BR112017017207B1 - Processo para produzir um glicosídeo terpenoide, composição de sabor, ingrediente alimentício, alimento, bebida ou outro produto consumível, cosmético e produto farmacêutico que compreende o dito glicosídeo terpenoide - Google Patents

Abstract

MÉTODOS DE PRODUÇÃO BIOSSINTÉTICA E RECUPERAÇÃO DE REBAUDIOSÍDEO M. A presente invenção refere-se a vários processos de recuperação que são fornecidos para a recuperação completa de glicosídeos de esteviol de baixo teor de sólidos solúveis obtidos em micro-organismos recombinantes. Os glicosídeos de aglicosil esteviol solúveis foram completamente recuperados no processamento à jusante e depois convertidos em glicosídeos de esteviol por hidrolases. Os glicosídeos de esteviol obtidos foram purificados e utilizados como adoçantes, intensificadores de doçura, intensificadores de sabor, e modificadores de sabor em alimentos, bebidas, cosméticos e produtos farmacêuticos.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[001]Este pedido incorpora por referência o Pedido de Patente US. No. 14/254 653, depositado em 16 de abril de 2014, e publicado como US 2014/0227421 em 14 de agosto de 2014, em sua totalidade.

CAMPO DA TÉCNICA

[002]A invenção refere-se a um processo para a produção de glicosídeos terpenoides por micro-organismos recombinantes e à recuperação dos glicosídeos produzidos para uso em vários produtos alimentícios e bebidas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003]Atualmente, as alternativas ao açúcar estão recebendo cada vez mais atenção devido à consciência de muitas doenças em conjunto com o consumo de alimentos e bebidas com alto teor de açúcar. Contudo, muitos adoçantes artificiais tal como dulcina, o ciclamato de sódio e a sacarina foram proibidos ou restritos em alguns países devido a preocupações quanto à sua segurança. Portanto, os adoçantes não calóricos de origem natural estão se tornando cada vez mais populares. A erva-doce Stevia rebaudiana Bertoni, produz uma série de glicosídeos diterpeno que caracterizam doçura de alta intensidade e propriedades sensoriais superiores às de muitos outros adoçantes de alta potência.

[004]Os glicosídeos doces mencionados acima, têm uma aglicona comum, o esteviol, e diferem pelo número e tipo de resíduos de carboidratos nas posições C13 e C19. As folhas da Estévia são capazes de acumular até 10-20% (em peso seco) de glicosídeos de esteviol. Os principais glicosídeos encontrados nas folhas de Estévia são Rebaudiosídeo A (2 a 10%), Esteviosídeo (2 a 10%) e Rebaudiosídeo C (1 a 2%). Outros glicosídeos, tais como Rebaudiosídeo B, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N e O, Esteviolbiosídeo, Dulcosídeo A e Rubusosídeo são encontrados em níveis inferiores (aproximadamente 0 a 0,5%).

[005]Dois principais glicosídeos, Esteviosídeo e Rebaudiosídeo A, foram amplamente estudados e caracterizados em termos de adequabilidade como adoçantes comerciais de alta intensidade. Estudos de estabilidade em bebidas carbonatadas confirmaram a sua estabilidade ao calor e ao pH (Chang S. S., Cook, J. M. (1983) Stability studies of stevioside and Rebaudioside A in carbonated beverages. J. Agric. Food Chem. 31: 409 a 412).

[006]Os glicosídeos de esteviol diferem entre si, não apenas pela estrutura molecular, mas também por suas propriedades gustativas. Geralmente, o esteviosídeo é 110 a 270 vezes mais doce do que a sacarose, o Rebaudiosídeo A entre 150 e 320 vezes e o Rebaudiosídeo C entre 40 e 60 vezes mais doce do que a sacarose. O Dulcosídeo A é 30 vezes mais doce que a sacarose. O Rebaudiosídeo A tem o menos adstringente, o menos amargo, e o de sabor residual menos persistente, possuindo assim os atributos sensoriais mais favoráveis nos principais glicosídeos de esteviol (Tanaka O. (1987) Improvement of taste of natural sweeteners. Pure Appl. Chem. 69: 675 a 683; Phillips K. C. (1989) Stevia: steps in developing a new sweetener. In: Grenby TH ed. Developments in sweeteners, vol. 3. Elsevier Applied Science, Londres. 1 a 43).

[007]O Rebaudiosídeo M (também conhecido como Rebaudiosídeo X, CAS No: 1220616-44-3) é um dos glicosídeos de esteviol menos encontrados na planta Stevia rebaudiana. Verificou-se possuir propriedades de sabor superiores e é um adoçante natural altamente desejável de alta intensidade (WO 2013/096420 007748 aqui incorporado como referência, em sua totalidade).

[008]Devido à baixa concentração nas folhas de Estévia, o número de métodos biocatalíticos para a produção de glicosídeos de esteviol secundários (incluindo Rebaudiosídeo M) por enzimas e hospedeiros recombinantes (WO 2013/176738, WO 2014/122328, WO 2015/007748 aqui incorporados por referência, em sua totalidade).

[009]Ao produzir Rebaudiosídeo M em micro-organismos recombinantes, um deles procurará atingir a maior concentração/titulação de Rebaudiosídeo M (Reb M). Para a produção de micro-organismos recombinantes de diferentes compostos, a viabilidade comercial geralmente começa em titulações acima de 10 g/L. Por outro lado, sabe-se que Reb M tem solubilidade limitada na água de aproximadamente 1 g/L (US 2015/0017284 aqui incorporada por referência, em sua totalidade). Assim, na produção de micro-organismos recombinantes de Reb M em concentrações acima de 1 g/L, o Reb M precipitará/cristalizará a partir do meio.

[010]Geralmente após a fermentação de micro-organismos recombinantes, uma das primeiras etapas de processamento à jusante é a remoção de células microbianas ou detritos celulares. Isto pode ser conseguido por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado à centrifugação, decantação, filtração, etc. Como um resultado, uma lama de células microbianas (detritos celulares) e uma solução límpida de produto dissolvido são obtidas. A solução é processada mais à jusante para a recuperação do produto enquanto a lama é descartada após a esterilização. Devido à solubilidade limitada de Reb M, ele cristaliza e durante o processamento à jusante uma quantidade significativa de cristais de Reb M é perdida com a biomassa/lama separada durante o processo de remoção de células (detritos celulares). Isso reduz a eficiência do processo inteiro e torna-o menos comercialmente viável.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[011]Portanto, é necessário desenvolver um processo simples para a produção de Reb M por micro-organismos recombinantes, que apresente mecanismo(s) de recuperação altamente eficiente(s).

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[012]Os desenhos em anexo são incluídos para fornecer uma compreensão adicional da invenção. Os desenhos ilustram as modalidades da invenção e, em conjunto com a descrição, servem para explicar os princípios das modalidades da invenção.

[013]A Figura 1 mostra um cromatograma de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) de Rebaudiosídeo M.

[014]A Figura 2 mostra um cromatograma HPLC de Rebaudiosídeo M α- glicosilado contendo derivados de α-1,4-glucosil de Rebaudiosídeo M.

[015]A Figura 3 mostra um cromatograma HPLC de derivados de α-1,4- glucosil tratados com glucoamilase de Rebaudiosídeo M.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[016]As vantagens da presente invenção tornar-se-ão mais evidentes a partir da descrição detalhada fornecida em seguida. No entanto, dever-se-ia entender que a descrição detalhada e exemplos específicos, enquanto indicam modalidades preferenciais da invenção, são fornecidos apenas a título de ilustração, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e escopo da invenção tornar-se- ão evidentes para os versados na técnica a partir desta descrição detalhada.

[017]Também dever-se-ia entender que os métodos descritos poderiam ser aplicados a qualquer glicosídeo conhecido de esteviol ou glicosídeo terpenoide.

[018]A análise HPLC das matérias-primas e produtos foi realizada no cromatógrafo líquido Agilent Technologies série 1200 (EUA), equipado com coluna Zorbax-NH2 (4,6 X 250mm). A fase móvel foi gradiente de acetonitrilo e água de 80:20, v/v (0-2 min) a 50:50, v/v (2-90 min). Um detector de arranjo de diodos definido a 210 nm foi usado como o detector.

[019]A presente invenção tem como objetivo superar as desvantagens dos processos existentes para a produção de glicosídeo(s) de esteviol encontrados na planta Stevia rebaudiana por micro-organismos recombinantes. A invenção refere-se a um processo para a produção de glicosídeo(s) de esteviol encontrados na planta Stevia rebaudiana por micro-organismos recombinantes e recuperação de glicosídeo(s) produzido(s) para uso em vários produtos alimentícios e bebidas como adoçante, intensificador de doçura, sabor, intensificador/modificador de sabor.

[020]Os glicosídeos de esteviol são selecionados a partir do grupo que consiste de Esteviosídeo, Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo C, Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo E, Rebaudiosídeo F, Rebaudiosídeo G, Rebaudiosídeo H, Rebaudiosídeo I, Rebaudiosídeo J, Rebaudiosídeo K, Rebaudiosídeo L, Rebaudiosídeo M, Rebaudiosídeo N, Rebaudiosídeo O, Dulcosídeo A, Esteviolbiosídeo, Rubusosídeo, Esteviolmonosídeo, bem como qualquer outro glicosídeo de esteviol encontrado na planta Stevia rebaudiana e suas misturas.

[021]A invenção, em parte, refere-se a um processo de produção de glicosídeos de esteviol encontrados na planta Stevia rebaudiana por fermentação de micro-organismos recombinantes.

[022]O processo da invenção, pode ainda incluir uma etapa de adicionar álcool ao meio de fermentação de micro-organismos recombinantes resultando em melhor dissolução de glicosídeos de esteviol.

[023]O processo da invenção pode incluir uma etapa de adicionar solvente compreendendo álcool a qualquer meio que pode ser obtido a partir de processamento à jusante de meios de fermentação de hospedeiro(s) recombinante(s). Em uma modalidade, os ditos meios compreendem células de micro-organismos recombinantes separados (detritos celulares) e glicosídeos de esteviol cristalinos.

[024]O álcool pode ser selecionado a partir do grupo incluindo, mas não limitado a, metanol, etanol, n-propanol, iso-propanol, n-butanol, isobutanol e combinações desses. O álcool pode estar na forma de solução aquosa ou anidra.

[025]O processo da invenção pode incluir uma etapa de produzir derivados α-glicosilados de glicosídeos de esteviol encontrados na planta de Stevia rebaudiana onde os ditos derivados α-glicosilados contêm ao menos um resíduo de α-glicosil em sua molécula.

[026]O processo da invenção pode incluir uma etapa adicional de hidrólise seletiva de ligação a-glicosídica para converter derivados α-glicosilados de glicosídeos de esteviol em glicosídeos de esteviol encontrados na planta Stevia rebaudiana.

[027]A invenção, em parte, refere-se a uma composição que compreende derivados α-glicosilados de glicosídeos de esteviol encontrados na planta Stevia rebaudiana.

[028]A invenção, em parte, refere-se a um processo para produzir uma composição compreendendo formas α-glicosiladas de Esteviosídeo, Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo C, Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo E, Rebaudiosídeo F, Rebaudiosídeo G, Rebaudiosídeo H, Rebaudiosídeo I, Rebaudiosídeo J, Rebaudiosídeo K, Rebaudiosídeo L, Rebaudiosídeo M, Rebaudiosídeo N, Rebaudiosídeo O, Dulcosídeo A, Esteviolbiosídeo, Rubusosídeo, Esteviolmonosídeo, bem como qualquer outro glicosídeo de esteviol encontrado na planta Stevia rebaudiana e suas misturas.

[029]Em uma modalidade, o processo compreende uma etapa enzimática de a-glicosilação. A etapa de a-glicosilação pode ocorrer dentro da célula hospedeira recombinante, na superfície da célula hospedeira recombinante, ou fora da célula hospedeira recombinante.

[030]Em uma modalidade, a a-glicosilação é conseguida utilizando transglicosidase(s) e doadores de carboidrato. Exemplos não limitantes de doador de carboidrato incluem amido, maltodextrinas, sólidos de xarope de milho, ciclodextrinas, sacarose, maltose, malto-oligossacarídeos, fruto-oligossacarídeos, inulina, inosuligossacarídeos, xilolossacarídeos, açúcar de acoplamento, lactose e suas combinações.

[031]Em outra modalidade, a a-glicosilação é conseguida por a- glicosiltransferase(s) e o doador de glicosil nucleotídeo.

[032]Ainda em outra modalidade, a a-glicosilação é conseguida por a- glicosiltransferase(s) e por doador de glicosil não nucleotídeo.

[033]Em uma modalidade, a enzima(s) ciclomaltodextrina glucanotransferase (CGTase; EC 2.4.1.19) e o amido (como doador de glicose) foram utilizados para produzir derivados de a-1,4-glucosil de glicosídeos de esteviol contendo ao menos um resíduo de a-1,4-glucosil em suas moléculas.

[034]Outras enzimas e doadores de resíduos de glicosil podem ser utilizados para produzir derivados de a-glicosil de glicosídeos de esteviol contendo ao menos um resíduo de a-1,1-glicosil, ao menos um resíduo de a-1,2-glicosil, ao menos um resíduo de a-1,3-glicosil, ao menos um resíduo de a-1,4-glicosil, ao menos um resíduo de a-1,5-glicosil, ao menos um resíduo de a-1,6-glicosil em suas moléculas. As enzimas podem estar na forma de caldo de cultura livre de células, caldo de cultura livre de células líquidas concentradas, caldo de cultura livre de células secas por aspersão ou liofilizadas, ou proteína de alta pureza. Preparações enzimáticas livres e imobilizadas podem ser utilizadas. A(s) enzima(s) para a síntese de derivados de a-glicosil pode também ser incorporada no micro-organismo recombinante capaz de produzir moléculas de glicosídeos de esteviol encontradas na planta Stevia rebaudiana.

[035]Em uma modalidade, a(s) enzima(s) para a síntese de derivados de a- glicosil pode também ser incorporada em qualquer hospedeiro recombinante capaz de produzir moléculas de glicosídeos de esteviol encontrados na planta Stevia rebaudiana.

[036]Os derivados de α-glicosil obtidos têm maior solubilidade em água e, portanto, não se precipitam. Assim, a remoção de células microbianas (detritos celulares) não resulta em perda ou resulta em perda mínima de produto.

[037]Em uma modalidade após a separação das células microbianas (detritos celulares), os derivados de α-1,4-glucosil dissolvidos no sobrenadante são hidrolisados por glucoamilase para hidrólise seletiva de ligações α-1,4-glucosídicas e conversão de derivados α-1,4-glucosilados de glicosídeos de esteviol em moléculas de glicosídeos de esteviol encontrados na planta Stevia rebaudiana.

[038]Outras enzimas capazes de hidrolisar ligações α-1,4-glicosidicas podem também ser utilizadas. A enzima pode estar na forma de caldo de cultura livre de células, caldo de cultura livre de células líquidas concentradas, caldo de cultura livre de células secas por aspersão ou liofilização, ou proteína de alta pureza. Preparações enzimáticas livres e imobilizadas podem ser utilizadas.

[039]Em uma modalidade, a transglucosilação foi realizada por CGTase de Bacillus stearothermophilus St-100 (PureCircle Sdn Bhd Collection of Industrial Microorganisms - Malaysia).

[040]A atividade das preparações de CGTase foi determinada de acordo com o procedimento descrito por Hale W. S., Rawlins L. C. (1951) Amylase de Bacillus macerans. Cereal Chem. 28, 49 a 58.

[041]Os amidos de diferentes origens podem ser utilizados como doadores de unidades de glucosil, tais como, derivados de trigo, milho, batata, tapioca e sagu. Alternativamente, também podem ser utilizados outros doadores de resíduos de glucosil tais como maltodextrinas, ciclodextrinas, etc.

[042]O amido foi submetido à hidrólise parcial (liquefação) antes da reação de transglicosilação. O equivalente de dextrose do amido parcialmente hidrolisado pode estar na gama de aproximadamente 10-25, de preferência aproximadamente 12-16. Qualquer enzima capaz de hidrólise de amido pode ser utilizada para liquefação, tal como α-amilases, β-amilases, etc. Em uma modalidade, as misturas CGTase e α-amilase como enzimas de liquefação.

[043]Após a conclusão da reação de transglucosilação de Reb M, aproximadamente 0,5-1,0 unidades de glucoamilase (AMG300L, Novozymes), por grama de sólidos, foram adicionadas e a reação foi continuada durante aproximadamente 12-16 horas a aproximadamente 45-65° C, de preferência aproximadamente 60° C.

[044]Uma unidade da atividade de glucoamilase é definida como a quantidade de glucoamilase que liberará 0,1 μmol/min de p-nitrofenol a partir da solução PNPG sob as condições do ensaio descrito em Food Chemicals Codex 5â ed., pág. 907.

[045]A reação é interrompida por aquecimento a aproximadamente 95° C durante aproximadamente 15 minutos para inativar a(s) enzima(s), e a solução pode ser tratada com carbono ativado e/ou dessalinizada passando através de resinas de troca iônica. Outros métodos adequados de descoloração e dessalinização, tais como filtração por membrana, ou outros métodos conhecidos na técnica podem ser utilizados.

[046]A mistura reacional pode ser adicionalmente concentrada por evaporador a vácuo e/ou seca por meio de um secador por aspersão. Outros métodos adequados de concentração e secagem, tais como filtração por membrana, liofilização ou outros métodos conhecidos da técnica podem ser utilizados.

[047]Os glicosídeos de esteviol a partir da mistura reacional obtida podem ser recuperados por qualquer método ou combinação de métodos conhecidos na técnica para extração, separação, purificação, isolamento e produção de glicosídeos de esteviol encontrados na planta Stevia rebaudiana. Exemplos não limitantes de tais métodos incluem extração por água e ou solventes orgânicos, tratamento com floculantes, coagulantes, tratamento com resinas de adsorção macroporosa, tratamento com resina de troca iônica, tratamento com carbono ativado, filtração por membrana, filtração por membrana RO, microfiltração, nanofiltração, ultrafiltração, cromatografia, HPLC, cromatografia SMB, cromatografia em fluido supercrítico (SF), cromatografia em resina de adsorção, cromatografia de adsorção multicoluna, cromatografia de troca iônica, cromatografia contínua, extração em fluido supercrítico, extração assistida por ultrassom, extração assistida por micro-ondas, extração assistida por enzimas, extração sólido-líquido, extração líquido-líquido, cristalização, cristalização assistida por ultrassom, cristalização de gradiente, cristalização de solvente-antissolvente, co-cristalização, centrifugação, decantação, secagem por aspersão, secagem em leito fluido, liofilização, secagem instantânea, evaporação, granulação a úmido, granulação compacta, aglomeração, moagem, peneiração, e quaisquer combinação dos mesmos.

[048]O(s) glicosídeo(s) de esteviol purificado obtido pode ser utilizado como adoçantes, intensificadores de doçura, intensificadores de sabor e modificadores de sabor em vários produtos alimentícios e bebidas. Exemplos não limitantes de produtos alimentícios e bebidas incluem refrigerantes carbonatados, bebidas prontas para beber, bebidas energéticas, bebidas isotônicas, bebidas com baixas calorias, bebidas sem calorias, bebidas esportivas, chás, sucos de frutas e vegetais, bebidas de suco, bebidas lácteas, bebidas de iogurte, bebidas alcoólicas, bebidas em pó, produtos de panificação, biscoitos, cereais, confeitos, doces, balas, gomas de mascar, produtos lácteos, leite aromatizado, iogurtes, iogurtes aromatizados, leite cultivado, molho de soja e outros produtos à base de soja, molhos de salada, maionese, vinagre, sobremesas congeladas, produtos à base de carne, produtos à base de peixe, alimentos engarrafados e enlatados, adoçantes de mesa, frutas e vegetais.

[049]Adicionalmente, o(s) glicosídeo(s) de esteviol purificado obtido pode ser utilizado em fármacos ou preparações farmacêuticas ou cosméticos, incluindo, mas não limitados a, pastas de dente, enxaguatórios bucais, xarope para tosse, comprimidos mastigáveis, pastilhas, preparações vitamínicas e similares.

[050]O(s) glicosídeo(s) de esteviol purificado obtido pode ser usado “como está” ou em combinação com outros adoçantes, sabores, ingredientes flavorizantes e ingredientes alimentícios.

[051]Exemplos não limitantes de adoçantes incluem os glicosídeos de esteviol, Esteviosídeo, Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo C, Dulcosídeo A, Esteviolbiosídeo, Rubusosídeo, Esteviolmonosídeo, bem como qualquer outro glicosídeo de esteviol encontrado na planta Stevia rebaudiana e suas misturas, extrato de estévia, glicosídeos de esteviol glicosilados, extrato de Luo Han Guo, mogrosídeos, xarope de milho com alto teor de frutose, xarope de milho, açúcar invertido, fruto-oligossacarídeos, inulina, inulo-olossacarídeos, açúcar de acoplamento, malto-oligossacarídeos, maltodextrinas, sólidos de xarope de milho, glicose, maltose, sacarose, lactose, aspartame, sacarina, sucralose, álcoois de açúcar.

[052]Exemplos não limitantes de flavorizantes e ingredientes flavorizantes incluem glicosídeos de esteviol glicosilados, glicosídeo(s) de esteviol, mogrosídeo(s), sabores de limão, laranja, frutado, banana, uva, pera, abacaxi, amêndoa amarga, cola, canela, açúcar, algodão doce, baunilha, NSF-01, NSF-02, NSF-03, NSF-04 (disponível a partir de PureCircle).

[053]Exemplos não limitantes de outros ingredientes alimentícios incluem sabores, acidulantes, ácidos orgânicos e aminoácidos, agentes corantes, agentes de volume, amidos modificados, gomas, texturizantes, conservantes, antioxidantes, emulsificantes, estabilizadores, espessantes, agentes gelificantes.

[054]Os seguintes exemplos ilustram várias modalidades da invenção. Deve- se entender que a invenção não está limitada aos materiais, proporções, condições e procedimentos estabelecidos nos exemplos, que são apenas ilustrativos.

EXEMPLO 1 Preparação de CGTase

[055]Uma cepa de Bacillus stearothermophilus St-100 foi inoculada em 2.000 litros de meio de cultura esterilizado contendo 1,0% de amido, 0,25% de extrato de milho, 0,5% de (NH4)2SO4 e 0,2% de CaCO3 (pH 7,0-7,5) a 56° C durante 24 horas com aeração contínua (2.000 L/min) e agitação (150 rpm). O caldo de cultura obtido foi filtrado usando a membrana cerâmica Kerasep 0,1 μm (Novasep, França) para separar as células. O permeado livre de células foi ainda concentrado 2 vezes em ultrafiltros Persep de 10 kDa (Orelis, França). A atividade da enzima foi determinada de acordo com Hale, Rawlins (1951). Uma preparação de enzima em bruto com atividade de aproximadamente 2 unidades/mL foi obtida.

EXEMPLO 2 Preparação de α-glicosil Reb M

[056]100 g de amido de tapioca foram suspensos em 300 mL de água (pH 6,5). 2 KNU de α-amilase (Termamyl Classic, Novozymes, Dinamarca) e 30 unidades de CGTase obtidas de acordo com o EXEMPLO 1 foram adicionados, e a liquefação do amido foi realizada a 80° C durante aproximadamente uma hora para equivalente de dextrose aproximadamente 15. O O pH da mistura reacional foi ajustado para pH 2,8 por ácido clorídrico e a mistura foi fervida a 100° C durante 5 minutos para inativar as enzimas. Após resfriamento a 65° C, o pH foi ajustado para pH 6,0 com solução de hidróxido de sódio. 10 g de Rebaudiosídeo M cristalino (Reb M, também conhecido como Rebaudiosídeo X) produzido por PureCircle Sdn. Bhd. (Malásia), tendo solubilidade em água de 0,5 g/L (a 25° C) e contendo 96,97% de Reb M e 3,03% de Reb D, foi dissolvido fervendo em 9.000 mL de água (o pH foi ajustado para pH 6,0) e foi adicionado ao amido liquefeito e agitado até uma solução homogênea ser obtida. 200 unidades de CGTase foram adicionadas à solução e a mistura foi mantida a uma temperatura de 65° C durante 24 horas sob agitação contínua. A mistura reacional obtida foi aquecida a 95° C durante 15 minutos para inativar a enzima. 20 gramas de carvão ativado foram adicionados e a mistura foi aquecida a 75° C e mantida durante 30 min. A mistura foi filtrada e o filtrado foi passado através da coluna embalada com 1.000 mL de resina adsorvente macroporosa Amberlite XAD 7HP. A coluna foi lavada com 5 volumes de água e 2 volumes de etanol a 20% (v/v). Os glicosídeos adsorvidos foram eluídos com 50% de etanol. O eluato obtido foi passado através de colunas embaladas com as resinas de troca iônica Amberlite FPC23 (H +) e Amberlite FPA51 (OH-). O etanol foi evaporado e a solução de água dessalinizada e descolorada foi concentrada a 60° C sob vácuo, depois seca em uma forma de pó utilizando um secador de aspersão de laboratório. 15,9 gramas de produto de α-glicosil Reb M foram obtidos tendo solubilidade em água de 500 g/L (a 25° C). O ensaio HPLC de α-glicosil Reb M é fornecido na Tabela 1. Tabela 1 Ensaio HPLC de α-glicosil Reb M

EXEMPLO 3 Hidrólise de α-glicosil Reb M

[057]10 g de α-Glycosil Reb M obtido de acordo com o EXEMPLO 2 form dissolvidos em 90 mL de água. A temperatura foi mantida a 60° C, e 5 unidades de glucoamilase (AMG300L, Novozymes) foram adicionadas, e a reação foi continuada durante 12 horas a 60° C. A mistura reacional obtida foi aquecida a 95° C durante 15 minutos para inativar a enzima. 0,5 grama de carvão ativado foi adicionado e a mistura foi aquecida a 75° C e mantida durante 30 minutos. A mistura foi filtrada e o filtrado foi diluído com água até 5% de teor de sólidos e passada através da coluna empacotada com 1.000 mL de resina adsorvente macroporosa Amberlite XAD 7HP. A coluna foi lavada com 5 volumes de água e 2 volumes de etanol a 20% (v/v). Os glicosídeos adsorvidos foram eluídos com 50% de etanol. O eluato obtido foi passado através de colunas embaladas com as resinas de troca iônica Amberlite FPC23 (H +) e Amberlite FPA51 (OH-). O etanol foi evaporado e a solução de água dessalinizada e descolorada foi concentrada a 60° C sob vácuo até 10% de teor de sólidos. A solução concentrada foi deixada durante 24 horas para cristalizar Reb M. Os cristais foram separados por filtração e secos sob vácuo para produzir aproximadamente 4,5 g de Reb M com 99% de pureza (peso em base seca).

EXEMPLO 4 Avaliação de Reb M

[058]A avaliação sensorial de Reb M preparada de acordo com o EXEMPLO 3, foi carregada usando solução aquosa de 600ppm, com 20 membros. A amostra de Reb M foi avaliada juntamente com amostras de sacarose a 10% e 600 ppm de amostras de Reb A e Esteviosídeo comercialmente disponíveis. Com base na aceitação geral, as amostras mais desejáveis e mais indesejáveis foram escolhidas. Os resultados são apresentados na Tabela 2. Tabela 2 Avaliação sensorial de amostras no sistema de água

[059]Como aparente dos resultados na Tabela 2, a qualidade da doçura do Reb M foi classificada como a mais superior.

EXEMPLO 5 Bebida de suco de laranja com baixas calorias

[060]O concentrado de laranja (35%), ácido cítrico (0,35%), ácido ascórbico (0,05%), cor vermelho laranja (0,01%), sabor de laranja (0,20%), e diferentes glicosídeos de esteviol (0,06%) foram blendados e dissolvidos completamente em água (até 100%) e pasteurizados. Os glicosídeos de esteviol foram representados pelas amostras de Reb A, Esteviosídeo e Reb M, obtidas de acordo com o EXEMPLO 3.

[061]As avaliações sensoriais das amostras estão resumidas na Tabela 3. Os dados mostram que os melhores resultados podem ser obtidos usando a amostra de Reb M. Particularmente, a bebida preparada com Reb M exibiu um perfil de sabor e uma sensação na boca redonda e completa. Tabela 3 Avaliação de amostras de bebidas de suco de laranja

[062]O mesmo método pode ser usado para preparar sucos e bebidas de suco de outras frutas, tal como maçãs, limões, damascos, cerejas, abacaxis, mangas, etc.

EXEMPLO 6 Bebida carbonatada de zero caloria

[063]Uma bebida carbonatada de acordo com a fórmula apresentada abaixo foi preparada.

[064]Os glicosídeos de esteviol foram representados pelas amostras de Reb A, Esteviosídeo e Reb M, obtidas de acordo com o EXEMPLO 3.

[065]As propriedades sensoriais foram avaliadas por 20 membros. Os resultados estão resumidos na Tabela 4. Tabela 4 Avaliação de amostras de bebidas carbonatadas com zero caloria

[066]Os resultados acima mostram que as bebidas preparadas com amostra de Reb M possuíam as melhores características organolépticas.

EXEMPLO 7 Biscoitos dietéticos

[067]Farinha (50%), margarina (30%), frutose (10%), maltitol (8%), leite integral (1%), sal (0,2%), fermento em pó (0.15%), vanilina (0.1%) e diferentes glicosídeos de esteviol (0,06%) foram bem amassados na máquina de mistura de massa. A massa obtida foi moldada e cozida no forno a 200° C durante 15 minutos. Os glicosídeos de esteviol foram representados pelas amostras de Reb A, Esteviosídeo e Reb M, obtidas de acordo com o EXEMPLO 3.

[068]As propriedades sensoriais foram avaliadas por 20 membros. Os melhores resultados foram obtidos em amostras preparadas com Reb M. Os membros observaram o perfil de sabor redondo e completo e a sensação na boca em biscoitos preparados com Reb M.

[069]Deve ser entendido que as descrições acima e modalidades específicas aqui mostradas são meramente ilustrativas do melhor modo da invenção e dos seus princípios, e que as modificações e adições podem ser facilmente feitas pelos versados na técnica sem abandonar o espírito e o escopo da invenção, que, portanto, é entendido como limitado apenas pelo escopo das reivindicações em anexo.

Claims (17)

1. Processo para produzir um glicosídeo terpenoide CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: a. usar um micro-organismo recombinante para sintetizar um glicosídeo terpenoide; b. produzir um derivado de a-glicosil solúvel em água do glicosídeo terpenoide, em que o derivado de a-glicosil solúvel em água do glicosídeo terpenoide é produzido pelo micro-organismo recombinante e tem ao menos um resíduo de a-glicosil; c. separar o micro-organismo recombinante do derivado de a-glicosil solúvel em água do glicosídeo terpenoide; e d. hidrolisar seletivamente pelo menos um resíduo de a-glicosil do derivado de a-glicosil solúvel em água do glicosídeo terpenoide para obter o glicosídeo terpenoide.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda a etapa de: e. purificar o glicosídeo terpenoide.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que na etapa (a), o glicosídeo terpenoide é sintetizado por ao menos um biocatalisador.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que na etapa (a), o glicosídeo terpenoide é sintetizado por ao menos uma enzima.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (b) ocorre no micro-organismo recombinante.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (b) ocorre fora do micro-organismo recombinante.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (b) ocorre na superfície do micro-organismo recombinante.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (d) ocorre fora do micro-organismo recombinante.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (d) ocorre ao colocar em contato o derivado de a-glicosil solúvel em água do glicosídeo terpenoide com ao menos um biocatalisador.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (d) ocorre ao colocar em contato o derivado de a-glicosil solúvel em água do glicosídeo terpenoide com ao menos uma enzima.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o glicosídeo terpenoide é selecionado do grupo que consiste em extrato de estévia, glicosídeos de esteviol, esteviosídeo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo G, rebaudiosídeo H, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo L, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O, dulcosídeo A, esteviolbiosídeo, rubusosídeo, glicosídeos de esteviol glicosilados, glicosídeos de esteviol glucosilados, bem como qualquer outro glicosídeo de esteviol encontrado na planta Stevia rebaudiana e misturas destes.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o glicosídeo terpenoide é selecionado do grupo que consiste em extrato de Luo Han Guo, glicosídeos de mogrol, mogrosídeos, mogrosídeo I, mogrosídeo II, mogrosídeo II B, mogrosídeo II E, mogrosídeo III, mogrosídeo III A2, mogrosídeo IV, mogrosídeo V, mogrosídeo VI, neomogrosídeo, grosmomosídeo I, siamenosídeo I, 7-oxo-mogrosídeo II E, 11-oxo-mogrosídeo A1, 11-desoxi-mogrosídeo III, 11- oxomogosídeo IV A, 7-oxo-mogrosídeo V , 11-oxo-mogrosídeo V, bem como qualquer outro glicosídeo de mogrol encontrado na planta Siraitia grosvenorii e misturas destes.

13. Composição de sabor CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o glicosídeo terpenoide, como definido na reivindicação 1, e ao menos um agente flavorizante adicional selecionado do grupo que consiste em limão, cereja, laranja, frutas, banana, uva, pera, abacaxi, manga, amêndoa amarga, cola, canela, açúcar, algodão doce, baunilha, glicosídeos terpenoides, NSF01, NSF02, NSF03, NSF04 e uma combinação destes.

14. Ingrediente alimentício CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o glicosídeo terpenoide, como definido na reivindicação 1, e ao menos um ingrediente alimentício adicional selecionado do grupo que consiste em acidulantes, ácidos orgânicos e aminoácidos, agentes corantes, agentes de volume, amidos modificados, gomas, texturizantes, conservantes, antioxidantes, emulsionantes, estabilizadores, espessantes, agentes gelificantes e uma combinação destes.

15. Alimento, bebida ou outro produto consumível CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o glicosídeo terpenoide feito pelo processo como definido na reivindicação 1.

16. Cosmético CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o glicosídeo terpenoide feito pelo processo como definido na reivindicação 1.

17. Produto farmacêutico CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o glicosídeo terpenoide feito pelo processo como definido na reivindicação 1.

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