JP2020518264A - 高強度の甘味料の製造方法 - Google Patents

高強度の甘味料の製造方法 Download PDF

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Abstract

本明細書では、モグロシド化合物、例えば、化合物１の産生方法、モグロシド化合物を産生するための組成物（例えば、宿主細胞）および本明細書に開示された方法によって産生されたモグロシド化合物、ならびにモグロシド化合物（例えば、化合物１）を含む組成物（例えば、細胞溶解物）および組換え細胞が提供される。また、本明細書では、新規ククルビタジエノールシンターゼおよびその使用も提供される。

Description

背景
発明の属する技術分野
本開示は、甘味化合物を製造するための方法、システムおよび組成物、ならびに甘味化合物を含む組成物に関する。
背景の説明
味覚システムは、外界の化学組成に関する感覚情報を提供する。味覚伝達は、動物における化学的に誘発される感覚の最も洗練された形態の１つである。味覚のシグナル伝達は、単純な後生動物から最も複雑な脊椎動物まで、動物界全体で見られる。哺乳類には、５つの基本的な味覚様式：甘い、苦い、酸っぱい、塩辛いおよびうま味（グルタミン酸ナトリウムの味、別名、風味）があると考えられている。
何世紀にもわたって、様々な天然および非天然組成物および／または化合物が、食品および飲料を含む摂取可能な組成物および／または経口的に投与される医薬組成物に添加され、それらの味を改善している。「味」の基本的なタイプはごく少数であることが長い間知られていたが、味覚の生物学的および生化学的基礎はほとんど理解されておらず、ほとんどの味覚改善剤または味覚修飾剤は、主に単純な試行錯誤プロセスによって発見された。
甘味に関して、糖尿病および心血管疾患は、世界的に増加している健康上の懸念であるが、米国では驚くべき速度で成長している。砂糖およびカロリーは、健康にプラスの栄養効果を与えるために制限できる重要な要素である。高強度甘味料は、さまざまな味質の砂糖の甘さを提供できる。これらは、砂糖よりも何倍も甘いので、砂糖を置き換えるのに必要な甘味料ははるかに少ない。
高強度甘味料は、広範囲の化学的に異なる構造を有し、したがって、様々な特性、例えば、これに限定されないが、匂い、フレーバー、口当たりおよび後味を有する。これらの特性、特にフレーバーおよび後味は、試飲の時間の経過とともに変化することがよく知られており、各時間プロファイルは、甘味料固有のものである。
例えば、スクロース、フルクトース、グルコース、エリスリトール、イソマルト、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトールなどの甘味料、特定の既知の天然テルペノイド、フラボノイドまたはタンパク質甘味料などの有用な天然の香味剤を特定することにおいて、近年、著しい進展があった。例えば、Kinghomら、“Noncariogenic Intense Natural Sweeteners,” Med. Res. Rev. 18 (5) 347〜360頁 (1998年)（スクロース、フルクトースなどの一般的な天然甘味料よりもはるかに強い発見された天然素材について説明）を参照されたい。同様に、アスパルテーム、サッカリン、アセスルファム−Ｋ、シクラメート、スクラロースなどの新しい人工甘味料の特定および商品化に、近年、進展があった。例えば、Agerら、Angew. Chem. Int. Ed. 37, 1802〜1817頁 （1998年)を参照されたい。上記で特定された参考文献の内容全体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
サッカリンおよび６−メチル−１，２，３−オキサチアジン−４（３Ｈ）−オン−２，２−ジオキシドカリウム塩（アセスルファムカリウム）などの甘味料は、一般に、苦味および／または金属の後味を有すると特徴付けられている。２，４−ジヒドロキシ安息香酸で調製された製品では、甘味料に付随する望ましくない後味が低減されており、さらに、それらの味が知覚できる濃度よりも低い濃度で低減されていることが特許請求されている。また、スクラロースやアスパルテームなどの高強度甘味料には、甘味の送達の問題、すなわち、甘味の開始の遅れと長引くことが報告されている。S. G. Wietら、J. Food Sci. , 58(3) : 599〜602頁, 666頁（1993年）を参照されたい。
新しい甘味化合物、甘味増強剤、ならびにかかる化合物および増強剤を含み、かつ味および送達特性が改善された組成物が必要である。さらに、かかる望ましい特性を有する新しい甘味化合物および／または甘味増強剤を含む食品が必要である。
発明の概要
本明細書では、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１の産生方法が提供される。
いくつかの実施形態では、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、モグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な第１の酵素と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、モグロシドＩＩＩＥを第１の酵素と接触させることは、モグロシドＩＩＩＥを第１の酵素をコードする第１の遺伝子を含む組換え宿主細胞と接触させることを含む。第１の遺伝子は、例えば、組換え宿主細胞に対して異種であり得る。
いくつかの実施形態では、モグロシドＩＩＩＥは、第１の酵素をコードする第１のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞内の第１の酵素と接触する。モグロシドＩＩＩＥは、例えば、組換え細胞に供給され得るか、組換え宿主細胞に存在し得るか、組換え宿主細胞により産生され得るかまたはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、この方法は、第１の酵素が発現される条件下で、培養培地中で組換え宿主細胞を培養することを含む。第１の酵素は、例えば、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上であり得る。
いくつかの実施形態では、第１の酵素は、ＣＧＴアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＧＴアーゼは、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４のいずれか１つの配列と、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＧＴアーゼは、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＧＴアーゼは、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４のアミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、第１の酵素は、デキストランスクラーゼである。例えば、デキストランスクラーゼは、配列番号２、１０３、１０６〜１１０、１５６、１５９〜１６２および８９６に記載された配列のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号１０４、１０５、１５７、１５８および８９５のいずれか１つと、少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、第１の酵素は、トランスグルコシダーゼである。例えば、トランスグルコシダーゼは、配列番号１６３〜２９１および７２３のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号１６３〜２９１および７２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の酵素は、ベータグルコシダーゼである。例えば、ベータグルコシダーゼは、配列番号１０２、２９２、３５４〜３７４および６７８〜７４１のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、この方法は、モグロシドＩＩＡを、モグロシドＩＩＡからのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な酵素と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、モグロシドＩＩＡを酵素と接触させることは、モグロシドＩＩＡを組換え宿主細胞と接触させてモグロシドＩＩＩＥを産生することを含み、ここで、組換え宿主細胞は、モグロシドＩＩＡからのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な酵素をコードする遺伝子を含む。モグロシドＩＩＡは、例えば、組換え宿主細胞に供給され得るか、組換え宿主細胞により産生され得るか、組換え宿主細胞に存在し得るかまたはそれらの任意の組み合わせであり得る。モグロシドＩＩＡからモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な酵素は、例えば、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上であり得る。
いくつかの実施形態では、第２の酵素は、ウリジンジホスフェート−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）である。例えば、ＵＧＴは、ＵＧＴ７３Ｃ３（配列番号４）、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号５）、ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号６）、ＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号７）、ＵＧＴ７３Ｅ１（配列番号８）、ＵＧＴ９８（配列番号９または４０７）、ＵＧＴ１５７６（配列番号１５）、ＵＧＴ ＳＫ９８（配列番号１６）、ＵＧＴ４３０（配列番号１７）、ＵＧＴ１６９７（配列番号１８）、ＵＧＴ１１７８９（配列番号１９）であり得る。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、配列番号４〜９、１５〜１９、１２５、１２６、１２８、１２９、２９３〜３０７、４０７、４０９、４１１、４１３、４３９、４４１および４４４のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、ＵＧＴ１４９５（配列番号１０）、ＵＧＴ１８１７（配列番号１１）、ＵＧＴ５９１４（配列番号１２）、ＵＧＴ８４６８（配列番号１３）、ＵＧＴ１０３９１（配列番号１４）、配列番号１１６〜１２４、１２７、１３０、４０８、４１０、４１２、４１４、４４０、４４２、４４３および４４５に記載された配列のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、この方法は、モグロールを、モグロールからのモグロシドＩＩＩＥおよび／またはＩＩＥの産生を触媒することが可能な１種以上の酵素と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、モグロールを１種以上の酵素と接触させることは、モグロールを組換え宿主細胞と接触させてモグロシドＩＩＩＥおよび／またはモグロシドＩＩＥを産生することを含み、ここで、組換え宿主細胞は、モグロールからのモグロシドＩＩＩＥおよび／またはモグロシドＩＩＥの産生を触媒することが可能な１種以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子を含む。モグロールは、例えば、組換え宿主細胞に供給され得るか、組換え宿主細胞により産生され得るか、組換え宿主細胞に存在し得るかまたはそれらの任意の組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、モグロールからのモグロシドＩＩＥおよび／またはモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な１種以上の酵素のうちの少なくとも１種は、配列番号３１５、３１６、４２０、４２２、４２４、４２６、４３０、４３１、４４６、８７１、８４５〜９４９および９５１〜１０１２に記載された配列のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、配列を含むかまたは上記配列のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、モグロールからのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な１種以上の酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を含む。いくつかの実施形態では、１種以上の酵素のうちの少なくとも１種は、ウリジンジホスフェート−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）である。例えば、ＵＧＴは、ＵＧＴ７３Ｃ３、ＵＧＴ７３Ｃ６、８５Ｃ２、ＵＧＴ７３Ｃ５、ＵＧＴ７３Ｅ１、ＵＧＴ９８、ＵＧＴ１４９５、ＵＧＴ１８１７、ＵＧＴ５９１４、ＵＧＴ８４６８、ＵＧＴ１０３９１、ＵＧＴ１５７６、ＵＧＴ ＳＫ９８、ＵＧＴ４３０、ＵＧＴ１６９７またはＵＧＴ１１７８９であり得るかまたは配列番号４〜９、１５〜１９、１２５、１２６、１２８、１２９、２９３〜３０７、４０５、４０６、４０７、４０９、４１１、４１３、４３９、４４１および４４４のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、モグロシド化合物を、モグロシド化合物からのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な１種以上の酵素と接触させてモグロシドＩＩＩＥを産生することを含み、ここで、モグロシド化合物は、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＶおよびシアメノシドのうちの１種以上である。いくつかの実施形態では、モグロシド化合物を、モグロシド化合物からのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な１種以上の酵素と接触させることは、モグロシド化合物を、組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、モグロシド化合物からのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な１種以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子を含む。モグロシド化合物は、例えば、組換え宿主細胞に供給され、組換え宿主細胞により産生され、組換え宿主細胞に存在し、かつそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、モグロシド化合物からのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な１種以上の酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を含む。いくつかの実施形態では、モグロシド化合物は、モグロシドＩＩＥである。
いくつかの実施形態では、モグロシド化合物からのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な１種以上の酵素は、配列番号１、３、７８〜１０１、１０６〜１０９、１４７、１５４、１６３〜３０３、４０５、４１１、３５４〜４０５、４４７〜７２３、７７０、７７６および７８２のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、モグロシド化合物は、モグロシドＩＩＡまたはモグロシドＩＩＥである。いくつかの実施形態では、１種以上の酵素と接触させることにより、モグロシドＩＩＩＡ、モグロシドＩＶＥおよびモグロシドＶのうちの１種以上が産生される。
いくつかの実施形態では、１種以上の酵素は、配列番号３０４、４０５、４１１、８７２、８７４、９７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０、８９２、８９４および８９６のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、１種以上の酵素は、配列番号３０５、４０６、４１２、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９、８９１、８９３および８９５のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、この方法は、モグロシドＩＡ１を組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８酵素をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８酵素は、配列番号９、４０７、１６または３０６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ９８は、配列番号３０７に記載された配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、接触によって、細胞内でモグロシドＩＩＡが産生される。
いくつかの実施形態では、この方法は、１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールを組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、エポキシドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールは、組換え宿主細胞に供給され、組換え宿主細胞に存在し、組換え宿主細胞により産生され、かつそれらの任意の組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、この方法は、１１−ヒドロキシククルビタジエノールを組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、シトクロムＰ４５０またはエポキシドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含む。１１−ヒドロキシククルビタジエノールは、組換え宿主細胞に提供され、組換え宿主細胞によって産生され、かつ／または組換え宿主細胞に存在し得る。
いくつかの実施形態では、この方法は、３，２４，２５−トリヒドロキシククルビタジエノールを組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、シトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、３，２４，２５−トリヒドロキシククルビタジエノールは、組換え宿主細胞に供給されるか、組換え宿主細胞に存在するか、組換え宿主細胞により産生されるかまたはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、接触によって、組換え宿主細胞内でモグロールが産生される。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０は、配列番号２０、４９、３０８、３１５、４３０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８８９および８９２のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含むか；またはシトクロムＰ４５０は、配列番号３１〜４８、３１６、４３１、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８９０および８９１のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、エポキシドヒドロラーゼは、配列番号２１〜３０および３０９〜３１４のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含むか、またはエポキシドヒドロラーゼは、配列番号１１４および１１５のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、この方法は、ククルビタジエノールを組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、シトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、接触によって、１１−ヒドロキシククルビタジエノールが産生される。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールは、組換え宿主細胞に供給され、組換え宿主細胞によって産生され、かつ／または組換え宿主細胞に存在する。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０は、配列番号３１〜４８、３１６、４３１、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９および８９２のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０は、配列番号２０、３１、４９、３０８、３１５、４３０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０および８９１と、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、２，３−オキシドスクアレン、ジオキシドスクアレンおよびジエポキシスクアレンのうちの１種以上を、組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、中間モグロシドを組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、ククルビタジエノールシンターゼに融合した１つ以上の融合ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ククルビタジエノールシンターゼのＮ末端、Ｃ末端またはその双方に融合した融合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ドメインは、約３〜約１０００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、融合ドメインは、約５〜約５０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、融合ドメインは、機能性タンパク質の配列の実質的な部分または配列全体である。
いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有する融合ポリペプチドは、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７〜３３３、４１７、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４または９０６と、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３および９０５と、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、接触によって、ククルビタジエノールが産生される。いくつかの実施形態では、２，３−オキシドスクアレンおよびジエポキシスクアレンが、組換え宿主細胞に供給され、組換え宿主細胞によって産生され、かつ／または組換え宿主細胞に存在する。いくつかの実施形態では、２，３−オキシドスクアレンおよびジエポキシスクアレンのうちの１種以上は、配列番号８９８または９００と、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、配列を含む酵素によって産生される。いくつかの実施形態では、２，３−オキシドスクアレン、ジエポキシスクアレンおよびジエポキシスクアレンのうちの１種以上の産生物は、配列番号８９７または８９９と、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列によってコードされる酵素を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４および９０６のいずれか１つと、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼ活性を含むポリペプチドは、配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３および９０５のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列を含む遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態では、１１−ヒドロキシククルビタジエノールは、組換え宿主細胞に供給され、組換え宿主細胞によって産生され、かつ／または組換え宿主細胞に存在する。いくつかの実施形態では、１１−ヒドロキシククルビタジエノールは、ＣＹＰ８７Ｄ１８および／またはＳｇＣＰＲタンパク質をコードする遺伝子を含む細胞（例えば、組換え宿主細胞）で発現される。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ８７Ｄ１８またはＳｇＣＰＲタンパク質は、配列番号８７１または８７３と、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ８７Ｄ１８またはＳｇＣＰＲタンパク質は、配列番号８７１または８７３と、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、この方法は、スクアレンを組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、スクアレンエポキシダーゼをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、接触によって、２，３−オキシドスクアレンが産生される。いくつかの実施形態では、スクアレンは、組換え宿主細胞に供給され、組換え宿主細胞によって産生され、かつ／または組換え宿主細胞に存在する。いくつかの実施形態では、スクアレンエポキシダーゼは、配列番号５０〜５６、６０、６１、３３４または３３５のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スクアレンエポキシダーゼは、配列番号３３５と、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、この方法は、ファルネシルピロリン酸を、組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、スクアレンシンターゼをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、接触によって、スクアレンが産生される。いくつかの実施形態では、ファルネシルピロリン酸は、組換え宿主細胞に供給され、組換え宿主細胞によって産生され、かつ／または組換え宿主細胞に存在する。いくつかの実施形態では、スクアレンシンターゼは、配列番号６９および３３６のいずれか１つと、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スクアレンシンターゼは、配列番号３３７と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列を含む配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、この方法は、ゲラニル−ＰＰを、組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、ファルネシル−ＰＰシンターゼをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、接触によって、ファルネシル−ＰＰが産生される。いくつかの実施形態では、ゲラニル−ＰＰは、組換え宿主細胞に供給され、組換え宿主細胞によって産生され、かつ／または組換え宿主細胞に存在する。いくつかの実施形態では、ファルネシル−ＰＰシンターゼは、配列番号３３８と、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ファルネシルＰＰシンターゼは、配列番号３３９と、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、（１）モグロシドＩＩＩＥからの化合物Ｉの産生を触媒することが可能な第１の酵素、（２）モグロシドＩＩＡからのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な酵素、（３）エポキシドヒドロラーゼ、（４）シトクロムＰ４５０、（５）ククルビタジエノールシンターゼ活性を有するポリペプチド、（６）スクアレンエポキシダーゼ、（７）ファルネシルＰＰシンターゼをコードする遺伝子のうちの１つ以上は、異種プロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、異種プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、ヒトベータアクチン、ＣＡＧ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｕｂｉ、Ｔ７、Ｔ７ｌａｃ、Ｓｐ６、ａｒａＢＡＤ、ｔｒｐ、ｌａｃ、Ｐｔａｃ、ｐＬプロモーターまたはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性、抑制性または構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、ピルビン酸、アセチル−ＣｏＡ、クエン酸塩およびＴＣＡサイクル中間体のうちの１種以上の産生は、組換え宿主細胞で上方制御されている。いくつかの実施形態では、サイトゾル局在は、組換え宿主細胞で上方制御されている。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の遺伝子のうちの１つ以上は、２Ａ自己切断ペプチドをコードする少なくとも１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、植物、二枚貝、魚、真菌、細菌または哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、植物は、ラカンカ属（Siraitia）、ツルレイシ属（Momordica）、アマチャヅル属（Gynostemma）、カボチャ属（Cucurbita）、キュウリ属（Cucumis）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、ヨモギ属（Artemisia）、ステビア属（Stevia）、トチバニンジン属（Panax）、ウィザニア属（Withania）、トウダイグサ属（Euphorbia）、ウマゴヤシ属（Medicago）、オリヅルラン属（Chlorophytum）、ウコギ属（Eleutherococcus）、タラノキ属（Aralia）、クワ属（Morus）、ウマゴヤシ属、カバノキ属（Betula）、ゲンゲ属（Astragalus）、ナンヨウアブラギリ属（Jatropha）、ツバキ属（Camellia）、クリタケ属（Hypholoma）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ナス属（Solanum）、コスギラン属（Huperzia）、ワチガイソウ属（Pseudostellaria）、ツナソ属（Corchorus）、キヅタ属（Hedera）、ゼニゴケ属（Marchantia）およびクワ属からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、真菌は、白癬菌、サングハングポルス属（Sanghuangporus）、タイワノフングス属（Taiwanofungus）、シラガニセホウライタケ属（Moniliophthora）、マルソニア属（Marssonina）、ディプロディア属（Diplodia）、シイタケ属（Lentinula）、キサントフィロミセス属（Xanthophyllomyces）、ポコニア属（Pochonia）、コレトトリカム属（Colletotrichum）、ジアポルテ属（Diaporthe）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、コクシジオイデス属（Coccidioides）、ヒストプラズマ属、サングハングポルス属、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、ポコニア属、ペニシリウム属（Penicillium）、スポロトリックス属（Sporothrix）、メタリジウム属（Metarhizium）、アスペルギルス属、ヤロウィア属（Yarrowia）およびリポミセス属（Lipomyces）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、真菌は、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）またはロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporin toruloides）である。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、酵母細胞である。いくつかの実施形態では、酵母は、カンジダ属（Candida）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、サッカロミケス亜門（Saccharomycotina）、タフリナ菌亜門（Taphrinomycotina）、シゾサッカロミセス綱（Schizosaccharomycetes）、コマガタエラ属（Komagataella）、担子菌門（Basidiomycota）、ハラタケ亜門（Agaricomycotina）、シロキクラゲ綱（Tremellomycetes）、サビキン亜門（Pucciniomycotina）、アウレオバシジウム属、コニオカエタ属（Coniochaeta）、ロドスポリジウム属（Rhodosporidium）およびミクロボリオミセテス（Microboryomycetes）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細菌は、フランキア属（Frankia）、アクチノバクテリア（Actinobacteria）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）およびエンテロコッカス属（Enterococcus）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞またはヤロウィア・リポリティカ細胞である。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の遺伝子のうちの１つ以上は、細菌、哺乳動物、植物、真菌および／または昆虫の細胞での発現のためのコドン最適化遺伝子である。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の遺伝子のうちの１つ以上は、コードされた酵素の活性を高める機能的変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞の培養は、培養条件のｐＨ、溶存酸素レベル、窒素レベルまたはそれらの組み合わせについて培養をモニタリングすることを含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、化合物１を単離することを含む。いくつかの実施形態では、化合物１を単離することは、組換え宿主細胞を溶解することおよび／または培地から化合物１を単離することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、化合物１の精製を含む。いくつかの実施形態では、化合物１の精製は、ＨＰＬＣ、固相抽出またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、精製は、組換え宿主細胞を回収すること；上清を保存すること；および組換え宿主細胞を溶解することを含む。いくつかの実施形態では、溶解は、細胞をせん断力または洗剤洗浄に供し、それにより溶解物を得ることを含む。せん断力は、例えば、音波処理法、フレンチプレスセルまたはビーズから生じ得る。いくつかの実施形態では、溶解物は、濾過および精製工程に供される。いくつかの実施形態では、溶解物は、濾過され、固相抽出により精製される。
いくつかの実施形態では、この方法は、第１のモグロシドを１種以上のヒドロラーゼと接触させてモグロシドＩＩＩＥを産生した後に、前記モグロシドＩＩＩＥを第１の酵素と接触させることをさらに含む。ヒドロラーゼは、例えば、β−グルカンヒドロラーゼであり得る。いくつかの実施形態では、ヒドロラーゼは、ＥＸＧ１またはＥＸＧ２である。いくつかの実施形態では、ヒドロラーゼは、配列番号２９２、３６６〜３６８、３７２、３７６〜３９８、４４７〜５２０、５２４〜８４５、１０１３、１０１４および１０２３のいずれか１つと、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のモグロシドは、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、モグロシドＶＩまたはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、第１のモグロシドは、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡまたはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、第１のモグロシドを１種以上のヒドロラーゼと接触させることは、第１のモグロシドを、ヒドロラーゼをコードする遺伝子を含む宿主細胞と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、第１のモグロシドは、ヒドロラーゼをコードする遺伝子と、化合物１の産生を触媒することが可能な酵素をコードする遺伝子とを含む宿主細胞において１種以上のヒドロラーゼと接触する。宿主細胞は、モグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な第１の酵素をコードする第１の遺伝子を含む組換え宿主細胞であり得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、モグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な第１の酵素をコードする第１の遺伝子を含む組換え宿主細胞ではない。いくつかの実施形態では、第１のモグロシドは、宿主細胞に供給され、宿主細胞によって産生され、かつ／または宿主細胞に存在する。ヒドロラーゼをコードする遺伝子は、宿主細胞に対して異種または同種であり得る。いくつかの実施形態では、ヒドロラーゼをコードする遺伝子は、宿主細胞において正常レベルで発現される。いくつかの実施形態では、ヒドロラーゼをコードする遺伝子は、宿主細胞で過剰発現される。
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、シクロアルテノールシンターゼもしくはベータ−アミリンシンターゼなどのオキシドスクアレンシクラーゼまたはシクロアルテノールシンターゼもしくはベータ−アミリンシンターゼなどのオキシドスクアレンシクラーゼをコードする核酸配列を含み、ここで、オキシドスクアレンシクラーゼ、シクロアルテノールシンターゼまたはベータ−アミリンシンターゼは、ククルビタジエノールまたはエポキシククルビタジエノールを産生するように修飾されている。オキシドスクアレンシクラーゼは、例えば、配列番号３４１、３４３および３４６〜３４７のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、配列を含むか、この配列からなる。
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０レダクターゼは、配列番号３１８と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、配列を含むか、この配列からなる。
本明細書では、化合物１の構造
Figure 2020518264
 を有する化合物が開示されており、ここで、前記化合物は、本明細書で開示された方法のいずれかによって産生される。
本明細書では、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１を含む、細胞溶解物が開示されている。
また、本明細書では、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１と、モグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な酵素をコードする遺伝子とを含む組換え細胞が開示されている。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、前記組換え細胞にとって異種遺伝子である。
本明細書では、モグロシドＩＩＩＥからの、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１の産生を触媒することが可能な第１の酵素をコードする第１の遺伝子を含む組換え細胞が開示されている。第１の酵素は、例えば、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上であり得る。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、ＣＧＴアーゼである。例えば、ＣＧＴアーゼは、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４のいずれか１つの配列と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＧＴアーゼは、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれらのアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、デキストランスクラーゼである。例えば、デキストランスクラーゼは、配列番号２、１０３、１０６〜１１０、１５６および８９６に記載された配列のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％またはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号１０４、１０５、１５７、１５８および８９５のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、トランスグルコシダーゼである。トランスグルコシダーゼは、例えば、配列番号１６３〜２９１および７２３のいずれか１つの配列と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号３、９５〜１０２および１６３〜２９１および７２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれらのアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、ベータ−グルコシダーゼである。いくつかの実施形態では、ベータグルコシダーゼは、配列番号１０２、２９２、３５４〜３７６および６７８〜７４１のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞は、ウリジンジホスフェート−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）をコードする第２の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、配列番号４〜９、１５〜１９、１２５、１２６、１２８、１２９、２９３〜３０７、４０７、４０９、４１１、４１３、４３９、４４１および４４４のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、配列番号１１６〜１２４、１２７、１３０、４０８、４１０、４１２、４１４、４４０、４４２、４４３および４４５のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、ＵＧＴ１４９５（配列番号１０）、ＵＧＴ１８１７（配列番号１１）、ＵＧＴ５９１４（配列番号１２）、ＵＧＴ８４６８（配列番号１３）またはＵＧＴ１０３９１（配列番号１４）に記載された配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞は、ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８をコードする第３の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８は、配列番号９、４０７、１６または３０６と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ９８は、配列番号３０７に記載の核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、細胞は、エポキシドヒドロラーゼをコードする第４の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、エポキシドヒドロラーゼは、配列番号２１〜３０および３０９〜３１４のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含むか；または配列番号１１４および１１５のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、細胞は、Ｐ４５０をコードする第５の配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０は、配列番号２０、４９、３０８、３１５、４３０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０および８９１のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含むか；または配列番号３１〜４８、３１６、４３１、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９および８９２のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０は、配列番号３１〜４８、３１６および３１８のいずれか１つに記載された配列を含むかまたはそれらの配列からなる遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態では、細胞は、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする第６の配列を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ククルビタジエノールシンターゼのＮ末端、Ｃ末端またはその双方に融合した１つ以上の融合ドメインを含む。融合ドメインの長さは、例えば、約３〜約１０００アミノ酸長または約５〜約５０アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、融合ドメインは、機能性タンパク質の配列の実質的な部分または配列全体である。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７〜３３３、４１７、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４、９０６、９０６、８５１、８５４、８５６、１０２４、８５９、８６２、８６５、８６７、９１５、９２０、９２４、９２８、９３２、９３６、９４０、９４４、９４８、９５２、９５６、９５９、９６４、９６７、９７１、９７５、９７９、９８３、９８７、９９１、９９５、９９９、１００３、１００７および１０１１のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３および９０５のいずれか１つと、少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、細胞は、スクアレンエポキシダーゼをコードする第７の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、スクアレンエポキシダーゼは、配列番号５０〜５６、６０、６１、３３４および３３５のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スクアレンエポキシダーゼは、配列番号３３５と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、細胞は、スクアレンシンターゼをコードする第８の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、スクアレンシンターゼは、配列番号６９または３３６と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スクアレンシンターゼは、配列番号３３７に記載の核酸配列を含むかまたはそれからなる配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、細胞は、ファルネシル−ＰＰシンターゼをコードする第９の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、ファルネシル−ＰＰシンターゼは、配列番号３３８と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ファルネシルＰＰシンターゼは、配列番号３３９と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物、植物、細菌、真菌または昆虫の細胞である。例えば、細胞は、酵母細胞であり得る。いくつかの実施形態では、酵母は、カンジダ属、サッカロミセス属、サッカロミケス亜門、タフリナ菌亜門、シゾサッカロミセス綱、コマガタエラ属、担子菌門、ハラタケ亜門、シロキクラゲ綱、サビキン亜門（pucciniomycotina）、アウレオバシジウム属、コニオカエタ属およびミクロボリオミセテスから選択される。いくつかの実施形態では、植物は、ラカンカ属、ツルレイシ属、アマチャヅル属、カボチャ属、キュウリ属、シロイヌナズナ属、ヨモギ属、ステビア属、トチバニンジン属、ウィザニア属、トウダイグサ属、ウマゴヤシ属、オリヅルラン属、ウコギ属、タラノキ属、クワ属、ウマゴヤシ属、カバノキ属、ゲンゲ属、ナンヨウアブラギリ属、ツバキ属、クリタケ属、アスペルギルス属、ナス属、コスギラン属、ワチガイソウ属、ツナソ属、キヅタ属、ゼニゴケ属およびクワ属からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、真菌は、白癬菌、サングハングポルス属、タイワノフングス属、シラガニセホウライタケ属、マルソニア属、ディプロディア属、シイタケ属、キサントフィロミセス属、ポコニア属、コレトトリカム属、ジアポルテ属、ヒストプラズマ属、コクシジオイデス属、ヒストプラズマ属、サングハングポルス属、アウレオバシジウム属、ポコニア属、ペニシリウム属、スポロトリックス属およびメタリジウム属から選択される。
いくつかの実施形態では、細胞は、モグロシドＶの加水分解を可能にする少なくとも１種のヒドロラーゼをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、化合物１は、組換え細胞においてヒドロラーゼに対する耐性を示し、ここで、ヒドロラーゼは、モグロシドＶＩ、モグロシドＶ、モグロシドＩＶ〜モグロシドＩＩＩＥを加水分解する能力を示す。
いくつかの実施形態では、組換え細胞は、シクロアルテノールシンターゼまたはベータ−アミリンシンターゼなどのオキシドスクアレンシクラーゼまたはシクロアルテノールシンターゼまたはベータ−アミリンシンターゼなどのオキシドスクアレンシクラーゼをコードする核酸配列を含み、ここで、オキシスクアレンシクラーゼ、シクロアルテノールシンターゼまたはベータ−アミリンシンターゼは、ククルビタジエノールまたはエポキシククルビタジエノールを産生するように修飾されている。
いくつかの実施形態では、オキシドスクアレンシクラーゼは、配列番号３４１、３４３および３４６〜３４７のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０レダクターゼは、シトクロムＰ４５０活性を再生する。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０レダクターゼは、配列番号３１８と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号８９７、８９９、９０９、９１１、９１３、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８７１、８７３、９０１、９０３および９０５のいずれか１つに記載された配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号３１５、３１６、４２０、４２２、４２４、４２６、４３０、４３１、４４６、８７１、８４５〜９４９および９５１〜１０１２に記載された配列を含む酵素を含むかまたはこれらの配列番号のいずれか１つの配列によってコードされている。
いくつかの実施形態では、細胞は、第１のモグロシドを加水分解してモグロシドＩＩＩＥを産生することが可能なヒドロラーゼをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロラーゼは、β−グルカンヒドロラーゼである。いくつかの実施形態では、ヒドロラーゼは、ＥＸＧ１またはＥＸＧ２である。いくつかの実施形態では、ヒドロラーゼは、配列番号２９２、３６６〜３６８、３７２、３７６〜３９８、４４７〜５２０、５２４〜８４５、１０１３、１０１４および１０２３のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のモグロシドは、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、モグロシドＶＩまたはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、第１のモグロシドは、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡまたはそれらの組み合わせである。
ヒドロラーゼをコードする遺伝子は、組換え宿主細胞に対して異種または同種であり得る。ヒドロラーゼをコードする遺伝子は、組換え宿主細胞において正常レベルで発現され得るかまたは過剰発現され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、酵母細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、サッカロミセス・セレビシエまたはヤロウィア・リポリティカである。
また、本明細書では、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１の産生方法も開示されている。いくつかの実施形態では、この方法は、第１のモグロシドを、１種以上のヒドロラーゼと接触させてモグロシドＩＩＩＥを産生すること；および前記モグロシドＩＩＩＥを、モグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な酵素と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、加水分解は、β−グルカンヒドロラーゼである。いくつかの実施形態では、ヒドロラーゼは、ＥＸＧ１であり、例えば、ＥＸＧ１は、配列番号１０１２または１０１４と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロラーゼは、ＥＸＧ２であり、例えば、ＥＸＧ２は、配列番号１０２３と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のモグロシドは、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、モグロシドＶＩまたはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、第１のモグロシドは、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡまたはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、第１のモグロシドを、１種以上のヒドロラーゼと接触させることは、第１のモグロシドを、ヒドロラーゼをコードする第１の遺伝子と化合物１の産生を触媒することが可能な酵素をコードする第２の遺伝子とを含む組換え宿主細胞と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、第１のモグロシドは、ヒドロラーゼをコードする第１の遺伝子と化合物１の産生を触媒することが可能な酵素をコードする第２の遺伝子とを含む組換え宿主細胞において、１種以上のヒドロラーゼと接触する。いくつかの実施形態では、第１のモグロシドは、組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子は、組換え宿主細胞に対してネイティブである。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子は、正常レベルで発現される。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子は、組換え宿主細胞に対して異種である。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子は、過剰発現される。いくつかの実施形態では、第２の遺伝子は、組換え宿主細胞に対して異種である。いくつかの実施形態では、化合物１の産生を触媒することが可能な酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上である。
本明細書では、第１のモグロシドを加水分解してモグロシドＩＩＩＥを産生することが可能なヒドロラーゼをコードする第１の遺伝子；およびモグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な酵素をコードする第２の遺伝子を含む、組換え細胞であって、ここで、化合物１が、構造：
Figure 2020518264
 を有する、組換え細胞が開示されている。
いくつかの実施形態では、ヒドロラーゼは、β−グルカンヒドロラーゼである。例えば、ヒドロラーゼは、ＥＸＧ１またはＥＸＧ２であり得る。いくつかの実施形態では、ＥＸＧ２タンパク質は、配列番号１０２３と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のモグロシドは、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、モグロシドＶＩまたはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、第１のモグロシドは、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡまたはそれらの組み合わせである。第１の遺伝子は、組換え宿主細胞に対して異種または同種であり得る。第１の遺伝子は、宿主細胞において正常レベルで過剰発現または発現され得る。細胞は、例えば、酵母細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、サッカロミセス・セレビシエまたはヤロウィア・リポリティカである。
また、本明細書では、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有する融合ポリペプチドが開示されており、ここで、融合ポリペプチドは、ククルビタジエノールシンターゼに融合した融合ドメインを含む。融合ドメインは、ククルビタジエノールシンターゼのＮ末端、Ｃ末端またはその双方に融合され得る。融合ドメインは、例えば、約３〜約１０００アミノ酸長または約５〜約５０アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、融合ドメインは、機能性タンパク質の配列の実質的な部分または配列全体を含む。いくつかの実施形態では、融合ドメインは、機能性タンパク質の配列の実質的な部分または配列全体である。いくつかの実施形態では、融合ドメインは、酵母タンパク質の配列の一部または配列全体を含む。いくつかの実施形態では、融合ドメインは、酵母タンパク質の配列の一部または配列全体である。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８５１、８５４、８５６、１０２４、８５９、８６２、８６５、８６７、９１５、９２０、９２４、９２８、９３２、９３６、９４０、９４４、９４８、９５２、９５６、９５９、９６４、９６７、９７１、９７５、９７９、９８３、９８７、９９１、９９５、９９９、１００３、１００７および１０１１のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８５１、８５４、８５６、１０２４、８５９、８６２、８６５、８６７、９１５、９２０、９２４、９２８、９３２、９３６、９４０、９４４、９４８、９５２、９５６、９５９、９６４、９６７、９７１、９７５、９７９、９８３、９８７、９９１、９９５、９９９、１００３、１００７および１０１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むか、これらのアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの融合ドメインは、配列番号８６６、８７０、９１７、９２１、９２５、９２９、９３３、９３７、９４１、９４５、９４９、９５３、９５７、９６１、９６８、９７２、９７６、９８０、９８４、９８８、９９２、９９６、１０００、１００４、１００８および１０１２のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの融合ドメインは、配列番号８６６、８７０、９１７、９２１、９２５、９２９、９３３、９３７、９４１、９４５、９４９、９５３、９５７、９６１、９６８、９７２、９７６、９８０、９８４、９８８、９９２、９９６、１０００、１００４、１００８および１０１２のいずれか１つに記載された配列を含むか、これらの配列からなる。
いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４および９０６のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４および９０６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むかまたはこれらのアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３および９０５のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３および９０５のいずれか１つに記載の核酸配列を含むかまたはこれらの核酸配列からなる遺伝子によってコードされる。
本明細書では、本明細書に開示された融合ポリペプチドのいずれかをコードし、かつククルビタジエノールシンターゼ活性を有する核酸配列を含む組換え核酸分子が開示されている。本明細書では、本明細書に開示され、かつククルビタジエノールシンターゼ活性を有する融合ポリペプチドのいずれかを含み、かつ／またはククルビタジエノールシンターゼ活性を有する融合ポリペプチドをコードする本明細書に開示された任意の組換え核酸分子を含む、組換え細胞が開示されている。また、本明細書では、本明細書に開示され、かつククルビタジエノールシンターゼ活性を有する融合ポリペプチドのいずれかを使用する方法が開示されている。この方法は、ククルビタジエノールシンターゼの基質を、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有する融合ポリペプチドと接触させることを含み得る。いくつかの実施形態では、接触によって、ククルビタジエノール、２４，２５−エポキシククルビタジエノールまたはそれらの組み合わせが産生される。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼの基質は、２，３−オキシドスクアレン、ジオキシドスクアレンおよびジエポキシスクアレンのうちの１種以上を含む。いくつかの実施形態では、接触は、基質を、融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え宿主細胞と接触させることを含む。組換え宿主細胞は、例えば、融合ポリペプチドを発現し得る。いくつかの実施形態では、基質は、組換え宿主細胞に供給され、組換え宿主細胞に存在し、かつ／または組換え宿主細胞によって産生される。
詳細な説明
定義
他に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、一般に、本開示が属する技術分野の当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。すべての特許、出願、公開された出願および他の刊行物は、その全体が参照により組み込まれている。本明細書の用語に複数の定義がある場合、特に明記しない限り、このセクションの定義が優先する。
「溶媒和物」は、溶媒と本明細書に記載された化合物またはその塩との相互作用によって形成された化合物を指す。適切な溶媒和物は、水和物を含む生理学的に許容される溶媒和物である。
本明細書で用いられる「甘味料」、「甘い香味剤」、「甘い風味の実体」、「甘い化合物」または「甘味化合物」は、対象物において検出可能な甘い風味を引き出す化合物またはその生理学的に許容される塩を指す。
本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、調節要素と遺伝子またはそのコード領域との間の接続を説明するために使用される。典型的には、遺伝子発現は、１つ以上の調節要素、例えば、限定されることなく、構成的または誘導性プロモーター、組織特異的調節要素およびエンハンサーの制御下に置かれる。遺伝子またはコード領域は、調節要素に「作動可能に連結される」または「作動的に連結される」または「作動可能に結合される」と言われており、これは遺伝子またはコード領域が調節要素によって制御されるか、影響を受けることを意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。
「調節要素」および「発現制御要素」という用語は、互換的に使用され、特定の宿主生物において作動可能に連結したコード配列の発現に影響を与え得る核酸分子を指す。これらの用語は、広く使用されており、かつプロモーター、エンハンサー配列、応答要素、タンパク質認識部位、誘導性要素、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、イントランス、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要なコア要素、上流要素、エンハンサー、応答要素（例えば、Lewin, “Genes V” (Oxford University Press, Oxford) 847〜873頁）およびそれらの組み合わせを含む、転写を促進または調節するすべての要素をカバーする。原核生物の例示的な調節要素には、プロモーター、オペレーター配列およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞で使用される調節要素には、限定されずに、転写および翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、内部リボソーム進入要素（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列等が含まれ、これらは宿主細胞におけるコード配列の発現および／またはコードされたポリペプチドの産生を提供かつ／または調節する。本明細書のいくつかの実施形態では、本明細書に記載された組換え細胞は、調節要素に作動可能に連結された遺伝子を含む。
本明細書で使用される、２Ａ配列または要素は、２つのタンパク質間のリンカーとして導入された小さなペプチドを指し、ポリタンパク質の自律的なリボソーム内自己プロセッシングを可能にする（例えば、de Felipe. Genetic Vaccines and Ther.2：13頁（2004年）; de Felipeら、Traffic 5：616〜626頁（2004年）を参照のこと）。これらの短いペプチドは、単一のベクターから複数のタンパク質の共発現を可能にする。当技術分野では、多くの２Ａ要素が知られている。本明細書で開示される方法およびシステムで使用され得る２Ａ配列の例としては、米国特許公開第２００７０１１６６９０号明細書に記載されている、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎ウイルス（Ｅ２Ａ）、アセガ・アシグナウイルス（Ｔ２Ａ）およびブタテスコウイルス−１（Ｐ２Ａ）由来の２Ａ配列が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にし、かつ遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、遺伝子の転写開始部位に近接した遺伝子の５’非コード領域に位置している。転写の開始で機能するプロモーター内の配列要素は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられる。プロモーターの例としては、細菌、酵母、植物、ウイルスおよび哺乳動物（ヒトを含む）からのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターは、誘導性、抑制性および／または構成的であり得る。誘導性プロモーターは、温度の変化などの培養条件の変化に応じて、その制御下でＤＮＡからの転写レベルの増加を開始する。
本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、転写の開始部位に対するエンハンサーの距離または向きに関係なく、転写の効率を高め得る調節要素の種類を指す。
本明細書で使用される「導入遺伝子」という用語は、ヒトの介入によって、標的細胞の１つ以上の染色体に組み込まれる任意のヌクレオチドまたはＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、概して、転写調節配列などの目的の遺伝子の所望の発現を得るのに有用な他の配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、染色体が組み込まれた場所をマークするために使用される核酸または他の分子をさらに含み得る。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関して「配列同一性パーセント（％）」は、２つの配列を整列させた後、別の配列の塩基またはアミノ酸残基と同一である候補配列の塩基またはアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書で使用されている。必要に応じて、配列アラインメントにギャップを導入して、最大パーセントの配列同一性を達成することができる。保存的置換は、配列同一性の一部とは見なされない。配列同一性パーセント（％）を決定するためのアラインメントは、当業者の範囲内のさまざまな方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＦＡＳＴＡ（米国、ウィスコンシン州、マディソンからの遺伝学コンピューティンググループ（ＧＣＧ）パッケージで利用可能）またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）などの公的に利用可能なコンピューターメソッドおよびプログラムを使用して達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
例えば、アミノ酸の配列同一性パーセント（％）の値は、例えば、Altschulら、Methods in Enzymology, 1996年, 266 : 460〜480頁に記載されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータープログラムを使用することによって得ることができる。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータープログラムにおける多くの検索パラメータは、当業者により調整され得る。例えば、調整可能なパラメータの一部は、以下の値を用いて設定され得る：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワードしきい値（Ｔ）＝１１およびスコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２を使用する場合、アミノ酸配列同一性％の値は、（ａ）第１の目的のタンパク質のアミノ酸配列とＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって決定される第２の目的のタンパク質のアミノ酸配列との間で一致する同一のアミノ酸残基の数を、（ｂ）第１の目的のタンパク質のアミノ酸残基の総数で割ることによって求められる。
アミノ酸の配列同一性パーセントは、例えば、Altschulら、Nucleic Acids Res., 1997年, 25 :3 389〜3402頁に記載された配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２を用いても求めることができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードするか、メリーランド州ベセスダの国立衛生研究所から入手することができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は、いくつかの調整可能な検索パラメータを使用する。これらの調整可能な検索パラメータの一部のデフォルト値は、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝ｙｅｓ、ｓｔｒａｎｄ＝ａｌｌ、予想される出現回数＝１０、最小低複雑度長＝１５／５、マルチパスｅ値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５およびスコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。
ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２がアミノ酸配列比較のために使用される状況では、所与のアミノ酸配列Ｂとのまたはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（これは代替的に、所与のアミノ酸配列Ｂとのまたはそれに対する特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、それを含む所与のアミノ酸配列Ａとして表現され得る）は、次のように計算される：
フラクションＸ／Ｙの１００倍
（式中、Ｘは、ＡおよびＢのプログラムのアライメントにおいて、配列アライメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２によって同一に一致するものとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂのアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％に等しくないことが理解されることになる。
本明細書で使用される「単離された」とは、指定された化合物が、その自然環境から分離されているため、その自然状態の化合物と共に存在する１種以上の他の化合物または生物学的薬剤が、もはや存在しないことを意味する。
本明細書で使用される「精製された」とは、指定された化合物が、典型的には、（例えば、その天然の環境において）指定された化合物と共に見られる他の化合物よりも多量に存在することを意味する。いくつかの実施形態では、精製された化合物の相対量は、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、４００％または１０００％を超えて増加する。いくつかの実施形態では、精製された化合物は、化合物と組み合わせた他の化合物に対して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％を超える重量パーセントレベルで存在する。いくつかの実施形態では、本明細書では実施形態から産生される化合物１は、産生後の化合物と組み合わせた他の化合物に対して１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％を超える重量パーセントレベルで存在する。
本明細書に記載される「精製」は、細胞溶解物および／または上清から化合物１を抽出するための方法であって、細胞が、化合物１の産生物を排出する方法を指し得る。本明細書に記載される「溶解物」は、細胞壁および細胞膜の破壊後の細胞の細胞内容物を含み、かつ例えば、タンパク質、糖およびモグロシドを含み得る。精製には、タンパク質を除去するための硫酸アンモニウムの沈殿、タンパク質を除去するための塩析、疎水性分離（ＨＰＬＣ）およびアフィニティカラムの使用が含まれる。本明細書の方法により産生される産生物を考慮して、吸着樹脂を用いて特定のモグロシドを除去するための親和性媒体が考えられている。
本明細書に記載される「ＨＰＬＣ」は、溶液中に溶解された化合物を分離するために使用され得る液体クロマトグラフィーの形態である。ＨＰＬＣ装置は、移動相のリザーバー、ポンプ、インジェクター、分離カラムおよび検出器で構成され得るが、これらに限定されない。化合物は、その後、サンプル混合物をカラムに注入することにより分離され得る。混合液パス内の異なる成分は、移動液相と固定相との間のそれらの分配挙動の違いにより、異なる速度でカラムを通過し得る。使用できるカラムがいくつかある。カラムは、通常の位相カラム、逆相カラム、サイズ排除タイプのカラムおよびイオン交換カラムであり得るが、これらに限定されない。
また、タンパク質および糖サンプルを脱塩するために有用である、固相抽出および分画の使用も考えられている。他の方法としては、ＨＰＬＣ、サンプル分析用液体クロマトグラフィーおよび液液抽出を挙げることができ、これらはAurea Andrade-Eiroaら（TrAC Trends in Analytical Chemistry 第80巻, 2016年6月、641〜654頁）に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本明細書に記載される、精製するための「固相抽出」（ＳＰＥ）は、液体混合物に溶解または懸濁した化合物が、それらの物理的および化学的性質に従って混合物において他の化合物から分離されるサンプルの調製方法を指す。例えば、分析ラボは、固相抽出を使用して、分析のためにサンプルを濃縮かつ精製することができる。固相抽出を使用して、例えば、尿、血液、水、飲料、土壌および動物組織などの、さまざまなマトリックスから目的の分析物を単離することもできる。本明細書の実施形態では、細胞溶解物中または細胞培地中にある化合物１は、固相抽出により精製することができる。
ＳＰＥは、液体（移動相として知られる）に溶解または懸濁した溶質の親和性を使用し、サンプルが固体（固定相として知られる）を通過して、混合物を望ましい成分と望ましくない成分とに分離する。また、ＳＰＥは、気固相および液固相で直接使用され、かつ適用され得るかまたは例えば、熱脱着を使用して、後続のクロマトグラフィー分析で間接的に固体サンプルに適用され得る。これにより所望の目的の分析物が生じ得るか、サンプル中の不要な不純物が固定相に保持される。固定相を通過する部分は、目的の分析物または望ましくない不純物が含まれているかどうかに応じて、収集または廃棄できる。固定相に保持されている部分に所望の分析物が含まれる場合、この分析物は、その後、さらなる工程で固定相から除去して集めることができ、ここで、固定相は、適切な溶離液で濯がれる。
固相抽出を実施できる方法は、限定されない。この手順には、限定することなく、以下が含まれ得る：順相ＳＰＥ手順、逆相ＳＰＥ、イオン交換ＳＰＥ、陰イオン交換ＳＰＥ、陽イオン交換および固相微量抽出。固相抽出については、SajidらおよびPlotka-Wasylka Jら（Anal Chim Acta. 2017 May 1; 965 : 36〜53頁, Crit Rev Anal Chem. 2017 Apr 11:1〜11頁；その全体が参照により組み込まれる）に記載されている。
いくつかの実施形態では、細胞によって産生された化合物１は、固相抽出により精製される。いくつかの実施形態では、例えば、固相抽出により精製された、化合物１の純度は、７０％、８０％、９０％または１００％純粋であるかまたは任意の前述の値によって定義された任意のレベルの純度である。
本明細書に記載される「発酵」は、特定の製品を生産するためにホスト培地における宿主細胞のバルク成長を広く指す。本明細書の実施形態では、産生される最終産生物は、化合物１である。これは、空気の有無にかかわらず発生させる方法も含み、例えば、嫌気性環境で実施することができる。全細胞（組換え宿主細胞）は、発酵ブロス中または反応緩衝液中にあり得る。
化合物１および化合物１を産生するための中間モグロシド化合物は、組換え細胞溶解物または上清から中間モグロシド化合物および化合物１を収集することにより単離され得る。溶解物は、細胞を回収し、せん断力（フレンチプレスセルまたは音波処理）または界面活性剤処理により細胞を溶解した後に得ることができる。その後、溶解物は、濾過され、硫酸アンモニウムで処理されてタンパク質が除去され、Ｃ１８ ＨＰＬＣ（５×１０ｃｍのＡｔｌａｎｔｉｓ ｐｒｅｐ Ｔ３ ＯＢＤカラム、５μｍ、水）で分画され、１０→３０％のＢのＡ／Ｂグラジエント（Ａ＝水、Ｂ＝アセトニトリル）を用いて３０分間注入され、９５％のＢで洗浄され、その後、１％で再平衡化（合計実行時間＝４２分）される。実行により、３０ｍＬ／フラクションで風袋引きされたチューブ（１２フラクション／プレート、１回の実行あたり３プレート）に収集され得る。溶解物も、遠心分離されて、固形物および粒子状物質が除去され得る。
プレートは、その後、Ｇｅｎｅｖａｃ ＨＴ１２／ＨＴ２４で乾燥され得る。所望の化合物は、他の異性体とともにフラクション２１で溶出されると予想される。プールされたフラクションは、３５分かけて１５→３０％のＢのＡ／Ｂグラジエント（Ａ＝水、Ｂ＝アセトニトリル）を使用して、フルオロ−フェニルＨＰＬＣカラム（３×１０ｃｍ、ＸｓｅｌｅｃｔフルオロフェニルＯＢＤカラム、５μｍ、水）で４７回実行してさらに分画され、９５％のＢで洗浄され、その後、１５％で再平衡化され得る（総実行時間＝４５分）。各実行により、３０ｍＬ／フラクションで１２の風袋引きされたチューブ（１２フラクション／プレート、実行ごとに１プレート）に収集された。所望の純度を有する所望のピークを含むフラクションをＵＰＬＣ分析に基づいてプールし、減圧下で乾燥させると、白っぽい粉末状固体を得ることができる。純粋な化合物を１０ｍＬの水に再懸濁／溶解し、凍結乾燥すると、少なくとも９５％の純度を得ることができる。
本明細書で使用される、「グリコシド結合」は、２つのフラノース基および／またはピラノース基を接続する共有結合を指す。一般的に、グリコシド結合は、１つのフラノースまたはピラノース部分のアノマー炭素と別のフラノースまたはピラノース部分の酸素との間の結合である。グリコシド結合は、結合した炭素原子の番号付けおよびアルファ／ベータ方向を用いて命名される。α−およびβ−グリコシド結合は、アノマー位置の相対的な立体化学および環内のＣ１から最も遠い立体中心に基づいて区別される。例えば、スクロースは、以下に示すように、アルファ１−２グリコシド結合を介して結合したグルコース１分子とフルクトース１分子で構成される二糖である。
Figure 2020518264
ベータ１−４グリコシド結合の例は、セルロースに見出され得る：
Figure 2020518264
明細書および添付の特許請求の範囲に使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の対象を含む。したがって、例えば、「芳香族化合物」についての言及は、芳香族化合物の混合物を含む。
多くの場合、範囲は、本明細書では、「約」１つの特定の値からおよび／または「約」別の特定の値までとして表される。かかる範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または別の特定の値までを含む。同様に、値が、先行詞「約」の使用により近似値として表される場合、特定の値が、別の実施形態を形成することが理解されよう。さらに、各範囲のエンドポイントが、他のエンドポイントに関連しておよび他のエンドポイントとは無関係に重要であることがさらに理解されよう。
本明細書に記載される「コドン最適化」は、コドンを、最大タンパク質発現効率を高めることが知られているコドンに変化させる設計プロセスを指す。いくつかの代替形態では、細胞での発現のためのコドン最適化が記載されており、ここで、コドン最適化は、ヒトの高ｍＲＮＡおよびタンパク質収率に最適化された合成遺伝子転写物を作成するように、当業者に知られているアルゴリズムを使用することによって実行され得る。コドンは、例えば、細菌細胞、哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞でのタンパク質の発現に最適化され得る。ヒトのコドン最適化のためのアルゴリズムを含むプログラムは、すぐに利用できる。このようなプログラムには、例えば、ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）またはＧｅｎｅＧＰＳ（登録商標）アルゴリズムが含まれ得る。さらに、コドン最適化された配列は、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから商業的に得ることができる。本明細書の実施形態の一部では、化合物１の産生のための組換え細胞は、合成のための酵素をコードする遺伝子を含み、ここで、遺伝子は、発現のために最適化されたコドンである。いくつかの実施形態では、遺伝子は、細菌、酵母、真菌または昆虫細胞での発現のために最適化されたコドンである。
本明細書で使用される、「核酸」、「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、交換可能であり、ホスホジエステル結合または修飾された結合で構成されているかどうかにかかわらず、任意の核酸、例えば、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホルアミデート、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートまたはスルトン結合およびかかる結合の組み合わせを指す。「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語には、具体的には、５つの生物学的に発生する塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基から構成される核酸も含まれる。
ポリヌクレオチドの非限定的な例には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されるフラグメント、ならびに連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼのいずれかによって生成されるフラグメントが含まれる。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチドであるモノマー（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）または天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性体）または双方の組み合わせで構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンまたはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖修飾は、例えば、１つ以上のヒドロキシル基を、ハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基で置き換えることを含むかまたは糖は、エーテルまたはエステルとして官能化され得る。さらに、糖部分全体を、アザ糖や炭素環糖類似体などの立体的および電子的に類似した構造に置き換えることができる。塩基部分の修飾の例には、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジンまたは他のよく知られた複素環置換が含まれる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはかかる結合の類似体によって結合され得る。ホスホジエステル結合の類似体には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホアニリデート、ホスホルアミデートなどが含まれる。「核酸分子」という用語には、ポリアミド骨格に付着した天然または修飾核酸塩基を含む、いわゆる「ペプチド核酸」も含まれる。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。いくつかの代替形態では、融合タンパク質をコードする核酸配列が提供される。いくつかの代替形態では、核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１〜１０２３のいずれか１つを含む。
「をコードする」または「コードする」は、本明細書で使用されており、アミノ酸の定義された配列などの他の高分子を合成するためのテンプレートとして機能するように、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の特性を参照する。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳によってタンパク質が細胞または他の生体系で産生される場合、タンパク質をコードする。本明細書のいくつかの実施形態では、組換え細胞が提供され、ここで、組換え細胞は、デキストランスクラーゼ、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼ、デキストラナーゼおよび／またはＵＧＴなどの酵素をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号１６３〜２９０および７２３のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＧＴアーゼは、配列番号１、３、７８〜１０１、１４７および１５４のいずれか１つの配列によってコードされるか、これらの配列を有する。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼ、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼ、デキストラナーゼおよび／またはＵＧＴなどの酵素をコードする遺伝子は、宿主細胞での発現のために最適化されたコドンである。「ポリペプチドをコードする核酸配列」には、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。
最適化は、ポリヌクレオチド内の二次構造の発生を低減するためにも実施され得る。いくつかの代替方法では、ベクター内の配列の最適化を実行して、総ＧＣ／ＡＴ比を減らすこともできる。厳密なコドン最適化は、不要な二次構造につながり得るかまたは二次構造を発生させる望ましくない高いＧＣ含有量につながり得る。そのため、二次構造は、転写効率に影響する。ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒなどのプログラムは、二次構造の回避およびＧＣ含有量の最適化のために、コドンの使用法が最適化された後に使用され得る。これらの追加プログラムは、初期コドン最適化後のさらなる最適化およびトラブルシューティングのために使用されて、最適化の最初のラウンド後に発生し得る二次構造を制限し得る。最適化のための代替的プログラムは、すぐに利用可能である。いくつかの代替法では、ベクターは、二次構造回避のために最適化された配列を含み、かつ／または配列は、総ＧＣ／ＡＴ比を低減するように最適化され、かつ／または配列は、細菌または酵母細胞での発現のために最適化される。
「ベクター」、「発現ベクター」または「構築物」は、細胞内で異種核酸の発現をもたらす調節要素を有する細胞に異種核酸を導入するために使用される核酸である。ベクターには、プラスミド、ミニサークル、酵母およびウイルスゲノムが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの代替形態では、ベクターは、プラスミド、ミニサークル、酵母またはゲノムである。いくつかの代替形態では、ベクターは、大腸菌などの細菌系でのタンパク質発現用である。いくつかの代替形態では、ベクターは、大腸菌などの細菌系でのタンパク質発現用である。いくつかの代替形態では、ベクターは、酵母システムでのタンパク質発現用である。いくつかの実施形態では、発現用のベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、遺伝子の発現の上方制御のためのプロモーター配列を含む組換えベクターである。「調節要素」は、転写または翻訳の開始、ならびに転写または翻訳産物の速度、安定性および可動性に影響を及ぼし得るヌクレオチド配列を有する核酸を指し得る。
本明細書に記載される「組換え宿主」または「組換え宿主細胞」は、そのゲノムが少なくとも１つの組み込まれたＤＮＡ配列により増強されている宿主である。上記の組み込まれたＤＮＡ配列は、１つ以上のポリペプチドをコードする異種核酸であってもよい。かかるＤＮＡ配列には、自然には存在しない遺伝子、通常ＲＮＡに転写されないまたはタンパク質に翻訳されない（「発現されない」）ＤＮＡ配列および非組換え宿主に導入することが望まれる他の遺伝子またはＤＮＡ配列が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、コドンバイアスなどの発現問題を防ぐために使用される。タンパク質の発現のための市販の宿主には、例えば、ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（商標）細胞、異種遺伝子の発現のためのｔＲＮＡ補足宿主株、タンパク質の発現を高めるロゼッタ(商標)（ＤＥ３）コンピテント株およびサッカロミセス属、ピキア属（Pichia）、クルイウェロマイセス属（Kluyveromyces）、ハンゼヌラ属およびヤロウィア属の市販の酵母発現システムがある。
組換え宿主は、市販の細胞、例えば、稀なコドンを有し得る酵素の発現のためのロゼッタ細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ＣＹＰ５３３、ＣＹＰ９３７、ＣＹＰ１７９８、ＣＹＰ１９９４、ＣＹＰ２０４８、ＣＹＰ２７４０、ＣＹＰ３４０４、ＣＹＰ３９６８、ＣＹＰ４１１２、ＣＹＰ４１４９、ＣＹＰ４４９１、ＣＹＰ５４９１、ＣＹＰ６４７９、ＣＹＰ７６０４、ＣＹＰ８２２４、ＣＹＰ８７２８、ＣＹＰ１００２０およびＣＹＰ１０２８５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むシトクロムＰ４５０ポリペプチドの産生のための組換え遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０ポリペプチドは、配列番号３１〜４８、３１６、４３１、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７および８９１に記載された配列のいずれか１つを含む遺伝子にコードされている。
いくつかの実施形態では、Ｐ４５０酵素は、ＣＰＲ４４９７などの少なくとも１つのＣＹＰ活性剤によって支援される。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、ＣＰＲ４４９７をコードする遺伝子をさらに含み、ここで、遺伝子は、配列番号１１２に記載された核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、ＣＰＲ４４９７をコードする遺伝子をさらに含み、ここで、ＣＰＲ４４９７のアミノ酸配列は、配列番号１１３に記載されている。
組換え宿主細胞が酵母細胞である、いくつかの実施形態では、組換え細胞において、モグロシドの脱グルコシル化につながり得るグルカナーゼ活性の低下を防ぐＸＧ１遺伝子および／またはＥＸＧ２遺伝子が欠失している。
宿主細胞の種類は、さまざまであり得る。例えば、宿主細胞は、ハラタケ属（Agaricus）、アスペルギルス属、バチルス属（Bacillus）、カンジダ属、コリネバクテリウム属（corynebacterium）、エスケリキア属（Escherichia）、フザリウム／ジベレラ属（Fusarium/Gibberella）、クルイウェロマイセス属、アイカワタケ属（Laetiporus）、マツオウジ属（Lentinus）、ファフィア属（Phaffia）、マクカワタケ属（Phanerochaete）、ピキア属、ニセツリガネゴケ属（Physcomitrella）、ロドトルラ属（Rhodoturula）、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、スファセロマ属（Sphaceloma）、キサントフィロミセス属、ヤロウィア属、レンチナス・チグリヌス（Lentinus tigrinus）、ラエチポルス・スルフレウス（Laetiporus sulphureus）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、フィスコミトレラ・パテンス（Physcomitrella patens）、ロドツルラ・グルチニス（Rhodoturula glutinis）、ロドツルラ・ムシラギノサ（Rhodoturula mucilaginosa）、ファフィア・ロドザイマ（Phaffia rhodozyma）、キサントフィロマイセス・デンドロホス（Xanthophyllomyces dendrorhous）、フザリウム・フジクロイ／ギベレラ・フジクロイ（Fusarium fujikuroi/Gibberella fujikuroi）、トルラ酵母（Candida utilis）、ヤロウィア・リポリティカ、ラカンカ属、ツルレイシ属、アマチャヅル属、カボチャ属、キュウリ属、シロイヌナズナ属、ヨモギ属、ステビア属、トチバニンジン属、ウィザニア属、トウダイグサ属、ウマゴヤシ属、オリヅルラン属、ウコギ属、タラノキ属、クワ属、ウマゴヤシ属、カバノキ属、ゲンゲ属、ナンヨウアブラギリ属、ツバキ属、クリタケ属、アスペルギルス属、ナス属、コスギラン属、ワチガイソウ属、ツナソ属、キヅタ属、ゼニゴケ属およびクワ属、トリコフィトン属（Trichophyton）、サングハングポルス属、タイワノフングス属、モニリオフトラ、マルソニナ、ディプロディア、シイタケ属、キサントフィロミセス属、ポコニア属、コレトトリカム族、ジアポルテ属、ヒストプラズマ属、コクシジオイデス属（Coccidioides）、ヒストプラズマ属、サングハングポルス属、アウレオバシジウム属、ポコニア属、ペニシリウム属、スポロトリックス属、メタリジウム属、アスペルギルス属、ヤロウィア属、リポミセス属、アスペルギルス・ニデュランス、ヤロウィア・リポリティカ、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporin toruloides）、カンジダ属、サッカロミセス属、サッカロミケス亜門、タフリナ菌亜門、シゾサッカロミセス綱、コマガタエラ属、担子菌門、ハラタケ亜門、シロキクラゲ綱、サビキン亜門、アウレオバシジウム属、コニオカエタ、ロドスポリジウム属およびミクロボリオミセテス、ギベレラ・フジクロイ、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、大腸菌（Escherichia coli）、ロドバクテル・スファエロイデス（Rhodobacter sphaeroides）およびロドバクテル・カプスラツス（Rhodobacter capsulatus）からなる群から選択され得る。産生物の収量を高める方法は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）に記載されている。組換え微生物の作製方法は知られている。
アスペルギルス種から組換え宿主細胞を作製する方法は、国際公開第２０１４０８６８４２号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ゲノムのヌクレオチド配列は、公開されている遺伝子データライブラリを通じて取得することができ、合理的な設計および経路の修正により、産生物の収率を向上かつ改善することができる。
本明細書に記載された「培養培地」は、それらの産生段階の間の細胞の増殖および維持のための富栄養ブロスであり得る。様々な株を維持して増殖させるための酵母培養物は、クローニングおよびタンパク質発現で使用するために複雑な培地の特定の配合物を必要とすることがあり、当業者に理解され得る。市販の培養培地は、例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから使用され得る。培地は、ＹＰＤブロスまたは酵母窒素ベースであり得る。酵母は、ＹＰＤまたは合成培地において３０℃で増殖し得る。
溶原性ブロス（ＬＢ）は、通常、細菌細胞のために使用される。酵素およびモグロシドの増殖に使用される細菌細胞は、培養培地中の他の細胞の増殖および汚染を防ぐために抗生物質耐性を有し得る。細胞は、例えば、クロラムフェニコール、ペニシリン、カナマイシンおよびアンピシリンなどの抗生物質に対する耐性のための抗生物質遺伝子カセットを含み得る。
本明細書に記載される「融合タンパク質」は、別個のタンパク質のアミノ酸配列の一部または全体を元々コード化した２つ以上の核酸配列の結合により作り出されたタンパク質である。例えば、融合タンパク質は、機能性タンパク質（例えば、酵素（ククルビタジエノールシンターゼを含むが、これに限定されない））および１つ以上の融合ドメインを含有し得る。本明細書に記載される融合ドメインは、タンパク質（例えば、酵素、転写因子、毒素および翻訳因子を含むが、これらに限定されない機能性タンパク質）の全長または一部／断片であり得る。融合タンパク質中の１つ以上の融合ドメインの位置は、さまざまであり得る。例えば、１つ以上の融合ドメインは、融合タンパク質のＮおよび／またはＣ末端領域（例えば、Ｎおよび／またはＣ末端）にあり得る。１つ以上の融合ドメインは、融合タンパク質の中央領域にもあり得る。融合ドメインは、融合タンパク質の末端に位置する必要はない。所望の特性を付与するために、融合ドメインが選択され得る。例えば、融合ドメインは、それが融合される酵素の酵素活性に影響を与える（例えば、増加または減少させる）かまたはそれが融合されるタンパク質の安定性に影響を与える（例えば、増加または減少させる）。融合ドメインは、多量体化（例えば、二量体化および四量体化）ドメインおよび／または機能的ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、融合ドメインは、それが融合されるタンパク質の多量体化を増強または減少させ得る。非限定的な例として、融合タンパク質は、全長タンパク質Ａならびに全長タンパク質ＡのＮ末端領域および／またはＣ末端領域に融合される融合ドメインを含有し得る。いくつかの例では、融合タンパク質は、タンパク質Ａの部分配列、タンパク質Ａの部分配列のＮ末端領域および／またはＣ末端領域（例えば、Ｎ末端およびＣ末端）に融合した融合ドメインを含有する。融合ドメインは、例えば、タンパク質Ａの配列の一部または配列全体またはタンパク質Ａとは異なるタンパク質の配列の一部または配列全体であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示された方法、システムおよび組成物での使用に適した１種以上の酵素は、融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、第１表に列挙された核酸配列の１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、第１表に列挙されたアミノ酸配列の１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、第１表に列挙されたアミノ酸配列の１つに対して少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸タンパク質配列を含み、かつ融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端または双方の末端領域に融合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、第１表に列挙されたアミノ酸タンパク質配列の１つおよび融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端または双方の末端領域に位置する融合ドメインを含む。
融合ドメインの長さは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００からのアミノ酸またはこれらの数字のいずれか２つの間の範囲のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、融合ドメインは、約３、４、５、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０のアミノ酸長またはこれらの数字のいずれか２つの間の範囲のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、融合ドメインは、機能性タンパク質（例えば、酵素、転写因子または翻訳因子）の配列の実質的な部分または配列全体である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有するタンパク質である。
培養培地での細胞増殖およびタンパク質発現技術の最適化も考えられている。培養培地での増殖の場合、酵母などの細胞は、低ｐＨに敏感であり得る（Narendranathら, Appl Environ Microbiol. 2005年5月; 71(5): 2239〜2243頁; 参照によりその全体が組み込まれる)。増殖の間、酵母は一定の細胞内ｐＨを維持しなければならない。増殖および代謝の間に酵母細胞内で機能する多くの酵素がある。各酵素は、最適なｐＨで最良に機能するが、これは酵母自体の好酸性の性質のために酸性である。細胞外ｐＨが最適レベルから逸脱する場合、酵母細胞は、エネルギーを投資して水素イオンを注入または排出し、最適な細胞内ｐＨを維持する必要がある。そのため、ｐＨを制御するバッファーを含む培地が最適である。代替的に、モニターされたｐＨが高い場合、細胞を新しい培地に移すこともできる。
細菌および酵母細胞の増殖最適化は、培養培地への栄養素およびサプリメントの添加によって達成することもできる。代替的に、培養物は、温度、ｐＨ制御および制御された通気率について設計された発酵槽で増殖させることができる。溶存酸素および窒素は、必要に応じて培地に流入され得る。
本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、調節配列と後者の発現をもたらす異種核酸配列との間の機能的連結を指す。
「モグロシド」および「モグロシド化合物」は、本明細書で互換的に使用され、トリテルペン配糖体のファミリーを指す。モグロシドの非限定的な例示的な例としては、例えば、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩが挙げられ、これらは果実の甘味の原因であるラカンカ（スウィングル）の果実から同定されている。本明細書の実施形態では、モグロシド中間体は、
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 の構造を有する化合物１のインビボ（in vivo）、エクスビボ（ex vivo）またはインビトロ（in vitro）での産生に使用され得る。いくつかの実施形態では、化合物１を産生するための組換え細胞は、モグロシドをさらに産生し、モグロシドの産生のための酵素をコードする遺伝子を含む。モグロシドの産生が可能な組換え細胞は、国際公開第２０１４０８６８４２号にさらに記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、前記酵素の発現および化合物１およびモグロシド中間体の産生を可能にするために培地で増殖される。いくつかの実施形態では、化合物１は、せん断力で細胞を溶解することにより（すなわち、フレンチプレスセルまたは音波処理）または洗剤溶解法により得られる。いくつかの実施形態では、前記細胞は、化合物１の産生をブーストするために、モグロールなどの前駆体分子とともに増殖培地に補充される。
本明細書で使用される「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列を指す。いくつかの代替形態では、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近接した遺伝子の５’非コード領域に位置している。転写の開始で機能するプロモーター内の配列要素は、しばしばコンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられる。制限されることなく、これらのプロモーター要素には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡ配列、ＣＡＡＴ配列、分化特異的要素（ＤＳＥ；McGeheeら、Mol. Endocrinol. 7:551 (1993年)；これによりその全体が参照により明示的に組み込まれる）、サイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）、血清応答要素（ＳＲＥ；Treismanら、Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990年)；その全体が参照により組み込まれる）、グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）およびＣＲＥ／ＡＴＦなどの他の転写因子の結合部位(O’Reillyら、J. Biol. Chem. 267:19938 (1992年)；その全体が参照により組み込まれる)、ＡＰ２（Yeら、J. Biol. Chem. 269:25728 (1994年)；その全体が参照により組み込まれる）、ＳＰ１、ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質（ＣＲＥＢ；Loekenら、Gene Expr. 3:253 (1993年)；その全体が参照により組み込まれる）およびオクタマー因子（一般に、Watsonら編、Molecular Biology of the Gene, 第4版 (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987年；その全体が参照により組み込まれる))が含まれる。本明細書で使用される場合、プロモーターは、構成的に活性、抑制性または誘導性であり得る。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写の速度は、誘導剤に応じて増加する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合、転写速度は、誘導剤によって調節されない。
本明細書で使用される「リボソームスキップ配列」は、翻訳中にリボソームにリボソームスキップ配列を「スキップ」させ、ペプチド結合を形成せずにリボソームスキップ配列の後の領域を翻訳させる配列を指す。例えば、いくつかのウイルスは、ペプチド結合を介してタンパク質を連結させることなく、単一の核酸上のいくつかのタンパク質の連続的な翻訳を可能にするリボソームスキップ配列を有する。本明細書に記載するように、これは「リンカー」配列である。本明細書で提供される核酸のいくつかの代替形態では、核酸は、タンパク質が共発現され、かつペプチド結合によって連結されないように、本明細書に記載された酵素の遺伝子の配列間にリボソームスキップ配列を含む。いくつかの代替形態では、リボソームスキップ配列は、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａ配列である。いくつかの代替形態では、リボソームスキップ配列は、Ｔ２Ａ配列である。
化合物１
本明細書に開示されるように、化合物１は、
Figure 2020518264
 の構造を有する化合物またはそれらの塩である。
化合物１は、甘味が望まれる多種多様な産生物に使用され得る高強度の甘味料である。化合物１は、スクロースまたはフルクトースなどの他の甘味料に低カロリーの利点をもたらす。
いくつかの実施形態では、化合物１は、単離および精製された形態である。いくつかの実施形態では、化合物１は、化合物１が実質的に精製される組成物中に存在する。
いくつかの実施形態では、化合物１またはその塩は、単離されており、かつ固体形態である。いくつかの実施形態では、固体形態は、非晶質である。いくつかの実施形態では、固体形態は、結晶性である。いくつかの実施形態では、化合物は、凍結乾燥物の形態である。いくつかの実施形態では、化合物１は単離され、かつ緩衝液内にある。
当業者は、本明細書に記載されたいくつかの構造が、動力学的であっても、他の化学構造によって適正に表され得る化合物の共鳴形態または互変異性体であり得ることを認識し；当業者は、かかる構造が、かかる化合物のサンプルの非常に小さな部分を表しているにすぎないことを認識している。かかる化合物は、かかる共鳴形態または互変異性体が本明細書に示されていないが、描かれた構造の範囲内であるとみなされる。
同位体は、化合物１で存在し得る。化合物構造で表される各化学元素は、上記元素の任意の同位体を含み得る。例えば、化合物構造において、水素原子は、化合物に存在すると明示的に開示または理解され得る。水素原子が存在し得る化合物の任意の位置で、水素原子は、水素−１（プロチウム）および水素−２（重水素）を含むがこれらに限定されない水素の任意の同位体であり得る。したがって、本明細書における化合物への言及は、文脈が別段明示的に示さない限り、すべての潜在的な同位体形態を包含する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された化合物において、かかる同位体の自然に広まっているものに対して１種以上の同位体が濃縮されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された化合物において、重水素が濃縮されている。いくつかの実施形態では、化合物中の水素原子の０．０３１２％超は、重水素である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された化合物中の水素原子の０．０５％、０．０８％または０．１％超は、重水素である。
いくつかの実施形態では、化合物１は、アミノ基および／またはカルボキシル基またはそれらに類似した基の存在によって酸および／または塩基塩を形成することが可能である。
いくつかの実施形態では、化合物１は、実質的に単離される。いくつかの実施形態では、化合物１は、実質的に精製される。いくつかの実施形態では、化合物は、凍結乾燥物の形態である。いくつかの実施形態では、化合物は、結晶性である。いくつかの実施形態では、化合物は、非晶質である。
産生組成物
いくつかの実施形態では、産生組成物には、望ましくない化合物がまったく含有されていないか、一定量未満含有されている。いくつかの実施形態では、組成物は、モグロシドＩ、モグロシドＩＩおよびモグロシドＩＩＩの１つ以上の異性体を含有するかまたは含有しない。いくつかの実施形態では、組成物は、５％、３％、２％、１％、０．５％、０．３％、０．１％、８００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、２００ｐｐｍまたは１００ｐｐｍ未満の重量パーセントの、モグロシドＩ、モグロシドＩＩおよびモグロシドＩＩＩのすべての異性体を含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＥ、モグロシドＩＩＥおよび１１−オキソ−モグロールのうち１つ以上を含有するかまたは含有しない。いくつかの実施形態では、組成物は、５％、３％、２％、１％、０．５％、０．３％、０．１％、８００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、２００ｐｐｍまたは１００ｐｐｍ未満の重量パーセントの、モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＥ、モグロシドＩＩＥおよび１１−オキソ−モグロールのうち１つ以上を含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、５％、３％、２％、１％、０．５％、０．３％、０．１％、８００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、２００ｐｐｍまたは１００ｐｐｍ未満の重量パーセントのモグロシドＩＩＩＥを含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、５％、３％、２％、１％、０．５％、０．３％、０．１％、８００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、２００ｐｐｍまたは１００ｐｐｍ未満の重量パーセントの１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥを含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、５％、３％、２％、１％、０．５％、０．３％、０．１％、８００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、２００ｐｐｍまたは１００ｐｐｍ未満の重量パーセントの１１−オキソ−モグロールを含有する。
いくつかの実施形態では、産生組成物は、固体形態であり、結晶または非晶質であり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、粒子形態である。組成物の固体形態は、再結晶化、濾過、溶媒蒸発、研削、粉砕、噴霧乾燥、噴霧凝集、流動床凝集、湿式または乾式造粒およびそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない任意の適切な技術を使用して生成され得る。いくつかの実施形態では、さらなる食品製造プロセスでの使用を促進するために、流動性粒子状組成物が提供される。いくつかのかかる実施形態では、５０μｍ〜３００μｍ、８０μｍ〜２００μｍまたは８０μｍ〜１５０μｍの粒径が生成される。
いくつかの実施形態では、溶液形態である化合物１を含む産生組成物が提供される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載された産生方法の１つによって産生された溶液は、さらに精製することなく使用される。いくつかの実施形態では、溶液中の化合物１の濃度は、３００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、８００ｐｐｍ、０．１重量％、０．５重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１５重量％または２０重量％を上回る。いくつかの実施形態では、モグロシドＩ、モグロシドＩＩおよびモグロシドＩＩＩの全ての異性体の濃度は、５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．３％未満、０．１％未満、８００ｐｐｍ未満、５００ｐｐｍ未満、２００ｐｐｍ未満または１００ｐｐｍ未満である。いくつかの実施形態では、産生組成物中のモグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＥ、モグロシドＩＩＥおよび１１−オキソ−モグロールのうちの１種以上の濃度は、５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．３％未満、０．１％未満、８００ｐｐｍ未満、５００ｐｐｍ未満、２００ｐｐｍ未満、１００ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満、１ｐｐｍ未満または０．１ｐｐｍ未満である。いくつかの実施形態、モグロシドＩＩＩＥの濃度は、５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．３％未満、０．１％未満、８００ｐｐｍ未満、５００ｐｐｍ未満、２００ｐｐｍ未満、１００ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満、１ｐｐｍ未満または０．１ｐｐｍ未満である。いくつかの実施形態では、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥの濃度は、５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．３％未満、０．１％未満、８００ｐｐｍ未満、５００ｐｐｍ未満、２００ｐｐｍ未満、１００ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満、１ｐｐｍ未満または０．１ｐｐｍ未満である。いくつかの実施形態では、１１−オキソ−モグロールの濃度は、５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．３％未満、０．１％未満、８００ｐｐｍ未満、５００ｐｐｍ未満、２００ｐｐｍ未満、１００ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満、１ｐｐｍ未満または０．１ｐｐｍ未満である。
化合物１および中間体のモグロシド化合物の産生方法
いくつかの実施形態では、化合物１は、様々な出発化合物および／または中間体化合物を、１種以上の酵素と接触させることによって産生される。接触は、インビボ（例えば、組換え細胞内）またはインビトロで行われ得る。化合物１を産生するための出発化合物および中間体化合物としては、モグロシドＶ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＥ、シアメノシドＩ、モグロシドＶＩ異性体、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＶＥまたはモグロシドＩＶＡが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される化合物１は、本明細書に記載されるようにインビボで組換え宿主細胞で産生されるかまたはこれらの方法の改変によって産生される。方法論を修正する方法には、とりわけ、当業者に知られている温度、溶媒、試薬などが含まれる。本明細書に示され、説明された方法は、単なる例示であり、いかなる方法でも特許請求の範囲を限定することを意図するものではなく、また解釈されるものでもない。当業者は、開示された方法の修正を認識し、本明細書の開示に基づいて代替経路を考案することができるであろう；このようなすべての修正および代替経路は、特許請求の範囲内にある。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示された化合物１は、組換え細菌細胞、酵母細胞、植物細胞または昆虫細胞からの精製および／または単離によって得られる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ラカンカ由来である。いくつかのかかる実施形態では、ラカンカから得られた抽出物は、適切な精製技術を用いて分画され得る。いくつかの実施形態では、抽出物は、ＨＰＬＣを用いて分画され、適切なフラクションが収集されて、所望の化合物が単離および精製された形で得られる。
いくつかの実施形態では、化合物１は、ラカンカから単離された化合物の酵素的修飾によって産生される。例えば、いくつかの実施形態では、ラカンカから単離された化合物１は、１種以上の酵素と接触されて、所望の化合物が得られる。接触は、インビボ（例えば、組換え細胞内）またはインビトロで行われ得る。化合物１を産生するための出発および中間化合物としては、モグロシドＶ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＥ、シアメノシドＩ、モグロシドＶＩ異性体、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＶＥまたはモグロシドＩＶＡが挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物の１種以上は、インビボで作られ得る。本明細書に記載された化合物を産生するための使用に適した酵素としては、ペクチナーゼ、β−ガラクトシダーゼ（例えば、アロマーゼ）、セルラーゼ（例えば、セルクラスト）、クリクロマトロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（例えば、トルザイム）、インベルターゼ、グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１）、デキストランスクラーゼ、ラクターゼ、アラバンス、キシラナーゼ、ヘミセルロース、アミラーゼまたはそれらの組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号８９〜９４のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含むトルザイムである。
いくつかの実施形態では、化合物１
Figure 2020518264
 の製造方法であって、ラカンカの抽出物をＨＰＬＣカラムで分画し、化合物１を含む溶出フラクションを収集することを含む、製造方法が提供される。
いくつかの実施形態では、化合物１
Figure 2020518264
 の製造方法であって、モグロシドＩＩＩＥを、グルコーストランスフェラーゼ酵素ＵＧＴ７６Ｇ１で処理することを含む、製造方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、配列番号４４０に記載された配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、配列番号４３９に記載されたアミノ酸配列を含む。
種々のモグロシド化合物は、化合物１を産生するための中間体化合物として使用され得る。かかるモグロシド化合物の非限定的な例は、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物３である。いくつかの実施形態では、化合物３の産生方法は、モグロシドＩＩＩＥを、１種以上のシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを発現させる細胞（例えば、組換え宿主細胞）と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼは、配列番号９５に記載のアミノ酸配列を含む。
種々のモグロシド化合物は、化合物１を産生するための中間体化合物として使用され得る。かかるモグロシド化合物の非限定的な例の１つは、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１２である。いくつかの実施形態では、化合物１２の産生方法は、モグロシドＶＩを、１つ以上のインベルターゼを発現する細胞（例えば、組換え宿主細胞）と接触させることを含む。
種々のモグロシド化合物は、化合物１を産生するための中間体化合物として使用され得る。かかるモグロシド化合物の非限定的な例の１つは、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物５である。いくつかの実施形態では、化合物５の産生方法は、モグロシドＩＩＩＥを、１つ以上のシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを発現する細胞（例えば、組換え宿主細胞）と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、デンプンの存在下で実施される。
種々のモグロシド化合物は、化合物１を産生するための中間体化合物として使用され得る。かかるモグロシド化合物の非限定的な例の１つは、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物４である。いくつかの実施形態では、化合物４の産生方法は、モグロシドＩＩＩＥを、１つ以上のシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを発現する細胞（例えば、組換え宿主細胞）と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、デンプンの存在下で実施される。
高度グリコシル化モグロシドの加水分解
いくつかの実施形態では、１種以上の高度グリコシル化モグロシドが、１種以上のヒドロラーゼ酵素との接触によってモグロシドＩＩＩＥに加水分解される。いくつかの実施形態では、高度グリコシル化モグロシドは、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、モグロシドＶＩおよびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、高度グリコシル化モグロシドは、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥおよびそれらの組み合わせから選択される。
驚くべきことに、特定のヒドロラーゼが、高度グリコシル化モグロシドをモグロシドＩＩＩＥに加水分解する能力を示すにもかかわらず、かかる酵素による加水分解に対する耐性を化合物１が示すことを発見した。化合物１に存在するアルファ結合グリコシドは、加水分解に対するそれらの耐性のために、他のモグロシド（例えば、ベータ結合グリコシド）に比べて独自の利点をもたらす。いくつかの実施形態では、化合物１の微生物産生の間、微生物宿主は、望ましくないベータ結合モグロシドを加水分解してモグロシドＩＩＩＥに戻す。このため、化合物１の純度は、以下により改善される：１）望ましくないモグロシドＶＩ、モグロシドＶおよびモグロシドＩＶのレベルの低減、２）加水分解により、化合物１の産生のための前駆体として使用されるべき利用可能なモグロシドＩＩＩＥの量が増加する。
図３８は、グリコソル化酵素による高度グリコシル化モグロシドの産生を示し、これは次いで加水分解されてモグロシドＩＩＩＥに戻され得る。その結果、モグロシドの混合物は、高度グリコシル化モグロシドの望ましい収率よりも低い収率を有する。ヒドロラーゼは除去できるが、モグロシドの混合物が依然として得られ、産生生物の寿命は短くなり得る。しかしながら、化合物１は、加水分解に耐性があるので、加水分解を使用して高度グリコシル化モグロシドをモグロシドＩＩＩＥに誘導し、次にこれを化合物１に変換することができる（図３９に示す通り）。
いくつかの実施形態では、ヒドロラーゼは、β−グルカンヒドロラーゼである。いくつかの実施形態では、ヒドロラーゼは、ＥＸＧ１である。ＥＸＧ１タンパク質は、配列番号１０１３または１０１４と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＥＸＧ１タンパク質は、配列番号１０１３または１０１４に記載されたアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ヒドロラーゼは、ＥＸＧ２である。ＥＸＧ２タンパク質は、配列番号１０２３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＥＸＧ２タンパク質は、配列番号１０２３に記載されたアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。ヒドロラーゼは、例えば、本明細書に開示されたヒドロラーゼのいずれか１つであり得る。
モグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生
化合物１は、モグロシドＩＩＩＥを化合物１に変換することが可能な１種以上の酵素との接触によりモグロシドＩＩＩＥから産生され得る。いくつかの実施形態では、化合物１の産生を触媒することが可能な酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上である。
いくつかの実施形態では、化合物１の産生を触媒することが可能な酵素は、ＣＧＴアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＧＴアーゼは、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４のいずれか１つの配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＧＴアーゼは、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４のアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、化合物１の産生を触媒することが可能な酵素は、デキストランスクラーゼである。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号２、１０３、１０６〜１１０、１５６および８９６のいずれか１つの配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号２、１０３、１０６〜１１０、１５６および８９６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号１０４、１０５、１５７、１５８および８９５のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号１０４、１０５、１５７、１５８および８９５のいずれか１つを含むかまたはそれらからなる核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、化合物１の産生を触媒することが可能な酵素は、トランスグルコシダーゼである。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号１６３〜２９０および７２３のいずれか１つと、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号１６３〜２９２および７２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。配列同一性パーセントを決定するためのパラメータは、Ｂｌａｓｔ検索（ncbi.nih.gov）によるＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアを用いて実行され得る。これらのプログラムを使用すると、タンパク質ホモログ間の保存を決定することができる。
いくつかの実施形態では、化合物１の産生を触媒することが可能な酵素は、ウリジンジホスフェート−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）である。ＵＧＴは、例えば、配列番号４〜９、１５〜１９、１２５、１２６、１２８、１２９、２９３〜３０７、４０７、４０９、４１１、４１３、４３９、４４１および４４４のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、配列番号４〜９、１０〜１４、１２５、１２６、１２８、１２９、２９３〜３０４、３０６、４０７、４０９、４１１、４１３、４３９、４４１および４４４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、ＵＧＴ１４９５（配列番号１０）、ＵＧＴ１８１７（配列番号１１）、ＵＧＴ５９１４（配列番号１２）、ＵＧＴ８４６８（配列番号１３）、ＵＧＴ１０３９１（配列番号１４）および配列番号１１６〜１２４、１２７、１３０、４０８、４１０、４１２、４１４、４４０、４４２、４４３および４４５と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、ＵＧＴ１４９５（配列番号１０）、ＵＧＴ１８１７（配列番号１１）、ＵＧＴ５９１４（配列番号１２）、ＵＧＴ８４６８（配列番号１３）、ＵＧＴ１０３９１（配列番号１４）、配列番号１１６〜１２４、１２７、１３０、４０８、４１０、４１２、４１４、４４０、４４２、４４３および４４５の核酸配列のいずれか１つを含み、それらからなる核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、酵素は、ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８であり得る。例えば、本明細書に記載されるように、化合物１を産生することが可能な組換え宿主細胞は、ＵＧＴ９８および／またはＵＧＴ ＳＫ９８をコードする第３の遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８は、配列番号９または１６と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、ＵＧＴ７３Ｃ３（配列番号４）、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号５）、ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号６）、ＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号７）、ＵＧＴ７３Ｅ１（配列番号８）、ＵＧＴ９８（配列番号９）、ＵＧＴ１５７６（配列番号１５）、ＵＧＴ ＳＫ９８（配列番号１６）、ＵＧＴ４３０（配列番号１７）、ＵＧＴ１６９７（配列番号１８）およびＵＧＴ１１７８９（配列番号１９）と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、ＵＧＴ７３Ｃ３（配列番号４）、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号５）、８５Ｃ２（配列番号６）、ＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号７）、ＵＧＴ７３Ｅ１（配列番号８）、ＵＧＴ９８（配列番号９）、ＵＧＴ１５７６（配列番号１５）、ＵＧＴ ＳＫ９８（配列番号１６）、ＵＧＴ４３０（配列番号１７）、ＵＧＴ１６９７（配列番号１８）およびＵＧＴ１１７８９（配列番号１９）のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、ＵＧＴ１４９５（配列番号１０）、ＵＧＴ１８１７（配列番号１１）、ＵＧＴ５９１４（配列番号１２）、ＵＧＴ８４６８（配列番号１３）またはＵＧＴ１０３９１（配列番号１４）と、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、ＵＧＴ１４９５（配列番号１０）、ＵＧＴ１８１７（配列番号１１）、ＵＧＴ５９１４（配列番号１２）、ＵＧＴ８４６８（配列番号１３）およびＵＧＴ１０３９１（配列番号１４）の配列のいずれか１つを含むかまたはそれらからなる核酸配列によってコードされる。本明細書に開示されるように、化合物１の産生を触媒することが可能な酵素は、本明細書に開示されるＵＧＴ酵素のいずれか１つと、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。さらに、化合物１を産生することが可能な組換え宿主細胞は、本明細書に開示されるＵＧＴ酵素のいずれか１つと、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる酵素を含み得る。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、本明細書に開示されるＵＧＴ酵素のいずれか１つの配列を含むかまたはそれからなる酵素を含む。
いくつかの実施形態では、化合物１の産生方法は、モグロシドＩＩＩＥを、グルコーストランスフェラーゼ酵素ＵＧＴ７６Ｇ１、例えば、配列番号４３９のＵＧＴ７６Ｇ１および配列番号４４０の核酸配列によってコードされたＵＧＴ７６Ｇ１で処理することを含む。
モグロシド化合物および化合物１の産生のための酵素
本明細書に記載されるように、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼの酵素は、本明細書の配列の表に記載されたアミノ酸配列を含み、また、配列の表に記載された核酸配列によってコードされ得る。さらに、酵素は、配列の表に記載されたアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する機能的ホモログも含み得る。配列同一性パーセントを決定するためのパラメータは、Ｂｌａｓｔ検索（ncbi.nih.gov）によるＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアを用いて実行され得る。これらのプログラムを使用すると、タンパク質ホモログ間の保存を決定することができる。
いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号１６３〜２９０および７２３のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＧＴアーゼは、配列番号１、３、７８〜１０１および１５４のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号１６３〜２９０および７２３のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含むか、核酸配列によってコードされる。
本明細書の方法はまた、ピルビン酸、アセチルＣｏＡ、クエン酸塩および他のＴＣＡ中間体（クエン酸回路）などの中間体を産生するために、組換え細胞内に遺伝子を組み込むことを含む。中間体はさらに、化合物１を産生するためのモグロシド化合物の産生に使用され得る。スクアレン含有量を増加させる方法は、GruchattkaらおよびRodriguezら（PLoS One. 2015年12月23日; 10（12; Microb Cell Fact. 2016年3月3日; 15:48；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
オキシドスクアレンおよびジエポキシスクアレンを産生するための酵素の発現がさらに考えられている。オキシドスクアレンおよびジエポキシスクアレンを産生するための酵素の使用は、スクアレンシンターゼおよび／またはスクアレンエポキシダーゼによってスクアレン合成をブーストするために使用され得る。例えば、Suらには、スクアレンシンターゼのためのラカンカ由来の４１７アミノ酸タンパク質であるＳｇＳＱＳをコードする遺伝子が記載されている（Biotechnol Lett. 2017年3月28日；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの発現のために組換え細胞を遺伝子操作することは、スクアレン合成にも有用である（Appl Environ Microbiol. 1997年9月; 63(9):3341-4. ; Front Plant Sci. 2011年6月30日; 2:25; FEBS J. 2008年4月; 275(8):1852-9.；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、２，３−オキシドスクアレンまたはジエポキシスクアレンは、配列番号８９８または９００と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する配列を含む酵素によって産生される。いくつかの実施形態では、２，３−オキシドスクアレンまたはジエポキシスクアレンは、配列番号８９７または８９９と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる酵素によって産生される。
ククルビタジエノール／エポキシククルビタジエノールを産生するための酵素の発現も考えられる。ペポカボチャ（C pepo）、ラカンカ（S grosvenorii）、サフラン（C sativus）、メロン（C melo）、ニホンカボチャ（C moschata）およびセイヨウカボチャ（C maxim）由来のククルビタジエノールシンターゼの例は、発現のためのベクターによる組換え細胞への操作が考えられる。チテルペン生合成用のオキシスクアレンシクラーゼも、組換え細胞での発現が考えられており、これにより非環式基質が環化して様々な多環式トリテルペンになり、これは化合物１の産生のための中間体としても使用され得る（Org Biomol Chem. 2015年7月14日;13(26):7331-6; その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
ヒドロキシククルビタジエノールを作るためのエポキシドヒドロラーゼ活性を示す酵素の発現も考えられる。本明細書のいくつかの実施形態では、ヒドロキシククルビタジエノールを作るためのエポキシドヒドロラーゼ活性を示す酵素をコードする遺伝子をさらに含む、化合物１の産生のための組換え細胞が提供される。かかる酵素は、Itkinらに示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Itkinらに記載された酵素は、第１表（本明細書に示された配列表）に示されている。また、Itkinらには、グリコシル化などの逆反応のために遺伝的に修飾され得る、重要なモグロシド、ＵＧＳファミリー、グリコシルトランスフェラーゼおよびヒドロラーゼを作るための酵素についても記載されている。
モグロシド化合物を加水分解してモグロールを産生する組換え細胞内での酵素の発現も、考えられている。これらの酵素には、ＣＡＺＹファミリーのタンパク質、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼ、デキストラナーゼ、酵母および真菌ヒドロラーゼが含まれる。かかる酵素は、例えば、モグロシドＶをモグロシドＩＩＩＥに加水分解するために使用することができ、ここで、モグロシドＩＩＩＥはさらに処理されて、例えばインビボで化合物１を産生し得る。いくつかの実施形態では、真菌ラクターゼは、配列番号６７８〜７２２のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、モグロール前駆体、例えば、スクアレンまたはオキシドスクアレン、モグロールまたはモグロシドが産生される。モグロール前駆体は、化合物１の産生における前駆体として使用され得る。スクアレンは、スクアレンシンターゼを使用してファメシルピロリン酸から産生され、オキシドスクアレンは、スクアレンエポキシダーゼを使用してスクアレンから産生され得る。スクアレンシンターゼは、例えば、ウリ科ファミリーの植物であるアマチャヅル（Gynostemma pentaphyllum）（タンパク質受託番号Ｃ４Ｐ９Ｍ２）由来のスクアレンシンターゼであり得る。また、スクアレンシンターゼは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（タンパク質受託番号Ｃ４Ｐ９Ｍ３）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、ロフィルラ（Citrus macrophylla）、ミドリサンゴ（Euphorbia tirucalli）（タンパク質受託番号Ｂ９ＷＺＷ７）、ダイズ（Glycine max）、スペインカンゾウ（Glycyrrhiza glabra）（タンパク質受託番号Ｑ４２７６０、Ｑ４２７６１）、ウラルカンゾウ（Glycrrhiza uralensis）（タンパク質受託番号Ｄ６ＱＸ４０、Ｄ６ＱＸ４１、Ｄ６ＱＸ４２、Ｄ６ＱＸ４３、Ｄ６ＱＸ４４、Ｄ６ＱＸ４５、Ｄ６ＱＸ４７、Ｄ６ＱＸ３９、Ｄ６ＱＸ５５、Ｄ６ＱＸ３８、Ｄ６ＱＸ５３、Ｄ６ＱＸ３７、Ｄ６ＱＸ３５、Ｂ５ＡＩＤ５、Ｂ５ＡＩＤ４、Ｂ５ＡＩＤ３、Ｃ７ＥＤＤ０、Ｃ６ＫＥ０７、Ｃ６ＫＥ０８、Ｃ７ＥＤＣ９）、ミヤコグサ（Lotus japonicas）（タンパク質受託番号Ｑ８４ＬＥ３）、ウマゴヤシ（Medicago truncatula）（タンパク質受託番号Ｑ８ＧＳＬ６）、エンドウ（Pisum sativum）、トウゴマ（Ricinus communis）（タンパク質受託番号Ｂ９ＲＨＣ３）由来のスクアレンシンターゼも含み得る。様々なスクアレンシンターゼが、国際公開第２０１６／０５０８９０号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
組換え宿主細胞
本明細書に開示された酵素のいずれか１つは、インビトロ、エクスビボまたはインビボで産生され得る。例えば、酵素をコードする核酸配列（ＵＧＴｓ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼ、デキストラナーゼ、シトクロムＰ４５０、エポキシドヒドロラーゼ、ククルビタジエノールシンターゼ、スクアレンエポキシダーゼ、スクアレンシンターゼ、ヒドロラーゼおよびオキシドスクアレンシクラーゼのいずれか１つを含むが、これらに限定されない）は、例えばコード核酸配列を含む発現ベクターの形で、インビボで宿主組換え細胞に導入され得る。発現ベクターは、例えば、標準的な形質転換技術（例えば、熱形質転換）またはトランスフェクションにより、宿主細胞に導入され得る。発現系は、細胞においてインビボで化合物１を産生するために、モグロシドおよび化合物１の産生のための酵素を産生し得る。有用な発現系には、細菌、酵母および昆虫細胞系が含まれるが、これらに限定されない。例えば、昆虫細胞系は、目的の酵素の発現のために組換えウイルス発現系で感染され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子は、特定の細胞での発現に最適化されたコドンである。いくつかの実施形態では、遺伝子は、酵素タンパク質の転写および翻訳を駆動するプロモーターに作動可能に連結されている。本明細書に記載されるように、コドン最適化を得ることができ、そして最適化された配列は、次いで、組換え宿主細胞を形質転換するためのベクターに組み込まれ得る。
発現ベクターは、酵母細胞で目的の遺伝子の転写を促進するために、転写または翻訳調節配列、転写もしくは翻訳因子のためのコード配列または種々のプロモーター（例えば、ＧＰＤ１プロモーター）および／またはエンハンサーをさらに含み得る。
本明細書に記載される組換え細胞は、いくつかの実施形態では、インビボで化合物１を産生するように遺伝的に修飾されている。さらに、細胞が、細胞成長中または細胞成長後にモグロール前駆体またはモグロシド前駆体に供給されて、インビボで化合物１を産生するための経路の特定の中間体の産生速度をブーストし得る。細胞は、懸濁状または固定化状であり得る。細胞は、発酵ブロス中または反応緩衝液中にあり得る。いくつかの実施形態では、浸透化剤は、細胞へのモグロール前駆体またはモグロシド前駆体の移動に使用される。いくつかの実施形態では、モグロール前駆体またはモグロシド前駆体は、精製された形でまたは組成物もしくは抽出物の一部として供給され得る。
組換え宿主細胞は、例えば、植物、二枚貝、魚、真菌、細菌または哺乳動物細胞であり得る。例えば、植物は、ラカンカ属、ツルレイシ属、アマチャヅル属、カボチャ属、キュウリ属、シロイヌナズナ属、ヨモギ属、ステビア属、トチバニンジン属、ウィザニア属、トウダイグサ属、ウマゴヤシ属、オリヅルラン属、ウコギ属、タラノキ属、クワ属、ウマゴヤシ属、カバノキ属、ゲンゲ属、ナンヨウアブラギリ属、ツバキ属、クリタケ属、アスペルギルス属、ナス属、コスギラン属、ワチガイソウ属、ツナソ属、キヅタ属、ゼニゴケ属およびクワ属から選択され得る。真菌は、白癬菌、サングハングポルス属、タイワノフングス属、シラガニセホウライタケ属、マルソニア属、ディプロディア属、シイタケ属、キサントフィロミセス属、ポコニア属、コレトトリカム属、ジアポルテ属、ヒストプラズマ属、コクシジオイデス属、ヒストプラズマ属、サングハングポルス属、アウレオバシジウム属、ポコニア属、ペニシリウム属、スポロトリックス属、メタリジウム属、アスペルギルス属、ヤロウィア属およびリポミセス属から選択され得る。いくつかの実施形態では、真菌は、アスペルギルス・ニデュランス、ヤロウィア・リポリティカまたはロドスポリジウム・トルロイデスである。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、酵母細胞である。いくつかの実施形態では、酵母は、カンジダ属、サッカロミセス属、サッカロミケス亜門、タフリナ菌亜門、シゾサッカロミセス綱、コマガタエラ属、担子菌門、ハラタケ亜門、シロキクラゲ綱、サビキン亜門、アウレオバシジウム属、コニオカエタ属、ロドスポリジウム属、ヤロウィア属およびミクロボリオミセテスから選択される。いくつかの実施形態では、細菌は、フランキア属、アクチノバクテリア、ストレプトマイセス属およびエンテロコッカス属から選択される。いくつかの実施形態では、細菌は、エンテロコッカス・ファエカリス（Enterococcus faecalis）である。
いくつかの実施形態では、組換え遺伝子は、細菌、哺乳動物、植物、真菌または昆虫細胞での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、遺伝子のうちの１つ以上は、コードされた酵素の活性を増加させる機能的変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞の培養は、組換え宿主細胞の培養は、培養条件のｐＨ、溶存酸素レベル、窒素レベルまたはそれらの組み合わせについて培養をモニタリングすることを含む。
スクアレンからのモグロールの産生
化合物１を産生するための方法のいくつかの実施形態は、化合物１の産生に使用するための中間体を産生することを含む。構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物は、組換え宿主においてインビボで産生される。いくつかの実施形態では、前記化合物は、前記組換え宿主細胞内にあるか、前記組換え細胞が増殖している培地に分泌されるかまたはその双方である。いくつかの実施形態では、前記組換え細胞は、インビボでモグロシド化合物などの中間体をさらに産生する。前記組換え細胞は、本明細書に開示される遺伝子が発現される条件下で、培養培地で増殖され得る。前記細胞を増殖させる方法のいくつかの実施形態は、本明細書に記載されている。
いくつかの実施形態では、中間体は、オキシドスクアレン、ククルビタジエノール、モグロールおよびモグロシドのうちの少なくとも１種であるかまたはこれらを含む。いくつかの実施形態では、モグロシドは、モグロシドＩＩＥである。本明細書に記載されるように、モグロシドは、例えば、植物または果物から自然に単離され得るグリコシドのファミリーである。本明細書で考えられているように、モグロシドは、組換え宿主細胞により産生され得る。
本明細書に記載される方法のいくつかの代替形態では、組換え宿主細胞は、ポリヌクレオチドを含むかまたは以下の１つ以上を含む配列を含む：
スクアレンエポキシダーゼをコードする遺伝子；
ククルビタジエノールシンターゼをコードする遺伝子；
シトクロムＰ４５０をコードする遺伝子；
シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子；および
エポキシドヒドロラーゼをコードする遺伝子。
いくつかの実施形態では、スクアレンエポキシダーゼは、配列番号５４と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、配列を含む。いくつかの実施形態では、スクアレンエポキシダーゼは、シロイヌナズナ（タンパク質受託番号：Ｑ９ＳＭ０２、０６５４０３、０６５４０２、０６５４０４、０８１０００またはＱ９Ｔ０６４）、セイヨウアブラナ（タンパク質受託番号１００６５７２７、０６５７２６）、ミドリサンゴ（タンパク質受託番号Ａ７ＶＪＮ１）、ウマゴヤシ（タンパク質受託番号Ｑ８ＧＳＭ８、Ｑ８ＧＳＭ９）、エンドウおよびトウゴマ（タンパク質受託番号Ｂ９Ｒ６ＶＯ、Ｂ９Ｓ７Ｗ５、Ｂ９Ｓ６Ｙ２、Ｂ９ＴＯＹ３、Ｂ９Ｓ７ＴＯ、Ｂ９ＳＸ９１）由来の配列、ならびにそれらと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有する前述のいずれかの機能的ホモログを含む。いくつかの実施形態では、スクアレンエポキシダーゼは、配列番号５０〜５６、６０、６１、３３４または３３５と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
いくつかの実施形態では、細胞は、ＥＲＧ７（ラノステロールシンターゼ）をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ラノステロールシンターゼは、配列番号１１１と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０ポリペプチドは、請求項３１から４８までのいずれか１項と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する配列を含む遺伝子にコードされる。いくつかの実施形態では、配列は、リボソームスキップ配列により分離されて、分離されたタンパク質を産生することができる。
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４および９０６のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４および９０６のいずれか１つの配列と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、配列を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号７３に記載された配列を含むＣ末端部分を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、コドン最適化されている。いくつかの実施形態では、コドン最適化遺伝子は、配列番号７４に記載された核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、ククルビタジエノールシンターゼに融合した融合ドメインを含む融合ポリペプチドである。融合ドメインは、例えば、ククルビタジエノールシンターゼのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。融合ドメインは、例えば、融合ポリペプチドのＮ末端領域またはＣ末端領域に位置し得る。融合ドメインの長さは、さまざまであり得る。例えば、融合ドメインは、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００アミノ酸長またはこれらの数値の任意の２つの間の範囲のアミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、融合ドメインは、３〜１０００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、融合ドメインは、５〜５０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、融合ドメインは、機能性タンパク質の配列の実質的な部分または配列全体を含む。いくつかの実施形態では、融合ドメインは、酵母タンパク質の配列の一部または配列全体を含む。例えば、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有する融合ポリペプチドは、配列番号８５１、８５４、８５６、１０２４、８５９、８６２、８６５、８６７、９１５、９２０、９２４、９２８、９３２、９３６、９４０、９４４、９４８、９５２、９５６、９５９、９６４、９６７、９７１、９７５、９７９、９８３、９８７、９９１、９９５、９９９、１００３、１００７および１０１１のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号８５１、８５４、８５６、１０２４、８５９、８６２、８６５、８６７、９１５、９２０、９２４、９２８、９３２、９３６、９４０、９４４、９４８、９５２、９５６、９５９、９６４、９６７、９７１、９７５、９７９、９８３、９８７、９９１、９９５、９９９、１００３、１００７および１０１１のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの融合ドメインは、配列番号８６６、８７０、９１７、９２１、９２５、９２９、９３３、９３７、９４１、９４５、９４９、９５３、９５７、９６１、９６８、９７２、９７６、９８０、９８４、９８８、９９２、９９６、１０００、１００４、１００８および１０１２のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの融合ドメインは、配列番号８６６、８７０、９１７、９２１、９２５、９２９、９３３、９３７、９４１、９４５、９４９、９５３、９５７、９６１、９６８、９７２、９７６、９８０、９８４、９８８、９９２、９９６、１０００、１００４、１００８および１０１２のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、融合ドメインと融合したククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４および９０６のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合ドメインと融合したククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４および９０６のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、融合ドメインと融合したククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３および９０５のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有する核酸配列を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、融合ドメインと融合したククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３および９０５のいずれか１つに記載された核酸配列を含むかまたはそれらからなる遺伝子によってコードされる。本明細書では、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有する融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子が開示されている。また、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有する融合ポリペプチドを含む組換え細胞または融合ポリペプチドをコードする組換え核酸分子も開示されている。
本明細書に開示されたククルビタジエノールシンターゼ活性を有する融合ポリペプチドは、ククルビタジエノールシンターゼとして酵素反応を触媒するために使用され得る。例えば、ククルビタジエノールシンターゼの基質は、これらの融合ポリペプチドの１つ以上と接触して、反応産生物を産生し得る。反応産生物の非限定的な例としては、ククルビタジエノール、２４，２５−エポキシククルビタジエノールおよびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。ククルビタジエノールシンターゼの基質の非限定的な例としては、２，３−オキシドスクアレン、ジオキシドスクアレン、ジエポキシスクアレンおよびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、基質は、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有する１つ以上の融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え宿主細胞と接触し得る。基質は、組換え宿主細胞に供給され得るか、組換え宿主細胞に存在し得るか、組換え宿主細胞により産生され得るかまたはそれらの任意の組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０は、ＣＹＰ５４９１である。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ５４０は、配列番号４４および／または配列番号７４に記載された配列と、少なくとも、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０レダクターゼポリペプチドは、配列番号４６と、少なくとも、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０ポリペプチドは、配列番号３１〜４８、３１６、４３１、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７および８９１のいずれか１つと、少なくとも、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有する配列を含む遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態では、エポキシドヒドロラーゼは、配列番号３８または４０と、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたは少なくともこれらの数字の配列同一性を有するかまたはこれらの数字のいずれか２つの間の範囲の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、エポキシドヒドロラーゼは、配列番号３８または４０に記載された配列を含むかまたはそれらからなる。
モグロール産生のためのスクアレンのいくつかの産生方法
スクアレンは、植物および動物で産生され得る天然の３０炭素有機分子であり、かつステロイドファミリーの生化学的前駆体である。さらに、スクアレンは、宿主組換え細胞においてインビボでのモグロール合成の前駆体として使用され得る。スクアレンの末端二重結合の１つを（スクアレンモノオキシゲナーゼを介して）酸化すると、２，３−スクアレンオキシドが生成し、これが酵素触媒による環化を受けて、ラノステロールが生成される。ラノステロールは、次いでコレステロールや他のステロイドに合成される。Gruchattkaら（“In Vivo Validation of In Silico Predicted Metabolic Engineering Strategies in Yeast: Disruption of α-Ketoglutarate Dehydrogenase and Expression of ATP-Citrate Lyase for Terpenoid Production.” PLOS ONE, 2015年12月23日；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、スクアレンの合成は、最初に解糖サイクルの前駆体から起こって、スクアレンを産生し得る。スクアレンは、次にＡＴＰクエン酸リアーゼの過剰発現によって上方制御され、スクアレンの産生を増加させ得る。本明細書に開示されたいくつかの実施形態は、組換え宿主細胞、例えば組換え酵母細胞においてスクアレンの産生および／またはスクアレンの産生をブーストするための酵素を含む。ＡＴＰクエン酸リアーゼは、スクアレンおよびメバロン酸の産生に使用され得るアセチルＣｏＡの合成を媒介することもでき、これは酵母、サッカロミセス・セレビシエに見られた（Rodriguesら “ATP citrate lyase mediated cytosolic acetyl-CoA biosynthesis increases mevalonate production in Saccharomyces cerevisiae” Microb Cell Fact. 2016年; 15: 48.；その全体が参照により組み込まれる）。アセチルＣｏＡ合成を媒介するための酵素をコードする遺伝子の一例は、配列番号１３０に記載されている。本明細書のいくつかの実施形態では、組換え細胞は、アセチルＣｏＡ合成を媒介するための配列を含む。
本明細書に開示されたいくつかの実施形態では、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１を産生するための方法が提供される。
いくつかの実施形態では、この方法は、化合物１をインビボで産生するための経路において中間体を産生することをさらに含む。いくつかの実施形態では、化合物１を産生する組換え宿主細胞は、ジオキシドスクアレンを変換して２４，２５−エポキシククルビタジエノールを産生し、オキシドスクアレンをククルビタジエノールに変換し、２４，２５−エポキシククルビタジエノールの１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールへのヒドロキシル化を触媒することが可能な酵素、ククルビタジエノールの１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールへの加水分解を触媒する酵素、ククルビタジエノールを２４，２５−エポキシククルビタジエノールにエポキシ化する酵素、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールのエポキシ化を触媒して１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールを産生する酵素、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールに変換する酵素、１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールを変換してモグロールを産生する酵素および／またはモグロシド前駆体のグリコシル化を触媒してモグロシド化合物を産生する酵素のうち少なくとも１種を含む。いくつかの実施形態では、グリコシル化のための酵素は、配列番号１２１、１２２、１２３および１２４のいずれか１つに記載された配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、２４，２５−エポキシククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒して１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールを形成するための酵素は、ＣＹＰ５４９１である。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ５４９１は、配列番号４９に記載された配列を含む。いくつかの実施形態では、スクアレンエポキシダーゼは、配列番号５４の配列と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、配列を含む。
いくつかの実施形態では、１１−ヒドロキシククルビタジエノールのエポキシ化が可能な酵素は、配列番号７４に記載されたアミノ酸配列を含む。
いくつかの代替形態では、組換え細胞は、ジオキシドスクアレントを２４，２５−エポキシククルビタジエノールに変換すること、オキシドスクアレンをククルビタジエノールに変換すること、２４，２５−エポキシククルビタジエノールを１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールにヒドロキシル化すること、ククルビタジエノールをヒドロキシル化して１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを産生すること、ククルビタジエノールをエポキシ化して２４，２５−エポキシククルビタジエノールを産生することおよび／または１１−ヒドロキシククルビタジエノールをエポキシ化して１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールを産生することが可能な酵素を発現するための遺伝子を含む。本明細書のこれらの実施形態では、中間体およびモグロシドは、インビボで産生される。
いくつかの実施形態では、化合物１の産生方法は、モグロシド化合物および中間体、例えば、オキシドスクアレン、ジキシドスクアレン、ククルビタジエノール、２４，２５−エポキシククルビタジエノール、１１−ヒドロシ−ククルビタジエノール、１１−ヒドロキシ２４，２５−エポキシククルビタジエノール、モグロールおよびモグロシド化合物のうち１種以上を産生することをさらに含む。
モグロシド化合物の産生方法
モグロシド化合物、例えば、国際公開第２０１４０８６８４２号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたモグロシド化合物の１種の産生方法が本明細書に記載されている。モグロシド化合物は、本明細書に開示された化合物１をさらに産生する細胞により中間体として使用され得る。
微生物、植物細胞または植物などの組換え宿主は、モグロール（トリテルペンコア）およびさまざまなモグロールグリコシド（モグロシド）の生合成に有用なポリペプチドを発現させるために使用され得る。
いくつかの実施形態では、産生方法は、以下の工程の１つ以上を任意の順序で含み得る：
（１）オキシドスクアレンのレベルを高める工程
（２）ジオキシドスクアレンのレベルを高める工程
（３）オキシドスクアレン−＞ククルビタジエノール
（４）ジオキシドスクアレン−＞２４，２５−エポキシククルビタジエノール
（５）ククルビタジエノール−＞１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール
（６）２４，２５−エポキシククルビタジエノール−＞１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノール
（７）１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール−＞モグロール
（８）１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノール−＞モグロール
（９）モグロール−＞さまざまなモグロシド化合物。
本明細書の実施形態では、オキシド−スクアレン、ジオキシド−スクアレン、ククルビタジエノール、２４，２５−エポキシククルビタジエノールまたはモグロールも、組換え細胞によって産生され得る。この方法は、本発明の方法の触媒工程で１種以上の酵素、例えば、シンターゼ、ヒドロラーゼ、ＣＹＰ４５０および／またはＵＧＴが発現される条件下で、組換え微生物を、培養培地で増殖させることを含み得る。組換え微生物は、流加法または連続法で増殖され得る。典型的には、組換え微生物は、化合物１の収量を増加させるために、所望の期間、定義された温度にて発酵槽内で増殖される。
いくつかの実施形態では、モグロシド化合物は、化合物１の収量を増加させるために、前駆体分子を含む供給された原料である全細胞を用いて産生され得る。原料は、細胞増殖中または細胞増殖後に供給され得る。全細胞は、懸濁状または固定化状であり得る。全細胞は、発酵ブロスまたは反応緩衝液中にあり得る。
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、オキシド−スクアレンをククルビタジエノールに、ククルビタジエノールを１１−ヒドロキシククルビタジエノールに、１１−ヒドロキシククルビタジエノールをモグロールにおよび／またはモグロールをモグロシドに触媒することが可能な酵素または酵素の混合物をコードする異種核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ジオキシド−スクアレンを２４，２５−エポキシククルビタジエノールに、２４，２５−エポキシククルビタジエノールをヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールに、１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールをモグロールにおよび／またはモグロールをモグロシドに触媒することが可能な酵素または酵素の混合物をコードする異種核酸を含み得る。
宿主細胞は、ククルビタジエノールシンターゼをコードする組換え遺伝子および／またはシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含み得る。
いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４および９０６（ククルビタジエノールシンターゼ）のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、オキシド−スクアレンのククルビタジエノールへの変換は、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４および９０６のいずれか１つのククルビタジエノールシンターゼによって触媒されるかまたはそれらと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するそれらの機能的ホモログによって触媒される。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドは、配列番号７３に記載された配列を含むＣ末端部分を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、コドン最適化されている。いくつかの実施形態では、コドン最適化された遺伝子は、配列番号７４に記載の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールの１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールへの変換は、配列番号４９のＣＹＰ５４９１によって触媒されるかまたはそれらと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するそれらの機能的ホモログによって触媒される。
いくつかの実施形態では、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールのモグロールへの変換は、配列番号２９のエポキシドヒドロラーゼ、配列番号３０のエポキシドヒドロラーゼおよびそれらと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有する前述の機能的ホモログからなる群から選択されるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、エポキシドヒドロラーゼ１およびエポキシドヒドロラーゼ２をコードする遺伝子は、発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、エポキシドヒドロラーゼのコドン最適化遺伝子は、配列番号１１４または１１５に記載された核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、エポキシドヒドロラーゼは、配列番号２１〜２８のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含む（Itkinら、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、モグロールのモグロシドへの変換は、配列番号１５のＵＧＴ１５７６、配列番号９のＵＧＴ９８、配列番号６８のＵＧＴ ＳＫ９８およびそれらと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有する前述の機能的ホモログからなる群から選択される１種以上のＵＧＴによって宿主組換え細胞で触媒される。
いくつかの実施形態では、宿主組換え細胞は、シトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含み、配列番号３１〜４８、３１６、４３１、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７および８９１の配列のいずれか１つによってコードされている。
いくつかの実施形態では、宿主組換え細胞は、配列番号５０の配列を含むスクアレンエポキシダーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、宿主組換え細胞は、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４および９０６のいずれか１つのククルビタジエノールシンターゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドは、配列番号７３に記載された配列を含むＣ末端部分を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、コドン最適化されている。いくつかの実施形態では、コドン最適化された遺伝子は、配列番号７４に記載された核酸配列を含む。
モグロールからのモグロシド化合物の産生
いくつかの実施形態では、化合物１の産生方法は、モグロシドＩＩＩＥを、モグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な第１の酵素と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、インビボで実施され、ここで、組換え細胞は、モグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な第１の酵素をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、モグロールからのモグロシドＩＥ１の産生を触媒することが可能な酵素をコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号４〜８のいずれか１つに記載された配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞はさらに、モグロシドＩＩＥを、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶおよびシアメノシドＩに変換する酵素を含む。いくつかの実施形態では、モグロシドＩＩＥを、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶおよびシアメノシドＩに変換する酵素は、配列番号９〜１４および１１６〜１２０に記載された核酸配列を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、化合物１の産生方法は、モグロシドＩＩＩＥを、グルコーストランスフェラーゼ酵素ＵＧＴ７６Ｇ１で処理することを含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、ＨＰＬＣカラムで組換え細胞から溶解物を分画し、化合物１を含む溶出フラクションを収集することを含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、モグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な第１の酵素と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、モグロシドＩＩＩＥを第１の酵素と接触させることは、モグロシドＩＩＩＥを第１の酵素をコードする第１の遺伝子を含む組換え宿主細胞と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子は、組換え宿主細胞に対して異種である。いくつかの実施形態では、モグロシドＩＩＩＥは、第１の酵素をコードする第１のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞内の第１の酵素と接触する。いくつかの実施形態では、モグロシドＩＩＩＥは、組換え宿主細胞に存在する。いくつかの実施形態では、モグロシドＩＩＩＥは、組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、この方法は、第１の酵素が発現される条件下で、培養培地で組換え宿主細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上である。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、ＣＧＴアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＧＴアーゼは、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４のいずれか１つの配列と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号１６３〜２９０および７２３のいずれか１つによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＧＴアーゼは、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４のいずれか１つに記載された配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、デキストランスクラーゼである。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号２、１０３、１０６〜１１０、１５６および８９６のいずれか１つの配列と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤｅｘＴは、配列番号２、１０３、１０６〜１１０、１５６および８９６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤｅｘＴは、配列番号１０４または１０５に記載された核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号２または１０６〜１１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、トランスグルコシダーゼである。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号３、１６３〜２９１および７２３のいずれか１つの配列と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号１６３〜２９１および７２３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号１６３〜２９１および７２３のいずれか１つによってコードされる。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号１６３〜２９０および７２３のいずれか１つによって記載されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、配列番号１、３、７８〜１０１および１５４に記載された配列のいずれか１つを含むＣＧＴアーゼをコードする。
いくつかの実施形態では、この方法は、モグロシドＩＩＡを組換え宿主細胞と接触させてモグロシドＩＩＩＥを産生することを含み、ここで、組換え宿主細胞はさらに、モグロシドＩＩＡからモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な第２の酵素をコードする第２の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、モグロシドＩＩＡは、組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、第２の酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上である。いくつかの実施形態では、第２の酵素は、ウリジンジホスフェート−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）である。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号１６３〜２９０および７２３のいずれか１つによって記載されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４に記載されたアミノ酸配列を含むＣＧＴアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、ＵＧＴ７３Ｃ３（配列番号４）、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号５、４４４または４４５）、８５Ｃ２（配列番号６）、ＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号７）、ＵＧＴ７３Ｅ１（配列番号８）、ＵＧＴ９８（配列番号９または４０７）、ＵＧＴ１５７６（配列番号１５）、ＵＧＴ ＳＫ９８（配列番号１６）、ＵＧＴ４３０（配列番号１７）、ＵＧＴ１６９７（配列番号１８）、もしくはＵＧＴ１１７８９（配列番号１９）または配列番号４、５、７〜９、１５〜１９、１２５、１２６、１２８、１２９、２９３〜３０４、３０６、３０７、４０７、４３９、４４１および４４４のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、ＵＧＴ１４９５（配列番号１０）、ＵＧＴ１８１７（配列番号１１）、ＵＧＴ５９１４（配列番号１２）、ＵＧＴ８４６８（配列番号１３）またはＵＧＴ１０３９１（配列番号１４）に記載された遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態では、この方法は、モグロールを組換え宿主細胞と接触させてモグロシドＩＩＩＥを産生することを含み、ここで、組換え宿主細胞は、モグロールからのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な１種以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、モグロールは、組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、１種以上の酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を含む。いくつかの実施形態では、第２の酵素は、ウリジンジホスフェート−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）である。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、ＵＧＴ７３Ｃ３、ＵＧＴ７３Ｃ６、８５Ｃ２、ＵＧＴ７３Ｃ５、ＵＧＴ７３Ｅ１、ＵＧＴ９８、ＵＧＴ１４９５、ＵＧＴ１８１７、ＵＧＴ５９１４、ＵＧＴ８４６８、ＵＧＴ１０３９１、ＵＧＴ１５７６、ＵＧＴ ＳＫ９８、ＵＧＴ４３０、ＵＧＴ１６９７またはＵＧＴ１１７８９である。
いくつかの実施形態では、この方法は、モグロシド化合物を組換え宿主細胞と接触させてモグロシドＩＩＩＥを産生することを含み、ここで、組換え宿主細胞は、モグロシド化合物からのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な１種以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子をさらに含み、ここで、モグロシド化合物は、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＶまたはシアメノシドのうちの１種以上である。いくつかの実施形態では、モグロシド化合物は、組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、１種以上の酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を含む。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号１６３〜２９０および７２３のいずれか１つによって記載されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４に記載されたアミノ酸配列を含むＣＧＴアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、この方法は、モグロシドＩＡ１を組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８酵素は、配列番号９、４０７または１６と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、接触によって、細胞内でモグロシドＩＩＡが産生される。いくつかの実施形態では、１種以上の酵素は、配列番号１、３、７８〜１０１、１０６〜１０９、１４７、１５４、１６３〜３０３、４０５、４１１、３５４〜４０５、４４７〜７２３、７７０、７７６および７８２のいずれか１つによって記載されたアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、この方法はさらに、１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールを、組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞はさらに、エポキシドヒドロラーゼをコードする第３の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールは、組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを、組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、シトクロムＰ４５０またはエポキシドヒドロラーゼをコードする第４の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０ポリペプチドは、配列番号３１〜４８、３１６、４３１、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７および８９１のいずれか１つに記載された配列を含む遺伝子にコードされる。いくつかの実施形態では、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールは、組換え宿主細胞によって産生される。
いくつかの実施形態では、この方法はさらに、３，２４，２５トリヒドロキシククルビタジエノールを、組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞はさらに、シトクロムＰ４５０をコードする第５の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０ポリペプチドは、配列番号３１〜４８、３１６および３１８のいずれか１つに記載された配列を含む遺伝子にコードされる。いくつかの実施形態では、３，２４，２５トリヒドロキシククルビタジエノールは、組換え宿主細胞により産生される。いくつかの実施形態では、接触によって、組換え宿主細胞においてモグロールが産生される。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０は、配列番号２０、３０８または３１５と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０ポリペプチドは、配列番号３１〜４８、３１６、４３１、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７および８９１のいずれか１つに記載された配列を含む遺伝子にコードされる。いくつかの実施形態では、エポキシドヒドロラーゼは、配列番号２１〜３０および３０９〜３１４のいずれか１つと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、ククルビタジエノールを、組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、シトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、接触によって、１１−ククルビタジエノールが産生される。いくつかの実施形態では、１１−ヒドロキシククルビタジエノールは、ＣＹＰ８７Ｄ１８またはＳｇＣＰＲタンパク質をコードする遺伝子を含む細胞で発現される。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ８７Ｄ１８またはＳｇＣＰＲは、配列番号３１５、８７２または８７４に記載された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ８７Ｄ１８またはＳｇＣＰＲは、配列番号３１６、８７１または８７３によりコードされる。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールは、組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０をコードする遺伝子は、配列番号３１〜４８、３１６、４３１、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７および８９１のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０は、配列番号３１〜４８、３１６、４３１、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７および８９１と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０ポリペプチドは、配列番号３１〜４８、３１６、４３１、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７および８９１のいずれか１つに配列を含む遺伝子にコードされる。
いくつかの実施形態では、この方法はさらに、２，３−オキシドスクアレンを、組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、ククルビタジエノールシンターゼをコードする第７の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４または９０６に記載されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３および９０５に記載されたいずれか１つの配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、接触によって、ククルビタジエノールが産生される。いくつかの実施形態では、２，３−オキシドスクアレンは、組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、２，３−オキシドスクアレンまたはジエポキシスクアレンは、配列番号８９８または９００に記載された配列を含む酵素によって産生される。いくつかの実施形態では、２，３−オキシドスクアレンまたはジエポキシスクアレンは、配列番号８９７または８９９に記載された核酸配列によってコードされる酵素によって産生される。
いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７４に記載された配列を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３および９０５のいずれか１つに記載された核酸配列を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、１１−ヒドロキシククルビタジエノールは、細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、１１−ＯＨククルビタジエノールは、ＣＹＰ８７Ｄ１８またはＳｇＣＰＲタンパク質をコードする遺伝子を含む細胞で発現される。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ８７Ｄ１８またはＳｇＣＰＲは、配列番号３１５、８７２または８７４に記載された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ８７Ｄ１８またはＳｇＣＰＲは、配列番号３１６、８７１または８７３によってコードされる。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドは、配列番号７３に記載された配列を含むＣ末端部分を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子が、コドン最適化されている。いくつかの実施形態では、コドン最適化された遺伝子は、配列番号７４に記載された核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４および９０６（例えば、ペポカボチャ、ラカンカ、サフラン、メロン、ニホンカボチャおよびセイヨウカボチャ由来のククルビタジエノールシンターゼを含む）のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドは、配列番号７３に記載された配列を含むＣ末端部分を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、コドン最適化されている。いくつかの実施形態では、コドン最適化された遺伝子は、配列番号７４に記載された核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、国際公開第２０１６／０５０８９０号に記載され、その全体が参照により組み込まれている、ミヤコグサ（ＢＡＥ５３４３１）、ブラックコットンウッド（Populus trichocarpa）（ＸＰ＿００２３１０９０５）、ブラックコホシュ（Actaea racemosa）（ＡＤＣ８４２１９）、シラカンバ（Betula platyphylla）（ＢＡＢ８３０８５）、スペインカンゾウ（Glycyrrhiza glabra）（ＢＡＡ７６９０２）、ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）（ＸＰ＿００２２６４２８９）、ツボクサ（Centella asiatica）（ＡＡＳ０１５２４）、オタネニンジン（Panax ginseng）（ＢＡＡ３３４６０）およびシラカンバ（ＢＡＢ８３０８６）由来のポリペプチドを含むアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、スクアレンを組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、スクアレンエポキシダーゼをコードする第８の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、接触によって、２，３−オキシドスクアレンが産生される。いくつかの実施形態では、スクアレンは、組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、スクアレンエポキシダーゼは、配列番号５０〜５６、６０、６１、３３４または３３５と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、ファルネシルピロリン酸を組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、スクアレンシンターゼをコードする第９の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、接触によって、スクアレンが産生される。いくつかの実施形態では、ファルネシルピロリン酸は、組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、スクアレンシンターゼは、配列番号６９または３３６と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、この方法はさらに、ゲラニル−ＰＰを、組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、ファルネシル−ＰＰシンターゼをコードする第１０の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、接触によって、ファルネシル−ＰＰが産生される。いくつかの実施形態では、ゲラニル−ＰＰは、組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、ファルネシル−ＰＰシンターゼは、配列番号３３８と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の遺伝子のうちの１つ以上が、異種プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、異種プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、ヒトベータアクチン、ＣＡＧ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｕｂｉ、Ｔ７、Ｔ７ｌａｃ、Ｓｐ６、ａｒａＢＡＤ、ｔｒｐ、Ｌａｃ、Ｐｔａｃ、ｐＬプロモーターまたはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性、抑制性または構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、ピルビン酸、アセチル−ＣｏＡ、クエン酸塩およびＴＣＡサイクル中間体の１つ以上の産生は、組換え宿主細胞で上方制御されている。いくつかの実施形態では、サイトゾル局在は、組換え宿主細胞で上方制御されている。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の遺伝子のうちの１つ以上は、２Ａ自己切断ペプチドをコードする少なくとも１つの配列を含む。本明細書で使用される場合、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０などの用語から、特定の順序および／または前の番号の存在要件が推測されるものではない。例えば、本明細書に記載された組換え宿主細胞は、第１の遺伝子および第３の遺伝子を含み得るが、第２の遺伝子を含まないこともあり得る。別の例として、組換え宿主細胞は、第１の遺伝子、第５の遺伝子および第１０の遺伝子を含み得るが、第２の遺伝子、第３の遺伝子、第４の遺伝子、第６の遺伝子、第７の遺伝子、第８の遺伝子および第９の遺伝子を含まないこともあり得る。
組換え宿主細胞は、例えば、植物、二枚貝、魚、真菌、細菌または哺乳動物の細胞であり得る。例えば、植物は、ラカンカ属、ツルレイシ属、アマチャヅル属、カボチャ属、キュウリ属、シロイヌナズナ属、ヨモギ属、ステビア属、トチバニンジン属、ウィザニア属、トウダイグサ属、ウマゴヤシ属、オリヅルラン属、ウコギ属、タラノキ属、クワ属、ウマゴヤシ属、カバノキ属、ゲンゲ属、ナンヨウアブラギリ属、ツバキ属、クリタケ属、アスペルギルス属、ナス属、コスギラン属、ワチガイソウ属、ツナソ属、キヅタ属、ゼニゴケ属およびクワ属からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、真菌は、白癬菌、サングハングポルス属、タイワノフングス属、シラガニセホウライタケ属、マルソニア属、ディプロディア属、シイタケ属、キサントフィロミセス属、ポコニア属、コレトトリカム属、ジアポルテ属、ヒストプラズマ属、コクシジオイデス属、ヒストプラズマ属、サングハングポルス属、アウレオバシジウム属、ポコニア属、ペニシリウム属、スポロトリックス属、メタリジウム属、アスペルギルス属、ヤロウィア属およびリポミセス属から選択される。いくつかの実施形態では、真菌は、アスペルギルス・ニデュランス、ヤロウィア・リポリティカまたはロドスポリジウム・トルロイデスである。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、酵母細胞である。いくつかの実施形態では、酵母は、カンジダ属、サッカロミセス属、サッカロミケス亜門、タフリナ菌亜門、シゾサッカロミセス綱、コマガタエラ属、担子菌門、ハラタケ亜門、シロキクラゲ綱、サビキン亜門、アウレオバシジウム属、コニオカエタ属、ロドスポリジウム属およびミクロボリオミセテスから選択される。いくつかの実施形態では、細菌は、フランキア属、アクチノバクテリア、ストレプトマイセス属、エンテロコッカス属から選択される。いくつかの実施形態では、細菌は、エンテロコッカス・ファエカリスである。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の遺伝子のうちの１つ以上が、細菌、哺乳動物、植物、真菌または昆虫細胞での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の遺伝子のうちの１つ以上は、コードされる酵素の活性を高める機能的変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞の培養は、培養条件のｐＨ、溶存酸素レベル、窒素レベルまたはそれらの組み合わせについて培養をモニタリングすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、化合物１を単離することを含む。いくつかの実施形態では、化合物１を単離することは、組換え宿主細胞を溶解することを含む。いくつかの実施形態では、化合物１を単離することは、培養培地から化合物１を単離することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、化合物１を精製することを含む。いくつかの実施形態では、化合物１の精製は、ＨＰＬＣ、固相抽出またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、精製は、組換え細胞を回収すること、上清を保存することおよび細胞を溶解することを含む。いくつかの実施形態では、溶解は、細胞をせん断力または界面活性剤洗浄に供し、それにより溶解物を得ることを含む。いくつかの実施形態では、せん断力は、音波処理法、フレンチプレスセルまたはビーズから生じる。いくつかの実施形態では、溶解物は、濾過および精製工程に供される。いくつかの実施形態では、溶解物は、濾過され、固相抽出により精製される。
いくつかの実施形態では、化合物１の構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物が提供され、ここで、前記化合物は、本明細書で提供された代替法のいずれか１つの方法によって産生される。
いくつかの実施形態では、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１を含む細胞溶解物が提供される。
いくつかの実施形態では、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１およびモグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な酵素をコードする遺伝子を含む組換え細胞が提供される。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、前記組換え細胞にとって異種遺伝子である。
いくつかの実施形態では、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１の、モグロシドＩＩＩＥからの産生を触媒することが可能な第１の酵素をコードする第１の遺伝子を含む組換え細胞が提供される。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８または１５４（ＣＧＴアーゼ）と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８または１５４（ＣＧＴアーゼ）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、デキストランスクラーゼである。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号２、１０３、１０６〜１１０、１５６および８９６のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号２、１０３、１０４または１０５のアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号２、１０３〜１１０および１５６〜１６２および８９６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ＤｅｘＴは、配列番号１０４または１０５に記載された核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、トランスグルコシダーゼである。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号２０１または配列番号２９１の配列と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記組換え細胞はさらに、ウリジンジホスフェート−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）をコードする第２の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、配列番号４、５、６、７、８、９、１５、１６、１７、１８および１９のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、配列番号４、５、６、７、８、９、１５、１６、１７および１８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、ＵＧＴ１４９５（配列番号１０）、ＵＧＴ１８１７（配列番号１１）、ＵＧＴ５９１４（配列番号１２）、ＵＧＴ８４６８（配列番号１３）またはＵＧＴ１０３９１（配列番号１４）に記載された配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、前記細胞は、ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８をコードする第３の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８は、配列番号９、４０７または１６と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞は、エポキシドヒドロラーゼをコードする第４の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、エポキシドヒドロラーゼは、配列番号２１〜３０および３０９〜３１４のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞は、Ｐ４５０をコードする第５の配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０は、配列番号２０、４９、３０８、３１５または３１７と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０は、配列番号３１〜４８、３１６、４３１、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７および８９１のいずれか１つに記載された配列を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼをコードする第６の配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４および９０６のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドは、配列番号７３に記載された配列を含むＣ末端部分を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、コドン最適化されている。いくつかの実施形態では、コドン最適化された遺伝子は、配列番号７４に記載された核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞はさらに、スクアレンエポキシダーゼをコードする第７の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、スクアレンエポキシダーゼは、配列番号５０〜５６、６０、６１、３３４および３３５のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞はさらに、スクアレンシンターゼをコードする第８の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第８の遺伝子は、配列番号６９または配列番号３３６と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞はさらに、ファルネシル−ＰＰシンターゼをコードする第９の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ファルネシル−ＰＰシンターゼは、配列番号３３８と少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞は、哺乳動物、細菌、真菌または昆虫の細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、酵母細胞である。酵母の非限定的な例として、カンジダ属、サッカロミセス属、サッカロミケス亜門、タフリナ菌亜門、シゾサッカロミセス綱、コマガタエラ属、担子菌門、ハラタケ亜門、シロキクラゲ綱、サビキン亜門、アウレオバシジウム属、コニオカエタ属およびミクロボリオミセテスが挙げられる。いくつかの実施形態では、前記植物は、ラカンカ属、ツルレイシ属、アマチャヅル属、カボチャ属、キュウリ属、シロイヌナズナ属、ヨモギ属、ステビア属、トチバニンジン属、ウィザニア属、トウダイグサ属、ウマゴヤシ属、オリヅルラン属、ウコギ属、タラノキ属、クワ属、ウマゴヤシ属、カバノキ属、ゲンゲ属、ナンヨウアブラギリ属、ツバキ属、クリタケ属、アスペルギルス属、ナス属、コスギラン属、ワチガイソウ属、ツナソ属、キヅタ属、ゼニゴケ属およびクワ属からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、真菌は、白癬菌属、サングハングポルス属、タイワノフングス属、シラガニセホウライタケ属、マルソニア属、ディプロディア属、シイタケ属、キサントフィロミセス属、ポコニア属、コレトトリカム属、ジアポルテ属、ヒストプラズマ属、コクシジオイデス属、ヒストプラズマ属、サングハングポルス属、アウレオバシジウム属、ポコニア属、ペニシリウム属、スポロトリックス属またはメタリジウム属である。
いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号８９７、８９９、９０９、９１１、９１３、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８７１、８７３、９０１、９０３または９０５のいずれか１つに記載された酵素の配列を含む。いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、８７２、８７４〜８９６、８９８、９００、９０２、９０４、９０６、９０８、９１０、９１２および９５１〜１０１２に記載された配列を含むか、これらの配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、遺伝子合成により得ることができる。これは、例えば、ＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔまたはＩＤＴのいずれかによって実施され得る。ＤＮＡは、例えば、ｐＱＥ１、ｐＧＥＸ−４Ｔ３、ｐＤｅｓｔ−１７、ｐＥＴシリーズ、ＰＦＡＳＴＢＡＣなどの過剰発現ベクター中に、標準的な分子生物学的技術によってクローニングされ得る。大腸菌宿主株は、１のＯＤ６００での誘導のために１ｍＭのＩＰＴＧを用いて酵素（すなわち、トップ１０またはＢＬ２１シリーズ＋／−コドンプラス）を産生するために使用され得る。大腸菌株は、３７℃、２５０ｒｐｍで増殖され、誘導中に室温または３０℃（１５０ｒｐｍ）に切り替えられ得る。示される場合、いくつかの酵素は、また、ｐＦＡＳＴＢＡＣおよび最適化されたＭＯＩを用いてＳＦ９昆虫細胞株により発現され得る。酵素を含む粗抽出物は、音波処理により生成され、本明細書に記載された反応に使用され得る。すべてのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ反応は、スクロースシンターゼを含み、遺伝子合成を介してシロイヌナズナ（A. thaliana）から得られ、大腸菌で発現され得る。
化合物１を産生するための高度グリコシル化モグロシドの加水分解
いくつかの実施形態では、高度グリコシル化モグロシドは、化合物１を産生するために加水分解され得る。高度グリコシル化モグロシドの非限定的な例としては、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩが挙げられる。加水分解プロセスを触媒して化合物１を産生することが可能な酵素は、例えば、ＣＧＴアーゼ（例えば、澱粉なしで加水分解を示す）、セルラーゼ、βグルコシダーゼ、トランスグルコシダーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、デキストラナーゼおよび真菌ラクターゼであり得る。これらの酵素のいくつかのアミノ酸配列およびこれらの酵素のいくつかをコードする核酸配列は、第１表に見出され得る。
いくつかの実施形態では、化合物１は、組換え細胞において加水分解酵素に対する耐性を示し、ここで、加水分解酵素は、モグロシドＶＩ、モグロシドＶ、モグロシドＩＶをモグロシドＩＩＩＥに加水分解する能力を示す。化合物１に存在するアルファ結合グリコシドは、加水分解に対する耐性により、他のモグロシド（ベータ結合グリコシド）よりも優れた利点をもたらす。化合物１の微生物産生中に、組換え宿主細胞（例えば、微生物宿主細胞）は、望ましくないベータ結合モグロシドを加水分解してモグロシドＩＩＩＥに戻し得る。特定の理論に束縛されることなく、宿主細胞による加水分解により、化合物１の純度は、以下の理由で向上し得ると考えられる：１）望ましくないモグロシドＶＩ、モグロシドＶおよびモグロシドＩＶのレベルが低下することおよび／または２）加水分解により、化合物１の産生のための前駆体として使用されるべき利用可能なモグロシドＩＩＩＥの量が増加すること。
モグロシド化合物の精製
いくつかの実施形態は、モグロシド化合物、例えば、化合物１を単離することを含む。いくつかの実施形態では、化合物１の単離は、組換え宿主細胞を溶解することを含む。いくつかの実施形態では、化合物１を単離することは、培養培地から化合物１を単離することを含む。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、化合物１を精製することを含む。いくつかの実施形態では、化合物１の精製は、ＨＰＬＣ、固相抽出またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、精製は、組換え細胞を回収すること、上清を保存することおよび細胞を溶解することを含む。いくつかの実施形態では、溶解は、細胞をせん断力または界面活性剤洗浄に供し、それにより溶解物を得ることを含む。いくつかの実施形態では、せん断力は、音波処理法、フレンチプレスセルまたはビーズから生じる。いくつかの実施形態では、溶解物は、濾過および精製工程に供される。いくつかの実施形態では、溶解物は、濾過され、固相抽出により精製される。その後、溶解物は、濾過され、硫酸アンモニウムで処理されてタンパク質が除去され、Ｃ１８ ＨＰＬＣ（５×１０ｃｍのＡｔｌａｎｔｉｓ ｐｒｅｐ Ｔ３ ＯＢＤカラム、５μｍ、水）で分画され、１０→３０％のＢのＡ／Ｂグラジエント（Ａ＝水、Ｂ＝アセトニトリル）を用いて３０分間注入され、９５％のＢで洗浄され、その後、１％で再平衡化（合計実行時間＝４２分）される。実行により、３０ｍＬ／フラクションで風袋引きされたチューブ（１２フラクション／プレート、１回の実行あたり３プレート）に収集され得る。溶解物も、遠心分離されて、固形物および粒子状物質が除去され得る。プレートは、その後、Ｇｅｎｅｖａｃ ＨＴ１２／ＨＴ２４で乾燥され得る。所望の化合物は、他の異性体とともにフラクション２１で溶出されると予想される。プールされたフラクションは、３５分かけて１５→３０％のＢのＡ／Ｂグラジエント（Ａ＝水、Ｂ＝アセトニトリル）を使用して、フルオロ−フェニルＨＰＬＣカラム（３×１０ｃｍ、ＸｓｅｌｅｃｔフルオロフェニルＯＢＤカラム、５μｍ、水）で４７回実行してさらに分画され、９５％のＢで洗浄され、その後、１５％で再平衡化され得る（総実行時間＝４５分）。各実行により、３０ｍＬ／フラクションで１２の風袋引きされたチューブ（１２フラクション／プレート、実行ごとに１プレート）に収集された。所望の純度を有する所望のピークを含むフラクションをＵＰＬＣ分析に基づいてプールし、減圧下で乾燥させると、白っぽい粉末状固体を得ることができる。純粋な化合物が、１０ｍＬの水に再懸濁／溶解され、凍結乾燥されると、少なくとも９５％の純度を得ることができる。
化合物１の精製のために、いくつかの実施形態では、化合物は、固相抽出により精製することができ、これによりＨＰＬＣが不要になり得る。化合物１は、例えば、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の純度までまたはおよそこれらの純度までまたは任意の２つの上記の値によって記載された範囲内の任意の純度レベルまで精製され得る。いくつかの実施形態では、固相抽出により精製される化合物１は、ＨＰＬＣ精製された材料と同一であるかまたは実質的に同一である。いくつかの実施形態では、この方法は、ＨＰＬＣカラムで組換え細胞から溶解物を分画し、化合物１を含む溶出フラクションを収集することを含む。
発酵
宿主細胞は、化合物１の産生のために本明細書に記載されるように発酵され得る。これは、空気の有無にかかわらず起こる方法を含むことができ、例えば、嫌気的環境下で行うことができる。全細胞（例えば、組換え宿主細胞）は、発酵ブロスまたは反応緩衝液中にあり得る。
モンク果実（ラカンカ）抽出物も、化合物１を産生するために細胞と接触させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、化合物１の産生方法が提供される。この方法は、モンク果実抽出物を、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩなどのモグロシドからの化合物１の産生を触媒することが可能な第１の酵素と接触させることを含み得る。いくつかの実施形態では、接触は、モグロール果実抽出物を、第１の酵素をコードする第１の遺伝子を含む組換え宿主細胞と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子は、組換え宿主細胞に対して異種である。いくつかの実施形態では、モグロール果実抽出物は、第１の酵素をコードする第１のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞中の第１の酵素と接触する。いくつかの実施形態では、モグロシドＩＩＩＥは、モグロール果実抽出物中にある。いくつかの実施形態では、モグロシドＩＩＩＥも組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、第１の酵素が発現される条件下にて培養培地中で組換え宿主細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上である。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、ＣＧＴアーゼである。例えば、ＣＧＴアーゼは、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４のいずれか１つの配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＧＴアーゼは、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＧＴアーゼは、配列番号７８〜１０１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、デキストランスクラーゼである。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号２、１０３、１０６〜１１０、１５６および８９６に記載された配列のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号２、１０３、１０６〜１１０、１５６および８９６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、トランスグルコシダーゼである。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号１６３〜２９０および７２３のいずれか１つの配列と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号１６３〜２９０および７２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、ベータ−グルコシダーゼである。いくつかの実施形態では、ベータグルコシダーゼは、配列番号２９２に記載されたアミノ酸配列または配列番号２９２と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、モグロール果実抽出物は、モグロシドＩＩＡを含み、組換え宿主細胞は、モグロシドＩＩＡからのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な第２の酵素をコードする第２の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、モグロシドＩＩＡも組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、第２の酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上である。いくつかの実施形態では、第２の酵素は、ウリジンジホスフェート−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）である。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、ＵＧＴ７３Ｃ３（配列番号４）、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号５、４４４または４４５）、８５Ｃ２（配列番号６）、ＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号７）、ＵＧＴ７３Ｅ１（配列番号８）、ＵＧＴ９８（配列番号９または４０７）、ＵＧＴ１５７６（配列番号１５）、ＵＧＴ ＳＫ９８（配列番号１６）、ＵＧＴ４３０（配列番号１７）、ＵＧＴ１６９７（配列番号１８）、ＵＧＴ１１７８９（配列番号１９）であるかまたはＵＧＴ７３Ｃ３（配列番号４）、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号５、４４４または４４５）、８５Ｃ２（配列番号６）、ＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号７）、ＵＧＴ７３Ｅ１（配列番号８）、ＵＧＴ９８（配列番号９または４０７）、ＵＧＴ１５７６（配列番号１５）、ＵＧＴ ＳＫ９８（配列番号１６）、ＵＧＴ４３０（配列番号１７）、ＵＧＴ１６９７（配列番号１８）、ＵＧＴ１１７８９（配列番号１９）と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、ＵＧＴ１４９５（配列番号１０）、ＵＧＴ１８１７（配列番号１１）、ＵＧＴ５９１４（配列番号１２）、ＵＧＴ８４６８（配列番号１３）またはＵＧＴ１０３９１（配列番号１４）に記載された遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、モンク果実抽出物は、モグロールを含む。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、モンク果実抽出物のモグロールを接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞はさらに、モグロールからのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な１種以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、モグロールも組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、１種以上の酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を含む。いくつかの実施形態では、第２の酵素は、ウリジンジホスフェート−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）である。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、ＵＧＴ７３Ｃ３、ＵＧＴ７３Ｃ６、８５Ｃ２、ＵＧＴ７３Ｃ５、ＵＧＴ７３Ｅ１、ＵＧＴ９８、ＵＧＴ１４９５、ＵＧＴ１８１７、ＵＧＴ５９１４、ＵＧＴ８４６８、ＵＧＴ１０３９１、ＵＧＴ１５７６、ＵＧＴ ＳＫ９８、ＵＧＴ４３０、ＵＧＴ１６９７またはＵＧＴ１１７８９であるかまたはそれらのＵＧＴと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、モンク果実抽出物を、組換え宿主細胞と接触させてモグロシドＩＩＩＥを産生することを含み、ここで、組換え宿主細胞はさらに、モグロシド化合物からのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な１種以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子を含み、ここで、モグロシド化合物は、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＶまたはシアメノシドのうちの１種以上である。いくつかの実施形態では、モグロシド化合物も組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、１種以上の酵素は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を含む。いくつかの実施形態では、モグロシド化合物は、モグロシドＩＩＥである。いくつかの実施形態では、１種以上の酵素は、配列番号２９３〜３０３のいずれか１つに記載されたアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、モグロシド化合物は、モルグロシドＩＩＡまたはモグロシドＩＩＥであり、ここで、モンク果実抽出物を１種以上の酵素を発現する組換え細胞と接触させると、モグロシドＩＩＩＡ、モグロシドＩＶＥおよびモグロシドＶが産生される。いくつかの実施形態では、１種以上の酵素は、配列番号３０４に記載されたアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、１種以上の酵素は、配列番号３０５に記載された配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、モンク果実抽出物は、モグロシドＩＡ１を含む。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、モンク果実抽出物を組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８酵素は、配列番号９、４０７、１６または３０６と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ９８は、配列番号３０７に記載された配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、接触によって、細胞内でモグロシドＩＩＡが産生される。いくつかの実施形態では、モンク果実抽出物は、１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールを含む。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、モンク果実抽出物を組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、エポキシドヒドロラーゼをコードする第３の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールも組換え宿主細胞により産生される。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、モンク果実抽出物を組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、シトクロムＰ４５０またはエポキシドヒドロラーゼをコードする第４の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールも組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、モンク果実抽出物は、３，２４，２５トリヒドロキシククルビタジエノールを含む。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、モンク果実抽出物を組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、シトクロムＰ４５０をコードする第５の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態で
は、３，２４，２５トリヒドロキシククルビタジエノールも組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、モグロール果実抽出物との接触によって、組換え宿主細胞内でモグロールが産生される。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０は、配列番号２０または３０８と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、エポキシドヒドロラーゼは、配列番号２１〜３０および３０９〜３１４のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、モンク果実抽出物は、ククルビタジエノールを含む。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、ククルビタジエノールを組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、シトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、接触により１１−ヒドロキシククルビタジエノールが産生される。いくつかの実施形態では、１１−ヒドロキシククルビタジエノールは、ＣＹＰ８７Ｄ１８またはＳｇＣＰＲタンパク質をコードする遺伝子を含む細胞で発現される。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ８７Ｄ１８またはＳｇＣＰＲは、配列番号３１５、８７２または８７４に記載された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ８７Ｄ１８またはＳｇＣＰＲは、配列番号３１６、８７１または８７３によってコードされる。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールも組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０をコードする遺伝子は、配列番号３１〜４８、３１６、４３１、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７および８９１のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シトクロムＰ４５０は、配列番号２０または４９と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、モンク果実抽出物は、２，３−オキシドスクアレンを含む。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、モンク果実抽出物の２，３−オキシドスクアレンを組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、ククルビタジエノールシンターゼをコードする第７の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４または９０６と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３または９０５と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、モンク果実抽出物は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩなどのモグロシド中間体を含む。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、モグロシド中間体を組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、ククルビタジエノールシンターゼをコードする第７の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４または９０６と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３または９０５と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、接触によりククルビタジエノールが産生される。いくつかの実施形態では、２，３−オキシドスクアレンおよびジエポキシスクアレンも組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、２，３−オキシドスクアレンまたはジエポキシスクアレンは、配列番号８９８または９００と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する配列を含むかまたは配列番号８９８または９００に記載された配列を含む酵素によって産生される。いくつかの実施形態では、２，３−オキシドスクアレンまたはジエポキシスクアレンは、配列番号８９７または８９９と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸によってコードされるかまたは配列番号８９７または８９９に記載された核酸によってコードされる酵素によって産生される。
いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４および９０６のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、ペポカボチャ、ラカンカ、サフラン、メロン、ニホンカボチャまたはセイヨウカボチャである。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３および９０５のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する核酸配列を含むかまたは配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３および９０５のいずれか１つに記載された核酸配列を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、１１−ＯＨククルビタジエノールは、細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、１１−ＯＨククルビタジエノールは、ＣＹＰ８７Ｄ１８またはＳｇＣＰＲをコードする遺伝子を含む細胞で発現される。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ８７Ｄ１８またはＳｇＣＰＲは、配列番号３１５、８７２または８７４と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する配列または配列番号３１５、８７２または８７４に記載された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ８７Ｄ１８またはＳｇＣＰＲは、配列番号３１６、８７１または８７３と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する配列または配列番号３１６、８７１または８７３に記載された配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、モンク果実抽出物は、スクアレンを含む。いくつかの実施形態では、２，３−オキシドスクアレンまたはジエポキシスクアレンは、配列番号８９８または９００と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する配列または配列番号８９８または９００に記載された配列を含む酵素によって産生される。いくつかの実施形態では、２，３−オキシドスクアレンまたはジエポキシスクアレンは、配列番号８９７または８９９と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する核酸配列または配列番号８９７または８９９に記載された配列によってコードされる酵素によって産生される。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、スクアレンを組換え宿主細胞と接触させる工程を含み、ここで、組換え宿主細胞は、スクアレンエポキシダーゼをコードする第８の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、接触により２，３−オキシドスクアレンが産生される。いくつかの実施形態では、スクアレンも組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、スクアレンエポキシダーゼは、配列番号５０〜５６、６０、６１、３３４または３３５のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スクアレンエポキシドは、配列番号３３５に記載された核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、モンク果実抽出物は、ファルネシルピロリン酸を含む。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、ファルネシルピロリン酸を組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、スクアレンシンターゼをコードする第９の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、接触によりスクアレンが産生される。いくつかの実施形態では、ファルネシルピロリン酸も組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、スクアレンシンターゼは、配列番号６９および３３６のいずれか１つと、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スクアレンシンターゼは、配列番号３３７に記載された核酸配列を含む配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、モンク果実抽出物は、ゲラニル−ＰＰを含む。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、ゲラニル−ＰＰを組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、組換え宿主細胞は、ファルネシル−ＰＰシンターゼをコードする第１０の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、接触によりファルネシル−ＰＰが産生される。いくつかの実施形態では、ゲラニル−ＰＰも組換え宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、ファルネシルＰＰシンターゼは、配列番号３３８と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ファルネシル−ＰＰシンターゼは、配列番号３３９に記載された核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の遺伝子のうちの１つ以上は、異種プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、異種プロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、ヒトベータアクチン、ＣＡＧ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｕｂｉ、Ｔ７、Ｔ７ｌａｃ、Ｓｐ６、ａｒａＢＡＤ、ｔｒｐ、ｌａｃ、Ｐｔａｃ、ｐＬプロモーターまたはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性、抑制性または構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、ピルビン酸、アセチル−ＣｏＡ、クエン酸塩およびＴＣＡサイクル中間体のうちの１種以上の産生は、組換え宿主細胞で上方制御されている。いくつかの実施形態では、サイトゾル局在は、組換え宿主細胞で上方制御されている。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の遺伝子は、２Ａ自己切断ペプチドをコードする少なくとも１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、植物、二枚貝、魚、真菌、細菌または哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、植物は、ラカンカ属、ツルレイシ属、アマチャヅル属、カボチャ属、キュウリ属、シロイヌナズナ属、ヨモギ属、ステビア属、トチバニンジン属、ウィザニア属、トウダイグサ属、ウマゴヤシ属、オリヅルラン属、ウコギ属、タラノキ属、クワ属、ウマゴヤシ属、カバノキ属、ゲンゲ属、ナンヨウアブラギリ属、ツバキ属、クリタケ属、アスペルギルス属、ナス属、コスギラン属、ワチガイソウ属、ツナソ属、キヅタ属、ゼニゴケ属およびクワ属から選択される。いくつかの実施形態では、真菌は、白癬菌、サングハングポルス属、タイワノフングス属、シラガニセホウライタケ属、マルソニア属、ディプロディア属、シイタケ属、キサントフィロミセス属、ポコニア属、コレトトリカム属、ジアポルテ属、ヒストプラズマ属、コクシジオイデス属、ヒストプラズマ属、サングハングポルス属、アウレオバシジウム属、ポコニア属、ペニシリウム属、スポロトリックス属、メタリジウム属、アスペルギルス属、ヤロウィア属およびリポミセス属から選択される。いくつかの実施形態では、真菌は、アスペルギルス・ニデュランス、ヤロウィア・リポリティカまたはロドスポリジウム・トルロイデスである。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、酵母細胞である。いくつかの実施形態では、酵母は、カンジダ属、サッカロミセス属、サッカロミケス亜門、タフリナ菌亜門、シゾサッカロミセス綱、コマガタエラ属、担子菌門、ハラタケ亜門、シロキクラゲ綱、サビキン亜門、アウレオバシジウム属、コニオカエタ属、ロドスポリジウム属およびミクロボリオミセテスから選択される。いくつかの実施形態では、細菌は、フランキア属、アクチノバクテリア、ストレプトマイセス属およびエンテロコッカス属からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細菌は、エンテロコッカス・ファエカリスである。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の遺伝子のうちの１つ以上は、細菌、哺乳動物、植物、真菌または昆虫細胞での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の遺伝子のうちの１つ以上は、コードされる酵素の活性を高める機能的変異を含む。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞の培養は、培養条件のｐＨ、溶存酸素レベル、窒素レベルまたはそれらの組み合わせについて培養をモニタリングすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、化合物１を単離することを含む。いくつかの実施形態では、化合物１の単離は、組換え宿主細胞を溶解することを含む。いくつかの実施形態では、化合物１の単離は、培養培地から化合物１を単離することを含む。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、化合物１を精製することを含む。いくつかの実施形態では、化合物１の精製は、ＨＰＬＣ、固相抽出またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、精製はさらに、組換え細胞を回収すること、上清を保存することおよび細胞を溶解することを含む。いくつかの実施形態では、溶解は、細胞をせん断力または界面活性剤洗浄に供し、それにより溶解物を得ることを含む。いくつかの実施形態では、せん断力は、音波処理法、フレンチプレスセルまたはビーズから生じる。いくつかの実施形態では、溶解物は、濾過および精製工程に供される。いくつかの実施形態では、溶解物は、濾過され、固相抽出により精製される。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、組換え宿主細胞の増殖培地へのモンク果実抽出物の第２または第３の添加をさらに含む。さらに、この方法は、モンク果実抽出物を組換え細胞溶解物と接触させることにより実施することができ、ここで、組換え細胞溶解物は、本明細書に列挙された発現酵素を含む。
一般に、本明細書に開示かつ記載された化合物は、個別にまたは組み合わせて、組成物で、例えば、摂取可能な組成物で提供され得る。一実施形態では、本明細書に開示かつ記載された化合物は、個別にまたは組み合わせて、摂取可能な組成物に甘い風味をもたらし得る。他の実施形態では、本明細書に開示かつ記載された化合物は、個別にまたは組み合わせて、別の甘味料の甘味を増強するための甘い風味増強剤として作用し得る。他の実施形態では、本明細書に開示された化合物は、本明細書に開示かつ記載された１種以上の化合物を、甘味料組成物中の１種以上の他の甘味料と組み合わせることによって、より砂糖様の時間的プロファイルおよび／またはフレーバープロファイルを甘味料組成物に付与する。別の実施形態では、本明細書に開示かつ記載された化合物は、個別にまたは組み合わせて、それらの組成物を本明細書に開示かつ記載された化合物と接触させて修飾組成物を形成することにより、組成物の甘味を増加または増強し得る。別の実施形態では、本明細書に開示かつ記載された化合物は、個別にまたは組み合わせて、味蕾以外の体内で発現される甘味受容体および／またはそれらのリガンドを調節する組成物であり得る。
本明細書で使用されるように、「摂取可能な組成物」は、単独でまたは別の物質と一緒に、消費を目的とするか否かに関わらず、口から摂取するのに適した任意の組成物を含む。摂取可能な組成物には、「食品または飲料製品」および「非食用製品」の双方が含まれる。「食品または飲料製品」とは、固形物、半固形物または液体（例えば、飲料）を含む、ヒトまたは動物による消費を目的とする食用製品を意味し、機能性食品（例えば、栄養素を供給するという基本的な栄養機能を超えて、健康増進および／または疾病予防特性を有することが主張された生鮮食品または加工食品）を含む。「非食品または飲料製品」または「非食用組成物」という用語には、消費以外の目的でまたは食品もしくは飲料として、ヒトまたは動物が口に入れることができる製品または組成物が含まれる。例えば、非食品もしくは飲料製品または非食用組成物には、サプリメント、栄養補助食品、医薬品および市販薬、歯磨剤およびうがい薬などのオーラルケア製品、ならびにチューインガムが含まれる。
モグロシド化合物を含む組成物
また、本明細書には、組成物、例えば、本明細書に開示された１種以上のモグロシド化合物、例えば、これに限定されないが、化合物１および図４３に示した化合物を含む摂取可能な組成物が開示されている。いくつかの実施形態では、摂取可能な組成物は、飲料であり得る。例えば、飲料は、強化スパークリング飲料、コーラ、レモンライム風味のスパークリング飲料、オレンジ風味のスパークリング飲料、グレープ風味のスパークリング飲料、イチゴ風味のスパークリング飲料、パイナップル風味のスパークリング飲料、ジンジャーエール、ルートビール、フルーツジュース、フルーツフレーバージュース、ジュースドリンク、ネクター、野菜ジュース、野菜フレーバージュース、スポーツドリンク、エネルギードリンク、強化されたウォータードリンク、強化されたビタミン入りウォーター、水に近い飲み物（near water drinks）、ココナッツウォーター、お茶タイプのドリンク、コーヒー、ココア飲料、牛乳成分を含む飲料、穀物エキスを含む飲料およびスムージーからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、飲料は、清涼飲料であり得る。
「摂取可能な成分」は、口から摂取されるのに適しており、かつ本明細書に記載された化合物と組み合わされて摂取可能な組成物を形成することができる物質である。摂取可能な成分は、製品の使用目的に応じて、例えば、固体、半固体、液体、ペースト、ゲル、ローション、クリーム、泡沫状物質、懸濁液、溶液またはそれらの任意の組み合わせ（例えば、固形分を含む液体）の形であり得る。摂取可能な成分は、人工または天然のものであり得る。摂取可能な成分には、多くの一般的な食品成分、例えば、中性、酸性または塩基性ｐＨの水、果物または野菜ジュース、酢、マリネ、ビール、ワイン、天然水／脂肪エマルジョン、例えば、牛乳またはコンデンスミルク、食用油およびショートニング、脂肪酸およびそれらのアルキルエステル、プロピレングリコールの低分子量オリゴマー、脂肪酸のグリセリルエステルおよび水性媒体中のかかる疎水性物質の分散液またはエマルジョン、塩化ナトリウムなどの塩、小麦粉、エタノールなどの溶媒、植物性粉末または小麦粉などの固形の食用希釈剤または他の液体ビヒクル；分散または懸濁助剤；界面活性剤；等張剤；増粘剤または乳化剤、防腐剤；固体バインダー；潤滑剤等が含まれる。
追加の摂取可能な成分には、酸、例えば、これに限定されないが、クエン酸、リン酸、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム、乳酸または酒石酸；苦味成分、例えば、カフェイン、キニーネ、緑茶、カテキン、ポリフェノール、生のロブスタコーヒー抽出物、生のコーヒー抽出物、ホエイプロテインアイソレートまたは塩化カリウム；着色剤、例えば、カラメル色、赤色＃４０、黄色＃５、黄色＃６、青色＃１、赤色＃３、紫色ニンジン、黒色ニンジンジュース、紫色サツマイモ、野菜ジュース、フルーツジュース、ベータカロチン、ウコンクルクミンまたは二酸化チタン；防腐剤、例えば、安息香酸ナトリウム、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、メタ重硫酸ナトリウム、ソルビン酸または安息香酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、ＥＤＴＡカルシウム二ナトリウム、アルファトコフェロール、混合トコフェロール、ローズマリー抽出物、ブドウ種子抽出物、レスベラトロールまたはヘキサメタリン酸ナトリウム；ビタミンまたは機能成分、例えば、レスベラトロール、Ｃｏ−Ｑ１０、オメガ３脂肪酸、テアニン、塩化コリン（シトコリン）、ファイバーソル、イヌリン（チコリ根）、タウリン、オタネニンジンエキス、グアナナエキス、ジンジャーエキス、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−カルニチン、Ｌ−酒石酸塩、Ｄ−グルコロノラクトン、イノシトール、バイオフラボノイド、エキナセア、ギンコビロバ、マテ茶、亜麻仁油、ガルシニアカンボジア皮抽出物、白茶抽出物、リボース、ミルクシスル抽出物、ブドウ種子抽出物、ピロジキシンＨＣｌ（ビタミンＢ６）、シアノバラミン（ビタミンＢ１２）、ナイアシンアミド（ビタミンＢ３）、ビオチン、乳酸カルシウム、パントテン酸カルシウム（パントテン酸）、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、塩化クロム、ポリニコチン酸クロム、硫酸第二銅、葉酸、ピロリン酸第二鉄、鉄、乳酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、リン酸一カリウム、リン酸一ナトリウム、リン、ヨウ化カリウム、リン酸カリウム、リボフラビン、硫酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、一硝酸チアミン、ビタミンＤ３、ビタミンＡパルミテート、グルコン酸亜鉛、乳酸亜鉛または硫酸亜鉛；混濁剤、例えば、エステル化剤、臭素化植物油（ＢＶＯ）または酢酸イソ酪酸スクロース（ＳＡＩＢ）；緩衝液、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウムまたは塩；フレーバー、例えば、プロピレングリコール、エチルアルコール、グリセリン、アラビアゴム（アカシアゴム）、マルトデキストリン、加工コーンスターチ、デキストロース、天然フレーバー、他の天然フレーバーを有する天然フレーバー（天然フレーバーＷＯＮＦ）、天然および人工フレーバー、人工フレーバー、二酸化ケイ素、炭酸マグネシウムまたはリン酸三カルシウム；および安定剤、例えば、ペクチン、キサンタンガム、カルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、中鎖トリグリセリド、セルロースゲル、セルロースガム、カゼインナトリウム、加工食品デンプン、アラビアゴム（アカシアゴム）またはカラギーナンが含まれる。
図１は、モグロシドＩＩＩＥをＣＧＴアーゼで処理した後に産生した化合物１のＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図２は、モグロシドＩＩＩＥをストレプトコッカス・ミュータンス・クラーク（Streptococcus mutans Clarke）ＡＴＣＣ２５１７５デキストランスクラーゼで処理した後に産生した化合物１のＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図３は、キシランの存在下にてセルクラストで処理した後のモグロシドのグリコシル化反応のＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図４は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼで処理した後のモグロシドのグリコシル化反応のＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図５は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼで処理した後のモグロシドのグリコシル化反応のＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図６は、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼＵＧＴ７３Ｃ６で処理してモグロシドＩを産生した後のモグロールのＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図７は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３３８）（配列番号４０５）で処理して、モグロシドＩ、モグロシドＩＩＡおよび２つの異なるモグロシドＩＩＩ産生物を産生した後のモグロールのＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図８は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３３８）（配列番号４０５）で処理して、モグロシドＩ、モグロシドＩＩＡおよび２つの異なるモグロシドＩＩＩ産生物を産生した後のモグロールのＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図９は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３３８）（配列番号４０５）で処理して、モグロシドＩ、モグロシドＩＩＡおよび２つの異なるモグロシドＩＩＩ産生物を産生した後のモグロールのＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図１０は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼで処理して、シアメノシドＩとモグロシドＶ産生物を産生した後のモグロシドＩＩＩＥのＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図１１は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼで処理して、シアメノシドＩとモグロシドＶ産生物を産生した後のモグロシドＩＩＩＥのＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図１２は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３３９）（配列番号４０９）で処理して、モグロシドＩ、イソモグロシドＶおよび化合物１誘導体をそれぞれ産生した後のモグロール、シアメノシドＩまたは化合物１の反応の産生物のＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図１３は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３３９）（配列番号４０９）で処理して、モグロシドＩ、イソモグロシドＶおよび化合物１誘導体をそれぞれ産生した後のモグロール、シアメノシドＩまたは化合物１の反応の産生物のＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図１４は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３３９）（配列番号４０９）で処理して、モグロシドＩ、イソモグロシドＶおよび化合物１誘導体をそれぞれ産生した後のモグロール、シアメノシドＩまたは化合物１の反応の産生物のＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図１５〜２０は、それぞれ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶＡまたはモグロシドＩＶＥを、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３３０）（配列番号４１１）で処理して産生した、モグロシドＩＩＩＡ、モグロシドＩＶＥ、モグロシドＶのＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図１５〜２０は、それぞれ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶＡまたはモグロシドＩＶＥを、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３３０）（配列番号４１１）で処理して産生した、モグロシドＩＩＩＡ、モグロシドＩＶＥ、モグロシドＶのＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図１５〜２０は、それぞれ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶＡまたはモグロシドＩＶＥを、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３３０）（配列番号４１１）で処理して産生した、モグロシドＩＩＩＡ、モグロシドＩＶＥ、モグロシドＶのＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図１５〜２０は、それぞれ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶＡまたはモグロシドＩＶＥを、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３３０）（配列番号４１１）で処理して産生した、モグロシドＩＩＩＡ、モグロシドＩＶＥ、モグロシドＶのＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図１５〜２０は、それぞれ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶＡまたはモグロシドＩＶＥを、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３３０）（配列番号４１１）で処理して産生した、モグロシドＩＩＩＡ、モグロシドＩＶＥ、モグロシドＶのＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図１５〜２０は、それぞれ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶＡまたはモグロシドＩＶＥを、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３３０）（配列番号４１１）で処理して産生した、モグロシドＩＩＩＡ、モグロシドＩＶＥ、モグロシドＶのＨＰＬＣデータおよび質量分析データ（挿入図）を示す。 図２１は、反応産生物のモグロシドＩＶＥおよびモグロシドＶの質量分析プロフィールを示す。 図２２は、反応産生物のモグロシドＩＶＥおよびモグロシドＶの質量分析プロフィールを示す。 図２３は、ククルビタジエノールシンターゼ（ＳｇＣｂＱ）（配列番号４１７）を用いるククルビタジエノールの産生を示す。 図２４は、酵素Ｃｐｅｐ２（配列番号４２０）を使用するククルビタジエノールの産生を示す。 図２５は、酵素Ｃｐｅｐ４（配列番号４２２）を使用するククルビタジエノールの産生を示す。 図２６は、エポキシドヒドロラーゼ（配列番号４２８）によって触媒反応から得られるジヒドロキシククルビタジエノールの産生を示す。 図２７Ａ〜Ｂは、微生物酵素による加水分解に対する化合物１の耐性を示す。 図２８は、Ｈｉｌｉｃ＿８０＿２０＿法からのα−モグロシド異性体混合物のＵＰＬＣクロマトグラムを示す。 図２９は、Ｈｉｌｉｃ＿８０＿２０＿法でのＵＰＬＣ分析からのサンプルの純度を示す。 図３０は、化合物１を産生するための非限定的な例示的な経路を示すフローチャートを示す。 図３１は、オキシドスクアレンをブーストするための図３０に示される工程１のジエポキシスクアレンのＵＶ吸光度を示す。 図３２は、メロン（Cucumis melo）およびセイヨウカボチャ（Cucurbita maxima）由来の酵素を使用する工程２でのククルビタジエノールの産生を示す。 図３３は、エンドウ（Pisum sativum）由来の酵素を使用する工程２でのククルビタジエノールの産生を示す。 図３４は、タマホコリカビ属（Dictyostelium sp.）由来の酵素を使用する工程２でのククルビタジエノールの産生を示す。 図３５は、図３０に示される経路の工程３の中間体を示す。 図３６は、図３０に示される経路の工程４の中間体、モグロール合成の質量分析データを示す。 図３７は、図３０に示される経路の工程７の中間体、化合物１の合成を示す。 図３８は、その後に加水分解されてモグロシドＩＩＩＥに戻り得る、グリコソル化酵素による高度グリコシル化モグロシドの産生を示す概略図である。 図３９は、いかにして加水分解により高度グリコシル化モグロシドを加水分解してモグロシドＩＩＩＥを産生し、次にこれを化合物１に変換することができるかを示す概略図である。 図４０Ａ〜Ｂは、２日間のインキュベーション後、モグロシドの実質的にすべてがサッカロミセス・セレビシエまたはヤロウィア・リポリティカ（Y. lipolytica）においてモグロシドＩＩＩＥに変換されたことを示す。 図４１は、化合物１由来の加水分解産生物が、サッカロミセス・セレビシエまたはヤロウィア・リポリティカにおいて検出されなかったことを示す。 図４２は、デキストランスクラーゼ（ＤＥＸＴ）を過剰発現するように修飾されたサッカロミセス・セレビシエにおける化合物１の産生を示す。 図４３は、３１１酵素（ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼによって触媒される酵素反応を示す。
実施例
上述の実施形態のいくつかの態様は、以下の実施例にさらに詳細に開示されており、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１：シアメノシドＩの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、シアメノシドＩは、本明細書に開示された化合物１を産生するための中間モグロシド化合物であり得る。例えば、シアメノシドＩを加水分解してモグロシドＩＩＩＥを産生し、次にこれを使用して化合物１を産生することができる。例えば、シアメノシドＩの産生方法は、モグロールを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、アスペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）由来のペクチナーゼを発現する組換え細胞が使用され得る。
別の例として、シアメノシドＩの産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、アスペルギルス・アクレアタス由来のペクチナーゼが使用され得る。
実施例２：モグロシドＩＶＥの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＶＥは、本明細書に開示された化合物１の産生のための中間モグロシド化合物であり得る。例えば、モグロシドＶからのモグロシドＩＶＥを、次に使用して化合物１を産生することができる。例えば、モグロシドＩＶＥの産生方法は、モグロシドＶを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。別の例として、前記組換え細胞は、ペクチナーゼをコードする遺伝子を含み得る。ペクチナーゼは、アスペルギルス・アクレアタス由来の遺伝子によってコードされ得る。
別の例として、モグロシドＩＶＥの産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、アスペルギルス・アクレアタス由来のペクチナーゼが使用され得る。
実施例３：モグロシドＩＩＩＥの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＩＩＥは、本明細書に開示された化合物１の産生のための中間モグロシド化合物であり得る。例えば、モグロシドＩＩＡをグリコシル化してモグロシドＩＩＩＥを産生し、次にこれを使用して化合物１を産生することができる。
別の例として、モグロシドＩＩＩＥの産生方法は、モグロシドＶ、モグロシドＩＩＡ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、アスペルギルス・アクレアタス由来のペクチナーゼは、組換え宿主細胞内の遺伝子によってコードされ得る。
実施例４：モグロシドＩＶＡの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＶＡは、本明細書に開示された化合物１の産生のための中間モグロシド化合物であり得る。例えば、モグロシドＶからのモグロシドＩＶＡを次に使用して、化合物１を産生することができる。
例えば、モグロシドＩＶＡの産生方法は、モグロシドＶを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。酵素はまた、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来のβ−ガラクトシダーゼであり得る。
別の例として、モグロシドＩＶＡの産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、アスペルギルス・オリゼ由来のβ−ガラクトシダーゼが、この方法で使用され得る。
実施例５：モグロシドＩＩＡの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＩＡは、本明細書に開示された化合物１を産生するための中間モグロシド化合物であり得る。例えば、モグロシドＩＩＡの産生方法は、モグロシドＩＡ１を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
別の例として、モグロシドＩＩＡの産生方法は、モグロシドＩＡ１、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、セルクラストも使用され得る。
実施例６：アロマーゼからのモグロシドＩＩＩＡ１の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＩＩＡ１は、本明細書に開示された化合物１を産生するための中間モグロシド化合物であり得る。例えば、モグロシドＩＩＩＡ１は、モグロシドＩＶＡを産生する中間体であり、次にモグロシドＩＶＡを中間体として使用して化合物１を産生することができる。例えば、モグロシドＩＩＩＡ１の産生方法は、シアメノシドＩを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、アロマーゼでもあり得る。別の例として、モグロシドＩＩＩＡ１の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例７：化合物３の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物３は、本明細書に開示される化合物１を用いて産生される中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物３の産生方法は、モグロールを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。酵素は、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）および／またはトルザイム由来のシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼであり得る。
別の例として、化合物３の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、ＣＧＴアーゼ酵素が使用され得る。
実施例８：化合物４の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物４は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した。例えば、化合物４の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
別の例として、化合物４の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。酵素は、例えば、バチルス・リケニフォルミスおよび／またはトルザイム由来のシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼであり得る。
実施例９：化合物５の産生
Figure 2020518264
 化合物５は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物５の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
別の例として、化合物５の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、バチルス・リケニフォルミスまたはトルザイム由来のＣＧＴアーゼが使用され得る。
実施例１０：化合物６の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物６は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物６の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
別の例として、化合物６の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、バチルス・リケニフォルミスまたはトルザイム由来のＣＧＴアーゼが使用され得る。
実施例１１：化合物７の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物７は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生された中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物７の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
別の例として、化合物７の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、バチルス・リケニフォルミスまたはトルザイム由来のＣＧＴアーゼが使用され得る。
実施例１２：化合物８の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物８は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物８の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
別の例として、化合物８の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、バチルス・リケニフォルミスまたはトルザイム由来のＣＧＴアーゼが使用され得る。
実施例１３：化合物９の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物９は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物９の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
別の例として、化合物９の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、バチルス・リケニフォルミスまたはトルザイム由来のＣＧＴアーゼが使用され得る。
実施例１４：化合物１０の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１０は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物１０の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
別の例として、化合物１０の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、バチルス・リケニフォルミスまたはトルザイム由来のＣＧＴアーゼが使用され得る。
実施例１５：化合物１１の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１１は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物１１の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥまたは１１−オキソ−ＭＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
別の例として、化合物１１の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、バチルス・リケニフォルミスまたはトルザイム由来のＣＧＴアーゼが使用され得る。
実施例１６：化合物１２の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１２は、本明細書に開示された化合物１の産生において使用され得る中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物１２の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＶＩ異性体を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼ、インベルターゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、パン酵母由来のインベルターゼ酵素であり得る。
別の例として、化合物１２の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＶＩ異性体およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼ、インベルターゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例１７：化合物１３の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１３は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシドであり得る。例えば、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。発現した酵素は、例えば、セルクラストでもあり得る。
別の例として、化合物１３の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、セルクラストが使用され得る。
実施例１８：化合物１４の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１４は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。例えば、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。発現した酵素は、例えば、セルクラストでもあり得る。
別の例として、化合物１４の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、セルクラストが使用され得る。この方法は、例えば、α−ラクトースなどの糖の存在も必要とし得る。
実施例１９：化合物１５の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１５は、本明細書に開示された化合物１の産生に使用され得る中間モグロシド化合物であり得る。例えば、この方法は、モグロシドＩＩＡを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
別の例として、化合物１５の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、トルザイムが使用され得る。
実施例２０：化合物１６の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１６は、本明細書に開示された化合物１の産生に使用され得る中間モグロシド化合物であり得る。例えば、この方法は、モグロシドＩＩＡを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
別の例として、化合物１６の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、トルザイムが使用され得る。
酵素は、例えば、トルザイムであり得る。組換え細胞はさらに、例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（例えば、トルザイム）、インベルターゼ、グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１）をコードする遺伝子を含み得る。
実施例２１：化合物１７の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１７は、本明細書に開示された化合物１の産生のための中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物１７を加水分解してモグロシドＩＩＩＥを産生し、次にこれを使用して化合物１を産生することができる。例えば、化合物１７の産生方法は、シアメノシドＩを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、トランスグルコシダーゼ、スクロースシンターゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを発現する組換え細胞が、使用され得る。
別の例として、化合物１７の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼが使用され得る。
実施例２２：化合物１８の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１８は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物１８を加水分解してモグロシドＩＩＩＥを産生し、次にこれを使用して化合物１を産生することができる。例えば、化合物１８の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、Ｓｕｓ１およびＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。
別の例として、化合物１８の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。酵素は、例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。
実施例２３：化合物１９の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１９は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物１９をさらに加水分解して、例えば化合物１を産生することができる。例えば、化合物１８の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、Ｓｕｓ１およびＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。
別の例として、化合物１９の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。酵素は、例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。酵素は、また、例えば、スクロースシンターゼＳｕｓ１であり得る。
実施例２４：化合物２０の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物２０は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物２０をさらに加水分解して、例えば化合物１を産生することができる。例えば、化合物２０の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、Ｓｕｓ１およびＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。
別の例として、化合物２０の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。酵素は、例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。酵素は、また、例えば、スクロースシンターゼＳｕｓ１であり得る。酵素は、例えば、スクロースシンターゼＳｕｓ１およびＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。
実施例２５：化合物２１の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物２１は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物２１をさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。例えば、化合物２１の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＶＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、Ｓｕｓ１およびＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。
別の例として、化合物２１の産生方法は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶＥ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。酵素は、例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。酵素は、また、例えば、スクロースシンターゼＳｕｓ１であり得る。酵素は、例えば、スクロースシンターゼＳｕｓ１およびＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。
実施例２６：化合物２２の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物２２は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物２２をさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。例えば、化合物２２の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＶＡを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、Ｓｕｓ１およびＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。
別の例として、化合物２２の産生方法は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶＥ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。酵素は、例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。酵素は、また、例えば、スクロースシンターゼＳｕｓ１であり得る。酵素は、例えば、スクロースシンターゼＳｕｓ１およびＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。
実施例２７：化合物２３の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物２３は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物２３をさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。例えば、化合物２２の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＶＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、デキストランスクラーゼであり得る。
別の例として、化合物２３の産生方法は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶＥ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。酵素は、例えば、デキストランスクラーゼであり得、これは高度グリコシル化モグロシドＩＶＥ異性体を、所望のモグロシドＶ異性体に加水分解する。
実施例２８および２９：真菌ラクターゼからのモグロシドＩＩＡ１およびモグロシドＩＩＡ２の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＩＡ１およびモグロシドＩＩＡ２は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。モグロシドＩＩＡ１およびモグロシドＩＩＡ２をさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。例えば、モグロシドＩＩＡ１およびモグロシドＩＩＡ２の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＶＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、真菌由来のラクターゼであり得る。
別の例として、モグロシドＩＩＡ１およびモグロシドＩＩＡ２の産生方法は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶＥ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例３０：ビスコザイムからのモグロシドＩＡの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＡは、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生された中間モグロシド化合物であり得る。モグロシドＩＡをさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。モグロシドＩＡの産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＡを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、ビスコザイムであり得る。
別の例として、モグロシドＩＡの産生方法は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶＥ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。酵素は、例えば、ビスコザイムであり得る。
実施例３１：化合物２４の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物２４は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物２４をさらに加水分解して、例えば化合物１を産生することができる。化合物２４の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、デキストランスクラーゼＤｅｘＴであり得る。
別の例として、化合物２４の産生方法は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶＥ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。酵素は、例えば、デキストランスクラーゼＤｅｘＴであり得る。
実施例３２：化合物２５の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物２５は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物２５をさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。化合物２５の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、デキストランスクラーゼＤｅｘＴであり得る。
別の例として、化合物２５の産生方法は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶＥ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。酵素は、例えば、デキストランスクラーゼＤｅｘＴであり得る。
実施例３３：化合物２６の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物２６は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物２６をさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。化合物２６の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、デキストランスクラーゼＤｅｘＴであり得る。
別の例として、化合物２６の産生方法は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶＥ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。酵素は、例えば、デキストランスクラーゼＤｅｘＴであり得る。
実施例３４および３５：ペクチナーゼからのモグロールおよびモグロシドＩＥの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロールおよびモグロシドＩＥは、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生された中間モグロシド化合物であり得る。モグロールを基質として使用してモグロシドＩＡ１を産生することができ、これをさらに加水分解して化合物１を形成し、モグロシドＩＥをさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。モグロールおよびモグロシドの産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＶを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、アスペルギルス・アクレアタス由来のペクチナーゼ酵素であり得る。
別の例として、モグロールおよびモグロシドＩＥの産生方法は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶＥ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例３６：モグロシドＩＩＥの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＩＥは、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。モグロシドＩＩＥをさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。モグロシドＩＩＥの産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＶを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、アスペルギルス・アクレアタス由来のペクチナーゼ酵素であり得る。
別の例として、モグロシドＩＩＥの産生方法は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶＥ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例３７および３８：化合物３２および３３の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物３２および３３は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物３２および３３をさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。化合物３２および３３の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶＥ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、アスペルギルス・アクレアタス由来のペクチナーゼ酵素であり得る。
別の例として、化合物３２および３３の産生方法は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶＥ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例３９および４０：化合物３４および３５の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物３４および３５は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物３２および３３をさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。化合物３４および３５の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、セルクラストであり得る。
別の例として、化合物３４および３５の産生方法は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶＥ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例４１および４２：モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩは、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩを、さらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。
例えば、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩを、ＵＧＴと接触させて、モグロシドＩＶＡを形成することもでき、別のモグロシド化合物は、モグロシドＩＩＩＥを作るために使用することができ、さらに加水分解されて化合物１を形成する。
モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩの産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。酵素は、例えば、セルクラストであり得る。
別の例として、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩの産生方法は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶＥ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例４３：化合物１を産生するためのＣＧＴ−ＳＬ酵素の使用
１ｍｌの反応体積、５ｍｇのモグロシドＩＩＩＥ、５０ｍｇの可溶性デンプン、ｐＨ５．０の０．１ＭのＮａＯＡＣ、１２５μｌのＣＧＴ−ＳＬ酵素（ゲオバチルス・サーモフィルス（Geobaccilus thermophillus）由来）および水を、撹拌棒を用いて混合し、５０℃でインキュベートした。ＨＰＬＣの時間ごとのサンプルを採取した。
ＨＰＬＣデータ：図１に示すような化合物１産生の質量分析
いくつかの実施形態では、ＣＧＴ−ＳＬは、配列番号３、１４８または１５４に記載された配列を含み得る。
実施例４４：クローニング：デキストランスクラーゼ酵素をコードする遺伝子を、ロイコノストック・シトリウム（Leuconostoc citreum）ＡＴＣＣ１１４４９からＰＣＲ増幅し、ｐＥＴ２３ａにクローニングした。
増殖条件：誘導のために１．１０ｍＭのラクトースのＯＤ６００を添加するまで、ＢＬ２１コドンプラスＲＩＬ株を、３７℃、２５０ｒｐｍにて２×ＹＴで増殖させ、室温、１５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。反応に使用した粗抽出物を、音波処理または浸透圧ショックのいずれかによって得た。
いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号２、１０３、１０６〜１１０、１５６および８９６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ＤｅｘＴは、配列番号１０３に記載されたアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤｅｘＴは、配列番号１０４または１０５に記載された核酸配列を含み得る。
実施例４５：モグロシドＩＩＩＥとＳ．ミュータンス・クラークＡＴＣＣ２５１７５デキストランスクラーゼとの反応による化合物１の産生
増殖条件：上記の株を、Wenham, Henessey and Cole (1979)に示すように、グルコースを補給して嫌気的に増殖させて、デキストランスクラーゼの産生を刺激した。５ｍｇ／ｍｌのモグロシドＩＩＩＥを、増殖培地に添加した。ＨＰＬＣの時間ごとのサンプルを採取した。ＨＰＬＣデータを、化合物１産生の質量分析として図２に示す。
実施例４６：モグロシドＩＩＩＥとＣＧＴアーゼとの反応
１ｍｌの反応体積、５ｍｇのモグロシドＩＩＩＥ、５０ｍｇの可溶性デンプン、ｐＨ５．０の０．１ＭのＮａＯＡＣ、１２５μｌの酵素および水を、撹拌棒を用いて混合し、５０℃でインキュベートした。ＨＰＬＣの時間ごとのサンプルを採取した。使用した酵素は、ＣＧＴアーゼであった。化合物１の産生物は、図１に示すようにＨＰＬＣデータおよび質量分析データに見られる。質量ピークは、化合物１のサイズに対応している。
実施例４７：モグロシドＩＩＩＥとセルクラストとの反応
セルクラストのキシロシル化は、モグロシドＩＩＩＥを用いて行い、ここで、セルクラストは、ネイティブな宿主：トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）由来であった。
反応条件：５ｍｇのモグロシドＩＩＩＥ、１００ｍｇのキシラン、５０μｌのセルクラストを、ｐＨ５．０の０．１Ｍ酢酸ナトリウムを用いて総体積１ｍｌで混合し、撹拌しながら５０℃でインキュベートした。ＨＰＬＣの時間ごとのサンプルを採取した。
キシロシル化産生物を、図３に強調して示す。キシロシル化により生じた産生物は、化合物１の産生における中間体として使用することができる。セルクラストの配列は、第１表に含まれており、本明細書ではキシロシル化産生物の産生に使用されている。
実施例４８：グリコシルトランスフェラーゼ（マルトトリオシルトランスフェラーゼ）（ネイティブな宿主：ゲオバチルス属（Geobacillus sp.）ＡＰＣ９６６９）
この例では、グリコシルトランスフェラーゼ（glycosytransferase）ＡＧＹ１５７６３．１(Amano Enzyme U.S.A. Co., Ltd., エルギン、イリノイ州；配列番号４３４、第１表を参照のこと）を使用した。２０ｍＬの脱イオン水、ｐＨ６．５の０．６ｍｌの０．５Ｍ ＭＥＳ、６ｇの可溶性デンプン、１５０ｍｇのモグロシドＩＩＩＥおよび３ｍｌの酵素を、４０ｍｌの平底スクリューキャップバイアルに加えた。バイアルを黒のキャップで密封し、３０℃でインキュベートし、磁気棒を用いて５００ｒｐｍで撹拌した。出発材料として使用される合計６００ｍｇのモグロシドＩＩＩＥに対して、さらに３つの同じ反応を設定した。２４時間後に反応を停止した。不溶性デンプンを、遠心分離（４０００ｒｐｍ、５分間、エッペンドルフ）で除去した。上清を撹拌しながら（５００ｒｐｍ）３０分間８０℃に加熱し、続いて、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分間、エッペンドルフ）した。上清を２５０ｍｌ、０．２２ミクロンＰＥＳで濾過し、ＬＣ−ＭＳ（Sweet Naturals 2016-Enzymatic_2016Q4_A.SPL, line 1254）で確認して、ＨＰＬＣデータを取得した。
ＡＧＹ１５７６３．１タンパク質（配列番号４３４）は、ネイティブなｇＤＮＡ（配列番号４３７）によってコードされ得るかまたはコドン最適化された（大腸菌の場合）ＤＮＡ配列（配列番号４３８）であり得る。
同様に機能することが予想されるさらなるグリコシルトランスフェラーゼの例は、ステビア（Stevia rebaudiana）（配列番号４３９）由来のＵＧＴ７６Ｇ１タンパク質であり、これは大腸菌で発現され得る。ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号４３９）のネイティブなコード配列は、配列番号４４０で示される。
実施例４９：モグロールの存在下でのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼＵＧＴ７３Ｃ５
モグロールを、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼと反応させて、モグロシドＩおよびモグロシドＩＩを産生した。１ｍｇ／ｍｌのモグロールを、ｐＨ７．０の０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ中で、２００μｌのＵＧＴ７３Ｃ５（シロイヌナズナ）（３３４）を含む粗抽出物、２μｌのスクロースシンターゼを含む粗抽出物、５ｍＭのＵＤＰ、１×Ｍ２２１のプロテアーゼ阻害剤、２００ｍＭのスクロース、０．５ｍｇ／ｍｌのスペクチノマイシンと反応させ、３０℃でインキュベートした。ＨＰＬＣのために２日後にサンプルを採取した。反応産生物は、図４および図５に示すように、モグロールからモグロシドＩおよびモグロシドＩＩまでであった。
ＵＧＴ７３Ｃ５のタンパク質配列を、配列番号４４１で示し、ＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号４４１）のネイティブなＤＮＡコード配列を、配列番号４４２で示し、かつＵＧＴ７３Ｃ５コード配列（大腸菌についてコドン最適化）を、配列番号４４３で示す。
実施例５０：モグロシドＩを産生するためのモグロールの存在下でのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７３Ｃ６）
反応条件：１ｍｇ／ｍｌのモグロールを、ｐＨ７．５の０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ中で、２００μｌのＵＧＴ７３Ｃ６を含む粗抽出物、２μｌのスクロースシンターゼを含む粗抽出物、５ｍＭのＵＤＰ、１×Ｍ２２１のプロテアーゼ阻害剤、２００ｍＭのスクロース、０．５ｍｇ／ｍｌのスペクチノマイシンと反応させ、３０℃でインキュベートした。ＨＰＬＣのために２日後にサンプルを採取した。反応産生物は、モグロール由来のモグロシドＩであった。ＨＰＬＣデータおよび質量分析データを図６に示す。
シロイヌナズナＵＧＴ７３Ｃ６をコードするタンパク質およびｇＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号４４４および配列番号４４５で示す。
実施例５１：モグロシドＩ、モグロシドＩＩＡおよび２つの異なるモグロシドＩＩＩ産生物を産生するためのモグロールの存在下でのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３３８）
反応条件：１ｍｇ／ｍｌのモグロールまたはモグロシドＩＩＡを、ｐＨ８．５の０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ中で、２００μｌの３３８を含む粗抽出物、２μｌのスクロースシンターゼを含む粗抽出物、５ｍＭのＵＤＰ、１×Ｍ２２１のプロテアーゼ阻害剤、２００ｍＭのスクロース、０．５ｍｇ／ｍｌのスペクチノマイシンと反応させ、３０℃でインキュベートした。ＨＰＬＣのために２日後にサンプルを採取した。
バチルス属のＵＤＰ−グリコトランスフェラーゼ（３３８）とモグロールとの反応（Pandeyら（2014年）に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）により、反応産生物：モグロシドＩ、モグロシドＩＩＡおよび２つの異なるモグロシドＩＩＩ産生物が生じた。図７〜９には、反応後に得られた産生物のＨＰＬＣおよび質量分析データが示される。図８には、モグロールＩＩＡのサイズに相関するピークが示される。
ＵＧＴ３３８をコードするタンパク質およびｇＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号４０５および配列番号４０６で示される。
実施例５２：シアメノシドＩおよびモグロシドＶを産生するためのモグロシドＩＩＩＥの存在下でのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３０１（ＵＧＴ９８））
反応条件：１ｍｇ／ｍｌのモグロシドＩＩＩＥを、ｐＨ７．０の０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ中で、２００μｌの３０１を含む粗抽出物、２μｌのスクロースシンターゼを含む粗抽出物、５ｍＭのＵＤＰ、１×Ｍ２２１のプロテアーゼ阻害剤、２００ｍＭのスクロース、０．５ｍｇ／ｍｌのスペクチノマイシンと反応させ、３０℃でインキュベートした。ＨＰＬＣおよび質量分析のために２日後にサンプルを採取した。モグロシドＩＩＩＥ由来の反応産生物は、図１０〜１１に示すようにシアメノシドＩおよびモグロシドＶであった。
ラカンカ３０１ＵＧＴ９８をコードするタンパク質およびｇＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号４０７および配列番号４０８で示される。
実施例５３：モグロールからモグロシドＩを、シアメノシドＩからイソモグロシドＶを、そして化合物１から化合物１誘導体を産生するための、モグロール、シアメノシドＩまたは化合物１の存在下でのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３３９）
反応条件：１ｍｇ／ｍｌのモグロール、シアメノシドＩまたは化合物１を、ｐＨ７．０の０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ中で、２００μｌの３３９を含む粗抽出物（Itkinらに記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、２μｌのスクロースシンターゼを含む粗抽出物、５ｍＭのＵＤＰ、１×Ｍ２２１のプロテアーゼ阻害剤、２００ｍＭのスクロース、０．５ｍｇ／ｍｌのスペクチノマイシンと反応させ、３０℃でインキュベートした。ＨＰＬＣのために２日後にサンプルを採取した。
モグロール由来の反応産生物によりモグロシドＩが生じ、シアメノシドＩによりイソモグロシドＶが生じ、そして化合物１により化合物１誘導体が生じた（図１２〜１４）。
ラカンカＵＧＴ３３９をコードするタンパク質およびＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号４０９および配列番号４１０で示される。
実施例５４：モグロシドＩＩＩＡ、モグロシドＩＶＥおよびモグロシドＶを産生するためのモグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶＡまたはモグロシドＩＶＥの存在下でのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３３０）
本明細書に記載されるように、Noguchiら２００８（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたＵＤＰ−グリコトランスフェラーゼ（３３０）の使用により、反応産生物であるモグロシドＩＩＩＡ、モグロシドＩＶＥ、モグロシドＶが生じた。ネイティブな宿主は、ゴマ（Sesamum indicum）であり、産生宿主は、ＳＦ９であった。反応のために、１ｍｇ／ｍｌのモグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶＡまたはモグロシドＩＶＥを、ｐＨ７．０の０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ中で、２００μｌの３３０を含む粗抽出物、２μｌのスクロースシンターゼを含む粗抽出物、５ｍＭのＵＤＰ、１×Ｍ２２１のプロテアーゼ阻害剤、２００ｍＭのスクロース、０．５ｍｇ／ｍｌのスペクチノマイシンと反応させ、３０℃でインキュベートした。ＨＰＬＣのために２日後にサンプルを採取した。
反応によってモグロシドＩＩＩＡ、モグロシドＩＶＥ、モグロシドＶなどの驚くべき産生物が生じた。図１５〜２０に示すように、産生した化合物のサイズは、モグロシドＩＩＩＡ、モグロシドＩＶＥおよびモグロシドＶに対応する。
ラカンカＵＧＴ３３０タンパク質をコードするタンパク質およびｇＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号４１１および配列番号４１２で示される。
実施例５５：モグロシドＩＩＩＡ、モグロシドＩＶＥおよびモグロシドＶを産生するためのモグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶＡまたはモグロシドＩＶＥの存在下でのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３２８）（Itkinらに記載される）
反応条件：１ｍｇ／ｍｌのモグロシドＩＩＩＥを、ｐＨ７．０の０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ中で、２００μｌの３３０を含む粗抽出物、２μｌのスクロースシンターゼを含む粗抽出物、５ｍＭのＵＤＰ、１×Ｍ２２１のプロテアーゼ阻害剤、２００ｍＭのスクロース、０．５ｍｇ／ｍｌのスペクチノマイシンと反応させ、３０℃でインキュベートした。ＨＰＬＣのために２日後にサンプルを採取した。
反応産生物は、モグロシドＩＶＥおよびモグロシドＶであった。図２１〜２２に示すように、質量分析データの産生物のサイズは、モグロシドＩＶＥおよびモグロシドＶに対応する。ラカンカＵＧＴ３２８タンパク質（グリコシルトランスフェラーゼ）およびそのコード配列は、それぞれ、配列番号４１３および４１４で示される。
スクロースシンターゼＡｔＳｕｓ１タンパク質配列およびＡｔＳｕｓ１タンパク質をコードするｇＤＮＡは、それぞれ、配列番号４１５および４１６で示される。
実施例５６：酵母でのモグロール産生
ＤＮＡは、ＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔまたはＩＤＴのいずれかを介した遺伝子合成により得られた。一部のククルビタジエノールシンターゼについては、１０〜６０日齢の苗木からｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを取得し、続いて、特異的および縮退したプライマーを使用してＰＣＲ増幅を行った。ＤＮＡを、標準的な分子生物学技術により、次の過剰発現ベクターの１つにクローン化した：ｐＥＳＣ−Ｕｒａ、ｐＥＳＣ−ＨｉｓまたはｐＥＳＣ−ＬＥＵ。サッカロミセス・セレビシエ株ＹＨＲ０７２（ｅｒｇ７のヘテロ接合体）を、ＧＥ Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入した。モグロール合成遺伝子を含むプラスミド（ｐＥＳＣベクター）を、Ｚｙｍｏ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩを使用して形質転換／共形質転換した。３０℃、２２０ｒｐｍでの異種遺伝子の誘導のために、適切に選択された２％グルコースまたは２％ガラクトースを含む標準培地（ＹＰＤまたはＳＣ）で株を増殖させた。指示された場合、ラノステロールシンターゼ阻害剤、Ｒｏ４８−８０７１（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を添加した（５０μｇ／ｍｌ）。モグロールおよび前駆体の酵母産生を、２日間の誘導後に準備し、続いて、溶解（酵母バスター）、酢酸エチル抽出、乾燥およびメタノールへの再懸濁を行った。サンプルをＨＰＬＣで分析した。
ククルビタジエノールの産生を、阻害剤を使用しない増殖条件下でククルビタジエノールシンターゼのラカンカＳｇＣｂＱによって触媒した。
ククルビタジエノールの産生を、ＨＰＬＣおよび質量分析データに示し、これは指示された産生物の質量ピークを示す（図２３）。ラカンカＳｇＣｂＱをコードするタンパク質配列およびＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号４４６および４１８で示す。
Ｃｐｅｐ２も、酵母におけるククルビタジエノールの産生に使用した。図２４に示すように、ククルビタジエノールに対応するピークおよび特徴的なフラグメントを示す質量分析プロファイルである。Ｃｐｅｐ２のタンパク質配列およびＣｐｅｐ２をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号４２０および４２１で示される。
ペポカボチャ（ジャック・オー・ランタン）Ｃｐｅｐ４も、阻害剤を使用しない増殖条件下でのククルビタジエノールの産生において使用した。ククルビタジエノールの産生を、図２４および２５に示す質量スペクトルデータで示す。示されているように、ピークおよびフラグメントは、ククルビタジエノールに対応する。Ｃｐｅｐ４をコードするタンパク質配列およびＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号４２２および４２３で示す。
Ｃｍａｘを表す推定ククルビタジエノールシンターゼタンパク質配列を、ネイティブな宿主のセイヨウカボチャから得た。推定コードＤＮＡ配列は、遺伝子の合成および発現に使用される。ククルビタジエノールシンターゼをコードするタンパク質およびＤＮＡのククルビタジエノールシンターゼ配列を以下に示す：
以下のタンパク質およびＤＮＡコード配列を、公的データベース（ＰｕｂＭｅｄ）を介して利用可能な既知のククルビタジエノールシンターゼ配列を有するゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物配列のアラインメントにより得た。これらのＣｍａｘタンパク質のいずれか１つが、本明細書に開示された方法、システム、組成物（例えば、宿主細胞）で使用され、化合物１を産生することが予想される。非限定的な例示的なＣｍａｘタンパク質は、Ｃｍａｘ１（ＤＮＡ）（配列番号４２５）によってコードされたＣｍａｘ１（タンパク質）（配列番号４２４）である。
Ｃｍｏｓ１を表す推定ククルビタジエノールシンターゼタンパク質配列を、ネイティブな宿主のニホンカボチャ（Cucurbita moschata）から得た。推定コードＤＮＡ配列は、遺伝子の合成および発現に使用される。以下に示すタンパク質およびＤＮＡコード配列を、公的データベース（ＰｕｂＭｅｄ）を介して利用可能な既知のククルビタジエノールシンターゼ配列を有するゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物配列のアラインメントにより得た。これらのＣｍｏｓタンパク質のいずれか１つを、本明細書に開示された方法、システム、組成物（例えば、宿主細胞）で使用して、化合物１を産生することができる。非限定的な例示的なＣｍｏｓ１タンパク質は、Ｃｍｏｓ１（ＤＮＡ）（配列番号４２７）によってコードされるＣｍｏｓ１（タンパク質）（配列番号４２６）である。
実施例５７：酵母におけるジヒドロキシククルビタジエノールの産生（ククルビタジエノールシンターゼおよびエポキシドヒドロラーゼ）
酵母におけるジヒドロキシククルビタジエノールの産生は、ククルビタジエノールシンターゼおよびエポキシドヒドロラーゼを使用して考慮された。これらの酵素のネイティブな宿主は、ラカンカである。
増殖条件：ＳｇＣｂＱを、ラノステロールシンターゼ阻害剤の存在下でエポキシドヒドロラーゼ（ＥＰＨ）と共発現させた。
可能なジヒドロキシククルビタジエノール産生物を、図２６に示す。
ＥＰＨタンパク質配列およびＥＰＨタンパク質をコードするＤＮＡ（コドン最適化されたサッカロミセス・セレビシエ）を、それぞれ、配列番号４２８および４２９で示す。
実施例５８：ククルビタジエノールシンターゼ、エポキシドヒドロラーゼ、シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼからのモグロールの産生
ククルビタジエノールシンターゼ、エポキシドヒドロラーゼ、シトクロムＰ４５０およびシトクロムＰ４５０レダクターゼを含む４つの酵素を、サッカロミセス・セレビシエで共発現させる。増殖条件では、ＳｇＣｂＱ、ＥＰＨ、ＣＹＰ８７Ｄ１８およびＡｔＣＰＲ（シロイヌナズナ由来のシトクロムＰ４５０レダクターゼ）を、ラノステロールシンターゼ阻害剤の存在下で共発現させる。サッカロミセス・セレビシエによるモグロールの産生が予想される。ＳｇＣｂＱ、ＥＰＨ、ＣＹＰ８７Ｄ１８およびＡｔＣＰＲをコードするタンパク質配列およびＤＮＡ配列（シロイヌナズナ由来のシトクロムＰ４５０レダクターゼ）は、ＣＹＰ８７Ｄ１８（タンパク質）（配列番号４３０）およびＣＹＰ８７Ｄ１８（ＤＮＡ）（配列番号４３１）；およびＡｔＣＰＲ（タンパク質）（配列番号４３２）およびＡｔＣＰＲ（ＤＮＡ）（配列番号４３３）である。
実施例５９：化合物１は、微生物加水分解に耐性がある。
酵母株サッカロミセス・セレビシエ、ヤロウィア・リポリティカおよびカンジダ・ボンビコラ（Candida bombicola）を、１ｍｇ／ｍｌのモグロシドＶまたは化合物１を補充したＹＰＤ中でインキュベートした。３日後、上清を、ＨＰＬＣにより分析した。
ＨＰＬＣデータに示されるように、エポキシドヒドロラーゼは、モグロシドＶをモグロシドＩＩＩＥに加水分解した。加水分解産生物は、化合物１では確認されなかった（図３７）。
実施例６０：ストレプトコッカス・ミュータンス・クラークＡＴＣＣ２５１７５デキストランスクラーゼ
ストレプトコッカス・ミュータンス・クラークは、グルコース補充で嫌気的に増殖させることができる。増殖条件の例は、Wenham, Henessey and Cole (1979年)に見出され得る。この方法では、例えば、デキストランスクラーゼの産生を刺激する。５ｍｇ／ｍｌのモグロシドＩＩＩＥを、増殖培地に加えた。産生をモニターするための時間ごとのサンプルを、例えば、ＨＰＬＣについて取得することができる。種々のデキストランスクラーゼの配列を、第１表で見出すことができ、これにはデキストランスクラーゼのタンパク質配列およびデキストランスクラーゼをコードする核酸配列（例えば、配列番号１５７〜１６２）が含まれる。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号２、１０３、１０６〜１１０、１５６および８９６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ＤｅｘＴは、配列番号１０３に記載されたアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤｅｘＴは、配列番号１０４または１０５に記載された核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書において、組換え細胞は、配列番号１５６〜１６２のいずれか１つに記載された配列を含むタンパク質をコードし、かつ／または配列番号１５７〜１６２のいずれか１つに記載された核酸配列を含むデキストランスクラーゼをコードする核酸を含む。この実施例は、化合物１を産生するために使用される。
実施例６１：純度９０％の化合物１の産生手順および官能評価
３種のα−モグロシド異性体の混合物を含むフラクションを、モグロシドＩＩＩＥ（ＭＩＩＩＥ）をデキストランスクラーゼ／デキストラナーゼ酵素反応で処理し、続いてＳＰＥ分画することにより得る。ＵＰＬＣ分析に基づくと、この混合物には３種の異性体、１１−オキソ−化合物１、化合物１およびモグロシドＶ異性体が、それぞれ、５：９０：５％の比率で含まれている。これらの３種の異性体は、ＬＣ−ＭＳ、１Ｄおよび２Ｄ ＮＭＲスペクトルによる異なるフラクション／ソースの精製から特徴付けられ、さらに文献で報告されているモグロシド系の密接に関連する異性体の比較によって特徴付けられる。このサンプルはさらに、三角形試験を使用して純粋な化合物１サンプルと比較することにより官能評価で評価される。
酵素反応および精製手順
１００ｍＬのｐＨ５．５の１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、２００ｇのスクロース、１００ｍＬのデキストランスクラーゼＤｅｘＴ（１ｍｇ／ｍｌの粗抽出物、ｐＥＴ２３ａ、ＢＬ２１−コドンプラス−ＲＩＬ、２Ｘ ＹＴで増殖）、１２．５ｇのモグロシドＩＩＩＥおよび６００ｍＬの水を、２．８Ｌの振盪フラスコに加え、フラスコを３０℃、２００ｒｐｍで振盪した。反応の進行を、ＬＣ−ＭＳによって定期的にモニターした。７２時間後、反応物を、２．５ｍＬのデキストラナーゼ（Amano製）で処理し、３０℃でフラスコを振盪し続けた。２４時間後に、反応混合物を８０℃で加熱することによりクエンチし、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を濾過し、４００ｇのＣ１８ ＳＰＥカラムに直接充填し、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏの５／２５／５０／７５／１００ステップ−グラジエントを使用して分画した。グラジエントの各ステップを、６つのジャーに収集し、各ジャーには２２５ｍＬが含まれている。所望の生成物を、７５％のＭｅＯＨフラクションの第２のジャー（ＳＰＥ ７５＿２）に溶出し、減圧下で乾燥させた。これを、さらに７ｍＬのＨ２Ｏに再懸濁／溶解し、バイアルを３日間凍結かつ凍結乾燥させて、１．４５ｇの白色固体を得た。
ＵＰＬＣ分析（図２８および図２９）によると、この混合物には、３種の特性決定されたα−モグロシド異性体；１１−オキソ−化合物１、化合物１およびモグロシドＶ異性体が、それぞれ、５：９０：５％の比率で含まれている。残留溶媒および／または構造的に無関係な不純物は、１Ｈおよび１３Ｃ−ＮＭＲ（ピリジン−ｄ５＋Ｄ２Ｏ）分析に基づいて確認されなかった。
官能評価
純粋な化合物１対純度９０％の化合物１の三角形試験を、２０１６年１１月１０日に実施した。２種の異なる組成物：（１）ＬＳＢ＋１７５ｐｐｍの純粋な化合物１（標準）および（２）ＬＳＢ＋１７５ｐｐｍの純度９０％の化合物１を試験した。組成物のすべてのサンプルを、ｐＨ約７．１で０％のエタノールを含む低ナトリウム緩衝液（ＬＳＢ）で作った。
結論：パネリストは、組成物（１）ＬＳＢ＋１７５ｐｐｍの純粋な化合物１（標準）が、組成物（２）ＬＳＢ＋１７５ｐｐｍの純度９０％の化合物１（試験）（ｐ＞０．０５）と有意な差がないことを見出した。試験分析結果の一部を、第２表〜第４表に示す。
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実施例６２：組換え酵母細胞における遺伝子発現
Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ、ＩＤＴまたはＧｅｎｅｗｉｚのいずれかによる遺伝子合成によってＤＮＡを得た。一部のククルビタジエノールシンターゼについては、１０〜６０日齢の苗木からｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを取得し、続いて、特異的および縮退したプライマーを使用してＰＣＲ増幅を行った。標準的な分子生物学技術または酵母ギャップ修復クローニング（Joskaら、２０１４年）により、以下の過剰発現ベクターの１つにＤＮＡをクローニングした：ｐＥＳＣ−Ｕｒａ、ｐＥＳＣ−ＨｉｓまたはｐＥＳＣ−ＬＥＵ。遺伝子発現を、以下のプロモーターのうちの１つによって制御した；Ｇａｌ１、Ｇａｌ１０、Ｔｅｆ１またはＧＤＳ。Ｚｙｍｏ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩを使用して、酵母の形質転換を行った。酵母株を、異種遺伝子の誘導のために２％のグルコースまたは２％のガラクトースを含む適切に選択された標準培地（ＹＰＤまたはＳＣ）で増殖させた。酵母株を、振盪フラスコまたは９６ウェルのプレートにおいて３０℃、１４０〜２５０ｒｐｍで増殖させた。指示がある場合、ラノステロールシンターゼ阻害剤、Ｒｏ４８−８０７１（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を添加した（５０μｇ／ｍｌ）。モグロールおよび前駆体の酵母産生を、溶解（酵母バスター）、酢酸エチル抽出、乾燥およびメタノールへの再懸濁により準備した。サンプルを、Ａ／Ｂグラジエント（Ａ＝Ｈ２Ｏ、Ｂ＝アセトニトリル）を使用して、以下に記載するＬＣＭＳ法で分析した。
ジエポキシスクアレンを分析する場合、ＬＣＭＳ法で、１．５分で５％のＢ、５．５分でグラジエント５％〜９５％のＢ、６分で９５％のＢ、３分で１００％のＢ、１．５分で５％のＢ、かつすべて０．３ｍｌ／分の流速で、Ｃ１８ ２．１×５０ｍｍカラムを使用した。
ククルビタジエノールを分析する場合、第１のＬＣＭＳ法で、６分でグラジエント１〜９５％のＢ、かつ０．５５ｍｌ／分の流速で、Ｃ４ ２．１×１００ｍｍカラムを使用し、第２のＬＣＭＳ法では、２分で６２〜６７％のＢ、１分で１００％のＢ、かつ０．９ｍｌ／分の流速で、ガードを有するＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４ ２．１×１００ｍＭ、１．７μｍを使用した。
１１−ＯＨククルビタジエノールを分析する場合、ＬＣＭＳ法で、６分でグラジエント６０〜９０％のＢ、０．５５ｍｌ／分の流速で、Ｃ８ ２．１×１００ｍｍカラムを使用した。
モグロールを分析する場合、ＬＣＭＳ法で、６分でグラジエント５０〜９０％のＢ、０．５５ｍｌ／分の流速で、Ｃ８ ２．１×１００ｍｍカラムを使用した。
モグロシドＩＩＩＥおよび化合物１を分析する場合、ＬＣＭＳ法で、６分でグラジエント１５〜３０％のＢ、０．５５ｍｌ／分の流速で、フルオロフェニル２．１×１００ｍｍカラムを使用した。
実施例６３：
ステップ１．オキシドスクアレンの可用性のブースト
サッカロミセス・セレビシエ株ＹＨＲ０７２（ラノステロールシンターゼｅｒｇ７のヘテロ接合体）を、ＧＥ Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社から購入した。プロモーターをｃｕｐ１のプロモーターに置き換えることにより、活性なｅｒｇ７遺伝子の発現が低下した（Ｐｅｎｇら、２０１５年）。ＧＤＳプロモーターの制御下にある切断型酵母ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ｔＨＭＧ−ＣｏＡ）およびＴｅｆ１プロモーターの制御下にある酵母スクアレンエポキシダーゼ（ｅｒｇ１）を、ゲノムに組み込んだ。ＨＰＬＣおよびＵＶ吸光度で示されるように、ジエポキシスクアレンの産生により、オキシドスクアレンのブーストをモニターした（図３１）。
ｔＨＭＧ−ＣｏＡ（タンパク質）配列番号８９８（経路１）
ｔＨＭＧ−ＣｏＡ（ＤＮＡ）配列番号８９７（経路１）
Ｅｒｇ１（タンパク質）配列番号９００；Ｅｒｇ１（ＤＮＡ）配列番号８９９
いくつかの実施形態では、ｔＨＭＧ−ＣｏＡ酵素を、ジエポキシスクアレンの産生に使用する。
ラカンカにおける推定スクアレンエポキシダーゼをコードする遺伝子（Ｉｔｋｉｎｓら、２０１６年）を選択し、オキシドスクアレン／ジエポキシスクアレン産生のブーストを試験した。３種のスクアレンエポキシダーゼの配列は、それらのアミノ酸およびコード配列（配列番号５０〜５６、６０、６１、３３４または３３５）について第１表に見出され得る。オキシドスクアレンおよび／またはジエポキシスクアレンを産生するためのおよびオキシドスクアレンおよび／またはジエポキシスクアレンの産生をブーストするための本明細書に開示された方法、システムおよび組成物における使用に適したスクアレンエポキシダーゼのさらなる配列には、ＳＱＥ１（タンパク質）配列番号９０８、ＳＱＥ１（ＤＮＡ）配列番号９０９；ＳＱＥ２（タンパク質）配列番号９１０、ＳＱＥ２（ＤＮＡ）配列番号９１１；ＳＱＥ３（タンパク質）配列番号９１２およびＳＱＥ３（ＤＮＡ）配列番号９１３が含まれる。
ステップ２．ククルビタジエノールの産生
ククルビタジエノールシンターゼ
ラカンカのククルビタジエノールシンターゼ遺伝子（ＳｇＣｂＱ）を含むプラスミドを、オキシドスクアレンがブーストされた酵母株に形質転換した。株を、３０℃、１５０〜２５０ｒｐｍで１〜３日増殖させた。ククルビタジエノールの産生を、示された産生物の質量ピークを示すＨＰＬＣおよび質量分析データに示す（図２３）。ＳｇＣｂＱタンパク質およびＳｇＣｂＱをコードするｇＤＮＡを、それぞれ、配列番号４４６および配列番号４１８で示す。ペポカボチャ（ジャック・オー・ランタン）タンパク質Ｃｐｅｐ２も、酵母でのククルビタジエノールの産生に使用した。図２４は、ククルビタジエノールに対応するピークおよび特徴的なフラグメントを含む質量分析プロファイルを示す。Ｃｐｅｐ２タンパク質およびＣｐｅｐ２をコードするＤＮＡを、それぞれ、配列番号４２０および配列番号４２１で示す。ペポカボチャ（ジャック・オー・ランタン）タンパク質Ｃｐｅｐ４も、ククルビタジエノールの産生に使用した。宿主細胞を、阻害剤を使用しない増殖条件下で培養した。ククルビタジエノールの産生を、図２５に示す質量スペクトルデータで実証する。示されるように、ピークおよびフラグメントは、ククルビタジエノールに対応する。Ｃｐｅｐ４タンパク質およびＣｐｅｐ４をコードするＤＮＡを、それぞれ、配列番号４２２および配列番号４２３で示す。セイヨウカボチャタンパク質Ｃｍａｘも、酵母でのククルビタジエノールの産生に使用した。図３２は、ククルビタジエノールに対応するピークおよび特徴的なフラグメントを含む質量分析プロファイルを示す。Ｃｍａｘ１タンパク質配列を、配列番号４２４で示し、Ｃｍａｘ１（ＤＮＡ）のコード配列を、配列番号４２５で示す。メロンタンパク質Ｃｍｅｌｏも、酵母でのククルビタジエノールの産生に使用した。図３２は、ククルビタジエノールに対応するピークおよび特徴的なフラグメントを含む質量分析プロファイルを示す。Ｃｍｅｌｏタンパク質配列を、配列番号９０２で示し、Ｃｍｅｌｏ（ＤＮＡ）のコード配列を、配列番号９０１で示す。ニホンカボチャタンパク質Ｃｍｏｓ１も、組換え宿主細胞、例えば、酵母細胞でのククルビタジエノールの産生に使用できることが予想される。Ｃｍｏｓ１の配列のＣｍｏｓ１（タンパク質）（配列番号４２６）およびＣｍｏｓ１（ＤＮＡ）（配列番号４２７）を、公的データベース（ＰｕｂＭｅｄ）を介して利用可能な既知のククルビタジエノールシンターゼ配列を有するゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物配列のアラインメントにより得た。Ｃｍｏｓｔ１タンパク質（配列番号４２６）は、組換え宿主細胞、例えば、酵母細胞でのククルビタジエノールの産生に使用できることが予想される。
他のオキシドスクアレンシクラーゼのククルビタジエノールシンターゼへの変換
修飾されたオキシドスクアレン遺伝子を含むプラスミドを、オキシドスクアレンでブーストされた酵母株に形質転換した。株を、３０℃、１５０〜２５０ｒｐｍで１〜３日増殖させた。
ネイティブな宿主のエンドウ由来のタンパク質ＰＳＸ Ｙ１１８Ｌも、酵母でのククルビタジエノールの産生に使用した。図３３は、チロシンが位置１１８でロイシンに変換される際のククルビタジエノールに対応するピークおよび特徴的なフラグメントを含む質量分析プロファイルを示す。修飾されたオキシドスクアレンシクラーゼをコードするタンパク質およびＤＮＡの配列は、ＰＳＸＹ１１８Ｌ（タンパク質）（配列番号９０４）およびＰＳＸＹ１１８Ｌ（ＤＮＡ、コドン最適化）（配列番号９０３）である。タマホコリカビ属由来のオキシドスクアレンシクラーゼも、酵母でのククルビタジエノールの産生に使用した。図３４に示すように、チロシンが位置８０でロイシンに変換される際のククルビタジエノールのＨＰＬＣピークを示す。修飾されたオキシドスクアレンシクラーゼをコードするタンパク質およびＤＮＡの配列は、ＤｄＣＡＳＹ８０Ｌ（タンパク質）（配列番号９０６）およびＤｄＣＡＳＹ８０Ｌ（ＤＮＡ）（配列番号９０５）である。
ククルビタジエノールシンターゼ活性の改善
ククルビタジエノールシンターゼ形態のメロンをコードする遺伝子を、コドン最適化し（配列番号９０７）、修飾のライブラリーを生成するための開始点として使用した。修飾を、酵素のＮ末端（すなわち、５’）またはＣ末端（すなわち、３’）で融合ペプチドからなる標準的な分子生物学技術により導入した。修飾されたククルビタジエノールシンターゼ遺伝子のプラスミドライブラリーを、オキシドスクアレンブーストにより酵母株に形質転換した。酵素活性を、上記のＬＣＭＳ法２を使用して、ククルビタジエノール対内部標準の予想保持時間での４０９および４２７陽性質量フラグメントのピーク高さまたは面積の比によって測定した。酵素性能を、親酵素の平均活性に対する平均％活性として記録した（ｎ＝８）。ステップ１の酵素の配列および酵素をコードする配列は、配列番号９５１〜１０１２に見出され得る。ステップ１の配列には、第１表に記載されている融合ＳＳ２ｃ−Ｇ１０、ＳＳ２ｅ−Ａ７ｂ、ＳＳ２ｄ−Ｇ１１、ＳＳ２ｅ−Ａ７ａ、ＳＳ４ｄ−Ｇ５、ＳＳ４ｄ−Ｃ７、ＳＳ３ｂ−Ｄ８およびＳＳ２ｃ−Ａ１０ａも含まれる。
ステップ３． １１−ＯＨククルビタジエノールの産生
ＣＹＰ８７Ｄ１８（ＣＹＰ４５０、ラカンカ）およびＳｇＣＰＲ（ＣＹＰ４５０レダクターゼ、ラカンカ）を、ククルビタジエノールを産生するサッカロミセス・セレビシエ株で発現させた。１１−ＯＨククルビタジエノール（すなわち、１１−ヒドロキシククルビタジエノール）を、ＨＰＬＣおよび質量分析データを使用して確認した（図３６）。ラカンカＣＹＰ８７Ｄ１８タンパク質配列を、配列番号８７２で示し、ＣＹＰ８７Ｄ１８（コドン最適化ＤＮＡ）コード配列を、配列番号８７１で示す。ラカンカＳｇＣＰＲタンパク質配列を、配列番号８７４で示し、ＳｇＣＰＲ１（コドン最適化ＤＮＡ）コード配列を、配列番号８７３で示す。
ラカンカ由来のさらなるＣＹＰ４５０およびカンゾウ属（Glycyrrhiza）（ＣＹＰ８８Ｄ６）を、ククルビタジエノールを産生するサッカロミセス・セレビシエ株で発現した。酵素のタンパク質配列およびＤＮＡコード配列を、配列番号８７５〜８９０で示す。
ステップ４．モグロールの産生
ＣＹＰ１７９８（ＣＹＰ４５０酵素、ラカンカ）およびＥＰＨ２Ａ（エポキシドヒドロラーゼ、ラカンカ）を、１１−ＯＨククルビタジエノールを産生するサッカロミセス・セレビシエ株で発現させた。モグロールを、ＨＰＬＣおよび質量分析データを使用して確認した（図３６）。配列について、酵素のＤＮＡコードおよびタンパク質配列を、配列番号８９１〜８９４で示す。
ククルビタジエノールおよび／または１１−ＯＨククルビタジエノールのエポキシ化
ラカンカ由来のさらなるＣＹＰ４５０およびＳＱＥならびにカンゾウ属（ＣＹＰ８８Ｄ６）も、ククルビタジエノールまたは１１−ＯＨククルビタジエノールを産生するサッカロミセス・セレビシエ株で発現させて、エポキシ化について試験した。
ＳＱＥについて、酵素のタンパク質およびＤＮＡコード配列を、配列番号８８２〜８８８で示す。ＣＹＰ４５０について、酵素のタンパク質およびＤＮＡコード配列を、配列番号８７５〜８９０で示す。
ステップ７：サッカロミセス・セレビシエでのモグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生。
切断型デキストランスクラーゼ（ｔＤｅｘＴ）を発現するサッカロミセス・セレビシエ株を、７ｍｇ／ｍｌのモグロシドＶを含むＹＰＤ（３０℃、２５０ｒｐｍ）で１〜２日間インキュベートし、モグロシドＩＩＩＥに加水分解した。サッカロミセス・セレビシエ細胞を、回収し、溶解し、その後、モグロシドＩＩＩＥを含むＹＰＤ上清と混合し戻した。デキストランスクラーゼ反応を開始するために、スクロースを２００ｇ／Ｌの最終濃度まで添加し、続いて３０℃、２５０ｒｐｍで２日間インキュベートした。化合物１の産生を、ＨＰＬＣを用いて確認した（図３７）。ｔＤｅｘＴのタンパク質配列を配列番号８９６で示し、ｔＤｅｘＴのＤＮＡコード配列を、配列番号８９５で示す。
実施例６４
サッカロミセス・セレビシエまたはヤロウィア・リポリティカを、酵母における加水分解酵素が、モグロシドＩＩＩＥを産生することを可能にするモグロシドＶの存在下で増殖させた。１日または２日後、細胞を溶解してＨＰＬＣで分析し、モグロシド含有量を求めた。１日間のインキュベーション後、サッカロミセス・セレビシエは、モグロシドＶ、モグロシドＩＶおよびモグロシドＩＩＩＥの混合物を産生した。２日間のインキュベーション後、図４０Ａに示すように、実質的にすべてのモグロシドが、モグロシドＩＩＩＥに変換された。
同様に、２日間のインキュベーション後、ヤロウィア・リポリティカは、大部分がモグロシドＩＩＩＥを産生した（図４０Ｂに示す）。
実施例６５
サッカロミセス・セレビシエまたはＹ．リポリティを、化合物１の存在下で増殖させた。他のモグロシドとは異なり（実施例６４を参照のこと）、化合物１の加水分解による加水分解産生物が、図４１に示すように確認された。
実施例６６
サッカロミセス・セレビシエを、改変してデキストランスクラーゼ（ＤｅｘＴ）を過剰発現させた。この改変された株を、モグロシド混合物の存在下で増殖させて、サッカロミセス・セレビシエの加水分解酵素がモグロシドＩＩＩＥを産生するようにした。２日間のインキュベーション後、細胞を溶解してＤｅｘＴ酵素を放出し、スクロースを補充した。２４時間後、かなりの量の化合物１を産生した（図４２に示す）。
実施例６７：ククルビタジエノールシンターゼ活性を有する融合タンパク質の産生
ククルビタジエノールシンターゼ遺伝子のサッカロミセス・セレビシエインフレーム融合ポリヌクレオチドのコレクションまたはライブラリー（配列番号９０７で示されるＤＮＡコード配列および配列番号９０２で示されるタンパク質配列）を準備した。インフレーム融合ポリヌクレオチドを酵母ベクター分子にクローニングして、融合タンパク質を産生した。
様々な融合タンパク質を産生し、ククルビタジエノールシンターゼ活性について試験した。この実施例で産生した融合タンパク質の一部の試験結果を第２表に示す。
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実施例６８：モグロシドＩＶおよびモグロシドＶ異性体を産生するためのモグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶＥまたはモグロシドＩＶＡの存在下でのＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（３１１酵素、配列番号４３６〜４３８）
反応条件：１７ｍｌの水が入った５０ｍｌのファルコンチューブに、３ｍｌのｐＨ７．０の１Ｍのトリス−ＨＣｌ、０．１２ｇのＵＤＰ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）、３ｇのスクロース、３００μｌのプロテアーゼ阻害剤１００×Ｍ２２１、１５０μｌのカナマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）、１．１８５ｍｌのスクロースシンターゼＳｕｓ１（１ｍｇ／ｍｌの粗抽出物）、１５０ｍｇの出発モグロシドおよび６ｍｌの３１１酵素（１ｍｇ／ｍｌの粗抽出物）を添加し、３０℃、１５０ｒｐｍでインキュベートした。反応の進行を、ＬＣ−ＭＳによって定期的にモニターした。３日後、撹拌（５００ｒｐｍ）しながら３０分間８０℃に加熱することにより、反応を停止した。次に、反応物を遠心分離し（４０００ｒｐｍで１０分間、エッペンドルフ）、上清を５０ｍｌの０．２２ミクロンＰＶＤＦで濾過した。同定した反応産生物を図４３に示す。
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本発明をその特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の真の技術思想および範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われ、同等物が置換され得ることを当業者は理解すべきである。これには、本明細書に記載されたすべての利点および特徴を与えない実施形態が含まれる。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスステップまたはステップを、本発明の課題、技術思想および範囲に適合させるために、多くの修正が加えられ得る。このような変更はすべて、本明細書に添付された特許請求の範囲内にあることが意図されている。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲を参照することによってのみ定義される。
発明の概要
本明細書では、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１の産生方法が提供される。
本明細書では、化合物１の構造
Figure 2020518264
 を有する化合物が開示されており、ここで、前記化合物は、本明細書で開示された方法のいずれかによって産生される。
本明細書では、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１を含む、細胞溶解物が開示されている。
また、本明細書では、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１と、モグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な酵素をコードする遺伝子とを含む組換え細胞が開示されている。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、前記組換え細胞にとって異種遺伝子である。
本明細書では、モグロシドＩＩＩＥからの、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１の産生を触媒することが可能な第１の酵素をコードする第１の遺伝子を含む組換え細胞が開示されている。第１の酵素は、例えば、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上であり得る。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、ＣＧＴアーゼである。例えば、ＣＧＴアーゼは、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４のいずれか１つの配列と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＧＴアーゼは、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれらのアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、デキストランスクラーゼである。例えば、デキストランスクラーゼは、配列番号２、１０３、１０６〜１１０、１５６および８９６に記載された配列のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％またはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号１０４、１０５、１５７、１５８および８９５のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、トランスグルコシダーゼである。トランスグルコシダーゼは、例えば、配列番号１６３〜２９１および７２３のいずれか１つの配列と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号３、９５〜１０２および１６３〜２９１および７２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれらのアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、ベータ−グルコシダーゼである。いくつかの実施形態では、ベータグルコシダーゼは、配列番号１０２、２９２、３５４〜３７６および６７８〜７４１のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
また、本明細書では、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１の産生方法も開示されている。いくつかの実施形態では、この方法は、第１のモグロシドを、１種以上のヒドロラーゼと接触させてモグロシドＩＩＩＥを産生すること；および前記モグロシドＩＩＩＥを、モグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な酵素と接触させることを含む。
本明細書では、第１のモグロシドを加水分解してモグロシドＩＩＩＥを産生することが可能なヒドロラーゼをコードする第１の遺伝子；およびモグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な酵素をコードする第２の遺伝子を含む、組換え細胞であって、ここで、化合物１が、構造：
Figure 2020518264
 を有する、組換え細胞が開示されている。
「モグロシド」および「モグロシド化合物」は、本明細書で互換的に使用され、トリテルペン配糖体のファミリーを指す。モグロシドの非限定的な例示的な例としては、例えば、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩが挙げられ、これらは果実の甘味の原因であるラカンカ（スウィングル）の果実から同定されている。本明細書の実施形態では、モグロシド中間体は、
Figure 2020518264
 の構造を有する化合物１のインビボ（in vivo）、エクスビボ（ex vivo）またはインビトロ（in vitro）での産生に使用され得る。いくつかの実施形態では、化合物１を産生するための組換え細胞は、モグロシドをさらに産生し、モグロシドの産生のための酵素をコードする遺伝子を含む。モグロシドの産生が可能な組換え細胞は、国際公開第２０１４０８６８４２号にさらに記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、前記酵素の発現および化合物１およびモグロシド中間体の産生を可能にするために培地で増殖される。いくつかの実施形態では、化合物１は、せん断力で細胞を溶解することにより（すなわち、フレンチプレスセルまたは音波処理）または洗剤溶解法により得られる。いくつかの実施形態では、前記細胞は、化合物１の産生をブーストするために、モグロールなどの前駆体分子とともに増殖培地に補充される。
化合物１
本明細書に開示されるように、化合物１は、
Figure 2020518264
 の構造を有する化合物またはそれらの塩である。
いくつかの実施形態では、化合物１
Figure 2020518264
 の製造方法であって、ラカンカの抽出物をＨＰＬＣカラムで分画し、化合物１を含む溶出フラクションを収集することを含む、製造方法が提供される。
いくつかの実施形態では、化合物１
Figure 2020518264
 の製造方法であって、モグロシドＩＩＩＥを、グルコーストランスフェラーゼ酵素ＵＧＴ７６Ｇ１で処理することを含む、製造方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、配列番号４４０に記載された配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、配列番号４３９に記載されたアミノ酸配列を含む。
種々のモグロシド化合物は、化合物１を産生するための中間体化合物として使用され得る。かかるモグロシド化合物の非限定的な例の１つは、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１２である。いくつかの実施形態では、化合物１２の産生方法は、モグロシドＶＩを、１つ以上のインベルターゼを発現する細胞（例えば、組換え宿主細胞）と接触させることを含む。
種々のモグロシド化合物は、化合物１を産生するための中間体化合物として使用され得る。かかるモグロシド化合物の非限定的な例の１つは、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物５である。いくつかの実施形態では、化合物５の産生方法は、モグロシドＩＩＩＥを、１つ以上のシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを発現する細胞（例えば、組換え宿主細胞）と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、デンプンの存在下で実施される。
種々のモグロシド化合物は、化合物１を産生するための中間体化合物として使用され得る。かかるモグロシド化合物の非限定的な例の１つは、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物４である。いくつかの実施形態では、化合物４の産生方法は、モグロシドＩＩＩＥを、１つ以上のシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを発現する細胞（例えば、組換え宿主細胞）と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、デンプンの存在下で実施される。
スクアレンからのモグロールの産生
化合物１を産生するための方法のいくつかの実施形態は、化合物１の産生に使用するための中間体を産生することを含む。構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物は、組換え宿主においてインビボで産生される。いくつかの実施形態では、前記化合物は、前記組換え宿主細胞内にあるか、前記組換え細胞が増殖している培地に分泌されるかまたはその双方である。いくつかの実施形態では、前記組換え細胞は、インビボでモグロシド化合物などの中間体をさらに産生する。前記組換え細胞は、本明細書に開示される遺伝子が発現される条件下で、培養培地で増殖され得る。前記細胞を増殖させる方法のいくつかの実施形態は、本明細書に記載されている。
本明細書に開示されたいくつかの実施形態では、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１を産生するための方法が提供される。
いくつかの実施形態では、化合物１の構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物が提供され、ここで、前記化合物は、本明細書で提供された代替法のいずれか１つの方法によって産生される。
いくつかの実施形態では、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１を含む細胞溶解物が提供される。
いくつかの実施形態では、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１およびモグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な酵素をコードする遺伝子を含む組換え細胞が提供される。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、前記組換え細胞にとって異種遺伝子である。
いくつかの実施形態では、構造：
Figure 2020518264
 を有する化合物１の、モグロシドＩＩＩＥからの産生を触媒することが可能な第１の酵素をコードする第１の遺伝子を含む組換え細胞が提供される。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８または１５４（ＣＧＴアーゼ）と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８または１５４（ＣＧＴアーゼ）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、デキストランスクラーゼである。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号２、１０３、１０６〜１１０、１５６および８９６のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号２、１０３、１０４または１０５のアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、デキストランスクラーゼは、配列番号２、１０３〜１１０および１５６〜１６２および８９６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ＤｅｘＴは、配列番号１０４または１０５に記載された核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の酵素は、トランスグルコシダーゼである。いくつかの実施形態では、トランスグルコシダーゼは、配列番号２０１または配列番号２９１の配列と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記組換え細胞はさらに、ウリジンジホスフェート−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）をコードする第２の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、配列番号４、５、６、７、８、９、１５、１６、１７、１８および１９のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、配列番号４、５、６、７、８、９、１５、１６、１７および１８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ＵＧＴは、ＵＧＴ１４９５（配列番号１０）、ＵＧＴ１８１７（配列番号１１）、ＵＧＴ５９１４（配列番号１２）、ＵＧＴ８４６８（配列番号１３）またはＵＧＴ１０３９１（配列番号１４）に記載された配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、前記細胞は、ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８をコードする第３の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８は、配列番号９、４０７または１６と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞は、エポキシドヒドロラーゼをコードする第４の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、エポキシドヒドロラーゼは、配列番号２１〜３０および３０９〜３１４のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞は、Ｐ４５０をコードする第５の配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０は、配列番号２０、４９、３０８、３１５または３１７と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ４５０は、配列番号３１〜４８、３１６、４３１、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７および８９１のいずれか１つに記載された配列を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼをコードする第６の配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４および９０６のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドは、配列番号７３に記載された配列を含むＣ末端部分を含む。いくつかの実施形態では、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子は、コドン最適化されている。いくつかの実施形態では、コドン最適化された遺伝子は、配列番号７４に記載された核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞はさらに、スクアレンエポキシダーゼをコードする第７の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、スクアレンエポキシダーゼは、配列番号５０〜５６、６０、６１、３３４および３３５のいずれか１つと、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞はさらに、スクアレンシンターゼをコードする第８の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第８の遺伝子は、配列番号６９または配列番号３３６と、少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞はさらに、ファルネシル−ＰＰシンターゼをコードする第９の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ファルネシル−ＰＰシンターゼは、配列番号３３８と少なくとも、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の配列同一性を有するかまたはこれらの数字の任意の２つの間の範囲の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞は、哺乳動物、細菌、真菌または昆虫の細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、酵母細胞である。酵母の非限定的な例として、カンジダ属、サッカロミセス属、サッカロミケス亜門、タフリナ菌亜門、シゾサッカロミセス綱、コマガタエラ属、担子菌門、ハラタケ亜門、シロキクラゲ綱、サビキン亜門、アウレオバシジウム属、コニオカエタ属およびミクロボリオミセテスが挙げられる。いくつかの実施形態では、前記植物は、ラカンカ属、ツルレイシ属、アマチャヅル属、カボチャ属、キュウリ属、シロイヌナズナ属、ヨモギ属、ステビア属、トチバニンジン属、ウィザニア属、トウダイグサ属、ウマゴヤシ属、オリヅルラン属、ウコギ属、タラノキ属、クワ属、ウマゴヤシ属、カバノキ属、ゲンゲ属、ナンヨウアブラギリ属、ツバキ属、クリタケ属、アスペルギルス属、ナス属、コスギラン属、ワチガイソウ属、ツナソ属、キヅタ属、ゼニゴケ属およびクワ属からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、真菌は、白癬菌属、サングハングポルス属、タイワノフングス属、シラガニセホウライタケ属、マルソニア属、ディプロディア属、シイタケ属、キサントフィロミセス属、ポコニア属、コレトトリカム属、ジアポルテ属、ヒストプラズマ属、コクシジオイデス属、ヒストプラズマ属、サングハングポルス属、アウレオバシジウム属、ポコニア属、ペニシリウム属、スポロトリックス属またはメタリジウム属である。
実施例１：シアメノシドＩの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、シアメノシドＩは、本明細書に開示された化合物１を産生するための中間モグロシド化合物であり得る。例えば、シアメノシドＩを加水分解してモグロシドＩＩＩＥを産生し、次にこれを使用して化合物１を産生することができる。例えば、シアメノシドＩの産生方法は、モグロールを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、アスペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）由来のペクチナーゼを発現する組換え細胞が使用され得る。
実施例２：モグロシドＩＶＥの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＶＥは、本明細書に開示された化合物１の産生のための中間モグロシド化合物であり得る。例えば、モグロシドＶからのモグロシドＩＶＥを、次に使用して化合物１を産生することができる。例えば、モグロシドＩＶＥの産生方法は、モグロシドＶを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。別の例として、前記組換え細胞は、ペクチナーゼをコードする遺伝子を含み得る。ペクチナーゼは、アスペルギルス・アクレアタス由来の遺伝子によってコードされ得る。
実施例３：モグロシドＩＩＩＥの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＩＩＥは、本明細書に開示された化合物１の産生のための中間モグロシド化合物であり得る。例えば、モグロシドＩＩＡをグリコシル化してモグロシドＩＩＩＥを産生し、次にこれを使用して化合物１を産生することができる。
実施例４：モグロシドＩＶＡの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＶＡは、本明細書に開示された化合物１の産生のための中間モグロシド化合物であり得る。例えば、モグロシドＶからのモグロシドＩＶＡを次に使用して、化合物１を産生することができる。
実施例５：モグロシドＩＩＡの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＩＡは、本明細書に開示された化合物１を産生するための中間モグロシド化合物であり得る。例えば、モグロシドＩＩＡの産生方法は、モグロシドＩＡ１を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例６：アロマーゼからのモグロシドＩＩＩＡ１の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＩＩＡ１は、本明細書に開示された化合物１を産生するための中間モグロシド化合物であり得る。例えば、モグロシドＩＩＩＡ１は、モグロシドＩＶＡを産生する中間体であり、次にモグロシドＩＶＡを中間体として使用して化合物１を産生することができる。例えば、モグロシドＩＩＩＡ１の産生方法は、シアメノシドＩを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、アロマーゼでもあり得る。別の例として、モグロシドＩＩＩＡ１の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例８：化合物４の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物４は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した。例えば、化合物４の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例９：化合物５の産生
Figure 2020518264
 化合物５は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物５の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例１０：化合物６の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物６は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物６の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例１１：化合物７の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物７は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生された中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物７の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
別の例として、化合物７の産生方法は、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、バチルス・リケニフォルミスまたはトルザイム由来のＣＧＴアーゼが使用され得る。
実施例１２：化合物８の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物８は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物８の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例１３：化合物９の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物９は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物９の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例１４：化合物１０の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１０は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物１０の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例１５：化合物１１の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１１は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物１１の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥまたは１１−オキソ−ＭＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例１６：化合物１２の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１２は、本明細書に開示された化合物１の産生において使用され得る中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物１２の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＶＩ異性体を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼ、インベルターゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、パン酵母由来のインベルターゼ酵素であり得る。
実施例１７：化合物１３の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１３は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシドであり得る。例えば、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。発現した酵素は、例えば、セルクラストでもあり得る。
実施例１８：化合物１４の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１４は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。例えば、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。発現した酵素は、例えば、セルクラストでもあり得る。
実施例１９：化合物１５の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１５は、本明細書に開示された化合物１の産生に使用され得る中間モグロシド化合物であり得る。例えば、この方法は、モグロシドＩＩＡを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例２０：化合物１６の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１６は、本明細書に開示された化合物１の産生に使用され得る中間モグロシド化合物であり得る。例えば、この方法は、モグロシドＩＩＡを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。
実施例２１：化合物１７の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１７は、本明細書に開示された化合物１の産生のための中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物１７を加水分解してモグロシドＩＩＩＥを産生し、次にこれを使用して化合物１を産生することができる。例えば、化合物１７の産生方法は、シアメノシドＩを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、トランスグルコシダーゼ、スクロースシンターゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。例えば、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを発現する組換え細胞が、使用され得る。
実施例２２：化合物１８の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１８は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。例えば、化合物１８を加水分解してモグロシドＩＩＩＥを産生し、次にこれを使用して化合物１を産生することができる。例えば、化合物１８の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、Ｓｕｓ１およびＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。
実施例２３：化合物１９の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物１９は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物１９をさらに加水分解して、例えば化合物１を産生することができる。例えば、化合物１８の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、Ｓｕｓ１およびＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。
実施例２４：化合物２０の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物２０は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物２０をさらに加水分解して、例えば化合物１を産生することができる。例えば、化合物２０の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、Ｓｕｓ１およびＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。
実施例２５：化合物２１の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物２１は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物２１をさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。例えば、化合物２１の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＶＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、Ｓｕｓ１およびＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。
実施例２６：化合物２２の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物２２は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物２２をさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。例えば、化合物２２の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＶＡを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、Ｓｕｓ１およびＵＧＴ７６Ｇ１であり得る。
実施例２７：化合物２３の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物２３は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物２３をさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。例えば、化合物２２の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＶＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、デキストランスクラーゼであり得る。
実施例２８および２９：真菌ラクターゼからのモグロシドＩＩＡ１およびモグロシドＩＩＡ２の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＩＡ１およびモグロシドＩＩＡ２は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。モグロシドＩＩＡ１およびモグロシドＩＩＡ２をさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。例えば、モグロシドＩＩＡ１およびモグロシドＩＩＡ２の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＶＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、真菌由来のラクターゼであり得る。
実施例３０：ビスコザイムからのモグロシドＩＡの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＡは、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生された中間モグロシド化合物であり得る。モグロシドＩＡをさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。モグロシドＩＡの産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＡを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、ビスコザイムであり得る。
実施例３１：化合物２４の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物２４は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物２４をさらに加水分解して、例えば化合物１を産生することができる。化合物２４の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、デキストランスクラーゼＤｅｘＴであり得る。
実施例３２：化合物２５の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物２５は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物２５をさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。化合物２５の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、デキストランスクラーゼＤｅｘＴであり得る。
実施例３３：化合物２６の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物２６は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物２６をさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。化合物２６の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、デキストランスクラーゼＤｅｘＴであり得る。
実施例３４および３５：ペクチナーゼからのモグロールおよびモグロシドＩＥの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロールおよびモグロシドＩＥは、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生された中間モグロシド化合物であり得る。モグロールを基質として使用してモグロシドＩＡ１を産生することができ、これをさらに加水分解して化合物１を形成し、モグロシドＩＥをさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。モグロールおよびモグロシドの産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＶを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、アスペルギルス・アクレアタス由来のペクチナーゼ酵素であり得る。
実施例３６：モグロシドＩＩＥの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＩＥは、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。モグロシドＩＩＥをさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。モグロシドＩＩＥの産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＶを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、アスペルギルス・アクレアタス由来のペクチナーゼ酵素であり得る。
実施例３７および３８：化合物３２および３３の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物３２および３３は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物３２および３３をさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。化合物３２および３３の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶＥ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、イソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＩＩＥ、１１−デオキシ−モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＡ、１１−オキソ−モグロシドＶＩ、１１−オキソ−モグロシドＩＩＩＥ、１１−オキソ−モグロシドＩＶＥ、モグロシドＩＥ、モグロール、１１−オキソ−モグロール、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩのうちの１種以上を、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、アスペルギルス・アクレアタス由来のペクチナーゼ酵素であり得る。
実施例３９および４０：化合物３４および３５の産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、化合物３４および３５は、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。化合物３２および３３をさらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。化合物３４および３５の産生方法によって、化合物１を産生することもでき、この方法は、モグロシドＩＩＩＥを、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を発現する組換え宿主細胞と接触させることを含み得る。前記酵素は、例えば、セルクラストであり得る。
実施例４１および４２：モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩの産生
Figure 2020518264
 本明細書に開示されるように、モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩは、本明細書に開示された化合物１の産生中に産生した中間モグロシド化合物であり得る。モグロシドＩＩＩＡ２およびモグロシドＩＩＩを、さらに加水分解して、例えば、化合物１を産生することができる。

Claims (256)

  1. 構造：
    Figure 2020518264
     を有する化合物１の産生方法であって、
    モグロシドＩＩＩＥを、モグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な第１の酵素と接触させることを含む、方法。
  2. モグロシドＩＩＩＥを前記第１の酵素と接触させることが、モグロシドＩＩＩＥを、前記第１の酵素をコードする第１の遺伝子を含む組換え宿主細胞と接触させることを含む、請求項１記載の方法。
  3. 前記第１の遺伝子が、前記組換え宿主細胞に対して異種である、請求項２記載の方法。
  4. 前記モグロシドＩＩＩＥが、前記組換え宿主細胞に存在し、かつ／または前記組換え宿主細胞によって産生される、請求項２または３記載の方法。
  5. 前記第１の酵素が発現される条件下で、前記組換え宿主細胞を培養培地中で培養することを含む、請求項２から４までのいずれか１項記載の方法。
  6. 前記第１の酵素が、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上である、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
  7. 前記第１の酵素が、ＣＧＴアーゼである、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
  8. 前記ＣＧＴアーゼが、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４のいずれか１つの配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７記載の方法。
  9. 前記ＣＧＴアーゼが、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４のいずれか１つの前記アミノ酸配列を含む、請求項７記載の方法。
  10. 前記ＣＧＴアーゼが、配列番号１、３、７８〜１０１または１５４の前記アミノ酸配列からなる、請求項７記載の方法。
  11. 前記第１の酵素が、デキストランスクラーゼである、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
  12. 前記デキストランスクラーゼが、配列番号２、１０３、１０６〜１１０、１５６、１５９〜１６２および８９６に記載された配列のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１記載の方法。
  13. 前記デキストランスクラーゼが、配列番号１０４、１０５、１５７、１５８および８９５のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１１記載の方法。
  14. 前記第１の酵素が、トランスグルコシダーゼである、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
  15. 前記トランスグルコシダーゼが、配列番号１６３〜２９１および７２３のいずれか１つの配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４記載の方法。
  16. 前記トランスグルコシダーゼが、配列番号１６３〜２９１および７２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１４記載の方法。
  17. 前記第１の酵素が、ベータ−グルコシダーゼである、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
  18. 前記ベータ−グルコシダーゼが、配列番号１０２、２９２、３５４〜３７４および６７８〜７４１のいずれか１つに記載された配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７記載の方法。
  19. モグロシドＩＩＡを、モグロシドＩＩＡからのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な第２の酵素と接触させることを含む、請求項１から１８までのいずれか１項記載の方法。
  20. モグロシドＩＩＡを前記第２の酵素と接触させることが、モグロシドＩＩＡを前記組換え宿主細胞と接触させてモグロシドＩＩＩＥを産生することを含み、ここで、前記組換え宿主細胞は、前記第２の酵素をコードする第２の遺伝子を含む、請求項１９記載の方法。
  21. 前記モグロシドＩＩＡが、前記組換え宿主細胞によって産生され、かつ／または前記組換え宿主細胞に存在する、請求項２０記載の方法。
  22. 前記第２の酵素が、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上である、請求項２０または２１記載の方法。
  23. 前記第２の酵素が、ウリジンジホスフェート−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）である、請求項２２記載の方法。
  24. 前記ＵＧＴが、ＵＧＴ７３Ｃ３（配列番号４）、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号５）、ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号６）、ＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号７）、ＵＧＴ７３Ｅ１（配列番号８）、ＵＧＴ９８（配列番号９または４０７）、ＵＧＴ１５７６（配列番号１５）、ＵＧＴ ＳＫ９８（配列番号１６）、ＵＧＴ４３０（配列番号１７）、ＵＧＴ１６９７（配列番号１８）、ＵＧＴ１１７８９（配列番号１９）であるかまたは配列番号４〜９、１５〜１９、１２５、１２６、１２８、１２９、２９３〜３０７、４０７、４０９、４１１、４１３、４３９、４４１および４４４のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２３記載の方法。
  25. 前記ＵＧＴが、ＵＧＴ１４９５（配列番号１０）、ＵＧＴ１８１７（配列番号１１）、ＵＧＴ５９１４（配列番号１２）、ＵＧＴ８４６８（配列番号１３）、ＵＧＴ１０３９１（配列番号１４）および配列番号１１６〜１２４、１２７、１３０、４０８、４１０、４１２、４１４、４４０、４４２、４４３および４４５に記載された配列のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項２４記載の方法。
  26. モグロールを、モグロールからのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な１種以上の酵素と接触させることを含む、請求項１から２５までのいずれか１項記載の方法。
  27. モグロールを、モグロールからのモグロシドＩＩＥおよび／またはＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な前記１種以上の酵素と接触させることが、モグロールを前記組換え宿主細胞と接触させてモグロシドＩＩＥおよび／またはＩＩＩＥを産生することを含み、ここで、前記組換え宿主細胞が、モグロールからのモグロシドＩＩＥおよび／またはＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な前記１種以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子を含む、請求項２から２６までのいずれか１項記載の方法。
  28. 前記モグロールが、前記組換え宿主細胞によって産生され、かつ／または前記組換え宿主細胞に存在する、請求項２７記載の方法。
  29. モグロールからのモグロシドＩＩＥおよび／またはＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な前記１種以上の酵素のうちの少なくとも１種が、配列番号３１５、３１６、４２０、４２２、４２４、４２６、４３０、４３１、４４６、８７１、８４５〜９４９および９５１〜１０１２に記載された配列のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むかまたは配列番号３１５、３１６、４２０、４２２、４２４、４２６、４３０、４３１、４４６、８７１、８４５〜９４９および９５１〜１０１２の配列のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列によってコードされる、請求項２７または２８記載の方法。
  30. 前記１種以上の酵素が、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を含む、請求項２７から２９までのいずれか１項記載の方法。
  31. 前記１種以上の酵素のうちの少なくとも１種が、ウリジンジホスフェート−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）である、請求項２７から３０までのいずれか１項記載の方法。
  32. 前記ＵＧＴが、ＵＧＴ７３Ｃ３、ＵＧＴ７３Ｃ６、８５Ｃ２、ＵＧＴ７３Ｃ５、ＵＧＴ７３Ｅ１、ＵＧＴ９８、ＵＧＴ１４９５、ＵＧＴ１８１７、ＵＧＴ５９１４、ＵＧＴ８４６８、ＵＧＴ１０３９１、ＵＧＴ１５７６、ＵＧＴ ＳＫ９８、ＵＧＴ４３０、ＵＧＴ１６９７またはＵＧＴ１１７８９であるかまたは配列番号４〜９、１５〜１９、１２５、１２６、１２８、１２９、２９３〜３０７、４０５、４０６、４０７、４０９、４１１、４１３、４３９、４４１および４４４のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３１記載の方法。
  33. モグロシド化合物を、モグロシド化合物からのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な１種以上の酵素と接触させてモグロシドＩＩＩＥを産生することを含み、ここで、前記モグロシド化合物が、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＶおよびシアメノシドのうちの１種以上である、請求項１から３２までのいずれか１項記載の方法。
  34. モグロシド化合物を、モグロシド化合物からのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な１種以上の酵素と接触させてモグロシドＩＩＩＥを産生することが、前記モグロシド化合物を前記組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、前記組換え宿主細胞が、前記モグロシド化合物からのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な前記１種以上の酵素をコードする１つ以上の遺伝子を含む、請求項３３記載の方法。
  35. 前記モグロシド化合物が、前記組換え宿主細胞によって産生され、かつ／または前記組換え宿主細胞に存在する、請求項３４記載の方法。
  36. 前記モグロシド化合物からのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な前記１種以上の酵素が、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＧＴアーゼ、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上を含む、請求項３３から３５までのいずれか１項記載の方法。
  37. 前記モグロシド化合物がモグロシドＩＩＥである、請求項３３から３６までのいずれか１項記載の方法。
  38. 前記モグロシド化合物からのモグロシドＩＩＩＥの産生を触媒することが可能な前記１種以上の酵素が、配列番号１、３、７８〜１０１、１０６〜１０９、１４７、１５４、１６３〜３０３、４０５、４１１、３５４〜４０５、４４７〜７２３、７７０、７７６および７８２のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３から３７までのいずれか１項記載の方法。
  39. 前記モグロシド化合物が、モグロシドＩＩＡまたはモグロシドＩＩＥであり、ここで、１種以上の酵素と接触させることにより、モグロシドＩＩＩＡ、モグロシドＩＶＥおよびモグロシドＶのうちの１種以上を産生する、請求項３３から３８までのいずれか１項記載の方法。
  40. 前記１種以上の酵素が、配列番号３０４、４０５、４１１、８７２、８７４、９７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０、８９２、８９４および８９６のいずれか１つに記載されたアミノ酸を含む、請求項３３から３７までのいずれか１項記載の方法。
  41. 前記１種以上の酵素が、配列番号３０５、４０６、４１２、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９、８９１、８９３および８９５のいずれか１つに記載された配列によってコードされる、請求項３３から３７までのいずれか１項記載の方法。
  42. モグロシドＩＡ１を前記組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、前記組換え宿主細胞が、ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８酵素をコードする遺伝子を含む、請求項２から４１までのいずれか１項記載の方法。
  43. 前記ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８酵素が、配列番号９、４０７、１６または３０６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４２記載の方法。
  44. 前記ＵＧＴ９８が、配列番号３０７に記載された配列によってコードされる、請求項４２記載の方法。
  45. 前記接触により前記細胞内でモグロシドＩＩＡが産生される、請求項４２から４４までのいずれか１項記載の方法。
  46. １１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールを、前記組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、前記組換え宿主細胞が、エポキシドヒドロラーゼをコードする第３の遺伝子を含む、請求項２から４５までのいずれか１項記載の方法。
  47. 前記１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールが、前記組換え宿主細胞に存在し、かつ／または前記組換え宿主細胞によって産生される、請求項４６記載の方法。
  48. １１−ヒドロキシククルビタジエノールを前記組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、前記組換え宿主細胞が、シトクロムＰ４５０またはエポキシドヒドロラーゼをコードする第４の遺伝子を含む、請求項２から４７までのいずれか１項記載の方法。
  49. 前記１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールが、前記組換え宿主細胞によって産生され、かつ／または前記組換え宿主細胞に存在する、請求項４８記載の方法。
  50. ３，２４，２５−トリヒドロキシククルビタジエノールを前記組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、前記組換え宿主細胞が、シトクロムＰ４５０をコードする第５の遺伝子を含む、請求項１から４９までのいずれか１項記載の方法。
  51. 前記３，２４，２５−トリヒドロキシククルビタジエノールが、前記組換え宿主細胞に存在し、かつ／または前記組換え宿主細胞によって産生される、請求項５０記載の方法。
  52. 前記接触により前記組換え宿主細胞内でモグロールが産生される、請求項４７から５１までのいずれか１項記載の方法。
  53. 前記シトクロムＰ４５０が、配列番号２０、４９、３０８、３１５、４３０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８８９および８９２のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか；または前記シトクロムＰ４５０が、配列番号３１〜４８、３１６、４３１、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８９０および８９１のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項５０から５２までのいずれか１項記載の方法。
  54. 前記エポキシドヒドロラーゼが、配列番号２１〜３０および３０９〜３１４のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか；または前記エポキシドヒドロラーゼが、配列番号１１４および１１５のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項４６から５３までのいずれか１項記載の方法。
  55. ククルビタジエノールを前記組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、前記組換え宿主細胞が、シトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を含む、請求項２から５４までのいずれか１項記載の方法。
  56. 前記接触により１１−ヒドロキシククルビタジエノールが産生される、請求項５５記載の方法。
  57. 前記ククルビタジエノールが、前記組換え宿主細胞によって産生され、かつ／または前記組換え宿主細胞に存在する、請求項５５または５６記載の方法。
  58. 前記シトクロムＰ４５０が、配列番号３１〜４８、３１６、４３１、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９および８９２のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項５５から５７までのいずれか１項記載の方法。
  59. 前記シトクロムＰ４５０が、配列番号２０、３１、４９、３０８、３１５、４３０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０および８９１と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５５から５７までのいずれか１項記載の方法。
  60. ２，３−オキシドスクアレン、ジオキシドスクアレンおよびジエポキシスクアレンのうちの１種以上を、前記組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、前記組換え宿主細胞が、ククルビタジエノールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする第７の遺伝子を含む、請求項２から５９までのいずれか１項記載の方法。
  61. ククルビタジエノールシンターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、ククルビタジエノールシンターゼに融合した融合ドメインを含む融合タンパク質である、請求項６０記載の方法。
  62. 前記融合タンパク質が、前記ククルビタジエノールシンターゼのＮ末端領域、Ｃ末端領域またはその双方に融合した融合ドメインを含む、請求項６１記載の方法。
  63. 前記融合ドメインが、約３〜約１０００アミノ酸長である、請求項６２記載の方法。
  64. 前記融合ドメインが、約５〜約５０アミノ酸長である、請求項６２記載の方法。
  65. 前記融合ドメインが、機能性タンパク質の配列の実質的な部分または配列全体である、請求項６２記載の方法。
  66. ククルビタジエノールシンターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７〜３３３、４１７、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４または９０６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６１記載の方法。
  67. ククルビタジエノールシンターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３または９０５と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項６１または６２記載の方法。
  68. 前記接触によりククルビタジエノールおよび／または２４，２５−エポキシククルビタジエノールが産生される、請求項６０から６７までのいずれか１項記載の方法。
  69. ２，３−オキシドスクアレン、ジオキシドスクアレンおよびジエポキシスクアレンのうちの１種以上が、前記組換え宿主細胞によって産生され、かつ／または前記組換え宿主細胞に存在する、請求項６０から６８までのいずれか１項記載の方法。
  70. 前記２，３−オキシドスクアレンまたはジエポキシスクアレンが、配列番号８９８または９００に記載された配列を含む酵素によって産生される、請求項６９記載の方法。
  71. ２，３−オキシドスクアレン、ジオキシドスクアレンおよびジエポキシスクアレンのうちの１種以上の産生物が、配列番号８９７または８９９に記載された核酸配列によってコードされる酵素を含む、請求項６９記載の方法。
  72. ククルビタジエノールシンターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４および９０６のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６０記載の方法。
  73. ククルビタジエノールシンターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３および９０５のいずれか１つと７０％の配列同一性を有する核酸配列を含む遺伝子によってコードされる、請求項６０記載の方法。
  74. 前記１１−ヒドロキシククルビタジエノールが、前記組換え宿主細胞によって産生され、かつ／または前記組換え宿主細胞に存在する、請求項５６から７３までのいずれか１項記載の方法。
  75. 前記組換え宿主細胞が、ＣＹＰ８７Ｄ１８またはＳｇＣＰＲタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項７４記載の方法。
  76. 前記ＣＹＰ８７Ｄ１８またはＳｇＣＰＲタンパク質が、配列番号８７２または配列番号８７４と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７５記載の方法。
  77. 前記ＣＹＰ８７Ｄ１８またはＳｇＣＰＲタンパク質が、配列番号８７１または配列番号８７３と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項７５記載の方法。
  78. スクアレンを前記組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、前記組換え宿主細胞が、スクアレンエポキシダーゼをコードする第８の遺伝子を含む、請求項２から７７までのいずれか１項記載の方法。
  79. 前記接触により２，３−オキシドスクアレンが産生される、請求項７８記載の方法。
  80. 前記スクアレンが、前記組換え宿主細胞によって産生され、かつ／または前記組換え宿主細胞に存在する、請求項７８または７９記載の方法。
  81. 前記スクアレンエポキシダーゼが、配列番号５０〜５６、６０、６１、３３４および３３５のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７８から８０までのいずれか１項記載の方法。
  82. 前記スクアレンエポキシダーゼが、配列番号３３５と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項７８から８０までのいずれか１項記載の方法。
  83. ファルネシルピロリン酸を、前記組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、前記組換え宿主細胞は、スクアレンシンターゼをコードする第９の遺伝子を含む、請求項２から８２までのいずれか１項記載の方法。
  84. 前記接触によりスクアレンが産生される、請求項８３記載の方法。
  85. 前記ファルネシルピロリン酸が、前記組換え宿主細胞によって産生され、かつ／または前記組換え宿主細胞に存在する、請求項８３または８４記載の方法。
  86. 前記スクアレンシンターゼが、配列番号６９および３３６のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８３から８５までのいずれか１項記載の方法。
  87. 前記スクアレンシンターゼが、配列番号３３７と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含む配列によってコードされる、請求項８３から８５までのいずれか１項記載の方法。
  88. ゲラニル−ＰＰを、前記組換え宿主細胞と接触させることを含み、ここで、前記組換え宿主細胞は、ファルネシル−ＰＰシンターゼをコードする第１０の遺伝子を含む、請求項２から８７までのいずれか１項記載の方法。
  89. 前記接触によりファルネシル−ＰＰが産生される、請求項８８記載の方法。
  90. 前記ゲラニル−ＰＰが、前記組換え宿主細胞によって産生され、かつ／または前記組換え宿主細胞に存在する、請求項８８または８９記載の方法。
  91. 前記ファルネシル−ＰＰシンターゼが、配列番号３３８と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８８から９０までのいずれか１項記載の方法。
  92. 前記ファルネシル−ＰＰシンターゼが、配列番号３３９と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項８８から９０までのいずれか１項記載の方法。
  93. 前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の遺伝子のうちの１つ以上が、異種プロモーターに作動可能に連結される、請求項２から９２までのいずれか１項記載の方法。
  94. 前記異種プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、ヒトベータアクチン、ＣＡＧ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｕｂｉ、Ｔ７、Ｔ７ｌａｃ、Ｓｐ６、ａｒａＢＡＤ、ｔｒｐ、ｌａｃ、Ｐｔａｃ、ｐＬプロモーターまたはそれらの組み合わせである、請求項９３記載の方法。
  95. 前記プロモーターが、誘導性、抑制性または構成的プロモーターである、請求項９３または９４記載の方法。
  96. ピルビン酸、アセチル−ＣｏＡ、クエン酸塩およびＴＣＡサイクル中間体のうちの１種以上の産生は、前記組換え宿主細胞で上方制御されている、請求項２から９５までのいずれか１項記載の方法。
  97. サイトゾル局在が、前記組換え宿主細胞で上方制御されている、請求項２から９６までのいずれか１項記載の方法。
  98. 前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の遺伝子のうちの１つ以上が、２Ａ自己切断ペプチドをコードする少なくとも１つの配列を含む、請求項２から９７までのいずれか１項記載の方法。
  99. 前記組換え宿主細胞が、植物、二枚貝、魚、真菌、細菌または哺乳動物細胞である、請求項２から９８までのいずれか１項記載の方法。
  100. 前記植物が、ラカンカ属（Siraitia）、ツルレイシ属（Momordica）、アマチャヅル属（Gynostemma）、カボチャ属（Cucurbita）、キュウリ属（Cucumis）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、ヨモギ属（Artemisia）、ステビア属（Stevia）、トチバニンジン属（Panax）、ウィザニア属（Withania）、トウダイグサ属（Euphorbia）、ウマゴヤシ属（Medicago）、オリヅルラン属（Chlorophytum）、ウコギ属（Eleutherococcus）、タラノキ属（Aralia）、クワ属（Morus）、ウマゴヤシ属（Medicago）、カバノキ属（Betula）、ゲンゲ属（Astragalus）、ナンヨウアブラギリ属（Jatropha）、ツバキ属（Camellia）、クリタケ属（Hypholoma）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ナス属（Solanum）、コスギラン属（Huperzia）、ワチガイソウ属（Pseudostellaria）、ツナソ属（Corchorus）、キヅタ属（Hedera）、ゼニゴケ属（Marchantia）およびクワ属（Morus）からなる群から選択される、請求項９９記載の方法。
  101. 前記真菌が、白癬菌属（Trichophyton）、サングハングポルス属（Sanghuangporus）、タイワノフングス属（Taiwanofungus）、シラガニセホウライタケ属（Moniliophthora）、マルソニア属（Marssonina）、ディプロディア属（Diplodia）、シイタケ属（Lentinula）、キサントフィロミセス属（Xanthophyllomyces）、ポコニア属（Pochonia）、コレトトリカム属（Colletotrichum）、ジアポルテ属（Diaporthe）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、コクシジオイデス属（Coccidioides）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、サングハングポルス属（Sanghuangporus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、ポコニア属（Pochonia）、ペニシリウム属（Penicillium）、スポロトリックス属（Sporothrix）、メタリジウム属（Metarhizium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ヤロウィア属（Yarrowia）およびリポミセス属（Lipomyces）からなる群から選択される、請求項９９記載の方法。
  102. 前記真菌が、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）またはロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporin toruloides）である、請求項９９記載の方法。
  103. 前記組換え宿主細胞が、酵母細胞である、請求項９９記載の方法。
  104. 前記酵母が、カンジダ属（Candida）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、サッカロミケス亜門（Saccharomycotina）、タフリナ菌亜門（Taphrinomycotina）、シゾサッカロミセス綱（Schizosaccharomycetes）、コマガタエラ属（Komagataella）、担子菌門（Basidiomycota）、ハラタケ亜門（Agaricomycotina）、シロキクラゲ綱（Tremellomycetes）、サビキン亜門（Pucciniomycotina）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、コニオカエタ属（Coniochaeta）、ロドスポリジウム属（Rhodosporidium）およびミクロボリオミセテス（Microboryomycetes）からなる群から選択される、請求項１０３記載の方法。
  105. 前記細菌が、フランキア属（Frankia）、アクチノバクテリア（Actinobacteria）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）およびエンテロコッカス属（Enterococcus）からなる群から選択される、請求項９９記載の方法。
  106. 前記組換え宿主細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞またはヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞である、請求項９９記載の方法。
  107. 前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の遺伝子のうちの１つ以上が、細菌、哺乳動物、植物、真菌および／または昆虫の細胞での発現のためのコドン最適化遺伝子である、請求項２から１０６までのいずれか１項記載の方法。
  108. 前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の遺伝子のうちの１つ以上が、コードされる酵素の活性を高める機能的変異を含む、請求項２から１０７までのいずれか１項記載の方法。
  109. 前記組換え宿主細胞の培養が、培養条件のｐＨ、溶存酸素レベル、窒素レベルまたはそれらの組み合わせについて培養をモニタリングすることを含む、請求項５から１０８までのいずれか１項記載の方法。
  110. 化合物１を単離することを含む、請求項１から１０９までのいずれか１項記載の方法。
  111. 化合物１の単離が、前記組換え宿主細胞を溶解することおよび／または前記培養培地から化合物１を単離することを含む、請求項１１０記載の方法。
  112. 化合物１を精製することを含む、請求項１から１１１までのいずれか１項記載の方法。
  113. 化合物１の精製が、ＨＰＬＣ、固相抽出またはそれらの組み合わせを含む、請求項１１２記載の方法。
  114. 前記精製が、前記組換え宿主細胞を回収すること；上清を保存すること；および前記組換え宿主細胞を溶解することを含む、請求項１１２または１１３記載の方法。
  115. 前記溶解が、前記細胞をせん断力または界面活性剤洗浄に供し、それにより溶解物を得ることを含む、請求項１１４記載の方法。
  116. 前記せん断力が、音波処理法、フレンチプレスセルまたはビーズから生じる、請求項１１５記載の方法。
  117. 前記溶解物が、濾過および精製工程に供される、請求項１１５または１１６記載の方法。
  118. 前記溶解物が、濾過され、かつ固相抽出により精製される、請求項１１７記載の方法。
  119. 第１のモグロシドを１種以上のヒドロラーゼと接触させてモグロシドＩＩＩＥを産生した後に、前記モグロシドＩＩＩＥを前記第１の酵素と接触させることを含む、請求項１から１１８までのいずれか１項記載の方法。
  120. 前記ヒドロラーゼが、β−グルカンヒドロラーゼである、請求項１１９記載の方法。
  121. 前記ヒドロラーゼが、ＥＸＧ１またはＥＸＧ２である、請求項１１９記載の方法。
  122. 前記ヒドロラーゼが、配列番号２９２、３６６〜３６８、３７２、３７６〜３９８、４４７〜５２０、５２４〜８４５、１０１３、１０１４および１０２３のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１９記載の方法。
  123. 前記第１のモグロシドが、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、モグロシドＶＩおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１９から１２２までのいずれか１項記載の方法。
  124. 前記第１のモグロシドが、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１９から１２２までのいずれか１項記載の方法。
  125. 前記第１のモグロシドを、１種以上のヒドロラーゼと接触させることが、前記第１のモグロシドを、前記ヒドロラーゼをコードする遺伝子を含む宿主細胞と接触させることを含む、請求項１１９から１２４までのいずれか１項記載の方法。
  126. 前記ヒドロラーゼをコードする遺伝子を含む前記宿主細胞が、前記組換え宿主細胞である、請求項１２５記載の方法。
  127. 前記ヒドロラーゼをコードする遺伝子を含む前記宿主細胞が、化合物１の産生を触媒することが可能な第１の酵素をコードする第１の遺伝子を含む前記組換え宿主細胞ではない、請求項１２５記載の方法。
  128. 前記第１のモグロシドが、前記宿主細胞によって産生され、かつ／または前記宿主細胞に存在する、請求項１２５から１２７までのいずれか１項記載の方法。
  129. 前記ヒドロラーゼをコードする前記遺伝子が、前記宿主細胞に対して同種である、請求項１２５から１２８までのいずれか１項記載の方法。
  130. 前記ヒドロラーゼをコードする前記遺伝子が、前記宿主細胞において正常レベルで発現される、請求項１２５から１２９までのいずれか１項記載の方法。
  131. 前記ヒドロラーゼをコードする前記遺伝子が、前記宿主細胞で過剰発現される、請求項１２５から１３０までのいずれか１項記載の方法。
  132. 前記ヒドロラーゼをコードする前記遺伝子が、前記宿主細胞に対して異種である、請求項１２５から１３１までのいずれか１項記載の方法。
  133. 前記組換え細胞が、シクロアルテノールシンターゼもしくはベータ−アミリンシンターゼなどのオキシドスクアレンシクラーゼまたはシクロアルテノールシンターゼもしくはベータ−アミリンシンターゼなどのオキシドスクアレンシクラーゼをコードする核酸配列をさらに含み、ここで、前記オキシドスクアレンシクラーゼ、シクロアルテノールシンターゼまたはベータ−アミリンシンターゼが、ククルビタジエノールまたはエポキシククルビタジエノールを産生するように修飾されている、請求項２から１３２までのいずれか１項記載の方法。
  134. 前記オキシドスクアレンシクラーゼが、配列番号３４１、３４３および３４６〜３４７のいずれか１つに記載された配列を含む、請求項１３３記載の方法。
  135. 前記組換え細胞が、シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子を含む、請求項２から１３４までのいずれか１項記載の方法。
  136. 前記シトクロムＰ４５０レダクターゼが、配列番号３１８に記載された配列を含む、請求項１３５記載の方法。
  137. 化合物１の構造
    Figure 2020518264
     を有する化合物であって、前記化合物が、請求項１から１３６までのいずれか１項記載の方法によって産生される、化合物。
  138. 構造：
    Figure 2020518264
     を有する化合物１を含む、細胞溶解物。
  139. 構造：
    Figure 2020518264
     を有する化合物１およびモグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な酵素をコードする遺伝子を含む、組換え細胞。
  140. 前記遺伝子が、前記組換え細胞にとって異種遺伝子である、請求項１３９記載の組換え細胞。
  141. モグロシドＩＩＩＥからの、構造：
    Figure 2020518264
     を有する化合物１の産生を触媒することが可能な第１の酵素をコードする第１の遺伝子を含む、組換え細胞。
  142. 前記第１の酵素が、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上である、請求項１４１記載の細胞。
  143. 前記第１の酵素が、ＣＧＴアーゼである、請求項１４１記載の細胞。
  144. 前記ＣＧＴアーゼが、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４のいずれか１つの配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４３記載の細胞。
  145. 前記ＣＧＴアーゼが、配列番号１、３、７８〜１０１、１４８および１５４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１４１記載の細胞。
  146. 前記第１の酵素が、デキストランスクラーゼである、請求項１４１記載の細胞。
  147. 前記デキストランスクラーゼが、配列番号２、１０３、１０６〜１１０、１５６および８９６に記載された配列のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４６記載の細胞。
  148. 前記デキストランスクラーゼが、配列番号１０４、１０５、１５７、１５８および８９５のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１４６記載の細胞。
  149. 前記第１の酵素が、トランスグルコシダーゼである、請求項１４１記載の細胞。
  150. 前記トランスグルコシダーゼが、配列番号１６３〜２９１および７２３のいずれか１つの配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４９記載の細胞。
  151. 前記トランスグルコシダーゼが、配列番号３、９５〜１０２、１６３〜２９１および７２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１４９記載の細胞。
  152. 前記第１の酵素が、ベータ−グルコシダーゼである、請求項１４１記載の細胞。
  153. 前記ベータ−グルコシダーゼが、配列番号１０２、２９２、３５４〜３７６および６７８〜７４１と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５２記載の細胞。
  154. ウリジンジホスフェート−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）をコードする第２の遺伝子を含む、請求項１４１から１５３までのいずれか１項記載の細胞。
  155. 前記ＵＧＴが、配列番号４〜９、１５〜１９、１２５、１２６、１２８、１２９、２９３〜３０７、４０７、４０９、４１１、４１３、４３９、４４１または４４４と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５４記載の細胞。
  156. ＵＧＴが、配列番号１１６〜１２４、１２７、１３０、４０８、４１０、４１２、４１４、４４０、４４２、４４３および４４５のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１５４記載の細胞。
  157. 前記ＵＧＴが、ＵＧＴ１４９５（配列番号１０）、ＵＧＴ１８１７（配列番号１１）、ＵＧＴ５９１４（配列番号１２）、ＵＧＴ８４６８（配列番号１３）またはＵＧＴ１０３９１（配列番号１４）に記載された配列によってコードされる、請求項１５４記載の細胞。
  158. ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８をコードする第３の遺伝子を含む、請求項１４１から１５７までのいずれか１項記載の細胞。
  159. 前記ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８が、配列番号９、４０７、１６または３０６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５８記載の細胞。
  160. 前記ＵＧＴ９８が、配列番号３０７に記載された核酸配列によってコードされる、請求項１５８記載の細胞。
  161. エポキシドヒドロラーゼをコードする第４の遺伝子を含む、請求項１４１から１６０までのいずれか１項記載の細胞。
  162. 前記エポキシドヒドロラーゼが、配列番号２１〜３０および３０９〜３１４のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか；または配列番号１１４および１１５のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１６１記載の細胞。
  163. Ｐ４５０をコードする第５の配列を含む、請求項１４１から１６２までのいずれか１項記載の細胞。
  164. 前記Ｐ４５０が、配列番号２０、４９、３０８、３１５、４３０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０および８９１のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか；または配列番号３１〜４８、３１６、４３１、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９および８９２のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１６３記載の細胞。
  165. 前記Ｐ４５０が、配列番号３１〜４８、３１６および３１８のいずれか１つに記載された配列を含む遺伝子によってコードされる、請求項１６３記載の細胞。
  166. ククルビタジエノールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする第６の配列を含む、請求項１４１から１６５までのいずれか１項記載の細胞。
  167. ククルビタジエノールシンターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、融合タンパク質である、請求項１６６記載の方法。
  168. 前記融合タンパク質が、ククルビタジエノールシンターゼのＮ末端、Ｃ末端またはその双方に融合した融合ドメインを含む、請求項１６７記載の方法。
  169. 前記融合ドメインが、約３〜約１０００アミノ酸長である、請求項１６８記載の方法。
  170. 前記融合ドメインが、約５〜約５０アミノ酸長である、請求項１６９記載の方法。
  171. 前記融合ドメインが、機能性タンパク質の配列の実質的な部分または配列全体である、請求項１６８または１６９記載の方法。
  172. ククルビタジエノールシンターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７〜３３３、４１７、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４、９０６、８５１、８５４、８５６、１０２４、８５９、８６２、８６５、８６７、９１５、９２０、９２４、９２８、９３２、９３６、９４０、９４４、９４８、９５２、９５６、９５９、９６４、９６７、９７１、９７５、９７９、９８３、９８７、９９１、９９５、９９９、１００３、１００７および１０１１のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１６６記載の細胞。
  173. ククルビタジエノールシンターゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３および９０５のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１６６記載の細胞。
  174. スクアレンエポキシダーゼをコードする第７の遺伝子を含む、請求項１４１から１７３までのいずれか１項記載の細胞。
  175. 前記スクアレンエポキシダーゼが、配列番号５０〜５６、６０、６１、３３４および３３５のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７４記載の細胞。
  176. 前記スクアレンエポキシダーゼが、配列番号３３５と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１７４記載の細胞。
  177. スクアレンシンターゼをコードする第８の遺伝子を含む、請求項１４１から１７６までのいずれか１項記載の細胞。
  178. 前記スクアレンシンターゼが、配列番号６９または３３６と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７７記載の細胞。
  179. 前記スクアレンシンターゼが、配列番号３３７に記載された核酸配列を含む配列によってコードされる、請求項１７７記載の細胞。
  180. ファルネシル−ＰＰシンターゼをコードする第９の遺伝子を含む、請求項１４１から１７９までのいずれか１項記載の細胞。
  181. 前記ファルネシル−ＰＰシンターゼが、配列番号３３８と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８０記載の細胞。
  182. 前記ファルネシル−ＰＰシンターゼが、配列番号３３９と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１８０記載の細胞。
  183. 前記細胞が、哺乳動物、植物、細菌、真菌または昆虫の細胞である、請求項１４１から１８２までのいずれか１項記載の細胞。
  184. 前記細胞が、酵母細胞であり、ここで、前記酵母が、カンジダ属（Candida）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、サッカロミケス亜門（Saccharomycotina）、タフリナ菌亜門（Taphrinomycotina）、シゾサッカロミセス綱（Schizosaccharomycetes）、コマガタエラ属（Komagataella）、担子菌門（Basidiomycota）、ハラタケ亜門（Agaricomycotina）、シロキクラゲ綱（Tremellomycetes）、サビキン亜門（Pucciniomycotina）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、コニオカエタ属（Coniochaeta）およびミクロボリオミセテス（Microboryomycetes）からなる群から選択される、請求項１４１から１８２までのいずれか１項記載の細胞。
  185. 前記植物が、ラカンカ属（Siraitia）、ツルレイシ属（Momordica）、アマチャヅル属（Gynostemma）、カボチャ属（Cucurbita）、キュウリ属（Cucumis）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、ヨモギ属（Artemisia）、ステビア属（Stevia）、トチバニンジン属（Panax）、ウィザニア属（Withania）、トウダイグサ属（Euphorbia）、ウマゴヤシ属（Medicago）、オリヅルラン属（Chlorophytum）、ウコギ属（Eleutherococcus）、タラノキ属（Aralia）、クワ属（Morus）、ウマゴヤシ属（Medicago）、カバノキ属（Betula）、ゲンゲ属（Astragalus）、ナンヨウアブラギリ属（Jatropha）、ツバキ属（Camellia）、クリタケ属（Hypholoma）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ナス属（Solanum）、コスギラン属（Huperzia）、ワチガイソウ属（Pseudostellaria）、ツナソ属（Corchorus）、キヅタ属（Hedera）、ゼニゴケ属（Marchantia）およびクワ属（Morus）からなる群から選択される、請求項１８３記載の細胞。
  186. 前記真菌が、白癬菌属（Trichophyton）、サングハングポルス属（Sanghuangporus）、タイワノフングス属（Taiwanofungus）、シラガニセホウライタケ属（Moniliophthora）、マルソニア属（Marssonina）、ディプロディア属（Diplodia）、シイタケ属（Lentinula）、キサントフィロミセス属（Xanthophyllomyces）、ポコニア属（Pochonia）、コレトトリカム属（Colletotrichum）、ジアポルテ属（Diaporthe）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、コクシジオイデス属（Coccidioides）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、サングハングポルス属（Sanghuangporus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、ポコニア属（Pochonia）、ペニシリウム属（Penicillium）、スポロトリックス属（Sporothrix）またはメタリジウム属（Metarhizium）である、請求項１８３記載の細胞。
  187. 前記組換え細胞が、モグロシドＶの加水分解を可能にする少なくとも１種の加水分解酵素をコードする遺伝子を含む、請求項１４１から１８６までのいずれか１項記載の細胞。
  188. 化合物１が、前記組換え細胞において加水分解酵素に対する耐性を示し、ここで、前記加水分解酵素が、モグロシドＶＩ、モグロシドＶ、モグロシドＩＶをモグロシドＩＩＩＥに加水分解する能力を示す、請求項１４１から１８７までのいずれか１項記載の細胞。
  189. 前記組換え細胞が、シクロアルテノールシンターゼもしくはベータ−アミリンシンターゼなどのオキシドスクアレンシクラーゼまたはシクロアルテノールシンターゼもしくはベータ−アミリンシンターゼなどのオキシドスクアレンシクラーゼをコードする核酸配列をさらに含み、ここで、前記オキシドスクアレンシクラーゼ、シクロアルテノールシンターゼまたはベータ−アミリンシンターゼが、ククルビタジエノールまたはエポキシククルビタジエノールを産生するように修飾されている、請求項１４１から１８８までのいずれか１項記載の細胞。
  190. 前記オキシドスクアレンシクラーゼが、配列番号３４１、３４３および３４６〜３４７のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８９記載の細胞。
  191. 前記細胞が、シトクロムＰ４５０レダクターゼまたはシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子を含む、請求項１４１から１９０までのいずれか１項記載の細胞。
  192. 前記シトクロムＰ４５０レダクターゼが、シトクロムＰ４５０活性を再生する、請求項１９１記載の細胞。
  193. 前記シトクロムＰ４５０レダクターゼが、配列番号３１８と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１９１記載の細胞。
  194. 前記細胞が、配列番号８９７、８９９、９０９、９１１、９１３、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８７１、８７３、９０１、９０３または９０５に記載された配列を含む、請求項１４１から１９３までのいずれか１項記載の細胞。
  195. 前記細胞が、配列番号３１５、３１６、４２０、４２２、４２４、４２６、４３０、４３１、４４６、８７１、８４５〜９４９または９５１〜１０１２に記載された配列を有する酵素を含むかまたは配列番号３１５、３１６、４２０、４２２、４２４、４２６、４３０、４３１、４４６、８７１、８４５〜９４９または９５１〜１０１２に記載された配列によってコードされる、請求項１４１から１９３までのいずれか１項記載の細胞。
  196. 第１のモグロシドを加水分解してモグロシドＩＩＩＥを産生することが可能なヒドロラーゼをコードする遺伝子を含む、請求項１４１から１９５までのいずれか１項記載の細胞。
  197. 前記ヒドロラーゼが、β−グルカンヒドロラーゼである、請求項１９６記載の細胞。
  198. 前記ヒドロラーゼが、ＥＸＧ１またはＥＸＧ２である、請求項１９６記載の細胞。
  199. 前記ヒドロラーゼが、配列番号２９２、３６６〜３６８、３７２、３７６〜３９８、４４７〜５２０、５２４〜８４５、１０１３、１０１４および１０２３のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９６記載の細胞。
  200. 前記第１のモグロシドが、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、モグロシドＶＩおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１９６から１９９までのいずれか１項記載の細胞。
  201. 前記第１のモグロシドが、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１９６から２００までのいずれか１項記載の細胞。
  202. 前記ヒドロラーゼをコードする前記遺伝子が、前記組換え宿主細胞に対して同種である、請求項１９６から２０１までのいずれか１項記載の細胞。
  203. 前記ヒドロラーゼをコードする前記遺伝子が、正常レベルで発現される、請求項１９６から２０２までのいずれか１項記載の細胞。
  204. 前記ヒドロラーゼをコードする前記遺伝子が、過剰発現される、請求項１９６から２０２までのいずれか１項記載の細胞。
  205. 前記ヒドロラーゼをコードする前記遺伝子が、前記細胞に対して異種である、請求項１９６から２０４までのいずれか１項記載の細胞。
  206. 前記細胞が、酵母細胞である、請求項１９６から２０５までのいずれか１項記載の細胞。
  207. 前記細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）である、請求項２０６記載の細胞。
  208. 構造：
    Figure 2020518264
     を有する化合物１の産生方法であって、
    第１のモグロシドを、１種以上のヒドロラーゼと接触させてモグロシドＩＩＩＥを産生すること；および
    前記モグロシドＩＩＩＥを、モグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な酵素と接触させること
    を含む、方法。
  209. 前記ヒドロラーゼが、β−グルカンヒドロラーゼである、請求項２０８記載の方法。
  210. 前記ヒドロラーゼが、ＥＸＧ１である、請求項２０８記載の方法。
  211. 前記ＥＸＧ１が、配列番号１０１２または１０１４と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１０記載の方法。
  212. 前記ヒドロラーゼが、ＥＸＧ２である、請求項２０８記載の方法。
  213. 前記ＥＸＧ２が、配列番号１０２３と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１０記載の方法。
  214. 前記第１のモグロシドが、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、モグロシドＶＩおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２０８から２１３までのいずれか１項記載の方法。
  215. 前記第１のモグロシドが、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２１４記載の方法。
  216. 前記第１のモグロシドを、前記１種以上のヒドロラーゼと接触させることが、前記第１のモグロシドを、前記ヒドロラーゼをコードする第１の遺伝子と化合物１の産生を触媒することが可能な前記酵素をコードする第２の遺伝子とを含む組換え宿主細胞と接触させることを含む、請求項２０８から２１５までのいずれか１項記載の方法。
  217. 前記第１のモグロシドを、前記ヒドロラーゼをコードする第１の遺伝子と化合物１の産生を触媒することが可能な前記酵素をコードする第２の遺伝子とを含む組換え宿主細胞において、前記１種以上のヒドロラーゼと接触させる、請求項２０８から２１６までのいずれか１項記載の方法。
  218. 前記第１のモグロシドを、前記組換え宿主細胞によって産生する、請求項２０８から２１７までのいずれか１項記載の方法。
  219. 前記第１の遺伝子が、前記組換え宿主細胞に対してネイティブである、請求項２０８から２１８までのいずれか１項記載の方法。
  220. 前記第１の遺伝子が、正常レベルで発現されるかまたは過剰発現される、請求項２０８から２１９までのいずれか１項記載の方法。
  221. 前記第１の遺伝子が、前記組換え宿主細胞に対して同種または異種である、請求項２０８から２１８までのいずれか１項記載の方法。
  222. 化合物１の産生を触媒することが可能な前記酵素が、ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）、グリコトランスフェラーゼ、デキストランスクラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、ペクチナーゼおよびデキストラナーゼのうちの１種以上である、請求項２０８から２２１までのいずれか１項記載の方法。
  223. 第１のモグロシドを加水分解してモグロシドＩＩＩＥを産生することが可能なヒドロラーゼをコードする第１の遺伝子；および
    モグロシドＩＩＩＥからの化合物１の産生を触媒することが可能な酵素をコードする第２の遺伝子を含む、組換え細胞であって、ここで、化合物１が、構造：
    Figure 2020518264
     を有する、組換え細胞。
  224. 前記ヒドロラーゼが、β−グルカンヒドロラーゼである、請求項２２３記載の細胞。
  225. 前記ヒドロラーゼが、ＥＸＧ１またはＥＸＧ２である、請求項２２３記載の細胞。
  226. 前記ＥＸＧ２タンパク質が、配列番号１０２３と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２２８記載の細胞。
  227. 前記第１のモグロシドが、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、モグロシドＶＩおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２３から２２６２２５までのいずれか１項記載の細胞。
  228. 前記第１のモグロシドが、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶＥ、モグロシドＶＩ、モグロシドＩＶＡおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２３から２２６２２７までのいずれか１項記載の細胞。
  229. 前記第１の遺伝子が、前記組換え宿主細胞に対して同種または異種である、請求項２２３から２２８までのいずれか１項記載の細胞。
  230. 前記第１の遺伝子が、正常レベルで発現されるかまたは過剰発現される、請求項２２３から２２９までのいずれか１項記載の細胞。
  231. 前記細胞が、酵母細胞である、請求項２２３から２３０までのいずれか１項記載の細胞。
  232. 前記細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）である、請求項２３１記載の細胞。
  233. ククルビタジエノールシンターゼ活性を有する融合ポリペプチドであって、ククルビタジエノールシンターゼに融合した融合ドメインを含む、融合ポリペプチド。
  234. 前記融合ドメインが、前記ククルビタジエノールシンターゼのＮ末端に融合した、請求項２３３記載の融合ポリペプチド。
  235. 前記融合ドメインが、前記ククルビタジエノールシンターゼのＣ末端に融合した、請求項２３３記載の融合ポリペプチド。
  236. 前記融合ドメインが、約３〜約１０００アミノ酸長である、請求項２３３から２３５までのいずれか１項記載の融合ポリペプチド。
  237. 前記融合ドメインが、約５〜約５０アミノ酸長である、請求項２３３から２３６までのいずれか１項記載の融合ポリペプチド。
  238. 前記融合ドメインが、機能性タンパク質の配列の実質的な部分または配列全体を含む、請求項２３３から２３６までのいずれか１項記載の融合ポリペプチド。
  239. 前記融合ドメインが、機能性タンパク質の配列の実質的な部分または配列全体である、請求項２３３から２３６までのいずれか１項記載の融合ポリペプチド。
  240. 前記融合ドメインが、酵母タンパク質の配列の一部または配列全体を含む、請求項２３３から２３９までのいずれか１項記載の融合ポリペプチド。
  241. 前記融合ドメインが、酵母タンパク質の配列の一部または配列全体である、請求項２３３から２３９までのいずれか１項記載の融合ポリペプチド。
  242. 前記融合ポリペプチドが、配列番号８５１、８５４、８５６、１０２４、８５９、８６２、８６５、８６７、９１５、９２０、９２４、９２８、９３２、９３６、９４０、９４４、９４８、９５２、９５６、９５９、９６４、９６７、９７１、９７５、９７９、９８３、９８７、９９１、９９５、９９９、１００３、１００７および１０１１のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２４１記載の融合ポリペプチド。
  243. 前記融合ポリペプチドが、配列番号８５１、８５４、８５６、１０２４、８５９、８６２、８６５、８６７、９１５、９２０、９２４、９２８、９３２、９３６、９４０、９４４、９４８、９５２、９５６、９５９、９６４、９６７、９７１、９７５、９７９、９８３、９８７、９９１、９９５、９９９、１００３、１００７および１０１１のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含む、請求項２４１記載の融合ポリペプチド。
  244. 前記融合ポリペプチドの前記融合ドメインが、配列番号８６６、８７０、９１７、９２１、９２５、９２９、９３３、９３７、９４１、９４５、９４９、９５３、９５７、９６１、９６８、９７２、９７６、９８０、９８４、９８８、９９２、９９６、１０００、１００４、１００８および１０１２のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２３３から２３５までのいずれか１項記載の融合ポリペプチド。
  245. 前記融合ポリペプチドの前記融合ドメインが、配列番号８６６、８７０、９１７、９２１、９２５、９２９、９３３、９３７、９４１、９４５、９４９、９５３、９５７、９６１、９６８、９７２、９７６、９８０、９８４、９８８、９９２、９９６、１０００、１００４、１００８および１０１２のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含む、請求項２３３から２３５までのいずれか１項記載の融合ポリペプチド。
  246. 前記ククルビタジエノールシンターゼが、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４および９０６のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２３３から２４１まで、２４４および２４５のいずれか１項記載の融合ポリペプチド。
  247. 前記ククルビタジエノールシンターゼが、配列番号７０〜７３、７５〜７７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９〜３３３、４２０、４２２、４２４、４２６、４４６、９０２、９０４および９０６のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列を含む、請求項２３３から２４１まで、２４４および２４５のいずれか１項記載の融合ポリペプチド。
  248. 前記ククルビタジエノールシンターゼが、配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３および９０５のいずれか１つと７０％の配列同一性を有する核酸配列を有する遺伝子によってコードされる、請求項２３３から２４１まで、２４４および２４５のいずれか１項記載の融合ポリペプチド。
  249. 前記ククルビタジエノールシンターゼが、配列番号７４、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、４１８、４２１、４２３、４２５、４２７、８９７、８９９、９０１、９０３および９０５のいずれか１つに記載された核酸配列を有する遺伝子によってコードされる、請求項２３３から２４１まで、２４４および２４５のいずれか１項記載の融合ポリペプチド。
  250. 請求項２３３から２４９までのいずれか１項記載の融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、組換え核酸分子。
  251. 請求項２３３から２４９までのいずれか１項記載の融合ポリペプチドまたは請求項２５０記載の組換え核酸分子を含む、組換え細胞。
  252. ククルビタジエノールシンターゼの基質を、請求項２３３から２４９までのいずれか１項記載のククルビタジエノールシンターゼ活性を有する融合ポリペプチドと接触させることを含む、方法。
  253. 接触によりククルビタジエノール、２４，２５−エポキシククルビタジエノールまたはそれらの組み合わせが産生される、請求項２５２記載の方法。
  254. 前記ククルビタジエノールシンターゼの基質が、２，３−オキシドスクアレン、ジオキシドスクアレンおよびジエポキシスクアレンのうちの１種以上を含む、請求項２５２または２５３記載の方法。
  255. 前記接触が、前記基質を、前記融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え宿主細胞と接触させることを含む、請求項２５２から２５４までのいずれか１項記載の方法。
  256. 前記基質が、前記組換え宿主細胞に存在し、かつ／または前記組換え宿主細胞によって産生される、請求項２５５記載の方法。
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