CN107404911A - 莱鲍迪苷m生物合成生产和回收方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于完全回收重组微生物中获得的低溶解性的甜菊醇糖苷的各种回收方法。在下游处理中完全回收了可溶性α‑糖基甜菊醇糖苷，并随后通过水解酶转化成甜菊醇糖苷。将获得的甜菊醇糖苷纯化并用作食品、饮料、化妆品和药品中的甜味剂、增甜剂、风味增强剂和风味改良剂。

Description

莱鲍迪苷M生物合成生产和回收方法
相关申请
本申请按引用全部并入于2014年4月16日提交并于2014年8月14日作为US 2014/0227421公开的美国专利申请系列No.14/254,653。
发明背景
发明领域
本发明涉及通过重组微生物生产萜烯苷并回收所产生的糖苷用于各种食品和饮料中的方法。
相关领域的描述
由于意识到许多疾病与高糖食品和饮料的食用有关，如今越来越关注糖替代品。然而，许多人造甜味剂，如甘素、甜蜜素和糖精，由于对它们的安全性的关注，在一些国家被禁止或限制。因此，天然来源的无热量甜味剂变得越来越流行。甜味草本植物甜菊(steviarebaudiana Bertoni)，产生多种二萜苷，其以优于许多其他高效力甜味剂的高强度甜味和感官特性为特色。
上述甜味糖苷，具有共同的糖苷配基甜菊醇，而区别在于C13和C19位置的碳水化合物残基的数量和类型。甜菊的叶子能够累积高达10-20％(基于干重)甜菊醇糖苷。甜菊叶子中发现的主要糖苷是莱鲍迪苷A(2-10％)、蛇菊苷(2-10％)和莱鲍迪苷C(1-2％)。其他糖苷，如莱鲍迪苷B、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N和O，蛇菊双糖苷、杜克苷(Dulcoside)A和悬钩子苷以较低的水平(大约0-0.5％)被发现。
两种主要的糖苷-蛇菊苷和莱鲍迪苷A，得到了广泛研究并且就其作为商业高强度甜味剂的适合性进行了表征。碳酸饮料中的适合性研究证实了它们的热和pH稳定性(ChangS.S.,Cook,J.M.(1983)Stability studies of stevioside and Rebaudioside A incarbonated beverages.J.Agric.Food Chem.31:409-41)。
甜菊醇糖苷不仅彼此的分子结构不同，其味道特性也不同。通常，发现蛇菊苷比蔗糖甜110-270倍，莱鲍迪苷A比蔗糖甜150至320倍，而莱鲍迪苷C比蔗糖甜40-60倍。杜克苷A比蔗糖甜30倍。莱鲍迪苷A具有最小的涩味，最小的苦味和最小的持久回味，因此在许多甜菊醇糖苷中具有最佳的感官属性(Tanaka O.(1987)Improvement of taste of naturalsweeteners.Pure Appl.Chem.69:675-683；Phillips K.C.(1989)Stevia:steps indeveloping a new sweetener.见:Grenby T.H.编辑，Developments in sweeteners，第3卷，Elsevier Applied Science，London.1-43)。
莱鲍迪苷M(也称为莱鲍迪苷X；CAS No:1220616-44-3)是甜菊植物中发现的次要甜菊醇糖苷中的一种。发现其具有卓越的味道特性并且是非常理想的天然高强度甜味剂(WO2013/096420 007748，将其全部并入本文中作为参考)。
由于在甜菊叶中的低浓度，描述了通过酶和重组宿主生产次要甜菊醇糖苷(包括莱鲍迪苷M)的多种生物催化方法(WO2013/176738、WO2014/122328、WO2015/007748，将其全部并入本文中作为参考)。
当在重组微生物中生产莱鲍迪苷M时，目的在于获得最高浓度/滴定度的莱鲍迪苷M(Reb M)。对于不同化合物的重组微生物生产，商业可行性通常在高于10g/L的滴定度下开始。另一方面，已知Reb M在水中具有约1g/L的有限溶解度(US2015/0017284，将其全部并入本文中作为参考)。因此，在高于1g/L浓度下的Reb M的重组微生物生产中，Reb M将从培养基中沉淀/结晶。
通常，在重组微生物发酵后，下游处理的第一个步骤之一是除去微生物细胞或细胞碎片。这可以通过本领域已知的任何方法来实现，所述方法包括但不限于，离心、滗析、过滤等。因此，获得了微生物细胞(细胞碎片)的浆状物和溶解产物的澄清溶液。将该溶液进行的进一步的下游处理用于产品回收，同时灭菌后将所述浆状物丢弃。由于Reb M有限的溶解度，其结晶并且在下游处理过程中，在细胞(细胞碎片)去除过程中，相当大量的Reb M结晶随着分离的生物质/浆状物丢失。这降低了整个过程的效率并且使得它在商业上是不太可行的。
因此，需要研发一种通过重组微生物生产Reb M的简单方法，其特征在于非常有效的回收机制。
附图简述
包括附图来提供本发明的进一步理解。所述附图说明了本发明的实施方案，并且与说明书一起用于解释本发明实施方案的原理。
图1显示了莱鲍迪苷M的高效液相色谱(HPLC)；
图2显示了含有莱鲍迪苷M的α-1,4-葡糖基-衍生物的α-糖基化莱鲍迪苷M的HPLC色谱；
图3显示了葡糖淀粉酶处理的莱鲍迪苷M的α-1,4-葡糖基-衍生物的HPLC色谱。
发明详述
从下文中给出的详述，本发明的优势将变得更清楚。然而，应当理解详细的描述和特定的实施例，尽管表明了本发明的优选实施方案，但只是通过说明的方式给出，因为从这个详细的描述，本领域技术人员将清楚本发明的精神和范围内的各种变化和改变，
还应当理解所述的方法能够适用于甜菊醇或萜烯苷的任何已知糖苷。
在配备了Zorbax-NH2(4.6×250mm)柱的Agilent Technologies1200 Series(USA)液相色谱上进行了原料和产物的HPLC分析。移动相是从80:20，v/v(0-2分钟)至50:50，v/v(2-90分钟)的乙腈-水梯度。将210nm的二极管阵列检测仪组用作检测仪。
本发明的目的在于克服现有的通过重组微生物生产甜菊植物中发现的甜菊醇糖苷的方法的缺陷。本发明涉及通过重组微生物生产甜菊植物中发现的甜菊醇糖苷并回收所生产的糖苷作为甜味剂、增甜剂、风味剂、风味改良剂/增强剂用于各种食品和饮料中的方法。
甜菊醇糖苷选自蛇菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷G、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O、杜克苷A、蛇菊双糖苷、悬钩子苷、蛇菊单糖苷，以及甜菊(stevia rebaudiana)植物中发现的任何其他甜菊醇糖苷，及其混合物。
本发明部分涉及通过重组微生物的发酵生产甜菊植物中发现的甜菊醇糖苷的方法。
本发明的方法可以进一步包括将醇加入重组微生物的发酵培养基中的步骤，导致甜菊醇糖苷更好的溶解。
本发明的方法可以包括将包含醇的溶剂加入可获自重组宿主的发酵培养基的下游处理的任何培养基中的步骤。在一个实施方案中，所述培养基包括分离的重组微生物细胞(细胞碎片)和结晶甜菊醇糖苷。
醇可以选自包括但不限于甲醇、乙醇、正-丙醇、异-丙醇、正-丁醇、异-丁醇及其组合的组。醇可以是水溶液的形式或是无水的。
本发明的方法可以包括生产甜菊植物中发现的甜菊醇糖苷的α-糖基化衍生物的步骤，其中所述α糖基化衍生物在其分子中含有至少一个α-糖基残基。
本发明的方法可以包括α-糖苷键的选择性水解以将甜菊醇糖苷的α-糖基化衍生物转化成甜菊植物中发现的甜菊醇糖苷的再一个步骤。
本发明部分涉及包含甜菊植物中发现的甜菊醇糖苷的α-糖基化衍生物的组合物。
本发明部分涉及生产组合物的方法，所述组合物包含蛇菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷G、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O、杜克苷A、蛇菊双糖苷、悬钩子苷、蛇菊单糖苷，以及甜菊(stevia rebaudiana)植物中发现的任何其他甜菊醇糖苷，及其混合物的α-糖基化形式。
在一个实施方案中，所述方法包括酶促α-糖基化步骤。α-糖基化步骤可以在重组宿主细胞内、重组宿主细胞的表面上或重组细胞外进行。
在一个实施方案中，通过使用转糖苷酶和碳水化合物供体来实现α-糖基化。碳水化合物供体的非限制性实例包括淀粉、麦芽糖糊精、玉米糖浆固体、环糊精、蔗糖、麦芽糖、麦芽寡糖、果寡糖、菊粉、菊粉寡糖、木寡糖、偶联糖、乳糖及其组合。
在另一个实施方案中，通过α-糖基转移酶和核苷酸糖基供体来实现α-糖基化。
在再另一个实施方案中，通过α-糖基转移酶和非-核苷酸糖基供体来实现α-糖基化。
在一个实施方案中，使用环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶(CGT酶；EC2.4.1.19)和淀粉(作为葡萄糖供体)来生产在其分子中含有至少一个α-1,4-糖基残基的甜菊醇糖苷的α-1,4-糖基-衍生物。
可以使用其他酶和糖基残基供体来生产在其分子中含有至少一个α-1,1-糖基残基、至少一个α-1,2-糖基残基、至少一个α-1,3-糖基残基、至少一个α-1,4-糖基残基、至少一个α-1,5-糖基残基、至少一个α-1,6-糖基残基的甜菊醇糖苷的α-糖基-衍生物。酶可以是无细胞培养液、浓缩液体无细胞培养液、喷雾干燥或冷冻干燥的无细胞培养液，或高纯度蛋白质的形式。可以使用游离和固定化酶制剂。也可以将用于α-糖基-衍生物合成的酶掺入能够产生甜菊植物中发现的甜菊醇糖苷分子的重组微生物中。
在一个实施方案中，用于α-糖基化-衍生物合成的酶也可以掺入能够产生甜菊植物中发现的甜菊醇糖苷的任何重组宿主中。
获得的α-糖基-衍生物具有较高的水溶性并且因此没有沉淀。因此，微生物细胞(细胞碎片)去除导致产品没有或最小损失。
在一个实施方案中，分离微生物细胞(细胞碎片)后，通过葡糖淀粉酶水解溶解于上清液中的α-1,4-糖基衍生物，葡糖淀粉酶用于α-1,4-糖苷键的选择性水解并将甜菊醇糖苷的α-1,4-糖基化衍生物转化成甜菊植物中发现的甜菊醇糖苷分子。
也可以使用能够水解α-1,4-糖苷键的其他酶。酶可以是无细胞培养液、浓缩液体无细胞培养液、喷雾干燥或冷冻干燥的无细胞培养液，或高纯度蛋白质的形式。可以使用游离和固定化酶制剂。
在一个实施方案中，通过嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)St-100(PureCircle Sdn Bhd Collection of Industrial Microorganisms-Malaysia)的CGT酶完成了转糖基。
CGT酶的活性是按照在Hale W.S.,Rawlins L.C.(1951)浸麻类芽孢杆菌(Bacillus macerans)的淀粉酶。Cereal Chem.28,49-58中所述的程序测定的。
不同来源的淀粉可以用作糖基单体的供体，如，源自小麦、玉米、马铃薯、木薯和西米。或者，也可以使用糖基残基的其他供体，如麦芽糖糊精、环糊精等。
在转糖基反应前，使淀粉接受部分水解(液化)。部分水解的淀粉的葡萄糖当量在约10-25，优选约12-16的范围中。能够淀粉水解的任何酶可以用于液化，如α-淀粉酶、β-淀粉酶等。在一个实施方案中，优选CGT酶和α-淀粉酶混合物作为液化酶。
在完成Reb M转糖基时，添加约0.5-1.0单位的葡糖淀粉酶(AMG300L、Novozymes)/克固体，并且将反应在约45-65℃，优选约60℃下继续约12-16小时。
将一单位的葡糖淀粉酶活性定义为在Food Chemicals Codex，第5版，第907页中所述的测定条件下，将从PNPG溶液中释放0.1μmol/分钟的对-硝基酚的葡糖淀粉酶的量。
通过在约95℃下加热15分钟，将酶灭活来停止反应，并且用活性炭处理溶液和/或通过离子交换树脂脱盐。可以使用其他合适的脱色和脱盐方法，如膜滤，或本领域已知的其他方法。
可以通过真空蒸发仪进一步浓缩反应混合物和/或通过喷雾干燥器来干燥。可以使用其他合适的浓缩和干燥方法，如膜滤、冷冻干燥或本领域已知的其他方法。
可以通过本领域已知的用于提取、分离、纯化、离析和生产甜菊植物中发现的甜菊醇糖苷的任一种方法或方法的组合来回收来自所获得的反应混合物的甜菊醇糖苷。这样的方法的非限制性实例包括通过水和或醇溶剂提取，用絮凝剂、凝结剂处理，用大孔吸附树脂处理，离子交换树脂处理，活性炭处理，膜滤，RO-膜滤，微滤，纳滤，超滤，色谱，HPLC，SMB-色谱，超临界流体(SF)色谱，吸附树脂色谱，多柱吸附色谱，离子交换色谱，连续色谱，超临界流体提取，超声波辅助提取，微波辅助提取，酶辅助提取，固体-液体提取，液体-液体提取，结晶，超声波辅助结晶，梯度结晶，溶剂-抗溶剂结晶，共结晶，离心，滗析，喷雾干燥，流化床干燥，冷冻干燥，急速干燥，蒸发，湿法制粒，压制制粒，聚集，研磨，过筛，及其任意组合。
所获得的纯化甜菊醇糖苷可以用作各种食品和饮料产品中的甜味剂、增甜剂、风味增强剂和风味改良剂。食品和饮料产品的非限制性实例包括碳酸软饮料、即饮饮料、能量饮料、等渗饮料、低热量饮料、零热量饮料、运动饮料、茶、水果和蔬菜汁、汁液饮料、乳饮料、酸奶饮料、含醇饮料、粉状饮料、烘焙制品、小甜饼、饼干、烘焙混合物、谷物、糖食、糖果、太妃糖、口香糖、乳制品、调味奶、酸奶、调味酸奶、培养的奶、酱油和其他大豆基制品、沙拉酱、蛋黄酱、醋、冷冻甜点、肉制品、鱼-肉制品、瓶装和罐装食品、桌面甜味剂、水果和蔬菜。
另外，所获得的纯化甜菊醇糖苷可以用于药物或药物制剂和化妆品，包括但不限于牙膏、漱口水、咳嗽糖浆、咀嚼片、锭剂、维生素制剂等中。
所获得的纯化甜菊醇糖苷可以“按原样(as-is)”使用或与其他甜味剂、风味剂、风味成分和食品成分结合使用。
甜味剂的非限制性实例包括甜菊醇糖苷、蛇菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷G、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O、杜克苷A、蛇菊双糖苷、悬钩子苷、蛇菊单糖苷，以及甜菊(stevia rebaudiana)植物中发现的任何其他甜菊醇糖苷，及其混合物，甜菊提取物、糖基化甜菊醇糖苷、罗汉果提取物、罗汉果苷、高果糖玉米糖浆、玉米糖浆、转化糖、果寡糖、菊粉、菊粉寡糖、偶联糖、麦芽寡糖、麦芽糖糊精、玉米糖浆固体、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、阿斯巴甜、糖精、三氯蔗糖、糖醇。
风味剂和风味成分的非限制性实例包括糖基化甜菊醇糖苷、甜菊醇糖苷、罗汉果苷、柠檬、橙子、水果、香蕉、葡萄、梨、菠萝、苦杏仁、可乐果、肉桂、糖、棉花糖、香草香精、NSF-01、NSF-02、NSF-03、NSF-04(可获自PureCircle)。
附加食品成分的非限制性实例包括风味剂、酸化剂、有机酸和氨基酸、着色剂、填充剂、改性淀粉、树胶、组织形成剂、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂、胶凝剂。
以下实施例说明了本发明的各种实施方案。应当理解本发明不限于实施例中所列的材料、比例、条件和程序，其只是说明性的。
实施例1
CGT酶的制备
将嗜热脂肪芽孢杆菌St-100的菌株接种于2,000升含有1.0％淀粉、0.25％玉米提取物、0.5％(NH4)2SO4和0.2％CaCO3(pH7.0-7.5)的灭菌培养基中，在56℃下伴随连续通气(2,000L/分钟)和搅拌(150rpm)持续24小时。使用Kerasep 0.1μm陶瓷膜(Novasep，法国)过滤所获得的培养液，以分离细胞。将无细胞透过液在Persep 10kDa超滤器(Orelis，法国)上浓缩2倍。根据Hale，Rawlins(1951)测定了酶活性。获得了具有约2单位/mL活性的粗酶制剂。
实施例2
α-糖基Reb M的制备
将100g木薯淀粉悬浮于300mL水(pH6.5)中。加入2KNU的α-淀粉酶(TermamylClassic，Novozymes，丹麦)和30单位的根据实施例1获得的CGT酶，并且在80℃下，将淀粉的液化进行约一小时至约15的葡萄糖当量。通过盐酸，将反应混合物的pH调节至pH2.8，并将混合物在5分钟过程中在100℃下煮沸，以灭活酶。冷却至65℃后，用氢氧化钠溶液将pH调节至pH6.0。通过在9,000mL水(pH调节至pH6.0)中煮沸来溶解10g由PureCircle Sdn.Bhd.(马来西亚)生产的具有0.5g/L水溶性(在25℃下)并含有96.97％Reb M和3.03％Reb D的结晶莱鲍迪苷M(Reb M；也称为莱鲍迪苷X)，并加入液化的淀粉中，搅拌直至获得均匀的溶液。将200单位的CGT酶加入该溶液中，并将混合物在65℃的温度下在连续搅拌下保持24小时。将获得的反应混合物在95℃下加热15分钟，以灭活酶。加入20克活性炭，并将混合物加热至75℃，并保持30分钟。将混合物过滤，并使滤液通过填充了1,000mL Amberlite XAD 7HP大孔吸附树脂的柱子。用5体积的水和2体积的20％(v/v)乙醇洗涤柱子。用50％乙醇洗脱吸附的糖苷。使获得的洗脱液通过填充了Amberlite FPC23(H+)和Amberlite FPA51(OH-)离子交换树脂的柱子。将乙醇蒸发并将脱盐和脱色的水溶液在真空下在60℃下浓缩，然后使用实验室喷雾干燥器干燥成粉末形式。获得了15.9克α-糖基Reb M产物，其具有500g/L的水溶性(在25℃下)。表1中提供了α-糖基Reb M的HPLC测定。
表1
α-糖基Reb M的HPLC测定
化合物 含量，面积％
Reb M 6.9
Reb D 0.3
单-糖基-Reb M(RebMG1) 11.8
双-糖基-Reb M(RebMG2) 7.6
Reb M的高级α-1,4-糖基化衍生物 73.4
总的Reb M的α-1,4-糖基化衍生物 92.8
实施例3
α-糖基Reb M的水解
将10g根据实施例2获得的α-糖基Reb M溶解于90mL水中。将温度维持在60℃中，并加入5单位葡糖淀粉酶(AMG300L，Novozymes)，将反应在60℃下持续12小时。将获得的反应混合物在95℃下加热15分钟，使酶灭活。加入0.5克活性炭并将混合物加热至75℃，并保持30分钟。将混合物过滤，并用水将滤液稀释至5％固体含量，并使其通过填充了1,000mLAmberlite XAD 7HP大孔吸附树脂的柱子。用5体积的水和2体积的20％(v/v)乙醇洗涤柱子。用50％乙醇洗脱吸附的糖苷。使获得的洗脱液通过填充了Amberlite FPC23(H+)和Amberlite FPA51(OH-)离子交换树脂的柱子。将乙醇蒸发并将脱盐和脱色的水溶液在真空下在60℃下浓缩，直至10％固体含量。将浓缩的溶液静置24小时，使Reb M结晶。通过过滤分离结晶，并在真空下干燥，以产生约4.5g的具有99％纯度的Reb M(wt/wt，基于干基)。
实施例4
Reb M的评价
使用600ppm水溶液，20名专家，进行了根据实施例3制备的Reb M的感官评价。连同10％蔗糖和600ppm市售Reb A和蛇菊苷样品一起评价了Reb M样品。基于整体的接受性，选择了最理想和最不理想的样品。结果显示于表2中。
表2
水系统中的样品的感官评价
从表2的结果，可以清楚Reb M的甜味品质是被评价为最优的。
实施例5
低热量橙汁饮料
将橙子浓缩物(35％)、柠檬酸(0.35％)、抗坏血酸(0.05％)、橙红色(0.01％)、橙子香精(0.20％)和不同的甜菊醇糖苷(0.06％)混合且在水中(补足100％)完全溶解并巴氏杀菌。甜菊醇糖苷由Reb A、蛇菊苷和根据实施例3获得的Reb M样品来代表。
该样品的感官评价概括于表3中。数据显示出通过使用Reb M样品可以获得最佳结果。特别地，用Reb M制备的饮料呈现出全面和完整的风味特征和口感。
表3
橙汁饮料样品的评价
相同的方法可以用于制备来自其他水果，如苹果、柠檬、杏、樱桃、菠萝、芒果等的汁液和汁液饮料。
实施例6
零热量碳酸饮料
制备了根据以下呈现的配方的碳酸饮料。
成分 含量，％
可乐果香精 0.340
正-磷酸 0.100
柠檬酸钠 0.310
苯甲酸钠 0.018
柠檬酸 0.018
甜菊醇糖苷 0.05
碳酸水 至100
甜菊醇糖苷由Reb A、蛇菊苷和根据实施例3获得的Reb M样品来代表。
通过20名专家来评价感官特性。结果概括于表4中。
表4
零热量碳酸饮料样品的评价
以上结果表明使用Reb M样品制备的饮料具有最佳的感官特征。
实施例7
减肥饼干
将面粉(50％)、人造黄油(30％)、果糖(10％)、麦芽糖醇(8％)、全脂奶(1％)、盐(0.2％)、烘焙粉(0.15％)、香草(0.1％)和不同的甜菊醇糖苷(0.06％)在面团混合机中充分捏合。将所获得的面团模制并在200℃的烤箱中烘焙15分钟。甜菊醇糖苷由Reb A、蛇菊苷和根据实施例3获得的Reb M样品来代表。
通过20名专家来评价感官特性。在用Reb M制备的样品中获得了最佳结果。专家评价了用Reb M制备的饼干全面和完整的风味特征以及口感。
应当理解本文中之前显示的描述和特定的实施方案只是本发明的最佳方式及其原理的说明，并且通过本领域技术人员可以容易地进行修改和添加，而不脱离本发明的精神和范围，因此不用说本发明只受所附权利要求的范围限制。

Claims (16)

1.用于生产萜烯苷的方法，包括步骤：
a.生产萜烯苷的α-糖基衍生物，其具有至少一个α-糖基残基；
b.将所生产的萜烯苷的α-糖基衍生物水解，以获得萜烯苷。
2.权利要求1的方法，进一步包括步骤：
c.纯化所获得的萜烯苷。
3.权利要求1的方法，其中步骤(a)，通过重组微生物来合成萜烯苷。
4.权利要求1的方法，其中步骤(a)，通过至少一种生物催化剂来合成萜烯苷。
5.权利要求1的方法，其中步骤(a)，通过至少一种酶来合成萜烯苷。
6.权利要求1的方法，其中步骤(a)发生在重组微生物中。
7.权利要求1的方法，其中步骤(a)发生在重组微生物外。
8.权利要求1的方法，其中步骤(a)发生在重组微生物表面上。
9.权利要求1的方法，其中步骤(b)发生在重组微生物外。
10.权利要求1的方法，其中步骤(b)通过将萜烯苷的α-糖基衍生物与至少一种生物催化剂接触来进行。
11.权利要求1的方法，其中步骤(b)通过将萜烯苷的α-糖基衍生物与至少一种酶接触来进行。
12.权利要求1的方法，其中萜烯苷选自甜菊提取物、甜菊醇糖苷、蛇菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷G、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O、杜克苷A、蛇菊双糖苷、悬钩子苷、糖基化甜菊醇糖苷、糖基化甜菊醇糖苷以及甜菊(Stevia rebaudiana)植物中发现的任何其他甜菊醇糖苷，及其混合物。
13.权利要求1的方法，其中萜烯苷选自罗汉果提取物、罗汉果醇糖苷(mogrolglycoside)、罗汉果苷、罗汉果苷I、罗汉果苷II、罗汉果苷II B、罗汉果苷II E、罗汉果苷III、罗汉果苷III A2、罗汉果苷IV、罗汉果苷V、罗汉果苷VI、新罗汉果苷(neomogroside)、光果木鳖皂苷I、赛门苷I、7-氧代-罗汉果苷II E、11-氧代-罗汉果苷A1、11-脱氧-罗汉果苷III、11-氧代罗汉果苷IV A、7-氧代-罗汉果苷V、11-氧代-罗汉果苷V，以及罗汉果(Siraitia grosvenorii)植物中发现的任何其他罗汉果醇糖苷，及其混合物。
14.风味组合物，包含权利要求1的萜烯苷和至少一种选自柠檬、浆果、橙子、水果、香蕉、葡萄、梨、菠萝、芒果、苦杏仁、可乐果、肉桂、糖、棉花糖、香草、萜烯苷、NSF01、NSF02、NSF03、NSF04及其组合的附加风味剂。
15.食品成分，包含权利要求1的萜烯苷和至少一种选自酸化剂、有机酸和氨基酸、着色剂、填充剂、改性淀粉、树胶、组织形成剂、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂、胶凝剂及其组合的附加食品成分。
16.食品、饮料、化妆品、药品或其他消费品，包含权利要求1的萜烯苷。
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