CN115697077A - 莱鲍迪苷m甜味剂组合物 - Google Patents

莱鲍迪苷m甜味剂组合物 Download PDF

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Abstract

本文提供高甜度甜味剂，其包含至少95％的由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株产生的莱鲍迪苷M，所述菌株被改造为当与甘蔗糖浆一起发酵时产生高纯度的莱鲍迪苷M。此外，提供了从澄清的发酵液中纯化高甜度甜味剂的方法。还提供了含有所述高甜度甜味剂的糖替代品及其制备方法。

Description

莱鲍迪苷M甜味剂组合物
技术领域
本公开涉及含有高纯度莱鲍迪苷M的甜味剂组合物及制备所述甜味剂组合物的方法。
背景技术
为了限制高糖消费对健康的影响，人们希望获得来自天然材料的低热量甜味剂。甜叶菊属植物(Stevia rebaudiana属)产生多种称为甜菊醇糖苷的甜味糖基化二萜。在所有已知的甜菊醇糖苷中，莱鲍迪苷M(rebaudioside M)具有最高的效力(比蔗糖甜约300倍)，并且具有最吸引人的风味特性。然而，甜叶菊属植物仅产生微量的莱鲍迪苷M，并且其只占总甜菊醇糖苷含量非常少的一部分(<1.0％)，从而使从甜菊叶中分离莱鲍迪苷M不切实际。因此需要替代方法来获得莱鲍迪苷M。一种此类方法是应用合成生物学来设计从可持续原料来源产生大量莱鲍迪苷M的微生物(例如，酵母)。此外，鉴于莱鲍迪苷M具有高甜度的甜味，需要稀释高甜度甜味而不引入异味的可使用的甜味剂，如含有莱鲍迪苷M的餐桌甜味剂和糖替代品。
发明内容
本文提供包含大于95％的莱鲍迪苷M的高甜度甜味剂、生产所述高甜度甜味剂的方法以及含有所述高甜度甜味剂和一种或多种填充剂的糖替代品。
在一个方面，本发明提供一种纯化的高甜度甜味剂，其含有至少95重量％的莱鲍迪苷M和小于5000ppm的莱鲍迪苷D、小于4000ppm的莱鲍迪苷B和小于2000ppm的莱鲍迪苷A。
在一个实施例中，莱鲍迪苷D小于3200ppm，莱鲍迪苷B小于2000ppm，莱鲍迪苷A小于1000ppm。在另一个实施例中，当量化莱鲍迪苷M时，莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷B和莱鲍迪苷A都低于定量限(LOQ)。在另一个实施例中，使用高效液相色谱(HPLC)测定莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷B和莱鲍迪苷A的含量。
在另一个方面，本发明提供一种含有本文中提供的所述纯化的高甜度甜味剂的餐桌甜味剂。在一个实施例中，所述餐桌甜味剂含有填充剂。在另一个实施例中，所述填充剂选自赤藓糖醇、糊精、菊粉、聚葡萄糖和麦芽糖糊精。
在另一个方面，本发明提供一种含有本文中所述的纯化的高甜度甜味剂的糖替代品。在一个实施例中，所述糖替代品含有一种或多种填充剂。在另一个实施例中，所述填充剂选自赤藓糖醇、可溶性纤维、糊精、菊粉、聚葡萄糖和麦芽糖糊精。在另一个实施例中，所述糖替代品具有按重量计与蔗糖相同的甜度水平。在一个实施例中，所述糖替代品含有约85重量％至约90重量％的赤藓糖醇、约9重量％至约15重量％的可溶性纤维和约0.1％至约1.0％的本文中所述的纯化的高甜度甜味剂。在另一个实施例中，所述糖替代品含有约90重量％的赤藓糖醇、约9.5重量％的可溶性纤维和约0.5％的本文中所述的纯化的高甜度甜味剂。在另一个实施例中，所述可溶性纤维选自β-葡聚糖、葡甘露聚糖、果胶、瓜尔胶、菊粉、低聚果糖、抗消化糊精和聚葡萄糖。在一个优选的实施例中，所述抗消化糊精是NUTRIOSEFM10。在另外的实施例中，所述高甜度甜味剂与一种或多种填充剂聚集。
在另一个方面，本发明提供一种制备所述纯化的高甜度甜味剂的方法，所述方法包括以下步骤：获得包含莱鲍迪苷M的澄清发酵液；采用超滤器过滤所述澄清的发酵液，得到超滤渗透液；采用纳米过滤器过滤所述超滤渗透液，得到纳滤滤过液；洗涤所述纳滤滤过液；和将洗涤后的纳滤滤过液喷雾干燥，得到本文中所述的纯化的高甜度甜味剂。在一个实施例中，所述超滤器的超滤截留分子量为约2kDa至约100kDa。在另一个实施例中，所述超滤器的超滤截留分子量为约20kDa。在又一个实施例中，所述纳米过滤器的纳滤截留分子量为约200Da至约1000Da。在另一个实施例中，所述纳米过滤器的纳滤截留分子量为约300Da至约500Da。在另外的实施例中，将所述澄清发酵液的pH调节为大于pH7。在另一个实施例中，所述澄清发酵液的pH为约pH10。在另外的实施例中，在用酸溶液酸化之后洗涤所述纳滤滤过液。在一个实施例中，所述酸溶液包含柠檬酸。
在另一个方面，本发明提供一种制备所述糖替代品的方法，所述方法包括以下步骤：向混合器中添加第一填充剂；用所述第一填充剂预涂覆所述混合器；添加第二填充剂和本文中所述的纯化的高甜度甜味剂；混合所述第一填充剂、第二填充剂和高甜度甜味剂；向混合物中添加水；混合所述第一填充剂、第二填充剂、高甜度甜味剂和水；以及干燥所述混合物。在一个实施例中，所述第一填充剂是赤藓糖醇。在另一个实施例中，所述第二填充剂是可溶性纤维。在另一个实施例中，所述可溶性纤维是抗消化糊精。在又一个实施例中，所述抗消化糊精是NUTRIOSE FM10。
附图说明
图1是示出从前体法尼基焦磷酸(FPP)到甜菊醇的生化途径的图。
图2是示出从前体类异戊二烯骨架甜菊醇到许多已知的甜菊醇糖苷(包括莱鲍迪苷M)的生化途径图。
图3是示出生产莱鲍迪苷M的发酵过程的放大图。
图4是示出生产包含莱鲍迪苷M的高甜度甜味剂的纯化工艺的流程图。
具体实施方式
本文所述“高甜度甜味剂”是指按重量计至少比蔗糖甜数倍的蔗糖替代品。此外，高甜度甜味剂是低热量或零热量的，不会影响血糖水平。高甜度甜味剂的示例性实例包括植物甜叶菊(Stevia rebaudiana)产生的甜菊醇糖苷。优选的高甜度甜味剂是主要包含甜菊醇糖苷莱鲍迪苷M的一种甜味剂。
本文所述“糖替代品”是指提供类似于蔗糖的甜味但是按重量计包含显著低于蔗糖的热量的食品添加剂。
本文所述“餐桌甜味剂”是指包含高甜度甜味剂的组合物，其被配制为供消费者使用来直接使饮料和食品变甜。
本文所述“填充剂”是指与高甜度甜味剂组合添加到甜味剂制品中来为甜味剂制品提供增加的体积或质量的任意化合物。填充剂的主要功能是稀释所述高甜度甜味剂，使甜味剂制品具有与蔗糖相似的每体积甜度。许多填充剂中的任一种填充剂可与所述高甜度甜味剂组合使用。在一个优选的实施例中，多元醇或糖醇(例如赤藓糖醇)与乙酰磺胺酸钾一起用作填充剂。优选赤藓糖醇，因为它具有非常低的热量含量。此外，赤藓糖醇在小肠中被迅速吸收，因此具有高的消化耐受性。此外，由于赤藓糖醇是一种不影响血清血糖或胰岛素水平的糖醇，因此对糖尿病患者是安全的。
其它可能的填充剂包括两种二糖醇的混合物。这两种二糖醇是葡萄糖-甘露醇和葡萄糖-山梨醇。优选所使用的二糖醇容易获得并且热量值低。此外，优选二糖醇是非致龋的和低血糖的，从而甜味剂不太可能引起蛀牙和影响血糖水平。此外，优选填充剂是白色的、结晶的和无味的，从而得到的甜味剂可以提供尽可能实用的糖替代品。
本文中所述“可溶性纤维”和“可溶性玉米纤维”以及“可溶性小麦纤维”和“抗消化糊精”是指在小肠中抗消化的填充剂，并且当作为糖替代品的组分添加时，使糖替代品在特定烹饪用途(例如烘焙)中表现得像糖一样。示例性的可溶性纤维包括β-葡聚糖、葡甘露聚糖、果胶、瓜尔胶、菊粉、低聚果糖、抗消化糊精和聚葡萄糖。优选的可溶性纤维是抗消化糊精(NUTRIOSE FM10(Roquette))，这是一种葡萄糖聚合物，其与淀粉的不同之处在于，除了(1,4)-和(1,6)-糖苷键之外还具有(1,2)-和(1,3)-糖苷键。
本文中所述术语“介质”是指培养基和/或发酵培养基。
本文中所述术语“产量”通常是指由本文中提供的转基因(geneticallymodified)宿主细胞产生的甜菊醇糖苷的量。在一些实施例中，产量以宿主细胞的甜菊醇糖苷的产率表示。在其它实施例中，产量以产生甜菊醇糖苷的宿主细胞的生产率表示。
本文中所述术语“贝壳杉烯酸”是指化合物贝壳杉烯酸，包括贝壳杉烯酸的任意立体异构体。在优选的实施例中，该术语是指在本领域中已知为对映型贝壳杉烯酸的对映异构体，并且具有以下结构：
Figure GDA0004020161380000041
本文中所述术语“甜菊醇”是指化合物甜菊醇，包括甜菊醇的任意立体异构体。在优选的实施例中，该术语是指具有以下结构的化合物：
Figure GDA0004020161380000051
本文中所述术语“甜菊醇糖苷”是指甜菊醇的糖苷，包括但不限于19-糖苷、甜菊醇单糖苷、甜菊醇二糖苷、甜茶苷、杜克苷B、杜克苷A、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷G、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O、莱鲍迪苷D2和莱鲍迪苷M2。
本文中所述术语“莱鲍迪苷M”或“Reb M”是指具有以下结构的甜菊醇糖苷：
所述高甜度甜味剂是由被改造(engineered)为表达甜菊醇糖苷的宿主细胞的发酵产生的。本发明的宿主细胞经改造以表达将由甘蔗糖浆提供的碳转化为莱鲍迪苷M所必需的酶促途径。有用的酶和编码这些酶的核酸是本领域技术人员已知的。特别有用的酶和核酸在下面的部分中进行了描述，并且在，例如，US2014/0329281A1、US2014/0357588A1、US2015/0159188、WO2016/038095A2和US2016/0198748A1中进一步描述。
在另外的实施例中，宿主细胞还包含一种或多种能够从碳源制备香叶基香叶基二磷酸的酶。这些包括DXP途径的酶和MEV途径的酶。有用的酶和编码所述酶的核酸是本领域技术人员已知的。各个途径的示例性酶在下文描述，并且，例如，在通过引用全部并入本文中的US2016/0177341A1中进一步描述。
在一些实施例中，宿主细胞包含选自以下的一种或多种或全部的类异戊二烯途径酶：(a)缩合两个乙酰辅酶A分子而形成乙酰乙酰-CoA的酶(例如，乙酰-coA硫解酶)；(b)将乙酰乙酰-CoA与另一个乙酰-CoA分子缩合而形成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)的酶(例如，HMG-CoA合酶)；(c)将HMG-CoA转化为甲羟戊酸的酶(例如，HMG-CoA还原酶)；(d)将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸5-磷酸的酶(例如，甲羟戊酸激酶)；(e)将甲羟戊酸5-磷酸转化为甲羟戊酸5-焦磷酸的酶(例如，磷酸甲羟戊酸激酶)；(f)将甲羟戊酸5-焦磷酸转化为异戊烯基二磷酸(IPP)的酶(例如，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶)；(g)将IPP转化为二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的酶(例如，IPP异构酶)；(h)可以将IPP和/或DMAPP分子缩合而形成含有五个以上碳的聚异戊二烯化合物的聚异戊二烯合酶；(i)将IPP与DMAPP缩合而形成香叶基焦磷酸(GPP)的酶(例如，GPP合酶)；(j)将两个IPP分子与一个DMAPP分子缩合的酶(例如，FPP合酶)；(k)将IPP与GPP缩合而形成法呢基焦磷酸(FPP)的酶(例如，FPP合酶)；(l)将IPP和DMAPP缩合而形成香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的酶；和(m)将IPP和FPP缩合而形成GGPP的酶。
在一些实施例中，其它酶是天然的。在有利的实施例中，其它酶是异源的。在一些实施例中，两种或更多种酶可在一个多肽中组合。
细胞株
本文提供的本发明的宿主细胞包括古细菌、原核细胞和真核细胞。
合适的原核宿主细胞包括但不限于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和革兰氏变异菌中的任意一种。实例包括但不限于属于以下属的细胞：农杆菌属(Agrobacterium)、脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)、鱼腥藻属(Anabaena)、倒囊藻属(Anacystis)、节杆菌属(Arhrobacter)、固氮菌属(Azobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、着色菌属(Chromatium)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、席藻属(Phormidium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红细菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红球菌属(Rhodococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、栅藻属(Scenedesmun)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphlococcus)、链霉菌属(Strepromyces)、集球藻属(Synnecoccus)和发酵单胞菌属(Zymomonas)。原核菌株的实例包括但不限于：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacines)、产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)、乳发酵短杆菌(immariophilum)、贝氏梭菌(Clostridium beigerinckii)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、Pseudomonas mevalonii、Pseudomonas pudica、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、宋内志贺菌(Shigellasonnei)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。在一个具体的实施例中，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
合适的古细菌宿主包括但不限于属于以下属的细胞：气火菌属(Aeropyrum)、古丸菌属(Archaeglobus)、盐杆菌属(Halobacterium)、产甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、火球菌属(Pyrococcus)、硫化叶菌属(Sulfolobus)和热原体属(Thermoplasma)。古细菌菌株的实例包括但不限于：闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)、盐杆菌属(Halobacterium sp.)、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、嗜酸热原体菌(Thermoplasma acidophilum)、火山热原体菌(Thermoplasma volcanium)、掘越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、深海热球菌(Pyrococcus abyssi)和敏捷气热菌(Aeropyrumpernix)。
合适的真核宿主包括但不限于真菌细胞、藻类细胞、昆虫细胞和植物细胞。在一些实施例中，可用于本方法的酵母包括已保藏在微生物保藏中心(例如IFO、ATCC等)并且属于以下属的酵母：芽孢酵母属(Aciculoconidium)、神食酵母属(Ambrosiozyma)、节囊酵母属(Arthroascus)、Arxiozyma、阿舒囊霉属(Ashbya)、Babjevia、本森顿酵母属(Bensingtonia)、Botryoascus、Botryozyma、酒香酵母属(Brettanomyces)、布勒掷孢酵母属(Bullera)、布勒担孢酵母属(Bulleromyces)、假丝酵母属(Candida)、固囊酵母属(Citeromyces)、棒孢酵母属(Clavispora)、隐球酵母属(Cryptococcus)、木拉克酵母属(Cystofilobasidium)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、Dekkara、Dipodascopsis、双足囊菌属(Dipodascus)、Eeniella、Endomycopsella、Eremascus、假囊酵母属(Eremothecium)、担孢酵母属(Erythrobasidium)、Fellomyces、线黑粉酵母属(Filobasidium)、半乳糖酵母属(Galactomyces)、地霉属(Geotrichum)、季氏酵母属(Guilliermondella)、孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、汉逊酵母属(Hansenula)、Hasegawaea、胶珊瑚属(Holtermannia)、Hormoascus、生丝毕赤酵母属(Hyphopichia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克勒克酵母属(Kloeckera)、Kloeckeraspora、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、Kondoa、Kuraishia、Kurtzmanomyces、白冬孢酵母属(Leucosporidium)、油脂酵母属(Lipomyces)、路德酵母属(Lodderomyces)、马拉色氏霉菌属(Malasserzia)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、木克拉酵母属(Mrakia)、Myxozyma、拿逊酵母属(Nadsonia)、Nakazawaea、针孢酵母属(Nematospora)、Ogataea、卵孢酵母属(Oosporidium)、管囊酵母属(Pachysolen)、Phachytichospora、法夫酵母属(Phaffia)、毕赤酵母属(Pichia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母菌属(Saccharomyces)、类酵母属(Saccharomycodes)、酵母属(Saccharomycopsis)、Saitoella、坂口酵母属(Sakaguchia)、接合酵母属(Saturnospora)、Schizoblastoporion、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、Sporopachydermia、冠孢酵母属(Stephanoascus)、梗孢酵母属(Sterigmatomyces)、拟梗孢酵母属(Sterigmatosporidium)、Symbiotaphrina、合轴酵母属(Sympodiomyces)、Sympodiomycopsis、孢圆酵母属(Torulaspora)、Trichosporiella、丝孢酵母属(Trichosporon)、三角酵母属(Trigonopsis)、Tsuchiyaea、Udeniomyces、Waltomyces、威克酵母属(Wickerhamia)、拟魏克酵母属(Wickerhamiella)、魏氏酵母属(Williopsis)、接合糖酵母属(Yamadazyma)、耶氏酵母属(Yarrowia)、接合囊酵母属(Zygoascus)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、接合拟威尔酵母属(Zygowilliopsis)和Zygozyma。
在一些实施例中，宿主微生物是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、布鲁塞尔德克酵母(Dekkera bruxellensis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis，以前称为乳酸酵母(Saccharomyces lactis))、马克斯克鲁维酵母(Kluveromyces marxianus)、解腺嘌呤阿氏酵母(Arxula adeninivorans)或多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha，现在已知为安格斯毕赤酵母(Pichia angusta))。在一些实施例中，宿主微生物是假丝酵母属(Candida)的菌株，例如解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、高里假丝酵母(Candidaguilliermondii)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、假热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utils)。
在优选的实施例中，宿主微生物是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施例中，宿主是选自发面酵母、CEN.PK2、CBS 7959、CBS 7960、CBS 7961、CBS 7962、CBS7963、CBS 7964、IZ-1904、TA、BG-1、CR-1、SA-1、M-26、Y-904、PE-2、PE-5、VR-1、BR-1、BR-2、ME-2、VR-2、MA-3、MA-4、CAT-1、CB-1、NR-1、BT-1和AL-1的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株。在一些实施例中，宿主微生物是选自PE-2、CAT-1、VR-1、BG-1、CR-1和SA-1的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。在一个具体的实施例中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株是PE-2。在另一个具体的实施例中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株是CAT-1。在另一个具体的实施例中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株是BG-1。
甜菊醇糖苷的生物合成途径
在一些实施例中，通过对细胞进行改造以表达编码能够催化甜菊醇糖苷的生物合成的酶的多核苷酸，来活化莱鲍迪苷M在转基因宿主细胞中的生物合成途径。
在一些实施例中，转基因宿主细胞含有编码香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)的异源多核苷酸、编码柯巴基焦磷酸合酶(CDPS)的异源多核苷酸、编码贝壳杉烯合酶(KS)的异源多核苷酸、编码贝壳杉烯氧化酶(KO)的异源多核苷酸、编码贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)的异源多核苷酸、编码细胞色素P450还原酶(CPR)的异源多核苷酸、编码UDP-葡萄糖转移酶的异源多核苷酸、编码UGT74G1的异源多核苷酸、编码UGT76G1的异源多核苷酸、编码UGT85C2的异源多核苷酸、编码UGT91D的异源多核苷酸、编码EUGT11的异源多核苷酸或编码UGT40087的异源多核苷酸。在一些实施例中，转基因宿主细胞含有编码变体GGPPS、CDP、KS、KO、KAH、CPR、UDP-葡萄糖转移酶、UGT74G1、UGT76G1、UGT85C2、UGT91D、EUGT11或UGT40087的异源多核苷酸。在一些实施例中，相对于参考酶，变体酶可具有1至20个氨基酸取代。在一些实施例中，多核苷酸的编码序列是针对特定宿主细胞进行优化的密码子。
香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)
香叶基香叶基焦磷酸合酶(EC 2.5.1.29)催化法尼基焦磷酸向香叶基香叶基焦磷酸的转化。香叶基香叶基焦磷酸合酶的实例包括甜叶菊(Stevia rebaudiana)(登录号ABD92926)、藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)(登录号CAA75568)、小家鼠(Musmusculus)(登录号AAH69913)、假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)(登录号XP_002288339)、棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)(登录号ZP-05004570)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfulobus acidocaldarius)(登录号BAA43200)、聚球藻属(Synechococcus sp.)(登录号ABC98596)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(登录号MP_195399)和三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)(登录号AFC92798.1)以及US2014/0329281A1中描述的那些。
柯巴基焦磷酸合酶(CDPS)
柯巴基焦磷酸合酶(EC 5.5.1.13)催化香叶基香叶基二磷酸向柯巴基焦磷酸的转化。柯巴基焦磷酸合酶的实例包括甜叶菊(Stevia rebaudiana)(登录号AAB87091)、棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)(登录号EDY51667)、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobioum japonicum)(登录号AAC28895.1)、玉米(Zea mays)(登录号AY562490)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(登录号NM_116512)和水稻(Oryza sativa)(登录号Q5MQ85.1)以及US2014/0329281A1中描述的那些。
贝壳杉烯合酶(KS)
贝壳杉烯合酶(EC 4.2.3.19)催化柯巴基二磷酸向贝壳杉烯和二磷酸盐的转化。酶的实例包括慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)(登录号AAC28895.1)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(登录号Q9SAK2)和白云杉(Picea glauca)(登录号ADB55711.1)以及US2014/0329281A1中描述的那些。
双官能柯巴基焦磷酸合酶(CDP)和贝壳杉烯合酶(KS)
CDPS-KS双官能酶(EC 5.5.1.13和EC 4.2.3.19)也可用于本发明的宿主细胞中。实例包括桃拟茎点霉(Phomopsis amygdali)(登录号BAG30962)、暗球腔菌属(Phaeosphaeria sp.)(登录号O13284)、小立碗藓(Physcomitrella patens)(登录号BAF61135)，和藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)(登录号Q9UVY5.1)，以及US2014/032928A1、US2014/0357588A1、US2015/0159188和WO2016/038095中所述的那些。
对映型贝壳杉烯氧化酶(KO)
对映型贝壳杉烯氧化酶(EC 1.14.13.88)在本文也称为贝壳杉烯氧化酶，其催化贝壳杉烯向贝壳杉烯酸的转化。酶的示例性实例包括水稻(Oryza sativa)(登录号Q5Z5R4)、藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)(登录号O94142)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)(登录号Q93ZB2)、甜叶菊(Stevia rebaudiana)(登录号AAQ63464.1)和豌豆(Pisum sativum)(Uniprot编号Q6XAF4)，以及US2014/0329281A1、US2014/0357588A1、US2015/0159188和WO2016/038095中所述的那些。
贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)
贝壳杉烯酸羟化酶(EC 1.14.13)也称为甜菊醇合酶，其催化贝壳杉烯酸向甜菊醇的转化。酶的实例包括甜叶菊(Stevia rebaudiana)(登录号ACD93722)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(登录号NP_197872)、葡萄(Vitis vinifera)(登录号XP_002282091)和蒺藜苜蓿(Medicago trunculata)(登录号Q9UVY5.1)，以及US2014/0329281、US2014/0357588、US2015/0159188和WO2016/038095中所述的那些。
细胞色素P450还原酶(CPR)
细胞色素P450还原酶(EC 1.6.2.4)对于以上KO和/或KAH的活性是必需的。酶的实例包括甜叶菊(Stevia rebaudiana)(登录号ABB88839)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(登录号NP_194183)、藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)(登录号CAE09055)和青蒿素(Artemisia annua)(登录号ABC47946.1)，以及US2014/0329281、US2014/0357588、US2015/0159188和WO2016/038095中所述的那些。
UDP糖基转移酶74G1(UGT74G1)
UGT74G1能够用作尿苷5’-二磷酸葡萄糖基：甜菊醇19-COOH转移酶和尿苷5’-二磷酸葡萄糖基：甜菊醇-13-O-葡萄糖苷19-COOH转移酶。因此，UGT74G1能够将甜菊醇转化为19-糖苷；将甜菊醇转化为19-糖苷，将甜菊醇单糖苷转化为甜茶苷；并且将甜菊醇二糖苷转化为甜菊糖苷。UGT74G1已描述于Richman et al.,2005,Plant J.,vol.41,pp.56-67；US2014/0329281；WO2016/038095；登录号AAR06920.1。
UDP糖基转移酶76G1(UGT76G1)
UGT76G1能够将葡萄糖部分转移至受体分子甜菊醇糖苷(其中糖苷＝Glcb(1->2)Glc)的C-3’位置。这种化学可发生在受体分子的C-13-O-连接的葡萄糖或受体分子的C-19-O-连接的葡萄糖处。因此，UGT76G1能够用作尿苷5’-二磷酸葡萄糖基转移酶，将葡萄糖部分转移至：(1)在β键形成Reb B中的甜菊醇二糖苷上的13-O-连接的葡萄糖的C-3’位置，(2)在β键形成Reb A中的甜菊糖苷上的19-O-连接的葡萄糖的C-3’位置，以及(3)在β键形成Reb M中的Reb D上的19-O-连接的葡萄糖的C-3’位置。UGT76G1已描述于Richman et al.,2005,Plant J.,vol.41,pp.56-67；US2014/0329281；WO2016/038095；登录号AAR06912.1。
UDP糖基转移酶85C2(UGT85C2)
UGT85C2能够用作尿苷5’-二磷酸葡萄糖基：甜菊醇13-OH转移酶和尿苷5’-二磷酸葡萄糖基：甜菊醇-19-O-葡萄糖苷13-OH转移酶。UGT85C2能够将甜菊醇转化为甜菊醇单糖苷，还能够将19-糖苷转化为甜茶苷。UGT85C2酶的实例包括甜叶菊(Stevia rebaudiana)的那些酶：例如，参见Richman et al.,(2005),Plant J.,vol.41,pp.56-67；US2014/0329281；WO2016/038095；登录号AAR06916.1。
UDP糖基转移酶91D(UGT91D)
UGT91D能够用作尿苷5’-二磷酸葡萄糖基：甜菊醇-13-O-葡萄糖苷转移酶，将葡萄糖部分转移至受体分子甜菊醇-13-O-葡萄糖苷(甜菊醇单糖苷)的13-O-葡萄糖的C-2’位置，从而产生甜菊醇二糖苷。UGT91D还能够用作尿苷5’-二磷酸葡萄糖基：甜茶苷转移酶，将葡萄糖部分转移至受体分子甜茶苷的13-O-葡萄糖的C-2’位置，从而提供甜菊糖苷。UGT91D也被称为UGT91D2、UGT91D2e或UGT91D-like3。UGT91D酶的实例包括甜叶菊(Steviarebaudiana)的那些酶，例如，参见登录号ACE87855.1；US2014/0329281；以及WO2016/038095。
UDP糖基转移酶40087(UGT40087)
UGT40087能够将葡萄糖部分转移至Reb A的19-O-葡萄糖的C-2’位，从而产生RebD。UGT40087还能够将葡萄糖部分转移至甜菊糖苷的19-O-葡萄糖的C-2’位，从而产生RebE。UGT40087的实例包括登录号XP_004982059.1和WO2018/031955的那些。
能够将Reb A转化为Reb D的另外的尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UGTAD)
除了UGT40087之外，另外的UGTAD能够将葡萄糖部分转移至Reb A的19-O-葡萄糖的C-2’位置，从而产生Reb D。UGTAD还能够将葡萄糖部分转移至甜菊糖苷的19-O-葡萄糖的C-2’位置，从而产生Reb E。UGTAD的实例包括来自水稻(Oryza sativa)的Os_UGT_91C1(也称为EUGT11(参见WO2013/022989，登录号XP_01529141.1))；来自番茄(Solanumlycopersicum)的S1_UGT_101249881(也称为UGTSL2(参见WO2014/193888，登录号XP_0042504851))；sr.UGT_925778；Bd_UGT0840(参见登录号XP_003560669.1)；Hv_UGT_V1(参见登录号BAJ94055.1)；Bd_UGT10850(参见登录号XP_010230871.1)；以及OB_UGT91B1_like(参见登录号XP_0066504551.)。
MEV途径FPP和/或GGPP生产
在一些实施例中，本文提供的转基因宿主细胞包含可用于形成FPP和/或GGPP的一种或多种MEV途径的异源酶。所述一种或多种MEV途径的酶可包括：将乙酰-CoA与丙二酰-CoA缩合而形成乙酰乙酰-CoA的酶；将两分子的乙酰-CoA缩合而形成乙酰乙酰-CoA的酶；将乙酰乙酰-CoA与乙酰-CoA缩合而形成HMG-CoA的酶；或将HMG-CoA转化为甲羟戊酸的酶。此外，转基因宿主细胞可包括：将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸的MEV途径酶；将甲羟戊酸5-磷酸转化为甲羟戊酸5-焦磷酸的MEV途径酶；将甲羟戊酸5-焦磷酸转化为异戊烯焦磷酸的MEV途径酶；或将异戊烯焦磷酸转化为二甲基烯丙基二磷酸的MEV途径酶。具体地说，所述一种或多种MEV途径酶选自乙酰-CoA硫解酶、乙酰乙酰-CoA合成酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶和异戊烯二磷酸：二甲基烯丙基二磷酸异构酶(IDI或IPP异构酶)。本发明的转基因宿主细胞可以从包含一种或多种MEV途径酶的编码序列的一种或多种异源核苷酸序列表达一种或多种MEV的异源酶。
在一些实施例中，转基因宿主细胞包含编码可以将异戊烯焦磷酸(IPP)转化为二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的酶的异源核酸。此外，所述宿主细胞可以含有编码可以缩合IPP和/或DMAPP分子而形成聚异戊二烯基化合物的酶的异源核酸。在一些实施例中，转基因宿主细胞还含有编码可以修饰IPP或聚异戊二烯而形成类异戊二烯化合物(如FPP)的酶的异源核酸。
乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA
转基因宿主细胞可以含有编码将两分子的乙酰辅酶A缩合而形成乙酰乙酰-CoA的酶(乙酰-CoA硫解酶)的异源核酸。编码乙酰-CoA硫解酶的核苷酸序列的实例包括(登录号NC_000913REGION：2324131.2325315(大肠杆菌)(Escherichia coli))；(D49362(脱氮副球菌)(Paracoccus denitrificans))；以及(L20428(酿酒酵母)(Saccharomycescerevisiae))。
乙酰-CoA硫解酶催化两分子的乙酰-CoA的可逆缩合以生成乙酰乙酰-CoA，但该反应在热力学上是不利的；乙酰乙酰-CoA硫解优先于乙酰乙酰-CoA合成。乙酰乙酰-CoA合酶(AACS)(也称为乙酰-CoA：丙二酰-CoA酰基转移酶；EC 2.3.1.194)将乙酰-CoA与丙二酰-CoA缩合而形成乙酰乙酰-CoA。与乙酰-CoA硫解酶相反，由于丙二酰-CoA的相关脱羧作用，AACS催化的乙酰乙酰-CoA合成本质上是一种能量有利的反应。此外，AACS不表现出对乙酰乙酰-CoA的硫解活性，因此该反应是不可逆的。
在表达乙酰-CoA硫解酶和异源ADA和/或磷酸转乙酰酶(PTA)的细胞中，有利于乙酰乙酰-CoA硫解的由乙酰-CoA硫解酶催化的可逆反应会导致大量乙酰-CoA池。鉴于ADA的可逆活性，这种乙酰-CoA池可能反过来推动ADA进行将乙酰-CoA转化为乙醛的逆反应，从而减少ADA对乙酰-CoA生产的益处。同样，PTA的活性是可逆的，因此，大量的乙酰-CoA池可能会促使PTA发生将乙酰-CoA转化为乙酰磷酸的逆反应。因此，在一些实施例中，为了对乙酰-CoA提供强大助力而推动ADA和PTA的正向反应，本文提供的转基因宿主细胞的MEV途径利用乙酰乙酰-CoA合酶，以由乙酰-CoA和丙二酰-CoA形成乙酰乙酰-CoA。
可使用从链霉菌属(Streptomyces sp.)菌株CL190获得的AACS(参见Okamura etal.,(2010),PNAS,vol.107,pp.11265-11270)。来自链霉菌属(Streptomyces sp.)菌株CL190的代表性AACS编码核酸序列包括登录号AB540131.1的序列，并且相应的AACS蛋白序列包括登录号D7URV0和BAJ10048的序列。可用于本发明的其它乙酰乙酰-CoA合酶包括以下的那些：链霉菌属(Streptomyces sp.)(参见登录号AB183750；KO-3988BAD86806；KO-3988AB212624；以及KO-2988BAE78983)；环状链霉菌(S.anulatus)菌株9663(参见登录号FN178498和CAX48662)；游动放线菌属(Actinoplanes sp.)A40644(参见登录号AB113568和BAD07381)；链霉菌属(Streptomyces sp.)C(参见登录号NZ_ACEW010000640和ZP_05511702)；达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)DSM 43111(参见登录号NZ_ABUI01000023和ZP_04335288)；溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)Agy99(参见登录号NC_008611和YP_907152)；海洋分枝杆菌(Mycobacterium marinum)M(参见登录号NC_010612和YP_001851502)；链霉菌属(Streptomyces sp.)MG1(参见登录号NZ_DS570501和ZP_05002626)；链霉菌属(Streptomyces sp.)AA4(参见登录号NZ_ACEV01000037和ZP_05478992)；玫瑰孢链霉菌(S.roseosporus)NRRL 15998(参见登录号NZ_ABYB01000295和ZP_04696763)；链霉菌属(Streptomyces sp.)ACTE(参见登录号NZ_ADFD01000030和ZP_06275834)；产绿色链霉菌(S.viridochromogenes)DSM 40736(参见登录号NZ_ACEZ01000031和ZP_05529691)；弗兰克氏菌属(Frankia sp.)CcI3(参见登录号NC_007777和YP_480101)；巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis)(参见登录号NC_018681和YP_006812440.1)；和龟嗜皮菌(Austwickia chelonae)(参见登录号NZ_BAGZ01000005和ZP_10950493.1)。其它合适的乙酰乙酰-CoA合酶包括美国专利申请公开号2010/0285549和2011/0281315中描述的那些。
也可用于本文提供的组合物和方法的乙酰乙酰-CoA合酶包括那些被认为是本文所述的任何乙酰乙酰-CoA合酶的“衍生物”的分子。这种“衍生物”具有以下特性：(1)其与本文所述的任何乙酰乙酰-CoA合酶具有实质上的同源性；(2)能够催化乙酰-CoA与丙二酰-CoA的不可逆缩合而形成乙酰乙酰-CoA。如果衍生物的氨基酸序列与所述乙酰乙酰-CoA合酶的氨基酸序列至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％相同，则称乙酰乙酰-CoA合酶的衍生物与乙酰乙酰-CoA合酶具有“实质上的同源性”。
乙酰乙酰-CoA转化为HMG-CoA
在一些实施例中，宿主细胞包含编码可以将乙酰乙酰-CoA与另一个乙酰-CoA分子缩合而形成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)的酶(例如HMG-CoA合酶)的异源核苷酸序列。编码这种酶的核苷酸序列的实例包括：(NC_001145.补体19061.20536；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、(X96617；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、(X83882；拟南芥(Arabidopsis thaliana))、(AB037907；灰色北里孢菌(Kitasatosporagriseola))、(BT007302；智人(Homo sapiens))和(NC_002758，基因座标签SAV2546，基因ID1122571；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))。
HMG-CoA转化为甲羟戊酸
在一些实施例中，宿主细胞包含编码可将HMG-CoA转化为甲羟戊酸的酶(例如HMG-CoA还原酶)的异源核苷酸序列。HMG-CoA还原酶可以是使用NADH的羟甲基戊二酰-CoA还原酶-CoA还原酶。HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.34；EC 1.1.1.88)催化(S)-HMG-CoA还原脱酰基为(R)-甲羟戊酸，它可以分为两类：I类HMGr和II类HMGr。I类HMGr包括来自真核生物和大多数古细菌的酶，II类HMGr包括一些原核生物和古细菌的HMG-CoA还原酶。除了序列上的差异之外，这两类酶的辅因子特异性也不同。与仅利用NADPH的I类酶不同，II类HMG-CoA还原酶在区分NADPH和NADH的能力上有所不同(例如，参见Hedl et al.，(2004)Journal ofBacteriology,vol.186,pp.1927-1932)。
可用于本发明的HMG-CoA还原酶包括能够利用NADH作为辅因子的HMG-CoA还原酶，例如，来自P.mevalonii、闪烁古生球菌(A.fulgidus)或金黄色葡萄球菌(S.aureus)的HMG-CoA还原酶。在具体的实施例中，HMG-CoA还原酶仅能够利用NADH作为辅因子，例如，来自P.mevalonii、S.pomeroyi或食酸戴尔福特菌(D.acidovorans)的HMG-CoA还原酶。
在一些实施例中，使用NADH的HMG-CoA还原酶来自Pseudomonas mevalonii。之前已经描述了编码HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)的Pseudomonas mevalonii的野生型mvaA基因的序列(参见Beach and Rodwell,(1989),J.Bacteriol.,vol.171,pp.2994-3001)。Pseudomonas mevalonii的代表性mvaA核苷酸序列包括登录号M24015的序列。Pseudomonasmevalonii的代表性HMG-CoA还原酶蛋白序列包括登录号AAA25837、P13702、MVAA_PSEMV的序列。
在一些实施例中，使用NADH的HMG-CoA还原酶来自Silicibacter pomeroyi。Silicibacter pomeroyi的代表性HMG-CoA还原酶核苷酸序列包括登录号NC_006569.1的序列。Silicibacter pomeroyi的代表性HMG-CoA还原酶蛋白质序列包括登录号YP_164994的序列。
在一些实施例中，使用NADH的HMG-CoA还原酶来自食酸戴尔福特菌(Delftiaacidovorans)。食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans)的代表性HMG-CoA还原酶核苷酸序列包括NC_010002REGION：补体(319980..321269)。食酸戴尔福特菌(Delftiaacidovorans)的代表性HMG-CoA还原酶蛋白质序列包括登录号YP_001561318的序列。
在一些实施例中，使用NADH的HMG-CoA还原酶来自马铃薯(Solanum tuberosum)(参见Crane et al.,(2002),J.Plant Physiol.,vol.159,pp.1301-1307)。
可用于本发明实践中的使用NADH的HMG-CoA还原酶还包括被称为本文所述任意的使用NADH的HMG-CoA还原酶的“衍生物”的那些分子，例如，来自P.mevalonii、S.pomeroyi和食酸戴尔福特菌(D.acidovorans)。这种“衍生物”具有以下特性：(1)它与本文所述的任意的使用NADH的HMG-CoA还原酶具有实质上的同源性；(2)能够催化(S)-HMG-CoA还原脱酰基为(R)-甲羟戊酸，同时优先使用NADH作为辅因子。如果衍生物的氨基酸序列与所述使用NADH的HMG-CoA还原酶的氨基酸序列至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％相同，则称使用NADH的HMG-CoA还原酶的衍生物与使用NADH的HMG-CoA还原酶具有“实质上的同源性”。
本文所述短语“使用NADH”是指使用NADH的HMG-CoA还原酶对作为辅因子的NADH的选择性高于NADPH，例如，对NADH的比活性高于对NADPH的比活性。对作为辅因子的NADH的选择性表示为kcat(NADH)/kcat(NADPH)比。本发明的使用NADH的HMG-CoA还原酶的kcat(NADH)/kcat(NADPH)比为至少5、10、15、20、25或大于25。使用NADH的HMG-CoA还原酶可仅使用NADH。例如，仅使用NADH的使用NADH的HMG-CoA还原酶在体外以NADH作为唯一辅因子提供时表现出一些活性，并且当NADPH作为唯一辅因子提供时未表现出可检测到的活性。本领域已知的用于测定辅因子特异性的任何方法可用于鉴定优选NADH作为辅因子的HMG-CoA还原酶(例如，参见(Kim et al.,(2000),Protein Science,vol.9,pp.1226-1234)和(Wilding et al.,(2000),J.Bacteriol.,vol.182,pp.5147-5152)。
在一些情况下，使用NADH的HMG-CoA还原酶，例如，通过辅因子结合口袋的定向诱变而被改造为对NADH的选择性高于NAPDH。用于改造NADH-选择性的方法在(Watanabe etal.,(2007),Microbiology,vol.153,pp.3044-3054)中进行了描述，并且测定HMG-CoA还原酶的辅因子特异性的方法在(Kim et al.,(2000),Protein Sci.,vol.9,pp.1226-1234)中进行了描述。
使用NADH的HMG-CoA还原酶可以源自天然包含甲羟戊酸降解途径的宿主物种，例如，分解代谢甲羟戊酸作为其唯一碳源的宿主物种。在这些情况下，通常在其天然宿主细胞内催化内化的(R)-甲羟戊酸氧化酰化为(S)-HMG-CoA的使用NADH的HMG-CoA还原酶被用来催化逆反应，即，在包含甲羟戊酸生物合成途径的转基因宿主细胞中将(S)-HMG-CoA还原脱酰化为(R)-甲羟戊酸。能够以甲羟戊酸作为其唯一碳源生长的原核生物在以下文献中进行了描述：(Anderson et al.,(1989),J.Bacteriol,vol.171,pp.6468-6472)；(Beach etal.,(1989),J.Bacteriol.,vol.171,pp.2994-3001)；Bensch et al.,J.Biol.Chem.,vol.245,pp.3755-3762)；(Fimongnari et al.,(1965),Biochemistry,vol.4,pp.2086-2090)；Siddiqi etal.,(1962),Biochem.Biophys.Res.Commun.,vol.8,pp.110-113)；(Siddiqi et al.,(1967),J.Bacteriol.,vol.93,pp.207-214)和(Takatsuji et al.,(1983),Biochem.Biophys.Res.Commun.,vol.110,pp.187-193)。
宿主细胞可以同时含有使用NADH的HMGr和使用NADPH的HMG-CoA还原酶两者。编码使用NADPH的HMG-CoA还原酶的核苷酸序列的实例包括：(NM_206548；黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster))、(NC_002758，基因座标签SAV2545、基因ID 1122570；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、(AB015627；链霉菌属(Streptomyces sp.)KO3988)、(AX128213，提供编码截短的HMG-CoA还原酶的序列；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))和(NC_001145：补体(115734.118898；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))。
甲羟戊酸转化为甲羟戊酸-5-磷酸
宿主细胞可以含有编码可以将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸5-磷酸的酶(例如，甲羟戊酸激酶)的异源核苷酸序列。编码这种酶的核苷酸序列的示例性实例包括：(L77688；拟南芥(Arabidopsis thaliana))和(X55875；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。
甲羟戊酸-5-磷酸转化为甲羟戊酸-5-焦磷酸
宿主细胞可以含有编码可以将甲羟戊酸-5-磷酸转化为甲羟戊酸-5-焦磷酸的酶(例如，磷酸甲羟戊酸激酶)的异源核苷酸序列。编码这种酶的核苷酸序列的示例性实例包括：(AF429385；橡胶树(Hevea brasiliensis))、(NM_006556；智人(Homo sapiens))和(NC_001145.补体712315.713670；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。
甲羟戊酸-5-焦磷酸转化为IPP
宿主细胞可以含有编码可以将甲羟戊酸-5-焦磷酸转化为异戊烯二磷酸(IPP)的酶(例如，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶)的异源核苷酸序列。编码这种酶的核苷酸序列的示例性实例包括：(X97557；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、(AF290095；屎肠球菌(Enterococcus faecium))和(U49260；智人(Homo sapiens))。
IPP转化为DMAPP
宿主细胞可以含有编码可以将通过MEV途径产生的IPP转化为二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的酶(例如，IPP异构酶)的异源核苷酸序列。编码这种酶的核苷酸序列的示例性实例包括：(NC_000913，3031087.3031635；大肠杆菌(Escherichia coli))和(AF082326；雨生红球藻(Haematococcus pluvialis))。
聚异戊二烯合酶
在一些实施例中，宿主细胞还包含编码可以缩合IPP和/或DMAPP分子而形成含有五个以上碳的聚异戊二烯化合物的聚异戊二烯合酶的异源核苷酸序列。
宿主细胞可含有编码可将一分子IPP与一分子DMAPP缩合而形成一分子香叶基焦磷酸(“GPP”)的酶(例如，GPP合酶)的异源核苷酸序列。编码这种酶的核苷酸序列的非限制性实例包括：(AF513111；北美冷杉(Abies grandis))、(AF513112；北美冷杉(Abiesgrandis))、(AF513113；北美冷杉(Abies grandis))、(AY534686；金鱼草(Antirrhinummajus))、(AY534687；金鱼草(Antirrhinum majus))、(Y17376；拟南芥(Arabidopsis thaliana))、(AE016877、基因座AP11092；蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)；ATCC 14579)、(AJ243739；甜橙(Citrus sinensis))、(AY534745；仙女扇(Clarkiabreweri))、(AY953508；松小蠹(Ips pini))、(DQ286930；番茄(Lycopersiconesculentum))、(AF182828；胡椒薄荷(Mentha x piperita))、(AF182827；胡椒薄荷(Menthax piperita))、(MPI249453；胡椒薄荷(Mentha x piperita))、(PZE431697、基因座CAD24425；产玉米素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)、(AY866498；库洛胡黄连(Picrorhiza kurrooa)、(AY351862；葡萄(Vitis vinifera))和(AF203881，基因座AAF12843；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis))。
宿主细胞可含有编码可将两分子IPP与一分子DMAPP缩合，或将一分子IPP加成到一分子GPP而形成一分子法呢基焦磷酸(“FPP”)的酶(例如，FPP合酶)的异源核苷酸序列。编码FPP合酶的核苷酸序列的非限制性实例包括：(ATU80605；拟南芥(Arabidopsisthaliana))、(ATHFPS2R；拟南芥(Arabidopsis thaliana))、(AAU36376；青蒿素(Artemisiaannua))、(AF461050；普通牛(Bos taurus))、(D00694；大肠杆菌(Escherichia coli)K-12)、(AE009951，基因座AAL95523；具核梭杆菌具核亚种(Fusobacterium nucleatumsubsp.nucleatum)ATCC 25586)、(GFFPPSGEN；藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi))、(CP000009，基因座AAW60034；氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)621H)、(AF019892；向日葵(Helianthus annuus))、(HUMFAPS；智人(Homo sapiens))、(KLPFPSQCR；乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis))、(LAU15777；白羽扇豆(Lupinus albus))、(LAU20771；白羽扇豆(Lupinus albus))、(AF309508；小家鼠(Mus musculus))、(NCFPPSGEN；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))、(PAFPS1；灰白银胶菊(Parthenium argentatum))、(PAFPS2；灰白银胶菊(Parthenium argentatum))、(RATFAPS；褐家鼠(Rattus norvegicus))、(YSCFPP；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、(D89104；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe))、(CP000003，基因座AAT87386；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))、(CP000017，基因座AAZ51849；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))、(NC_008022，基因座YP_598856；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)MGAS10270)、(NC_008023，基因座YP_600845；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)MGAS2096)、(NC_008024，基因座YP_602832；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)MGAS10750)、(MZEFPS；玉米(Zea mays))、(AE000657，基因座AAC06913；风产液菌(Aquifex aeolicus)VF5)、(NM_202836；拟南芥(Arabidopsis thaliana))、(D84432，基因座BAA12575；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))、(U12678，基因座AAC28894；慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA 110)、(BACFDPS；嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus))、(NC_002940，基因座NP_873754；杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)35000HP)、(L42023，基因座AAC23087；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)Rd KW20)、(J05262；智人(Homosapiens))、(YP_395294；清酒乳酸杆菌清酒亚种(Lactobacillus sakei subsp.sakei)23K)、(NC_005823，基因座YP_000273；问号钩端螺旋体哥本哈根型(Leptospirainterrogans serovar Copenhageni)Fiocruz菌株L1-130)、(AB003187；藤黄微球菌(Micrococcus luteus))、(NC_002946，基因座YP_208768；淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)FA 1090)、(U00090，基因座AAB91752；根瘤菌属(Rhizobium sp.)NGR234)、(J05091；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae))、(CP000031，基因座AAV93568；Silicibacter pomeroyi DSS-3)、(AE008481，基因座AAK99890；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)R6)和(NC_004556，基因座NP779706；苛养木杆菌(Xylellafastidiosa)Temecula1)。
此外，宿主细胞可含有编码可将IPP和DMAPP，或IPP和FPP结合而形成香叶基香叶基焦磷酸(“GGPP”)的酶的异源核苷酸序列。编码这种酶的核苷酸序列的非限制性实例包括：(ATHGERPYRS；拟南芥(Arabidopsis thaliana))，(BT005328；拟南芥(Arabidopsisthaliana))，(NM_119845；拟南芥(Arabidopsis thaliana))，(NZ_AAJM01000380，基因座ZP_00743052；苏云金芽孢杆菌以色列血清型(Bacillus thuringiensis serovarisraelensis)，ATCC 35646sq1563)，(CRGGPS；长春花(Catharanthus roseus))，(NZ_AABF02000074，基因座ZP_00144509；具核梭杆菌文森亚种(Fusobacterium nucleatumsubsp.vincentii)，ATCC 49256)，(GFGGPSGN；藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi))，(AY371321；银杏(Ginkgo biloba))，(AB055496；橡胶树(Hevea brasiliensis))，(AB017971；智人(Homo sapiens))，(MCI276129；卷枝毛霉菌拉斯坦变种(Mucorcircinelloides f.lusitanicus))，(AB016044；小家鼠(Mus musculus))，(AABX01000298，基因座NCU01427；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))，(NCU20940；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa))，(NZ_AAKL01000008，基因座ZP_00943566；青枯菌(Ralstonia solanacearum)UW551)，(AB118238；褐家鼠(Rattus norvegicus))，(SCU31632；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))，(AB016095；细长聚球藻(Synechococcus elongates))，(SAGGPS；白芥子(Sinapis alba))，(SSOGDS；嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius))，(NC_007759，基因座YP_461832；嗜酸热互营菌(Syntrophus aciditrophicus)SB)，(NC_006840，基因座YP_204095；费氏弧菌(Vibrio fischeri)ES114)，(NM_112315；拟南芥(Arabidopsisthaliana))，(ERWCRTE；成团泛菌(Pantoea agglomerans))，(D90087，基因座BAA14124；菠萝泛菌(Pantoea ananatis))，(X52291，基因座CAA36538；荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus))，(AF195122，基因座AAF24294；球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides))，和(NC_004350，基因座NP_721015；变形链球菌(Streptococcus mutans)UA159)。
虽然上文描述了甲羟戊酸途径的酶的实例，但在一些实施例中，DXP途径的酶可用作替代或额外的途径，以在本文所述的宿主细胞、组合物和方法中产生DMAPP和IPP。DXP途径的酶和编码酶的核酸是公知的，并且在本领域例如WO 2012/135591中进行了表征。
制备莱鲍迪苷M的方法
本发明提供通过以下方法制备包含大于95％的莱鲍迪苷M的高甜度甜味剂：(a)在适合制备莱鲍迪苷M的条件下，在具有碳源的培养基中培养能够产生莱鲍迪苷M的本文所述的任意转基因宿主细胞群，和(b)从所述培养基中回收纯度大于95％的莱鲍迪苷M。
与不具有遗传修饰的亲本细胞或仅具有遗传修饰的子集但在其他方面遗传上相同的亲本细胞相比，转基因宿主细胞产生增加的量的莱鲍迪苷M。在一些实施例中，宿主细胞可产生较高水平的莱鲍迪苷M，大于约1克/升发酵培养基。在一些实施例中，宿主细胞产生较高水平的莱鲍迪苷M，大于约5克/升发酵培养基。在一些实施例中，宿主细胞产生较高水平的莱鲍迪苷M，大于约10克/升发酵培养基。在一些实施例中，莱鲍迪苷M的产量为约10至约50克/升细胞培养基、约10至约15克/升细胞培养基、大于约15克/升细胞培养基、大于约20克/升细胞培养基、大于约25克/升细胞培养基或大于约40克/升细胞培养基。
在一些实施例中，宿主细胞产生较高水平的莱鲍迪苷M，大于约50毫克/克干细胞重量。在一些此类实施例中，莱鲍迪苷M的产量为约50至约1500毫克/克干细胞重量、大于约100毫克/克干细胞重量、大于约150毫克/克干细胞重量、大于约200毫克/克干细胞重量、大于约250毫克/克干细胞重量、大于约500毫克/克干细胞重量、大于约750毫克/克干细胞重量或大于约1000毫克/克干细胞重量。
在大多数实施例中，可通过诱导化合物的存在来诱导宿主细胞产生较高水平的莱鲍迪苷M。这种宿主细胞可在不存在诱导化合物的情况下容易地操纵。然后加入诱导化合物，诱导宿主细胞产生较高水平的莱鲍迪苷M。在其它实施例中，通过改变培养条件(例如生长温度、培养基成分等)来诱导宿主细胞产生较高水平的甜菊醇糖苷。
培养基和条件
用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是微生物学或发酵科学领域的技术人员公知的(例如，参见Bailey et al.,Biochemical Engineering Fundamentals,second edition,McGraw Hill,New York,1986)。根据宿主细胞、发酵和过程的具体要求，必须考虑适当的培养基、pH值、温度以及对需氧、微需氧或厌氧条件的要求。
本文提供的制备莱鲍迪苷M的方法可以在合适的容器中在合适的培养基(例如，添加或不添加泛酸盐补充剂)中进行，所述合适的容器包括但不限于细胞培养板、微量滴定板、烧瓶或发酵罐。此外，所述方法可在本领域已知的任意发酵规模下进行，以支持微生物产品的工业生产。可使用任意合适的发酵罐，包括搅拌罐发酵罐、气升式发酵罐、气泡发酵罐或它们的任意组合。在利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为宿主细胞的具体实施例中，菌株可在发酵罐中生长，如Kosaric等在Ullmann's Encyclopedia ofIndustrial Chemistry,Sixth Edition,vol.12,pp.398-473,Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KDaA,Weinheim,Germany中详细所述。
在一些实施例中，培养基是能够产生莱鲍迪苷M的转基因微生物可以在其中生存的任意培养基。所述培养基可以是包含可同化碳源、氮源和磷酸盐源的水性培养基。这种培养基还可以包括适当的盐、矿物质、金属和其他营养物。可以将碳源和各个必需的细胞营养物逐渐或连续地添加到发酵培养基中，并且各个所需的营养物可以，例如，根据基于将碳源转化为生物质的细胞的代谢或呼吸功能的预定细胞生长曲线，基本上维持在细胞生长的有效同化所需的最低水平。
培养微生物的合适条件和合适培养基是本领域公知的。例如，合适的培养基可用一种或多种另外的试剂补充，例如，诱导剂(例如，当编码基因产物的一种或多种核苷酸序列在诱导型启动子的控制下时)、阻遏剂(例如，当一个或多个编码基因产物的核苷酸序列在抑制型启动子的控制下时)或选择剂(例如，用于选择包含遗传修饰的微生物的抗生素)。
碳源可以是单糖、二糖、多糖、非发酵性碳源或它们的一种或多种组合。合适的单糖的非限制性实例包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖、核糖及它们的组合。合适的二糖的非限制性实例包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖及它们的组合。合适的多糖的非限制性实例包括淀粉、糖原、纤维素、壳质及它们的组合。合适的非发酵性碳源的非限制性实例包括乙酸酯和甘油。
培养基中的碳源(例如葡萄糖)的浓度可足以促进细胞生长，但是不太高以抑制所使用的微生物的生长。通常，在培养物中加入碳源，例如葡萄糖，以达到期望的生长和生物质水平。培养基中的碳源(例如葡萄糖)的浓度可大于约1g/L，优选大于约2g/L，更优选大于约5g/L。此外，培养基中的碳源(例如葡萄糖)的浓度通常小于约100g/L，优选小于约50g/L，更优选小于约20g/L。应注意的是，培养物组分浓度可指初始和/或持续组分浓度两者。在一些情况下，可能需要允许培养基在培养期间耗尽碳源。
可在合适的培养基中使用的可同化氮源包括简单氮源、有机氮源和复合氮源。这种氮源包括无水氨、铵盐以及动物、植物和/或微生物来源的物质。合适的氮源包括蛋白质水解物、微生物生物质水解物、蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、尿素和氨基酸。通常，培养基中氮源的浓度大于约0.1g/L，优选大于约0.25g/L，更优选大于约1.0g/L。然而，超过一定浓度时，向培养基中添加氮源并不利于微生物的生长。因此，培养基中氮源的浓度小于约20g/L，优选小于约10g/L，更优选小于约5g/L。此外，在一些情况下，可能需要允许培养基在培养期间耗尽氮源。
有效培养基可含有其它化合物，例如无机盐、维生素、微量金属或生长促进剂。所述其它化合物也可存在于有效培养基中的碳源、氮源或矿物质源中，或可专门添加至培养基中。
培养基还可含有合适的磷酸盐源。所述磷酸盐源包括无机磷酸盐源和有机磷酸盐源两者。优选的磷酸盐源包括磷酸盐，例如磷酸二氢钠或磷酸氢二钠、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾、磷酸铵及它们的混合物。通常，培养基中磷酸盐的浓度大于约1.0g/L，优选大于约2.0g/L，更优选大于约5.0g/L。然而，超过一定浓度时，向培养基中添加磷酸盐并不利于微生物的生长。因此，培养基中磷酸盐的浓度通常小于约20g/L，优选小于约15g/L，更优选小于约10g/L。
合适的培养基还可以包括镁源，优选是生理上可接受的盐形式，例如七水硫酸镁，尽管可以使用提供相似量的镁的浓度的其他镁源。通常，培养基中镁的浓度大于约0.5g/L，优选大于约1.0g/L，更优选大于约2.0g/L。然而，超过一定浓度时，向培养基中添加镁并不利于微生物的生长。因此，培养基中镁的浓度通常小于约10g/L，优选小于约5g/L，更优选小于约3g/L。此外，在一些情况下，可能需要允许培养基在培养期间耗尽镁源。
培养基还可包括生物学上可接受的螯合剂，例如柠檬酸三钠的二水合物。在这种情况下，培养基中螯合剂的浓度大于约0.2g/L，优选大于约0.5g/L，更优选大于约1g/L。然而，超过一定浓度时，向培养基中添加螯合剂并不利于微生物的生长。因此，培养基中螯合剂的浓度通常小于约10g/L，优选小于约5g/L，更优选小于约2g/L。
培养基还可初始包含生物学上可接受的酸或碱以维持培养基所需的pH值。生物学上可接受的酸包括但不限于盐酸、硫酸、硝酸、磷酸及它们的混合物。生物学上可接受的碱包括但不限于氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾及它们的混合物。在一些实施例中，所使用的碱是氢氧化铵。
培养基还可包括生物学上可接受的钙源，包括但不限于氯化钙。通常，培养基中钙源(例如氯化钙二水合物)的浓度在约5mg/L至约2000mg/L的范围内，优选在约20mg/L至约1000mg/L的范围内，更优选在约50mg/L至约500mg/L的范围内。
培养基还可包括氯化钠。通常，培养基中氯化钠的浓度在约0.1g/L至约5g/L的范围内，优选在约1g/L至约4g/L的范围内，更优选在约2g/L至约4g/L的范围内。
培养基还可包括微量金属。所述微量金属可作为储备溶液添加至培养基中，为方便起见，所述储备溶液可与培养基的其余部分分开制备。通常，添加到培养基中的所述微量金属溶液的量大于约1ml/L，优选大于约5ml/L，更优选大于约10ml/L。然而，超过一定浓度时，向培养基中添加微量金属并不利于微生物的生长。因此，添加到培养基中的所述微量金属溶液的量通常小于约100mL/L，优选小于约50mL/L，更优选小于约30mL/L。应注意的是，除了在储备溶液中添加微量金属之外，可单独添加单个组分，每种组分的浓度均在上述微量金属溶液的范围所规定的各组分浓度独立对应的范围内。
培养基可包括其它维生素，例如泛酸盐、生物素、钙、泛酸盐、肌醇、吡哆醇-HCl和硫胺素-HCl。所述维生素可作为储备溶液添加至培养基中，为方便起见，所述储备溶液可与培养基的其余部分分开制备。然而，超过一定浓度时，向培养基中添加维生素不利于微生物的生长。
本文所述的发酵方法可在常规培养模式下进行，包括但不限于分批、分批补料、细胞循环、连续和半连续模式。在一些实施例中，发酵以分批补料模式进行。在这种情况下，培养基的一些组分在培养期间耗尽，包括在发酵的生产阶段的泛酸盐。在一些实施例中，培养物可在例如生产阶段开始时补充相对高浓度的此类组分，从而在需要添加之前支持生长和/或甜菊醇糖苷生产一段时间。这些组分的优选范围在整个培养过程中随着其被培养物耗尽而进行添加来得以维持。培养基中各组分的含量可通过，例如，定期对培养基采样和测定浓度来监测。或者，一旦建立标准培养程序，可以在整个培养过程中的特定时间以对应于已知含量的时间间隔进行添加。正如本领域技术人员将认识到的那样，培养期间营养物质的消耗速率随着培养基的细胞密度的增加而增加。此外，正如本领域已知的那样，为了避免将外来微生物引入到培养基中，使用无菌添加方法进行添加。此外，可在培养期间添加消泡剂。
培养基的温度可以是适合于转基因细胞生长和/或产生甜菊醇糖苷的任意温度。例如，在用接种体接种培养基之前，培养基可以被带到并维持在约20℃至约45℃的范围内的温度，优选约25℃至约40℃的范围内的温度，更优选约28℃至约32℃的范围内的温度。所述培养基的pH可通过向所述培养基中添加酸或碱来控制。在这种情况下，当使用氢氧化铵来控制pH时，其还方便地充当培养基的氮源。优选pH保持在约3.0至约8.0，更优选约3.5至约7.0，最优选约4.0至约6.5。
在培养期间监测所述培养基的碳源浓度，例如葡萄糖浓度。可使用已知技术来监测培养基的葡萄糖浓度，例如使用葡萄糖氧化酶测试或高压液相色谱法，其可用于监测上清液(例如培养基的无细胞组分)中的葡萄糖浓度。碳源浓度通常维持在发生细胞生长抑制的水平以下。虽然这种浓度会因生物体而异，但是对于作为碳源的葡萄糖来说，细胞生长抑制在葡萄糖浓度大于约60g/L时发生，并且可容易地通过试验来确定。因此，当葡萄糖用作碳源时，葡萄糖优选被馈送到发酵罐并且维持在低于检测限。或者，培养基中的葡萄糖的浓度维持在约1g/L至约100g/L的范围内，更优选在约2g/L至约50g/L的范围内，并且还更优选在约5g/L至约20g/L的范围内。尽管碳源浓度可通过添加，例如，基本上纯的葡萄糖溶液来维持在所需水平内，但通过添加原始培养基的等分试样来维持培养基的碳源浓度是可接受的并且是优选的。使用原始培养基的等分试样是可取的，因为这样可同时维持培养基中其他营养物质(例如氮源和磷酸盐源)的浓度。同样，可以通过添加微量金属溶液的等分试样来维持培养基中的微量金属的浓度。
其他合适的发酵培养基和方法在，例如，WO 2016/196321中进行了描述。
甜菊醇糖苷的回收
一旦由宿主细胞产生甜菊醇糖苷，就可以使用本领域已知的任何合适的分离和纯化方法对其进行回收或分离，以供后续使用。例如，可以通过离心将含有甜菊醇糖苷的澄清水相从发酵中分离出来。或者，可通过在发酵反应中加入反乳化剂，将含有甜菊醇糖苷的澄清水相从发酵中分离出来。反乳化剂的实例包括絮凝剂和凝结剂。
宿主细胞中产生的甜菊醇糖苷可能存在于培养上清液中和/或与宿主细胞结合。当一部分甜菊醇糖苷与宿主细胞结合时，甜菊醇糖苷的回收会涉及改善甜菊醇糖苷从细胞中释放的方法。这可以采取用热水或缓冲液处理洗涤细胞的形式，可以使用或不使用表面活性剂，加入或不加入缓冲液或盐。温度可以是被认为是适合释放甜菊醇糖苷的任意温度。例如，温度可在40℃至95℃；或60℃至90℃；或75℃至85℃的范围内。或者，温度可以是40℃、45℃、50℃、55℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃或95℃。可以使用物理或化学细胞破坏来增强甜菊醇糖苷从宿主细胞的释放。可替代地和/或随后，培养基中的甜菊醇糖苷可以使用分离单元操作来回收，包括溶剂萃取、膜澄清、膜浓缩、吸附、色谱、蒸发、化学衍生化、结晶和干燥。
在优选的实施例中，在发酵过程中由宿主细胞产生莱鲍迪苷M。发酵结束之后，将发酵液离心以去除宿主细胞和其他致密碎片。然后用水稀释澄清的发酵液，并通过添加NaOH将pH调节至pH 10。然后采用20kDa的截留分子量为对澄清的发酵液进行超滤，以将大溶质与小的甜菊醇糖苷分离。将滤液用柠檬酸调节pH，并且用300至500Da的过滤器进行纳滤。纳滤浓缩莱鲍迪苷M，然后将所述莱鲍迪苷M从溶液中结晶出来，以形成酸性浆料。然后将酸性浆料进行第一压滤，并用酸洗涤。将酸洗后的材料进行第二压滤，重新悬浮在水中，并喷雾干燥，以形成最终纯化的莱鲍迪苷M。
实施例
实施例1：能够产生莱鲍迪苷M的酵母菌株
制备能够产生高含量的莱鲍迪苷M的酵母菌株。通过在GAL1或GAL10启动子的控制下表达甲羟戊酸途径的基因，从野生型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株(CEN.PK2)中产生法尼烯生产菌株。该菌株包括来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的以下染色体整合的甲羟戊酸途径基因：乙酰-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶和IPPDMAPP异构酶。此外，所述菌株含有来自青蒿素(Artemisia annua)的多个拷贝的法尼烯合酶，同样受GAL1或GAL10启动子的控制。本文所述的所有异源基因是使用公开可获得的或其它合适的算法进行优化的密码子。所述菌株还含有GAL80基因的缺失，并且编码角鲨烯合酶的ERG9基因通过用酵母基因MET3的启动子替换天然启动子而被下调(Westfall et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109(3),2012,pp.E111-E118)。如何产生具有高通量类异戊二烯的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株的实例在美国专利第8,415,136号和美国专利第8,236,512号中进行了描述，它们的全部内容并入本发明中。
图1示出了从FPP到甜菊醇的示例性生物合成途径。图2示出了从甜菊醇到糖苷RebM的示例性生物合成途径。为了将上述法尼烯碱株转化为具有高通量的C20类异戊二烯贝壳杉烯，将四个拷贝的香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)整合到基因组中，然后整合两个拷贝的柯巴基焦磷酸合酶和一个拷贝的贝壳杉烯合酶。此时，从所述菌株中除去法尼烯合酶的所有拷贝。一旦新菌株被证实制备了对映型贝壳杉烯，则将剩余的将对映型贝壳杉烯转化为Reb M的基因插入到基因组中。表1列出了用于将FPP转化为Reb M的所有基因和启动子。除了整合了两个基因拷贝的Sr.KAH酶之外，贝壳杉烯合酶之后的每个基因都以单个拷贝整合。含有表1所述所有基因的菌株主要产生Reb M。
表1.用于将FPP转化为Reb M的酶的基因、启动子和氨基酸序列
Figure GDA0004020161380000301
1前65个氨基酸被去除并替换为蛋氨酸
实施例2：莱鲍迪苷M的发酵工艺
获得含RebM的发酵液的发酵工艺由图3所示的步骤组成。每个步骤都为酵母的生长和生产提供了适当的pH、温度、通气和营养条件。每个步骤的主要条件总结在表2中，并在下面进行更详细的描述。
所述工艺从储存在-70℃的甘油溶液中的酵母储备开始。为了积累足够的生物量来接种生产发酵罐，在烧瓶中培养有2个步骤，在罐中培养有2个步骤。所有发酵罐均使用培养基(营养溶液)启动，并接种上一步的培养物。以分批或分批补料工艺来提供来自甘蔗的浓缩糖料溶液，以使酵母生长和/或产生RebM。主发酵罐(MF)中的进料旨在保持发酵限糖，由于生产阶段过程较长(8天)，因此，用溶解氧峰值检查单元以脉冲形式输送，最终在第8天收获，并且罐几乎连续进料，体积增加，并进行了部分抽样。从部分抽样和收获物中收集的所有发酵液通过分离和纯化单元进行处理，得到最终纯化的RebM。
表2–生产含RebM发酵液的发酵过程中各个步骤的操作条件
Figure GDA0004020161380000311
实施例3：莱鲍迪苷M的纯化工艺
图4和表3概述了RebM的整体纯化方案。纯化工艺从向发酵液中加入水开始，然后加热到75℃至80℃以完全溶解RebM。然后将稀释的发酵液离心，以将生物质和固体与含有RebM的上清相(澄清的发酵液)分离。离心后，使用截留分子量为20kDa的过滤器对澄清的发酵液进行超滤。超滤从含有RebM的渗透物中去除大的和难溶解的底物。然后通过截留分子量为300至500Da的过滤系统进行纳滤来处理渗透物。纳滤步骤截留并浓缩RebM，同时使得去除水和一价盐。在纳滤期间，产生富含RebM的浆料。通过第一压滤机收集浆料。然后通过添加含有柠檬酸(pH为3至4)的洗涤溶液洗涤收集的浆料，随后通过第二压滤机，以从酸性洗涤溶液中除去固体RebM。将来自第一压滤机和第二压滤机的湿饼喷雾干燥，得到粉末。通过HPLC和质谱分析纯化的RebM粉末的三个单独样品，以测定其甜菊醇糖苷杂质分布，如表4中所示。具体地说，在第一压滤机之后获得两个样品(列1aFP-5和列1aFP-6)，在第二压滤机之后获得第三个样品(2aFP-1)。如表中所示，所有三个样品都含有以干物质重量计大于95％的莱鲍迪苷M，并且莱鲍迪苷M占总甜菊醇糖苷(TSG)的含量大于99％。
表3：单元操作及其预期功能清单
Figure GDA0004020161380000321
表4：干燥的纯化的高甜度甜味剂的组成。
Figure GDA0004020161380000331
实施例4：糖替代品
制备含有90％的赤藓糖醇、9.5％的可溶性纤维(Roquette NUTRIOSE FM10)和0.5％的纯化莱鲍迪苷M的糖替代品。简而言之，获得110磅的赤藓糖醇、11.6磅的可溶性纤维(Roquette NUTRIOSE Fm10)和0.79磅的纯度大于95％的莱鲍迪苷M。将55磅的赤藓糖醇倒入150-Lb混合器(Littleford卧式螺杆混合器)中，并将混合器以30的犁速运行两分钟，以涂覆混合器。将11.6磅的可溶性纤维、0.79磅的纯度>95％的莱鲍迪苷M和55磅的赤藓糖醇依次添加至混合器中。将犁速设置为30并且混合6分钟。然后将切碎机设置为犁速为30，并混合2分钟。向喷雾器中添加10盎司的蒸馏水，并将犁速设置为30，再混合5分钟。将切碎机犁速设置为30，并在真空(-5Hg或-0.2BAR)下干燥3分钟。然后将混合物装入与装袋机相连的料斗中以进行装袋。
序列表
SEQ ID NO:1(Ro.KAH氨基酸序列)
MEVTVGSWVALSLVFVSIIVGWAWSVLDWVWLKPKKLERCLREQGLKGNSYWFLYG
DMKENSILLKQAKSKPMNLSTSHDIAPQVIPFVDQTVKVYGKNSFDWIGPIPRVNIMNPE
ELKDVFTKYDDFIKPISNPLFKLLATGLANYEGEKWAKHRRIINPTFHSEKLKRMLPSFH
QSCTEMIKEWESLVSKEGSSCELDVWPFLENMTADVISRTAFGTSYKKGRKIFELLREQA
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GVEVRLPTLLIHHDKELWGDDANEFKPERFSEGVSKATKSRLSFFPFGGGPRICIGQNFA
MMEAKLALVLILQHFTFELSPSYAHAPSYRITLQPQYGVPIILHRR
SEQ ID NO:2(Ro.KAH编码核酸序列)
ATGGAAGTAACCGTTGGATCTTGGGTAGCTTTGTCCTTAGTCTTCGTTTCTATTATCG
TCGGTTGGGCTTGGTCCGTTTTAGATTGGGTCTGGTTGAAACCAAAGAAGTTAGAAA
GATGTTTGAGAGAACAAGGTTTAAAGGGTAACTCTTACTGGTTCTTGTATGGTGACA
TGAAAGAGAACTCTATTTTGTTGAAGCAAGCTAAGTCTAAGCCAATGAACTTATCTA
CCTCTCACGACATCGCCCCACAAGTTATTCCATTTGTCGACCAAACTGTCAAGGTCT
ACGGTAAGAACTCTTTCGATTGGATCGGTCCTATTCCAAGAGTCAATATCATGAACC
CAGAAGAATTGAAGGATGTTTTCACCAAGTACGATGACTTCATCAAGCCAATTTCTA
ACCCTTTGTTCAAGTTGTTGGCTACCGGTTTGGCTAATTACGAAGGTGAGAAGTGGG
CTAAGCACAGACGTATTATCAACCCAACTTTCCATTCTGAGAAGTTGAAAAGAATGT
TGCCATCCTTCCACCAATCTTGTACTGAAATGATCAAGGAATGGGAATCTTTGGTTT
CTAAGGAAGGTTCTTCTTGTGAGTTAGACGTCTGGCCATTCTTAGAAAACATGACCG
CTGACGTTATTTCTAGAACTGCTTTCGGTACTTCTTACAAGAAGGGTAGAAAGATTT
TCGAATTGTTGAGAGAACAAGCTATTTACGCCACCAAGGCTATCCAATCTTTTTACA
TTCCAGGTTGGCGTTTTTTGCCTACTAAAATGAACAAGAGAATGAAGGAAATCAACA
AGGAGATCAAGGGTTTGATTAAGGGTATCATCATCAAAAGAGAACACACTATCAAG
GCTGGTGAAGAAACTAAGGATGACTTGTTAGGTGCTTTGATGGAATCTAACTTGAAG
GACATTAGAGAACACGGTAAGAACAACAAGAACTTCGGTATGTCTATCGAAGACGT
TATCGAAGAGTGTAAGTTGTTCTACTTTGCTGGTCAAGAAACTACTTCTGTTTTGTTA
GTTTGGACCATGGTTTTGTTGGGTCAAAATCAAAACTGGCAAGATAGAGCTAGACA
AGAAATCTTGCAAGTTTTTGGTTCTAATAAGCCAGACTTCGATGGTTTGACTCACTTG
AAAGTTGTCACCATGATTTTATTGGAAGTCTTGAGATTGTACCCAGCTGTTATCGAA
TTGCCAAGAACCATTCACAAGAAGACTCAATTGGGTAAATTCTCTTTACCTGAAGGT
GTTGAAGTTAGATTGCCAACTTTGTTAATCCACCATGATAAGGAATTGTGGGGTGAT
GACGCTAACGAATTCAAGCCAGAACGTTTCTCTGAAGGTGTTTCTAAGGCTACCAAA
TCCAGATTGTCCTTTTTTCCTTTCGGTGGTGGTCCTAGAATCTGTATTGGTCAAAACT
TTGCTATGATGGAAGCTAAATTGGCTTTGGTTTTGATTTTGCAACACTTCACTTTCGA
ATTGTCCCCTTCCTACGCCCATGCTCCATCCTACAGAATTACCTTACAACCTCAATAT
GGTGTCCCTATTATCTTGCACCGTCGTTA
SEQ ID NO:3(GGPPS)
MLTSSKSIESFPKNVQPYGKHYQNGLEPVGKSQEDILLEPFHYLCSNPGKDVRTKMIEAF
NAWLKVPKDDLIVITRVIEMLHSASLLIDDVEDDSVLRRGVPAAHHIYGTPQTINCANYV
YFLALKEIAKLNKPNMITIYTDELINLHRGQGMELFWRDTLTCPTEKEFLDMVNDKTGG
LLRLAVKLMQEASQSGTDYTGLVSKIGIHFQVRDDYMNLQSKNYADNKGFCEDLTEGK
FSFPIIHSIRSDPSNRQLLNILKQRSSSIELKQFALQLLENTNTFQYCRDFLRVLEKEAREEI
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SEQ ID NO:4(CDPS)
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GGGERSPQFPEAIDWIARNQLPDGSWGDAGMFIVQDRLINTLGCVVALATWGVHEEQR
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DKELLEYLETAINNFDGGAPCTYPVDNFDRLWSVDRLRRLGISRYFTSEIEEYLEYAYRH
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SEQ ID NO:5(KS)
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SEQ ID NO:6(KO)
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NVDTMGLTTHRLHPLQVKLKPRNRIY
SEQ ID NO:7(CPR)
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LIGCIVMLVWRRSGSGNSKRVEPLKPLVIKPREEEIDDGRKKVTIFFGTQTGTAEGFAKA
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INMANGNGYTVFDAQHPYKANVAVKRELHTPESDRSCIHLEFDIAGSGLTYETGDHVG
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SSPKKSALVALAAHASDPTEAERLKHLASPAGKDEYSKWVVESQRSLLEVMAEFPSAKP
PLGVFFAGVAPRLQPRFYSISSSPKIAETRIHVTCALVYEKMPTGRIHKGVCSTWMKNAV
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MISQGAYLYVCGDAKGMARDVHRSLHTIAQEQGSMDSTKAEGFVKNLQTSGRYLRDV
W
SEQ ID NO:8(UGT85C2)
MDAMATTEKKPHVIFIPFPAQSHIKAMLKLAQLLHHKGLQITFVNTDFIHNQFLESSGPH
CLDGAPGFRFETIPDGVSHSPEASIPIRESLLRSIETNFLDRFIDLVTKLPDPPTCIISDGFLS
VFTIDAAKKLGIPVMMYWTLAACGFMGFYHIHSLIEKGFAPLKDASYLTNGYLDTVIDW
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VMSLEDMTEFGWGLANSNHYFLWIIRSNLVIGENAVLPPELEEHIKKRGFIASWCSQEKV
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KRDEVKRLVQELMGEGGHKMRNKAKDWKEKARIAIAPNGSSSLNIDKMVKEITVLARN
SEQ ID NO:9(UGT74G1)
MAEQQKIKKSPHVLLIPFPLQGHINPFIQFGKRLISKGVKTTLVTTIHTLNSTLNHSNTTTT
SIEIQAISDGCDEGGFMSAGESYLETFKQVGSKSLADLIKKLQSEGTTIDAIIYDSMTEWV
LDVAIEFGIDGGSFFTQACVVNSLYYHVHKGLISLPLGETVSVPGFPVLQRWETPLILQN
HEQIQSPWSQMLFGQFANIDQARWVFTNSFYKLEEEVIEWTRKIWNLKVIGPTLPSMYL
DKRLDDDKDNGFNLYKANHHECMNWLDDKPKESVVYVAFGSLVKHGPEQVEEITRAL
IDSDVNFLWVIKHKEEGKLPENLSEVIKTGKGLIVAWCKQLDVLAHESVGCFVTHCGFN
STLEAISLGVPVVAMPQFSDQTTNAKLLDEILGVGVRVKADENGIVRRGNLASCIKMIM
EEERGVIIRKNAVKWKDLAKVAVHEGGSSDNDIVEFVSELIKA
SEQ ID NO:10(UGT91D_样3)
MYNVTYHQNSKAMATSDSIVDDRKQLHVATFPWLAFGHILPYLQLSKLIAEKGHKVSF
LSTTRNIQRLSSHISPLINVVQLTLPRVQELPEDAEATTDVHPEDIPYLKKASDGLQPEVT
RFLEQHSPDWIIYDYTHYWLPSIAASLGISRAHFSVTTPWAIAYMGPSADAMINGSDGRT
TVEDLTTPPKWFPFPTKVCWRKHDLARLVPYKAPGISDGYRMGLVLKGSDCLLSKCYH
EFGTQWLPLLETLHQVPVVPVGLLPPEIPGDEKDETWVSIKKWLDGKQKGSVVYVALG
SEVLVSQTEVVELALGLELSGLPFVWAYRKPKGPAKSDSVELPDGFVERTRDRGLVWTS
WAPQLRILSHESVCGFLTHCGSGSIVEGLMFGHPLIMLPIFGDQPLNARLLEDKQVGIEIP
RNEEDGCLTKESVARSLRSVVVEKEGEIYKANARELSKIYNDTKVEKEYVSQFVDYLEK
NARAVAIDHES*
SEQ ID NO:11(UGT76G1)
MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFT
FRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITD
ALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFP
MLKVKDIKSAYSNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIP
LPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQS
FLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTL
ESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGE
YIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL
SEQ ID NO:12(UGT40087)
MDASDSSPLHIVIFPWLAFGHMLASLELAERLAARGHRVSFVSTPRNISRLRPVPPALAPL
IDFVALPLPRVDGLPDGAEATSDIPPGKTELHLKALDGLAAPFAAFLDAACADGSTNKV
DWLFLDNFQYWAAAAAADHKIPCALNLTFAASTSAEYGVPRVEPPVDGSTASILQRFVL
TLEKCQFVIQRACFELEPEPLPLLSDIFGKPVIPYGLVPPCPPAEGHKREHGNAALSWLDK
QQPESVLFIALGSEPPVTVEQLHEIALGLELAGTTFLWALKKPNGLLLEADGDILPPGFEE
RTRDRGLVAMGWVPQPIILAHSSVGAFLTHGGWASTIEGVMSGHPMLFLTFLDEQRINA
QLIERKKAGLRVPRREKDGSYDRQGIAGAIRAVMCEEESKSVFAANAKKMQEIVSDRN
CQEKYIDELIQRLGSFEK
SEQ ID NO:13(Rs.KAH)
MEVTVASSVALSLVFISIVVRWAWSVVNWVWFKPKKLERFLREQGLKGNSYRFLYGD
MKENSILLKQARSKPMNLSTSHDIAPQVTPFVDQTVKAYGKNSFNWVGPIPRVNIMNPE
DLKDVLTKNVDFVKPISNPLIKLLATGIAIYEGEKWTKHRRIINPTFHSERLKRMLPSFHQ
SCNEMVKEWESLVSKEGSSCELDVWPFLENMSADVISRTAFGTSYKKGQKIFELLREQV
IYVTKGFQSFYIPGWRFLPTKMNKRMNEINEEIKGLIRGIIIDREQIIKAGEETNDDLLGAL
MESNLKDIREHGKNNKNVGMSIEDVIQECKLFYFAGQETTSVLLAWTMVLLGQNQNW
QDRARQEVLQVFGSSKPDFDGLAHLKVVTMILLEVLRLYPPVIELIRTIHKKTQLGKLSL
PEGVEVRLPTLLIHHDKELWGDDANQFNPERFSEGVSKATKNRLSFFPFGAGPRICIGQN
FSMMEAKLALALILQHFTFELSPSHAHAPSHRITLQPQYGVRIILHRR
SEQ ID NO:14(At.KAH)
MESLVVHTVNAIWCIVIVGIFSVGYHVYGRAVVEQWRMRRSLKLQGVKGPPPSIFNGN
VSEMQRIQSEAKHCSGDNIISHDYSSSLFPHFDHWRKQYGRIYTYSTGLKQHLYINHPEM
VKELSQTNTLNLGRITHITKRLNPILGNGIITSNGPHWAHQRRIIAYEFTHDKIKGMVGLM
VESAMPMLNKWEEMVKRGGEMGCDIRVDEDLKDVSADVIAKACFGSSFSKGKAIFSMI
RDLLTAITKRSVLFRFNGFTDMVFGSKKHGDVDIDALEMELESSIWETVKEREIECKDTH
KKDLMQLILEGAMRSCDGNLWDKSAYRRFVVDNCKSIYFAGHDSTAVSVSWCLMLLA
LNPSWQVKIRDEILSSCKNGIPDAESIPNLKTVTMVIQETMRLYPPAPIVGREASKDIRLG
DLVVPKGVCIWTLIPALHRDPEIWGPDANDFKPERFSEGISKACKYPQSYIPFGLGPRTCV
GKNFGMMEVKVLVSLIVSKFSFTLSPTYQHSPSHKLLVEPQHGVVIRVV
SEQ ID NO:15(Sr.KAH)
MEASYLYISILLLLASYLFTTQLRRKSANLPPTVFPSIPIIGHLYLLKKPLYRTLAKIAAKY
GPILQLQLGYRRVLVISSPSAAEECFTNNDVIFANRPKTLFGKIVGGTSLGSLSYGDQWR
NLRRVASIEILSVHRLNEFHDIRVDENRLLIRKLRSSSSPVTLITVFYALTLNVIMRMISGK
RYFDSGDRELEEEGKRFREILDETLLLAGASNVGDYLPILNWLGVKSLEKKLIALQKKRD
DFFQGLIEQVRKSRGAKVGKGRKTMIELLLSLQESEPEYYTDAMIRSFVLGLLAAGSDTS
AGTMEWAMSLLVNHPHVLKKAQAEIDRVIGNNRLIDESDIGNIPYIGCIINETLRLYPAGP
LLFPHESSADCVISGYNIPRGTMLIVNQWAIHHDPKVWDDPETFKPERFQGLEGTRDGFK
LMPFGSGRRGCPGEGLAIRLLGMTLGSVIQCFDWERVGDEMVDMTEGLGVTLPKAVPL
VAKCKPRSEMTNLLSEL*。
序列表
<110> 阿迈瑞斯公司
<120> 莱鲍迪苷M甜味剂组合物
<130> 5033PCT.1029BS
<150> 62/989,034
<151> 2020-03-13
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 523
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 1
Met Glu Val Thr Val Gly Ser Trp Val Ala Leu Ser Leu Val Phe Val
1 5 10 15
Ser Ile Ile Val Gly Trp Ala Trp Ser Val Leu Asp Trp Val Trp Leu
20 25 30
Lys Pro Lys Lys Leu Glu Arg Cys Leu Arg Glu Gln Gly Leu Lys Gly
35 40 45
Asn Ser Tyr Trp Phe Leu Tyr Gly Asp Met Lys Glu Asn Ser Ile Leu
50 55 60
Leu Lys Gln Ala Lys Ser Lys Pro Met Asn Leu Ser Thr Ser His Asp
65 70 75 80
Ile Ala Pro Gln Val Ile Pro Phe Val Asp Gln Thr Val Lys Val Tyr
85 90 95
Gly Lys Asn Ser Phe Asp Trp Ile Gly Pro Ile Pro Arg Val Asn Ile
100 105 110
Met Asn Pro Glu Glu Leu Lys Asp Val Phe Thr Lys Tyr Asp Asp Phe
115 120 125
Ile Lys Pro Ile Ser Asn Pro Leu Phe Lys Leu Leu Ala Thr Gly Leu
130 135 140
Ala Asn Tyr Glu Gly Glu Lys Trp Ala Lys His Arg Arg Ile Ile Asn
145 150 155 160
Pro Thr Phe His Ser Glu Lys Leu Lys Arg Met Leu Pro Ser Phe His
165 170 175
Gln Ser Cys Thr Glu Met Ile Lys Glu Trp Glu Ser Leu Val Ser Lys
180 185 190
Glu Gly Ser Ser Cys Glu Leu Asp Val Trp Pro Phe Leu Glu Asn Met
195 200 205
Thr Ala Asp Val Ile Ser Arg Thr Ala Phe Gly Thr Ser Tyr Lys Lys
210 215 220
Gly Arg Lys Ile Phe Glu Leu Leu Arg Glu Gln Ala Ile Tyr Ala Thr
225 230 235 240
Lys Ala Ile Gln Ser Phe Tyr Ile Pro Gly Trp Arg Phe Leu Pro Thr
245 250 255
Lys Met Asn Lys Arg Met Lys Glu Ile Asn Lys Glu Ile Lys Gly Leu
260 265 270
Ile Lys Gly Ile Ile Ile Lys Arg Glu His Thr Ile Lys Ala Gly Glu
275 280 285
Glu Thr Lys Asp Asp Leu Leu Gly Ala Leu Met Glu Ser Asn Leu Lys
290 295 300
Asp Ile Arg Glu His Gly Lys Asn Asn Lys Asn Phe Gly Met Ser Ile
305 310 315 320
Glu Asp Val Ile Glu Glu Cys Lys Leu Phe Tyr Phe Ala Gly Gln Glu
325 330 335
Thr Thr Ser Val Leu Leu Val Trp Thr Met Val Leu Leu Gly Gln Asn
340 345 350
Gln Asn Trp Gln Asp Arg Ala Arg Gln Glu Ile Leu Gln Val Phe Gly
355 360 365
Ser Asn Lys Pro Asp Phe Asp Gly Leu Thr His Leu Lys Val Val Thr
370 375 380
Met Ile Leu Leu Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Val Ile Glu Leu
385 390 395 400
Pro Arg Thr Ile His Lys Lys Thr Gln Leu Gly Lys Phe Ser Leu Pro
405 410 415
Glu Gly Val Glu Val Arg Leu Pro Thr Leu Leu Ile His His Asp Lys
420 425 430
Glu Leu Trp Gly Asp Asp Ala Asn Glu Phe Lys Pro Glu Arg Phe Ser
435 440 445
Glu Gly Val Ser Lys Ala Thr Lys Ser Arg Leu Ser Phe Phe Pro Phe
450 455 460
Gly Gly Gly Pro Arg Ile Cys Ile Gly Gln Asn Phe Ala Met Met Glu
465 470 475 480
Ala Lys Leu Ala Leu Val Leu Ile Leu Gln His Phe Thr Phe Glu Leu
485 490 495
Ser Pro Ser Tyr Ala His Ala Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Leu Gln Pro
500 505 510
Gln Tyr Gly Val Pro Ile Ile Leu His Arg Arg
515 520
<210> 2
<211> 1571
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 2
atggaagtaa ccgttggatc ttgggtagct ttgtccttag tcttcgtttc tattatcgtc 60
ggttgggctt ggtccgtttt agattgggtc tggttgaaac caaagaagtt agaaagatgt 120
ttgagagaac aaggtttaaa gggtaactct tactggttct tgtatggtga catgaaagag 180
aactctattt tgttgaagca agctaagtct aagccaatga acttatctac ctctcacgac 240
atcgccccac aagttattcc atttgtcgac caaactgtca aggtctacgg taagaactct 300
ttcgattgga tcggtcctat tccaagagtc aatatcatga acccagaaga attgaaggat 360
gttttcacca agtacgatga cttcatcaag ccaatttcta accctttgtt caagttgttg 420
gctaccggtt tggctaatta cgaaggtgag aagtgggcta agcacagacg tattatcaac 480
ccaactttcc attctgagaa gttgaaaaga atgttgccat ccttccacca atcttgtact 540
gaaatgatca aggaatggga atctttggtt tctaaggaag gttcttcttg tgagttagac 600
gtctggccat tcttagaaaa catgaccgct gacgttattt ctagaactgc tttcggtact 660
tcttacaaga agggtagaaa gattttcgaa ttgttgagag aacaagctat ttacgccacc 720
aaggctatcc aatcttttta cattccaggt tggcgttttt tgcctactaa aatgaacaag 780
agaatgaagg aaatcaacaa ggagatcaag ggtttgatta agggtatcat catcaaaaga 840
gaacacacta tcaaggctgg tgaagaaact aaggatgact tgttaggtgc tttgatggaa 900
tctaacttga aggacattag agaacacggt aagaacaaca agaacttcgg tatgtctatc 960
gaagacgtta tcgaagagtg taagttgttc tactttgctg gtcaagaaac tacttctgtt 1020
ttgttagttt ggaccatggt tttgttgggt caaaatcaaa actggcaaga tagagctaga 1080
caagaaatct tgcaagtttt tggttctaat aagccagact tcgatggttt gactcacttg 1140
aaagttgtca ccatgatttt attggaagtc ttgagattgt acccagctgt tatcgaattg 1200
ccaagaacca ttcacaagaa gactcaattg ggtaaattct ctttacctga aggtgttgaa 1260
gttagattgc caactttgtt aatccaccat gataaggaat tgtggggtga tgacgctaac 1320
gaattcaagc cagaacgttt ctctgaaggt gtttctaagg ctaccaaatc cagattgtcc 1380
ttttttcctt tcggtggtgg tcctagaatc tgtattggtc aaaactttgc tatgatggaa 1440
gctaaattgg ctttggtttt gattttgcaa cacttcactt tcgaattgtc cccttcctac 1500
gcccatgctc catcctacag aattacctta caacctcaat atggtgtccc tattatcttg 1560
caccgtcgtt a 1571
<210> 3
<211> 320
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 3
Met Leu Thr Ser Ser Lys Ser Ile Glu Ser Phe Pro Lys Asn Val Gln
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Lys His Tyr Gln Asn Gly Leu Glu Pro Val Gly Lys Ser
20 25 30
Gln Glu Asp Ile Leu Leu Glu Pro Phe His Tyr Leu Cys Ser Asn Pro
35 40 45
Gly Lys Asp Val Arg Thr Lys Met Ile Glu Ala Phe Asn Ala Trp Leu
50 55 60
Lys Val Pro Lys Asp Asp Leu Ile Val Ile Thr Arg Val Ile Glu Met
65 70 75 80
Leu His Ser Ala Ser Leu Leu Ile Asp Asp Val Glu Asp Asp Ser Val
85 90 95
Leu Arg Arg Gly Val Pro Ala Ala His His Ile Tyr Gly Thr Pro Gln
100 105 110
Thr Ile Asn Cys Ala Asn Tyr Val Tyr Phe Leu Ala Leu Lys Glu Ile
115 120 125
Ala Lys Leu Asn Lys Pro Asn Met Ile Thr Ile Tyr Thr Asp Glu Leu
130 135 140
Ile Asn Leu His Arg Gly Gln Gly Met Glu Leu Phe Trp Arg Asp Thr
145 150 155 160
Leu Thr Cys Pro Thr Glu Lys Glu Phe Leu Asp Met Val Asn Asp Lys
165 170 175
Thr Gly Gly Leu Leu Arg Leu Ala Val Lys Leu Met Gln Glu Ala Ser
180 185 190
Gln Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Gly Leu Val Ser Lys Ile Gly Ile His
195 200 205
Phe Gln Val Arg Asp Asp Tyr Met Asn Leu Gln Ser Lys Asn Tyr Ala
210 215 220
Asp Asn Lys Gly Phe Cys Glu Asp Leu Thr Glu Gly Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240
Pro Ile Ile His Ser Ile Arg Ser Asp Pro Ser Asn Arg Gln Leu Leu
245 250 255
Asn Ile Leu Lys Gln Arg Ser Ser Ser Ile Glu Leu Lys Gln Phe Ala
260 265 270
Leu Gln Leu Leu Glu Asn Thr Asn Thr Phe Gln Tyr Cys Arg Asp Phe
275 280 285
Leu Arg Val Leu Glu Lys Glu Ala Arg Glu Glu Ile Lys Leu Leu Gly
290 295 300
Gly Asn Ile Met Leu Glu Lys Ile Met Asp Val Leu Ser Val Asn Glu
305 310 315 320
<210> 4
<211> 736
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 4
Met Glu His Ala Arg Pro Pro Gln Gly Gly Asp Asp Asp Val Ala Ala
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Leu Pro Tyr Met Ile Glu Ser Ile Lys Ser Lys Leu
20 25 30
Arg Ala Ala Arg Asn Ser Leu Gly Glu Thr Thr Val Ser Ala Tyr Asp
35 40 45
Thr Ala Trp Ile Ala Leu Val Asn Arg Leu Asp Gly Gly Gly Glu Arg
50 55 60
Ser Pro Gln Phe Pro Glu Ala Ile Asp Trp Ile Ala Arg Asn Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asp Gly Ser Trp Gly Asp Ala Gly Met Phe Ile Val Gln Asp Arg
85 90 95
Leu Ile Asn Thr Leu Gly Cys Val Val Ala Leu Ala Thr Trp Gly Val
100 105 110
His Glu Glu Gln Arg Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Ile Gln Asp Asn Leu
115 120 125
Trp Arg Leu Gly Glu Asp Asp Glu Glu Trp Met Met Val Gly Phe Glu
130 135 140
Ile Thr Phe Pro Val Leu Leu Glu Lys Ala Lys Asn Leu Gly Leu Asp
145 150 155 160
Ile Asn Tyr Asp Asp Pro Ala Leu Gln Asp Ile Tyr Ala Lys Arg Gln
165 170 175
Leu Lys Leu Ala Lys Ile Pro Arg Glu Ala Leu His Ala Arg Pro Thr
180 185 190
Thr Leu Leu His Ser Leu Glu Gly Met Glu Asn Leu Asp Trp Glu Arg
195 200 205
Leu Leu Gln Phe Lys Cys Pro Ala Gly Ser Leu His Ser Ser Pro Ala
210 215 220
Ala Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Glu Thr Gly Asp Lys Glu Leu Leu Glu
225 230 235 240
Tyr Leu Glu Thr Ala Ile Asn Asn Phe Asp Gly Gly Ala Pro Cys Thr
245 250 255
Tyr Pro Val Asp Asn Phe Asp Arg Leu Trp Ser Val Asp Arg Leu Arg
260 265 270
Arg Leu Gly Ile Ser Arg Tyr Phe Thr Ser Glu Ile Glu Glu Tyr Leu
275 280 285
Glu Tyr Ala Tyr Arg His Leu Ser Pro Asp Gly Met Ser Tyr Gly Gly
290 295 300
Leu Cys Pro Val Lys Asp Ile Asp Asp Thr Ala Met Ala Phe Arg Leu
305 310 315 320
Leu Arg Leu His Gly Tyr Asn Val Ser Ser Ser Val Phe Asn His Phe
325 330 335
Glu Lys Asp Gly Glu Tyr Phe Cys Phe Ala Gly Gln Ser Ser Gln Ser
340 345 350
Leu Thr Ala Met Tyr Asn Ser Tyr Arg Ala Ser Gln Ile Val Phe Pro
355 360 365
Gly Asp Asp Asp Gly Leu Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Cys Arg Ala Phe
370 375 380
Leu Glu Glu Arg Arg Ala Thr Gly Asn Leu Arg Asp Lys Trp Val Ile
385 390 395 400
Ala Asn Gly Leu Pro Ser Glu Val Glu Tyr Ala Leu Asp Phe Pro Trp
405 410 415
Lys Ala Ser Leu Pro Arg Val Glu Thr Arg Val Tyr Leu Glu Gln Tyr
420 425 430
Gly Ala Ser Glu Asp Ala Trp Ile Gly Lys Gly Leu Tyr Arg Met Thr
435 440 445
Leu Val Asn Asn Asp Leu Tyr Leu Glu Ala Ala Lys Ala Asp Phe Thr
450 455 460
Asn Phe Gln Arg Leu Ser Arg Leu Glu Trp Leu Ser Leu Lys Arg Trp
465 470 475 480
Tyr Ile Arg Asn Asn Leu Gln Ala His Gly Val Thr Glu Gln Ser Val
485 490 495
Leu Arg Ala Tyr Phe Leu Ala Ala Ala Asn Ile Phe Glu Pro Asn Arg
500 505 510
Ala Ala Glu Arg Leu Gly Trp Ala Arg Thr Ala Ile Leu Ala Glu Ala
515 520 525
Ile Ala Ser His Leu Arg Gln Tyr Ser Ala Asn Gly Ala Ala Asp Gly
530 535 540
Met Thr Glu Arg Leu Ile Ser Gly Leu Ala Ser His Asp Trp Asp Trp
545 550 555 560
Arg Glu Ser Asn Asp Ser Ala Ala Arg Ser Leu Leu Tyr Ala Leu Asp
565 570 575
Glu Leu Ile Asp Leu His Ala Phe Gly Asn Ala Ser Asp Ser Leu Arg
580 585 590
Glu Ala Trp Lys Gln Trp Leu Met Ser Trp Thr Asn Glu Ser Gln Gly
595 600 605
Ser Thr Gly Gly Asp Thr Ala Leu Leu Leu Val Arg Thr Ile Glu Ile
610 615 620
Cys Ser Gly Arg His Gly Ser Ala Glu Gln Ser Leu Lys Asn Ser Glu
625 630 635 640
Asp Tyr Ala Arg Leu Glu Gln Ile Ala Ser Ser Met Cys Ser Lys Leu
645 650 655
Ala Thr Lys Ile Leu Ala Gln Asn Gly Gly Ser Met Asp Asn Val Glu
660 665 670
Gly Ile Asp Gln Glu Val Asp Val Glu Met Lys Glu Leu Ile Gln Arg
675 680 685
Val Tyr Gly Ser Ser Ser Asn Asp Val Ser Ser Val Thr Arg Gln Thr
690 695 700
Phe Leu Asp Val Val Lys Ser Phe Cys Tyr Val Ala His Cys Ser Pro
705 710 715 720
Glu Thr Ile Asp Gly His Ile Ser Lys Val Leu Phe Glu Asp Val Asn
725 730 735
<210> 5
<211> 757
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 5
Met Lys Arg Glu Gln Tyr Thr Ile Leu Asn Glu Lys Glu Ser Met Ala
1 5 10 15
Glu Glu Leu Ile Leu Arg Ile Lys Arg Met Phe Ser Glu Ile Glu Asn
20 25 30
Thr Gln Thr Ser Ala Ser Ala Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Met Val
35 40 45
Pro Ser Leu Asp Ser Ser Gln Gln Pro Gln Phe Pro Gln Cys Leu Ser
50 55 60
Trp Ile Ile Asp Asn Gln Leu Leu Asp Gly Ser Trp Gly Ile Pro Tyr
65 70 75 80
Leu Ile Ile Lys Asp Arg Leu Cys His Thr Leu Ala Cys Val Ile Ala
85 90 95
Leu Arg Lys Trp Asn Ala Gly Asn Gln Asn Val Glu Thr Gly Leu Arg
100 105 110
Phe Leu Arg Glu Asn Ile Glu Gly Ile Val His Glu Asp Glu Tyr Thr
115 120 125
Pro Ile Gly Phe Gln Ile Ile Phe Pro Ala Met Leu Glu Glu Ala Arg
130 135 140
Gly Leu Gly Leu Glu Leu Pro Tyr Asp Leu Thr Pro Ile Lys Leu Met
145 150 155 160
Leu Thr His Arg Glu Lys Ile Met Lys Gly Lys Ala Ile Asp His Met
165 170 175
His Glu Tyr Asp Ser Ser Leu Ile Tyr Thr Val Glu Gly Ile His Lys
180 185 190
Ile Val Asp Trp Asn Lys Val Leu Lys His Gln Asn Lys Asp Gly Ser
195 200 205
Leu Phe Asn Ser Pro Ser Ala Thr Ala Cys Ala Leu Met His Thr Arg
210 215 220
Lys Ser Asn Cys Leu Glu Tyr Leu Ser Ser Met Leu Gln Lys Leu Gly
225 230 235 240
Asn Gly Val Pro Ser Val Tyr Pro Ile Asn Leu Tyr Ala Arg Ile Ser
245 250 255
Met Ile Asp Arg Leu Gln Arg Leu Gly Leu Ala Arg His Phe Arg Asn
260 265 270
Glu Ile Ile His Ala Leu Asp Asp Ile Tyr Arg Tyr Trp Met Gln Arg
275 280 285
Glu Thr Ser Arg Glu Gly Lys Ser Leu Thr Pro Asp Ile Val Ser Thr
290 295 300
Ser Ile Ala Phe Met Leu Leu Arg Leu His Gly Tyr Asp Val Pro Ala
305 310 315 320
Asp Val Phe Cys Cys Tyr Asp Leu His Ser Ile Glu Gln Ser Gly Glu
325 330 335
Ala Val Thr Ala Met Leu Ser Leu Tyr Arg Ala Ser Gln Ile Met Phe
340 345 350
Pro Gly Glu Thr Ile Leu Glu Glu Ile Lys Thr Val Ser Arg Lys Tyr
355 360 365
Leu Asp Lys Arg Lys Glu Asn Gly Gly Ile Tyr Asp His Asn Ile Val
370 375 380
Met Lys Asp Leu Arg Gly Glu Val Glu Tyr Ala Leu Ser Val Pro Trp
385 390 395 400
Tyr Ala Ser Leu Glu Arg Ile Glu Asn Arg Arg Tyr Ile Asp Gln Tyr
405 410 415
Gly Val Asn Asp Thr Trp Ile Ala Lys Thr Ser Tyr Lys Ile Pro Cys
420 425 430
Ile Ser Asn Asp Leu Phe Leu Ala Leu Ala Lys Gln Asp Tyr Asn Ile
435 440 445
Cys Gln Ala Ile Gln Gln Lys Glu Leu Arg Glu Leu Glu Arg Trp Phe
450 455 460
Ala Asp Asn Lys Phe Ser His Leu Asn Phe Ala Arg Gln Lys Leu Ile
465 470 475 480
Tyr Cys Tyr Phe Ser Ala Ala Ala Thr Leu Phe Ser Pro Glu Leu Ser
485 490 495
Ala Ala Arg Val Val Trp Ala Lys Asn Gly Val Ile Thr Thr Val Val
500 505 510
Asp Asp Phe Phe Asp Val Gly Gly Ser Ser Glu Glu Ile His Ser Phe
515 520 525
Val Glu Ala Val Arg Val Trp Asp Glu Ala Ala Thr Asp Gly Leu Ser
530 535 540
Glu Asn Val Gln Ile Leu Phe Ser Ala Leu Tyr Asn Thr Val Asp Glu
545 550 555 560
Ile Val Gln Gln Ala Phe Val Phe Gln Gly Arg Asp Ile Ser Ile His
565 570 575
Leu Arg Glu Ile Trp Tyr Arg Leu Val Asn Ser Met Met Thr Glu Ala
580 585 590
Gln Trp Ala Arg Thr His Cys Leu Pro Ser Met His Glu Tyr Met Glu
595 600 605
Asn Ala Glu Pro Ser Ile Ala Leu Glu Pro Ile Val Leu Ser Ser Leu
610 615 620
Tyr Phe Val Gly Pro Lys Leu Ser Glu Glu Ile Ile Cys His Pro Glu
625 630 635 640
Tyr Tyr Asn Leu Met His Leu Leu Asn Ile Cys Gly Arg Leu Leu Asn
645 650 655
Asp Ile Gln Gly Cys Lys Arg Glu Ala His Gln Gly Lys Leu Asn Ser
660 665 670
Val Thr Leu Tyr Met Glu Glu Asn Ser Gly Thr Thr Met Glu Asp Ala
675 680 685
Ile Val Tyr Leu Arg Lys Thr Ile Asp Glu Ser Arg Gln Leu Leu Leu
690 695 700
Lys Glu Val Leu Arg Pro Ser Ile Val Pro Arg Glu Cys Lys Gln Leu
705 710 715 720
His Trp Asn Met Met Arg Ile Leu Gln Leu Phe Tyr Leu Lys Asn Asp
725 730 735
Gly Phe Thr Ser Pro Thr Glu Met Leu Gly Tyr Val Asn Ala Val Ile
740 745 750
Val Asp Pro Ile Leu
755
<210> 6
<211> 499
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 6
Met Asp Thr Leu Thr Leu Ser Leu Gly Phe Leu Ser Leu Phe Leu Phe
1 5 10 15
Leu Phe Leu Leu Lys Arg Ser Thr His Lys His Ser Lys Leu Ser His
20 25 30
Val Pro Val Val Pro Gly Leu Pro Val Ile Gly Asn Leu Leu Gln Leu
35 40 45
Lys Glu Lys Lys Pro His Lys Thr Phe Thr Lys Met Ala Gln Lys Tyr
50 55 60
Gly Pro Ile Phe Ser Ile Lys Ala Gly Ser Ser Lys Ile Ile Val Leu
65 70 75 80
Asn Thr Ala His Leu Ala Lys Glu Ala Met Val Thr Arg Tyr Ser Ser
85 90 95
Ile Ser Lys Arg Lys Leu Ser Thr Ala Leu Thr Ile Leu Thr Ser Asp
100 105 110
Lys Cys Met Val Ala Met Ser Asp Tyr Asn Asp Phe His Lys Met Val
115 120 125
Lys Lys His Ile Leu Ala Ser Val Leu Gly Ala Asn Ala Gln Lys Arg
130 135 140
Leu Arg Phe His Arg Glu Val Met Met Glu Asn Met Ser Ser Lys Phe
145 150 155 160
Asn Glu His Val Lys Thr Leu Ser Asp Ser Ala Val Asp Phe Arg Lys
165 170 175
Ile Phe Val Ser Glu Leu Phe Gly Leu Ala Leu Lys Gln Ala Leu Gly
180 185 190
Ser Asp Ile Glu Ser Ile Tyr Val Glu Gly Leu Thr Ala Thr Leu Ser
195 200 205
Arg Glu Asp Leu Tyr Asn Thr Leu Val Val Asp Phe Met Glu Gly Ala
210 215 220
Ile Glu Val Asp Trp Arg Asp Phe Phe Pro Tyr Leu Lys Trp Ile Pro
225 230 235 240
Asn Lys Ser Phe Glu Lys Lys Ile Arg Arg Val Asp Arg Gln Arg Lys
245 250 255
Ile Ile Met Lys Ala Leu Ile Asn Glu Gln Lys Lys Arg Leu Thr Ser
260 265 270
Gly Lys Glu Leu Asp Cys Tyr Tyr Asp Tyr Leu Val Ser Glu Ala Lys
275 280 285
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290 295 300
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Leu Ala Lys Asp Lys Asn Arg Gln Asp Arg Leu Tyr Glu Glu Leu Leu
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Asn Val Cys Gly His Glu Lys Val Thr Asp Glu Glu Leu Ser Lys Leu
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370 375 380
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<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 7
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Ala Ile Ile Lys Gly Glu Pro Val Ile Val Ser Asp Pro Ala Asn Ala
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165 170 175
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245 250 255
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275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
Gly Val Leu Cys Asp Asn Leu Ser Glu Thr Val Asp Glu Ala Leu Arg
355 360 365
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370 375 380
Glu Asp Gly Thr Pro Ile Ser Ser Ser Leu Pro Pro Pro Phe Pro Pro
385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
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Asn
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<213> 酿酒酵母
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<213> 酿酒酵母
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<213> 酿酒酵母
<400> 13
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225 230 235 240
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245 250 255
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Ile Arg Thr Ile His Lys Lys Thr Gln Leu Gly Lys Leu Ser Leu Pro
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Glu Gly Val Glu Val Arg Leu Pro Thr Leu Leu Ile His His Asp Lys
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Glu Leu Trp Gly Asp Asp Ala Asn Gln Phe Asn Pro Glu Arg Phe Ser
435 440 445
Glu Gly Val Ser Lys Ala Thr Lys Asn Arg Leu Ser Phe Phe Pro Phe
450 455 460
Gly Ala Gly Pro Arg Ile Cys Ile Gly Gln Asn Phe Ser Met Met Glu
465 470 475 480
Ala Lys Leu Ala Leu Ala Leu Ile Leu Gln His Phe Thr Phe Glu Leu
485 490 495
Ser Pro Ser His Ala His Ala Pro Ser His Arg Ile Thr Leu Gln Pro
500 505 510
Gln Tyr Gly Val Arg Ile Ile Leu His Arg Arg
515 520
<210> 14
<211> 525
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 14
Met Glu Ser Leu Val Val His Thr Val Asn Ala Ile Trp Cys Ile Val
1 5 10 15
Ile Val Gly Ile Phe Ser Val Gly Tyr His Val Tyr Gly Arg Ala Val
20 25 30
Val Glu Gln Trp Arg Met Arg Arg Ser Leu Lys Leu Gln Gly Val Lys
35 40 45
Gly Pro Pro Pro Ser Ile Phe Asn Gly Asn Val Ser Glu Met Gln Arg
50 55 60
Ile Gln Ser Glu Ala Lys His Cys Ser Gly Asp Asn Ile Ile Ser His
65 70 75 80
Asp Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro His Phe Asp His Trp Arg Lys Gln
85 90 95
Tyr Gly Arg Ile Tyr Thr Tyr Ser Thr Gly Leu Lys Gln His Leu Tyr
100 105 110
Ile Asn His Pro Glu Met Val Lys Glu Leu Ser Gln Thr Asn Thr Leu
115 120 125
Asn Leu Gly Arg Ile Thr His Ile Thr Lys Arg Leu Asn Pro Ile Leu
130 135 140
Gly Asn Gly Ile Ile Thr Ser Asn Gly Pro His Trp Ala His Gln Arg
145 150 155 160
Arg Ile Ile Ala Tyr Glu Phe Thr His Asp Lys Ile Lys Gly Met Val
165 170 175
Gly Leu Met Val Glu Ser Ala Met Pro Met Leu Asn Lys Trp Glu Glu
180 185 190
Met Val Lys Arg Gly Gly Glu Met Gly Cys Asp Ile Arg Val Asp Glu
195 200 205
Asp Leu Lys Asp Val Ser Ala Asp Val Ile Ala Lys Ala Cys Phe Gly
210 215 220
Ser Ser Phe Ser Lys Gly Lys Ala Ile Phe Ser Met Ile Arg Asp Leu
225 230 235 240
Leu Thr Ala Ile Thr Lys Arg Ser Val Leu Phe Arg Phe Asn Gly Phe
245 250 255
Thr Asp Met Val Phe Gly Ser Lys Lys His Gly Asp Val Asp Ile Asp
260 265 270
Ala Leu Glu Met Glu Leu Glu Ser Ser Ile Trp Glu Thr Val Lys Glu
275 280 285
Arg Glu Ile Glu Cys Lys Asp Thr His Lys Lys Asp Leu Met Gln Leu
290 295 300
Ile Leu Glu Gly Ala Met Arg Ser Cys Asp Gly Asn Leu Trp Asp Lys
305 310 315 320
Ser Ala Tyr Arg Arg Phe Val Val Asp Asn Cys Lys Ser Ile Tyr Phe
325 330 335
Ala Gly His Asp Ser Thr Ala Val Ser Val Ser Trp Cys Leu Met Leu
340 345 350
Leu Ala Leu Asn Pro Ser Trp Gln Val Lys Ile Arg Asp Glu Ile Leu
355 360 365
Ser Ser Cys Lys Asn Gly Ile Pro Asp Ala Glu Ser Ile Pro Asn Leu
370 375 380
Lys Thr Val Thr Met Val Ile Gln Glu Thr Met Arg Leu Tyr Pro Pro
385 390 395 400
Ala Pro Ile Val Gly Arg Glu Ala Ser Lys Asp Ile Arg Leu Gly Asp
405 410 415
Leu Val Val Pro Lys Gly Val Cys Ile Trp Thr Leu Ile Pro Ala Leu
420 425 430
His Arg Asp Pro Glu Ile Trp Gly Pro Asp Ala Asn Asp Phe Lys Pro
435 440 445
Glu Arg Phe Ser Glu Gly Ile Ser Lys Ala Cys Lys Tyr Pro Gln Ser
450 455 460
Tyr Ile Pro Phe Gly Leu Gly Pro Arg Thr Cys Val Gly Lys Asn Phe
465 470 475 480
Gly Met Met Glu Val Lys Val Leu Val Ser Leu Ile Val Ser Lys Phe
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Leu Val Glu Pro Gln His Gly Val Val Ile Arg Val Val
515 520 525
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<211> 500
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 15
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1 5 10 15
Tyr Leu Phe Thr Thr Gln Leu Arg Arg Lys Ser Ala Asn Leu Pro Pro
20 25 30
Thr Val Phe Pro Ser Ile Pro Ile Ile Gly His Leu Tyr Leu Leu Lys
35 40 45
Lys Pro Leu Tyr Arg Thr Leu Ala Lys Ile Ala Ala Lys Tyr Gly Pro
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65 70 75 80
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85 90 95
Asn Arg Pro Lys Thr Leu Phe Gly Lys Ile Val Gly Gly Thr Ser Leu
100 105 110
Gly Ser Leu Ser Tyr Gly Asp Gln Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala
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Ser Pro Val Thr Leu Ile Thr Val Phe Tyr Ala Leu Thr Leu Asn Val
165 170 175
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180 185 190
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465 470 475 480
Val Pro Leu Val Ala Lys Cys Lys Pro Arg Ser Glu Met Thr Asn Leu
485 490 495
Leu Ser Glu Leu
500

Claims (31)

1.一种纯化的高甜度甜味剂，其包含至少95重量％的莱鲍迪苷M和小于20,000ppm的组合量的莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷B和莱鲍迪苷A。
2.根据权利要求1所述的纯化的高甜度甜味剂，其包含小于5000ppm的莱鲍迪苷D、小于4000ppm的莱鲍迪苷B和小于2000ppm的莱鲍迪苷A。
3.根据权利要求1或2所述的纯化的高甜度甜味剂，其中，所述莱鲍迪苷D小于3200ppm，所述莱鲍迪苷B小于2000ppm，所述莱鲍迪苷A小于1000ppm。
4.根据前述权利要求中任一项所述的纯化的高甜度甜味剂，其中，当还量化莱鲍迪苷M时，所述莱鲍迪苷D、所述莱鲍迪苷B和所述莱鲍迪苷A均低于定量限(LOQ)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的纯化的高甜度甜味剂，其中，使用高效液相色谱法(HPLC)测定莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷B和莱鲍迪苷A的量。
6.一种餐桌甜味剂，其包含权利要求1至5中任一项所述的纯化的高甜度甜味剂。
7.根据权利要求6所述的餐桌甜味剂，其还包含填充剂。
8.根据权利要求7所述的餐桌甜味剂，其中，所述填充剂选自赤藓糖醇、糊精、菊粉、聚葡萄糖和麦芽糖糊精。
9.一种糖替代品，其包含权利要求1至5中任一项所述的纯化的高甜度甜味剂。
10.根据权利要求9所述的糖替代品，其还包含一种或多种填充剂。
11.根据权利要求10所述的糖替代品，其中，所述填充剂选自赤藓糖醇、可溶性纤维、糊精、菊粉、聚葡萄糖和麦芽糖糊精。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的糖替代品，其中，所述糖替代品包含按重量计与蔗糖相同水平的甜度。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的糖替代品，其包含约85重量％至约90重量％的赤藓糖醇、约9重量％至约15重量％的可溶性纤维和约0.1％至约1.0％的权利要求1至4中任一项所述的纯化的高甜度甜味剂。
14.根据权利要求13所述的糖替代品，其包含约90重量％的赤藓糖醇、约9.5重量％的可溶性纤维和约0.5％的权利要求1至4中任一项所述的纯化的高甜度甜味剂。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的糖替代品，其中，所述可溶性纤维选自β-葡聚糖、葡甘露聚糖、果胶、瓜尔胶、菊粉、低聚果糖、抗消化糊精和聚葡萄糖。
16.根据权利要求15所述的糖替代品，其中，所述抗消化糊精是NUTRIOSE FM10。
17.根据权利要求9至16中任一项所述的糖替代品，其中，所述高甜度甜味剂与一种或多种填充剂聚集。
18.一种制备权利要求1至5中任一项所述的纯化的高甜度甜味剂的方法，其包括：
获得包含莱鲍迪苷M的澄清的发酵液；
采用超滤器过滤所述澄清的发酵液，产生超滤渗透物；
采用纳米过滤器过滤所述超滤渗透物，产生纳滤流过物；
洗涤所述纳滤流过物；以及
喷雾干燥所述洗涤的纳滤流过物，获得权利要求1至5中任一项所述的纯化的高甜度甜味剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述超滤器的超滤截留分子量是约2kDa至约100kDa。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述超滤器的超滤截留分子量是约20kDa。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中，所述纳米过滤器的纳滤截留分子量是约200Da至约1000Da。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述纳米过滤器的纳滤截留分子量是约300Da至约500Da。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中，所述澄清的发酵液经pH调节至pH大于pH7。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述澄清的发酵液的pH是约pH10。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中，在用酸溶液酸化之后洗涤所述纳滤流过物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述酸溶液包含柠檬酸。
27.一种制备权利要求9至17中任一项所述的糖替代品的方法，其包括：
将第一填充剂添加到混合器中；
用所述第一填充剂预涂布所述混合器；
添加第二填充剂和权利要求1至5中任一项所述的纯化的高甜度甜味剂；
将所述第一填充剂、所述第二填充剂和所述高甜度甜味剂混合；
向所述混合物中添加水；
将所述第一填充剂、所述第二填充剂、所述高甜度甜味剂和水混合；
干燥所述混合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述第一填充剂是赤藓糖醇。
29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述第二填充剂是可溶性纤维。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述可溶性纤维是抗消化糊精。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述抗消化糊精是NUTRIOSE FM10。
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