ES2204884T3 - Procedimiento para la obtencion de proteinas o productos genicos que contienen proteinas. - Google Patents
Procedimiento para la obtencion de proteinas o productos genicos que contienen proteinas.Info
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Abstract
PARA LA OBTENCION DE PROTEINAS O DE PRODUCTOS GENETICOS CON PROTEINAS MEDIANTE TRANSFORMACION DE CELULAS-HUESPED EUCARIOTAS CON UNA MOLECULA DE DNA QUE CONTIENE EL GEN PARA LA PROTEINA DESEADA, CULTIVO DE LAS CELULAS Y AISLAMIENTO DEL PRODUCTO GENETICO TRAS LA EXPRESION, SE USA COMO CELULAS-HUESPED UNA CEPA DE LEVADURA QUE ES DEFICIENTE EN LAS PROTEASAS A Y B.
Description
Procedimiento para la obtención de proteínas o
productos génicos que contienen proteínas.
La invención se refiere a una procedimiento para
la obtención de proteínas o productos génicos que contienen
proteínas por medio de métodos de tecnología génica, mediante la
transformación de células hospedadoras eucarióticas con una molécula
de ADN recombinante que contiene el gen para la proteína deseada,
cultivo de las células resultantes y aislamiento del producto génico
mediante métodos ya conocidos.
La determinación de parámetros
clínico-químicos tiene lugar hoy en día en gran
extensión mediante métodos enzimáticos. La enzimas utilizadas para
la obtención de los reactivos necesarios para ello, se obtienen a
partir de diferentes fuentes de origen vegetal o animal o a partir
de microorganismos.
Para la obtención de enzimas y otras proteínas,
los microorganismos ganan una creciente importancia puesto que
solamente éstos pueden estar disponibles prácticamente en cualquier
cantidad mediante fermentación, con lo cual es posible aislar
grandes cantidades de proteína. Una especial significación tienen a
este respecto las levaduras conocidas como p. ej., el
Saccharomyces cerevisae, puesto que en estos organismos la
expresión homóloga de proteínas es igualmente posible como la
expresión heteróloga eucariótica, p. ej., de proteínas
terapéuticamente importantes. En el E. coli por el contrario,
el organismo anfitrión más a menudo utilizado, muchas proteínas
expresadas heterólogamente se diferencian de sus equivalentes
expresadas naturalmente en un sistema homólogo, y son biológicamente
no activas o dan como resultado unos agregados proteínicos
insolubles inactivos, llamados "cuerpos refráctiles". Muchas
proteínas eucarióticas que se expresan inactivamente en E.
coli, se expresan en el S. cerevisiae en forma soluble y
activa [Biotechnology and Genetic Engineering Reviews ("Revista de
Biotecnología e Ingeniería Genética") 3 (1985)
377-416]. Esto puede estar condicionado entre otras
cosas a que las levaduras mediante los sistemas de modificación
posttranslacionales típicos eucarióticos, como p. ej., el "plegado
de las proteínas", la maduración de las proteínas, la
glicosilación y la acetilación, de que disponen, sean capaces de la
secreción y formación de puentes de disulfuro en polipéptidos y
proteínas. Además las levaduras no son patógenas y al contrario del
E. coli están exentas de toxinas y pirógenos componentes de
la pared celular.
La levadura es uno de los más antiguos organismos
de cultivo de la humanidad. Fue utilizada y lo será siempre
principalmente para la fermentación alcohólica (vino, cerveza, etc.)
y como "auxiliar para la cocción" en la preparación de pastas
alimenticias. Además, la levadura ha alcanzado importancia
industrial como fuente de materia prima barata para el aislamiento
de substancias de peso molecular pequeño como p. ej., NAD, ATP y
glutatión y substancias de gran peso molecular como p. ej., ADN, ARN
y principalmente de enzimas, como p. ej.,
alcohol-deshidrogenasa,
aldehido-deshidrogenasa,
acetil-CoA-sintetasa,
\alpha-glucosidasa,
glicerinaldehido-3-fosfatodeshidrogenasa,
glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
y hexoquinasa. La levadura es fácil de cultivar y debido a las
experiencias de muchos años, fácil de fermentar a escala de
industrial. La levadura, un unicelular que figura entre los
eucariotas más pequeños, posee las características típicas de un
eucariota, pero en cambio es fácilmente accesible a las
investigaciones genéticas y manipulaciones genéticas, por lo cual es
particularmente apropiado como organismo hospedador en vistas a la
tecnología del ADN recombinante, es decir para la expresión homóloga
y heteróloga de polipéptidos y proteínas biológicamente activos.
En muchos casos sin embargo, la cantidad de
proteína formada en la expresión de proteínas en la levadura, no es
suficiente. A menudo ocurre que después de alcanzar la fase temprana
de cultivo estacionario, la actividad específica de una proteína
deseada en el curso de la fase de cultivo estacionario, desciende de
nuevo, aunque la biomasa de microorganismos formada todavía aumenta.
Esto se atribuye principalmente a un ataque proteolítico de las
proteasas específicas del hospedador contra las proteínas
formadas.
Un objetivo de la presente invención es por lo
tanto la puesta a punto de un procedimiento para la obtención de
proteínas por medio de métodos de tecnología génica, con los cuales
se puedan formar y acumular establemente proteínas también en la
fase estacionaria de cultivo, y con ello pueda aumentarse el
rendimiento del procedimiento de fermentación.
Este objetivo se consigue según la invención
mediante un procedimiento para la obtención de proteínas o productos
génicos que contienen proteínas, mediante la transformación de
células hospedadoras eucarióticas con una molécula de ADN
recombinante que contiene el gen para la proteína deseada, cultivo
de las células y aislamiento del producto génico después de la
expresión, el cual procedimiento se caracteriza porque como células
hospedadoras se emplea una cepa de levaduras que en la fase de
cultivo estacionario es deficiente en las proteasas A y B.
Se prefiere la cepa de levaduras que además, es
deficiente en la proteasa D.
En otra forma de ejecución preferida se emplea
una cepa de levaduras, la cual además de las deficiencias en las
proteasas A, B y eventualmente D, es deficiente por lo menos en una
de las carboxipeptidasas Y y S. La denominación de las proteasas y
carboxipeptidasas en la presente solicitud de patente corresponde a
la denominación empleada en Yeast ("Levaduras") 1 (1985)
139-154.
Mediante el empleo de estas cepas de levaduras
deficientes en proteasas en el procedimiento según la invención, es
posible obtener en las levaduras proteínas o productos génicos que
contienen proteínas, con elevados rendimientos, sin que tenga lugar,
ni en los tiempos de fermentación extremadamente largos ni en el
aislamiento subsiguiente según métodos de por sí ya conocidos, un
ataque proteolítico y con ello una inactivación de las
proteínas.
En una forma de ejecución particularmente
preferida de la invención, se emplea como células hospedadoras la
cepa ABYSD-11,DSM 4322. Esta cepa hospedadora es
deficiente respecto a las proteasas A, B, D y a las
carboxipeptidasas Y y S. Adicionalmente, presenta auxotrofía en la
biosíntesis de la adenina, histidina y lisina. La auxotrofía
representa la incapacidad de los microorganismos (la mayor parte
mutantes de bacterias o de levaduras) de poder sintetizar
determinados factores de crecimiento, como p. ej., aminoácidos a
partir de sencillos precursores. Al contrario de las
correspondientes cepas de tipo salvaje, los mutantes auxotrofos no
crecen por esta razón en los llamados medios mínimos. En su lugar
necesitan un medio completo, que contenga los componentes necesarios
para el crecimiento que no pueden sintetizar por si mismos. Los
microorganismos pueden ser auxotrofos para un factor de crecimiento
pero también para varios (E.-L. Winnacker, Gene und Klone ("Genes
y clones"), 1985, editorial Chemie, apéndice C).
En otra versión preferida de la invención se
cruzan las cepas de levaduras deficientes en proteasas con otra cepa
de levaduras auxotrofas o/y sensibles a substancias químicas, se
aíslan después de la esporulación mediante selección por auxotrofía
o/y sensibilidad de las cepas híbridas aparecidas, para obtener una
cepa de levaduras la cual por lo menos es deficiente a las proteasas
A y B y por lo menos presenta una de las auxotrofías o/y
sensibilidad a las substancias químicas de las cepas madre, y estas
cepas híbridas son las que se emplean como células hospedadoras.
Con la expresión sensibilidad a las substancias
químicas, se entiende la incapacidad de un microorganismo de crecer
en un medio que contiene determinadas substancias químicas, p. ej.,
metotrexato, cloranfenicol y el derivado de gentamicina G418.
Solamente después de la transformación del microorganismo con un ADN
recombinante que contiene un gen que comunica resistencia contra
estas substancias químicas (deshidrofolatoreductasa, DHFR;
cloranfenicol-acetiltransfe-rasa,
CAT; transposón Tn601,
aminoglicósido-fosfotransferasa codificada por el
transposón Tn601, etc.) puede crecer el microorganismo en el medio.
El cruce y la esporulación pueden por ejemplo efectuarse
análogamente a Sherman y col., Methods in Yeast Genetics ("Métodos
en Genética de Levaduras"), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, Nueva York, 1984. En una forma de ejecución
particularmente preferida de la invención se cruza la cepa de
levadura ABYSD-11,DSM 4322, (a pra1,
prb1, prc1, prd1, cps1 ,ade
lys his 7), o bien con la cepa de levadura
TCY2824-1A (\alpha
mal1S-\Delta ura3-52 his4),
DSM 4317, ó bien con DBY 746, DSM 4316, (\alpha
his3-\Delta1 leu2-3
leu2-112 ura3-52
trp1-289a), las cuales presentan un gen
defectuoso de la estructura de la maltasa y auxotrofías en la ruta
de la biosíntesis del uracilo e histidina o respectivamente
auxotrofía en la ruta de la biosíntesis de la histidina, leucina,
uracilo y triptófano. De preferencia se aíslan a continuación las
cepas híbridas, que son deficientes en las proteasas A, B y
eventualmente D, y en las carboxipeptidasas Y y S, y presentan
además por lo menos una o respectivamente varias auxotrofías como p.
ej., las auxotrofías de uracilo, lisina y de utilización de la
maltasa, o las auxotrofías de leucina y triptófano, o finalmente las
auxotrofías de leucina, uracilo e histidina de las cepas madre.
En otra forma de ejecución preferida de la
invención la molécula recombinante de ADN contiene además del gen
para la proteína deseada o para el producto génico que contiene
proteínas deseadas, uno o varios genes, los cuales complementan las
auxotrofías o/y sensibilidades químicas de la cepa hospedadora.
Mediante la forma de ejecución preferida de la
invención se hace posible una sencilla diferenciación de las células
hospedadoras transformadas y no transformadas. La presencia y
expresión de genes que complementan una o varias de las auxotrofías
o/y sensibilidades a los productos químicos de la cepa hospedadora,
hace posible en efecto que las células transformadas puedan crecer
también en medios que por ejemplo no contienen un aminoácido el cual
la célula hospedadora no puede sintetizar por ella misma, cuyo gen
sin embargo está presente en la molécula de ADN recombinante. Las
cepas hospedadoras no transformadas que no presentan pues la
molécula de ADN recombinante y el gen complementario de la
auxotrofía obtenida a continuación, pueden no crecer por el
contrario en un medio de esta clase. Con ello puede efectuarse de
manera sencilla una selección de células hospedadoras transformadas,
con lo cual se evita también el peligro de una pérdida del ADN
recombinante que contiene el gen de la proteína deseada, durante la
fermentación, puesto que no existe ninguna ventaja a favor del
crecimiento de las células no transformadas.
Alternativamente es también posible vencer la
auxotrofía o/y la sensibilidad a las substancias químicas de una
cepa hospedadora mediante la aplicación de otra molécula adicional
de ADN recombinante, la cual contiene uno o más genes, la cual
complementa las auxotrofías o respectivamente las sensibilidades a
las substancias químicas de las células hospedadoras. Con ello se
tiene una posibilidad sencilla de seleccionar las células
hospedadoras que contienen el gen para el producto deseado.
Para la molécula de ADN recombinante entran en
consideración todas las moléculas de ADN recombinante con las cuales
pueden ser transformadas las células de levaduras, y que son capaces
para la expresión de un gen externo. Con ello entra en consideración
no solamente la transcripción extra cromosomática por ejemplo, de un
plásmido, sino que también es posible incluir el gen para la
proteína deseada mediante un vector de integración o un fragmento de
ADN a integrar, el cual contiene cada vez un cassette completo de
expresión (promotor, terminador, regulador, reforzador de la
transcripción, entre otros), en el genoma de la levadura y
expresarlo juntamente con las proteínas propias de la levadura.
Condición previa para ello es la presencia de homologías en la
molécula de ADN recombinante y las secuencias cromosómicas de la
levadura. Por medio de estas regiones homólogas puede incluirse un
fragmento de ADN a integrar según métodos de por sí ya conocidos, en
el cromosoma de la levadura.
En otra forma de ejecución preferida de la
invención, la molécula de ADN recombinante es o bien un plásmido, o
un vector de integración o un fragmento de ADN a integrar. Como
plásmidos son de nuevo particularmente preferidas los plásmidos de
levaduras, que existen en alto número de copias en las células.
Estos plásmidos de levaduras son por ejemplo híbridos
levadura/vectores de E. coli ("vectores lanzadera") los
cuales reciben el nombre de YRp, YEp, YIp y YCp. En un gran número
de copias se encuentran en las células solamente los plásmidos YEp e
YRp. Esto es debido a la presencia de secuencias que permiten una
replicación autónoma de los plásmidos independientemente de la
replicación del cromosoma de la levadura y están presentes
normalmente en un número de piezas de 5 a 40 copias por célula. Los
plásmidos YIp pueden solamente ser llevados a la expresión mediante
la integración en el genoma de la levadura. Por ello constituyen un
modelo para construir vectores de integración. Los plásmidos YIp
presentan una proporción de transformación diez veces más pequeña
aunque tienen una estabilidad significativamente mayor en
comparación con los plásmidos YRp y YEp. Los plásmidos YRp y YEp
pueden perderse en la proliferación de las células sin la presión de
la selección (Nature 305 (1983) 391-397).
Dicha presión de selección consiste, en la forma preferida de
ejecución de la invención, en que la fermentación se efectúe a
partir de cepas hospedadoras auxotrofas o sensibles a las
substancias químicas en medios mínimos, o medios que contienen unas
determinadas substancias químicas para las cuales la cepa
hospedadora es sensible, y el ADN recombinante presente
adicionalmente uno o más genes, que complementan la auxotrofía o la
sensibilidad.
La presente invención permite la expresión de
proteínas homólogas o heterólogas o productos génicos que contienen
proteínas, con un alto rendimiento y forma proteolítica no atacada,
por lo que puede efectuarse de una manera sencilla también la
selección de células transformadas, y con ello también una elevación
del rendimiento del producto génico deseado. Igualmente, en la
expulsión de la masa celular y en los otros procedimientos para la
obtención del producto génico mediante métodos de por sí ya
conocidos, no tiene lugar el ataque proteolítico sobre el producto
formado debido a la deficiencia en proteasas de las células
hospedadoras.
En una forma de ejecución preferida de la
invención, se obtiene la proteína alfa-glucosidasa
PI (ver también el ejemplo 4).
Los siguientes ejemplo aclararán más la
invención:
Para la obtención de la cepa de
Saccharomyces ABYSMAL81 y ABYSDMAL81 se cruzó el haploide
cepa de Saccharomyces cerevisae ABYSD-11
(a pra1 prb1 prc1 prd1,
cps1, ade lys his7), DSM 4322, la cual
es deficiente respecto a las proteasas A, B y D y las
carboxipeptidasas Y y S, y además posee una auxotrofía en la
biosíntesis de la adenina, histidina y lisina, con la cepa
Saccharomyces carlsbergensis, TCY2824-1A,
(\alpha mal1S-\Delta
ura3-52 his4), DSM 4317, la cual se
caracteriza por un gen estructural defectuoso de la \alpha -
glucosidasa y por una auxotrofía en la biosíntesis del uracilo y la
histidina.
A continuación se efectuó una esporulación y se
comprobó la auxotrofía de los segregados de levadura aparecidos
mediante plaqueado con diferentes medios de selección, y también las
deficiencias en proteasas, mediante la determinación de las
actividades de proteasa en los lisados celulares. Fueron
identificadas las cepas ABYSDMAL81 (ura3-52
ma1S-\Delta lys pra1
prb1 prc1 prd1 cps1) y ABYSMAL81
(ura3-52
mal1S-\Delta lys pra1
prb1 prc1 cps1).
Los segregantes fueron fijados en 5 ml del medio
YEPD (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa), se
cosecharon las células en la fase logarítmica tardía hasta la fase
estacionaria temprana, se lavaron dos veces con agua y se
desagregaron con perlas de vidrio mediante homogeneización en un
mezclador rotativo (MGG 145 (1976) 327.333). Las células se
extrajeron con 1 ml de Tris 20 mmoles/l (HCl), de pH 7,0, y se
siguió operando con el sobrenadante como extracto crudo después de
la centrifugación. Para la activación de las proteasas se tituló el
extracto crudo a pH 5,0 y se incubó durante 24 horas a 25ºC.
Ninguna hidrólisis mediante los extractos
celulares de 1,2% de hemoglobina desnaturalizada con ácido, pH 3,0
(Eur. J. Biochem. 42 (1974) 621-626).
0,5 ml de tampón de lactato 0,1 moles/litro, de
pH 3,0, con 1,2% de hemoglobina desnaturalizada con ácido, se
incubaron con 0,1 ml de lisado de células a 25ºC. Después de 30
minutos la reacción se interrumpió con 0,5 ml de ácido
tricloroacético al 10% y después de centrifugar se determinó los
productos solubles del ácido tricloroacético bien por medición de la
absorción a 280 nm o bien por una determinación modificada de la
folina según McDonald y Chen (Anal. Biochem. 10 (1965)
175-177).
Para el cálculo se la actividad especifica se
efectuó una determinación de proteínas según Zamenhof (Methods
Enzymol. 3 (1957) 702).
Existe una deficiencia en proteasa A, cuando la
actividad hidrolítica específica de los lisados celulares frente a
la hemoglobina desnaturalizada con ácido disminuye a menos del 5% en
comparación con una cepa tipo salvaje.
Ninguna hidrólisis mediante extractos celulares
del 2,4% de AzocoII a pH 7 (Eur. J. Biochem. 42 (1974
621-626).
0,5 ml de una suspensión de AzocoII al 2,4% en
0,1 moles/litro de tampón de fosfato, de pH 7,0, fueron incubados
con 0,1 ml de lisado de células con agitación a 25ºC. Para la
activación de la proteasa B se mezcló el extracto crudo antes de la
determinación de la actividad con dodecilsulfato de sodio
(concentración final 0,25%).
Después de 30 minutos se interrumpió la reacción
mediante la adición de 0,5 ml de ácido tricloroacético al 10%, y
después de una centrifugación se determinó la extinción del
sobrenadante a 550 nm.
Existe una deficiencia en proteasa B cuando la
actividad hidrolítica especifica de los lisados celulares frente al
AzocoII ha disminuído a menos del 5% en comparación con una cepa
tipo salvaje.
Ninguna hidrólisis mediante extractos celulares
de 0,5 mmoles/litro de
Bz-Pro-Phe-Arg-NA
(benzoil-L-propil-L-fenilalanil-L-arginil-p-nitroanilida)
en 50 mmoles/litro de tampón maleato de Tris, de pH 7,0, en
presencia de amino-peptidasa M (J. Biol. Chem. 260
(1985) 4585-4590)
Principio del ensayo:
Se mezclaron 0,03 ml de tampón maleato de Tris de
0,5 moles/litro, pH 7,0, con 0,015 ml de
Bz-Pro-Phe-Arg-NA
de 10 mmoles/litro (disuelto en sulfóxido de dimetilo), 10 \mul
(40 \mug, 249 mU) de aminopeptidasa M, 0,145 ml de agua y 0,1 ml
de extracto crudo, y se determinó la variación de la extinción a 405
nm frente a un valor sin reactivos.
Existe una deficiencia en proteasa D, cuando la
actividad hidrolítica específica frente a
Bz-Pro-Phe-Arg-NA
ha disminuído a menos del 10% en comparación con una cepa tipo
salvaje.
Ninguna hidrólisis mediante extractos celulares
de 0,5 mmoles/litro de
benzoil-L-tirosin-4-nitroanilida,
pH 7 (Agr. Biol. Chem. 35 (1971) 658-666).
0,1 ml con extracto crudo activado con
desoxicolato (concentración final 0,5%) se incubaron con 1 ml de
tampón de fosfato, pH 7,0, de 0,1 moles/litro, y 0,2 ml de
benzoil-L-tirosin-4-nitroanilida
(disuelto en dimetilformamida) de 3 mmoles/litro a 25ºC. Después de
10 minutos se interrumpió la reacción con 1 ml de 1 mmoles/litro de
cloruro de mercurio y se determinó la p-nitroanilina
liberada a 410 nm.
Existe una deficiencia en carboxipeptidasa Y,
cuando la actividad hidrolítica específica frente al
benzoil-L-tirosin-4-nitroanilida
ha disminuído a menos del 5% en comparación con una cepa tipo
salvaje.
Ninguna hidrólisis mediante extractos celulares
de Cbz-Gly-Leu
(benciloxicarbonil-glicil-L-leucina)
a pH 7,4 con el subsiguiente análisis de la leucina liberada en un
ensayo con L-aminoácido
oxidasa-peroxidasa (Eur. J. Biochem 73 (1977)
553-556).
0,5 ml de solución de ensayo (0,25 mg/ml de
L-aminoácido oxidasa, 0,4 mg/ml de Meerrettich
peroxidasa y 0,5 mmoles/litro de MnCl_{2}), 0,4 ml de solución de
Cbz-Gly-Leu (disuelto en 0,2
moles/litro de tampón de fosfato, pH 7,0), de 27,5 mmoles/litro,
0,05 ml de dihidrocloruro de o-dianisidina (2 mg/ml,
disuelto en H_{2}O), 0,05 ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo
de 22 mmoles/litro, y 0,1 ml de lisado celular dializado (diálisis:
0,1 M de cloruro de imidazol, de pH 5,3; 24 horas; 25ºC), se mezcla
y se determina la variación de la extinción a 405 nm.
Existe una deficiencia en carboxipeptidasa Y,
cuando la actividad hidrolítica específica frente al
Cbz-Gly-Leu ha disminuído a menos
del 5% en comparación con una cepa de tipo salvaje.
Como resultado de las comprobaciones descritas,
se constató que la cepa ABYSDMAL81 es deficiente en las proteasas A,
B, D y las carboxipeptidasas Y y S y la cepa ABYSMAL81 es deficiente
en las proteasas A y B y las carboxipeptidasas Y y S.
Ningún crecimiento en el medio sintético completo
I con 0,67% de base nitrogenada de levadura (YNB, sal de mezcla de
vitaminas, Difco), 0,5% ácidos Casamino (CAA, hidrolizado de
proteínas, Difco), 2% de maltosa (única fuente de C), 20 mg/litro de
uracilo y 30 mg/litro se adenina.
Ningún crecimiento en el medio sintético completo
II con 0,67% de YNB, 0,5% de CAA, 2% de glucosa (única fuente de C),
y 30 mg/litro de adenina.
Ningún crecimiento en el medio sintético completo
II con uracilo (20 mg/litro) pero sin lisina (en lugar de 0,5% de
CAA se empleó una mezcla de aminoácidos sin lisina).
Crecimiento en el medio sintético completo II con
uracilo (20 mg/litro) pero sin adenina y sin histidina (en lugar de
0,5% de CAA se utilizó una mezcla de aminoácidos sin histidina).
Ejemplos 2 y
3
Para la obtención de las cepas de
Saccharomyces ABYSD91
(leu2-3,2-112
trp1-289a pra1 prb1 prd1
prc1 cps1), ABYSD106 (ura3-52
leu2-3,2-112 his
pra1 prb1 prd1 prc2 cps1),
ABYS91 (leu2-3,2-112
trp1-289a pra1 prb1 prc1
cps1) y ABYS106 (ura3-52
leu2-3,2-112 his
pra1 prb1 prc1 cps1), se cruzó, como se
ha descrito en el ejemplo 1, la cepa ABYSD-11 del
Saccharomyces cerevisiae con la cepa DBY746,DSM 4316 del
Saccharomyces carlsbergensis. Después de la esporulación se
comprobaron las deficiencias en proteasas y las auxotrofías de los
segregados de las levaduras.
Para ABYS91 y ABYSD91:
Comprobación de las deficiencias en
proteasa
Ver el ejemplo 1
Ningún crecimiento en el medio sintético completo
II con uracilo pero sin leucina o respectivamente triptófano (en
lugar de 0,5% de CAA se empleó una mezcla de aminoácidos sin leucina
o respectivamente triptófano).
Crecimiento en el medio sintético completo II sin
adenina, uracilo, histidina y lisina (en lugar de 0,5% de CAA se
utilizó una mezcla de aminoácidos sin histidina y lisina).
Para ABYS106 y ABYSD106:
Comprobación de las deficiencias en
proteasa
Ver el ejemplo 1
Ningún crecimiento en el medio sintético completo
II.
Ningún crecimiento en el medio sintético completo
II con uracilo pero sin leucina o respectivamente histidina (en
lugar de 0,5% de CAA se utilizó una mezcla de aminoácidos sin
leucina o respectivamente histidina).
\newpage
Crecimiento en el medio sintético completo II con
uracilo pero sin adenina, lisina y triptófano (en lugar de 0,5% de
CAA se utilizó una mezcla de aminoácidos sin lisina y
triptófano).
La cepa de Saccharomyces ABYSMAL81
(ejemplo 1) se transformó con el plásmido YEp/5C6b3 (Nature
275 (1978) 104-109).
Para la obtención de este plásmido se digirió el
vector YRp/GLUPI, DSM 4173P, con las endonucleasas de restricción
SspI y HindIII, se aisló el fragmento SspI/-HindIII de 3,0 kBp de
largo y se ligó al fragmento de vector PvuII/-SpHI aislado de YEp 24
(gen 8 (1979), 17-24; Cold Spring Harbor, Symp.
Quant. Biol. 43 (1979) 77-90; Gene 29 (1984)
113-124; Nature 286 (1980) 860-865)
- después de completar el extremo 5' colgante de la HindIII - y
degradar el extremo 3' colgante del sitio de corte de restricción de
SphI con Klenow-polimerasa. En el plásmido aparecido
YEp/S4 el cassette de expresión de la
\alpha-glucosidasa PI está integrado en una
orientación paralela al gen de la \beta-lactamasa.
A continuación se ligó en el lugar de corte de restricción de la
BamHI del YEp/S4, un fragmento de BamHI de aproximadamente 3,1 kBp
de longitud que contenía el gen MAL2-8^{c}p. A
continuación se digirió el plásmido pRM2, DSM 4314P, con la
endonucleasa de restricción SaII, se completaron los extremos 5'
colgantes con Klenow-polimerasa, se proveyeron de
engarces BamHI (d(CGGGATCCCG), se escindieron finalmente con
BamHI y se aisló el fragmento que contenía el gen
MAL2-8^{c}p de 3,1 kBp de longitud. La
construcción vectorial obtenida recibió el nombre de YEp/5C6b3.
La cepa transformada se trató en un medio YEP (1%
de extracto de levadura, 2% de peptona) con 4% de maltosa y se dejó
crecer hasta la fase tardía logarítmica o respectivamente
estacionaria. A continuación se recogió la biomasa y se lavó con 10
mmoles/litro de tampón de fosfato, pH 6,8. Las células de 5 ml de
medio YEP (aproximadamente 0,1 a 0,2 g de levadura, peso húmedo) se
disgregaron mediante homogeneización con un mezclador con agitación
(MGG 145 (1976) 327-333).
La determinación de la actividad específica de la
\alpha-glucosidasa se efectuó a base de la
hidrólisis de
p-nitrofenil-\alpha-D-glucopiranosido
(MGG 151 (1977) 95-103) y la determinación de la
proteína según Zamenhof (Methods Enzymol. 3 (1957) 702).
El extracto crudo obtenido de esta forma fue
estable a la enzima durante 10 días a 4ºC. Tampoco se encontró
ninguna variación en las bandas de la
SDS-electroforesis durante este período de tiempo.
Esto demuestra que también las otras enzimas y proteínas contenidas
en este sobrenadante son estables en esta cepa de levadura y no se
degradan proteoliticamente de manera visible.
En la tabla I se compara la estabilidad
enzimática de la \alpha-glucosidasa de las
levaduras de pastelería (referidas en Deutsche Hefewerke Nürnberg,
DHW) con la estabilidad de la \alpha-glucosidasa
expresada recombinante en los transformantes de la
\alpha-glucosidasa deficientes en proteasa. En las
levaduras de pastelería la actividad específica de la
\alpha-glucosidasa alcanza un máximo en la fase
tardía de crecimiento logarítmico hasta la fase temprana
estacionaria. En otro desarrollo de la fermentación la actividad
específica de la \alpha-glucosidasa disminuye
ostensiblemente (tabla 1). Por el contrario, sorprendentemente,
incluso después de alcanzar la fase estacionaria de crecimiento se
acumula establemente la \alpha-glucosidasa en
cepas malO transformadas deficientes en proteasa, con lo cual
la fermentación y el trabajo ulterior de la biomasa, se vuelve
esencialmente mas fácil.
Medios de fermentación: levadura de pastelería:
1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de maltosa.
ABYSMAL81: Medio completo sintético II.
Expresión heteróloga de una proteína de fusión,
que consta de la parte N-terminal de la
\alpha-glucosidasa y los antígenos HIV1, en cepas
de levadura deficientes en proteasa.
En el vector de expresión PI de la
\alpha-glucosidasa YEp/5C6b3 (ejemplo 4) se
intercambió el fragmento BgIII de 1,4 KBp de longitud, el cual
codifica aproximadamente el 80% de la
\alpha-glucosidasa PI, por un fragmento de ADN de
aproximadamente 300 Bp de longitud, el cual codifica una parte de la
proteína de membrana gp41 del retrovirus HIV1. Adicionalmente, se
subclonó un fragmento RsaI/HindIII de aproximadamente 300 Bp
(secuencia, ver la secuencia de WMJ-1 de la Pos.
1638 a la Pos. 1943 de la figura 1 de Cell 45 (1986)
637-648 en el vector pUC18 de
E-coli digerido con HincII y HindIII (M13mp18
y pUC19, secuencia en Gene 33 (1985) 103-119)
(construcción: pUC18HRH.300). A partir del pUC18HRH.300 se aisló el
fragmento BamH1/HindIII de aproximadamente 320 Bp de longitud y se
ligó al fragmento de vector pUR278 BamH1/HindIII de aproximadamente
5,2 KBp de longitud (secuencia en EMBO 2 (1983)
1791-1794)(construcción: pUR278HRH.300). El plásmido
pUR278HRH.300 se digirió con HindIII, se completaron los extremos 5'
colgantes con "Klenow polimerasa" y se proveyeron con engarces
BamHI (d(GGGATCCC). A continuación se escindió con BamHI y se
aisló el fragmento BamHI de aproximadamente 300 Bp de longitud, y se
ligó al fragmento de vector YEp/5C6b3 BgIII de aproximadamente 11
KBp de longitud. En la orientación correcta del ADN del polipéptido
de membrana gp41, se forma una proteína de fusión, compuesta del
terminal N de la \alpha-glucosidasa (50
aminoácidos), 4 aminoácidos dependientes de la construcción en el
lugar de la fusión, 101 aminoácidos de la proteína de membrana gp41,
y 3 aminoácidos dependientes de la construcción en el terminal C con
un peso molecular de aproximadamente 18500 D. La construcción
deseada se aisló mediante la proteína de fusión expresada en la cepa
de expresión de levadura deficiente en proteasa ABYSMAL81 después de
la transformación y desarrollo (ver más adelante), seguido de
SDS-electroforesis sobre gel y Westernblot en virtud
de la reactividad inmunológica con sueros HIV1 humanos. La proteína
de fusión se expresó en aproximadamente el 5% del total de la
proteína y apareció como una banda dominante en el gel de
SDS-poliacrilamida después de la tintura con
Coomassie.
Para la expresión de la proteína de fusión
\alpha-Gluc.PI-gp41 se trataron
los transformantes en el medio selectivo (0,67% de YNB, 0,5% de CAA,
30 mg/litro de adenina), con 2% de glucosa y 2% de maltosa. Después
de una fase de inducción de 10 a 20 horas (según el consumo de
glucosa) se recogieron las células.
(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (10)
1. Procedimiento para la obtención de proteínas o
productos génicos que contienen proteínas, mediante la
transformación de células eucarióticas hospedadoras con una molécula
de ADN recombinante que contiene el gen para la proteína deseada,
cultivo de las células y aislamiento del producto génico después de
la expresión, caracterizado porque como células hospedadoras
se utiliza una cepa de levaduras, que en la fase de cultivo
estacionario es deficiente en las proteasas A y B.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la cepa de levaduras es también
deficiente en la proteasa D.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque la cepa de levaduras es también
deficiente en las carboxipeptidasas Y, o/y S.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque se utiliza la cepa de levaduras
ABYSD-11,DSM 4322.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la cepa de
levaduras deficiente en proteasa se cruza con otra cepa de levaduras
auxotrofas o/y sensibles a substancias químicas, después de la
esporulación y selección de las cepas híbridas formadas, se aisla
una cepa de levaduras por medio de la auxotrofía o/y la sensibilidad
a substancias químicas, la cual por lo menos es deficiente en las
proteasas A y B y presenta por lo menos una de las auxotrofías o/y
sensibilidades a substancias químicas de las cepas originales y se
utiliza esta cepa de levaduras como células hospedadoras.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque se cruza la cepa de levaduras
ABYSD-11, DSM 4322 con la cepa
TCY2824-1A,DSM 4317 ó DBY746,DSM 4316, formando una
cepa que es deficiente en las proteasas A y B y las
carboxipeptidasas Y y S y eventualmente en la proteasa D, así como
presenta auxotrofías de utilización del uracilo, lisina y maltosa,
presenta auxotrofía de las cepas originales a la lecitina y el
triptófano o a la leucina, uracilo e histidina, se aísla y se emplea
como célula hospedadora.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque se emplea una
molécula de ADN recombinante, que contiene adicionalmente uno o
varios genes, la cual complementa las auxotrofías o/y sensibilidades
a substancias químicas de la cepa hospedadora.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque como molécula de
ADN recombinante, se emplea un plásmido, un vector de integración o
un fragmento de ADN integrador.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque la molécula de ADN recombinante, es un
plásmido de levadura que se encuentra en la célula en un alto número
de copias.
10. Cepa de levaduras que en la fase estacionaria
de crecimiento es deficiente en las proteasas A y B.
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