーゼ上１１０／Ｊ　ｌ　
（４０ｎ　、　２４０　ｍＵ　）　、水０．１４５ム及
び粗ｄｘキス０．１ｒＩＬＬと混合し、かつ４０５　ｎ
ｍの吸光度変化全試薬盲検値に対して測定した。

プロテアーゼＤは、Ｂｚ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｎ
Ａに対する加水分解比活性が野生型株に比べて１０％↓
りも低い数値に低下した場合に欠損している。

カルボキシペデテダーゼＹ欠１ｆｆ（ｐｒｃｌ）の検出 ［１，５ｍｍｏｔ／　ｌベンゾイル−Ｌ−チロシン−４
−ニトロアニリド（ｐＨ７）の細胞エキスによる加水分
所なし〔’　Ａｒｇ、　Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　　、
　３５巷、６５８へ６６６貞（１９７１年）〕デオキシ
コレートで粘性化した（最終濃度０．５　％　）粗Ｂエ
キス０．１　ａｚ　ｋ　Ｏ，１ｍｏｂ　／　ｌホスフェ
ート緩＃液（Ｐｉ−ｉ７．０．）ＩＩＩ及び３　ｍｍｏ
ｔ／ｌベン１戸イル−Ｌ−チロシン−４−ニトロアニリ
ド（ジメチルホルムアミド中に浴ｍ　）　０．２　ｍｅ
。

と２５℃で恒温保持した。１０分後にｉ　ｍｍｏｔ／ｌ
塩化水鋏１塩化水土１Ｍつ遊離したｐ−＝トロアニリン
に４１０ｎｍで測定した。

カルボキシペプチダーゼＹ欠損は、ベンシイ／ｌｚ　−
Ｌ　−チロシン−４−ニトロアニＩＪ）−に対ｔ−る加
水分解比活性が野生型株と比べて５％ｚり低い数値に低
下した場合に存在する。

カルボキシペデテダーセ゛Ｓ欠損（ｃｐｓ１）の検出 −７，４で細胞エキスによるＣｂｚ　−Ｇｔｙ　−Ｌｅ
ｕ（ベンジルオキシカルボニル−グリシル−Ｌ−ロイシ
ン）の加水分解なしく次にＬ−アミノばオキシダーゼ−
ペルオキシダーゼ試験で遊馳ロイシンの分析）　（”　
Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

７６巻、５５６〜５５６頁（１９７７年）〕試験浴液（
０，２５／’Ｑ／ＩＵＬ−アミノ鈑オキシダーゼＩ　Ｏ
，４ＩＷＪ　／　ｆｆ１Ａ西年ワサビペルオキシダーゼ
及び０．５　ｍｍｏｔ／　ｌ　ＭｎＣｌ２　）　０．５
　ｍｇ　、　２７．５ｍｍｏｔ／　７３　Ｃｋ＋ｚ　−
Ｇｔｙ　−Ｌｅｕ　浴液（０，２ｍｏｔ／ｌホスフェー
ト緩衝液、ｐＨ７，口中に俗廣）０．４ｍシ、０−ジア
ニシジンジヒドロクロリド（２！ｎＱ／ＩＬｔ、Ｈ２Ｏ
中に溶解）　０．０５ｍｇ　、　２２　ｍｍｏｔ／ｌフ
ェニルメチルスルホニルフルオリ）”　０．０５九及び
透析しｆｃ細胞溶解物（透析＝０．１モル塩仕イミダゾ
ール、　ｐＨ５，３；　２４１＃ｙ間；２５℃）０．１
ｍ１−虚名しかつ４０５　ｎｍで吸光度変化を測定し次
。

カルメキシペデテダーゼＹ欠損は、Ｃｂｚ−ｏｚｙ　−
Ｌｅｕに対する加水仕事比活性が野生型体と比べて５％
エク低いＭ値に低下しｆｃ場合に存在する。

前記の検出法に基つき、囲体Ａ８ＹＳＤＭＡＬ　８１で
はプロテアーゼＡ、Ｂ、Ｄ及びカルボキシペプチダーゼ
Ｙ及びＳが入角し、かつ菌株ＡＢＹ８−ＭＡＬ　ｌ：ｌ
　１ではプロテアーゼＡ、Ｂ″ｉひにカルボキシペプチ
ダーゼＹ及びＳが欠損していることが確認さｒ’Ｌ　ｆ
ｃ　。

酵母窒素ベース（ＹＮＢ　、塩−ビタミン混合物。

Ｄｉｒｃｏ　）　０．６７％、カブミノ岐（ＣＡＡ　ｒ
　＆白買氷解物、　Ｄｉｒｃｏ　）　Ｑ、５％、マルト
ース（唯一のＣ源）２％、クラシル２０〜／ｌ及びアデ
ニン６ＣＪｍ６／／ｌ’！含有する合成完全培地ｌ上で
発育せず。

ＹＮＢ　Ｏ，６７％、　ＣＡＡ　Ｏ，５％、グルコース
（１４１ｍ−のＣ源）２チ及びアデニン６０ＩｎＱ／ｌ
ｔ含有する合成完全培地■上で光背せず。

リジン栄養老来性の検出 クラシル（２０ｍＱ／Ｊ）ｋ官有するが、リジン′に含
有しない合成完全培地ｆｌ　（ＣＡＡ　Ｏ，５％の代り
にリシン會含自−しないアミノ酸混合物？！−便用した
）上では発育せず。

ウラシル（２０ｍＱ／　ｌ）ｋ含有するが、アデニン及
びヒスチジンを含有しない合成完全培地（ＣＡＡ　Ｏ，
５％代りにヒスチジンを含まないアミノ酸混合物を使用
した）上で発育。

例２及び６ サツカロミセス株ＡＢＹＳＤ　９１　（１ｅｕ２−３　
。

２−１１２　　ｔｒｐ　　１−２８９ａ　　Ｐｒａ　　
１　　ｐｒｂ　１　　ｐｒｄ　　するに当り、例１に記
載し７’ＣＩうに、サツカロミセス・セレビシェｆｉ株
ＡＢＹｓＤ　−１１ｋサツカロミセス・カールスペルｒ
ンシス１株ＤＢＹ　７４６゜ＤＡＭ　４３１６と交雑さ
せた。胞子彫成後、酵母分離体音そのプロテアーゼ欠損
及び朱六安求性について試験した。

ＣＡＡの代りにロイシンもしくはトリプトファンを含ま
ないアミノ酸混合物？使用した）上で発育せず。

ウラシル−、アデニン−、ヒスチジン−及びリジン−原
宋膏性の検出 ７７’ニン、ウラシル、ヒスチジン及びリジンを含有し
ない合成完全培地■（０，５％ＣＡＡＯ代りにヒスチジ
ン及びリジン全官有しないアミノ酸混合物を便用しｆｃ
）上で発育。

例１参照 合成完全培地■上で発酋せず。

例１参黒 出 ウラシルｋＫむが、ロイシンもしくはトリプトファン’
ｆ言’！ない合成完全培地ＩＩ　（［Ｊ、５％ワラシル
ｒ言むが、ロイシンもしくはヒスチジン７を官有しない
合成完全培地Ｕ　＜　Ｏ，Ｓ％ＣＡＡの代りにロイシン
もしくはヒヌテジン會宮まないアミノ酸混合物を使用し
た）上で発育せず。

アデニン−、リジン−及びトリプトファン原栄ウラシル
を含有するが、アデニン、リジン及びトリプトファン７
含有しない合成完全培地■（０，５％ＣＡＡの代りにロ
イシン及びトリプトファンゲ含有しないアミノ酸混合物
？使用しｆｃ）上で発育。

例　　４ α−グルコシダーゼｐｒの発現 サツカロミセス国体ＡＨＹＳＭＡＬ　８１　（例１）を
プラスミドｙｇｐ　／　５Ｃ６ｔ）３で形質転換した〔
ｒｑａｔｕｒｅ　　＊　２７５巻、１０４〜１０９ｇ（
１９７８年）〕。

このグラスミドの製造に当って、ベクターＹＲｐ　／　
（）ＬＵＰＩ　、　ＤＳＭ　４１７３　Ｐヶ制限エンド
スクレアーゼＳｓｐ　ｌ及びＨｊｎｄ　ｌで消化し、約
３、Ｑ　ｋｂｐの長さのＳｓｐ　Ｉ　／　Ｈｌｎｄ　ｌ
−フラグメントを分離し、かつＹＥｐ　２４からの分離
Ｐｖｕ　１１／　Ｓｓｐ　ＨＩ−ベクターフラグメント
（”　Ｇｅｎ６８含、１７〜２４負（１９７９年）　；
　Ｃｏｌｄ８ｐｒｊｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　　、　　”　
　Ｓｙｍｐ、　　Ｑｕａｎｔ、　　Ｂｉｏ１４６巻、７
７〜９０負（１９７９年）　；　”（）ｏｎｅ″。

２９巻、１１６〜１２４自（１９８４年）；Ｎａｔｕｒ
ｅ　　ｍ　２８６巻、８６０〜８６５頁（１９８０年）
〕中に−クレノウボリメラーゼでＨｌｎｄ　ｌの突出５
′−末端勿光槙しかつ５ｐｈＩ　１ｌｌＩＩＪ限切断個
所の突出６′−末端を分鱗後一連結した。生成しｆｃ、
ｆラスミドｙｇｐ　／　Ｓ　４中でα−グルコシダーゼ
ＰＩ発現カセットが平行配向（ｇｌｅｌｃｈｌａｕｆｉ
ｇｅ　Ｏｒｊｅｎｔｉｅｒｕｎｇ）でＩ−ラクタマーゼ
遺伝子に統合している。その後、ＹＥｐ／８４のＢａｍ
　ＨＩ−制限切断個所中に、ＭＡＬ　２−８０１）−ｆ
ｆｌ伝子’ｋＨ１ｍする長さｆＪ３．１ｋｂｐのＢａｍ
ＨＩ−７ラグメントが連結した。そのためにプラスミド
ｐＲＭ２　、　ＤＳｈ４４５１４　Ｐ會制限エンドヌク
レアーゼ５ａｔＩで消化し、突出５′−末端？クレノウ
ボリメラーゼで満たし、ＢａｍＨＩリンカ−（ｔｉ（Ｃ
Ｇ（）Ｃ）ＡＴＣＣＣＧＪ　）　’ｉ挿入し、ＢａｍＨ
Ｉで後から脱隠しかつ長さ３．１　ｋｂｐのＭＡＬ　２
−８０ｐ遺伝子？含有するＢａｍ　ＨＩフラグメンＭＦ
−分離する。この生成ベクターｋ　ＹＥｐ　／　５Ｃ６
ｂ３と表わした◇ 形質転換した凶株ｔマルトース４％を含有するｙｇｐ　
Ｊ＠地（静母エキス１％、ペプトン２％ン中で生育させ
かつ後期対数期もしくは定常ル」まで尾誉した。引続い
て、バイオマスを採取しかつ１０　ｍｍｏｔ／　ｌ−ホ
スフェート緩備ｉ　（ｐ）１３、ｄ）で抗浄した。Ｙｇ
Ｐ培地５　ｍわ（酵母約０．１〜０．２ｙ、湿式１知）
からの細胞ケ回転ミックス（Ｗｈｉｒｌ田ｉｘ　）で均
質化することにエフ伜解したし″上ＪＣ）Ｇ″、１４５
巷、６２７〜６６６負（１９７６年）〕。

α−グルコシダーゼ比活性の街１１定にｐ−ニトロフェ
ニル−α−Ｄ−グルコピラノシドの加水分解［”　ＭＧ
Ｇ　”　、　１５１舎、９５〜１０６自（１’、’７７
年２〕及びデーメンホ７による蛋白％＋則定　〔’　　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｊｎｏｌ、　　　　、　３
　巻　、　７０２０（１９５７年ン〕に基いて行なった
。

この工うにして得られた粗製エキス甲でその酵素に４°
Ｃで１０日以上安定でりった。ＳＤＳ　ｒル′亀気泳動
でもこの期間はバンドパターンの変化は認められなかっ
た。このことは、この上置み中に宮まれる他の酵素及び
蛋白質もこの酵母株中で安定しておりかつ著しくは蛋白
質分解作用を受けないこと金示す。

＆Ｉ中で、パン酵母（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｈｅｆｅｗ＠
＄ｅＮｉｒｎｂｅｒｇ＋　ＤＨＷ　）のα−グルコシダ
ー−ｈ’　ノｕ索安定性ｔ２″ロチアーゼが欠ｆＭ　し
ているα−グルコシダーゼ形買転換体中の組換え発現さ
せたα−グルコシダーゼの安定性と比軟して＠載した。

パン酵母ではα−グルコシダーセ゛比粘性ハ対数期後期
乃至翅冨ル」早期で最大になる。醗杯が丈に進行すると
α−グルコシメ′−ゼ比活性は者しく低下する（表１）
。こｎとは反対に、定常発冑期に達した後でもグロテア
ーゼが欠損している形質転換さｎ　ｆｔ　ｍａｌ　Ｏ１
株は安定して畜槓されて、＠異的でめジ、そ１し故バイ
オマスの醗醇及び後処理は著しく簡便になる。

醗酪培地： パン酵母＝１％酵母エキス、２％ペプトン。

２チマルトース Ａ８ＹＳｍＩ、　８１　：　　合成完全培地１例　　５ α−グルコシダーゼのＮ木端部とＨＩＶｉ仇涼と、Ｃり
底る融合蚤白買全プロテアーゼ欠損酵母体中で非相同発
現 α−グルコシタ゛−ｔ−”ｐｘ発現ベクターＹＥｐ　１
５Ｃ６１）３（例４）中で、α−グルコシダーゼＰＩの
約８０％をコード付けする長さｉ、４ｋｂｐのＢｇ、ｔ
　ｌフラグメントｉ　ＨＩＶｌ−レトロウィルスのｇｐ
４１腹蛋白質の一部全コード付けする長さボつ３００　
ｂｐのＤＮＡフラグメントに対して父換した。そのため
に、長さ約３　Ｑ　ＯｂｐのＲｓａｌ　／　Ｈｉｎｄ　
１１１−フラグメント（閂己タリニ″Ｃｅ１ｔ　’４５
巻、６６７〜６４８貞（１９８６年〕の第１図の１６６
８〜１９４６の詔Ｊ−１の配列診ｐｆｉ、　）　’＜　
Ｈｌｎｃ　ｌ及びＨｊｎｄｉで消化したＥ、コリベクタ
ーｐＵＣ１８ＣＬイ１３　ｍｐ　１８及びｐＵＣｌ９゜
１己　タリ　：　　″　Ｇｅｎｅ　　　　　＋　　　３
　３　　巻　、　　１　　口　６〜１　１　９　＊＜　
１９８５年ノ〕中にサブクローン化した（構造：　ｐＵ
ｃ１８ＨＲＨ，３００）。ｐＵＣｌ　８ＨＲＨ，３００
から長さＦＪ　３２０　ｂｐ　（１）　Ｂａｍ　ＨＩ　
／　Ｈｌｎｄ　ｉ　−７ラグメントを分離しかつ長さ約
５．２　ｋｂｐのｐＵＲ２７８ＢａｍＨＩ　／　Ｈｊｎ
ｄ、　１−ベクターフラグメント中に連結した〔配列二
″’　ＥＭＢＯ”　＃　２巻、１７９１〜１７９４頁（
１９８３年）〕（構造：　ｐＵＲ２７８ＨＲＨ，３００
）。プラスミドｐＵＲ２７８ＨＲＨ，６００ｋＨａｎｄ
　ＩＭで消化し、突出５′末端を”タレノウポリメラー
ゼ”で＃たしかつＪ３ａｍ　ＨＩ−リンカ−Ｃｄ（ＧＧ
ＧＡＴＣＣＣ）　ｍｌ　七挿入する。その後、ＢａｍＨ
Ｉで脱８＆シ、長さｉＪ　３００　ｂｐ　１７）Ｂａｎ
　ＨＩフラグメント？分離しかつ長妊約’Ｉ、　ｉ　ｋ
ｂｐ　（７）　ＹＥｐ　１５Ｃ６ｂ３　ＢｇｔＩｔ−ベ
クターフラグメント中に連結した。ｇｐ　４１−膜はゼ
リペデテドーＤＮＡの正しい配庫」で、α−グルコシダ
ーゼのＮ未満（アミノ酸５０個）、融合部位に構造會条
件とするアミノ酸４個、ｇｐ４１−膜蛋白質のアミノ酸
１０１個及び（末端に構造を条件とするアミノ酸６個＝
９取り、分子掻約１．８５００Ｄの融合蛋白質が生厄す
る。所望の構造物は形質転換しかつ培養した（下記参照
）後のプロテアーゼ欠損酵母発堝株ＡＢＹＳ）話Ｌ８１
中の発現融合蛍白質を介して、次いでＳＤＳデル亀気泳
励及びウエスタンプロットヲ行なってヒＩ−ＨＩＶ１血
清との免役反応に基いて分離し友。融合蛋白′１ｉｉｔ
は全蛋白質の杓５％で発現しかつクーフシ−染色後にＳ
Ｄ８ポリアクリルアミドｒル中の凌性バンドとして観察
することができた。

α−グルコシダーゼＰＩ−ｇｐ　４１融合蛋白質を発現
するために、形責転換体紫グルコース２％及びマルトー
ス２％勿含自する選択培地（ＹＮＢＯ０６７％、　ＣＡ
Ａ　［Ｊ、５％、アゾ＝ン６ＣＪｆｎＱ／ｌ）上で発育
させ友。１０〜２０時間の誘導期後（グルコース消帽１
細胞を採取した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、真核生物の宿主細胞を、所望の蛋白質の遺伝子を含
   有する組換え体ＤＮＡ分子で形質転換し、細胞を培養し
   かつ発現後に遺伝子生産物を分離することにより、蛋白
   質又は蛋白質含有遺伝子生産物を製造する方法において
   、宿主細胞として、プロテアーゼＡ及びＢが欠損してい
   る酵母菌株を使用することを特徴とする、蛋白質又は蛋
   白質含有遺伝子生産物の製法。 ２、付加的に、該酵母菌株はプロテアーゼＤが欠損して
   いる請求項１記載の方法。 ３、付加的に、該酵母菌株はカルボキシペプチダーゼＹ
   及び／又はＳが欠損している請求項１又は２記載の方法
   。 ４、酵母菌株ＡＢＹＳＤ−１１、ＤＳＭ４６２２を使用
   する請求項３記載の方法。 ５、プロテアーゼ欠損酵母菌株を他の栄養要求性及び／
   又は薬剤感受性酵母菌株と交雑させ、胞子形成させかつ
   生成したハイブリッド菌株から栄養要求性及び／又は薬
   剤感受性を介して選択した後で、少なくともプロテアー
   ゼＡ及びＢが欠損しておりかつ親株の栄養要求性及び／
   又は薬剤感受性の少なくとも一方を有する酵母菌株を分
   離し、かつこのハイブリッド菌株を宿主細胞として使用
   する請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。 ６、酵母菌法ＡＢＹＳＤ−１１、ＤＳＭ４３２２を菌株
   ＹＣＹ２８２４−１Ａ、ＤＳＭ４３１７又はＤＢＹ７４
   ６、ＤＳＭ４３１６と交雑させ、プロテアーゼＡ、Ｂ及
   びカルボキシペプチダーゼＹ及びＳ並びに場合によりプ
   ロテアーゼＤが欠損しておりかつ親株のウラシル−、リ
   ジン−及びマルトース有効化栄養要求性、ロイシン−及
   びトリプトフアン−又はロイシン−、ウラシル−及びヒ
   スチジン栄養要求性を有する菌株を単離し、かつそれを
   宿主細胞として使用する請求項５記載の方法。 ７、付加的に、宿主細胞の栄養要求性及び／又は薬剤感
   受性を相補う遺伝子１種以上を含有する組換え体ＤＮＡ
   分子を使用する請求項５又は６記載の方法。 ８、組換え体ＤＮＡ分子として統合ベクター又は統合性
   ＤＮＡフラグメントを使用する請求項１から７までのい
   ずれか１項記載の方法。 ９、組換え体ＤＮＡ分子が高いコピー数で細胞中に産出
   する酵母プラスミドである請求項８記載の方法。 １０、α−グルコシダーゼ（ＦＩ）を製造する請求項１
   から９までのいずれか１項記載の方法。